UNIVERSITE PARIS • SUD
UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE
FACULTE DE PHARMACIE DE CHATENAY·MALABRY
ANNEE 1989 - 1990
SERIE DOcrORAT N° 142
THESE
Présentée
A L'UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE
UNIVERSITE DE PARIS· SUD
pour robteniton du grade de
DOCTEUR DE L'UNIVERSITE DE PARIS • SUD
MENTION SCIENCES PHARMACEUTIQUES
par
Monsieur Daniel KONAN
Titre de la thèse:
VARIATIONS DES GLYCOFORMES DE L'ed-GLYCOPROTEINE ACIDE HUMAINE AU
COURS DE L'INSUFFISANCE HEPATOCELLULAlRE ET EN FIN DE GROSSESSE.
ETUDE D'UNE STRUCIURE TETRAANTENNEE ET BIFUCOSYLEE
soutenue le 24 Avril 1990
mRY: Président:
M.
le Professeur J. AGNERAY
Membres:
M.
le Professeur B. FOURNET
Rapporteur
Mme. le Professeur M.J. FOOLIETTI
M.
le Docteur D. BlOU
Rapporteur

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A LA MÉMOIRE DE MON PERE,
trop tôt disparu pour apprécier cette thèse que sa vie de travail et de
sacrifices m'a permis de réaliser
A LA MÉMOIRE DE MA SOEUR, ROSAMONDE
A MA MERE
A MES FRERES ET SOEURS
A ANNE-SOPHIE ET LIONEL-OLIVIER
A MES AMIS

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Je remercie tout paniculièrement :
Monsieur le Professeur 1 AGNERAY
qui m'a accueilli dans son laboratoire, a suivi mon travail et me fait
l'honneur de présider le jury de cette thèse
Monsieur le Professeur B. FOURNET.
qui, en m'accueillant dans son laboratoire à Lille a donné une
impulsion supplémentaire à la réalisation de ce travail.
Madame le Professeur M.l FOGLIETTI
qui me fait l'honneur de paniciper à ce jury.
Monsieur le Docteur D. BlOU
qui m'a suivi et encadré avec dévouement et beaucoup de patience.
J'apprécie ses grandes qualités humaines et scientifiques.
Madame le Professeur G. DURAND
qui a dirigé ce travail avec bienveillance et compétence.
Madame le Professeur 1 FEGER
qui m'a donné de nombreuses marques d'intérêts dans les étapes
essentielles de cette thèse.
Madame le Docteur N. SETA
qui nous a foumi le liquide d'ascite.

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Je remercie également:
Tout le personnel du laboratoire de Biochimie de Châtenay-Malabry.
Mes Collègues
H. NGUYEN, J.D. ROUZEAU, 1 DAVY et Mme GIAI-BRUERI.
Tout le personnel du laboratoire de Biochimie de l'USTL Villeneuve d'Ascq.
Mes Collègues
P. CARDON, Y. LEROY, P. BOULANGER, lM. WIERUSZESKI,
Ph. TIMMERMANN et G. STRECKER
qui sont la preuve vivace de la gentillesse des "Gens du Nord".
Josyane FEINSTEIN
qui a dactylographié cette thèse avec beaucoup d'enthousiasme.
Je remercie aussi tous ceux qui d'une façon ou d'une autre auront contribué à
la réalisation de ce travail.

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Page
INTRODUCTION
DONNEES GENERALES SUR l'al-GLYCOPROTEINE ACIDE
1 - PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES
3
II - smucruRE ET COMPOSmON CIDMIQUE
6
1 - Type oligomannosyle
8
2 - Type N-acétyllactosaminyle ou type complexe
8
3 - Type mixte
Il
III - BIOSYNTIIESE DES GLYCANNES
14
IV - ROLE BIOLOOIQUE DE LA COPULE GLYCANNIQUE'
20
V - CATABOLISME ET EPURATION DES GLYCOPROTEINES
21
VI - VARIATIONS SmUCTURALES DE L'a1-GLYCOPROTEINE ACIDE
22
TECHNIQUES ET MATERIELS UTILISES
1 - TECHNIQUES IMMUNOCillMIQUES
24
A - IMMUNODIFFUSION RADIALE (IDR)
24
1 - Principe
24
2 - Expression mathématique
24
3 - Technique
25
4 - Révélation et lecture de la plaque
25
B - ELECIROIMMUNODIFFUSION MONODIMENSIONNELLE
26
(EIDm)
1 - Principe
26
2 - Technique
26
C - ELECIROIMMUNODIFFUSION MONODIMENSIONNELLE EN
QUINCONCE
27
1 - Principe
27
2 - Technique
27
D - REACI1FS POUR IDR, EIDm, EIDm EN QUINCONCE
29

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PAGE
E - IMMUNOAFFINOELECTROPHORESE CROISEE EN PRESENCE
DE CONCANAVALINE A (CIAE - ConA)
29
1 - Principe
30
2 - Technique
32
3 - Réactifs
34
il - ELECTROPHORESE EN GEL DE POLYACRYLAMIDE
36
1 - Principe
36
2 - Préparation des gels
36
3 - Préparation des échantillons
38
4 - Migration électrophorétique
38
5 - Coloration du gel
38
6 - Réactifs
39
ID - PURlFICATION DE L'al-GLYCOPROTEINE ACIDE
PAR CHROMATOGRAPHIE D'IMMUNOAFFINITE
41
A - OBTENTION DE L'IMMUNSERUM ANTI-al-GLYCOPROTEINE
ACIDE HUMAINE
4 1
B - PURIFICATION DES ANTICORPS SPECIFIQUES ANTI-al-
GLYCOPROTEINE ACIDE PAR CHROMATOGRAPHIE
D'IMMUNOAFFINITE
42
1 - Généralités
42
2 - hnmobilisation de l'al-glycoprotéine acide sur polyacrylamide
agarose par l'intennédiaire de la glutaraldéhyde
43
3 - Chromatographie d'immunoaffinité pour la préparation des
anticorps spécifiques anti-al-glycoprotéine acide humaine
45
45
4 - Résultats
47
5 - Matériels et réactifs
C - PURIFICATION DE L'al-GLYCOPROTEINE ACIDE D'UN
LIQUIDE BIOLOGIQUE PAR CHROMATOGRAPIDE
48
D'IMMUNOAFFINITE
48
1 - Principe
2 - Couplage des anticorps anti-al-glycoprotéine acide au
Sépharose 4 B activé par le bromure de cyanogène
49
3 - Chromatographie d'immunoaffinité pour la purification de l'al-
glycoprotéine acide humaine
51
4 - Matériels et réactifs
54
5 - Analyse de l'al-glycoprotéine acide purifiée
55
IV - ISOLEMENT DES SOUS-POPULATIONS GLYCANNIQUES DE L'al-
GLYCOPROTEINE ACIDE PAR CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE
SUR CONCANAVALINE A
55
1- Principe
55
2 - Mode opératoire
56

---

PAGE
2.1. Chromatographie d'affinité sur ConA-Sépharose 4 B
de l'al-glycoprotéine acide native
56
2.2. Chromatographie d'affinité sur ConA-Sépharose 4 B
des glycannes radiomarqués
57
3 - Matériels et réactifs
58
v -TECHNIQUE D'ETUDE DE LA STRUCTURE GLYCANNIQUE
59
A - ETUDE DE LA COMPOSmON EN OSES PAR
CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE (CPG)
59
1 - Méthanolyse
59
2 - Trifluoroacétylation
59
3 - Chromatographie en phase gazeuse
60
B - LffiERATION DES OLlGOSACCHARIDES PAR
HYDRAZINOLYSE
63
1 - Hydrazinolyse
63
2 - Chromatographie d'exclusion sur Fractogel TSK HW 40S
63
3 - N-reacétylation
64
4 - Réduction
65
C - FRACTIONNEMENT DES GLYCANNES PAR
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PRESSION (CLHP)
65
SUR ECHANGEUR D'ANIONS
1 - Technique
65
2 - Identification des fractions
67
D - PERMElHYLATION DES GLYCANNES
67
1 - Principe
67
2 - Mode opératoire
67
3 - Matériels et réactifs
69
RESULTATS
1 - PURIFICATION DE l'al-GLYCOPROTEINE ACIDE CHEZ L'HOMME
70
A - PREPARATION DE L'IMMUNOAOSORBANT
70
B - DEFINITION DES ECHANTILLONS BIOLOGIQUES
71
71
1 - Population saine
71
2 - Cirrhose alcoolique
71
3 - Grossesse
4 - Mise en évidence des altérations qualitatives de glycosylation de
l'al-glycoprotéine acide par CIAE-ConA
72
C - PURIFICATION DE L'al-GLYCOPROTEINE ACIDE HUMAINE
75

---

PAGE
D - ETUDE QUALITATIVE DE L'al-GLYCOPR01EINE ACIDE
PURIFIEE
75
1 - Immunoaffmoélectrophorèse croisée en présence de
concanavaline A (CIAE-ConA)
75
2 - Etude du degré de sialylation
79
3 - Critère de pureté de l'al-glycoprotéine acide
81
II - APPROCHE DE LA STRUCfURE GLYCANNIQUE DES
GLYCOFORMES DE L'al-GLYCOPR01EINE ACIDE
86
A - ETUDES CHEZ UN SEUL INDIVIDU CIRRHOTIQUE
86
1- Composition en oses de la molécule native
86
2 - Fractionnement des glycoformes de l'al-glycoprotéine acide
native par chromatographie d'affinité sur ConA-Sépharose 4B
88
3 - Etudes des oligosaccharides
89
3.1. Libération desoligosaccharides par hydrazinolyse
89
3.2. Fractionnement des sialyloligosaccharides par
chromatographie d'affinité sur ConA-Sépharose 4 B
93
3.3. Fractionnement des sialyloligosaccharides par
chromatographie liquide haute pression
95
3.4. Etude de la fraction F4 tétrasialylée et tétraantennée
97
4 - Composition en oses de l'al-glycoprotéine acide de sujets
cirrothiques. Comparaison à celle de l'al-glycoprotéine acide
d'une population saine
101
B - APPROCHE DE LA STRUCIURE GLYCANNIQUE DE L'al-
GLYCOPR01EINE ACIDE AU COURS DU 3è TRIMESTRE DE
LA GROSSESSE
103
1 - Composition en ose de l'al-glycoprotéine acide au cours du
104
3è trimestre de la grossesse
2 - Fractionnement des glycoformes de l'al-glycoprotéine acide en
chromatographie d'affinité sur ConA-Sépharose 4 B
106
3 - Fractionnement des sialyloligosaccharides radiomarqués par
chromatographie d'affinité sur ConA-Sépharose 4 B
108
DISCUSSION - CONCLUSION GENERALE
110
BIBLIOGRAPHIE
116

---

LISTE DES TABLEAUX
PAGE
TABLEAUI
Propriétés physico-chimiques de l'al-glycoprotéine acide humaine
4
TABLEAUn
Préparation des anticorps anti al-glycoprotéine acide humaine
45
TABLEAUm
Mode de détennination des rapports molaires en monosaccharides
de l'al-glycoprotéine acide par chromatographie en phase gazeuse
62
TABLEAU IV
Caractéristiques de l'immunoadsorbant al-glycoprotéine acide
73
humaine
TABLEAU V
Distribution des proportions relatives des glycoformes de l'al-
glycoprotéine acide humaine après CIAE-ConA en fonction de la
77
nature de l'échantillon
TABLEAU VI
Chromatographie d'immunoaffmité pour la purification de l'al-
glycoprotéine acide d'un mélange de sérums de sujets sains
77
TABLEAUvn
Chromatographie d'immunoaffmité pour la purification de l'al-
glycoprotéine acide du liquide d'ascite du sujet cirrhotique
78
TABLEAUvm
Chromatographie d'immunoaffmité pour la purification de l'al-
glycoprotéine acide d'un mélange de sérums de femmes enceintes
78
(3è trimestre de grossesse)
TABLEAU IX
Pourcentage du pic 1 de l'al-glycoprotéine acide humaine en
CIAE-ConA avant et après purification par chromatographie
82
d'immunoaffinité
TABLEAUX
Evaluation de la désialylation de l'al-glycoprotéine acide humaine
au cours des purifications par chromatographie d'immunoaffmité
82
TABLEAU XI
Coefficient d'extinction spécifique e 10/00 d'une solution d'al-
glycoprotéine acide humaine purifiée à 1 mg/ml dans de l'eau
85
distillée
TABLEAU XII
Composition en oses de l'al-glycoprotéine acide isolée du sérum
de sujet sain (GPAn) et du liquide d'ascite d'un individu cirrhotique
87
(GPAc)
TABLEAUxm
Distribution des glycoformes de l'al-glycoprotéine acide de sujets
sain (GPA~ et cirrhotique(GPAc) après chromatographie d'affinité
90
sur ConA- épharose.

---

PAGE
TABLEAU XIV
Masse moléculaire apparente (Da) des glycofonnes de l'al-
glycoprotéine acide des sujets sain (GPArJ et cirrhotique (GPAC>
90
après chromatographie d'affinité sur ConA-Sépharose .
TABLEAU XV
Composition molaire des oligosaccharides de l'al-glycoprotéine
acide des sujets sain (GPAn) et cirrhotique (GPAC>
92
TABLEAU XVI
Résultats du marquage des oligosaccharides de l'al-glycoprotéine
acide des sujets sain (GPAn) et cirrhotique (GPAC> par le NaBH4
94
tritié
TABLEAUxvn
Distribution des différents glycannes radiomarqués de l'al-
glycoprotéine acide de sujets(GPAn) sains et cirrhotique(GPAc)
94
après chromatographie d'affinité sur ConA-Sépharose
TABLEAU XVllI
Composition molaire des sialyloligosaccharides de l'al-
glycoprotéine acide des sujets sain (GPArJ et cirrhotique (GPAC>
libérés après hydrazinolyse et fractionnés par chromatographie
96
liquide haute pression sur échangeur d'anions.
TABLEAU XIX
Rapport molaire des éthers méthyliques des
monosaccharidesissusde la perméthylation des
glycannes de la fraction F4 des sujets sains
(GPAn) et cirrhotiques (GPAC>
99
TABLEAU XX
Composition molaire en oses de l'al-glycoprotéine acide isolée du
105
sérum d'individus sains (GPAn) et cirrhotiques (GPAC>
TABLEAU XXI
Composition molaire en oses de l'al-glycoprotéine acide de sujets
sains (GPAn) et chez la femme au cours du 3è trimestre de
105
grossesse (GPAf)
TABLEAU XXII
Distribution des glycofonnes de l'al-glycoprotéine acide de sujet
sain (GPAn) et de la femme au cours du 3è trimestre de
grossesse (GPAf) après chromatographie d'affinité sur ConA-
107
Sépharose 4 B
TABLEAUXXm
Masse moléculaire apparente (Da) des glycoformes de l'al-
glycoprotéine acide du sujet sain (GPArJ et au cours de la
grossesse (GPAf) après chromatographie d'affinité ConA-
107
Sépharose
TABLEAU XXIV
Résultats du marquage des oligosaccharides de l'al-glycoprotéine
acide par NaB14 tritié chez le sujet sain (GPAn) et au cours du
3è trimestre de grossesse (GPAf)
109
~
TABLEAU XXV
Disribution des glycannes de l'al-glycoprotéine acide après
sialyloligosaccharides radiomarqués chez le sujet sain (GPAn) et au
109
cours du 3ème trimestre de grossesse (GPAf)

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LISTE DES FIGURES
PAGE
Figure 1
Représentation schématique de l'al-glycoprotéine acide
5
Figure 2
Liaison glycanne-peptide des glycoprotéines: liaison o-osidyle
7
Figure 3
Liasion glycanne-peptide des glycoprotéines: liaison N-osidyle
7
Figure 4
Pentasaccharide interne mannotriosido-di-N-acétylchitobiose
7
commun à toutes les N-glycoprotéines
Figure 5
Chaînes glycanniques des glycoprotéines de type oligomannosyle :
9
structure minimale
Figure 6
Chaînes glycanniques des glycoprotéines de type oligomannosyle :
9
structure maximale
Figure 7
Chaînes glycanniques des glycoprotéines de type N-acétyllacto-
9
saminyle
Figure 8
Structure d'une chaîne glycannique tétraantennée désialylée de l'al-
la
glycoprotéine acide humaine
Figure 9
Structure des différents oligosaccharides de l'al-glycoprotéine
acide humaine répartis en 5 classes (A, B, BF, C, CF) selon
Fournet et al (1978) et en 3 classes supplémentaires (D,E,G) selon
12
Yoshima et al (1981)
Figure 10
Schéma représentant les principales étapes post-traductionnelles
et organites intracellulaires intervenant dans la biosynthèse des
15
chaînes glycanniques des N-glycoprotéines d'après Lennarz (1983)
Figure Il
Réactions proposées pour la synthèse de l'oligosaccharide lié au
16
dolichol contenant le noyau central d'après Elbein (1983)
Figure 12
Etapes de maturation des chaînes oligosaccharidiques de type
complexe et oligomannosidique des N-glycosylprotéines d'après
17
Elbein (1983)
Figure 13
Niveau d'action des glycosidases ; le transfert du tétradéca-
saccharide sur le résidu asparaginyle est suivi d'une
déglycosylation séquentielle catalysée par des enzymes spécifiques
19
selon Kornfeld (1982)
Figure 14
Electroimmunodiffusion monodimensionnelle en quiconce
28
Figure 15
Immunoaffinoéleetrophorèse croisée en présence de concanavaline A
31
Figure 16
Electrophorèse dans la 1ère dimension
33
Figure 17
Electrophorèse dans la 2ème dimension
35

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PAGE
Figure 18
Chromatographie en phase gazeuse des méthylglycosides
trifluoroacétylés de l'al-glycoprotéine acide humaine sur
61
une colonne OV21O
Figure 19
Séparation des sialoglycannes de l'al-glycoprotéine acide humaine
68
par chromatographie liquide haute pression sur échangeur d'anions
Figure 20
Glycoformes de l'al-glycoprotéine acide obtenues en CIAE-ConA
73
à partir d'un mélange de sérums d'individus sains
Figure 21
Glycoformes de l'al-glycoprotéine acide obtenues en CIAE-ConA
74
à partir du sérum d'un seul individu cirrhotique
Figure 22
Glycoformes de l'al-glycoprotéine acide obtenues en CIAE-ConA
74
à partir du liquide d'ascite du même individu cirrhotique
Figure 23
Glycoformes de l'al-glycoprotéine acide obtenues en CIAE-ConA à
partir d'un mélange de sérums de femmes enceintes prélevés au 3è
76
trimestre de grossesse
Figure 24
Electroimmunodiffusion monodimensionnelle EIDm après purification
de l'al-glycoprotéine acide humaine par chromatographie
80
d'immunoaffinité.
Figure 25
Immunodiffusion radiale (IDR) après purification de l'al-glyco-
protéine acide humaine par chromatographie d'immunoaffinité.
80
Figure 26
Electroimmunodiffusion monodimensionnelle en quinconce
83
Figure 27
Electrophorese en gel de polyacrylamide-SDS de l'al-
85
glycoprotéine acide humaine purifiée
Figure 28
Electrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS des différentes
glycoformes de l'al-glycoprotéine acide humaine obtenues en
9 )
chromatographie d'affinité sur ConA-Sépharose 4 B
Figure 29
Chromatographie en phase gazeuse des éthers méthyliques des
perméthyloligosaccharides de la fraction F4 de l'al-glycoprotéine
98
acide de sujets sains sur une colonne OV101
Figure 30
Structure primaire des oligosaccharides tétraantennés tétrasialylés
fucosylés des glycannes de l'al-glycoprotéine acide de sujets
102
sain (A) et cirrhotique (B)

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ABREVIATIONS
Cl2 HS
Alpha-2-Heremans-Schmid glycoprotéine
Ac
Anticorps
Ag
Antigène
BBS
Borate Buffer Saline
CIAE
Immunoaffinoélectrophorèse croisée
ConA
Concanavaline A
CLHP
Chromatographie liquide haute pression
CPG
Chromatographie en phase gazeuse
CPM
Coup par minute
crSA
Centre de transfusion sanguine des armées
Da
Dalton
00
Densité optique
Dol
Dolichol
EIDm
Electroimmunodiffusion monodimensionnelle
Fuc
Fucose
Gal
Galactose
GalNAc
N-acétylgalactosamine
GleNAc
N-acétylglucosamine
GPA
Alpha-l-glycoprotéine acide
HBP
Hepatic Binding Protein
IDR
Immunodiffusion radiale
IS
Inununsérum
kDa
Kilodalton
Man
Mannose
NeuAc
Acide N-acétyl neuraminique
PAGE
Electrophorèse en gel de polyacrylamide
PEG
Polyéthylène glycol
RMN
Résonance magnétique nucléaire
SAB
Sérum albumine bovine
SDS
Sodium dodécyle sulfate
Tris
Tris (hydroxyméthyl) aminométhane

---

INTRODUCTION

---

-
-
1 -
L'a.1- glycoprotéine acide (GPA) ou orosomucoïde est une glycoprotéine isolée
du sérum de plusieurs mammifères (Weimer et al ,1950; Bezkorovainy et al, 1962). Elle
se différencie des autres glycoprotéines par ses propriétés spécifiques : forte teneur en
oses 43 % et plus particulièrement en acide sialique. Tout ceci lui confère un faible point
isoélectrique et une grande solubilité dans l'eau. Elle a été identifiée et purifiée dès 1950
(Weimer et al ,1950). La structure des copules glycannique (Fournet et al ,1978; Yoshima
et al ,1981) et peptidique (Schmid et al ,1973; Ricca et al ,1981; Dente et al ,1985) est
maintenant bien connue. La partie protéique est composée chez l'homme d'une chaîne
polypeptidique de 183 acides aminés. Le nombre de gènes ainsi que les séquences du
génome impliquées dans la biosynthèse ont été précisées chez l'Homme et le Rat (Dente
et al, 1985; Ricca et al ,1981). Le rôle biologique de la GPA n'est pas encore bien connu.
Son intervention dans divers processus physiologiques a été évoquée : agrégation
plaquettaire, immunomodulation (Chiu et al , 1977; Bennett et Schmidt 1980 ). Son rôle
dans le transport de substances endogènes (progestérone) ou exogènes (médicaments
basiques tels que le propranolol) est maintenant bien établi. Des variations quantitatives
ont été constatées dans certaines circonstances pathologiques, notamment une forte
augmentation au cours de processus inflammatoires et néoplasiques. Ainsi la GPA est
devenue l'un des marqueurs le plus cité de l'inflammation. Elle fait partie des "acute phase
proteins" ou protéines de la réponse inflammatoire aiguë.
Deux grands types d'hétérogénéités ont été mis en évidence selon qu'elles
affectent la copule peptidique ou la copule glycannique. Les premières correspondent à
des variations ponctuelles dues à la substitution de résidus aminoacyles et sont mises en
évidence par analyse en gel d'amidon à pH 5,0 ou par clivage au bromure de cyanogène
suivi d'une digestion trypsique (Schmid,1975 ).L'origine est d'ordre génétique. Le
second type d'hétérogénéité concerne la chaîne glycannique. Le développement au cours
des deux dernières décennies de techniques d'études immunochimiques en présence de
lectines et notamment de l'immunoaffinoélectrophorèse croisée en présence de
concanavaline A (CIAE - ConA) a permis de mettre en évidence dans un certain nombre

---

- 2 -
de circonstances physiologiques (grossesse) et pathologiques (atteintes hépatiques,
syndromes inflammatoires) des variations qualitatives de la structure glycannique de la
GPA (Wells et al ,1981; Raynes, 1982 ; Nicollet et al,1982; Hansen et al,1984;
Mackiewicz et al ,1985 ;Serbource-Goguel Seta et ai, 1986; Jezequel et al, 1986 ). Ces
variations qualitatives peuvent être associées ou non à des variations quantitatives de la
concentration sérique. Elles peuvent porter soit sur le degré de ramification de la copule
glycannique, c'est-à-dire le nombre d'antennes, soit sur certains résidus glycosyles aux
extrémités non réductrices des antennes (Biou et al, 1981; Bordas et al, 1981; Serbouce-
Goguel Seta et al, 1983 ). La CIAE en présence d'une lectine apparait comme un outil très
précieux par sa sensibilité et sa relative simplicité pour la mise en évidence d'altérations de
la copule glycannique. La spécificité de la CIAE pennet une étude directe sans purification
préalable de nombreux liquides biologiques (sérums, ascites etc...). Elle pennet sans
investissement onéreux un dépistage précoce des altérations glycanniques de la GPA.
Mais cette technique ne pennet pas de préciser au niveau moléculaire la nature exacte des
altérations observées. Ceci ne peut être envisagé qu'après purification de la glycoprotéine
et l'étude détaillée de la copule glycannique.
Au cours de ce travail, nous nous sommes plus particulièrement intéressés à la
nature moléculaire des altérations glycanniques de la GPA observées au cours d'une
atteinte hépatique hélas très fréquente en France: la cirrhose éthylique et au cours d'une
évolution plus physiologique : la grossesse. Mais pour bien comprendre la nature de ces
altérations un rappel sur la structure glycannique et la biosynthèse de la GPA est
nécessaire.

---

-
- 3 -
1 - PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES
Les principaux travaux de synthèse concernant l' al- glycoprotéine acide (OPA)
et plus particulièrement ses propriétés physico-chimiques (Tableau 1) ont été présentés
par (Schmid, 1975; Charlwood et al, 1976). Les constantes physicochimiques varient
légèrement selon les espèces, l'état physiopathologique de l'individu, la technique de
purification et la technique d'analyse.
La masse moléculaire est de l'ordre de 42500 daltons. La chaîne polypeptidique
déduite des séquences de l'ADN complémentaire (Dente et al,1985) et de l'ARN messager
(Ricca et Taylor, 1981) comprend respectivement 183 et 187 acides aminés chez l'Homme
et le Rat ce qui correspond à une masse moléculaire moyenne d'environ 21400 daltons.
La copule glycannique est une des plus importantes parmi les glycoprotéines sériques
(environ 43 % chez l'Homme). La forte teneur d'une part en résidus sialyles (environ 10
%), d'autre part en résidus aspartates et glutamates confère à la OPA un point isoionique
très bas (3,5).
La comparaison des séquences primaires en acides aminés de la OPA chez le Rat
(Ricca et Taylor ,1981) et chez l'Homme (Schmid et al ,1973 ) indique une identité pour
44 % des acides aminés, ce qui correspond (c.ompte tenu des acides aminés substitués par
des chaînes latérales peu différentes) à 59 % d'homologie. Il y a au total 5 sites de
glycosysation chez l'Homme et 6 chez le Rat. Un pont
disulfure et 4 sites de
glycosylation sont pratiquement communs aux deux glycoprotéines. La région comprise
entre les acides aminés 50 et 90 joue certainement un rôle important dans le rôle
biologique de la OPA puisque 68 % des acides aminés y sont identiques et qu'elle
contient 3 sites de glycosylation et un résidu Cys appartenant au pont disulfure commun
(Figure 1).

---

- 4 -
TABLEAU 1
Propriétés physico-chimiques de l'al-glycoprotéine acide
humaine
M.M.
43000 (a)
pl
3,5
(a)
1%
8,93
(a)
E
lem
(278 nro)
Acides aminés
183
(c)
M.M. de la chaîne peptidique
21270 (b)
Site de glycosylation
5
(a)
Composition de la copule glycannique (%)
Hexoses (Gal, Man)
14,3
(a)
GlcNAc
14,1
(a)
NeuAc
11,4
(a)
Fuc
1,0
Ca)
Total
40,8
a)
SCHMID
(1975)
b)
RICCAetal
(1981)
c)
DEN1Eetal
(1985)

---

-
- 5 -
38
54
_ - - - - - -....7
116
58
Figure 1
Représentation schématique de l'al-glycoprotéine acide
haut: al-glycoprotéine acide humaine
bas : al-glycoprotéine acide de rat
( Schmid,1975 )
d'après Ricca et Taylor (1981 )
Les cercles représentent les chaînes glycanniques et les numéros, les positions des acides aminés N-
glycosylés ou impliqués dans les ponts disulfures.

---

DONNEES GENERALES SUR
L'al·GLYCOPROTEINE ACIDE

---

•
- 6 -
II • STRUCTURE ET COMPOSITION CHIMIQUE
Une glycoprotéine est une hétéroprotéine comportant une copule protéique et
une copule glycannique reliées par une ou des liaisons covalentes stables. Cette liaison
peut être soit du type O-osidyle soit du type N-osidyle. On connait quelques exemples de
liaison S-osidyle.
Dans les glycoprotéines à liaison O-osidyle, les résidus séryles ou thréonyles
de la copule peptidique fournissent souvent la fonction alcool permettant la combinaison
avec l'hydroxyle anomérique de l'extrémité réductrice de la chaîne oligosaccharide
(Figure 2). On trouve ces structures dans les mucines, les protéoglycannes et certains
glycoconjugués de membranes.
Les glycoprotéines à liaison N-osidyle font toujours intervenir comme accepteur,
l'azote amidique (R - CO - NH2) d'un résidu asparaginyle de la copule peptidique qui se
combine à l'hydroxyle anomérique B d'un résidu N-acétylglucosaminyle (GlcNAc) de
l'extrémité réductrice de la chaîne glycanne. Ainsi les différentes chaînes glycanniques
sont reliées au squelette pol.ypeptique (Figure 3) au niveau d'un tripeptide Asn - X -
Ser (Thr) (X': acide aminé quelconque). Chaque tripeptide définit donc un site de
glycosylation . Cette liaison est remarquablement stable. On la retrouve dans de très
nombreuses glycoprotéines sériques, hormonales, virales, membranaires. Une autre
particularité de ces glycoprotéines à liaison N-osidyle réside dans la chaîne glycannique
qui comporte toujours le même pentasaccharide de base ou noyau (Figure 4). Partant de
l'extrémité réductrice engagée dans la liaison N-osidyle, ce pentasaccharide comporte
deux résidus GlcNAc et trois résidus Man. Les trois premiers résidus (GlcNAc - GlcNAc
- Man) sont reliés par des liaisons ~-osidyles, donc présentent une structure linéaire
perpendiculaire à la copule peptidique. Les deux derniers résidus Man 4 et 4' se fixent
sur le Man 3 du noyau par des liaison a-osidyles et forment un angle avec le plan des
trois premiers résidus. Ce noyau central de structure invariable constitue le
pentasaccharide de base encore dénommé mannotriosido-di-N-acétyl-chitobiose. Ce
noyau central peut être considéré comme un véritable porte-antenne comportant une tige et

---

•
- 7 -
•
o
NHAC
1
CH,
1
R---fIIH/ i 'CO-R'
Figure 2
Liaison glycanne-peptide des glycoprotéines : liaison O-osidyle.
HNAC
,
R
Figure 3
Liaison glycanne-peptide des glycoprotéines : liaison N-osidyle
4'
Mana~6
/3Man~1"""'4GlcNAc~1-+4GlcNAc~-+Asn
3
2
1
Mana
4
Pentasaccharide interne mannotriosido-di-N-acét \\'lchitobiose commun
Figure 4
à toutes les l'i-gl~·coprotéine;.
.

---

-
- 8 -
deux ramifications. Il est destiné à orienter la copule glycannique de la molécule vers
l'extérieur. Les glycoprotéines à liaison N-osidyles se différencient en trois types
(Kornfeld et al, 1980; Montreuil ,1980; Montreuil, 1981).
1. type oU20mannosjdyie
Le pentasaccharide de base est substitué au niveau des Man 4 et 4' par un certain
nombre de résidus a-mannosyles. Selon les glycoprotéines, on peut rencontrer toutes les
possibilités entre une structure minimale avec deux substituants a-Man (Figure 5) et la
structure maximale comportant six substituants a-Man (Figure 6).
2. Type N.acétyl.lactosamjnyle ou type complexe (Figure 7)
Le pentasaccharide de base est substitué par un certain nombre d'antennes
constituées d'un motif disaccharidique : ~-Gall,4 GleNAc se fixant sur les Man 4 et 4'.
Cette liaison est possible en ~ 1,2 ; ~ 1,4 sur les Man 4 ou bien en B 1,2 ; B 1,4 ou B
1,6 sur les Man 4' (Schachter, 1984.). Sur le noyau central (Figure 8) vont donc venir
se greffer un nombre variable de ces motifs disaccharidiques encore dénommés N-acétyl-
lactosaminyles compris entre 2 et 5, pour définir les structures bi, tri, tétraantennées et
plus rarement pentaantennées. Les antennes sont fixées au noyau par des liaisons ~ 1;l et
~ 1,4 s'établissant respectivement entre les résidus GleNAc 5 et 7 et le Man 4 et ~ 1,2 et
~ 1,6 entre les résidus GleNAc 5' et 7' et le Man 4'. Les antennes sont elles-mêmes
susceptibles d'être substituées par des résidus sialyles (NeuAc) ou fucosyles (Fuc) en
nombre et position variables. Les résidus NeuAc se branchent chez l'Homme par des
liaisons a 2,3 ou a 2,6 sur les résidus Gal 6, 6', 8 ou 8' des extrémités non
réductrices des antennes. Les résidus Fuc se branchent selon les espèces soit par des
liaisons a 1,3 sur les résidus GleNAc 7 et 5' des antennes soit par des liaisons a 1,6
sur le résidu GleNAc 1 de l'extrémité réductrice. Lorsqu'un résidu GleNAc est substitué
en a 1,3 par un Fuc, ceci élimine en principe la possibilité d'une sialylation en a 2,6 du
Gal contigu (Paulson et al ,1978; Prieels et al,1981). Par conséquent, chez l'individu
sai~, les substitutions par des résidus NeuAc a 2,6 et Fuc a 1,3 s'excluent mutuellement
d'une même antenne.

---

- 9 -
Man ~1--)~4GIcNAc~I--.::~. 4GlcNAc~1-+Asn
/ 3
3
2
1
Man al
4
Figure 5
Chaînes glycanniques des glycoprotéines de type oligomannosyle :
strucnrre minimale
Man al.-.......2Man al
~6 4'
3 Man al
Man all--.~2Manal;F
~6
3 Man ~1-+4 GleNAc ~1+4 GleNAc ~~sn
! 3
2
1
Man al-...;~
.. 2Man al-..+2Man al
4
Figure 6
Chaînes glycanniques des glycoprotéines de type oligomannosyle :
Strucnrre maximale
5
4'
Manal
'Man~1---+4GlcNAc~l+4GlcNAc~-.Asn
4
13 3
2
1
( Fuc>n
Manal
Figure 7
Chaînes glycanniques des glycoprotéines de type N-acétyllactosaminyle

---

-
10 -
Gal1U....4 GleNAc ~k.
8'
7'
-6
4'
Man al
Gal ~1-+4 GleNAc ~1)"2
\\
6'
5'
6
Man ~1-+4 GleNAc ~1+4 GleNAc ~l-+Asn
3
3
2
l
Gal PI+4 GleNAc ~l .......,;.
8
7·"11'4
Man al
.
2
/ , 4
Gal ~1-+4 GleNAc pl
6
5
Figure 8
Structure d'une chaîne glycannique tétraantennée désialylée de l'al-
glycoprotéine acide humaine

---

-
11 -
Les résidus sialyles et fucosyles qui constituent les extrémités non réductrices des
chaînes glycannes présentent des caractéristiques très différentes: les résidus sialyles étant
acides et hydrophiles alors que les résidus fucosyles sont neutres et hydrophobes.
3. Type mixte
On connait des glycoprotéines de structure mixte possédant des chaînes glycannes
de type N-osidyles et O-osidyles sur la même molécule. On connait aussi des
glycoprotéines à liaison N-osidyle possédant un type N-acétyl-Iactosaminyle sur le Man 4
et un type oligomannosidyle sur le Man 4'. On les appelle encore glycoprotéines de type
hybride. Enfin, dans certaines glycoprotéines, le Man du noyau central peut être substitué
en B 1,4 par un résidu GleNAc. Dans ce cas, on parle d'une structure intercalaire. Cette
structure n'a cependant jamais été décrite pour la GPA.
On conçoit que le large choix d'une part, au niveau du nombre d'antennes et
d'autre part, au niveau de la substitution de ces antennes par des résidus Fuc et/ou NeuAc
va conférer à un oligosaccharide appartenant à un site donné de très grandes possibilités
structurales. Ainsi selon Fournet et al ( 1978), les oligosaccharides du site II de la GPA
peuvent être' bi, tri ou tétraantennés tandis que ceux des sites III, IV et V sont tri et
tétraantennés. Globalement, chez l'Homme sain, la GPA est faiblement biantennée et
surtout tri et tétraantennée. Cette grande diversité structurale se manifeste en
électrophorèse en gel de polyacrylamide SDS par un aspect très diffus de la bande
correspondant à la GPA.
Les différents oligosaccharides fixés sur les 5 sites de glycosylation se répartissent
selon Fournet et al (1978) en 5 classes distinctes (Figure 9) : biantennée (A),
triantennée (B), triantennée monofucosylée (BF), tétraantennée (C), tétraantennée
monofucosylée (CF). La présence de ces 5 classes a par la suite été confirmée par
(Yoshima et al 1981) qui décrit cependant 3 classes supplémentaires tétraantennées et
minoritaires D,E,G (figure 9).

---

-
12 -
Gal ~ (1->4) Ole NAc ~ (1->2) Man CI (1->6) _
_ _
_ _
Man ~ (I·->4)GIe NAc~(I·->4)GIeNAe~I-->Asn
Gal ~ (1.->4) Gle NAt ~ (1->2) Man CI (1->3)
.
Â
Gal ~ (1.->4) Ole NAt ~ (1->2) Man CI (1->6)~
./Man ~ (1->4) Ole NAt ~ (I->4)GIe NAt ~I-->Asn
Gal ~ (1->4) Gle NAt ~ (1->4)...
/
Man CI (1->3)
B
Gal ~ (1->4) Gle NAt ~ (I->2(
Gal ~ (1->4) Gle NAt ~ (1->2) Man CI (I->6)~
Man ~ (1.->4) Ole NAe ~ (I-->4)Gk NAe ~1-->ÂSIl
Gal ~ (I_./Ie NAe ~ (1.->4\\
/
FlIC CI (1--->3)
/ManCl(l-->3)
BF
Gal ~ (1 -->4) Gle NAe ~ (1-->2)
Gal ~ (1_.>4) Gle NAe ~ (1.->6)...........
Man CI (1-.>6>-....,
Gal ~ (1 _.>4) Gle NAe ~ (1-->2)............
"
Man ~ (1->4)OIeNAe ~ (1·->4)Glc NAe ~1-->ÂSIl
Gal ~ (1-->4) Ole NAe ~ (1->4)...........
/
Man Q (1--->3)
C
Gal ~ (1-->4) Gle NAt ~ (1-->2)/
Gal ~ (1->4) Gle NAt ~ (1->6>--- Man CI (1-.>6),
Gal ~ (I->4)GIe NAt ~ (1.->2)..........
"-
~Man~(1->4)OleNAt~(I->4)GlcNAt~I·->Asn
Gal ~ (1->4) ~Ie NAt ~ (1.->4)"
Futiï(l···>3)
/Man CI (1-->3
'CF
Gal ~(I_·>4)GIe NAt ~ (1->2)
Gal ~ (1->4) Gle NAt ~ (1->6)...........Man CI (1-.>6~
Gal ~ (lF~~~ ~ (1->2"""-
/
Man ~ (1->4) Gle NAt ~ (1->4) Gle NAt ~I->Asn
Gal ~ (1->4UiIe NAt ~ (1->4)...........
FI€'ii (1->3)
/
Man CI (1-·>3)
D
Gal ~ (1->4) Gle NAt ~ (1->2)
Gal ~(I-->4) Gle NAt ~ (1->3}GaI ~ (1->4) Gle NAt ~ (1->6)"Man CI (1.->6),
Gal ~ (1->4) Gle NAc ~ (1->2)............
"- Man P(1-->4)
GalP(l->4)GIeNAc~(I->4>-"""",
/
Man CI (1-->3)
Gal P (1->4)GIe NAc ~(1->2y/'
E
_
Gal P (1->4)GIe NAc P (1->6)...........
Man Q (1-··>6>-.",
Gal ~ (1·->4) Gle NAe ~ (I-->3}GaI ~ (1 ••->4) Gle NAt ~ (1->2Y
' "
./Man p(1->4)
Gal P (1-->4)GIe NAc ~(l.->4)..........
. /
Man CI (1-->3)
Gal ~ (1->4)GIe NAt ~(I->2y""
G
Figure 9
Structure des différents oligosaccharides de l'al-glycoprotéine acide
humaine répartis en 5 classes (A, B, BF, C, CF) selon Fournet et al (1978 )
et en 3 classes supplémentaires ( D,E,G ) selonYoshima et al (1981)

---

-
13 -
(i) : un oligosaccharide tétraantenné bifucosylé possédant 2 résidus Fuc liés en
a 1,3 aux résidus GlcNAc 7 et 5' des antennes. Selon Yoshima et al (1981), il n'existe
pas de structure biantennée fucosylée car la fucosyltransférase a 1,3 n'agirait sur la GPA
qu'après la GlcNAc transférase IV qui est à l'origine de la troisième antenne. Cette
affirmation est en contradiction avec les travaux de Cardon et al (1986 ) qui décrivent une
structure biantennée, monosialylée et fucosylée en a 1,3 sur la GlcNAc 5 ou 5'.
(U) : un oligosaccharide tétraantenné possédant un disaccharide N-acétyl-
lactosaminyle supplémentaire relié en ~ 1,3 au Gal 8' de l'antenne fixée en ~ 1,6 sur le
résidu Man 4' du noyau.
(Ui): un oligosaccharide isomère du précédant, par une liaison ~ 1,3 entre la
N-acétyllactosamine supplémentaire et le Gal 6' de l'antenne flXée en ~ 1,2 sur le résidu
Man 4' du noyau.
Ainsi, selon Yoshima et al (1981) la GPA humaine apparait tri et tétraantennée à
86 % (triantennée 39 %, tétraantennée 47 %). Moins de 35 % des oligosaccharides sont
fucosylés (28 % monofucosrlés). La classe des biantennés représente environ 10 % des
oligosaccharides et n'est jamais fucosylée.
TI n'existe pas pour la GPA chez l'Homme sain d'oligosaccharides neutres c'est-à-
dire non sialylés et les différentes liaisons sialosyles s'établissent en a 2,3 et a 2,6 avec
les seuls résidus Gal des antennes.
La troisième antenne se fixe toujours par une liaison osidyle ~ 1,4 sur le Man 4 du
noyau. TI n'existe donc pas de structure triantennée (tri') ~ 1,2 et ~ 1,6 sur le Man 4' du
noyau. Ceci reflèterait la spécificité de la GlcNAc transférase IV responsable de la
formation des glycannes triantennés de la GPA humaine. La liaison ~ 1,6 sur le Man 4'
serait donc indicatrice des glycannes tétraantennés.

---

-
14 -
III . BIOSYNTHESE DES GLYCANNES (Elbein,1983; Lennarz,
1983; Schachter, 1983.)
La biosynthèse est réalisée dans le réticulum endoplasmique puis dans l'appareil
de Golgi (Figure 10).
Le pentasaccharide de base est d'abord synthétisé sur un intermédiaire lipidique, le
dolichol-phosphate (Dol-P). Au cours de cette biosynthèse, les monosaccharides après
avoir été activés sous forme de glycosyle nucléotides (UDP-GleNAc, GDP-Man) ou
dérivés dolichol-phosphate (Dol - P - Man, Dol-P-Glc) sont transférés sur l'accepteur
lipidique de départ le Dolichol-P pour donner un produit final (contenant le
pentasaccharide de
base)
de formule
brute Glc3 - Man9
- GlcNAc2 -
pyrophosphoryldolichol (figure Il).
Cet oligosaccharide est ensuite transféré du transporteur lipidique sur le résidu
asparaginyle d'un tripeptide Asn - X - Ser (Thr) de la copule peptidique de la GPA
probablement au cours de la synthèse de cette dernière sur les polysomes liés à la
membrane du réticulum endoplasmique (Figure 12). Les trois résidus glucosyles sont
ensuite libérés par des a glucosidases (I et mmembranaires du réticulum endoplasmique
(Elting et al ,1980; Lucocq et al ,1986). L'oligosaccharide résultant Man 9 - GlcNAc 2-
Asn - protéine est ensuite transféré dans l'appareil de Golgi puis hydrolysé par l'a-
mannosidase 1membranaire pour donner le produit Mans - GlcNAc2 - Asn - protéine qui
possède le futur résidu Man 4 du noyau en extrémité non réductrice. TI est cependant
intéressant de noter que des études récentes mettent en évidence, à côté de cette voie
principale, d'autres voies annexes pouvant intervenir dans la régulation de la maturation
des glycoprotéines. Ainsi, une autre mannosidase a été caractérisée par Schweden et al
(1986) et localisée dans les régions du réticulum endoplasmique proches de l'appareil de
Golgi tout comme la glucosidase II . Cette enzyme peut agir sur la structure Man9
GlcNAc2 et lui enlever 3 résidus Man pour donner un oligosaccharide Man6 GlcNAc2 qui
sera transféré dans le Golgi . De même, une endo-a-D mannosidase pouvant suppléer

---

-
15 -
eYTO
Dot-P
001
p
P1
fGtù,
RER
UDP-Gn
,...GDP-F'
r'OP-GtI
SA
1
.
....
t()()c
toœC
HOOC
)
)
)
,
,
..
GO-Gn-",
Gn-"
.... ,
....
•
SA
.., ,'-~AIII
,.HCfi~
1
.-~crt;A'n
Cio-GtI-y
r
Srr -Gan-Go
Gn-./
t c:::::::.tr ...-y
~GOLGI
(
(
:NHa
NH.
Figure 10
Schéma représentant les principales étapes post-traductionnelles
et organites intracellulaires intervenant dans la biosynthèse
des chaînes glycanniques des N.glycosylprotéines d'après Lennarz (1983 )
SA : NeuAe
Ga: Gal
Gn : GleNAc
M: Man
F: Fue
Dol : Doliehol

---

-
16 -
"CORE·GLYCOPROTEIH
Figure Il
R~actions proposées pour la biosynthèse de l'oligosaccharide li~ au
dolichol,contenant le noyau central d'après Elbein ( 1983)

---

..
-
17 -
Glc)Man9GlcNAc2-PP-Ool
rI'rO'OI'
Glc)Man9GlcNAc2-Asn-P,0Iel"
~
~'Glc
~
Man9GlcNAc2-P,0Ieln
~
~ HIGH-MANNOSE
~.......
STRUCTURES
II'
~
MDn
Dn,
•
Man, •
Man'
MonGlcNAc 2-P,otein
Man'
L,..UDP-GlcNAc
Ma",
i
Man
Man'
'ManGlcNAc2-Prol.in
GlcNAc-Man' J
~ 'Man
Man,
, ManGlcNAc 2- P,olein
GleNAc-Ma"
J UDP-GlcNAc
. / UDP-Gal
r CMP·NeuNAe
j
NeuNAc-Gal-GlcNAc-Man,
,ManGlcNAC2- P,olel"
NeuNAc-GDI-GlcN~c-Man
Figure 12
Etapes de maturation des chaînes oligosaccharidiques de type complexe ou
oligomannosidique des N·glycosylprotéines d'après Elbein (1983 )

---

-
19 -
Glc
J.. 1-2 g1ucosidase
_ a 1,2 ~
l
Glc
~al,3~
~ 1-3 g1ucosidase ----. -
Gle
.
I~a1,3~
Man
Man
Man
J.. -Mannosidase l
.. al,2 ~
a1,2 ~ 4:
la1,2 __ -( -Mannosidase l
-...........
Man
Man
Man
---"'a1,2 ~
a1,:S\\+- /al.• .--"'\\-Mannosidase II
Man
Man
/ '
a~
Aloi'
GnT1
wrH".
GnT2
GleNAc
~Ol••
GlcNAc
~
Asn
Figure 13
Niveau d'action des glycosidases ; le transfert du tétradécasaccharide sur le
résidu asparaginyle est suivi d'une déglycosylation séquentielle catalysée par
des enzymes spécifiques
selon Korofeld (1982 )

---

- 20 -
catalyse la fixation d'un résidu GleNAc en J3 1,6 sur le Man 4' du noyau (antenne a 1,6),
étant ainsi à l'origine de la quatrième antenne (Yamashita et al,1985 ). Une activité
GlcNAc-transférase YI a été démontrée in vitro sur des extraits d'oviducte de poule. Elle
permet
la fixation d'une cinquième antenne sur le Man 4' par une liaison J3 1,4
(Brockhausen et al ,1987 ).
L'étape finale de la synthèse de la GPA consiste en son externalisation vers le
secteur extracellulaire à partir de vésicules qui seraient formées dans la partie trans de
l'appareil de Golgi et qui viendraient fusionner avec la membrane plasmique.
IV - ROLE BIOLOGIQUE DE LA COPULE GLYCANNIQUE
Les recherches fondamentales de ces dernières années essaient de déterminer
pourquoi au cours de l'évolution il y a une tendance à la glycosylation des protéines. Ces
glycoprotéines ainsi créées doivent peut-être apporter aux espèces qui les possèdent un
avantage déterminant pour leur survie.
Pour les protéines des liquides extracellulaires, la glycosylation améliore
considérablement la stabilité dans les milieux aqueux. Cest ainsi que pratiquement toutes
les protéines du plasma sanguin sont des glycoprotéines à quelques exceptions près
comme l'albumine sérique.
Pour les enzymes de la digestion, une glycosylation importante assure une
protection contre les protéases car les chaînes glycannes qui s'étalent à la périphérie des
molécules les protègent contre les enzymes protéolytiques. On est souvent étonné de la
grande résistance de certaines glycoprotéines aux protéases.
La présence de résidus sialyles possédant une charge électronégative à l'extrémité
non réductrice de nombreuses chaînes glycanniques des mucines est à l'origine de la
viscosité de ces molécules et de leur pouvoir de combinaison avec la surface de la
muqueuse créant un enduit protecteur résistant aux pH très acides et aux protéases.
La glycosylation des glycoconjugués de membranes joue très certainement un rôle
biologique détenninant. La transformation maligne d'une cellule s'accompagne souvent

---

-
2] -
d'une modification de la composition glycosidique des glycoconjugués de membranes. A
cause de leur grande diversité de forme et d'isomèrie, les structures glycanniques
fournissent certainement de grandes possibilités de combinaisons pour des systèmes de
reconnaissance. On sait que le typage immunochimique de nombreuses bactéries repose
sur les détenninants antigéniques portés par des résidus glycosyles, de même que pour de
nombreux déterminants de groupes sanguins.
v . CATABOLISME ET EPURATION DES GLYCOPROTEINES
Ashwell et al (1974 ) ont mis en évidence le rôle d'un récepteur membranaire de
l'hépatocyte dans l'épuration des glycoprotéines désialylées . Bien que possédant une
forte affinité pour les asialoglycoprotéines et plus particulièrement pour l'asialo-GPA, on
ne sait pas encore si le récepteur d'Ashwell constitue une réalité physiologique dans le
catabolisme de la GPA. La GPA plasmatique désialylée est rapidement fixée par le
récepteur d'Ashwell ou "Hepatic Binding protein" (HBP) puis endocytée pour être
dégradée dans les lysosomes par des osidases et des protéases. Le récepteur HBP qui
reconnait les résidus ~ Gal (mais aussi les résidus cx-D-GalNAc) en position terminale des
antennes des asialoglycoprotéines est en fait une lectine spécifique du galactose
(Baenziger et Maynard, 1980 ). Après fixation de l'asialo-GPA sur le récepteur HBP
plusieurs récepteurs conjugués (asialo-GPA-HBP] se regroupent ce qui provoque un
phénomène d'internalisation d'une vésicule d'endocytose qui amène l'asialoglycoprotéine
au lysosome pour être catabolisée. Les récepteurs HBP endocytés avec les
asialoglycoprotéines disparaissent ainsi de la surface pour être recyclés (plus de 95 % des
récepteurs HBP sont sur le chemin aller-retour entre la membrane de l'hépatocyte et les
lysosomes). La synthèse ou la régénération de l'HBP est soumise à régulation notamment
à celle de l'insuline qui restaure l'activité des récepteurs chez des rats dont le diabète est
induit par un traitement à la streptozotocine ( Dodeur et al, 1982). Le résidu NeuAc de la
GPA constitue une protection contre la capture hépatique. Une désialylation quelle que
soit son étiologie donne le signal de son élimination par le foie {Neufeld et Ashwell ,1979;

---

- 22 -
Weigel, 1980). La demi-vie de l'asialo-GPA est de l'ordre de 2 minutes tandis que celle
de la glycoprotéine native est d'environ 27 heures (Van Rijk et Van Den Hamer ,1976 ).
La capture de l'asialo-GPA par l'HBP est saturable et compétitive avec les autres
asialoglycoprotéines. Ceci a permis à Marshall et al ( 1974) de développer une méthode
de dosage non spécifique des asialoglycoprotéines.
L'HBP est aussi une glycoprotéine sialylée de type complexe. La désialylation de
l'HBP en dévoilant les résidus Gal de ses antennes entraîne son inactivation probablement
par autofixation des résidus Gal démasqués sur le site spécifique du récepteur.
VI • VARIATIONS STRUCTURALES DE L'al·GLYCOPROTEINE
ACIDE
L'hétérogénéité de la GPA a été décrite pour la première fois dans les années 1960
par Schmid et al ( 1962) . Elle se situe à deux niveaux.
- au niveau de la copule peptidique, elle correspond à des variations ponctuelles
d'acides anùnés encore dénommées "variants".
- au niveau de la copule glycannique, l'étiologie est beaucoup plus complexe
puisqu'elle fait intervenir la régulation des nombreuses glycosyltransférases impliquées
(environ 30 ont été répertoriées).On parle alors de " glycoformes" .
. Variations portant sur le nombre de glycannes
Chaque site de glycosylation d'une N-glycosyl-protéine est défini par la séquence
Asn - X - Ser (Thr) ; cependant, tous les sites jX)tentiels peuvent ne pas être glycosylés et
il est fort probable que l'activité de l'enzyme de glycosylat.ion soit modulée par
l'environnement du site et la configuration tertiaire de la protéine. Ainsi, les deux sites de
glycosylation (Asn 293, Asn 311) de l'ovalbumine dénaturée sont glycosylés in vitro
alors qu'in vivo un seul site de la protéine native l'est (Asn 293). La 'Y - glutamyl
transpeptidase synthétisée par le foie sain jX)ssède 4 chaînes glycannes tandis que celle
produite par un hépatome en possèderait 12 (Yamashita et al ,1983 ). La GPA humaine
possède nonnalement 5 chaînes glycannes. Chandrasekaran et al (1984 ) ont cependant

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- 23 -
isolé à partir de métastases de foie une forme légère de 37000 daltons contenant 3 à 4
chaînes et une fonne lourde de 45000 daltons qui en contiendrait de 5 à 6.
. Variation portant sur le degré de ramification des glycannes
La GPA humaine possède 5 sites de glycosylation avec 3 configurations
d'antennes pour chaque site. Le nombre théorique de possibilités structurales pour 5 sites
est donc de 35 soit 243 isotypes différamment antennés.
n existe une technique analytique qui, bien que grossière n'en demeure pas moins
suffisamment sensible pour individualiser des glycoformes présentant un intérêt
physiopathologique : la CIAE-Con A (B~g-Hansen et al ,1975; Bayard et al, 1983 ).
Chez l'individu sain, la proportion entre les différentes glycoformes est
sensiblement constante. Chez l'Homme, au cours de la grossesse ou lors de traitements
par les oestrogènes, on observe en CIAE- ConA une augmentation des formes non
retenues par la ConA (Wells et al ,1981; Raynes ,1982 ). En pathologie, au cours de la
cirrhose, un profil similaire à celui de la grossesse a été décrit pour la GPA humaine
(Wells et al ,1981; Serbource-Goguel et al, 1986). Cette évolution vers des glycoformes
non retenues par la ConA a été constatée pour d'autres glycoprotéines telles que la
transferrine (Spik et al ,1983 ) et l'a2HS (Jezequel et al,1986 ). A l'inverse, au cours de
l'inflammation aiguë, l'augmentation de synthèse en GPA porte essentiellement sur les
glycoformes retenues par la ConA (Nicollet et al, 1986 ).
• Variations portant sur les résidus glycosyles à la périphérie des
glycannes
Les possibilités de variations structurales seront beaucoup plus importantes que
précédemment car l'hétérogénéité pour chaque antenne porte d'une part sur la présence ou
non de résidus NeuAc et Fuc et d'autre part, sur la nature des liaisons sialosyles (a 2,3
ou a 2,6 Gal; a 2,6 GlcNAc) et fucosyles (a 1,3 et a 1,6) . Chez l'Homme sain bien
que le pourcentage global en résidus NeuAc soit constant, il existe des variations
individuelles dans le degré de sialylation de chaque molécule de GPA (Schmid et al,1962)
ou de chaque oligosaccharide (Yoshima et al ,1981 ).

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TECHNIQUES ET MATERIELS UTILISES

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-
24 -
1 • TECHNIQUES IMMUNOCHIMIQUES
A· IMMUNODIFFUSION RADIALE (IDR)
1. Principe
L'immunodiffusion radiale (Mancini et al ,1965) est une méthode quantitative
basée sur la formation d'un complexe antigène-anticorps (Ag-Ac) entre un Ag diffusant
radialement à partir d'un puits de dépôt et l'Ac correspondant d'un immunsérum inclus
dans un gel d'agarose à un certain pourcentage. A l'équilibre de diffusion, le complexe
Ag-Ac apparaît sous la forme d'un cercle de précipitation dont le carré du diamètre est
proportionnel à la quantité d'Ag déposée.
2. Expression Mathématique (Becker .1969
)
L'analyse des différents paramètres après diffusion complète permet d'établir la
relation reliant la surface du cercle de précipitation à la quantité d'Ag déposée.
4 VAg
4
1)2
=-------- CAg + qd2 + ---- p
7tPhT
7t
VAg
volume d'Ag déposé (~l)
CAg
concentration de l'Ag (mg/1oo ml)
P
pourcentage d'IS dans le gel
h
hauteur du gel (mm)
D
diamètre du cercle de précipitation (mm)
d
diamètre du puits de dépôt (mm)
T
titre de l'IS (mg Ag précipité/ml d'IS)
p,q
constantes dépendant du système Ag/Ac et du volume d'Ag
déposé.

---

- 25 -
La droite d'étalonnage J)2 = f (CAg) pennet non seulement de détenniner la
concentration en Ag d'une solution inconnue, mais aussi de calculer le titre d'un IS
connaissant la pente K de cette droite.
4 VAg
4 VAg
K=
--i~~
T = --------
7t PhT
7t PhK
3. TechniQue
Sur un film plastique "Gel Bond Marine Colloids" (Flobio France) découpé aux
dimensions convenables et dégraissé par l'éthanol à 95°, un volume donné d'agarose A37
contenant 1,5 % d'IS de lapin anti-GPA humaine (titre 0,45 mg Ag/ml IS) est coulé sur la
face hydrophile. Après refroidissement, 5 ~ de la solution d'Ag sont déposés dans les
puits ménagés dans le gel puis mis à diffuser 48 heures en chambre humide à température
ambiante. A l'équilibre de diffusion, la plaque est séchée par deux compressions
successives de 5 minutes avec 5 épaisseurs de papier fIltre, lavée deux fois 15 minutes par
une solution de NaCI 0,15 M puis séchée.
4. Réyélation et lecture de la plaque
Une fois séchée, la plaque est colorée par une solution de bleu de Coomassie
pendant 15 minutes. La décoloration s'effectue par passages successifs dans des bains de
décolorant. La lecture consiste à mesurer le carré du diamètre (mm2) des différents cercles
de précipitation puis à reporter leur valeur sur la droite d'étalonnage exprimant le carré
des diamètres en fonction des concentrations connues d'une gamme standard de GPA
exprimée en mg/1oo ml.

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- 26 -
B • ELECTROIMMUNODIFFUSION MONODIMENSIONNELLE
(EIDm) (Laurell ,1966.)
1 . Principe
C'est une technique de dosage des protéines plus rapide et plus sensible
que l'IDR. Deux phénomènes interviennent:
- la migration électrophorétique des protéines à pH 8,60 dans un gel
d'agarose à 1 %
- la formation d'un complexe précipitant entre une protéine antigénique et
l'anticorps spécifique correspondant incorporé dans le gel à un pourcentage défini. A
l'équilibre de la migration-diffusion, le complexe Ag-Ac apparait sous forme d'une fusée
de précipitation dont la hauteur est proportionnelle à la quantité d'Ag.
2· Technique
L'agarose A 37 contenant 1 % d'IS de lapin anti-GPA humaine (titre
0,45 mg Ag/ml IS) est coulé sur un film plastique (cf IDR chap. A - paragraphe 3). La
plaque est ensuite transférée sur un support de migration électrophorétique réfrigéré. Le
contact avec le tampon véronal pH 8,60 24 mM présent dans les compartiments anodique
et cathodique est assuré par 5 épaisseurs de papier Whatman nO 1. L'Ag est ensuite
déposé dans les puits correspondant du côté cathodique sous un volume de 5 ~l et sous
faible voltage (2,5 VIcm) pour éviter la diffusion latérale. La migration vers l'anode est
effectuée sous 10 Vlcm pendant 4 heures. La plaque est ensuite lavée, séchée et colorée
(cf IDR chap.A - paragraphe 4). En principe, la surface du pic est proportionnelle à la
quantité déposée. On peut en première approximation assimiler les surfaces aux hauteurs
des pics à condition que le coefficient de proportionnalité soit identique pour tous les
pics. Cette condition étant vérifiée, la hauteur de chaque pic est mesurée en mm. Une
gamme étalon déposée sur la même plaque et sous le même volume permet de relier la
hauteur à la concentration antigénique (mg/ml).

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-
27 -
C • ELECTROIMMUNODIFFUSION MONODIMENSIONNELLE
(EIDm) EN QUINCONCE. (Golovtchenko et al, 1972)
1. Principe
L'électroimmunodiffusion monodimensionnelle en quinconce est une méthode
très sensible, semi-quantitative, surtout utilisée pour analyser une ou plusieurs protéines
au cours d'une purification. Elle se déroule en deux étapes :
- la première étape consiste en une diffusion des différentes protéines dans un
gel
d'agarose sans IS.
- la deuxième étape, peu différente de l'EIDm, consiste en une migration
électrophorétique dans un gel d'agarose contenant un IS antiprotéines totales et/ou un IS
monospécifique. Si rIS est polyspécifique, plusieurs protéines peuvent être identifiées et
une éventuelle impureté détectée.
La révélation par un IS spécifique permet par comparaison des pics de déceler
la protéine recherchée dans les différentes fractions d'un éluat de chromatographie analysé
et de procéder à leur regroupement
2. Technique
Dans un gel d'agarose sans IS (Figure 14.) coulé sur un film plastique, des
puits sont ménagés en quinconce dans lesquels sont déposés les échantillons à analyser (5
JlI). Après diffusion pendant 90 minutes dans une chambre humide à température
ambiante, une bande de 2,5 cm de large du gel précédent correspondant à la zone de
diffusion protéique est transférée à l'extrémité cathodique d'un nouveau fIlm plastique de
10 cm de hauteur. Un gel d'agarose à 1 % contenant un IS anti-GPA humaine et/ou
antiprotéines totales est ensuite coulé sur la partie libre anodique du film plastique. Puis
une tension de 2,5 V/cm est appliquée pendant 18 heures. La plaque est ensuite lavée,
séchée et colorée (cf. IDR A - paragraphe 4).

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- 28 -
o
o
o
0
o
0
G
o
o
o
0
C
0
o
e ®
Figure 14
Electroimmunodiffusion monodimensionnelle en quinconce
a) gel de diffusion
b) gel contenant un immunsénun antiprotéines totales ou monospécifique

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- 29 -
D • REACTIFS POUR IDR, EIDm, EIDm en quinconce
• Gel d'a2arose
C'est une solution d'indubiose A 37 (Industrie Biologique Française) à 1 %
dans du tampon véronal pH 8,60 24 mM, obtenue par dissolution à chaud dans un bain-
marie bouillant. Le gel est ensuite réparti dans des tubes en verre et conservé à +4°C en
présence d'azoture de sodium 0,1 %.
• Tampon yéronal pH 8.60 24 mM force ionique 0.02
Véronal
4,3 mM
1,60 g (PM 184,20)
Véronal sodique
19,6 mM
8,24 g (PM 210,08)
Azoture de sodium
1,5 mM
0,20 g (pM 65
)
Eau distillée
qsp
2000 ml
• Colorant bleu de Coomassje 0.5 %
Bleu brillant de Coomassie (G 250 Serva)
5g
Ethanol à 95°
450 ml
Acide acétique pur
100 ml
Eau distillée
450 ml
• Décolorant
Ethanol à 95°
450 ml
Acide acétique pur
100 ml
Eau distillée
450 ml
E • IMMUNOAFFINOELECTROPHORESE CROISEE EN PRESENCE
DE CONCANAVALINE A (CIAE·ConA)
Cest une approche qualitative qui repose sur une technique immunochimique
en présence d'une lectine : la concanavaline A (Con A). La Con A présente une affinité
pour les résidus a-D-glucopyranosyle, a-D-mannopyranosyle et ~-D-fructofuranosyle
possédant les fonctions alcool 3, 4, 6 libres et en position équatoriale. En ce qui concerne

---

- 30 -
les N-glycannes, seules les structures possédant au moins deux résidus Man libres ou
seulement substitués en C2 seront fixés par la lectine. li en résulte pour les glycannes de
type complexe de la GPA une reconnaissance des structures biantennées classiques et à
l'opposé, une non-reconnaissance des structures tri et tétraantennées. Précisons cependant
que certaines structures biantennées moins orthodoxes ne sont pas reconnues (par
exemple, lorsque les résidus GlcNAc 5 ou 5' ou Man 3 sont substitués par des résidus
NeuAc ou Fuc ou GlcNAc).
1. Principe
L'électroimmunodiffusion bidimensionnelle (EIDb) décrite par Laurell (1966)
puis par Weeke (1973 ) est une technique faisant intervenir deux migrations
électrophorétiques successives dans un champ électrique (Figure lS ).
- La première est une électrophorèse de zone dans un gel d'agarose dépourvu
d'ISo
- La deuxième, perpendiculaire à la première est une électro- immunodiffusion
dans un gel contenant 1'IS spécifique de la protéine à étudier ou un IS ami-protéines
totales. En 1975, Bog-Hansen et al ont présenté une technique d'EIDb par affmité qui par
rapport à l'EIDb classique présente quelque~ modifications. Il s'agit de l'immuno-affino-
électrophorèse croisée en présence d'une lectine: en général, la concanavaline A (CIAE-
Con A).
a) En CIAE-ConA, la première migration est une électrophorèse d'affinité
vis à vis de la ConA incluse dans le gel de 1ère dimension à une concentration saturante.
En effet, la ConA est une lectine qui se lie par interaction biospécifique aux résidus a-D-
mannopyranosyles des glycannes des glycoprotéines. Son affmité pour ces résidus
d'une part, la teneur et/ou l'accessibilité de ceux-ci dans une glycoprotéine, d'autre part
conduisent à la séparation de différentes glycoformes .
b) La deuxième migration électrophorétique perpendiculaire à la première
réalisée en présence d'un monosaccharide compétiteur l'a-D-méthyl-gluco ou manno-
pyranoside et d'un IS spécifique, permet la dissociation des complexes "glycoprotéine-

---

-
31 -
+'
deuxi~me
~Jectroph~se
o
(
+
première ~Jectrophorèse
Figure IS
Immunoaffinoélectrophorèse croisée en présence de concana\\'aline A
a) gel de 1è électrophorèse en présence de ConA
b) gel de 2è électrophorèse contenant l'anticorps, l'a-D-méthyl-
glucopyranoside, le PEG 6000 et l'immunsérum

---

- 32 -
ConA" et la révélation des différentes glycoformes sous forme d'immuncomplexes
précipités.
La CIAE est d'abord qualitative et éventuellement semi-quantitative à condition
de déposer dans un des puits une quantité connue de la glycoprotéine étudiée et
d'interpréter les profils par rapports à ce témoin. Son intérêt sera donc d'alerter sur
d'éventuelles modifications des glycoformes d'une glycoprotéine au cours de différents
processus physiopathologiques.
2. Technique
2.1. ElectroDhorèse dans la Dremière dimension
Sur un film plastique (Gel Bond) de 10 x 10 cm, 15 ml de gel d'agarose à 1 %
sont coulés (Figure 16). L'équivalent de 13,50 ml est retiré et remplacé par le même
volume de gel d'agarose 1 % contenant 0,075 % de ConA soit 10,12 mg préalablement
dissous dans 300 J.Ù d'une solution de CaCIz ImM, MgClZ ImM et
MnClz ImM. De cette façon, les deux côtés latéraux de la plaque ne contiennent pas de
ConA. Les puits qui y seront ménagés recevront un mélange de sérum albumine bovine
(SAB) et de bleu de bromophénol. Ce mélange servira de témoin de migration. Des puits
distants de 1,5 cm sont réalisés dans le gel contenant la ConA dans lesquels sont déposés
4 J.Ll d'échantillon à environ 300 J.Lg/ml de GPA humaine. La migration électrophorétique
est effectuée dans le tampon Tris72 mM-Véronal 24 mM pH 8,60 sous une tension de
9VIcm pendant 90 minutes.
2.2. ElectroDhorèse dans la deuxième dimension
Le gel de la 1è migration est découpé en bandes de 1,5 x 10 cm qui sont
transférées séparément sur d'autres films de Gel Bond 10 x 10 cm. Chaque bande est
placée sur le second Gel Bond de façon à ce qu'on puisse couler 12 ml de gel d'agarose à
1 % contenant 2 % de PEG 6000, 0,5 % d'IS anti-GPA humaine.

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- 33 -
b
1
1
a
1
1
a
b
q
0
0
0
0
0
0 0'
e
Figure 16
Electrophorèse dans la l è dimension
a) gel contenant 0,075 % de ConA pour la migration des échantillons
( solution de GPA à 300J,Lg/ml, volume de dépôt: 5J.Ù )
b) gel SeIVant de témoin de migration contenant le bleu de bromophénol
et la sérumalbumine bovine

---

- 34 -
(T =0,45 mg/ml) et 4 % d'a-D-méthyl-glucopyranoside (Figure 17). La migration
électrophorétique est réalisée en 18 heures à 2,5 V/cm dans un tampon Tris 72 mM-
Véronal24mM pH 8,60.
2.3. Révélation el lecture des »Iagues
Après la révélation des pics par le bleu de Coomassie (cf. A. paragraphe 4), la
surface de chaque pic est mesurée par planimétrie (planimètre A Ott Kemplen Bayern),
puis comparée à la surface totale, ce qui permet de défmir le pourcentage du pic.
3. Réactifs
* Gd :Agarose Type II Médium EEO réf. A 6877 Sigma
* Tampon de mi&ratjon :
Tris
72
mM
8,7g
(PM = 121)
Véronal
·24
mM
4,4g
(PM = 184)
Lactate de calcium
0,4 mM
0,12g
(pM =308)
Azoture d~ sodium
0,2 mM
O,Olg
(PM = 65)
Hel
qsp
pH 8,60
Eau distillée
qsp
1000 ml
* CQncanayaline A (ConA> lliF-LKB lot nO 54 322
* Tampon pour djssoudre la ConA
MgC12
1mM
0,203 g
(PM =203)
MnC12
1mM
0,198 g
(PM = 198)
CaCl2
1mM
0,147 g
(PM = 147)
Eau distillée
qsp
1000 ml
* Polyéthylène &Iycol 6000 (PEG 6(00)
Fluka
* a·D.méthyl.glucopyranoside
Sigma
* Immunsérum antj.GPA humaine préparé au laboratoire
(titre 0,45 mg/ml)

---

- 35 -
+ Ac anti-al-GPA
gel
b
+ a- méthylglucopyranoside
+ .PEG6000
DEPOT
e
gel neutre
c
1ère electropborèse
•
8
Figure 17
Electrophorèse dans la 2è dimension
a) gel contenant la ConA (Iè dimension)
b) gel d'agarose contenant le PEG 6000 (2 %) et l'IS anti-al-glycoprotéine
acide humaine (0.5 %) et l'a-D-méthyl glucopyranoside
c) gel neutre

---

- 36 -
II • ELECTROPHORESE EN GEL DE POLYACRYLAMIDE
(Laemmli ,1970)
1. Principe
C'est une électrophorèse utilisée pour individualiser les protéines d'un milieu en
fonction de leur masse moléculaire apparente. Le gel forme en effet une sorte de fIlet dont
les mailles retardent les molécules en fonction de leur taille. Avec le gel de
polyacrylamide, la dimension de ces mailles peut être choisie grâce à une variation du
degré de polymérisation du gel. Dans l'électrophorèse en gel de polyacrylamide réalisée
en présence de sodium dodécyle sulfate (SOS), les protéines présentent une charge
semblable par unité de masse et par conséquent leur
migration est inversement
proportionnelle à leur poids moléculaire.
2 . Préparation des eels
Préparation du gel de migration
Pour des gels de 1,5 mm d'épaisseur:
Acrylamide (solution mère)
34 ml
Tampon de séparation Tris/HCl
0,75 M pH 8,80
38 ml
1EMEDl%
2,4 ml
Dégazer
SDS2%
4 ml
Dégazer
Persulfate d'ammonium 1%
3,4 ml
Laisser polymériser le gel de migration après l'avoir coulé dans le moule en
prenant soin de mettre une couche de butanol saturé d'eau à la surface du gel dans le
moule. La polymérisation se fait à température ambiante pendant 30 minutes à 1 heure.
Après la polymérisation le butanol est enlevé avec du papier filtre et la surface du gel
rincée avec la solution de lavage dont la composition est la suivante :

---

- 37 -
Solution de 'ayaee du eel
Tampon pour le gel de compression 0,25M pH 6,80
5
ml
TEMED 1 %
0,5 ml
Persulfate d'ammonium 1 %
0,4 ml
SDS 2 %
0,5 ml
Eau distillée
3,6 ml
Après la polymérisation du gel de migration, le gel de compression est
coulé au dessus. Sa polymérisation est effective au bout de 30 minutes à 1 heure à
température ambiante.
Préparation du gel de compression
Pour un gel de 1,5 mm d'épaisseur
Acrylamide (solution mère)
28 ml
Tampon pour le gel de compression 0,25 M pH 6,80
10 ml
TEMEDI %
Iml
2g .
Saccharose
.Dégazer
SDS2%
Iml
Dégazer
Persulfate d'ammonium 1 %
0,8 ml
Un peigne est disposé sur le moule avant de couler le gel de compression.
Après la polymérisation du gel, le retrait du peigne laissera une empreinte qui servira de
puits de dépôt pour les échantillons. Une couche de butanol saturé d'eau est mise à la
surface du gel comme dans le cas précédent. Les puits sont rincés avec le tampon
d'électrophorèse.

---

- 38 -
Préparation du tampon de dilution des échantillons
SDS 10 %
0,6 ml
Tampon TrislHCl
2M
pH 6,80
0,2 ml
Bleu de bromophénol 0,01 % (v/v)
0,12 ml
Glycérol 60 % (v/v)
100 ml
Mercaptoéthanol
0,3 ml
3 • Préparation des échantillons
Les manipulations sont effectuées à 4°C. Pour un mélange de protéines 4 à
20 Jlg sont mis par dépôt. Pour une protéine purifiée 0,4 à 2 Jlg sont déposés par puits.
Dans de petits godets plastiques on introduit l'équivalent de 100 JlI au total d'un mélange
de la protéine en solution et du tampon de dilution des échantillons. Soit 62 JlI de la
protéine en solution dans du tampon Tris-HCl 10 mM pH 7,40 et 38 III de tampon de
dilution des échantillons. Le mélange est alors porté au bain-marie bouillant pendant 3 à 4
minutes. L'étanchéité est assurée par du ruban adhésif.
4· Mieration électrophorétigue
Le bac anodique de la cuve d'électrophorèse est rempli par le tampon
d'électrophorèse. La bac cathodique est monté sur le moule. Dans les puits ménagés, une
prise d'essai de 80 JlI est déposée. Les puits sont remplis avec précaution par le tampon
d'électrophorèse à l'aide d'une pipette Gilson P 1000. Les puits sont remplis
individuellement jusqu'à ce qu'il y ait une jonction entre deux puits contigus. Puis le bac
cathodique est rempli avec le tampon de l'électrophorèse. On travaille avec une intensité
de courant constante de 80 mA et une tension de 70 volts. La migration dure entre 180 et
210 minutes à température ambiante avec un réfrigérant et est réalisée dans une cuve LKB
référence 2001-001.
5 • Coloration du eel
Après la migration, le gel est démoulé délicatement puis immergé dans une
solution pour être fixé. La fixation est effectuée à température ambiante toute une nuit

---

- 39 -
* Solution de fixation
Méthanol dénaturé 30 % (v/v)
300 ml
Anhydride trichloroacétique 10 % (plv)
100 g
Acide acétique glacial 10 % (vlv)
100 ml
Eau distillée
qsp
1000 ml
La coloration est réalisée dans un bain de coloration pendant une heure.
* Colorant bleu de Coomassie
Méthanol dénaturé
450 ml
Acide acétique
100 ml
Bleu de Coomassie 0250 (Serva)
2,5 g
Eau distillée
450 ml
La décoloration du gel se fait par passages successifs dans des bains de
décolorant sous agitation a température ambiante.
* Solution de décoloration
Méthanol
450 ml
Acide acétique
90 ml
Eau distillée
qsp
1000 ml
6 • Réactifs
* Solution mère d'acrylamide
Acrylamide (Serva)
22g
(PM 71,08)
N,N'-méthylène bisacrylamide (Serva)
0,6 g
(PM 154,20)
Eau distillée
qsp
100 ml
Conservation à +4°C
* Tampon de séparation Tris/Hel 0,7S M pH 8,80
Tris
0,75 M
45,5 g
(PM 121 )
Acide chlorhydrique
qsp
pH 8,80
Eau distillée
qsp
500ml

---

- 40 -
• Tampon TrisIHCI 2M pH 6,80
Tris
2M
24,2 g
(PM 121)
Acide chlorhydrique
qsp
pH
6,80
Eau distillée
qsp
100 ml
• Tampon pour le gel de compression TrislHCI 0,25 M pH
6,80 (" stacking" gel)
Tris
0,25 M
3,02 g
(PM 121)
Acide chlorhydrique
qsp
pH
6,80
Eau distillée
qsp
100 ml
• Persulfate d'ammonium 1%
Persulfate d'ammonium (Serva)
1 g
(PM 228,2)
Eau distillée
qsp
100 ml
• Tétraméthyléthylènediamine ( TEMEO ) 1%
TEMEO(LKB)
1ml
Eau distillée
qsp
100 ml
• Sodium dodécyle sulfate (SOS) 2%
SOS (Prolabo)
2g
(PM 288,38)
Eau distillée
qsp
100 ml
• Sodium dodécyle sulfate ( SOS) 10%
SOS (Prolabo)
10 g
(PM 288,38)
Eau distillée
qsp
100 ml

---

- 41 -
• Tampon d'électrophorèse Tris-Glycine 0,25 M pH 8,30
Tris
0,25M
3,02 g
(PM 121)
Glycine
0,20M
14,40 g
(PM 75)
SDS
1 g
(PM 288,38)
Eau distillée
qsp
1000 ml
• Tampon Tris 1 HCI 10 mM pH 7,40
Tris
10 mM
0,12 g
(PM 121)
Eau distillée
qsp
100 ml
Acide chlorhydrique
qsp
pH 7,40
Conservation à 40 C
III • PURIFICATION DE L'al·GLYCOPROTEINE ACIDE
PAR CHROMATOGRAPHIE D'IMMUNOAFFINITE
A - OBTENTION DE l'IMMUNSERUM ANTI-a.l GLYCOPROTEINE
ACIDE HUMAINE
Les animaux choisis sont des lapins de race Bouska. Chaque lapin est immunisé
selon le protocole suivant:
P
.,
. .
t-
remlere ID lec Ion
- 100 J.Ù de GPA humaine désialylée.
- 1 ml d'adjuvant complet de Freund.
- NaCIO,15 M QSP 2 ml.
Bien homogénéiser dans un bain de glace jusqu'à obtention d'une émulsion stable
puis injecter: 1 ml en multiinjections intradermiques dans les flancs de l'animal, 0,5 ml en
sous-cutané au niveau de l'épaule, 0,5 ml en sous-cutané dans la patte postérieure.
Rappel:
Un mois après la première injection, un rappel est effectué selon le même protocole
avec la moitié de la dose dans de l'adjuvant incomplet de Freund.

---

- 42 -
A partir de la 7ème semaine après la 1ère injection, des prélèvements réguliers sont
effectués tous les 7 jours pour analyser l'importance et la spécificité de la réponse immune
et déterminer le titre en Ac par des méthodes immunochimiques : immunodiffusion
d'Ouchterlony et IDR de Mancini. Lorsque le titre en Ac est suffisant, environ 60 ml de
sang sont prélevés à la veine marginale de l'oreille tous les 10 jours. Le sérum additionné
de 10 % de glycérol est conservé à -20°C avant d'être purifié par chromatographie
d'immunoaffinité.
B - PURIFICATION DES ANTICORPS SPECIFIQUES ANTI-al-
GLYCOPROTEINE ACIDE PAR CHROMATOGRAPHIE
D'IMMUNOAFFINITE
Les Ac spécifiques sont isolés par chromatographie d'immunoaffinité d'un
immunsérum de lapin anti-GPA humaine après vérification de la pureté et de la spécificité
selon les techniques précédemment décrites. Le titre en Ac est déterminé par IDR selon la
formule (Becker, 1969).
4 VAg
T=
1t PhK
VAg
volume Ag déposé (Ill)
P
pourcentage d'IS dans le gel
h
hauteur du gel (mm)
K
pente de la droite d'étalonnage (mm2/mg pour 100 ml)
Le titre est exprimé en mg d'Ag neutralisé par ml d'immunsérum.
1 - Généralités
La chromatographie d'immunoaffinité est une méthode de purification
basée sur la réaction spécifique des Ac avec un Ag préalablement insolubilisé
(immunoadsorbant). Le complexe Ag-Ac (phase insoluble) est ainsi facilement séparé du

---

- 43 -
reste des protéines (phase soluble). 11 est lavé pour éliminer toutes les protéines
contaminantes non spécifiquement fixées, puis traité par un milieu dans lequel le
complexe Ag-Ac est dissocié et les Ac récupérés.
Ce procédé demande donc la préparation préalable des immunoadsorbants.
La méthode la plus simple est l'immobilisation des Ag sur un support insoluble
préalablement activé. Ces groupements introduits après traitement avec un agent chimique
sont capables de fixer par liaisons covalentes les protéines secondairement ajoutées (Axen
et al, 1967; Temynck et al, 1972; Temynck et al, 1976 ).
Les supports utilisés sont en général des gels d'agarose ou de
polyacrylamide à l'origine préparés pour la fùtration moléculaire.
Les agents de couplages utilisés sont:
- soit la glutaraldéhyde qui réagit par l'une de ses fonctions aldéhydes avec
les groupements amides du polyacrylamide (Guesdon et al, 1976; Temynck et al, 1972;
Temynck et al, 1976) où les groupements aminés introduits dans le gel d'agarose, la
deuxième fonction restant libre pour réagir avec les groupements aminés des protéines.
- soit le bromure de cyanogène qui réagit avec les groupements hydroxylés
de l'agarose (Axen et al ,1967), les transfonnant en groupes actifs capables de réagir avec
les groupements aminés des protéines en formant des liaisons stables.
2 ·Immobilisation de l'al-I:lycoprotéine acide sur polyacrylamide-
al:arose par l'intermédiaire de la I:lutaraldéhyde
2.1. Ac(ivatiQD dU I:~J
L'ultrogel ACA 22 (environ 42 où) est lavé trois fois avec de l'eau distillée
puis une fois avec la solution de phosphate dipotassique 0,1 M pH 7,40. Ce lavage peut
se faire par décantations successives ou plus rapidement par centrifugation dans des tubes
de 50 où (5 minutes à 3000 toUTS/minute ).
- On ajoute 30 où de la solution de phosphate 0,1 M pH 7,40 et 10 ml de
glutaraldéhyde à 25 %.

---

- 44 -
- Le mélange est incubé toute la nuit à 37°C après avoir soigneusement
bouché le tube.
- Après centrifugation, le surnageant est aspiré et le culot lavé par la
solution de phosphate 0,1 M pH 7,40 (50 ml) plusieurs fois jusqu'à ce que l'odeur de la
glutaraldéhyde ait disparu. A ce stade, le gel "activé" peut être conservé plusieurs mois à
4°C dans une solution de glutaraldéhyde à 0,5 % dans la solution de phosphate 0,1 M pH
7,40.
2.2. C21111lal:e dç l'g 1·&lyç2pr2téin~ açide syr le &el adivé
- Au culot de 10 ml de gel activé, sont ajoutées 50 mg de GPA dans 10 ml
de la solution de phosphate O,IM pH 7,40.
- Sur un agitateur rotatif, la suspension est agitée toute une nuit à
température ambiante ou 48h à 4°C. Après centrifugation, on garde le surnageant.
- Le gel est lavé deux fois avec 10 ml de la solution de phosphate 0,1 M
pH 7,40. Nous mesurons l'absorbance ( 280 nm ) sur les deux premiers liquides de
lavage.
- Nous continuons les lavages dans un grand volume (50 ml) jusqu'à ce que
la densité optique à 280 nm soit inférieure à 0,005.
- Une suspension du gel est réalisée dans une solution de glycine 0,1 M
dans le tampon borate "borate buffer saline"(BBS) O,IM pH 8,30 et agitée pendant 2h à
la température du laboratoire ou une nuit à 4°C. Après centrifugation,le culot est lavé une
fois avec du BBS.
- Laver une fois avec le tampon glycine - HCI 0,2 M pH 2,20 NaCI
0,5 M. Le gel est alors neutralisé avec 5 ml de phosphate dipotassique 1 M puis on ajoute
45 ml de BBS.
- Centrifuger et remettre le gel en suspension dans du BBS contenant de
l'azoture de sodium 0,02%.

---

-
45 -
3 • Chromato2raphje d'jmmunoafflnjté pour la préparation des
anticorps
spécifiques antj-al-elycoprotéjne acide humaine
L'immunsérum (environ 50 ml. T =0,45 mg d'Ag/ml) préalablement dialysé
contre du tampon BBS puis filtré sur papier filtre Whatman nO 1 est introduit sur
l'immunoadsorbant (42ml) à température ambiante sous un débit de 20 ml/h. Après un
contact d'au moins 30 mn , l'immunoadsorbant est lavé à 4°C par un volume de gel avec
du BBS contenant du Tween 80 0,5 % (v/v) puis par trois volumes de gel de tampon
BBS sans Tween jusqu'à obtention d'une absorbance nulle à 280 nm en sortie de
colonne. Les Ac anti-GPA retenus sont élués à 4°C par le tampon glycine-HCl 0,2M pH
2,20 NaCl 0,5 M sous un débit de 50 ml/h. L'éluat est immédiatement neutralisé par une
solution de K2HP04 lM à raison de 1 ml pour 4 ml d'éluat. Ce dernier est concentré à
environ 5 mg/ml d'IgG puis congelé.
4 - Résultats
Plusieurs chromatographies d'immunoaffinité ont été successivement
réalisées. Les résultats sont reponés dans le tableau II
TABLEAU fi
Préparation des anticorps anti al-glycoprotéine acide humaine
------------------------------------------------------------------
Capacité
capacité
Activité
introduite (a)
éluée(b)
spécifique(c)
Volume IS
en GPA neutralisable
ml
(mg/ml de gel)
IgG(mg/ml de gel)
GPA neutralisable
Cl
C2
(mg/ml de gel)
mg/mg mole/mole
39
0,29
0,56
0,05
0,10
0,37
41
0,30
0,62
0,07
0,12
0,46
35
0,32
0,83
0,11
0,13
0,50
43
0,26
1.24
0,16
0,13
0,49
36
0,42
1,85
0,40
0,21
0,81
(a) La capacité de neutralisation de 1'IS introduit (mg de GPA neutralisée par ml de
gel) est détenninée par IDR sur 1'IS non purifié: elle correspond à l'expression
suivante:

---

~ 46 -
Schéma général de la purification
des anticorps anti-glycoprotéine acide humaine
IMMUNSERUM
50 ml (f = 0,45 mg/ml)
(20 ml/h)
contact (30 min)
tempérarure ambiante
ACA 22 - GPA humaine
Lavage 4°C
BBS avec et sans tween 800,5 % (20 ml/h)
EXCLU
RETENU
1Elution 4°C
t Tampon Glycine -HCl 0,2 MpH 2,20,NaCI 0,5M
ELUAT
! neutralisationK2HP041M
(1 volume pour 4 volumes d'éluat )
Dialyse, concentration, congélation - 20°C

---

-
47 -
Volume IS (ml) x Titre en IDR (mg d'Ag/ml d'IS) mg de GPA neutralisé
----------------------------------------------------------- == -------------------------
volume de gel (ml)
ml de gel
(b) La capacité éluée est exprimée:
- Soit en mg d'IgG éluée par ml de gel à partir de l'absorbance à 280 nm et du
coefficient d'extinction spécifique des IgG.
e 1%0 à 280nm = 1,4 g -1 1+1 cm -1
- Soit en mole de GPA neutralisable par ml de gel calculée après détennination
du titre en en Ac de l'éluat par IDR et application de la formule.
T (mg d'Ag neutralisable/ml d'éluat) x volume d'éluat (ml)
volume de gel (ml)
(c) L'activité spécifique (AS) peut s'exprimer de deux façons:
- soit par le rapport du titre en IDR sur la concentration en IgG.
Titre en IDR
mg d'Ag neutralisé en IDR/ml d'IS
mg d'Ag neutralisé en IDR
------------- = ----------------------------------------- = -----------------------
[lgG]
mg IgG/ml d'IS
mg d'IgG
- Soit en mole de GPA neutralisée/mole d'IgG en prenant pour masse
moléculaire pour la GPA 40 ()()() et pour les IgG 150000.
s. Matériels et réactifs
• TampoQ bQrate O.lM pH 8.30 NaCI 0.5 M (BBS)
Acide borique
O.IM
6,18
PM: 61,8
Tétraborate
0.025 M
9,54 g
PM: 381,87
de sodium 10H20
NaCl
0.5M
29 g
PM:58
HCI
QSP
pH 8,30
H20
QSP
1000 ml

---

- 48 -
• Tampon elycine HCI 0.2 M pH 2.20 NaCI 0.5 M
Glycine
O.2M
15 g
PM:75
NaCI
O.5M
29 g
PM :58
HCI
QSP
pH 2,20
H20
QSP
1000 ml
• Tampon borate 0.1 M pH 8.30 NaCI 0.5 M. Tween 80 0.5 %
(BBS Tween 80l
Tween 80
5ml
BBS
QSP
1000 ml
• Phosphate djpotassjgue 1 M
K2HP04
lM
174 g
PM 174
H2Û distillé
QSP
1000 ml
• Phosphate djpotassjgue 0.1 M
solution de phosphate dipotassique lM
100 ml
H2Û distillée
QSP
1000 ml
• ImmuDoadsorbant :
préparé au laboratoire comme précédemment décrit, il est constitué par
de la GPA humaine couplée par de la glutaraldéhyde sur un polymère d'acrylamide-
agarose : ACA 22 Institut Biologique Français selon la technique de (femynck et al
1972 )
• Colonne Pharmacia®
C 16/40.
C - PURIFICATION DE L'al-GLYCOPROTEINE ACIDE
D'UN LIQUIDE
BIOLOGIQUE PAR CHROMATOGRAPHIE D'IMMUNOAFFINITE
1. Prjncjpe
La purification de la GPA présente dans un liquide biologique quelconque
s'effectue par chromatographie d'immunoaffinité à partir d'un immunoadsorbant préparé
à partir des Ac préalablement purifiés (Cf. paragraphe B chapitre 3).

---

- 49 -
2. Couplaee des anticorps anti- ql-e1ycoprotéjne acide au
Sépharose 4 B actiyé par le bromuq: de _cyanoeène(Axfn et al.1972)
Le bromure de cyanogène (CNBr) est un produit dangereux et instable; il
est préférable d'utiliser le Sépharose activé disponible dans le commerce et prêt à l'emploi
pour la fixation des protéines.
Les Ac anti-GPA humaine purifiés sont couplés selon les indications du
fabricant sur un suppon de Sépharose 4B activé au CNBr (Sépharose 4B CNBr
Phannacia ® ).
2.1. Mode 2pérDtoire (pour 1 1: de Sépharose 48 activé)
a) Faire gonfler 1 g de Sépharose 4 B activé dans 20 ml de Hel 0,001 N
(on obtient alors un volume de gel d'environ 3 ml).
b) Laver avec HCI 0,001 N par filtration sur verre fritté. Le temps total de
contact avec HCI 0,001 N ne doit pas dépasser 15 min. Puislaver le gel par le tampon de
couplage Tris-HCI 0,2 M pH 8,20 NaCI 0,5 M.
c) Le gel gonflé est ensuite immédiatement mis en suspension dans 5 ml
environ de la solution de protéines à 2 - 3 mg/ml dans le tampon Tris - HCI 0,2 M pH
8,20 NaCI 0,5 M.
d) Puis la préparation est agitée sur un agitateur rotatif 2H à la température
du laboratoire (il faut 2 volumes de tampon Tris - HCI 0,2 M pH 8,20 NaCI 0,5 M
pour 1 volume de gel humide) puis 24H à + 4°C.
e) On procède ensuite à 10 lavages par 2 volumes de gel avec le tampon
Tris-HCL 0,2 M pH 8,20 NaCL 0,5 M.
L'extinction à 280 nm est prise sur les deux premiers liquides de lavage pour
calculer le rendement du couplage.
f) Détermination de la quantité d'anticorps anti-GPA fixés sur le gel:
l'absorbance à 280 nm de l'ensemble des lavages (volume v) est divisée par le coefficient
d'extinction des protéines (1,4 pour une solution d'IgG à 1 mg/ml) puis multipliée par le
volume v. on obtient alors la quantité de protéines non fixées y.

---

- 50 -
Connaissant la quantité x de protéines initialement mise en contact avec le volume
connu du gel, on détermine la quantité de protéines (Ac anti-GPA) fixée par ml de gel par
l'équation suivante:
x - y
volume de gel
g) Les groupements réactionnels CNBr en excès sont neutralisés par une
solution d'éthanolamine 1 M pH 8,0 (2 volumes/1 volume de gel) par incubation 2h à
température ambiante sous agitation rotative.
h) Le gel est lavé alternativement 4 fois par 2 volumes de gel avec le tampon
acétate 0,2 M pH 4,0 NaCI 0,5 M et le tampon Tris-HCl 0,2 M pH 8,20 NaCI 0,5 M.
i) L'immunoadsorbant est conservé à 4°C en présence d'azoture de sodium à
0,1 %.
2.2. Résultats
Volume de gel: 32 ml
IgG mises en contact du gel 136 mg
IgG couplées environ 136 mg soit un rendement p d'environ 100 %
La capacité théorique de neutralisation en GPA par les IgG couplées peut être
calculée à partir du titre (T) en Ac selon l'IDR (on suppose que le titre T en Ac est
conservé lors du couplage).
Capacité théorique: T IDR de l'IgG à coupler x volume* x p couplage
mg d'Ag x ml IS
==
--------------------
mllS
soit 0,354 x 60 x 0,996 # 21 mg de GPA neutralisables par les
IgG couplées.
ou encore en divisant par 32 =0,66 mg de GPA neutralisable par ml de gel
* Volume: volume d'lgG mis à coupler.

---

-
51 -
3. ChromatOl:raphje d'jmmunoaffinjté pour la purification de l'qI-
1
,.
'd
h
'
1: ycoproteme aCI eumame
• Equilibrage de la colonne
La colonne contenant l'immunadsorbant est équilibrée en tampon Tris-HCl
0,2 M pH 8,20 NaCI 0,5 M avec 1 à 2 volumes de colonne. Le débit est fixé à 40 ml/h.
Cette opération est effectuée à température ambiante.
• Introduction de l'échantillon
L'échantillon préalablement dialysé contre un tampon Tris-HCI 0,2M pH 8,20
NaCI 0,5 M puis filtré sur papier filtre (Whatman n°l) est introduit sur la colonne
contenant l'immunadsorbant sous un débit de 20 ml/h de telle sorte que le temps minimum
de contact entre l'échantillon et l'immunoadsorbant soit de 30 min.
• Lavages
L'immunoadsorbant est placé à 4°C puis lavé par le tampon Tris-HCI 0,2 M
pH 8,20 NaCI 0,5 M (environ 1 volume de colonne). On lave ensuite par 2 à 3 volumes
de colonnes avec le même tampon contenant du Tween 80 0,5 % .Le débit ici est de 40
ml/h. Le lavage est achevé après avoir passé. 10 volumes de colonne de tampon Tris-HCl
0,2 M pH 8,20 NaCI 0,5 M.
• Elution
L'élution est réalisée à 4°C par le tampon glycine-HCl 0,2 M pH 2,60 sous
un débit de 40 ml/h. L'élution est suivie sur un détecteur-enregistreur ISCO model UA45
à 280 nm. L'éluat est immédiatement neutralisé par une solutio.n de K2HP04 1 M à
raison de 1 ml pour 4 ml d'éluat.
· Concentration et dialyse
Au tenne de l'élution,le volume est noté et une mesure de l'adsorbance de la
solution de GPA est effectuée à 280 nm. L'éluat est ensuite concentré 10 fois sous vide
partiel dans un vase de Martin puis dialysé toujours à 4°C, 3 fois 4h contre un minimum
de 100 volumes d'eau distillée à chaque dialyse.

---

- 52 -
Le dialysat est ensuite centrifugé et le surnageant lyophilisé.
. Régénération de la colonne
A la fin de la chromatographie d'immunoaffinité, l'immunoadsorbant est
régénéré par :
2 volumes de colonne de tampon glycine - HCI 0,2 M pH 2,20 NaCI 0,5 M.
3 volumes de colonne de tampon Tris-HCI 0,2 M pH 8,20 Tween 800,5 % .
3 volumes de colonne de tampon acétate 0,1 M pH 4,0 NaCI 0,5 M
3 volumes de colonne de tampon Tris - HCI 0,2 M pH 8,20 NaCI 0,5 M.
Le débit ici est de 40 ml/h.
. Conservation de l'immunoadsorbant
L'immunoadsorbant en dehors des périodes d'utilisation est conservé dans le
tampon Tris-HCl 0,2 M pH 8,20 NaCI 0,5 M contenant de l'azoture de sodium 0,1 %.

---

- 53 -
SCHEMA GENERAL DE LA PURIFICATION DE L 'al-GLYCOPROTEINE
ACIDE HUMAINE DANS UN LIQUIDE BIOLOGIQUE
LIQUIDE BIOLOGIQUE
Introduction température ambiante
2Oml/h
SEPHAROSE 4B - Anti-GPA
Contact 30 min
Lavages 4°C
40ml/h
EXCLU
RETENU
Tampon glycine - HCI 0,2 M pH 2,60
4Oml/h 4°C
ELUAT
Neutralisation K2HP04 1 M (l v/4v)
lentt1llion - Dialyse 4°C - Centrifugation
Lyophylisanon du surnageant

---

- 54 -
4. Matériels et réactifs
· Colonne de verre Phannacia® C 16/40 contenant 32 ml d'immunoadsorbant et
conservé dans l'azoture de sodium 0,1 %.
· Pompe péristaltique Gilson ® model Minipuls n.
· Détecteur - enregistreur à 280 nm ISCO Model VA5
· Vase de Martin et sa tulipe pour concentrer l'éluat
· Boudin de dialyse Polylabo ® Medicell ref. 24001
* Tampon Tris - HCI 0,2 M pH 8,20 NaCI 0,5 M
Tris
0,2M
24,2 g
PM: 121
NACI
0,5M
29 g
PM:58
HCI concentré
QSP
pH 8,20
H20
QSP
1000 ml
* Tampon Tris - HCI 0,2 M
pH 8,20
NaCI 0,5 M
Tween 80
0,5 %
Tween 80
5ml
Tampon Tris - HCI 0,2 M / pH 8,20/ NaCI 0,5 M QSP 1000 ml
* Tampon Glycine - HCI 0,2 M pH 2,60
Glycine
0,2M
15 g
PM:75
HCI concentré
QSP
pH 2,60
1000 ml
* Tampon Acétate 0,1 M pH 4,0 NaCI 0,5 M
CH3 COONa,3H20 0,02 M
2,72 g
PM: 136,08
NaCI
0,5M
29 g
PM: 58
Acide acétique 0,08 M pur
4,8 ml QSP pH 4,0 PM = 60
H20
QSP
1000 ml
La solution de K2HP04 et le tampon Glycine - HCL 0,2 M
pH 2,20 NaCI 0,5 M ont été déjà décrits chapitre ID paragraphe B5.

---

- 55 -
s. Analyse de l'ql-&Iycoprotéine acide purifiée
La quantité de GPA purifiée est évaluée par 3 procédés:
- Immunochimie par IDR ou EIDm
- Pesée (après déshydratation 48h sous P205 )
- Absorbance à 280 nm sachant que le coefficient d'extinction spécifique à
280 nm de la GPA humaine est de E280 1 0/00 = 0,87 ( Schmid, 1975 ). L'absence de
désialylation au cours de la purification est vérifiée selon un procédé mis au point au
laboratoire (Biou et al , 1984 ).
La pureté et l'identité sont contrôlées par PAGE-SDS (Laemnùi et al, 1972)
et EIDm en quinconce (Golovtehenko et al, 1972 ).
IV • ISOLEMENT DES SOUS-POPULATIONS GLYCANNIQUES DE
L'al·GLYCOPROTEINE ACIDE PAR CHROMATOGRAPHIE
D'AFFINITE SUR CONCANA VALINE A.
1. Pripcipe
C'est une chromatographie d'affinité faisant intervenir une lectine, la ConA,
couplée à un gel de Sépharose 4 B activé au CNBr. La teneur et le degré de substitution
des résidus mannopyranosyles des chaînes glycannes des glycoprotéines permet de les
fractionner en glycoformes ou variants. En ce qui concerne les glycannes de type
complexes de la GPA,en principe seules les structures possédant 2 résidus Man libres ou
seulement substitués en C2 seront liées.L'a-D-méthyl-gluco -ou mannopyranoside
favorise par compétition, la dissociation des complexes formés entre les glycannes et la
ConA.
Le componement d'une molécule de GPA vis à vis de la ConA reflète le degré
de ramification moyen et la position relative des 5 chaînes glycannes sur le squelette
polypeptidique. Ainsi, une fraction retenue par la ConA possèdera une plus forte teneur
relative en glycannes biantennés qu'une fraction non retenue. Mais ces fractions qu'elles

---

- 56 -
soient retenues ou non, contiennent des structures tri et tétraantennées ( Bierhuizen et
al,1988 ).
L'affinité d'une glycoprotéine vis-à-vis de la ConA est un phénomène complexe
qui dépend non seulement dela teneur en structures biantennées et/ou oligomannosidiques
mais aussi probablement de paramètres physico-chimiques encore mal définis. En
revanche, le comportement des oligosaccharides libres vis-à-vis de la conA est bien plus
spécifique. Ainsi ne seront pas retenues outre les structures tri et tétrantennées, les
structures biantennées possédant une GlcNAc intercalaire sur le Man 3 et/ou un résidu
sialyle fixé en 0.-2,6 sur la GlcNAc 5 lorsque le résidu galactosyle est relié à cette
dernière par une liaison ~-1,3 (Bernard et al, 1984).
2. Mode opératoire
2.1. Çbr2mBtQeriWhi~ d'affinit~ ~yr C2nA·S~QhBr2~~ 4B d~ l'gl·
glycoprotéine acid~ native
2.1.1. Dépôt de l'échantillon
Sur une colonne préalablement équilibrée en tampon Tris-Hel 0,05 M pH 7,60
NaCI1M, l'échantillon est introduit sous un faible volume à un débit de 45 ml/h. Environ
60 mg de GPA native sont introduites sur la colonne contenant 50 ml de ConA Sépharose
4B. La chromatographie est réalisée à température ambiante. Un contact gel-échantillon de
30 min est nécessaire.
2.1.2. Elution
Les conditions d'élution sont celles définies par Bayard et Kerckaert (1980 )
La fraction A non retenue (GPA-A) est éluée par un volume de colonne de
tampon Tris-HCI 0,05 M pH 7,60, NaCll M, sous un débit de 45 ml/h
La fraction retardée (GPA-B) est ensuite éluée toute une nuit par 10 volumes de
colonne de tampon Tris-HCI 0,05 M pH 7,60 NaCll M sous un débit de 35 ml/h.
La fraction retenue (GPA-C) est éluée par le tampon Tris 0,05 M pH 7,60 NaCl
1 M contenant 0,15 M d'a.-D-méthylglucopyrannoside. Le débit ici est de 60 ml/h.

---

- 57 -
L'élution est suivie par la mesure de l'absorbance à 280 nm sur un enregistreur
Isco UA 45.
2.1.3. Régénération de la colonne
La colonne est régénérée par le tampon acétate de sodium 0.1 M pH 6.0 NaCI
0.25M
(3 volumes de colonne). En dehors des périodes d'utilisation le gel est conservé dans ce
même tampon contenant de l'azoture de sodium 0.2%.
Les fractions éluées sont concentrées et dialysées dans les mêmes conditions
que lors de la purification de la GPA.Elle sont alors lyophilisées puis déshydratées sous
P20S avant analyse.
2.2. Chromatographje d'affinité sur CopA-Sépharose 4 B de
glycappes radjomargués
Afin d'éliminer la radioactivité· non spécifique. les oligosaccharides après
hydrazinolyse et radiomarquage au borohydrure tritié subissent le traitement suivant: les
oligosaccharides sont repris dans de l'acide acétique pH 4.50 et évaporés en présence de
méthanol distillé afin d'éliminer les borates. Après évaporation. les oligosaccharides sont
chromatographiés sur TSK HW 40 S. Ce traitement a pour but d'éliminer les sels et
notamment les borates qui pourraient générer une radioactivité non spécifique.
Environ 100 ()()() CPM de glycannes sont chromatographiés sur une colonne de 1
ml de gel de ConA-Sépharose 4 B. Les glycannes radiomarqués sont introduits sous 1 ml
dans du tampon Tris-HCI 0.05 M pH 7.60 NaCI lM et chromatographiés selon
Narasimhan et al (1985 ) à température ambiante. La fraction non retenue CO est éluée
dans un volume de colonne avec le tampon Tris-HCI 0.05 M pH 7.60 NaCIIM sous un
débit de 10 mllh. L'éluat est recueilli dans des tubes à hémolyse sur un collecteur de
fractions à raison de 1 ml/tube. La fraction retenue Cl est éluée par le tampon Tris-HCl
0.05 M pH 7.60 NaCI lM contenant 10 mM d'a-D-méthylglucopyranoside. Dans ces
conditions. les glycannes tri et tétraantennés sont élués dans la fraction exclue CO et les
glycannes biantennés dans la fraction retenue Cl. A la fin de l'élution. le gel est lavé par

---

- 58 -
du tampon Tris-HCI 0,05M pH 7,60 NaCI 1 M contenant cette fois de l'a-D-
méthylglucopyranoside l00mM. Le taux de radioactivité de chaque fraction est déterminée
sur une partie aliquote de 10 ~l dans 3 ml de scintillant ACS®. La fraction exclue CO est
évaporée à l'évaporateur rotatif et rechromatographiée sur ConA Sépharose 4 B. TI n'y a
pas de différence significative entre les profils des 1ère et 2ème chromatographies. En
conclusion, on peut dire que la capacité de fIXation en fonnes retenues de la colonne n'est
pas saturée dans les conditions de la 1ère chromatographie.
3. Matériels et réactifs
• Tampon Tris 0,05 M
pH 7,60 NaCI
lM
Tris
0.05 M
6,06 g
PM: 121
NaCI
lM
58 g
PM:58
CaCI2
ImM
0,147 g
PM: 147
MgCI2
ImM
0,203 g
PM: 203
MnCL2
ImM
0,198 g
PM: 198
HCI pur
QSP
pH 7,60
H2û
QSP
1000 ml
• Tampon acétate 0,1 M. pH 6,0
NaCI
0,25 M
CH3COONa, 3H2û
96mM
13,05g
PM: 136,0
NaO
0.25 M
14,4 g
PM: 58
ea02
ImM
0.147 g
PM: 147
MgC12
ImM
0,203 g
PM: 203
Mn02
ImM
0,198 g
PM: 198
Acide acétique pur 4mM
QSP
pH 6,0
PM: 60
H2û
QSP
1000 ml
• Tampon d'élution
a-D-méthylglucopyranoside 0,01 M 0,38 g
PM 194
Tampon Tris 0,05 M pH 7,60 NaCI lM QSP 200 ml

---

- 59 -
• Tampon d'élution
a-D-méthylglucopyranoside 0,15 M
5,8 g
PM 194
Tampon Tris 0,05 M pH 7,60 NaCl 1 M QSP
200 ml
• Tampon d'élution
a-D-méthylglucopyranoside 0,1 M
3,8 g
PM 194
Tampon Tris 0,05 M pH 7,60 NaCl 1 M QSP
200 ml
• Colonne Pharmacia® C16/50.
V -TECHNIQUES D'ETUDE DE LA STRUCTURE GLYCANNIQUE
A • ETUDE DE LA COMPOSITION EN OSES: DOSAGE PAR
CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE (CPG)
1. Méthapol yse
Nous avons utilisé la technique de Zanetta et al ( 1972 ). Une solution de
250 J.1g de GPA dans l'eau désionisée à laquelle on ajoute 20 J.1g de mésoinositol (étalon
interne) est lyophylisée dans un tube Sovirel® 15. Le produit lyophilisé est placé dans un
dessicateur 48 h sous n05. Le résidu sec est repris par 1 ml d'un mélange méthanol -
HCl 0,5 N et placé à l'étuve 20h à 80°C. Après refroidissement, le solvant est évaporé
par un courant d'azote sous une hotte à 30°C. Le résidu sec va subir la
trifluoroacétylation.
2. TriDuoroacétvlatjop
Le résidu sec contenant les O-méthylglycosides est repris par un mélange à
partie égale de dichlorométhane 100 J.1l et d'anhydride trifluoroacétique 100 J.1l. Le tube est
bouché rapidement et porté à 150°C sur une plaque chauffante 2 fois 4 minutes. Le tube
est refroidi entre les deux passages. Après refroidissement, le produit est prêt à être injecté
en CPG.

---

- 60 -
3. Chromato2raphje en phase 2azeuse
Nous avons injecté 8 J.lI de produits trifluoroacétylés sur une colonne de
verre remplie de silicone OV 210 sur un support chromosorb W HP 5 % (100 - 200
mesh). Le chromatographe utilisé est du type Varian modèle 1400.
CONDITIONS CHROMATOGRAPHIQUES
Conditions
Valeurs
Température de la colonne
Initiale
l000C
Finale
24Q0C
Gradient de température
2°C/min
Température du détecteur
28Q0C
Température de l'injecteur
'1f:IYC
Débit des gaz
Gaz vecteur N2
20mVmin
Hydrogène
25 ml/min
Air
300mlImin
Volume d'échantillon injecté
8~
Lafigure 18 représente un tracé type de l'analyse quantitative des 0-
méthyl-glycosides des glycannes de type complexe. Le mode de calcul des rappons
molaires des différents monosaccharides est présenté dans le tableau ID •

---

- 61
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1 - - - •.
Figure 18
Chromatographie en phase gazeuse (CPG) des méthylglycosides
trifluoroacétylés de l'al-glycoprotéine acide humaine sur une colonne OV210

---

- 62 -
TABLEAU In
Mode de détermination des rapports molaires en monosaccharides
de l'al-glycoprotéine acide par chromatographie en phase
gazeuse
Masse à méthanolyser (quantité de monosaccharides totaux 100 à 200 ~g) :
- Quantité de méthanollHCl 0,5 N. de méthanollHCl1.5 N (1) (concentrations 1p.1000)
- Quantité de mésoinositol à introduire: 20 ~g
- Délipidation : ~ NON (1)
(1) selon la nature des produits volatils

---

- 63 -
B • LmERATION DES OLIGOSACCHARIDES PAR HYDRAZINOLYSE
1
L' hydrazinolyse est utilisée pour hydrolyser la liaison N-glycosylamine
des N-glycoprotéines. Dans une étape ultérieure, les groupements aminés libres sont
N-reacétylés et les oligosaccharides sont ensuite réduits par le borohydrure de potassium.
1. Hydrazinolyse (Bayard et al. 1976 )
Nous avons utilisé de l'hydrazine anhydre Pierce®. La glycoprotéine
préalablement lyophylisée et parfaitement déshydratée sous P20S pendant 48H est
recouverte par de l'hydrazine anhydre (1 ml pour 10 mg de glycoprotéine) puis portée à
l'étuve pendant 20 h à 105°C. L'excès d'hydrazine est évaporée après refroidissement en
présence de toluène. L'opération est répétée au moins 3 fois. L'hydrazine est piégée sous
forme de sulfate d'hydrazine par de l'acide sulfurique dilué placé dans le ballon de
récupération de l'évaporateur rotatif. Le résidu sec est repris par 1 ml d'acide acétique
0,5% pour être dessalé.
2. Chrowato2raphie d'exclusion sur Fracto2el TSK HW 40 S
Cette chromatographie est effectuée dans le but d'avoir des glycannes
débarrassés des produits de dégradation de l'hydrazinolyse et des hydrazones des acides
aminés.

---

- 64 -
• Conditions chromatoK,raphigues
- Colonne Phannacia HR 16/50
- Support fractogel TSK HW 40 S Merck (R) gel de silice
granulométrie 25 - 40 Il
- Solvant de la chromatographie: acide acétique 0,5 % pH 4,5
- Pompe LCA Shimadzu
Débit: 1 mVmin
Pression : 5 bar
Boucle d'injection: 1 ml
- Détection
Refractomètre SP 6040 Spectraphysics(R)
Spectrophotomètre Uvicord 2138 LKB (ÂF 206nm)
- Enregistreur Bicanal 2210 LKB
Sensibilité 0,1 V
Vitesse de déroulement du papier 1 mm/min.
Les glycannes élués sont évaporés 3 fois à l'évaporateur rotatif en présence
de méthanol distillé.
Le résidu sec est prêt à être N-reacétylé.
3. N • reacétvlatjon
Le résidu sec est repris par 2 ml d'eau distillée qualité milli Q® saturée de
bicarbonate de sodium. La N-reacétylation est réalisée par addition de 4-6 III d'anhydride
acétique pur toutes les 20 mn pendant 2 heures à température ambiante. Il faut 4 à 6 III
d'anhydride acétique par mg de glycanne. La N-reacétylation est arrêtée par addition
d'une résine échangeuse de cations, la Dowex 50 X 8 (H+ 200 - 400 mesh) Bio Rad®
jusqu'à pH 4,0. On effectue ensuite un dessalage sur Fractogel TSK HW 40S. Après 3
évaporations en présence de méthanol distillée, le résidu sec est repris par de l'eau qualité

---

- 65 -
milli Q®, le pH est ramené à 10,0 au pHmètre avec de la lessive de potasse avant
d'effectuer la réduction.
4. Réduction
La solution ramenée à pH 10 est traitée par du KBH.4. Il faut environ 1,5 mg de
KBH4 pour l mg de glycanne. L'opération dure 2 heures à température ambiante. La
réduction est arrêtée par l'addition de Dowex 50 X 8 jusqu'à obtention d'une solution de
pH 4,0. Cette solution est filtrée sur de la laine de verre puis évaporée en présence de
méthanol distillé. Le résidu sec est repris par de l'eau milli Q®puis dessalé sur Fractogel
TSK HW 40 S . L'éluat est concentré, évaporé en présence de méthanol distillé. Le résidu
sec est repris par de l'eau milli Q® puis lyophilisé; mais au préalable, une partie aliquote
aura été prise pour apprécier le rendement de l'hydrazinolyse par CPG.
C - FRACTIONNEMENT DES GLYCANNES PAR CHROMATOGRAPHIE
LIQUIDE HAUTE PRESSION (CLHP) SUR ECHANGEUR D'ANIONS
L'utilisation de phases stationnaires de fine granulométrie, le contrôle du débit de
la phase mobile par des pompes à haute pression et la mise au point de méthodes sensibles
de détection en continu de la composition de l'effluent, permettent de réaliser des
chromatographies très performantes en des temps très courts. Cette technique est connue
sous le nom de chromatographie liquide haute pression (CLHP).
1. Technique
En fonction de leur teneur en acide-N-acétylneuraminique (NeuAc), les glycannes
sont séparés par chromatographie sur une colonne échangeuse d'anions: Micro-Pak AX-
10 (Varian 0,4 cm x 80 cm).

---

- 66 -
. Condition§ chromato2ranhigues
Détecteur UV LKB 2138 Uvicord
Sensibilité
1
Longueur d'onde 206 nm.
Enregistreur monocanal2210
Sensibilité 100 mV
Déroulement papier 5 mm/min
Pompe Specta Physics 8750 couplée à un microprocesseur pour la
réalisation des gradients.
Boucle d'injection
500 ~
Pression
75 bar
Débit
2mVmin
Le lyophilisat repris par de l'eau milli Q est injecté sur la colonne. Les
oligosaccharides sont ensuite analysés selon le programme suivant:
TEMPS
% EAU
% PHOSPHATE 500 mM
0
100
0
20
100
0
30
97,5
2,5
50
97,5
2,5
60
95
5
80
95
5
180
60
40
Toutes les fractions issues de la chromatographie sur AX-I0 sont dessalées
sur Fractogel TSK HW40 S puis concentrées et lyophylisées.

---

- 67 -
2. Identification des fractions
Les diverses fractions obtenues après chromatographie sur AX-lO sont
méthanolysées et leur composition en oses analysée en CPG. Lajigure 19 représente
un chromatogramme type obtenu à partir des glycannes de la GPA humaine.
D • PERMETHYLATION DES GLYCANNES .
1. Principe
La méthylation permet de déterminer l'emplacement des liaisons osidiques
dans une chaîne oligosaccharidique. Toutes les fonctions alcool secondaires et primaires
libres d'un ose sont substituées par une fonction étheroxyde de méthyl.
2. Mode opératoire
Nous avons utilisé la méthode de Finne et al ( 1980 ) modifiée par Paz-
Parente et al ( 1983 ).
A 50 Ilg d'oligosaccharides lyophilisés dans un tube Sovirel ® 13, sont ajoutés
sous une cloche remplie d'azote 50 Ilg de DMSO bidistillé. On y fait barboter un courant
d'azote. Le produit est ensuite placé dans un bain d'ultrasons 15 min. On ajoute 100 III de
base (lithium sulfinyl carbanion). Le mélange est laissé 2h à température ambiante puis 20
min à -20°e. On ajoute alors 200 III d'iodure de méthyl et on laisse le mélange toute la
nuit à température ambiante et à l'abri de la lumière. On effectue le lendemain une
sonication de 30 min.
. Extraction
La méthylation est arrêtée par addition de 1 ml d'eau saturée de thiosulfate
de sodium. Les produits méthylés sont extraits par du chloroforme (3 fois 2 ml). La phase
chIoroformique est ensuite lavée par de l'eau distillée (la fois 2 ml) puis évaporée sous
courant d'azote et lyophylisée.

---

EAU
100%
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50
60
TEMPS
(IDJ.n)
Figure 19
Séparation des sialoglycannes de l'al-glycoprotéine acide humaine par
chromatographie liquide haute pression d'échangeur d'anions (AX·IO)

---

- 69 -
• Méthanollse
Les oligosaccharides pennéthylés sont méthanolysés par du méthanol-HCll,5
N 20h à 80°C. Après évaporation du mélange méthanol-HCI sous azote, les éthers
méthyliques O-méthylglycosylés sont peracétylés par un mélange pyridine/anhydride
acétique (1 : 5 v/v). En général, nous utilisons 10 J.11 de pyridine pour 50 J.11 d'anhydride
acétique. Le mélange est laissé en contact toute la nuit à température ambiante. Après
évaporation sous azote, le résidu sec est repris par du méthanol distillé et analysé en
chromatographie en phase gazeuse couplée ou non à la spectrométrie de masse selon la
méthode de Fournet et al (1981).
Nous avons utilisé une colonne capillaire imprégnée de silicone OV 101
(0,3 mm x 25). Les produits ont ensuite été analysés en spectrométrie de masse.
Conditions chromatographiques
- Température du détecteur et de l'injecteur: 220°C
- Gradient de température 120 - 2400C, 2°C/min
- Gaz vecteur: I:Ielium 0,05 bar.
Appareil CPG: Varian 300
Spectromètre de masse Riber-Mag 10-10 (énergie d'ionisation 70 ev).
3 . Matériels et réactifs
Toute la verrerie doit être traitée par un mélange sulfochromique et bien rincée à
l'eau distillée puis séchée.
. Diméthylsulfoxyde ( DMSO ) distillé et conservé sur tamis moléculaire.
. La base: le lithium sulfinyl carbanion est préparée au laboratoire.
- Chlorofonne Merck®
- Thiosulfate de sodium RP Normapur Prolabo®.
- Pyridine RP Nonnapur Prolabo®
- Anhydrine acétique RP Normapur Prolabo®.
- Iodure de Méthyl Merck ®
- Le méthanol - Ha 1,5 N est préparé au laboratoire.

---

RESULTATS

---

- 70 -
1 • PURIFICATION DE L'al·GLYCOPROTEINE ACIDE CHEZ
L'HOMME
A - PREPARATION DE L'IMMUNOADSORBANT
L'immunoadsorbant est préparé par éouplage des immunoglobulines spécifiques
anti-GPA humaines (purifiées par chromatographie d'immunoaffinité) sur un support de
Sépharose 4 B activé au bromure de cyanogène (Sépharose 4 B CNBr) Tableau IV
· immunoglobulines spécifiques anti-GPA humaines: 136 mg.
· Volume de gel humide : 32 ml. Ce volume a été choisi pour avoir pendant le
couplage une concentration en Ig spécifiques voisine de 5 mg/ml de gel humide. Par
ailleurs. comme on sait que le gel prend 3.5 fois son volume lorsqu'il est humide. nous
avons pris 9.2 g de gel sec. Le rendement (p) du couplage est calculé de la façon suivante:
Quantité d'Ig introduite - Quantité d'Ig exclue·
p couplage = -------------------------------------------------------- x 100
Quantité d'Ig introduite
136 - 0.527
P couplage = ---------------- x 100
136
p couplage = 99,6 %
OOLI x VLl + DOL2 x VL2
• Quantitié d'Ig exclue =
El %0 Ig
OOLI
: densité optique du 1er lavage =0,008
VLl
: volume de 1er lavage =60 ml
OOL2
: densité optique du 2ème lavage =0,006
VL2
: volume du 2ème lavage =43 ml
E 10/00
: coefficient d'extinction spécifique des Ig 2~O mm =1,4
· La capacité de neutralisation théorique (mg d'Ag neutralisé en IDR) est égale au
T IDR x Volume IS x p couplage (tableau IV) (TJDR : mg d'Ag neutralisé/ml d'IS).

---

- 71 -
. La capacité de neutralisation expérimentale est inférieure à la capacité de
neutralisation théorique ce qui est logique. Pour notre immunadsorbant elle correspond à
66 % de la capacité de neutralisation théorique.
B - DEFINITION DES ECHANTILLONS BIOLOGIQUES
La structure glycannique de la GPA est étudiée sur une population d'adultes sains
et sur deux modèles physiopathologiques correspondant l'un à l'insuffisance hépato-
cellulaire de la cirrhose alcoolique, l'autre à la grossesse au cour du dernier trimestre.
Nous nous sommes intéressés à ces deux états physiopathologiques après avoir constaté
en CIAE ConA d'importantes modifications allant dans le même sens.
1. PopulatioD saine
Notre échantillon de référence est constitué par un mélange de sérums de
donneurs de sang provenant d'adultes sains prélevés au Centre de Transfusion Sanguine
des Armées de Oaman (CfSA).
2. Cirrhose alcoolique
Après avoir constaté des modifications similaires du profil en CIAE-ConA
chez chaque individu d'une population de cirrhotiques, il nous a paru plus intéressant
d'étudier le modèle de l'insuffisance hépatocellulaire chez un seul cirrhotique placé dans
des circonstances pathologiques bien défmies. Dans ce but, nous avons choisi un individu
mâle atteint d'une cirrhose alcoolique appartenant à la classe C selon la classification de
Pugh et al ( 1973 ). Pour des raisons pratiques de prélèvements et de quantité, la GPA a
été purifiée à partir du liquide d'ascite; des études antérieures (Konan , 1985 ) ayant
prouvé que le liquide d'ascite est bien un ultrafI1trat du sérum dans lequel les sous-
populations glycanniques de la GPA en CIAE-ConA ne sont pas modifiées par rapport à
celles du sérum.
3. Grossesse
Contrairement au modèle de la cirrhose et pour des raisons de quantité, la
GPA a été purifiée à partir d'un mélange de sérums de femmes enceintes prélevés au
cours du troisième trimestre de la grossesse.

---

- 72 -
Tous les échantillons sont conservés à -20°C avant d'être utilisés.
4. Mise en évidence des altérations Qualitatiyes de glycosylation
Jk l'qI-glycoprotéine acide par CIAE ConA
La CIAE ConA pennet d'individualiser pour les glycoprotéines de type
complexe. des glycofonnes qui sont d'autant plus retenues par la ConA qu'elles sont plus
riches en structures biantennées (Bierhuizen et al. 1988). Ainsi sont définies des fonnes
ConA réactives ou retenues riches en structures biantennées. des formes ConA
moyennement réactives ou retardées et des formes non réactives ou non retenues. Le
degré de branchement de ces glycofonnes est d'autant plus important que les fonnes sont
moins retenues. (Krusius et al. 1976; Bayard et al. 1983 ; Bierhuizen et al. 1988).
• Population saine
Le profil de la GPA en CIAE ConA d'un individu sain présente 4 pics
(figure 20) : le pic 1. non retenu étant plus anodique). Les pics 4 et 3 correspondant aux
glycoformes retenues et très retardées. minoritaires. tandis que le pic 2 retardé est
majoritaire.
La proportion des différentes glycofonnes est définie par leurs surfaces relatives.
Ainsi. on définit le pourcentage du pic 1 =(pic 1/ 1: pics 1 + 2 + 3 + 4) x 100.
. Cirrhose alcoolique
Le sérum du sujet atteint de cirrhose alcoolique au stade décompensé présente
trois glycoformes par rapport au profil d'un individu sain. Chez notre individu
cirrhotique. on constate la disparition du pic 4 et une forte diminution relative des pics 3 et
2 au profit du pic 1 (figure 21).
Sur le liquide d'ascite du même individu. les mêmes modifications de profil sont
observées avec des surfaces relatives voisines de celles du sérum correspondant.
confirmant l'absence de sélection de sous-populations glycanniques au cours de
l'ultrafiltration (figure 22).

---

-
73 -
TABLEAU IV
Caractéristiques de l'immunoadsorbant anti-al-glycoprotéine acid.
humaine
Volume de gel
Masse d'Ig avant
Capacil~ de neutralisation
Rendement
(où)
le couplage mg
(mg d'Ag neutralisé en IDR)
du couplage
Théorique (a)
réelle (b)
(p)
32
136
21
13,8
99,6
(a) SOil 0,65 mg/ml de gel
(b) soit 0,43 mg/ml de gel
L'immunoadsorbant ainsi préparé est conservé à +4°C en présence d'azoture de sodium à 0,1 CJl
4
3
2
1
~
(
.
1
,
1
!
:
Figure 20
Glycofonnes de l'al-glycoprotéine acide obtenues en CIAE-ConA à partir
d'un mélange de sérums d'individus sains
1 - glycofmmes non retenues par la CanA
2 - glycofonnes retardœs par la CanA
3 - glycofonnes très retardées par la CanA
4 - glycoformes retenues par la CanA

---

- 74 -
1
Figure 21
Glycoformes de l'al-glycoprotéine acide obtenues en CIAE-ConA à partir du
sérum d'un seul individu cirrhotique
3
!'i
Figure 22
Glycoformes de l'al-glycoprotéine acide obtenues en CIAE-ConA à partir
du liquide d'ascite du mêm( individu cirrhotique
1 - glycoformes non retenues par la ConA
2 - glycoformes retardées par la ConA
3 - glycofonnes très retardées par la ConA

---

-75 -
• Grossesse
Au cours du 3ème trimestre de la grossesse, on observe en CIAE ConA, une
évolution du profil identique à celui de la cirrhose mais plus accentué avec une très fone
augmentation du pic 1 et une disparition des pics 4 et 3 (figure 23).
Le tableau V représente la distribution des surfaces relatives des glycoformes
de l'al- glycoprotéine acide en fonction de la nature de l'échantillon après CIAE-ConA.
C • PURIFICATION DE L'a1·GLYCOPROTEINE ACIDE HUMAINE
Les différents échantillons biologIques sont purifiés par passage sur
l'immunoadsorbant préparé précédemment (Cf Chapitre nI paragraphe C3 ).
Les tableaux VI, VII, VIII représentent respectivement les résultats des
chromatographies d'immunoaffinité pour la purification de la GPA à partir d'un mélange
de sérums de sujets sains, du liquide d'ascite d'un patient cirrhotique et d'un mélange de
sérums de femmes enceintes au cours du troisième trimestre de grossesse .
Comme nous l'avons indiqué dans la partie technique, après la chromatographie
d'immunoaffinité, l'éluat est concentré, dialysé contre de l'eau distillée et lyophiilisé.
Après lyophilisation, la GPA purifiée est stockée sous P20S puis pesée. Une solution à 1
mg de GPNml est ensuite constituée sur laquelle les essais de pureté et de composition
sont réalisés.
D • ETUDE QUALITATIVE DE L'a 1· GLYCOPROTEINE ACIDE
PURIFIEE
1. ImmuDoaffinoélectrophorèse croisée en présence de
ConcanayaJine A (CIAE·ConA)
1.1. Sujet sain
Avant purification, le profil en CIAE-ConA figure 20 révèle 4
glycoformes numérotées de 1 à 4 en partant du pic le plus anodique. Ces fractions
individualisées correspondent respectivement aux glycoformes non retenues (pic 1),
retardée (pic 2) très retardée (pic 3) et retenue (pic 4). Comme on le constate

---

-
76 -
·1
2
1
1,
Figure 23
Glycoformes de l'al-glycoprotéine acide obtenues en CIAE-ConA à partir
d'un mélange de sérums de femmes enceintes prélevés au 3è trimestre de
grossesse
1 - glycofonne~ non retenues par la ConA
2 - glycoformes retardées par la ConA

---

- 77 -
TABLEAU V
Distribution des proportions relatives des glycoformes
de l'al- glycoprotéine acide humaine après CIAE- ConA
en fonction de la nature de l'échantillon •
Swface des pics (%)
1
2
3
4
individus sains (sérum)
41,7 ± 2,5
44,8 ± 2,5
11,2 ± 1,5
2,3 ± 2,3
(n = 11)
Individu cirrhotique
63
31
0,6
0
(sérum)
Liquide ascite d'un
64
32
0,4
0
individu cirrhotique
Grossesse (sérum)
78,7 ± 5,0
20,6 ± 4,1
0,7 ± 1,4
0
(n = 11 )
TABLEAU VI
Chromatographie d'immunoaffinité pour la purification
de l'al-glycoprotéine acide d'un mélange de sérums de
sujets sains
Numéro
Volume (ml)
Eluatml
00280
Quantité GPA(mg)a
1
30
62
0,294
20,95
2
25
52
0,174
10,40
3
30
63
0,204
14,77
4
20
44
0,135
6,82
5
30
72
0,224
18,53
6
20
68
0,106
8,28
7
34
90
0,205
21,20
8
20
85
0,143
13,97
(a)Valeur calculée à partir de l'absorbance à 280 nrn et du coefficient d'extinction
spécifique e 1%0 à 280 nrn de l'al-glycoprotéine acide humaine égal à 0,87g-11+1cm- 1

---

- 78 -
TABLEAU VII
Chromatographie d'immunoaffinité pour la
purification de l'al-glycoprotéine acide du liquide
d'ascite du sujet cirrhotique
Numéro
Volume (ml)
Eluat ml
00280
Quantité GPA(mg)a
1
60
52
0,347
20,27
2
57
45
0,383
19,36
3
60
50
0,387
21,74
4
48
48
0,314
16,93
5
60
50
0,375
21,06
6
58
45
0,386
19,51
7
60
50
0,354
19,88
8
60
50
0,340
19,10
(a) Valeur calculée à partir de l'absorbance à 280 nm et du coefficient d'extinction
spécifique E 10/00 à 280nm de l'al-glycoprotéine acide humaine égal à 0,87g- l l+ lcm- l
TABLEAU VIII
Chromatographie d'immunoaffinité pour la purification de
l'al-glycoprotéine acide d'un mélange de sérums
de femmes enceintes (3è trimestre de grossesse)
Numéro
Volume (ml)
Eluatnù
00280
Quantité GPA(mg)a
1
30
63
0,204
14,77
2
20
44
0,135
6,82
3
30
72
0,224
18,53
4
20
68
0,106
8,28
5
34
90
0,205
21,20
6
20
85
0,143
13,97
7
30
54
0,260
16,13
8
35
72
0,281
23,25
(a)
voir les commentaires du tableau VII

---

-
79 -
(tableauIX), le processus de purification ne modifie pas significativement ce profil
,démontrant l'absence de sélection de glycofonnes au cours de la purification.
1.2. Cirrhose alcoolique
Avant purification, 3 glycofonnes sont individualisées correspondant
aux pics 3, 2, 1 (figure 21)
Par rapport au profil du sujet sain, on constate une
évolution vers des glycofonnes non retenues. Après purification, le profil en CIAE ConA
n'est pas modifié significativement et le pourcentage du pic 1 n'est pas modifié
(tableauIX).
1.3. Grossesse
On constate une profonde modification du profil en CIAE ConA par
rapport au sujet sain avec une disparition des glycofonnes retenues et très retardée (pic 3
et 4) au profit des glycofonnes retardées et non retenues (pics 2 et 1) figure23.Comme
précédemment, on n'observe pas de modifications notables dans le pourcentagedu pic 1
(tableau IX) après purification.
En conclusion, dans les 3 modèles précédents, les profils observés après
purification demeurent inchangés. La chromatographie d'immunoaffinité est donc une
technique pennettant de purifier la GPA sans modification apparente des glycofonnes ce
qui n'est pas le cas des autres techniques de purification comportant des étapes en milieu
acide plus ou moins prolongées.
2. Etude du de2ré de sjalyJatjoQ
L'augmentation du pHi de la GPA consécutive à la perte de résidus sialyles se
traduit en EIDm par une moindre mobilité électrophorétique qui favorise la diffusion
latérale au détriment de la migration électrophorétique perpendiculaire vers l'anode. Il en
résulte, à quantité égale déposée et par rapport à la GPA native, un pic plus large et moins
haut pour la GPA désialylée ou hyposialylée. Le dosage par EIDm (figure24) qui
mesure la hauteur des pics entraîne donc une sous-évaluation de la concentration de la
GPA hyposialylée lorsque cette dernière est dosée par rapport à une gamme étalon de
GPA native (Biou et al, 1981). En revanche, en IDR (figure 25) puisque seules les

---

- 80 -
r
2
lrn~ ~11"Jd~ ~n l
~
Figure 24
Electroimmunodiffusion monodimentionnelle (EIDm) après purification de
l'al-glycoprotéine acide humaine par chromatographie d'immunoaffinité
Gamme étalon d'al-glycoprotéine acide humaine BehringŒ ( 97Omi!/1 ).
Puits n08 à Il dilutions: 1nO,1137,1/25.I/20
Echantillons: éluats dilués de différentes préparations d'al-glycoprotéine acide de sujets
sains .Puits nO 2 à 7 et de 12 à 13
5
4
11
T; 0, l.t 5 r-j !lwlf.
0 0 0
loS; -1,~olo
4
3
2
0 0 0
3 2
1
eGO
Figure 25
Immunodiffu'ion radiale ( IDR) après purification de l'al-glycoprotéine
acide humaine par chromatographie d'immunoaffinité.
Gamme étalon d'al-glycoprotéine acide humaine Behring® ( 97Omg/l )
Puits nO 1 à 3 dilutions: 1/20, 1/10, 1/6
Echantillons: éluats dilués de différentes préparations d'al-glycoprotéine acide de sujets
sains. Puits nO 4 à 7 identiques à ceux de l'EIDm et de 8 à Il

---

-
81 -
forces de diffusion interviennent, les résultats demeurent inchangés quelque soit le taux de
sialylation. Panant de cette observation (Bordas et al, 1981) ont mis au point une courbe
d'étalonnage reliant le pourcentage de désialylation au pourcentage de sous-évaluation en
EIDm par rapport à l'IDR. En pratique, il suffit de doser l'échantillon convenablement
dilué par IDR et EIDm, de calculer l'éventuelle sous-évaluation et de la reporter sur la
courbe d'étalonnage pour obtenir le pourcentage d'hyposialylation. Pour éliminer
d'éventuelles erreurs dues à la dilution, les techniques par IDR et EIDm ont été adaptées
pour opérer sur des dilutions identiques.
Compte tenu des erreurs cumulées en IDR et EIDm, on considère qu'une
sous-évaluation inférieure à 10 % n'est pas significative (Biou et al, 1981).Le tableau X
regroupe les éventuelles sous-évaluations définies par le rapport [IDR - EIDm/IDR] x 100
déterminées après purification de la GPA à partir du liquide d'ascite de cirrhotique. Nous
constatons que la purification par chromatographie d'immunoaffinité n'entraîne pas de
sous-évaluation significative donc de désialylation de la GPA.
3. Critère de pureté de l'al -elycoprotéjne acide
3.1. . Ele~troimmunQdiffusion monodimensionnelle en guinconce
(EIDm en gyinconce)
L'EIDm en quinconce est une méthode semi-quantitative très sensible. Elle permet
de suivre au cours de la purification les fractions contenant la GPA et de vérifier l'absence
de contaminant (notamment l'albumine) en fin de purification. Par exemple, la figure 26
indique le tracé obtenu à partir du liquide d'ascite du cirrhotique. La présence de GPA est
démontrée par le tracé obtenu sur la partie A de la figure 26 à partir de l'inclusion du
seuilS monospécifique anti-GPA dans le gel. L'inclusion d'IS antiprotéines totales
(partie B du gel) et d'antialbumine (partie C du gel) démontre la présence éventuelle
d'impureté dans les fractions étudiées. Nous constatons que le puits n04 où nous avons
introduit l'éluat à pH 2,6 en chromatographie d'immunoaffinité contient de la GPA sans
impureté visible.

---

- 82 -
TABLEAUX IX
Pourcentage du pic 1 de l'al-glycoprotéine acide
humaine en CIAE-ConA avant et après purification
par chromatographie d'immunoaffinité
-----------------------------------------------------
Glycofonnes
Avant purification
Après purification
GPAn
0,40
0,42
GPAc
0,69
0,69
GPAr
0,83
0,82
GPAn : mélange de sérums de sujets sains
GPAc: liquide d'ascite d'un individu cirrhotique
GPAr: mélange de sérums de femmes enceintes ( 3ème trimestre de grossesse)
TABLEAU X
Evaluation indirecte de la désialylation de l'al-glycoprotéine acide
humaine au cours des purifications par chromatographie
d'immunoaffinité.
Préparation
IDRmgll
EIDmmgll
Pourcentage de
Désialylation
sous- évaluation
IDR-EIDm
x 100
IDR
1
672
675
0
0
2
616
622
0
0
3
836
837
0
0
·4
768
776
-1
non signicatif
5
732
779
-6,4
"
6
816
850
-4
"
"
7
848
821
+3
"
"
8
768
752
+2
"
"
9
788
758
+4
"
"
10
488
490
0
0

---

- 83 -
c
,
B
A
Il
~ 1~·~1.,~
5
3
1
5
3~ 1 5
3
•
1
•
•
•
2
,4
2 •
4 •
• 4- 2 -
r
e
•
•
•
•
•
•
Figure 26
Electroimmunodiffusion monodimensionnelle en quinconce
1 : diffusion en chambre humide (90 min)
il: migration électrophorétique (18h)
A: gel contenant l'immunsérum anti-GPA 0,75 %
B : gel contenant les immunsérums anti-GPA 1 % et anti-protéines totales 1 %
C: gel contenant l'immunsérum anti-GPA 1 % et l'antialbumine 1 %
Puits de dépôts.
1 - liquide d'ascite avant purification (5 Jll)
2 - fraction exclue (5 J.1l)
3 - solution de NaCl 0,15 M (5 J.1l)
4 - fraction éluée pH 2,60 (GPA, 5 Jll)
5 - fraction éluée pH 2,20 (GPA, 5 Jll)

---

- 84 -
Partie A :
La GPA introduite est uniquement retrouvée dans les éluats pH 2,60 et pH 2,20 (puits nO
4 et 5) et l'échantillon non purifié (puits nO 1). En effet, l'exclu ne contient pas de GPA.
La colonne n'est donc pas saturée.
Partie B :
Comme pour la partie A, la GPA est présente dans les puits nO 4 et 5. Le puits nO 4
permet de constater que la protéine éluée est pure. Cependant dans le puits nO 5, on note
une impureté qui semble être de l'albumine puisqu'elle est retrouvée dans le même puits
sur la partie C.
Partie C :
Le puits nO 5 contient de l'albumine comme impureté. La différence de hauteur entre
les pics d'impureté des puits nO 5 des parties B et C s'explique probablement par la teneur
plus faible de l'immunsérum antiprotéines totales en albumine.
Le dosage par une technique immunonéphélémétrique plus sensible que l'EIDm de
l'albumine éventuellement présente dans les éluats pH 2,60 et pH 2,20 (puits nO 4 et 5)
démontre bien qu'elle est en proportion négligeable par rapport à la GPA puisqu'elle
représente en moyenne 0,5 %.
3.2. :E1~çtr!.u~h2d~~ ~n a=eI de RQlxacrylamide • SDS
L'électrophorèse réalisée en gel de polyacrylamide sns (figure 27)
révèle une seule bande pour chaque échantillon déposé. Les masses moléculaires
apparentes mesurées à partir d'un mélange de protéines étalons introduit sont
respectivement 43000 chez le sujet sain, 45000 chez l'individu cirrhotique et 45000 au
cours de la grossesse.
3.3. M~~ur~ dU ~Qeffiçienl d'~xlin~tiQn sDçciOWl~ ~ 1 ~Q
A partir de nos produits purifiés stockés sous P205 jusqu'à poids
constant, nous avons fait une solution à 1 mg/ml dans de l'eau distillée ensuite nous
avons mesuré les absorbances à 280 nm et 278 nm puis calculé le coefficient d'extinction
spécifique e 10/00 278/280 nm de la GPA (tableau XI ) .Par rapport aux valeurs

---

- 85 -
. ---- -
-
..
-----
1
2
T
3
Figure 27
Electrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS de
l'al-glycoprotéine acide humaine purifiée
1- sérum du süjet sain
2- liquide d'ascite du sujet cirrhotique
3- sérums de femmes enceintes
(3è trimestre de la grossesse)
T- protéines étalon (Phannacia® - lot nO 81 04)
Phosphorylase b
94000
Da
Il
Sérum albumine bovine
. 67000
Il
Ovalbumine
43000
Il
Anhydrase carbonique
30000
Il
Inhibiteur ttypsique soja
20100
Il
a-lactalbumine
14400
TABLEAU XI
Coefficient d'extinction spécifique E l%c d'une solution d'al·
glycoprotéine acide humaine purifiée' 1 mg/ml dans de l'eau
distillée
Absorbance nm
278
280
sujet sain
0,86
0,84
sujet cintlotique
0,87
0,85
gTOssesse
.
0,87
0,85

---

- 86 -
annoncées dans la littérature (Schmidt, 1975 ) notre coefficient d'extinction est
légèrement inférieur mais les conditions expérimentales de la littérature ne sont pas
précisées (température, nature du solvant etc). Les coefficients d'extinction obtenus pour
les 3 échantillons (sujets sains, cirrhotiques, grossesse) ne semblent pas significativement
différents.
Compte tenu des 3 critères de pureté précédents, on peut affirmer que la GPA
obtenue par chromatographie d'immunoaffinité est pure. Sur ce produit purifié, nous
pouvons donc envisager l'étude de la structure de la copule glycannique.
II • APPROCHE DE LA STRUCTURE GLYCANNIQUE DES
GLYCOFORMES DE L'a l·GLYCOPROTEINE ACIDE
A • ETUDE CHEZ UN SEUL INDIVIDU CIRRHOTIQUE
1. Composition en oses de la molécule natiye de GPA
250 Jig de GPA purifiées par chromatographie d'immunoaffinité
sont méthanolysées selon la technique de Zanetta et al ( 1972). La composition en oses est
déterminée par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats exprimés en rapport
molaire donnent la composition moyenne en oses d'une chaîne oligosaccharidique de type
complexe sur la base de 3 résidus mannosyles par chaîne oligosaccharidique
(tableauXII ).
On remarque par rapport à la GPA de l'individu sain une augmentation des
résidus fucosyles de plus de 100 % chez le sujet cirrhotique. Une étude réalisée (Biou et
al ,1989 ) sur un échantillon plus important d'individus mâles sains (n = 14) et
cirrhotiques (n = 14) confIrme les tendances observées sur le tableau XII et notamment
l'importante hyperfucosylation retrouvée chez tous les individus cirrhotiques. Appliquée
à la GPA, la méthanolyse confirme la légère hyposialylation observée avec des méthodes
immunochimiques indirectes (Biou et al, 1981).

---

- 87 -
TABLEAU XII
Composition en oses de l'al-glycoprotéine acide isolée
du sérum de sujet sain ( GPAn ) et du liquide d'ascite
d'un individu cirrhotique (GPAC>
Fuc
Gal
Man
GleNAc
NeuAc
Total (%)
GPA n
0,7
7,6
6,1
14,4
13,4
42,2
Pourcentage en oses
GPAc
2,1
8,4
7,0
16,0
13,8
47,3
GPA n
2,0
18,2
14,7
27,9
18,7
Nombre de résidus /
mole de protéine·
GPAc
5,8
20,0
17,5
32,6
20,1
GPA n
0,4
3,7
3
5,7
3,8
Rappon molaire··
GPAc
1,0
3,6
3
5,6
3,45
• Les masses moléculaires respectives de la GPAn et de la GPAc sont estimées à
43 kDa et 45 kDa
*. Rappons molaires calculés sur la base de 3 résidus mannosyles par oligosaccharide.

---

- 88 -
2. Fractionnement des 2)ycoformes de la GPA native Dar
chromato2raphje d'affinité sur ConA.Sépharose 4 B
Appliquée à la molécule entière de GPA, la chromatographie sur ConA-
Sépharose 4 B permet de révéler une modification dans la composition des glycoformes.
Elle confIrme généralement le comportement en CIAE-ConA bien que les profIls observés
ne soient pas exactement supetposables. Elle présente en outre l'avantage de pouvoir être
préparative et permettre ainsi une étude plus poussée des glycoformes fractionnées.
Environ 60 mg de GPA purifiées sont chromatographiées sur une colonne de
ConA-Sépharose 4 B (50 ml) à température ambiante selon les conditions définies par
(Bayard et Kerckaert (1980). Au terme de la chromatographie, la GPA est fractionnée en
3 glycoformes. Une fraction "exclue" ou non retenue par la ConA (GPA-A), une fraction
retardée ou moyennement retenue par la ConA (GPA-B) et une fraction retenue par la
ConA (GPA-C). Les fractions exclues et retardées sont respectivement réintroduites sur la
colonne et éluées dans les mêmes conditions. Ceci démontre que les fractions GPA-A et
GPA-B ne sont pas des sous-produits d'une éventuelle saturation de la colonne lors de la
première chromatographie.
Les fractions éluées sont concentrées, dialysées contre l'eau, lyophilisées puis
déshydratées 48 h sous P205 avant d'être pesées.
Les glycoformes de la GPA du sujet sain sont représentées dans les proportions
suivantes 43,3 % pour la GPA-A, 47,3 % pour la GPA-B et 9,4 % pour la GPA-C. Ces
résultats ne sont pas très différents de ceux mentionnés par Bayard et Kerckaert (1980 )
qui sont respectivement de 40,6 %, 43,7 % et 15,6 % obtenus à partir d'une lectine et
d'un support non commercialisés. Nous constatons au cours de la cirrhose alcoolique les
résultats suivants: 67,8 %, 26,2 % et 6 % (Tableau XIll) respectivement pour les
glycoformes GPA-A, GPA-B, GPA-C, traduisant une évolution nette en faveur des
formes non retenues au détriment des formes retardées et retenues. Tous ces résultats sont

---

- 89 -
en accord avec ceux obtenus à partir des profils en CIAE ConA où l'on observe également
chez le cirrhotique un déplacement des glycoformes vers des structures non retenues.
L'électrophorèse en gel de polyacrylamide sns (figure 28) réalisée sur
chacune des glycoformes nous a permis d'en déterminer la masse moléculaire apparente
(Tableau XIV).
On constate une diminution des masses moléculaires apparentes lorsque l'affinité
pour la ConA augmente correspondant probablement à une diminution de la teneur en
oses du fait de la moindre ramification.
L'augmentation des masses moléculaires serait plutôt l'expression d'une
glycosylation accrue. L'hypothèse la plus probable expliquant l'accroissement de la masse
moléculaire apparente des glycoformes non retenues serait en rapport avec une évolution
des chaînes glycanniques vers des structures plus ramifiées.
3. Etude des oJhmsaeebarides
3.1. Libération des oJieosaeeharides Dar hldrazinolIse
Les chaînes glycannes libérées après hydrazinolyse ont été réduites soit par le
N aBH4 non marqué dans un but préparatif, soit par le NaBH4 tritié dans un but
analytique.
3.1.1. Ç2mR2~iti2n molair~ çn m2nOSa~~h!!ridç aDrè~
hy{!r@:iin2Inç
Après réduction au NaBH4 non marqué et dessalage sur Fractogel TSK HW
40 S, l'équivalent de 200 ~g est méthanolysé puis analysé en CPG après
trifluoroacétylation. Les résultats sont reportés dans le tableau X.V.
L'analyse de ces résultats nous permet de constater que l'hydrazinolyse n'a pas
modifiée les oligosaccharides puisque nous obtenons des compositions molaires
comparables à celles de la molécule complète de GPA (Tableau XII). Ainsi,
l'hyperfucosylation et la tendance à l'hyposialylation sont confinnées. Le rendement de
l'hydrazinolyse est d'environ 90 %.

---

- 90 -
TABLEAU XIII
Distribution des glycoformes de l'al-glycoprotéine
acide de sujets sain (GPAn) et cirrhotique (GPAC>
après chromatographie d'affinité sur ConA-Sépharose
GPA-A
GPA-B
GPA-C
rendement %
GPAn
43,3
47,3
9,4
65
GPAc
67,8
26,2
6,0
80
GPA-A:
glycofonnes non retenues par la ConA
GPA-B:
glycofonnes retardées par la ConA
GPA-C:
glycofonnes retenues par la ConA
TABLEAU XIV
Masse moléculaire apparente(Da) des glycoformes de l'al-
glycoprotéine acide des sujets sains -(GPAn ) et
cirrhotiques (GPAC> après chromatographie d'affinité
sur ConA-Sépharose et déterminée en PAGE - SDS
-------------------------------------------------
GPA-A
GPA-B
GPA-C
GPAn
43000
41500
40000
GPAc
45000
43500
42000
GPA-A: glycofonnes non retenues par la ConA
GPA-B: glycoformes retardées par la ConA
GPA-C: glycofonnes retenues par la ConA

---

- 91 -
"
t
., .
"
/.
,
•
. 1
..- i .
t
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•N· !~i:
• . . '
j,
1
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..
•••• ..... ....'.1.'rf;
t:
+
,• 1
- 1 2
3
4
,
5
6
7
8
9
T
Figure 28
Electrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS des différentes
glycoformes de l'al-glycoprotéine acide humaine obtenues en
chromatographie d'affinité sur ConA-Sépharose 4B
1 - GPA-A du sujet sain
2 - GPA-B du sujet sain
3 - GPA-C du sujet sain
4 - GPA-A du sujet cirrhotique
5 - GPA-B du sujet cirrhotique
6 - GPA-C du sujet cirrhotique
7 - GPA-A de la femme enceinte
8 - GPA-B de la femme enceinte
9 - GPA-C de la femme enceinte
T- protéines étalon (phannacia® -lot nO 8104
Phosphorylase b
94000
Sérum albumine bovine
67000
"
Ovalbwnine
43000
"
Anhydrase carbonique
3()()()()
"
Inhibiteur trypsique de soja
20100
"
a-lactalbumine
14400
"
GPA-A: glycofonnes non retenues par la ConA
GPA-B : glycofonnes retardées pr la ConA
GPA-C : glycofonnes retenues par la ConA

---

- 92 -
TABLEAU XV
Composition molaire des oligosaccharides
de l'a}-
glycoprotéine acide des sujets sain (GPAD ) et cirrhotique
(GPAc) libérés par hydrazinolyse
et analysés en
1
chromatographie en phase gazeuse(CPG)
Fuc
Gal
Man·
GlcNAc
NeuAc
GPAn
0.57
3.6
3
4.5
3.5
GPAc
3.7
3
5
2.7
• Les calculs sont effectués sur la base de 3 résidus mannosyles par glycanne

---

- 93 -
3.1.2. qlycannes radiomargués Dar le bQrohydrure de sodium
tritié
Les oligosaccharides radiomarqués au NaBH4 tritié sont dessalés sur Fractogel
TSK HW 40 S à pH légèrement acide (CH3COOH 0,5 %) afin d'éliminer la radioactivité
aspécifique. L'éluat est ensuite plusieurs fois évaporé à sec en présence de méthanol
jusqu'à radioactivité constante (Tableau XVI).
3.2.Fraçtionnement de!! §ialxloIiKo§gççhilride§ Iu!r chromatoKraDhie
d'affinitç sur ~onA·SéDhargse 4 B
Environ 100 000 CPM de glycannes· radiomarqués sont chromatographiés sur
une colonne de 1cm3 de ConA-Sépharose 4B. Les conditions chromatographiques sont
celles définies par Narasimhan et al (1985). Deux fractions sont éluées. Une fraction non
retenue par la ConA (CO), éluée dans un volume de colonne par le tampon acétate
0,1 M pH 6,0 et une fraction retenue par la ConA (Cl), éluée par une solution
d'a-D-méthylglucopyranoside 10 mM en tampon acétate pH 6,0. Dans ces conditions, il
a été montré que la fraction exclue de la GPA est constituée d'un mélange de glycannes tri
et tétraantennés tandis que la fraction retenue est constituée uniquement de glycannes
biantennés (Bierhuizen et al, 1988). La fraction exclue est concentrée, dessalée sur
Fractogel TSK HW 40 S et rechromatographiée. Une seule fraction a été éluée par un
volume de colonne avec le tampon acétate 0,1 M pH 6,0. Ceci prouve que le gel de
ConA-Sépharose est en excès par rapport aux structures biantennées à retenir. L'analyse
du tableau xvn s'avère assez décevante car elle ne permet pas de mettre en évidence de
tàçon très nette une évolution vers des formes ConA non retenues au cours de la cirrhose
contrairement aux observations faites en CIAE-ConA.

---

- 94 -
TABLEAU XVI
Résultas du marquage des oligosaccharides de l'al-
glycoprotéine acide des sujets sain ( GPAo ) et
cirrhotique ( GPAC> par le NaBH4 tritié
CPM avant dessalage
CPM après dessalage
Rendement
GPAn
14400000
11100 000
77%
GPAc
7987000
6880000
86%
le rendement de 77 à 86% est probablement dû aux pertes en glycannes lors du dessalage
et/ou à la radioactivité aspécifique.
TABLEAU xvn
Distribution des différents glycannes radiomarqués
de l'al-glycoprotéine acide de sujets sain (GPAo ) et
cirrhotique (GPAC>
après chromatographie d'affinité
sur ConA-Sépharose
------------------------ ~------------------------------
ConA exclue CO
ConA retenue Cl
rendement
CPM
Pourcentage
CPM
Pourcentage
GPAn
47024
89,5
5506
10,5
75%
GPAc
73662
90,7
7556
9,3
72%

---

- 95 -
3.3.Fractionne~ent des sialyloli&Q~a~~harides nar chrornato&raphie
liquide haute gression (CLHP)
3.3.1. Préparation des &h:cannes par CLHP sur échan&eur
d'anions (Micro - Pak AX-IO)
Classiquement pour la GPA humaine, 4 classes de sialyloligosaccharides sont
obtenues en fonction du nombre de résidus sialyles portés par chaque chaîne. Pour ce
faire les glycannes sont fractionnés selon leur charge anionique sur une résine échangeuse
d'anions, la Micro - Pak: AX-10, selon la méthode de Baenziger et al (1981). La
désorption des glycannes fIxés sur le support est effectuée par un gradient en tampon
phosphate 0,5 M pH 5,2 délivré par une pompe équipée d'un microprocesseur.
3.3.2. Anal,ne de la ~ornDosition en rnQnosDccharides des
sialyloli&o~accharide~ gar chrQrnato2ranhie en ghase
.&ilzeyse aRrès rnéthanolyse
Après avoir éliminé le phosphate par chromatographie d'exclusion sur Fractogel
TSK HW40S, la composition molaire de chaque fraction est analysée par CPG après
méthanolyse (Tableau XVIII).
Les oligosaccharides libérés par hydrazinolyse sont fractionnés par CLHP en 4
fractions pour la GPAn et en 5 fractions pour le sujet cirrhotique GPAc. La fraction
supplémentaire observée chez le sujet cirrhotique est en proportion minime et non sialylée.
La faible quantité de cette fraction pourrait faire penser qu'il s'agit d'oligosaccharides
ayant subi une désialylation au cours de l'hydrazinolyse. Mais en tout état de cause,
l'absence de cette fraction FO chez le sujet sain traité dans les mêmes conditions suggère
une relation avec l'état cirrhotique.
La composition môlaire (Tableau XVIII) en oses des différentes fractions
démontre (sur la base de 3 résidus mannosyles par molécule d'oligosaccharide et en
considérant le nombre de résidus galactosyles comme indicateur du nombre d'antennes)
une évolution vers des structures plus ramifIées pour l'ensemble des fractions mono, bi et

---

- 96 -
TABLEAU XVIII
Composition molaire des sialyloligosaccharides de l'al·
glycoprotéine acide des sujets sain (GPAD ) et cirrhotique
(G P Ac> libérés après hydrazinolyse et fractionnés par
chromatographie liquide haute pression sur échangeur
d'anions
Fractions
% chaque
Fuc
Gal
Man(a)
GlcNAc(b)
NeuAc
fraction
GPAn
FO neutre
GPAc
1,5
0,42
3,42
3
3,25
0,7
GPAn
7
0,25
2
3
3,2
1,1
FI monosialyle
GPAc
10,04
0,6
3,5
3
4,6
1,2
GPAn
35
0,23
2,5
3
3,5
2,2
F2 disialyle
GPAc
30
0,7
3,2
3
4,2
2,0
GPAn
41
0,6
3,3
3
4,4
3,2
F3 trisialyle
GPAc
41,3
0,9
3,9
3
4,1
3,1
GPAn
16
0,7
4,3
3
5,2
3,9
F4 tétrasialyle
GPAc
16,5
1,4
4,0
3
4,9
4,3
(a)
Calculs effectués sur la base de 3 résidus mannosyles par oligosaccharide
(b)
Le GleNAcI de l'extrémité réductrice transformé en GlcNAcQ1 après '1ydrazinolyse
N-réacétylation et réduction n'a pas été pris en compte pour les calculs.

---

- 97 -
trisialylées (FI, F2 et F3). On peut néanmoins évoquer la possibilité d'avoir des résidus
N-acétyllactosaminyles supplémentaires au cours de la cirrhose. Mais cette hypothèse
semble peu probable car l'augmentation des résidus GlcNAc est inconstante. L'hypothèse
d'une évolution vers des oligosaccharides plus ramifiés au cours de la cirrhose est par
ailleurs en accord avec les comportements observés en CIAE - ConA et en
chromatographie d'affinité sur ConA-Sépharose 4B qui révèlent une augmentation des
formes non retenues pour la molécule entière de GPA et à un degré moindre pour les
oligosaccharides.
Considérant la composition molaire en NeuAc, on constate par rapport à
l'individu sain une hyposialylation relative car les fractions neutres, mono et trisialylées
apparaissent plus galactosylées donc probablement plus antennées.
Considérant maintenant la composition en résidus fucosyles, nous observons
une nette augmentation au cours de la cirrhose quelle que soit la fraction. Cette
augmentation semble proportionnelle au nombre de résidus Gal donc en principe au
nombre d'antennes. Cet accroissement semble aussi proportionnel au nombre de résidus
NeuAc. Or selon Paulson et al (1978), la sialylation en a 2,6 du Gal terminal d'une
antenne exclu la fucosylation en a 1,3 de la GlcNAc de la même antenne. Ceci suggère
une augmentation relative de la sialylation des antennes en a 2,3 particulièrement pour la
fraction tétrasialylée et tétraantennée F4. La présence de plus d'un résidu Fuc (1,4) dans
cette fraction implique (en supposant un résidu sialyle par antenne), l'association sur la
même antenne des résidus Fuc et NeuAc a 2,3. Une analyse détaillée par pennéthylation
de cette fraction F4 apparait donc intéressante et nécessaire pour établir avec précision la
nature des différentes liaisons osidyles.
3.4. F;ludf de la fraction F4 télrB~ialylée et tétraantennée
Les différentes fractions issues de la chromatographie par CLHP sur AX-10 ont
été analysées par pennétylation (figure 29). Des problèmes analytiques n'ont pas
permis J'interprétation des fractions FI, F2 et F3. En revanche, les tracés obtenus pour
F4 sont lisibles et homogènes. Seule, la fraction F4 tétraantennée et tétrasialylée
~
..

---

\\
~
N
-
..Irt-.....••,
7
•N"...
i
1
~
,.
11
\\0
CP
III
... .
10
%
..
2
•
2 3
~~
45
Z
«
Z
u
Chromatographie
Figure
en
29
phase gazeuse des éthers
perméthyloligosaecharides
méthyliques des
de la fradion F4 de l'al_glycoprotéine
acide de sujets sains sur une colonne OV 101
1: 2,3,4-tri-O-Me-Fuc
5: 3,4-di-O-Me
9:
-Man
6_mono-O-Me-GlcNAcMe
2: 2,4,6-tri-O-Me-Gal
6: 2,4-di-O-Me-Man
10:Témoin
3: 2.3,6-tri-O-Me
11 :4,7
-Gal
7: Témoin
,8,9-tétra-O-Me-NeuAc
4:3,6-di-O-Me-Man
8:3,6-di_O-Me-GlcNAcNMe

---

- 99 -
(puisqu'en principe chez l'Homme chaque antenne porte au maximum un résidu sialyle) a
pu être étudiée. Les rapports molaires des éthers méthyliques des monosaccharides sont
présentés dans le tableau XIX.
TABLEAU XIX
Rapport molaire des éthers méthyliques des
monosaccharides issus de la perméthylation des glycannes
de la fraction F4 (a) des sujets sain (GPAn ) et cirrhotique
(GPAc>.
ETHERS METHYLIQUES
GPAn
GPAc
2,3, 4-tri-0 -Me-FuC<b)
0,2
0,4
2,3,4,6-tétra-0 -Me-Gal
0,1
0,3
2,3,4-tri-0 -Me-Gal
2,1
2,3
2,4,6-tri-0 -Me-Gal
1,9
1,9
2,4-di-0 -Me-Man
1,1
0,8
3,4-di-0 -Me-Man
1,0
1,0
3,6-di-0 -Me-Man
0,9
1,1
3,4, 6-tri-0 -Me-Man
0,1
3,6-di-0 -Me-GlcNAcNMe
3,4
2,3
6-mono-O -Me-GlcNAcNMe
0,7
1,1
1,3,5,6-tétra-0 -Me-GlcNAcNMeol
0,9
1,1
4,7,8,9-tétra-0 -Me-NeuAc
3,9
3,8
(a) calculs effectués sur la base de la somme des 0- Me-Man = 3
(b) La valeur des résidus Fuc est sous-évaluée à cause de leur forte volatilité.
O-Me : O-méthyl ; NAcNMe : N-acétyl-N-méthyl ; GlcNAcNMeol : N-acétyl-N-
méthylglucosaminitol

---

-
100 -
1 - Le nombre de 1,3,5, 6-tétra-O-Me-GlcNAcNMeol égal 1,1 démontre que le
résidu GlcNAcNMeol (pour une quantité théorique égale à 1) n'est pas du tout substitué.
2 - Le nombre de 6-0-Me-GlcNAcNMe égal 1,1 démontre que plus d'un GleNAc
est substitué en 3 probablement en a1,3 par du fucose. Chez l'individu sain, ce nombre
est plus faible (0,7).
3 - Le nombre de 3,4,6-tri-O-Me-Man égal à 0,1 démontre qu'il n'existe
pratiquement pas de Man monosubstitué en C2 seulement, c'est-à-dire, pratiquement pas
de structure triantennée.
4 - Le nombre de 2,4-di-O-Me-Man égal à 0,8 correspond au Man 3 du noyau
théoriquement égal à 1.
5 - Le nombre de 3,6-di-O-Me-Man égal à 1,1 et celui de 3,4-di-O-Me-Man égal à
1 correspond aux Man 4 et 4' qui sont tous deux égaux en théorie à 1. Puisqu'il n'existe
pas de structure tri' pour la GPA on peut afftrmer que le nombre de 3,4-di-O-Me-Man
correspond au nombre de structures tétraantennées en l'occurence 100 %.
6 - Le nombre total de résidus galactosyles est aux environs de 4. Ces Gal sont
substitués en proportion quasi équivalente en 3 ou en 6 probablement par des résidus
NeuAc.
7 - L'analyse de la fraction F4 montre que la totalité du Fuc est ftxé par une liaison
1,3 sur la GleNAc des antennes.
La présence de 1,4 résidus Fuc par oligosaccharide implique l'association sur plus
d'une antenne et l'augmentation de la séquence NeuAc - Gal- ([Fuc] - GleNAc) chez le
sujet cirrhotique. Notons toutefois, que cette séquence est aussi présente chez le sujet sain
qui possède 0,7 résidu Fuc pour la fraction F4. Cette structure correspondrait à l'antigène
sialylé de Lewis X (Fukushim~ et al, 1984; Hakomori, 1985).
Aftn de préciser l'anomérie et la position des résidus NeuAc et Fuc sur chaque
antenne, les fractions F4 du cirrhotique (F4c) et du sujet sain (F4n) ont été analysées en
résonance magnétique nucléaire (RMN) du proton 1 à 400 MHz. Dans le but d'avoir plus
d'informations sur la position du Fuc, les analyses ont porté sur les GleNAc 5, 5' ou
7,7'. La différence fondamentale entre les spectres RMN représentés à la même

---

-
101 -
échelle des fractionsF4n et F4c réside dans la présence d'un résidu Fuc pour l'un et deux
résidus Fuc pour l'autre liés en a 1,3 sur les GlcNac 7 et/ou 7' (figure 30). On
remarque également que les antennes 7 et 7' correspondant aux antennes fucosylées sont
toujours sialylées en a2,3 . En revanche, les antennes non fucosylées 5 et S' sont
toujours sialylées en a2,6. La séquence relative à l'antigène sialylé de Lewis X
représentant une structure mineure chez l'individu sain est amplifiée chez le sujet
cirrhotique. Une structure identique a été identifiée dans dans les glycoprotéines isolées de
métastases hépatiques de certains cancers (Chandrasekaran et al ,1984 ).
L'hyperfucosylation observée chez un seul individu cirrhotique est-elle
toujours présente dans la cirrhose ? Dans ce but, nous avons entrepris l'étude de la
composition en oses d'une population de cirrhotiques en la comparant à celle d'une
population témoin.
4 - Composition en oses de l'al-glycoprotéine acide de sujets cirrhotiques
Comparaison à celle de l'al-glycoprotéine acide d'une population saine
4.1. Définition de la population choisie
Pour notre étude. deux populations ont été constituées. Une population de
mâles adultes, sains (n = 14) représentant notre échantillon témoin et une population de
patients mâles (n = 14) présentant une cirrhose alcoolique. Les prélèvements de sang
veineux sont effectués sans anticoagulants. Trente minutes après le prélèvement, le sérum
est recueilli après centrifugation, 10 min à 1000 g à +4°C et conservé à -20°C avant la
purification de la GPA par chro~tographied'immunoaffinité.
4.2. Etude du profil en CIAE-ConA
En CIAE-ConA, on observe une évolution vers des glycoformes non retenues.
Le pourcentage du pic 1 égal à 0,62 ± 0,07 n'est pas significativement différent de celui
calculé à partii du liquide d'ascite d'un seul individu cirrhotique pour lequel il est égal à
0,69. En ce qui concerne la population d'individus sains ce pourcentage est de
0,42±0,03.

---

-
102 -
G)
NCl&Ac a.2 ...., Oal8J -... CGJeNAcBJ
r---------.J
'6
1
,
ManaJ
A
1
2
\\
",-'
Ncl&Aca2 . . . 6GalBI ---..4GlcNAc8I'/
V"ucal-3),
6
,
17'\\
1
-
V
ManSJ - - . 4GIcNAc8J .. 4OJcNAc-O'
,
NcllAca2 _
3Gal8J ---..4GlcNAc81
L - - -
J
"'-.4
3
1
ManaJ
2
NcuAca.2 __ 6GaJBI _4GIc~Aclll'/
N~"c 0.2 -..3 GalBJ ---+ o
4GlcNAc8J
FJaJ.3 '-......6
ManaJ
B
2
\\
NcuAca2 __ 6GaJ8J --.4G1CNAC8J"/
6
ManlU -----. 4GlcNAc8J .. 40lcNAco'
NeuAca2 _
3GaJ8J
o
-----.4G/cNAc8J
FuctJ o 3 "--4
1
ManaJ
2
NeuAca2 __ 6GaJlll_4GlcNAcBl / '
Figure 30
Structure primaire des oligosaccharides tétraantennés
tétrasialylés fucosylés des glycannes de Ilal·.
glycoprotéine acide de sujets sain (A)et cirrhotique(B)

---

-
103 -
4.3. Composition en oses après purification de la GPA
Les méthodes de purification sont rigoureusement identiques à celles utilisées
pour le liquide d'ascite. La composition molaire (tableau XX ) calculée sur la base de 3
résidus mannosyles par oligosaccharide confirme l'augmentation des oses totaux chez les
patients cirrhotiques 45 ± 3 % contre 40 ± 4 % chez les individus sains.
Ce tableau confirme les données déjà observées chez un individu cirrhotique à
savoir l'augmentation en résidus fucosyles observée ici dans la totalité de la population de
cirrhotiques qui sont plus du double par rapport à ceux de la population de sujets sains
1,1 ± 0,3 contre 0.41 ± 0,1. On constate aussi une hyposialylation relative comme cela
avait été déjà décrit dans les cirrhoses hépatiques par Serbource-Goguel et al (1983). Ces études
réalisées sur une population plus importante de cirrhotiques, bien que sommaires,
confinnent certaines altérations observées chez notre individu isolé. Ces altérations se
résument essentiellement en une modification du profil en CIAE-ConA au profit des
glycofonnes non retenues et une forte augmentation du degré de fucosylation. Ces deux
derniers paramètres peuvent être considérés comme des marqueurs très sensibles de la
cirrhose bien qu'il ne soient pas spécifiques. En effet, une hyperfucosylation des
glycoconjugués est aussi retrouvée dans certain') processus néoplasiques et au cours des
hépatites (Biou et al ,1989) bien que dans ce dernier cas, elle ne soit pas constante.
8 - APPROCHE DE LA STRUCTURE GLYCANNIQUE DE L'al-
GLYCOPROTEINE ACIDE AU COURS DU 3ème TRIMESTRE DE
LA GROSSESSE
Comme nous l'avons indiqué dans les chapitres précédents, la GPA a été
purifiée d'un mélange de sérums de femmes enceintes prélevées au cours des 7, 8 et gèmes
mois de la gestation. Au cours de la grossesse, l'évolution vers des glycoformes non
retenues par la ConA est révélée par l'augmentation très significative de la proportion du
pic 1 en CIAE-ConA (0,81 contre 0,42 chez l'individu sain). L'augmentation des formes

---

-
104 -
non retenues en CIAE-ConA est en accord avec les observations antérieures faites par
Wells et al (1981) et Raynes (1982).
1. Composition en oses de l'al-glycoprotéine acide au cours du 3ème
trimestre de la grossesse.
Un mélange de GPA purifiée de sérums de femmes enceintes est analysé sur le
plan de la composition molaire en oses et toujours sur la base de 3 résidus mannosyles
par chaîne oligosaccharidique (tableau XXI).
n n'existe pas de différence notable lorque l'on analyse les rapports molaires.
Cependant, on constate une légère augmentation des résidus galactosyles au cours du
3ème trimestre de grossesse. Cette différence est-elle significative? Elle ne l'est pas
compte tenu du petit nombre de détenninations effectuées. Toutefois, cet écart s'il était
confinné pourrait expliquer l'aspect observé en CIAE-ConA vers une disparition presque
totale des glycofonnes retenues et retardées. La proportion de structures biantennées de la
GPA chez l'Homme est d'environ 14 %. Par ailleurs, selon Bierhuizen et al (1988), des
relations existent entre le nombre de chaînes glycannes biantennées et le comportement en
chromatographie sur ConA Sépharose. Ainsi, la GPA retenue est composée de 40 % (2
chaînes sur 5) de structures biantennées tandis que la GPA retardée en comprend
seulement 20 % (1 chaîne sur 5) et les glycofonnes non retenues aucune. Une simple
transfonnation de structure biantennée en structure triantennée implique donc une totale
évolution en CIAE-ConA vers des formes non retenues. Si l'on peut faire le
rapprochement entre les comportements en chromatographie ConA-Sépharose et en
CIAE-ConA, l'augmentation correspondante dans le rapport molaire en Gal peut se
calculer. Ainsi, pour la GPAn, nous avons 3,6 Gal x 5 = 18 résidus galatosyles/mole.
Une évolution complète des structures biantennées vers des structures triantennées devrait
se traduire par 5 x 0,14 (3 - 2) = 0,7 Gal supplémentaire/mole soit 0,7 /5 = 0,14 Gal
supplémentaire/chaîne oligosaccharidique. Ce faible écart compte tenu de la précision de
la mesure des rapports molaires du Gal (3,6 ± 0,1 ; n = 14) ne permet pas d'observer des

---

-
105 -
TABLEAU XX
Composition molaire en oses de l'al-glycoprotéine acide
isolée du sérum d'individus sains (GPAo) et cirrhotiques (GPAC>
--------------------------------------------------------------------
Fuc
Gal
Man·
GleNAc
NeuAe
Total %
--------------------------------------------------------------------
GPAn
0,4 ± 0.1
3.6 ± 0.1
3
5.2 ± 0.2
3.6 ± 0.3
40 ± 4
(n =14)
GPAc
1.1 ± 0.3 '
3.7 ± 0.2
3
5,4 ± 0.2
3.3 ± 0.2
45 ± 3
(n = 14)
• rapport molaire calculé sur la base de 3 résidus mannosyles par oligosaceharide
TABLEAU XXI
Composition molaire en oses de l'a I-glycoprotéine acide de
sujets sains (GPAn ) et chez la femme au cours du
3è trimestre de grossesse ( GPAr)
Fue
Gal
Man·
GleNAc
NeuAc
Total %
GPAn
0,41 ± 0.1
3.6 ± 0.1
3
5.2±0.2
3.6±0.3
40±4
(n = 14)
GPAf
0.26 ± 0.04
3.67 ± 0.11
3
5.10 ± 0.22
3.39 ± 0.60
43 ± 1
(n =4)
* Voir commentaires Tableau XX.

---

-
106 -
différences significatives. L'augmentation des résidus galactosyles traduit probablement
une évolution vers des unités N-acétyllactosaminyles supplémentaires et expliquerait en
partie l'augmentation relative des oses totaux qui de 41 % passent à 43% . Par ailleurs.
par rapport à l'individu sain, on observe une diminution des résidus fucosyles au cours de
la grossesse.
2. Fractionnement des glycoformes de l'al- glycoprotéine acide
en chromatographie d'affinité sur ConA Sépharose 4B
Le comportement de la GPA observée vis à vis de la ConA en CIAE-ConA
est-il conservé en chromatographie d'affinité sur ConA Sépharose. La GPA (60 mg)
est
chromatographiée sur une colonne de ConA Sépharose selon la technique de Bayard et
Kerckaert (1980) comme précédemment décrite (chapitre IV § 2 ). Le tableau XXII
présente les résultats obtenus.
GPA-A: glycoforme non retenue par la ConA
GPA-B : glycoforme moyennement retenue ou retardée par la ConA
GPA-C : glycoforme retenue par la ConA
Au cours du dernier trimestre de la grossesse. on observe une disparition
presque totale des glycoformes retardées et retenues comme nous l'avons indiqué
précédemment. Nos résultats en ce qui concerne l'individu sain sont en accord avec ceux
de Bayard et Kerckaert (1980 ): 40,6 %. 43.7 % et 15.6 % respectivement pour les
glycoformes GPA-A. GPA-B et GPA-C. En ce qui concerne la grossesse. les résultats
(94.3 %. 2 % et 3.5 % respectivement pour les GPA-A. GPA-B. GPA-C) concordent
avec ceux obtenus en CIAE-ConA où l'on observe un déplacement presque global vers des
glycoformes non retenues. Les masses moléculaires apparentes calculées à partir de
l'électrophorèse en gel de polyacrylamide SOS montrent bien que les glycoformes exclues
sont enrichies en glycannes (Tableau XXIII}. L'accroissement de la masse moléculaire
apparente d'une façon générale est l'expression d'un enrichissement en chaînes glycannes
(Bierhuizen et al .1988).

---

-
107 -
TABLEAU XXII
Distribution des glycoformes de l'a,l-glycoprotéine acide
de
sujet sain (GPAn) et de la femme au cours du 3è trimestre de
grossesse ( GPAr) après chromatographie d'affinité sur
ConA Sépharose 4B.
-----------------------------------------------------------------
GPA-A
GPA-B
GPA-C
rendement %
%
%
%
GPAn
43,3
47,3
9,4
65
GPAf
94,3
2
3,5
65
GPA-A: glycofonnes non retenues par la ConA
GPA-B: glycofonnes retardées par la ConA
GPA-C: glycofonnes retenues par la ConA
TABLEAU XXIII
Masse moléculaire apparente*( Da)
des glycoformes de
l'a,l-glycoprotéine acide du sujet sain (GPAn) et au
cours de la grossesse (GPAr)après chromatographie
d'affinité sur ConA Sépharose 4B
GPA-A
GPA-B
GPA-C
GPAn
43000
41500
40000
GPAf
45000
43000
41000
*Masse moléculaire apparente détenninée par PAGE-SOS
GPA-A: glycofonnes non retenues par la ConA
GPA-B: glycofonnes retardées par la ConA
GPA-C : glycoformes retenues par la ConA

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-
108 -
3. Fractionneme~t des sialylolïgosaccharides radiomarqués par
chromatographie d'affinité sur ConA-Sépharose 4
B
Afin d'éliminer la radioactivité aspécifique (Chapitre IV - § 2.2), les
oligosaccharides radiomarqués sont dessalés sur TSK HW 40 S (Tableau XXIV), puis
100.00 CPM de sialyloligosaccharides sont chromatographiés sur ConA-Sépharose 4 B
dans les conditions bien définies (chapitre IV). Deux fractions ont été isolées : une
fraction non retenue (CO) et une fraction retenue (Cl) par la ConA (Tableau XXV).
L'analyse des sialyloligosaccharides radiomarqués en chromatographie d'affinité
sur ConA-Sépharose montre une diminution des formes retenues par la ConA qui passent
de 10,5 % à 3,6 % dans le dernier trimestre de la grossesse. La diminution de la
proportion des formes ConA-retenues et l'augmentation des formes ConA-non retenues
des glycannes viennent confirmer les résultats obtenus en CIAE-ConA, à savoir que le
déplacement des glycoformes observé en CIAE-ConA reflète bien une altération des
glycannes c'est-à-dire une évolution vers des formes ConA-exclues. Par ailleurs, une
étude en chromatographie d'affinité sur ConA-Sépharose des oligosaccharides
préalablement séparés par électrophorèse à haut voltage et désialylés montre que 95,1 %
sont exclus par la ConA (résultats non publiés). Puisque le comportement des
oligosaccharides sialylés ou non est identique en ConA-Sépharose, nous pouvons dire :
i) que l'augmentation des glycannes exclus au cours de la grossesse n'est pas due
à la présence d'acide sialique lié en a.2-6 sur une GleNAc S ou S'.
ii) que l'augmentation des glycannes exclus est vraisemblablement due à une
;i, :~mentation des proportions des glycannes multibranchés (tri ou tétraantennés). Cela
reste toutefois à prouver.

---

-
109 -
TABLEAU XXIV
Résultat du marquage des oligosaccharides de l'al-glycoprotéine
acide par le NaBH4 tritié chez le sujet sain ( GPAn) et au cours
du 3è trimestre de grossesse (GPAr)
CPM avant TSK
CPM après TSK
% récupération
GPAn
14.400.000
11. 100.000
77
GPAf
18.000.000
14.540.000
80
TABLEAU
XXV
Distribution des glycannes de l'al-glycoprotéine acide après
chromatographie d'affinité sur ConA-Sépharose des
sialyloligosaccharides radiomarqués chez le sujet sain
(GPAn ) et au cours du 3è trimestre de
grossesse ( GPAr).
CO%
Cl %
rendement
GPAn
89,5
10,5
75%
GPAf
96,4
3,6
90%
co :glycannes non retenus par ConA
Cl : glycannes retenus par la ConA

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DISCUSSION· CONCLUSION GENERALE

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110 -
La plupart des glycoprotéines plasmatiques présentent une microhétérogénéité au
niveau de la copule glycannique sans rapport direct avec des mutations au niveau du gène.
Ainsi. la même glycoprotéine peut exister sous la forme de nombreuses glycoformes qui
diffèrent entre elles par la structure de leurs chaînes oligosaccharidiques.
L'al-glycoprotéine acide (GPA) de par sa richesse en oses est à cet égard
particulièrement intéressante à étudier. Si la GPA possède un rôle ou une fonction
biologique. on peut supposer que l'enveloppe externe glycannique. au coeur des relations
stéréochimiques avec l'environnement extra ou intracellulaire participe de près ou de loin à
ce rôle. Chez l'Homme sain. la structure glycannique de la GPA est dominée par un taux
de sialylation élevé et un haut degré de branchement La microhétérogénéité des glycannes
est particulièrement importante pour cette glycoprotéine et se traduit notamment dans les
techniques physico-chimiques ou immunochimiques par un aspect très diffus de la bande
après révélation.
Parmi les nombreuses techniques physico-immunochimiques disponibles.
l'immunoaffinoélectrophorèse croisée en présence d'une lectine et notamment
la
concanavaline A (CIAE-ConA) occupe une place prépondérante. En effet. cette technique
s'avère particulièrement intéressante et sensible pour révéler des altérations glycanniques.
On peut donc affirmer que toute altération du profil en CIAE-ConA est associée à une
altération glycannique. Mais l'inverse n'est pas forcément vérifié. Un certain nombre
d'altérations à la périphérie des chaînes glycannes demeureront silencieuses en CIAE-
ConA. TI n'est pas possible de définir une altération précise de la structure glycannique en
relation avec une modification du profil CIAE-ConA. Ainsi. une augmentation des fonnes
non retenues en CIAE-ConA est généralement associée à une évolution vers des
glycannes plus ramifiées mais il existe de nombreuses exceptions à cette règle. Pour
l'acide sialique. en principe le degré de sialylation sur les résidus galactosyles pénultièmes
n'intervient pas dans l'affinité pour la ConA (Bierhuizen et al .1988 ). Cependant. pour la
GPA chez le Rat. il existe une différence dans le pourcentage en formes retenues par la
ConA avant et après désialylation. Une étude très précise au niveau structural a permis de

---

-
111 -
démontrer pour l'hémopexine de Rat· que les structures biantennées, sialylées sur le
résidu galactosyle pénultième et sur le résidu N-acétylglucosaminyle antépénultième ne
sont pas reconnues par la ConA (Bernard et al, 1984 ). En revanche, après désialylation
par la neuraminidase, elles le sont .
NeuAcQ2-6Gal~14GIcNAc~1-2ManQl\\
6
1
Man~l-4GIcNAc~l-4GIcNAc~l·NAsn
NeUACQ2~Gal~1-\\3GIcNAc~1.2ManQ!
1
6
NeuAcJ
L'acide sialique peut aussi intervenir indirectement en CIAE-ConA par son action sur la
mobilité électrophorétique de la GPA. Par exemple, Lefèvre et Jardillier (1989) ont
constaté une sous-évaluation en CIAE-ConA des formes retenues par la ConA. On peut
penser que ces formes hyposialylées étant moins mobiles comme l'ont démontré Biou et
al (1980) seront plus sensibles au courant d'électroendosmose dirigé vers la cathode et de
ce faît ne seront pas ou peu neutralisées par les Ac contenus dans le ge) de 2ème
dimension. Pour éviter cette sous-évaluation, on peut suggérer une simple électrophorèse
d'affinité dans la 1ère dimension avec immunofixation et quantification après révélation du
complexe lectine-glycoprotéine-Ac. L'utilisation de la CIAE-ConA comme technique de
dépistage d'altérations glycanniques a été décrite par de nombreux auteurs chez différentes
espèces et à propos de nombreuses glycoprotéines. En ce qui nous concerne, elle nous a
permis de révéler des altérations de la structure glycannique chez l'Homme pour la GPA
et l'a2HS (Jezequel et al, 1986) au cours de divers états physiopathologiques
(Seta et al, 1989).
Dans ce travail, nous avons observé que la cirrhose alcoolique modifie le profil
CIAE-ConA de la GPA au profit des formes ConA-non réactives. Des observations
• Sttueture d'\\D1C N-glycoprotéine bianlennée aisialylée isolée de l'hémopexine de rai (Bernard el al, 1984).

---

-
112 -
similaires ont été décrites pour 1'0.2 HS (Jezequel et al, 1986). La modification du profil
en CIAE-ConA de la GPA du sujet cirrhotique va dans le même sens que celle de 1'0.2
HS. Des modifications semblables ont été observées avec la transferrine dans des
pathologies identiques (Spik et al, 1983). Au contraire, dans les processus inflammatoires
aigus, le comportement des protéines telles que la GPA, entraîne une modification du
profil CIAE-ConA en faveur de fonnes ConA retenues (Nicollet et al, 1981 ; Raynes,
1982). On peut donc dire que les différents niveaux de dysfonctionnements hépatiques
peuvent avoir une incidence sur le mécanisme de glycosylation. Ceci expliquerait
pourquoi au cours d'états physiopathologiques bien définis, des profils CIAE-ConA
identiques sont retrouvés. Les modifications observées dans les glycofonnes de GPA
pendant la grossesse sont en accord avec celles décrites par Wells et al (1981), Seta et al
(1989). Ainsi, les profils en CIAE-ConA des glycofonnes du sujet cirrhotique et du
dernier trimestre de la grossesse évoluent tous deux vers des fonnes ConA exclues. Mais
cette évolution dépend probablement de mécanismes moléculaires différents.
Nous nous sommes ainsi intéressés aux altérations de la GPA au cours de
différentes atteintes hépatiques. Le foie étant le principal organe de synthèse de la GPA, il
nous a paru intéressant d'étudier les altérations glycanniques de la GPA ou d'autres
glycoprotéines au cours de l'insuffisance hép'atocellulaire du cirrhotique. Préalablement à
ce travail, des altérations de la structure glycannique de la GPA avaient été constatées par
des méthodes indirectes d'investigation notamment une hyposialylation (Biou et al, 1981 ;
Bordas et al, 1981) et une augmentation des fonnes non retenues par la ConA. Mais
quelles sont au niveau moléculaire les véritables altérations de la GPA ? Notre travail a
tout d'abord été mené chez un seul individu dont l'état pathologique, la cirrhose, était bien
établi et qui présentait en outre "l'avantage" d'être atteint d'une ascite ce qui nous
permettait de disposer d'importants volumes de liquide biologique à purifier.
Pour l'isolement et la purification de la GPA, la chromatographie
d'immunoaffinité a donné des résultats satisfaisants. La GPA est purifiée en une
seule étape. L'albumine qui demeure le principal contaminant représente moins de

---

-
113 -
0,5 % de la GPA. Par ailleurs, cette purification par chromatographie d'immunoaffinité
n'a pas généré ni sélectionné des sous-populations glycanniques différentes comme le
confinnent les résultats avant et après purification. L'étude de la composition molaire des
glycannes de la GPA purifiée du sujet atteint de
cirrhose éthylique indique une
augmentation de la teneur en oses et une hyperfucosylation. Elle indique aussi une relative
hyposialylation des chaînes glycannes en accord avec l'hyposialylation plus ou moins
importante observée par Serbource-Goguel et al (1983 ). Dans ce travail, nous
démontrons deux modifications majeures au niveau des glycannes de la GPA isolée chez
le patient cirrhotique. Ces modifications portent sur:
i) le nombre d'antennes par chaîne oligosaccharidique.
ü) les résidus sialyles et fucosyles en périphérie des antennes.
On observe dans un premier temps une transformation des oligosaccharides
biantennés en structures tri et tétraantennées. Dans la cirrhose alcoolique, il y aurait une
diminution relative de l'activité galactosyltransférase au profit d'une activité N-
acétylglucosaminyltransférase IV et V qui génère des glycannes tri et tétraantennées
(Schachter, 1984). ,
Le second type de modification touche les résidus fucosyles. L'augmentation du
nombre de résidus fucosyles parait caractéristique des troubles hépatiques étudiés dans le
cadre de ce travail. Cette hyperfucosylation est retrouvée chez tous les patients
cirrhotiques étudiés (Fuc = 1,1 ± 0,3; n = Il contre 0,40 ± D,Dl pour les sujets sains
(n = 3). Outre la cirrhose alcoolique, l'hyperfucosylation de la GPA est retrouvée dans
d'autres atteintes hépatiques telles que l'hépatite chronique, l'hépatite virale et l'hépatite
aiguë (Biou et al, 1989). L'analyse par perméthylation et en spectroscopie RMN à 400
MHz des structures tétrasialylées isolées de la GPA du sujet cirrhotique et du sujet sain
telles que nous les indiquons (figure 30 ) démontre chez le sujet cirrhotique la présence
de structures hyperfucosylées avec des résidus fucosyles liés en 7 et 7' sur les résidus
N-acétylglucosaminyles. Cette structure définie correspond au déterminant sialylé de

---

-
J 14 -
Lewis X: NeuAc (0.2 - 3) Gal (13 1-4) [Fuc (a 1 - 3)] GlcNAc. Une telle structure a été
aussi rencontrée dans les 'métastases hépatiques de tumeurs variées (Chandrasekaran
et al, 1984) et dans le sang de patients cancéreux (Sears et al, 1985) ; chez l'individu
sain, elles seraient présentes en quantité beaucoup plus faible. Le détenninant sialylé de
Lewis X est considéré par certains auteurs comme un marqueur précoce de certaines
affections tumorales ( Kawabara et al, 1985). Dans notre travail, nous montrons pour la
1ère fois que l'expression du déterminant sialylé de Lewis X est aussi augmentée dans
une affection bénigne: la cirrhose alcoolique. L'hyperfucosylation des glycoconjugués en
pathologie est bien connue et généralement décrite cormne marqueur d'affection tumorale.
Une grande variété de glycolipides fucosylés est rencontrée dans plusieurs cancers en
particulier ceux du tractus gastrointestinal, des poumons et des glandes mammaires
(Hakomori, 1985). L'augmentation de la fucosylation de l'a foetoprotéine a aussi été
décrite chez des patients développant un carcinome hépatocellulaire primaire (Aoyagi et
al, 1985). L'hyperfucosylation cormne le prouve notre travail démontre que la présence de
ce déterminant est dans le cas de notre malade, un marqueur d'un dysfonctionnement
hépatique bénin, plutôt que le témoin d'un processus néoplasique. La remarquable
hyperfucosylation observée chez un seul individu cirrhotique est~elle un marqueur
sensible et constant d'une insuffisance hépatocellulaire et plus particulièrement est-elle
toujours présente au cours de la cirrhose ou tout autre atteinte hépatique telle qu'une
hépatite associée à un syndrome de cytolyse? Une étude de la composition en oses de la
GPA menée sur une population de cirrhotique (n = 14) et d'hépatite virale (n = 14) nous
a permis de constater que l'hyperfucosylation était un signe toujours présent au cours de
la cirrhose (sensibilité 100 %). Elle n'est cependant pas spécifique puisqu'on la retrouve à
des degrés variables au cours des syndromes de cytolyse. Ces résultats suggèrent que
l'hyperfucosylation doit plutôt être considérée comme un marqueur d'un
dysfonctionnement hépatocellulaire. L'activité basale de la fucosyltransférase a 1,3 est-
elle augmentée? Les activités fucosy1transférases sur les GlcNAc 7 et 7' se manifestent-
elles avant ou après celles des sialyltransférases a 2,3 ? Le fait d'avoir toujours une

---

-
115 -
association sur une même antenne des résidus Neu Ac ex 2,3 et Fuc ex 1,3 et jamais des
résidus Neu Ac ex 2,6 et Fuc ex 1,3 (Paulson et al, 1978) suggère que l'activité
fucosyltransférase ex 1,3 est exclusive de l'activité sialyltransférase ex 2,6.
Pourquoi nous sommes-nous intéressés au modèle de la grossesse? En CIAE-
ConA, les profils observés en physiopathologie sont classés en 2 types: le modèle de
l'inflammation aiguë avec une augmentation des formes retenues et le modèle de la
grossesse avec une augmentation des formes non retenues (Wells et al, 1981 ; Raynes,
1982). On peut classer dans ce dernier cas, les évolutions observées au cours de deux
situations aussi différentes que la cirrhose et le 3ème trimestre de la grossesse. Au cours
de la cirrhose, nous avons démontré une évolution vers des structures plus ramifiées en
accord avec les observations faites en CIAE-ConA et la présence de structures originales
hyperfucosylées. Les mêmes modifications au cours du 3ème trimestre de la grossese
sont - elles observées ?
L'analyse de la composition molaire en oses démontre simplement une légère
augmentation non significative des résidus galactosyles, sans hyperfucosylation. Le
comportement en chromatographie d'affinité en présence de ConA recoupe celui observé
en CIAE-ConA. Notamment l'analyse des sialo ou asialoglycannes démontre la
diminution d'au moins 50 % des formes retenues au profit des formes non retenues.
Aucune différence dans le comportement en chromatographie d'affmité en présence de
ConA et notamment pas d'augmentation des formes retenues n'a été constatée sur les
asialoglycannes par rapport aux sialoglycannes (Biou et al, résultats non publiés). Il
n'existe donc pas de glycannes biantennés sialylés sur les GlcNAc 5 ou SI comme cela a
été décrit chez le Rat pour l'hémopexine (Bernard et al, 1984 ). Une étude plus poussée
après fractionnement des glycannes par électrophorèse à haut voltage suivie d'une
chromatographie d'exclusion sur Biogel P4 a démontré une évolution vers des formes de
masse moléculaire supérieure, non retenues par la ConA, mais qui ne semblent pas
originales sur le plan structural .

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