UNIVERSITE LOUIS PASTEUR STRASBOURG 1
1989
THESE
présentée à
L'UFR DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE
pour obtenir
le titre de
DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR
Domaine: BIOWGIE MOLECULAIRE VEGETALE.----
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ETUDE DE LA STRUCTURE DES GENES DE tRNA DE LA
MITOCHONDRIE DE MAIS (Zea mays) ET COMPARAISON DE
LEUR LOCALISATION DANS LES LIGNEES MALE-FERTILE (N)
ET MALE-STERILE (cms-T)
Soutenue le 14 septembre 1989 devant la Commission d'Examen
MM.
G.
DIRHEIMER,
Président. Rapporteur interne
J.H. WEIL,
Examinateur
F.
QUETIER,
Rapporteur externe
J.M. GRIENENBERGER.
Examinateur

---

à Monsieur et Madame Guissé
à mes Parents

---

Je tiens à remercier Monsieur le Professeur J.H. WEIL de m'avoir
accueilli dans son laboratoire à l'Institut de Biologie Moléculaire des Plantes du
CNRS à Strasbourg et de m'avoir aidé de ses conseils et encouragements.
Je suis reconnaissant à Monsieur le Professeur G. DIRHEIMER qui m'a
fait l'honneur de présider ce jury de thèse ainsi qu'à Monsieur le Professeur
F. QUETIER qui a accepté de juger ce travail.
Ce travail a été réalisé sous la direction de J.lvf. GRIENENBERGER à qui
je dois mon initiation aux techniques de la Biologie Moléculaire. Sans lui ce travail
n'aurait pu être mené à terme. Je tiens à lui exprimer toute ma reconnaissance.
Une partie du travail présenté ici a été réalisée avec la collaboration de
ValentinNEGRUK. Qu'il trouve ici l'expression de ma gratitude.
Je remercie également toutes les personnes, chercheurs et techniciens de
l'I.B.M.P. et de l'I.B.M.C., qui ont directement ou indirectement participé à la
réalisation de ce travail.
Je tiens aussi à remercier Carine Schwoob qui n'a pas ménagé ses efforts
pour la dactylographie de ce travail.

---

TABLE DES ABREVIATIONS
aa
acide arruné
BSA
sérum albumine bovine
Bis-acrylamide
N, N'-méthylène-bis-acrylamide
CCAse
tRNA nucléotidyl-transférase
Ci
curie
cms
stérilité mâle cytoplasmique
dATP
2'-désoxy-adénosine-S'-triphosphate
dCTP
2'-désoxy-cytidine-5'-triphosphate
ddNTP
2',3'-didésoxynucléoside-S'-triphosphate
DEAE
diéthylarrunoéthyl
dGTP
2'-désoxy-guanidine-S'triphosphate
DMSO
diméthyl sulfoxyde
DNA
acide désoxyribonucléique
DNAseI
désoxyribonucléase l
dNTP
2'-désoxy-ribonucléoside-5'-triphosphate
D.O·A
densité optique à A nm
DTT
dithiothréitol
dTTP
2'-désoxy-thymidine-S'-triphosphate
EDTA
éthylène diarrùne triacétate de sodium
HEPES
acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique
IPTG
isopropyl ~-D-thiogalactoside
kb
kilo paires de bases (= 1OOOpb)
rnRNA
RNA messager
nm
nanomètre
PDE
phosphodiestérase du venin de serpent
pb
paire(s) de bases
plv
poids à volume
PEG
polyéthylène glycol
qsp
quantité suffisante pour
RNA
acide ribonucléique
RNAse
Ribonucléase
rRNA
RNA ribosomique
RPC
reversed phase chromatographie
rprn
rotations par minute
SDS
dodécylsulfate de sodium
SSC
standard saline citrate
TCA
acide trichloro acétique
TEB
Tris-Borate-EDTA
TEA
Tris-Acétate- EDTA

---

TEMED
N, N, N', N'-tetraméthyléthylènediamine
Tris
tris(hydroxyméthyl)aminométhane
tRNA
RNA de transfert
u.v.
ultra violet
v/v
volume à volume
X-gal
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ~-D-galacto-pyranoside
Abréviation des acides aminés
A
=
Ala
Alanine
C
=
Cys
Cystéine
D
=
Asp
Acide aspartique
E
=
Glu
Acide glutan:?-que
F
=
Phe
Phénylalanine
G
=
Gly
Glycine
H
=
His
Hystidine
1
=
ne
Isoleucine
K
=
Lys
Lysine
M
=
Met
Méthionine
N
=
Asn
Asparagine
p
=
Pro
Proline
Q
=
GIn
Glutamine
R
=
Arg
Arginine
S
=
Ser
Serine
T
=
Thr
Thréonine
V
=
Val
Valine
W
=
Trp
Tryptophane
y
=
Tyr
Tyrosine
nucléotide rnQdifit
3-(3-amino-3-carboxyhydroxymethy1)Uridine

---

iNTRODUCTiON

---

Les génomes mitochondriaux des plantes supérieures se caractérisent par leur
grande taille et par la complexité de leur structure si on les compare aux autres génomes
mitochondriaux connus. Leur taille varie de 208 kb chez Brassica hirta (PALMER et
HERBüN, 1987) à 2400 kb chez la pastèque (WARD et coll., 1981), alors que les
génomes mitochondriaux des mammifères mesurent entre 15 et 18 kb et ceux des
champignons entre 18 et 78 kb (pour une revue, voir GRIVELL, 1983). La complexité
structurale des génomes mitochondriaux des plantes supérieures s'explique par la
présence de séquences répétées, directes ou inversées, qui sont impliquées dans des
phénomènes de recombinaison intra- et inter- moléculaire. De nombreuses séquences
répétées directes et inversées peuvent être présentes dans le même génome (QUETIER et
coll., 1985 ; LONSDALE et coll., 1984) et le nombre des différentes recombinaisons
dans lesquelles ces séquences sont impliquées peut être très élevé générant ainsi un très
grand nombre de molécules de tailles et de structl.~res différentes (LüNSDALE et coll.,
1984). De nombreuses observations en microscopie électronique (KOLODNER et
TEWARI, 1972 ; VEDEL et QUETIER, 1974 ; QUETIER et VEDEL, 1977 ;
SYNENSKI et coll., 1978) et des études physico-chimiques (VEDEL et QUETIER,
1974 ; WARD et coll., 1981) avaient déja mis en évidence cette structure complexe et
hétérogène du DNA mitochondrial des plantes supérieures.
Depuis les travaux de PALMER et SHIELDS (1984) sur le génome de Brassica
campestris, les études de cartographie sur les génomes mitochondriaux de plusieurs
plantes ont montré que la structure de ces génomes peut être représentée sous la forme
d'une seule molécule circulaire appelée cercle maître ou chromosome maître. Le cercle-
maître est une construction théorique déduite de la cartographie des cosmides contenant le
DNA mitochondrial cloné. Il comporte toute l'information génétique contenue dans la
mitochondrie et tous les jeux de séquences répétées. Les recombinaisons entre les
séquences répétées génèrent des molécules de plus petite taille lorsqu'il s'agit de
recombinaison entre des séquences répétées directes ou provoquent des inversions de
séquences lorsque les recombinaisons impliquent des séquences répétées inversées
(LüNSDALE, 1988).

---

2
La présence de ces séquences répétées, bien que largement répandue parmi les
génomes mitochondriaux des plantes n'est pas universelle puisqu'il a été rapporté que le
génome de Brassica hirta est constitué de séquences uniques (PALMER et HERBON,
1987), organisées en une seule molécule circulaire.
Les différentes sortes de molécules issues de ces recombinaisons ne suffisent pas
à expliquer toute la complexité du DNA mitochondrial des plantes supérieures. Il existe
en effet, dans la mitochondrie de nombreuses plantes, d'autres molécules de DNA
circulaires (plasmides) et linéaires (réplicons) indépendantes du cercle-maître. Ces
plasmides et ces réplicons sont très répandus et le tableau A montre les différentes
molécules extra-chromosomiques retrouvées dans différentes plantes. Certaines de ces
molécules sont très spécifiques de certaines lignées à l'intérieur d'une même variété. Il est
possible par exemple, de classer différentes lignées de maïs en fonction des épisomes qui
les caractérisent (tableau A). Le rôle de ces petites molécules n'est pas connu.
Il a été démontré que le DNA mitochondrial de certaines plantes supérieures porte
des insertions de DNA chloroplastiques (STERN et LONS DALE, 1982 ; STERN et
PALMER, 1984b). Dans leur majorité, ces séquences ne sont pas exprimées
(MAKAROFF et PALMER, 1987 ; FEJES et coll., 1988). Il s'agit généralement de
séquences chloroplastiques qui sont très peu remaniées comme c'est le cas pour
l'insertion chloroplastique de 12 kb décrite chez le maïs et qui comporte le gène du rRNA
16S et les gènes de tRNALeu , de tRNAIle, de tRNAVal et la moitié du gène de tRNAAla
(STERN et LONSDALE, 1982) ou encore l'insertion comportant le gène de la grande
sous-unité de la ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase (LONS DALE et coll., 1983). Il
semble que l'insertion de ces séquences chloroplastiques soit relativement récente dans la
mitochondrie des plantes mais le phénomène est assez répandu (STERN et PALMER,
1984 ; NUGENT et coll., 1988). Il a aussi été décrit des cas où des séquences
chloroplastiques transférées sont transcrites dans la mitochondrie. Il s'agit essentiellement
des gènes de tRNA tels que les gènes de tRNAHis (lAMS et coll., 1985), de tRNACys
(WINTZ et coll., 1988-b) et de tRNATrp (MARECHAL et coll., 1987) de la mitochondrie
du maïs ou du blé.
Par ailleurs, s'il est généralement admis que l'organisation du génome
mitochondrial ne varie pas sensiblement d'un individu à un autre dans la même lignée et
dans les conditions naturelles, de grandes variations ont été mises en évidence entre
différentes lignées d'une même espèce. Le cas le plus étudié est celui du maïs (FAURON
et HAVLIK, 1988 ; FAURON et coll., 1989) où l'organisation du cercle-maître est
complètement remaniée entre les lignées B37-N et B37-cmsT qui ont cependant le même
environnement nucléaire (figure 1). Le réarrangement de ces séquences entraîne:
a) la modification du nombre et de la nature des séquences répétées (fig.1-a).
Dans la lignée normale B37-N, le génome porte 6 jeux de séquences répétées dont 5

---

TABLEAU A: PLASMIDES ET REPLICONS TROUVES DANS
LES MITOCHONDRIES VEGETALES
Plasmides circulaires
Espèces
Tailles (en kb)
Références
Maïs
N, ems-T, cms-C, cms-S
1.9
1.4
Kemble et Bedbrook, 1980
cms-C
1.5
Dale et coll .. 1981
cms-C
1.4
Beta vu/garis
1.3
Powling, 1981
1.4
1.45
Hansen et Marcker, 1984
1.5
cms 01113M4
7.3
Phaseo/us vu/garis
1.9
Dale et coll., 1981
Vicia faba
1.4
Gabiet et coll., 1983
1.7
Gabiet et coll.; 1985
1.75
Nikiforova et Nëgruk, 1983
cms350
1.5
Negruk et coll., 1986
Wahleithner et Wolstenholme, 198ï
He/ianthus annus
1.45
Leroy et coll., 1985
1.41
Crouzillat et coll., 1989
1.8
Crouzi!lat et coll., 1989
Sorghum bieD/or
2.3
Chase et Pring, 1985
1.7
1.36
Réplicons linéaires
Espèces
Taille (en kb
Références
Brassiea spp
11.3
Palmer et coll., 1983
Erickson et coll., 1985
Sorghum bieD/or
N1
5.8
N2
5.4
Chase et Pring, 1986
Zeamays
cytoplasme S
S2
6.4
Levings et Sederoff, 1983
S1
5.4
Paillard et coll., 1985
2.3L
2.3
Bedinger et coll., 1986
2.1 L
2.1
cytoplasme RU
R1
7.4
Weissinger et coll., 1982
R2
5.4
Zea dip/operennis
01
7.4
Timothy et coll., 1983
02
5.4

---

TABLEAU B : GENES DE rRNA SEQUENCES DANS LES
MITOCHONDRIES VEGETALES
Gènes
Espèces
Références
rrn26
Oenothère
Manna et Brennicke, 1985
Maïs
Dale et coll., 1984
Blé
Falconet coll., 1988
rrn 18
Soja
Grabau, 1985
Blé
Spencer et coll., 1984
Maïs
Chao et coll., 1984
Oenothère
Brennicke et coll., 1985
Zea diploperennis
Gwynn et coll., 1987
rrnS
Soja
Morgens et coll., 1984
Blé
Spencer et coll., 1981
Maïs
Chao et coll., 1983
Oenothère
Brennicke et coll., 1985
Zea diploperennis
Gwynn et coll., 1987
TABLEAU C : GENES DE tRNA SEQUENCES DANS LES
MITOCHONDRIES VEGETALES
Gènes
Anticodons
Espèces
Références
1mC
GCA-1
Maïs
Wintz et coll., 1988b
GCA-2
Tomate
Izuchi et Sujita, 1989
tmD
GJC
Maïs
Parks et coll., 1985
Blé
Joyce et coll., 1988b
-
tmE
UUC
Blé
Gualberto et coll., 1989
Soja
Wintz et coll., 1987
Maïs
Ce travail
'" tmF
UAA
Maïs
Wintz et coll., 1988b
tmF
AAA
Maïs
Ce travail
tmG
GCC
Lupin
Bartnick et Borsuk, 1986
tmH
GJC
Maïs
lams et coll., 1985
tmK
UUU
Maïs
Ce travail
If tmL
CAA
Brassica
Oron et coll., 1985
trnfM
CAU
Lupin
Borsuk et coll., 1986
Soja
Grabau, 1987
Maïs
Parks et coll., 1984
Blé
Gray et Spencer, 1983
Oenothère
Gottschalk et Brennicke,
1985
trnM-1
CAU
Maïs
Parks et coll., 1984
trnM-2
CAU
Maïs
Ce travail
A. thaliana
Wintz et coll., 1988a
Soja
Wintz et coll., 1988a
tmN
GJU
Lupin
Karpinska et Augustyniak, 19BB
Phaseolus vulgaris
Bird et coll., 19B9
maïs
Ce travail
'" tmP
U2G
Blé
Maréchal et coll., 19B7
tmP
U2G
Blé
Runeberg-Roos et coll., 19B7
Blé
Joyce et coll., 198Ba
Maïs
Ce travail
tmO
UUG
Blé
Joyce et coll., 19BBa
Blé
Joyce et coll., 19B9
If tmR
ACG
Maïs
Dewey et coll., 19B6
tmS
GCU
Blé
Joyce et coll., 19BBb
Maïs
Wintz et coll., 19BBb
tmS
UGA
Blé
Joyce et coll., 19BBb
Maïs
Ce travail
tmS
GGA
Oenothère
Schuster et Brennicke, 19B7a
tmW
CCA
Blé
Maréchal et coll., 19B7
tmY
GUA
Blé
Joyce et coll., 19BBb
Maïs
Ce travail

---

FIGURE 1
Comparaison de l'organisation des génomes
mitocnondriaux du maïs B37-N et B37-cmsT
( FAURON et HAVLlK, 1989 )
a) Réorganisation des gènes et des séquences répétées:
4.6
5~ ~ 0.7
16
".5
coxID
-- rrn26
b) Réarrangement des blocs de séquences entre les deux génomes:
u
x
N
K
1
:Gènes
o
: Séquences d'insertion chloroplastique
o
:Séquences 52 et RI (Levings et SederoH, 1983; Weissinger et coll., 1982)
I2ZI
: Séquences répétées
J
C::====::::J! : Séquences trouvées seulement dans l'un ou "autre génome
K
_ _ _ _ : Séquences communes aux deux génomes

---

3
(14 kb: 14B, Il kb, 5.2 kb, 1 kb, 0.7 kb) sont des répétitions directes et la dernière (14
kb:14A ) est une répétition inversée. Dans la lignée B37-cmsT on ne trouve que 4 jeux de
séquences répétées. Seules les répétitions directes de Il kb et de 0,7 kb sont conservées.
De plus, une partie (1.5 kb), située à une extrémité de la séquence répétée de Il kb est
retrouvée ailleurs dans le génome; la troisième copie est en orientation inverse par rapport
aux 2 premières portées par les deux copies de la séquence répétée de Il kb. Par contre,
de nouvelles séquences répétées de 6 kb (inven;ées) et de 4.6 kb (directes) apparaissent.
Les anciennes séquences répétées directes de 14 kb (14 B), 5.2 kb et 1 kb et la séquence
répétée inversée de 14 kb (14 A) ne sont plus présentes qu'en une seule copie.
b)
la perte d'information génétique. En effet, des blocs de séquences allant
jusqu'à 25 kb sont absents du génome T si on le compare au génome N (fig. 1-b).
c) le gain de nouvelles infonnations génétiques Gusqu'à 30 kb) par apparition de
séquences spécifiques au génome T.
Au total, il ya une perte globale de matériel génétique (en quantité surtout) dans la variété
mâle-stérile ( dont le cercle maître mesure 540 kb ) par rapport à la variété fertile (dont le
cercle maître cOIJ1pte 570 kb).
d) une nouvelle distribution des gènes connus. Les conséquences de ces
remaniements affectent aussi les séquences chloroplastiques insérées dans le DNA
mitochondrial. En effet, seule une partie de l'insertion chloroplastique de 12 kb (STERN
et LONS DALE, 1982) est présente dans le génome T. Il n'en reste plus que 3 kb (fig.1-b:
FAURON et coll., 1989). Ces séquences sont donc aussi des sites actifs de
recombinaison.
Le génome mitochondrial de plantes supérieures contient un certain nombre de
gènes. Comme dans le cas des mitochondries animales et fongiques, la mitochondrie des
plantes supérieures est semi-autonome et ne possède pas tous les gènes qui pourraient
assurer son indépendance génétique. Jusqu'à présent, les gènes identifiés par clonage et
séquençage dans les génomes des plantes supérieures codent pour des rRNA (tableau B),
des tRNA (tableau C), et des protéines (tableau D). A ces gènes, il faut ajouter de
nombreuses wf (Unidentified Reading Frame) ou phases de lecture ouvertes, qui sont
présentes dans le génome mitochondrial des plantes supérieures (pour une revue, voir
LONSDALE,1988).
Pour ce qui concerne les tRNA, plus d'une trentaine de gènes provenant de
diverses' plantes ont été déjà séquencés (tableau C). Seuls, 16 gènes portant des
anticodons différents et correspondant à 14 acides aminés ont été retrouvés dans les
mitochondries végétales. Les gènes trnA, trnI, trnL, trnR, trnT et trnV n'ont encore été
mis en évidence chez aucune plante. Dans la mitochondrie du maïs, les seules séquences
pouvant correspondre à quelques uns de ces gènes se sont avérées être des pseudo-gènes
ou des gènes incomplets (DEWEY et coll., 1986) et/ou des séquences étrangères non

---

TABLEAU D : GENES DE PROTEINES IDENTIFIES DANS LES
MITOCHONDRIES VEGETALES
... ,. ;;~ ::,11 E\\ .:~ .'~n~'lib 1.n6i'fit)q~r:
.~ ~".o ,tiA ! (
'':
G è n e s .
Espèces
Références
1 ;
Complexe cytochrome oxydase
cox 1
Maïs
Isaac et coll., 1985b
Oenothère
Hiesel et col., 1987
sorgho: mil
Bailey-Serres et coll., 1986
sorgho: 9E
Bailey-Serres et coll., 1986
Blé
Bonen et coll., 1987
soja
Grabau, 1986
cox II
Maïs-N
Fox et Leaver, 1981
Blé
Bonen et coll., 1984
Riz
Kao et coll., 1984
Pois
Moon et coll., 1985
Oenothère
Hiesel et Brennicke, 1983
Soja
Grabau,1987
Zea diploperennis
Gwynn et coll., 1987
cox III
Oenothère
Hiesel et coll., 1987
Maïs
Mc carty et coll., 1989
Complexe cytochrome bc1
cm
Maïs
Dawson et coll., 1984
Oenothère
Schuster et Brennicke, 1985
Blé
Boer et coll., 1985
Complexe Fo-F1 ATPase
Maïs-N
Isaac et coll., 1985
atpA
Maïs-cmsT
Braun et Levings, 1985
Oenothère
Schuster et Brennicke, 1986
Pois
Morikami et Nakamura,1987
atp6
Maïs-cmsT
Dewey et coll., 1985a
Maïs-cmsC
Dewey et coll., 1988
Tabac
Bland et coll., 1987
soja
Grabau et coll., 1988
oenothère
Schuster et Brennicke, 1987b
atp9
Maïs-N
Dewey et coll., 1985b
Tabac
Bland et coll., 1986
Pétunia:F
Young et coll., 1986
Rothenberg et Hanson, 1987
Pétunia:cms et SH
Rothenberg et Hanson, 1988
complexe NAD/Q1
nad1
Pastèque (incomplet)
Stern et coll., 1986
Tabac (incomplet)
Bland et coll., 1986
Maïs (incomplet)
Bland et coll., 1986
nad3
Maïs
Gualberto et coll., 1988
Blé
Gualberto et coll., 1988
Pétunia:cms et F
Rasmussen et Hanson, 1988
nad4
Soja (incomplet)
Wintz et coll., 1989
nad5
Oenothère
Wissinger et coll., 1988
Protéines ribosoma/es
pseudo-rps4
Oenothère
Schuster et Brennicke, 1987a
rps12
Maïs
Gualberto et coll., 1988
Blé
Gualberto et coll., 1988
rps13
Oenothère
Schuster et Brennicke, 1987c
Tabac
Bland et coll., 1986
Maïs:cmsC
Bland et coll., 1986
Blé
Bonen, 1987
rps14
Fève
Wahleitner et Wolstenholme, 1988

---

4
fonctionnelles (STERN et LONS DALE, 1982). Un pseudo-gène de tRNALcu a aussi été
identifié chez Brassica (ORON et coll., 1985 ). De plus, à part le cas du gène trnS pour
lequel 3 anticodons différents ont été trouvés (tableau C ), tous les gènes homologues
trouvés dans les mitochondries de différentes espèces végétales comportent les mêmes
anticodons UrnE, trn?, trnD, trne, trnY, trnN,: tableau C). Pour l'heure, le jeu complet
de gènes de tRNA n'est connu pour aucune mitochondrie de plante supérieure, mais les
premières constatations (JOYCE et coll., 1988-b) montrent que; comme dans les
llÙtochondries animales et fongiques, le nombre de gènes de tRNA est lillÙté au maximum
à 22 (animaux) ou 24 (champignons). Par conséquent, il est possible que la théorie de
LAGERKVIST (1978) dite "two out of three" suggérant que l'appariement codon-
anticodon repose sur deux paires de bases au lieu de 3 ( pour les familles de tRNA
spécifiés par 4 codons différents ), puisse s'appliquer aussi aux mitochondries végétales.
Cependant, le fait qu'aucun anticodon ne soit retrouvé pour certains gènes de tRNA,
suggere que les tRNA correspondants sont importés. Cela a été confinné par des études
récentes sur les tRNALeu de la mitochondrie du haricot (MARECHAL-DRüUARD et
coll., 1988; MARECHAL-DROUARD et GUILLEMAUT, 1988). Il a en effet ~été
démontré chez cette plante, que 4 tRNALeu mitochondriaux ne diffèrent de leurs
homologues cytoplasmiques que par une modification post-transcriptionnelle. Ces
tRNALeu sont codés par le noyau puis importés dans la mitochondrie (GREEN et coll.,
1987; MARECHAL-DROUARD et coll., 1988).
Pour avoir des informations complètes sur le nombre et la nature des tRNA nécessaires à
la synthèse protéique mitochondriale, il est indispensable de:
a) détenniner la séquence nucléotidique de tous les gènes présent sur le DNA
llÙ tochondrial
b) isoler et séquencer tous les tRNA présents dans l'organite
c) séquencer les gènes de tRNA mitochondriaux présents sur le génome nucléaire.
Pour l'heure, en plus du nombre restreint de gènes de tRNA connus (tableau 3), très peu
de tRNA ont aussi été étudiés dans les mitochondries végétales (tableau E) et tous les
travaux effectués sur les tRNA ont porté sur le haricot.
Par ailleurs, aucune étude expérimentale n'a été faite sur l'expression des gènes de
tRNA mitochondriaux connus. Les seules données dont on dispose proviennent des
analyses de séquences en amont des gènes de tRNA mitochondriaux de plusieurs plantes,
effectuées par JOYCE et coll. (l988-b). Une séquence consensus 5'AAGAANRR3'
susceptible d'être impliquée dans l'initiation de la transcription des gènes de tRNA a été
trouvée par cet auteur, en amont de la majorité des gènes étudiés. Par contre, aucune
séquence consensus n'a pu être dégagée de l'analyse des séquences en aval de ces gènes
de tRNA.

---

TABLEAU E: tRNA DES MITOCHONDRIES VEGETALES SEQUENCES
Especes
tRNA
Anticodon
Références
Phaseolus vulgaris
Phe
~
Maréchal et coll.,1985-a
-
Trp
CCA
Maréchal et coll., 1985b
Ty r-1
NUA
Maréchal et coll.,1985-c
Tyr'2
NUA
Maréchal et coll.,1985-c
Met
CAU
Maréchal et coll., 1986
fMet
CAU
Maréchal et coll., 1986
Pro
Lm
Runeberg-Roos et coll., 1987
Leu-1
NM
Green et coll., 1987
Leu-2
NAG
Maréchal-Drouard et coll., 1988
Leu-4
NM
Maréchal-Drouard et
Guillemaut, 1988

---

5
Dans ce travail, notre étude a porté sur les gènes de tRNA mitochondriaux du
maïs. L'objectif de notre recherche a été d'étudier les gènes de tRNA présent sur le DNA
mitochondrial du maïs, leur nombre et leur organisation dans 2 lignées de maïs (B37-N et
B37-cmsT). Nous avons aussi essayé de détenniner le nombre de tRNA mitochondriaux
susceptibles d'être codés par le noyau. L'utilisation du code génétique est aussi discutée.
Par ailleurs, nos études ont aussi porté sur des régions du DNA mitochondrial du
maïs comportant des insertions chloroplastiques. L'origine de ces séquences, le
mécanisme probable de leur distribution et le sens évolutif de leur présence dans la
mitochondrie du maïs sont discutés.
Nous avons aussi caractérisé et analysé un fragment de DNA mitochondrial du maïs
comportant une structure chimérique qui est exprimée dans l'organite.

---

MATERPEL ET METHODES

---

6
I. MATERIEL D'ETUDE: LE MAIS
Le maïs, Zea mays, est une céréale (monocotylédone) appartenant à la tribu des
andropogoniacées. Bien que le maïs soit longtemps connu et sélectionné par l'homme,
l'origine phylogénétique de l'espèce Zea mays reste encore floue. En annexe 1 est
montrée l'origine probable des différentes variétés de maïs connues actuellement sur la
planète (source ENSA-ENSFA).
Dans notre étude, nous avons utilisé des variétés de maïs à cytoplasme nonnal (mâle
fertile) et des variétés à cytoplasme mâle-stérile. Trois. variétés à cytoplasme mâle-fertile
ont été utilisés et ce, pour deux raisons essentielles:
- Les variétés fertiles B37-N et WF9-N, parce que la carte de restriction de leurs
génomes mitochondriaux est déjà établie ( FAURüN et coll., 1988; LüNSDALE et coll.,
1984 ). De plus, les mitochondries de ces deux variétés normales se trouvent dans deux
environnements nucléaires différents. Nous avons entrepris l'étude comparée des gènes
de tRNA dans les génomes mitochondriaux de ces deux variétés pour voir si le
changement de l'environnement nucléaire pourrait avoir une influence sur leur
organisation et/ou sur leur nature.
- La variété INRA 248 a été utilisée parce qu'elle est disponible en quantité suffisante
et peut servir par conséquent pour les études de transcription.
- Pour sa part, la variété B37-cmsT qui est la variété à cytoplasme mâle stérile dont la
mitochondrie se trouve dans le même environnement nucléaire (B37) que la variété fertile
B37-N, a été utilisée parce que la carte de restriction de son génome mitochondrial est
aussi disponible (FAURüN et HAVLIK, 1988). Dans ce travail, les deux cartes de
restriction des génomes mitochondriaux B37-N et B37-cmsT ont servi de support pour
l'étude comparée de l'organisation et de l'expression des gènes de tRNA dans l'organite.
II. PURIFICATIüN DES ACIDES NUCLEIQUES
A. EXTRACTION DES ACIDES NUCLEIQUE MITOCHONDRIAUX
La méthode utilisée dérive de celle décrite par STERN et NEwrüN (1984)
1. PRINCIPE
Les acides nucléiques sont extraits de mitochondries purifiées à partir
d'hypocotyles de maïs. Les graines de maïs sont mises à germer à l'obscurité à 25°C. Les
jeunes hypocotyles sont broyés dans des tampons appropriés et le broyat est soumis à
une série de centrifugations différentielles pour obtenir un enrichissement en
mitochondrie. La fraction mitochondriale est ensuite lysée et les acides nucléiques sont
purifiés par des méthodes adéquates.

---

7
2. PURIFICATION DES MITOCHONDRIES
a) Croissance des plantes
Les graines de maïs sont généralement conservées dans des conditions assurant
une faible humidité ambiante et sont, de préférence, traitées avec un antifongique. Avant
d'entreprendre la mise en germination des graines, il faut se débarrasser de l'antifongique
en les rinçant. De plus, il faut lever la donnance des graines en les incubant une nuit (à
l'obscurité) à 25°C dans une bassine remplie d'eau. Les graines sont ensuite semées sur
de la venniculite stérilisée par autodavage.Le semis est incubé à 25°C à l'obscurité et
régulièrement arrosé d'eau. La récolte des hypocotyles se fait entre 5 et 7 jours de
croissance. Il est préférable de récolter les hypocotyles avant le début de l'auxesis et de la
différenciation cellulaire pour avoir un meilleur rendement en mitochondries purifiées.
b) Broyage
Les hypocotyles récoltés sont découpés en fins morceaux et placés à O°e.
Toutes les étapes qui suivent se dérouleront à 4°C au maximum. Les plantules sont
broyées dans un appareil de type Waring-Blendor dans le tampon d'extraction dont la
composition est la suivante:
- 0,35 M Sorbitol
- 50 mM Tris-Hel, pH 8
- 5 mM EDTA
-0,1% BSA
- 0,25 g/l spermine
- 0,25 g/l spermidine
- 1,25 ml/l mercapto-éthano1 (ajouté extemporanément)
On effectue généralement deux broyages à haute vitesse pendant 5 secondes
(2 x 5 sec). Le broyat est filtré sur 2 à 3 couches de gaze associées à un tamis nylon (45
Ilm). On élimine ainsi les gros débris de l'extrait cellulaire.
c) Centrifugations différentielles (KOLüDNER et TEWARI, 1972)
Pour se débarrasser des noyaux, des chloroplastes des amidons et des autres
débris cellulaires, le broyat est centrifugé pendant 10 minutes à 1000 g (BeclCman J6-B).
Le surnageant est récupéré et centrifugé 10 minutes à 10 000 g. Le culot enrichi en
mitochondries est resuspendu dans 10 ml du tampon d'extraction. Il est très important à
ce stade que les mitochondries soient bien resuspendues à l'aide d'un potter avant de
diluer la suspension obtenue avec 90 ml de tampon d'extraction. Les deux
centrifugations précédentes sont répétées sur la suspension de mitochondries. Le culot
final est très doucement resuspendu dans 10 m de tampon d'extraction. Pour obtenir du
DNA mitochondrial pur, il est indispensable à cette étape, de resuspendre les
mitochondries dans une solution contenant du MgCl2 (la mM). La suspension est alors

---

8
traitée à la DNAse 1. L'action de la DNAse l est arrêtée par addition d'EDTA (l0 mM).
La suspension est ensuite centrifugée à 10 000 g et le culot repris dans du tampon
d'extraction.
d) Purification des mitochondries sur gradient de saccharose
Les mitochondries peuvent être purifiées. sur un gradient de saccharose.
.
Ce gradient est constitué par trois couches de saccharose à 30,52 et 60% (de
haut en bas) dissous dans le tampon de lavage dont la composition est la suivante:
- 0,35 M Sorbitol
- 50 mM Tris-HCl, pH 8
-20 mM EDTA
On laisse le gradient s'équilibrer au moins 12h avant utilisation. Le gradient est
centrifugé Ih à 4°C à 83 000 g (25000 rpm). Les mitochondries sont collectées à
l'interphase 30%-52% avec une pipette stérile. La fraction mitochondriale est diluée avec
3 volumes du tampon de lavage. La dilution doit se faire très lentement et à 4°C afin
d'éviter les chocs osmotiques'- La suspension est ensuite centrifugée à la 000 g pendant
20 minutes et le culot constitué de mitochondries est repris dans 2 à 10 ml de tampon de
lavage.
3. LYSE DES MITOCHONDRIES ET EXTRACTION DES ACIDES
NUCLEIQUES
Lorsqu'on veut éviter la dégradation du RNA, on peut ajouter des inhibiteurs des
RNAses. Nous avons utilisé l'ATA (Acide Tri Aurintrocarboxylique ) à des
concentrations de 1 mM pendant la lyse et 50 ~M pour le stockage à long terme des
RNA. Cependant cet inhibiteur pose des problèmes car il est difficile à éliminer et inhibe
aussi certaines enzymes (par exemple, la polynucléotide-kinase). Nous ne l'avons utilisé
que pour la purification des RNA qui ont servi pour les expériences de transfert.
L'inhibiteur est rajouté dans le tampon de lyse. Les mitochondries sont lysées en ajoutant
0,25 volume du tampon de lyse à la suspension précédente. La composition du tampon
de lyse est la suivante:
- 10% (v/v) sarkosyl de sodium
- 25 mM Tris-HCl pH 7,5
- 20 mM EDTA
L'ensemble est homogénéisé par agitation lente. Le lysat est traité avec un volume
de phénol-chloroforme (v/v) contenant 0,8% d'hydroxyquinoline. Cette opération est
répétée jusqu'à la qisparition de l'interphase. La phase aqueuse est finalement extraite
avec un volume de chloroforme. Les acides nucléiques sont récupérés par précipitation en

---

9
mélangeant la phase aqueuse avec 2,5 volumes d'éthanol pur et 1/10 volume d'acétate
de sodium 3 M, pH 5.
4. PURIFICATION DES ACIDES NUCLEIQUES
a) Purification des RNA de haut poids moléculaire
Les acides nucléiques totaux extraits des mitochondries sont précipités au
chlorure de lithium à une concentration finale de 2M. L'ensemble est gardé à 4°C pendant
au moins 6 heures avant d'être centrifugé à12000 rpm dans une centrifugeuse SIGMA,
pendant 20 minutes. Le culot contenant les RNA de grande taille est séparé du surnageant
contenant le DNA, les tRNA, le rRNA 5S et les produits de dégradation. Les grands
RNA sont redissous dans de l'eau et précipités de nouveau avec du chlorure de lithium.
On obtient ainsi une fraction exempte de contaminants en DNA et en RNA de petites
tailles.
b) Purification des tRNA
La méthode dérive de celIe décrite par GUILLEMAUT (1972).
Les surnageants des précipitations précédentes contiennent du DNA et les
RNA de petire taille. Pour purifier les tRNA, on procède d'une part à la dégradation du
DNA et d'autre part à la séparation des tRNA des autres petites molécules de RNA par
chromatographie.
a) Dégradation du DNA
Le surnageant de la précipitation au chlorure de lithium est précipité à l'aide
de 2 volumes d'éthanol. Le culot obtenu après centrifugation est séché et redissous dans
une solution contenant du MgC12 10 mM et du Tris-HCl pH 7,550 mM sous agitation
magnétique à ooC. On rajoute à ce milieu, de la DNAse l à 5 Ilg/ml et on laisse incuber
30 minutes dans la glace (ou 10 minutes à température ambiante). La réaction est arrêtée
par chauffage pendant 10 minutes à 65°C. Les RNA sont ensuite précipités par addition
de 2 volumes d'éthanol et de l/1O d'acétate de Sodium 3M pH 5. Après centrifugation, le
culot de RNA est séché et dissous dans du tampon L (cf paragraphe suivant).
[3) Purification des tRNA par chromatographie
La fraction 4S du RNA mitochondrial obtenu après avoir séparé les RNA de
haut poids moléculaire et dégradé le DNA, est composée de plusieurs autres ·molécules de
RNA de petites tailles. Pour séparer les tRNA des autres molécules de RNA, l'ensemble
de la fraction 4S est fractionné soit sur une colonne de DEAE-ceIlulose, soit sur une
colonne hydrophobe RPC-5 (KOTHARI et TAYLOR, 1973 ). Notre expérience nous a
montré que la purification sur RPC-5 est plus efficace en ce qui concerne les tRNA. Le
RNA de la fraction 4S est dissous dans du tampon Low contenant:

---

la
- Tris-HCI
10 mM pH 7,5
- NaCI
O,2M
Ce milieu est déposé sur une colonne (DEAE ou RPC-S) et rincé
abondamment avec du tampon Low. Ceci pennet l'élimination des petits produits de
dégradation des acides nucléiques mitochondriaux. Les tRNA sont élués avec du tampon
H con tenan t :
- Tris-HCI
10 mM pH 7,5
- NaCI
lM
L'éluat est alors précipité à l'aide de 2 volumes d'éthanol. Après
centrifùgation, les tRNA sont séchés et dissous dans de l'eau bidistillée.
5. DOSAGE DES RNA
Le dosage des RNA est effectué par la mesure de la densité optique à 260 nm.
Pour un chemin optique de 1 cm, à cette longueur d'onde, 1 0.0. représente une
concentration en RNA de 40 llg/ml. Pour évaluer la pureté des RNA, une autre mesure
est faite à 280 nm. Le rapport 0.0. 260 nm/D.O..280 nm doit être compris entre 1,8 et
2, traduisant ainsi une absence de contamination protéique.
6. ANALYSE DES RNA PAR ELECTROPHORESE
a) Fractionnement des RNA de grandes tailles
Les grands RNA (rRNA, mRNA et dsRNA) ont été fractionnés par
électrophorèse sur gel d'agarose 1,S% en conditions dénaturantes. La dénaturation des
molécules de RNA est assurée par la présence de fonnaldéhyde dans le gel d'agarose
(LEHRACH et coll., 1977).
On dissout 1,S g d'agarose dans 72,8 ml d'eau par ébullition. L'agarose
dissous est refroidi à 60°C et on y ajoute la ml de tampon HEPES x 10 (200 mM
HEPES pH 8, la mM EDTA) et 16,2 ml de fonnaldéhyde. L'ensemble est coulé entre
deux plaques d'électrophorèse stériles. La base du gel est constituée par un socle de
polyacrylamide fait avec:
- 3,6 ml d'acrylamide-bisacrylamide 50-2,5%
- 1 ml de tampon HEPES IOx
- 5,3 ml d'cau bidistillée stérile
.
- 10 J..Ù dc T.E.M.E.D.
- 90 J..Ù dc S.P.S. ou A.P.S. 10%
L'épaisseur du gel est de 2 mm.

---

1 1
Avant de déposer l'échantillon de RNA sur le gel, on procède à une
dénaturation. On mélange ainsi 1 volume de la solution de RNA avec 3 volumes d'un
tampon de dénaturation contenant:
- 10 I.il de Tampon HEPES IOx
- 50 I.il de Fonnamide (75% final)
- 16 )lI de Fonnaldéhyde (9% final)
L'ensemble est chauffé à 65°C pendant 5 minute"s. On y ajoute ensuite 1 ~I de
Bleu de Bromophénol 0, 1% dans 50% de glycérol. L'échantillon dénaturé est alors
déposé sur le gel et la migration est faite à 120 V pendant 4 heures. On peut aussi faire
migrer à 40 V pendant 12 heures.
b) Fractionnement des tR NA
Les tRNA ont été fractionnés sur gel de polyacrylamide 15% en conditions
dénaturantes (présence d'urée 8 M) par la méthode de SANGER et COULSON (1978).
Le gel est constitué de :
- 15% acrylamide (Plv)
- 0,75% bis-acrylamide (plv)
- 8 Murée
- 0,045 M T.E.B. (fris-borate 45 mM, EDTA 1,25 mM)
- 0,07% de S.P.S. et 0,035% de T.E.M.E.D.
Le T.E.M.E.D. et le S.P.S., qui sont les catalyseurs de la polymérisation, sont
ajoutés juste avant de couler le gel entre les plaques d'électrophorèse. Le gel polymérisé
est soumis à une pré-migration pendant environ une heure. Avant d'être déposés sur le
gel, l'échantillon de tRNA est dénaturé en y ajoutant un volume égal de solution de dépôt
dont la composition est:
- 10 MUrée
- 25 mM Acide citrique
- 0,025% Xylène cyanol
- 0,025% Bleu de Bromophénol
Le tampon d'électrophorèse est du T.E.B. 0,045 M et l'électrophorèse est
effectuée pendant 15 à 20 heures à 1000-1500 V.
Après migration, les bandes de RNA sont révélées en incubant le gel pendant
1 h dans du tampon T.E.B. 0,045 M contenant 0,5 llg/m1 de bromure d'éthidium. Le
gel est ensuite débarrassé de l'excès de bromure d'éthidium par plusieurs lavages
successifs dans du tampon d'électrophorèse. Une photographie du gel est ensuite prise
sous éclairage U. V.

---

12
B. EXTRACTION DU DNA NUCLEAIRE
La méthode utilisée est inspirée de celle décrite par DAVIS et coll. (1986).
La croissance et la récolte des plantules se fait comme décrit précédemment.
Après la récolte, les plantules sont broyées dans un mortier contenant de l'azote liquide et
le broyat est dilué dans un tampon d'extraction (400 ml pour environ 60 g de plantules)
dont la composition est la suivante:
'- 10 mM
Tris -HCl pH 7,8
-0,25 M
Sucrase
- 3 mM
KCl
-25 mM
MgCl2
- 50% (p/v)
Glycérol
- 0,5% (P/v) Triton x 100
-7 mM
p-Mercapto-éLhanol
Le broyat est homogénéisé avec un appareil polytron, filtré sur un tamis de
nylon (25 llm) et centrifugé à 2000g pendant 10 minutes. Le culot est repris dans le
tampon d'extraction sans glycérol ni Triton, déposé sur une couche de sucrose 2M et
centrifugé à 2000 g pendant 10 minutes. Le culot de noyau est repris dans une solution
contenant 10% de Sarkosyl et 1 mg/ml de protéinase K, et laissé incuber au moins deux
heures. L'extrait est alors soumis à plusieurs extractions au phénol-chloroforme (v/v). La
phase aqueuse est ensuite déposée sur un coussin de CsCl (4 M) et centrifugée à
40000 rpm pendant 15 h dans une centrifugeuse LKB ( 2331,ultrospin 70 ). Le culot
translucide obtenu (contenant le DNA nucléaire) est resuspendu dans de l'eau bidistillée,
précipité avec 2 volumes d'éthanol et le DNA précipité est ensuite dissous dans 500 III
à 1 ml d'eau. La qualité du DNA est contrôlée par électrophorèse sur gel d'agarose. La
digestibilité du DNA nucléaire par des enzymes de restriction est aussi un contrôle de la
qualité de ce DNA.
C. EXTRACTION DES tRNA CHLOROPLASTIOUES
1. ISOLEMENT DES CHLOROPLASTES
Nous avons utilisé la technique décrite par GUILLEMAUT et coll.( 1972).
Les feuilles fraîches sont généralement récoltées après 10 jours de croissance.
Elles sont lavées, découpées et broyées dans un appareil de type "Waring Blendor". Le
broyat est dilué dans un tampon d'extraction (1 1 pour 350 g de feuilles) dont la
composition est la suivante:
- 0,35 M
Mannitol
- 50mM
Tris-HCl'pH 8
- 5 mM
EDTA
-7 mM
p-mercapto-éLhanol
- 1 g/l
BSA

---

13
L'ensemble est homogénéisé, filtré sur des toiles à bl uter de 100 )..lm puis 25 )..lm
de vide de maille, et centrifugé à 3 500 rpm (BECKMAN, 16-B) pendant 2 minutes à
4°C. Le surnageant est éliminé et le culot est remis en suspension dans le tampon
d'extraction ou l'EDTA est remplacé par du MgCI2 (14 mM). La suspension est
centrifugée de nouveau à 3 200 rpm (BECKMAN, 16-B) pendant 3 minutes et le culot
chloroplastique récupéré est suffisamment pur pour extraire les tRNA.
2. PURIFICATION DES tRNA
Le culot de chloroplaste est repris dans un tampon de lyse identique à celui décrit
en II.A.3. Les tRNA sont purifiés comme décrits précédemment pour les tRNA
mitochondriaux.
III. METHODES DE CLONAGE ET ANALYSE DES ACIDES
NUCLEIQUES
A. METHODES DE CLONAGE
1. REALISATION ET CRIBLAGE DES MINI-BANQUES
Pour disposer de tous les fragments de restriction issus de l'hydrolyse par une
enzyme de restriction donnée d'un cosmide contenant du DNA mitochondrial, nous
avons souvent été amenés à réaliser des mini-banques. Puisque l'objectif de notre étude
est la détermination de la séquence nucléotidique des fragments comportant des gènes de
tRNA, nous avons choisi le vecteur de séquençage M 13. Ce vecteur sera décrit dans le
chapitre concernant le séquençage (ITLB.2).
a) Digestion du DNA par les enzymes de restriction
La digestion du DNA par des enzymes de restriction se fait dans les conditions
conseillées par les fournisseurs. Elle est souvent réalisée dans un milieu réactionnel de 20
à 30 )..lI contenant:
- 1 à 5 Ilg de DNA
- 2 à 3 ~ du laITIpon de digestion 10 x
·4 U d'enzymes par Ilg de DNA
- H20 qsp 20 à 30 III
Le milieu de réaction est incubé pendant au moins 40 minutes ou 2 heures
suivant l'enzyme utilisée. Quatre types de tampon de digestion sont utilisés et leur
composition est indiquée dans le tableau suivant:

---

14
NaCl
KCl
Tris-HCl
DIT
Tampon A
10 mM pH7,4
10 rru\\1
lmM
Tampon B
SOmM
10 mM pH 7,4
10mM
TamponC
100 mM
50 mM pH 7,4
10 mM
Tampon K
20 mM
lOmMpH8
10 mM
lmM
La réactiôn est arrêtée par addition de 1/4 du volume de t.a~pon de charge qui
sert en même temps pour le dépôt des échantillons sur le gel d'agarose. Le tampon de
charge est composé de :
-40%
Saccharose
- 5 mM
EDTA
- 0,1%
SDS
- 0,025%
de Bleu de Bromaphénal
- 0,025%
de Xylène Cyanal
b) Analvse des fragments de restriction par électrophorèse sur gel d'agarose
Le fractionnement par électrophorèse sur gel d'agarose horizontal permet à la
fois d'analyser la taille des fragments de restriction et de s'assurer que la réaction
d'hydrolyse a été totale.
La concentration en agarose varie gelon la taille des fragments à analyser, de
0,7% (SOO pb à 8 kb) à 1,5% (de 300 pb à 2 kb).
Le gel est réalisé en fondant l'agarose par ébullition dans du tampon
d'électrophorèse T.E.B. (Tris-borate 89 mM pH 8, EDTA 2 mM). Après refroidissement
à 60°C, on rajoute au gel du bromure d'éthidium à une concentration finale de 0,5 ~g/ml.
On laisse le gel se solidifier à température ambiante en prenant soin d'aménager des
poches de dépôts. L'électrophorèse est effectuée à S Vlem et le niveau de migration est
contrôlé en exposant le gel sous une lampe U.V. Un témoin de migration, constitué par
une solution de ilONA ladder, BRL" est analysé en parallèle. En fin de migration, une
photo du gel est prise sous U.V. en utilisant le système Polaroïd.
e) Ligation des fragments de restriction avec le vecteur de clonage
La ligation des fragments de restriction avec le vecteur est effectuée grâce à la
T4 DNA ligase (WEISS et coll. 1968). La réaction de ligation est très importante dans le
processus de clonage c~r elle influe directement sur la quantité de recombinants et sur
leur qualité. Ceci est détenniné par le rapport molaire entre le vecteur et les inserts.

---

15
Généralement, un rapport de 5 molécules d'insert pour une molécule de
vecteur est utilisé. Il est cependant important de faire une gamme de ce rapport lorsqu'on
veut constituer une mini-banque car la taille des fragments et leur abondance sont des
facteurs qui influent sur la qualité de la ligarion. Le milieu réactionnel comprend:
- DNA à insérer
100 à 1000 ng
- Vecteur
100 ng
- Tris-HCl pH 7,5 70mM
- MgCl2
7mM
-DIT
5mM
- (r)A1P
ImM
- Spermidine 1 mM
- T4 DNA ligase
lU
La réaction est effectuée à 14°C pendant au moins 12 heures ou bien à
température ambiante pendant 2 heures pour les fragments de DNA ayant des extrémités
cohésives. Dans le cas des fragments de restriction ayant des extrémités franches, il est
utile d'augmenter la concentration en enzyme (2 Unités) et de favoriser le rapprochement
des extrémités par adjonction de chlorure d'hexamine cobalt (Ill) à une concentration
finale de 1,25 mM.
On arrête la réaction par addition de 1 ~l d'EDTA 0,5 M.
d) Transformation d'E,çQ{i par les plasmides recombinants
a) Souches d'E.coli utilisées
Deux souches d'E.coli K12 nous ont servi pour la transformation: lM 103
et NM 522. Ces souches ont les phénotypes suivant:
JM 103 : thi, strA, endA, sbc B15, hsd R4, Ll (lac-proAB)/{F', tra D36,
proAB, lac IqZ.M15], strep R, modification +, restriction-
NM 522: thi, supE, Ll hsds Ll (lac-proAB)/{F', proAB, laclq.2 LlM15],
modification -, restriction -
Ces souches sont caractérisées par l'absence de l'opéron lactose dans le
DNA chromosomique. Elles contiennent un épisome F' porteur du gène de la 13-
galactosidase modifié et le répresseur de l'opéron lac est produit constitutivement à la
suite d'une mutation dans son promoteur (MESSING et coll., 1977).
f3) Transformation des bactéries par la méthode de Hanahan
.: Préparation des cellules compétentes
L'objectif de la préparation de cellules compétentes est de fragiliser la
paroi bactérienne pour permettre une meilleure pénétration du DNA. La méthode que
nous avons utilisée est une méthode chimique qui a été développée par HANAHAN
(1983).

---

16
Les cellules (lM 103 ou NM 522) sont conservées sur du milieu
'
.
. .
déficient en proline afin de permettre la conservation de l'épisome F' et d'empêcher la
contamination par d'autres souches d'E.coli non porteuses de cet épisome. Pour avoir
des cellules vigoureuses, on procède à une préculture dans du milieu riche L.B. (cf
annexe2). 100 ~l de cette culture est remis à pousser dans 50 ml de milieu SOB (cf
annexe 2) en présence d'ion Mg++ (1 M MgCl2 - MgS04) à 37°C sous agitation. La
croissance des bactéries est arrêtée lorsque la D.O. à 550 nm atteint 0,6 en plaçant le
milieu de culture dans la glace pendant 15 mn. Le milieu est centrifugé à 2000 g (O°C) et
le culot bactérien est resuspendu dans 8 m de milieu T.F.B. (cf annexe 2) et placé dans la
glace pendant 15 minutes. Les bactéries sont une nouvelle fois sédimentées à 2000 g et
le culot est resuspendu dans 2 ml de T.F.B. On ajoute au milieu 70 ~l de DMSO et on
laisse incuber 5 minutes dans la glace. 70 ~l de DTT 2,2 M sont ensuite additionnés au
milieu et l'ensemble est laissé 10 minutes dans la glace. Enfin, 70 ~l de DMSO sont
rajoutés et l'incubation est prolongée de 5 minutes après lesquelles, les cellules sont
compétentes et prêtes à être transformées.
.: Transformation
Les cellules compétentes sont réparties (200 ~l par tube) et on dépose
dans chaque tube une aliquote de DNA issue de la ligation. L'ensemble est homogénéisé
doucement et mis dans la glace. Après 40 minutes d'incubation, les cellules sont
soumises à un choc thermique (42°C, 2 minutes) ayant pour but de favoriser la
p~nétration du DNA adsorbé sur la paroi, dans les bactéries. Les tubes sont remis dans la
glace après le choc thermique pendant au moins 3 minutes. Les cellules transformées sont
ensuite diluées avec 800 ~l de L.B., sédimentées à 2000 g pendant 10 minutes pour
éliminer le DTT et le DMSO toxiques pour les cellules. Les bactéries sont ensuite
resuspendues dans 200 ~l de L.B.
.: Sélection des bactéries transformées
Le vecteur M 13
Une série de souches du bactériophage M13 a été développée
(MESSING, 1983) dans le but de l'utiliser comme vecteur de clonage. Ces souches
dérivent de la souche sauvage par insertion dans une région intergénique, d'une séquence
portant des sites uniques de restriction. Ces sites sont utilisés pour l'insertion de
fragments de DNA étranger. Le bactériophage M13 est constitué d'une molécule de DNA
circulaire monocaténaire entourée d'une protéine capsidaire. Dans son cycle infectieux le
M13 passe par une forme bicaténaire qui est en fait la forme replicative. Cette forme
replicative a toutes les caractéristiques d'un plasmide et il est possible de l'utiliser comme
vecteur de clonage. Par les systèmes de clonage classique, on peut insérer du DNA
étranger dans cette molécule bicaténaire et transformer les souches E.coli réceptrices. La

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17
bactérie transformée produit alors des particules phagiques recombinantes. Le DNA
simple brin de l'insertion peut aussi être analysé et sa séquence nucléotidique déterminée
par la méthode de SANGER.
. Principe
Les vecteurs M 13 (mp 18-mp 19) utilisés
pour le clonage dans nos
expériences comportent le gène du peptide a. de la ~-galactosidase et les régions
régulatrices de l'opéron lactose. En transformant les souches d'E.coli décrites plus haut
avec ce vecteur, on réalise une complémentation avec l'épisome F' pour l'activité ~­
galactosidase. La bactérie transformée est donc capable d'hydrolyser le lactose. En
utilisant des analogues structuraux du galactose, on peut sélectionner les bactéries qui ont
été transformées. Deux analogues sont utilisés à cet effet: l'IPTG (isopropy1/~-D
thiogalactoside) et le X-gal (5-bromo, 4-chloro ; 3-indolyl ~-D galactoside). L'IPTG
active l'opéron lactose et la ~-galactosidase produite hydrolyse le X-gal (qui est incolore)
en bromochloro-indole qui est un produit bleu. Toutes les bactéries comportant le vecteur
intact donnent par conséquent des plaques bleues sur un tapis bactérien. Par contre,
l'introduction d'un fragment de DNA dans le gène de la ~-galactosidase du vecteur
inactive son activité. Les plaques sont alors incolores. On reconnait ainsi les clones
recombinants .
. Culture et sélection des cellules recombinantes
Les bactéries transformées contenues dans les 200 J.ll de L.B. sont
réparties en 3 aliquotes (1/100, 1/10 et environ 8110). Chaque aliquote est mélangée à
3 ml de L.B. agar 0,8% conservé à 42°C (cf annexe 1) contenant:
- 40 III de X-Gal dissout dans le diméthylformamide
- 20 III de IPTG 100 mM
- 50 III de bactéries non transformées en phase exponentielle de croissance
L'ensemble est étalé sur une boîte de pétri contenant du L.B. agar 1,5%
(cf annexe 2) et laissé refroidir à température ambiante. Les boîtes sont renversées une
fo~s que le L.B. agar 0,8% s'est solidifié et sont gardés à 37°C. Les premières plaques
sont detectables après 4 h de culture mais l'induction de l'activité ~-galactosidase est
visible plus tardivement.
e) Analyse des clones recombinants
Le bactériophage M13 présente l'avantage d'être sous deux formes: sous
forme de phage à DNA monocaténaire dans le milieu de culture, et sous forme de
plasmide (forme replicative) dans la bactérie. Les clones recombinants peuvent donc être
analysés sous ces deux formes.

---

18
Après la culture des transformants sur boîte de pétri pendant au moins
12 heures, on distingue des plaques bleues représentant les transformants ne contenant
que du M13 natif et des plaques blanches représentant les transformants recombinés. Les
phages de ces plaques peuvent être repiqués dans 2 ml de L.B. contenant des cellules
fraîches non transformées. De cette manière, le clone est amplifié. La culture se fait
pendant 5 heures au minimum, à 37°C et sous une très fone agitation. Après la culture, le
milieu est centrifugé à 10 000 rpm pendant 10 minutes et le surnageant contenant les
phages est séparé du culot bactérien. Les bactéries contiennent le DNA recombinant sous
sa forme replicative bicaténaire.
ex) Analyse des phages
:. Analyse directe
Le surnageant phagique peut être directement analysé par électrophorèse
sur gel d'agarose. Pour cela, 20 ~l de surnageant sont mélangés avec 5 ~l d'une solution
qui sert à la fois de tampon de charge et de tampon de lyse, dont la composition est la
suivante:
- 60%
Fonnamide
- 3% S.D.S.
·0,083%
Bleu de Bromophénol
- 25 mM
EDTApH8
L'ensemble est placé 5 minutes à 65°C, laissé refroidir 5 minutes et
déposé sur un gel d'agarose contenant du B.E.T. (0,5 ~g/ml). L'électrophorèse se fait à
20-100 V. Les échantillons sont analysés en même temps qu'un témoin ne contenant que
du M 13 natif. On peut déterminer ainsi, d'une manière grossière, la taille des phages
recombinants. Cette méthode est indicative mais ne renseigne pas sur le nombre ni la
qualité des insertions.
:. Analyse des phages après purification du DNA
Le DNA phagique peut être extrait avant d'être soumis à une
électrophorèse sur gel d'agarose. Pour cela, 1 ml de surnageant phagique est mélangé
avec 0,25 ml d'une solution de P.E.G. 20% - NaCI 2M. L'ensemble est homogénéisé en
vonexant et placé au moins 30 minutes dans la glace. La solution est ensuite centrifugée
20 minutes à 12000 rpm. Le culot contient les phages précipités. Le surnageant est
enlevé et les parois soigneusement nettoyées. Le culot est ensuite dissous dans 200 J.11
d'eau et soumis à une série d'extractions au phénol-chloroforme (v/v). Le DNA de la
phase aqueuse finale est précipité en y ajoutant 2,5 volume d'éthanol et 1/10 de volume
d'acétate de sodium 3 M pH 5 et placé à -20°C pendant au moins 2 heures. Après
centrifugation à 12000 rpm, le culot de DNA est lavé avec de l'éthanol 70%, séché et

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19
redissous dans la à 50 III d'eau bidistillée. Une aliquote de cette solution peut être testée
sur gel d'agarose comme précédemment.
:. Hybridation croisée des DNA phagiques :
Pour isoler deux à deux des phages contenant le même fragment de
DNA inséré dans les orientations opposées, on peut procéder à l'hybridation des DNA
simple-brins phagiques des clones recombinants. On peut faire cette hybridation en se
servant soit du surnageant phagique, soit des DNA simple-brin purifiés. Le milieu
réactionnel contient:
- DNA1
500 ng (ou 101J1 de surnageant phagique)
- DNA2
500 ng (ou 101J1 de surnageant phagique)
- NaCI
0.25 M
-SDS
1%
- Formamide déionisée
12%
-EDTA
5mM
- Bleu de bromophénol
0.02%
L'ensemble est placé à 65°C pendant 1 heure, puis laissé refroidir à
température ambiante pendant 15 minutes et analysé par électrophorèse sur gel d'agarose.
Quand les insertions des phages 1 et 2 sont constituées de séquences
complémentaires, leur hybridation donne une molécule plus lourde qui est retardée par
rapport aux simple-brins lors de la migration.
{3) Analyse des plasmides
:. Méthodes de purification des plasmides
.Méthode alcaline
Cette méthode est inspirée de celle décrite par MANIATIS et coll.
(1986). C'est une méthode de choix pour la préparation de plasmide à partir de petites
cultures. Le culot bactérien (2m!) est resuspendu dans 120 III d'une solution contenant:
- 50mM
Glucose
- 25 mM
Tris-HO pH 8
-lOmM
EDTA
L'ensemble est homogénéisé et laissé dans la glace la minutes. La
présence du glucose assure la pression osmotique. A la suspension de bactéries, on
ajoute 80 III de lysozyme (20 mg/ml) fraîchement préparé et on incube 10 minutes dans la
glace pour permettre une lyse ménagée de la paroi des bactéries. On procède ensuite à la
dénaturation des acides nucléiques et des protéines en ajoutant 160 /-11 d'une solution de
dénaturation (0,2 N NaOH, 1% SDS) et en incubant 5 minutes dans la glace. A ce stade,

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20
il est important de ne plus agiter fortement dans le souci de ne pas casser le DNA
nucléaire qui pourrait éventuellement contaminer la préparation de plasmides.
A la solution précédente, on additionne 80 III d'une solution d'acétate de
potassium 5 M pH 4,8. Le changement brusque du pH du milieu qui s'en suit entraîne la
renaturation rapide des molécules de DNA. Les plasmides et autres petites molécules sont
reconstituées mais le DNA génomique bactérien forme un réseau désordonné qui
précipite avec les protéines dénaturées. Par centrifugation à 12 000 rpm pendant 20
minutes, on sédimente ce réseau et le surnageant contenant les plasmides est récupéré,
traité deux fois au phénol-chlorQfurrne et précipité par addition de 2,5 volumes d'éthanol
pur.
. Méthode du lysat clair
Cette méthode (DA VIS et coll., 1986) peut être aussi appliquée à la
purification du DNA cosmidique.
Les bactéries contenues dans 5 à la ml de culture sont centrifugées à
12 000 rpm (SIGMA) pendan.t 10 minutes. Le culot bactérien est resuspendu dans 50 III
de tampon S.T. (25% Sucrose, 50 mM Tris-HCl pH 8). L'ensemble est mis dans la
glace; on y ajoute 25 III de lysozyme (20 mg/ml) et on laisse incuber 5 minutes. On
ajoute ensuite 62,5 III d'EDTA (0,2 M) pour arrêter la réaction avant d'ajouter 162,5 III
de tampon de lyse dont la composition est pour 100 ml :
- 1 ml
Triton 10%
- 31 ml
EDTA (2Na) 0,2 M pH 8
- 5 ml
Tris-HCl 1 M pH 8
- H20 qsp 100 ml
Sans vortexer, on laisse 15 minutes dans la glace et on congèle ensuite
l'ensemble à -80°C avant de laisser fondre à 37°C. Cette opération peut être répétée. Le
milieu est ensuite centrifugé à 12 000 rpm (SIGMA) le surnageant plasmidique est
récupéré et le DNA extrait comme précédemment. Dans les deux cas, on peut purifier
d'avantage le DNA plasmidique sur un coussin de CsCI comme cela a été décrit par
MANIATIS et coll., (1986).
Les deux méthodes sont aussi applicables à de plus grands volumes de
cultures bactériennes. On ajuste alors les proportions des solutions utilisées.
r) Autres métlwdes de criblage de la mini-banque
.: Criblage par analyse des profils de restriction
Le criblage des clones recombinants peut être effectué en analysant le
profil de restriction du DNA plasmidique de ces clones. Le plasmide est alors soumis à

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21
une ou plusieurs digestions enzymatiques permettant non seulement d'identifier les
clones recombinants mais aussi de les classer qualitativement.
~ Criblage par hybridation
Lorsqu'on cherche à isoler un clone contenant un fragment de restriction déjà
caractérisé dans une mini-banque, on peut procéder par hybridation. Le fragment de
restriction concerné est alors purifié comme cela est décrit en IlLA.2.a et marqué suivant
le protocole décrit en IlLB. L'hybridation se fait dans les conditions décrites en IlLe.
Pour transférer les plaques de la mini-banque on suit le protocole suivant qui dérive de la
méthode décrite par MANIATIS et coll., (1986) :
Des rondelles de nitrocellulose (85 mm diamètre) sont déposés sur les boîtes
de Pétri contenant les phages. Des répères d'orientation sont marqués sur les filtres et le
transfert se fait pendant 5 minutes. Les phages fixés à la nitrocellulose sont alors traités
au SDS 10% pendant 5 minutes puis dénaturés (0,2 M NaOH) pendant 5 minutes et
enfin mis au contact d'un tampon de neutralisation (O,5M Tris-HCl pH 8). Les filtres
sont enslJite séchés à température ambiante puis passés au four à 80°C pendant 2 heures.
Ces filtres sont hybridés avec la sonde radioactive. Les clones posirifs révélés après
l'autoradiographie sont repiqués individuellement et analysés par les méthodes décrites
précédemment.
2. CLONAGE DE FRAGMENTS PURIFIÉS
Au lieu de réaliser une mini-banque, on peut effectuer le clonage d'un fragment
précis, déjà caractérisé. Pour cela, il faut purifier le fragment concerné. Nous avons
souvent purifié les fragments de restriction après les avoir fractionnés par électrophorèse
sur gel d'agarose.
a) Purification des fragments de restriction
a) Utilisation de gel d'agarose à basse température de fusion
Les gels d'agarose à basse température de fusion (FMC, Biocorp., USA)
ont les mêmes propriétés que les gels d'agarose normaux en ce qui concerne leur capacité
de fractionnement des fragments de DNA. Ils ont en plus l'avantage de pouvoir se
liquéfier en dessous de 60°C, ce qui permet une extraction plus facile des fragments de
DNA sans risquer leur dénaturation. L'électrophorèse a lieu dans les mêmes conditions
que les gels classiques. Le morceau de gel contenant le fragment de restriction d'intérêt
est découpé après la migration et incubé à 60°C pendant 10 minutes. Le gel fondu est
ensuite dilué 3 à 4 fois avec de l'eau distillée et extrait 3 à 4 fois avec du phénol. Nous
évitons le chloroforme qui favorise la formation'd'un culot translucide qui s'avère

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22
inhibiteur pour les réactions de ligation. Le DNA de la phase aqueuse est précipité à l'aide
de 2,5 volumes d'éthanol.
{3) Filtration des morceaux d'agarose contenant du DNA
On peut aussi extraire les fragments à cloner en séparant la phase aqueuse
qui les contient de la phase solide du gel d'agarose. Pour cela, après l'électrophorèse, le
morceau d'agarose contenant le fragment d'intérêt est placé dans un tube de type Costar
contenant un filtre de nitrocellulose. Ce filtre se caractérise par sa faible rétention pour les
acides nucléiques. Le filtre sépare le morceau de gel du fond du tube. L'ensemble est
ensuite centrifugé à 12 000 rpm pendant au moins 20 minutes. La phase aqueuse
contenant le DNA se retrouve alors au fond du tube et la phase solide est éliminée avec le
filtre. La phase aqueuse est extraite avec du phénol et le DNA est récupéré par
précipitation à l'aide d'éthanol.
b) Clonage des fragments purifiés
Tout le reste de l'opération se fait comme dans le cas d'une mini-.banque.
L'avantage du clonage de fragments spécifiques est que le rapport de ligation est facile à
déterminer puisqu'on peut connaître la taille et la quantité de l'insert. De plus, le criblage
est plus facile.
3. SOUS-CLONAGE DES FRAGMENTS DE DNA EN VUE DE LEUR
SEQUENÇAGE
a) Sous-clonage basé sur la cartographie de restriction
Lorsqu'un fragment de restriction dépasse 500 pb en longueur, il est utile de le
découper en fragments de plus petites taille pour déterminer sa séquence nucléotidique.
Pour cela, on utilise une batterie d'enzymes de restriction à site de coupure fréquents
(enzymes comportant 4 nucléotides dans leur site de coupure) pour établir la carte
physique du fragment. Ces petits fragments sont sous-clonés et leur séquence
nucléotidique peut être facilement déterminée.
b) Utilisation d'oligonucléotides de synthèse
Il peut arriver que, dans certains cas, on ne retrouve pas de site de restriction
adéquat permettant de sous-cloner certaines régions d'un fragment de DNA. Ces régions
peuvent être séquencées en utilisant des oligonucIéotides de synthèse. La séquence de ces
oligonucléotides est déterminée à partir de la séquence des régions déjà connues. Ils vont
servir d'amorce pour la détermination de la séquence nucIéotidique des régions
inconnues par la méthode de SANGER (1977).

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23
c) Sous-clonage par la technique du cyclone
Nous avons aussi urilisé la technique de sous-clonage par délétion séquentielle
à la T4 DNA polymérase développée par DALE (1984) et améliorée par les laboratoires
lBI. Le principe de cette méthode est schématisé sur la figure 2.
Cette méthode permet d'obtenir une population de clones dont les insertions
sont de plus en plus petits et se chevauchent. En sélectionnant les clones en fonction de la
taille de leurs inserts (III.A.l), on peut aligner de manière ordonnée les séquences
obtenues.
La première étape de cette méthode consiste à hybrider un oligonucléotide au
DNA simple brin du phage recombinant. Cet oligonucléotide est situé en 3' de l'insert à
analyser et recouvre une partie du vecteur comportant un site de restriction EcoRI pour la
série impaire du vecteur Ml3 (mp9, mpl1, mpl9, etc... ) ou HindlII pour la série paire
(mp8, mp 10, mp 18, etc...). Après l'hybridation, le DNA est linéarisé à l'endroit où il est
bicaténaire par l'action de l'enzyme adéquat.
Dans la deuxième étape, le DN A linéarisé est soumis à l'action 3'
exonucléasique de la T4 DNA polymérase. La réaction est arrêtée à des intervalles de
temps réguliers de manière à avoir des inserts de moins en moins grands. Les différentes
aliquotes sont ensuite réunies et soumises à l'action de la Terminal-désoxyribonucléotidyl
transférase en présence de dATP ou de dGTP. Cet enzyme synthétise donc une queue
poly dA (pour les vecteurs pairs) et poly dG (pour les vecteurs impairs). Ces queues sont
complémentaires à la partie S' des oligonucléotides utilisés plus haut. Ainsi, en
rehybridant les DN A simple brin avec ces oligonucléotides, on peut recirculariser les
fragments obtenus après l'action de la T4 DNA polymérase.
La troisième étape consiste à faire agir de la T4 DNA ligase sur le DNA
recircularisé de manière à refermer les molécules sur elles-mêmes. Ces molécules
serviront ensuite à transformer des bactéries (E.coli) par la méthode décrite en IILA.!.
Le criblage et la sélection des clones se font comme décrit précédemment. Pour la
réalisation de la technique, nous avons suivi les indications du fournisseur (IBI système
RDS). Il est indispensable de s'y conformer.
B. TECHNIQUES DE MARQUAGE RADIOACTIF DES SONDES
1. MARQUAGE DU DNA
a) Marquage à partir de DNA simple brin
Le principe des marquages utilisés dans nos expériences a été décrit par
FEINBERG et VOGELSTEIN ( 1983 ).
Il s'agit en fait de synthétiser le brin complémentaire du DNA simple-brin
matrice en y incorporant un ou plusieurs nucléotides marqués (suivant l'activité
spécifique recherchée). Le DNA phagique est hybridé préalablement avec un

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oligonucléotide de synthèse (il peut s'agit de l'amorce universelle ou d'un
oligonucléotide spécifique). Le milieu d'hybridation contient :
- 10 à 100 ng de DNA simple brin
- 1 à 2,5 ng d'oligonucléoLide
- 1 J.Ù de tampon Klenow IOx (100 mM Tris pH 8, 50 mM MgCI2)
- H20 qsp 10 III
L'hybridation se fait à 65°C pendant 15 minutes. Le milieu est refroidi à
température ambiante. On dépose 5 III de la solution précédente dans un tube contenant
10 IlCi de a-[32P]dATP (400 Ci/mmoles) séchées et on mélange avec 5 III d'une
solution d'élongation contenant du dCTP, du dGTP et du dTTP à la concentration
uniforme de 0,5 IlM et 1 unité de l'enzyme de Klenow. L'ensemble
est vortexé,
brièvement centrifugé et mis à incuber pendant 10 minutes à 37°C. On y ajoute ensuite
2 III d'une solution de chasse contenant les 4 désoxyribonucléotides à la concentration
uniforme de 0,5 IlM et on laisse incuber pendant 10 minutes supplémentaires. La
réaction est arrêtée en chauffant le milieu à 65°C pendant la minutes. Les
désoxyribonucléosides en excès sont éliminés par chromatographie sur DEAE cellulose
ou par une série de précipitations à l'éthanol.
b) Marquage du DNA double brin
La méthode de marquage des DNA double brin que nous avons utilisée est
similaire à la méthode décrite pour les simple brins. Le DNA double brin est simplement
dénaturé par chauffage 5 minutes à 90°C et refroidissement immédiat avant de servir
comme matrice. Nous avons souvent utilisé pour la synthèse des brins complémentaires
une solution d'amorces multiples (Amersham).
c) Marquage des oligonucléotides de synthèse
Nous avons utilisé la méthode de marquage des oligonucléotides en 5' décrite
par MANIATIS et coll. (1986). Cette technique utilise la T4 polynucléotide kinase
(P.N.K.) et du y_[32p] dATP pour fixer en 5', un nucléotide marqué. Le milieu
réactionnel contient :
- 10 ng de l'oligonucléolide
- 10 unités de P.N.K.
- 1 J.Ù du tampon P.N.K. lOx
- 10 IlCi y_[32p]-dATP (3000 Ci/mmole)
- H20 qsp 10 III

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25
Le tampon P.N.K. lOx a la composition suivante:
- 0,5 M Tris-HCI pH 7,6
- 0,1 M MgCIZ
- 50 mM DIT
- 1 mM spennidine
-1 mMEDTA
La réaction se fait à 3rC pendant 30 minutes et elle est arrêtée par addition de
2 JlI d'EDTA 0,5 M. Les désoxynucléotides radioactifs non incorporés sont éliminés par
une série de précipitations à l'éthanol.
2. MARQUAGE DES tRNA
a) MarQuage en 3' à l'aide de la T4 RNA ligase
La technique utilisée dérive de celle d'ENGLAND et UHLENBECK (1978)
modifiée (BRUCE et UHLENBECK, 1978). La T4 RNA ligase catalyse la formation
d'une liaison phosphodiester entre le phosphate S' (d'un RNA simple brin et l'hydroxyle
3' d'un autrepNA ou RNA simple brin (SUGINO et coll., 1977). Cet enzyme est utilisé
pour incorporer le [32p] pCp à l'extrémité 3' des molécules de tRNA.
Les tRNA sont dénaturés avant le marquage par addition de DMSO (26% v/v)
et par chauffage à 100°C pendant 1 minute, suivit d'un brusque refroidissement à O°e. Le
milieu de marquage est composé de :
- 80 mM
Tris-HCI pH 7,5
-25 mM
MgCIZ
-40 mM
DIT
- 0,2 mM
AT?
- 0,5 Unilés
T4 RNA ligase
- 5!lg
tRNA dénalurés
- 50 !lCi
[32Pl pCp (300 Ci/mmole)
La réaction est effectuée à 15°C pendant 3 heures et arrêtée par chauffage à
6SoC pendant S minutes. Les tRNA marqués sont séparés du pCp résiduel par
chromatographie sur RPC-S (II.A.4.b).
b) Marquage à l'extrémité 3' à l'aide de la tRNA nucléotidyl transférase
La tRNA nucléotidyl transférase (CCAse) catalyse l'incorporation spécifique
des nucléotides C, C et A à l'extremité 3' des tRNA. Puisque nous extrayons des tRNA
matures qui comportent déjà ce trinucléotide, il est nécessaire par conséquent
d'hydrolyser ces tRNA de façon ménagée avant de procéder au marquage à l'aide de la
CCAse.

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26
Les tRNA (5 Ilg) sont mis dans un milieu réactionnel contenant du MgCl2
(10 mM) et du Tris (50 mM pH 8) et traités avec 0,5 Ilg de phosphodiesterase du venin
de serpent (P.D.E.) à 20°C (SILBERKLANG et coll. 1979). Des aliquotes sont
prélevées à 5, 10 et 15 minutes et traités immédiatement au phénol. Les phases aqueuses
sont ensuite réunies, extraites une nouvelle fois au phénol-chloroforme v/v) et les tRNA
sont précipités à l'éthanol. Les tRNA précipités sont repris dans un volume minimal
d'eau (1 à 5 Ill) bidistillée.
La réaction de marquage se fait dans un milieu de la III qui contient :
- 5 J.l.g
de tRNA traités à la P.D.E.
- 30 lJM
a_[32p] ATP (3000 Ci/mmole)
- 6 J.l.g
CCAse
-25 mM
Tris-glycine pH 8,9
-lOmM
MgCl2
- 50 J.l.M
CTP
-8mM
DIT
La réaction est arrêtée par addition de 1 III d'EDTA 0,5 M. Les tRNA sont
purifiés comme précédemment.
Dans les deux cas, on peut analyser les tRNA marqués par électrophorèse sur
gel d'acrylamide 15% en conditions dénaturantes (II.A.6.b).
C) TECHNIQUES DE TRANSFERT ET D'HYBRIDATION
1. METHODES DE TRANSFERT
a) Trans/en des acides nucléiques par capillarité
Les fragments de DNA séparés sur gel d'agarose sont transférés sur membrane
de nylon (Genscreen plus, NEN ; Hybond, Amersham) d'après une méthode qui dérive
de celle décrite par SOUTHERN (1975). Après électrophorèse, le gel contenant les
fragments de restriction est plongé pendant 30 minutes dans une solution alcaline (0,5 N
NaOH, NaCI 1,5 M) afin de dénaturer le DNA. Le gel est ensuite rincé avec de l'eau
distillée puis replongé dans une solution de neutralisation (Tris-Hel 0,5 M pH 7,5 ; 1,5
M NaCI) pendant 30 minutes.
Le gel est ensuite placé dans un bac à électrophorèse horizontal sur 3 couches
de papier Whatman 3 MM. Les extrémités de la couche inférieure de papier trempent
dans le tampon de transfert 20 x SSC (Nael 3 M, citrate de sodium 0,3 M) contenu dans
le réservoir du bac. On dépose sur le gel une membrane nylon découpée à sa taille. Deux
morceaux de papier 3 MM de même taille sont ensuite déposés -sur le filtre puis
recouverts par une pile de papier absorbant. Un poids de 1 kg environ est disposé sur
l'ensemble et le transfert du DNA se fait pendant que le tampon imbibe le papier
absorbant par capillarité. Le transfert dure au moins 12 heures.

---

a
b
~
[ '"n""'m, ]Ion,
~
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[ '''n,'",m"""
22·rr(l('
ij anneal 29-mer
ij enrœlZ2-mY
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~ cloave wllh Krd"
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0'
~ ~~~nuclease dlQoslion
~ ~~~nuc'ease diQeSllon
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"ONA po'ym,,"sc)
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~
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---'\\~
_ _ _'YV't
dA tail
vv-
dG lail
- - -........
FIGURE 2: Schéma montrant les différentes étapes du
sous-clonage par délétion séquentielle à la
T4-DNA polyinérase ( DALE et coll., 1985 )

---

27
La membrane est détachée du gel après le transfert et la position des poches et
l'orientation du gel sont marquées au crayon gras. La membrane est débarrassée des
morceaux d'agarose par un bain de 2 minutes dans du 2 x SSC puis le DNA y est
irréversiblement fixé par une irradiation de 5 minutes aux U.V.
Le transfert des RNA peut aussi se faire par capillarité mais le gel n'est pas
traité à la ~oude avant le transfert.
b) Transfert des tRNA sur membrane nylon
Les tRNA ont été fixés sur membrane nylon par transfert électrique
("electro-blotting"). Le procédé est inspiré du système I.B.I. (HBS). Le bac à transfert
provient du même laboratoire. Après l'électrophorèse, le gel d'acrylamide contenant les
tRNA est mis à équilibrer (2 x 30 minutes) dans 300 ml de tampon 0,25 x TEA (cf
Annexe). Les dimensions du gel augmentent après cet équilibrage et il est par conséquent
préférable de ne découper le filtre aux dimensions du gel qu'après cette opération. Nous
avons utilisé des membranes Hybond-N (Amersham). Après avoir mis la membrane au
contact du gel, l'ensemble est fixé entre deux éponges de type "scotch-brite" et coincé par
deux grilles plastiques. Ce dispositif est placé dans un tampon (0,25 x TEA) contenu
dans une cuve à transfert La cuve est munie de deux électrodes qui sont alors branchées
sur .un générateur. Le transfert est effectué en' mettant le générateur. sous tension pendant
20 mn à 0,15 ampères puis 1 heure à 0,5 ampères. Après le transfert, la membrane est
rincée avec 0,25 x TEA et séché à l'air. Le filtre est ensuite passé au four à 80°C pendant
deux heures. Cette opération est très importante car elle améliore considérablement les
signaux d'hybridation.
2. TECHNIQUES D'HYBRIDATION
La composition des milieux d'hybridation change en fonction du type d'acide
nucléique fixé sur membrane.
a) Membranes comportant des fragments de DNA
u) Préhybridation
La membrane sur laquelle est fixé le DNA est préhybridée pendant 2 à
12 heures dans le tampon d'hybridation dont la composition est:
- Tris-HCl
10 mMpH 8
-EDTA
1mM
- SDS
1%
-NaCl
lM

---

28
{3) Hybridation
La membrane préhybridée est replacée dans une nouvelle solution de
tampon d'hybridation. Cette solution contient la sonde radioactive que l'on a
préalablement dénaturé en chauffant à 100°C pendant 5 minutes et en refroidissant
brusquement dans la glace. L'hybridation a lieu entre 37°C et 65°C en fonction de la
sonde utilisée. Pour les désoxyoligonucléotides de synthèse, la température
d'hybridation est calculée de telle manière à être effectuée au moins 10°C en dessous de
la température de dénaturation du désoxyoligonucléotide, selon la formule établie par
WALLACE et coll. (1979) : Td: 2x(A+T)+4x(G+C).
y) Lavage
Après l'hybridation, les membranes sont soumises à une série de lavages
pour éliminer les hybridations non-spécifiques.
La membrane est rincée deux fois de suite pendant 5 minutes dans 200 ml
de 2 x SSC à température ambiante. Elle est placée ensuite dans une solution contenant 2
x SSC ; 1% SDS et lavée deux foi~ pendant 30 minutes à la température d'hybridation.
Enfin, elle est trempée dans une solution 0,1 x SSC à température ambiante. Cette étape
peut être renouvelée. On peut agir sur la stringence de l'hybridation à cette étape en
faisant varier la température des lavages. La membrane est ensuite autoradiographiée à -
70°C au contact d'un film (KODAK XAR-5) et d'un écran amplificateur (Philips). Le
film est développé après 24 heures et l'autoradiographie est reconduite pour une plus
longue période si cela s'avère nécessaire.
b) Membranes portant du RNA
L'hybridation se fait suivant le même principe que précédemment mais
généralement à 42°C et dans un tampon d'hybridation dont la composition est:
- 5 x
SSPE
- 50%
Fonnamide (v:v)
- 5 x
Solulion de Denhart
- 1%
S.D.S.
Avec : 20 x S SPE correspondant à :
- 3,6 M NaCI
- 0,2 M phosphate de Sodium pH 7.7
- 0,002 Na2 EDTA

---

The annealing reactlon
r-_~_O-_ _Jo_MCCCTACACC
---.
(
)
1
ONAPoil
I(l.enow
lI·gf·
The sequencing reaction
G+
T"
A"
dCTP.ddCTP
oClp
oCTp
deTp
dGTP
dGIP'd<!GTP
dGTp
dGlP
dTTP
dnp
dnp.Qdnp
dlTP
laollPJdi\\TP
1".:l'pIdA!p
la'lPidATp
la·)JPIdA rp 1 n(lAfP
~
~
_ _ nCCCAIGTCddC
_ _ nGCCAIGT6dC
_ _ lTGCCATCddr
_ _ TTGCCddA
_ _ nCCddC
_ _ lTGCCAT<WG
_ _ rrCcç"ddT
~L7
- - ï_Gdd_C
- - l'--ld<IG
.--
_ . _ J
Gel electrophoresis and autoradiography
C
G
A
C
G
G
A
5eQuence reaclS.
C
50 lTCCCArGTCC J'
C
G
1
T
FIGURE 3 : Schéma montrant les différentes étapes
du séquençage par la méthode de SANGER
(SANGER et coll., 1977 )

---

29
et la solution de Oenhart (x 100) qui est composée de :
- 2%
B.S.A. (p/v)
- 2%
Ficoll (p/v)
- 2%
Polyvinylpyrolidone (p/v)
c) Membrane comportant des tRNA
L'hybridation se fait dans les mêmes conditions que lorsque le ONA est fixé
sur la membrane.
D. SEQUENÇAGE DU DNA
1. PRINCIPE
La méthode de séquençage que nous avons utilisée dans nos travaux est celle
décrite par SANGER et coll. (1977). Cette méthode qui utilise le vecteur M13 a été
adaptée par plusieurs laboratoires à différents types de DNA polymérase (fragment de
KLENüW, TI-ONA polymérase). La technique se réalise en trois étapes:
1°) Une amorce (oligonucléotide de synthèse) est hybridée à la matrice de ONA
simple brin.
2°) A partir de l'amorce, le brin complémentaire de la matrice de ON A est
syn~hétisé. Quatr~ réactions indépendantes sont réalisées: chacune se fait en présence de
trois désoxynucléotides triphosphates froids (dCTP, dGTP et dTTP) et d'un
désoxynucléotide triphosphate radioactif (a-[32p] dATP) mais chaque réaction se
caractérise par la présence d'un 2',3'-didésoxynucléotide (ddNTP) différent.
L'incorporation des ddNTP pour chaque réaction provoque l'arrêt de l'élongation de la
chaîne, créant un ensemble de fragments de DNA se terminant spécifiquement par la
même base.
3°) L'ensemble des oligodésoxynucléotides de chaque réaction est analysé par
électrophorèse sur gel de polyacrylamide et la séquence est déduite de la position des
bandes 0 bservées.
La figure 3 schématise les différentes étapes du séquençage.
2. LES REACTIONS
a) Hybridation de l'amorce
L'hybridation se fait à 65°C pendant 15 minutes. Le milieu réactionnel est
ensuite refroidi lentement à température ambiante. Sa composition est:

---

30
- DNA simple brin
500 -1000 ng
- amorce
2,5 ng
- Tampon de réaction lOx
1,5 Jll
- H20 qsp
1OJ.1l
Le tampon de réaction lOx contient 100 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM MgCh.
b) Elongation et arrêt de la synthèse
Les milieux réactionnels, la stratégie et les rapports entre les dNTP et les
ddNTP varient suivant les fournisseurs et suivant l'enzyme utilisé pour la détermination
de la séquence nucléotidique. Pour notre pan, nous avons utilisé le fragment de Klenow
en nous référant aux indications du fournisseur Amersham, et la T7 DNA polymérase
conformément aux instructions du fournisseur USB (système sequenase).
Les réactions d'élongation sont arrêtées par addition du tampon de charge
contenant: 99% de formamide déionisé, 0,025% de bleu de bromophénol et 0,025% de
xylène cyanol.
c) Electrophorèse verticale sur gel de polyaCD/lamide
L'électrophorèse est réalisée sur un gel de polyacrylamide 6% en conditions
dénaturantes (6 M urée). Le gel est préparé comme indiqué en II.A.6.b. Il est soumis à
un pré-chauffage pendant au moins 30 minutes et l'électrophorèse se fait à 1500 V,
65 W constants.
Les milieux réactionnels sont chauffés à 95°C pendant 3 minutes et
immédiatement déposés dans les poches aménagées sur le gel. Plusieurs dépôts sont
effectués pour des migrations de 2, 4, et 8 h.
En fin d'électrophorèse, le gel est transféré sur une feuille de papier Whatman
3 MM. Le DNA est fixé, couvert d'une fine pellicule de plastique de Saran Wrap et
séché sous vide à 80°C pendant 45 minutes. Le gel séché est mis en autoradiographie
pendant 12 à 16 heures au contact d'un film (Fuji Photo film co., LTD).
d) Analyse des séQuences nucléQtidiQues ;
Les séquences Qnt été analysées à l'aide du programme UWGCG (University
Qf WiscQnsin Genetic CQmputer GrQup) de l'Université de MadisQn (WiscQnsin, USA) à
l'aide d'un Qrdinateur microVAX (DEVEREUX et CQll., 1984).
Les banques de dQnnées cQnsultées SQnt : GENBANK de NIH (NatiQnal
Institute ·Qf.Health, USA) et EMBL (EMBO) pQur les séquences nucléQtidiques et la
banque NBRF (NatiQnal BiQchemical Research FQundation, USA) pour les séquences
protéiques.

---

CHAPiTRE ffff
ETUDE DES GENES DE ~RNA MlffTOCHONDRffAUX
DUM/AffS

---

DlETlERIM~[N]Al~O[N OrES COSM~[O)lES
IPOR1A[N]1' DES GrElNllES DE ~~NA

---

3 1
1. DETERMINATION DES COSMIDES PORTANT DES GENES
DE tRNA
A) CARTES DE RESTRICTION DES GENOMES MITOCHONDRIAUX
B37-N ET B37-cms T
Les cartes de restriction SmaI, XhoI et SstH du génome mitochondrial de la variété
WF9 à cytoplasme mâle fertile (WF9-N) ont été établies par LONSDALE et coll.,
(1984). De même, les cartographies BamHI, SmaI et XhoI des génomes mitochondriaux
des variétés B37-N mâle fertile (FAURON et HAVLIK,1988) et B37 Cms-T mâle stérile
de type T (FAURON et coll.,1989) ont été récemment décrites. Les cartes de restriction
des différents génomes mitochondriaux de la variété B37 sont représentées sur les figures
4-a et 4-b de même que la localisation des fragments BamHI comportant des gènes de
tRNA.
Dans ce travail, nous avons utilisé des cosmides recouvranr-Ia totalité des trois
génomes étudiés. Les positions des cosmides des génomes B37-N et B37-cmsT, sont
-indiquées sur les figure 4-a et 4-b. La localisation des cosmides du génome WF9-N a
déja été rapportée (Wintz, 1988; figA-c ). Dans le laboratoire, nos études avaient
commencé sur les cosmides contenant des insertions du génome mitochondrial WF9-N
mais, pour des problèmes de maintenance et d'amplification de ces cosmides, nos
dernières études ont porté sur les cosmides contenant des insertions des génomes
mitochondriaux B37-N et B37-cmsT. C'est ainsi que dans ce travail, la séquence
nucléotidique des gènes des tRNA portés par les fragments BamHI de 22 kb, 4 kb et 3.5
kb (b) du génome B37-N (figA: cosmides N7D7 et N7F3) a été déterminée en utilisant
des fragments de restriction du cosmide 8-3B2 (chap.II.ILE; figA-c) du génome WF9-
N. De même, le gène de tRNA porté par le fragment BamHI 3.2 kb du cosmide N7DlO
du génome B37-N (figA et tableau F) a été séquencé sur un fragment SmaI de 1.25 kb
du cosmide 9-3HlO du génome WF9-N (chap.II.H.A; figA-c). D'autres études ont
aussi été effectuées sur les cosmides 9-1E8 (chap./II.LA; figA-c) et 9-2C4
(chap.IIl.I.B; figA-c) contenant des insertions de DNA mitochondrial de maïs WF9-
N.Tous les autres cosmides utilisés pour le séquençage des gènes de tRNA proviennent
de la variété fertile B37-N. L'organisation des gènes de tRNA a été étudiée dans les deux
vaÎi.étés B37-N et B37-cmsT.

---

o
10
20
30
40
50
60
70
80
30
100
N
l
'
1
1
1
I l !
!
•
N7D4(4)
•
•
10.3
16
o., 4.6
N8A'(6)~
•
N6,Ç6 (8)-
1 •. 2
N8F3(1)--
- N8A5 (19)
•
•
•
S ~.4 ~
X
t---------1
5Kb
B -6·~-'i""",,·,!~....,..JI'([IT
0.11
0 . .
FIGURE 4·a:
LOCALISATION ET IDENTIFICATION DES COSMIDES COMPORTANT
DES GENES DE tRNA DU GENOME MITOCHONDRIAL 837-N
Les fragments BamHI comportant des gènes de tRNA sont hachurés
S: Smal ; B: BamHI ; X: Xhol.
La position sur le cercle maître linéarisé est indiquée au dessus de la cane.

---

o
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
T
1
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1
I l !
1
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1
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306(4)--
s
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•
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304(13)
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•
102(18)
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-3HIO (14).--e
X
B
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X
I----l
B
5kb
FIGURE 4-b
LOCALISATION ET IDENTIFICATION DES COSMIDES COMPORTANT
DES GENES DE tRNA DU GENOME MITOCHONDRIAL 83?-cmsT
Les fragments BamHI comportant des gènes de tRNA sont hachurés
S: Smal ; B: BamHI ; X: Xhol.
La position sur le cercle maître linéarisé est indiquée au dessus de la carte.

---

o
100
200
1
~
1
Sm. 1
S.. Il
~ 11I~ I II~I I__ I_I_~_I
I_I
I
I ~I_I I
I__ ~
Xho 1
Al
(8.3011)
A4
(8-3F2)
A6
(6·382)
A9
(8·306)
A12
(9·301)
A2
(9-1 E8)
AS
(9-2(;4)
A7
(2c65)
Al0
(9-3H8)
Cl
(9-ICI0)
A3
19-3F2)
A6
(9.1 El)
AlI
(8.305)
C2
(9.1 ES)
300
400
500
1
1
1
Sm. 1
~ 1 0:== III
[]LJL~l...-----1I ~I- -
;
S5' Il
~
L
_..
__ __
==rro:=1.._
~==ë
__
_
_..
Il Il
1
1
C3
(9-102)
CS
(2c29)
C9 (2c70)
~I~
Xho 1
1
1
__ . .:
El (2cl)
C12
(9·3010)
C4
(9·2C4)
C7
(9-3Hl0)
Cl0
(9-2F7)
E2 (2c3)
Al
CS (2c7)
CO (2c13)
CIl
(9·2E5)
--
- - - - .
_
-.._
_.. - -.._
------
Cl·
--
FIGURE 4-c
LOCALISATION DES COSMIDES DU GENOME MITOCHONDRIAL WF9-N
La position sur le cercle maître linéarisé est indiquée au dessus de la carte.

---

32
B) LOCALISATION DES GENES DE tRNA SUR LES CERCLE-
MAITRES DES GENOMES NET T
1) ANALYSE DES tRNA MITOCHONDRIAUX
a) Analyse sur gel d'agarose de la fraction 4S du RNA mitochondrial
Pour localiser les régions du génome mitochondrial du maïs qui codent pour
des gènes de tRNA, nous avons utilisé la méthode de marquage à la tRNA nucléotidyl
transférase (CCAse) qui est très spécifique des tRNA car elle est basée sur la
reconnaissance de leur structure tertiaire. Cependant, il nous est apparu au fil des
expériences qu'il est indispensable de purifier les tRNA marqués par la CCAse, sur une
colonne RPC-5 car, comme nous le verrons plus loin, le marquage à la CCAse présente
aussi des limites. Les tRNA sont élués de la colonne à une concentration saline inférieure
ou égale à 1 M NaCl. La figure 5 montre l'analyse électrophorétique de la fraction 4S
marquée soit au [32p] pCp en utilisant la T4 RNA ligase, soit au a-[32p] ATP en utilisant
la CCAse. Cette expérience met en évidence la spécificité du marquage à la CCAse par
rapport à la T4 RNA ligase qui marque aussi le rRNA 5s.
b) Absence de contaminants chloroplastiques
La méthode utilisée pour s'assurer que nos préparations de tRNA
mitochondriaux sont exemptes de tRNA chloroplastiques a été antérieurement décrite par
WINTZ et coll. (l988-b). Cette méthode est basée sur le fait que le DNA mitochondrial
du maïs contient des insertions de DNA chloroplastique (STERN et LONSDALE,1982)
dont certaines comportent des gènes de tRNA. Il a été démontré que ces gènes de tRNA
ne sont pas exprimés dans la mitochondrie (WINTZ et coll., 1988-b).
Les préparations de tRNA mitochondriaux sont ainsi systématiquement testées
par hybridation avec un cosmide comportant ces gènes de tRNA chloroplastiques
(cosmide 8-3 H4, LONS DALE 1984). Si cette hybridation révèle les fragments
comportant les gènes de tRNA chloroplastiques, c'est que la préparation de tRNA
mitochondriaux est contaminée par des tRNA chloroplastiques.
2) HYBRIDATION D~S tRNA MITOCHONDRIAUX TOTAUX
Nous avons hybridé les tRNA mitochondriaux totaux, marqués au a-[32p] ATP à
l'aide de la CCAse et élués à lM NaCI, avec des filtres comportant des cosmides
représentatifs des cercles-maîtres des génomes mitochondriaux des maïs B37-N et B37-
cmsT. Ces expériences ont été effectuées avec des tRNA homologues extraits de la

---

Q)
CI)
cd
.2'
<Il
~
<i:
ü
z
ü
cr
55
+
tRNA
,...-....-
a
b
FIGURE 5 : Analyse comparative du marquage des tRNA
a): au a_[32p]ATP à l'aide de la CCAse
b): au a -e2p]pCp à l'aide de la T4-RNA ligase
La fraction 45 marquée par les deux méthodes a été fractionnée sur gel de polyacrylamide 15%.
Le gel a été exposé en autoradiographie pendant 1 heure au contact d'un film très sensible.

---

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- -
-
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- .\\.- •
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•
•
•
-
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FIGURE 6-a : Identification des fragments BarnHI du DNA mitochondrial
du maïs de la variété B37-N comportant des gènes de tRNA
En haut: Electrophorèse sur gel d'agarose des fragments BamHI de cosmides représentant
la totalité du cercie-maître. Les cosmides sont numérotés de 1 à 20 (cf fig.4-a)
En bas : Hybridation des fragments BamHI avec les tRNA mitochondriaux totaux de la
variété B37-N. Le même profil d'hybridation est obtenu en utilisant les tRNA
totaux extraits de mitochondries de la variété B37-cmsT

---

-~-----.---­
.. --
•
--
•
..
•
-
-.......
•
•
•
FIGURE 6-b: Identification des fragments BarnHI du DNA mitochondrial
du maïs de la variété B37-cmsT comportant des gènes de tRNA
En haut: Electrophorèse sur gel d'agarose des fragments BarnHI de cosmides représentant
la totalité du cercle-maître. Les cosmides sont numérotés de 1 à 18 (cf figA-b)
En bas : Hybridation des fragments BamHI avec les tRNA mitochondriaux totaux de la
variété B37-N. Le même profil d'hybridation est obtenu en utilisant les tRNA
totaux extraits de mitochondries de la variété B37-cmsT.

---

TABLEAU F-1:
QRGANISATIQN DES GENES DEtRNA SUR LE GENOME B37-N
N° du tracé
Nom du cosmide
Taille des fragments
Gènes de tRNA
d'hybridation
BamHI (en kb )
identifiés
11.5
Asn
3
N8811
4
mMet-1 +Asp
3.5a-1
Pro+Glu
4
N7D4
22
Lys
22
Lys+ Tyr
5
. N7F3
4
mMet-1 +Asp
3.5a-2
Pro+Glu
3.5b
mMet-2
6
N8A1
2.75
Asn+Phe
9
N787
1.25
Pseudo-Pro
5.9
Ser-1 +Pseudo-Phe
10
N7C9
3.6
Cys
5.9
Ser-1 +Pseudo-Phe
11
N5G6
5.1
Gin
3.6
Cys
12
N7E5
3
fMet
12
His
13
N8D11
3
fMet
14
12
His
N7D1D
3.2
Ser-2

---

TABLEAU F-2:
ORGANISATION DES GENES DE tRNA SUR LE GENOME B37-cmsT
N° du tracé
Nom du cosmide
Taille des fragments
Gènes de tRNA
d'hybridation
BamHI (en kb)
identifiés
5.9
Ser-1 +Pseudo-Phe
1
4E11
3.6
Cys
2
3H11
5.1
Gin
3.2
Ser-2
3
3G5
2.2
Phe
4
306
3
fMet
-
8
2G6
1.25
Pseudo-Pro
9
3B10
2.05
Pseudo-Asp
13
304
21.8
Lys+ Tyr
21.8
Lys+ Tyr
14
3H10
3.5b
mMet-2
21.8
Lys+ Tyr
10
Asn
15
3E3
4
mMet-1 +Asp
3.5b
mMet-2
3.5a-2
Pro+Glu
17
IE4
12
His
18
102
12
His

---

TABLEAU F-2:
ORGANISATION DES GENES DE tBNA SUR LE GENOME B37-cmsT
N° du tracé
Nom du cosmide
Taille des fragments
Gènes de tRNA
d'hybridation
BamHI (en kb)
identifiés
5.9
Ser-1 +Pseudo-Phe
1
4E11
3.6
Cys
2
3H11
5.1
Gin
3.2
Ser-2
3
3G5
2.2
Phe
4
306
3
fMet
-
8
2G6
1.25
Pseudo-Pro
9
3B10
2.05
Pseudo-Asp
13
304
21.8
Lys+ Tyr
21.8
Lys+ Tyr
14
3H10
3.5b
mMet-2
21.8
Lys+ Tyr
10
Asn
15
3E3
4
mMet-1 +Asp
3.5b
mMet-2
3.5a-2
Pro+Glu
17
IE4
12
His
18
102
12
His

---

33
mitochondrie des deux variétés de maïs (B37-N et B37-cmsT). Les filtres comportent des
cosmides digérés par BarnHI.
Les résultats de ces hybridations sont consignés sur les figure 6-a et 6-b. Dans les
tableaux F-a et F-b est indiquée la taille des fragments BamHI qui s'hybrident aux tRNA,
les cosmides auxquels ils appartiennent et les gènes qui y ont été identifiés (chap.II.II et
chapII.II). Au total, 10 cosmides (dont certains chevauchent) de la variété fertile B37-N
comportent des fragments codant pour des gènes de tRNA. Pannis ces gènes un certain
nombre ont déja été séquençés et étudiés (cf introduction). Pour notre part, nous nous
sommes intéréssés aux cosmides dont les fragments comportent des gènes de tRNA qui
n'ont pas été décrits chez le maïs.

---

---

G
G -C
G - C
A _
U
70
U _A
G -C
G _C
60
A -U
U
A
C
G
A
A
10
U
C
Ü
C'C
C
G
G
G
U
C
U
1
1
1
1
1
G
G
1
1 1
G
G
G
G
G
A
A
G
A
C 50
C
U
U
U
C
A
G
U
U - A
G
A
/
A
G
/
U
C _G
20
U
/
A
G-C
A
/
A
G
U
/
G
G-C
30
40
U
A
U - A
G
A
U
C
A
U
A
U
A
G
FIGURE 9 : Structure secondaire en feuille de trèfle
déduite de la séquence du gène trnS de la mitochondrie
du maïs.

---

35
par la méthode décrite dans le chapitre 1 puis, la mini-banque ainsi obtenue a été criblée
en sélectionnant les clones suivant la taille de leur insertion par électrophorèse sur gel
d'agarose. Nous avons pu ainsi sélectionner un clone contenant un fragment SmaI de
1,25 kb nommé C7-20. Le DNA de ce clone a été transféré sur un filtre nylon et hybridé
avec la sonde de tRNA mitochondriaux pour vérifier qu'il s'agit du clone recherché. Un
contrôle supplémentaire a été effectué en marquant le fragment 1,25 kb du' clone Cl-20
et en l'hybridant avec les fragments SmaI du cosmide Cl (9-3H10).
3. SOUS-CLONAGE ET SEQUENÇAGE DU CLONE C7-20
Nous avons établi la carte de restriction du fragment SmaI de 1,25 kb ( fig.7 ) et
un seul site, en l'occurrence BamHI, s'est avéré utilisable pour le sous-clonage dans le
vecteur Ml3. Nous avons mis à profit ce site et la stratégie de séquençage est montrée sur
la figure 7. L'analyse de ces séquences a révélé la présence d'un gène codant pour un
tRNAScr(UGA)
Le sens de transcription du gène ainsi que l'orientation du fragment SmaI de 1,25
kb ont été obtenus en comparant les cartes BamHI (FAURON et HA VLIK, 1989) et
SmaI (LONS DALE et coll., 1984) de la région contenant l'in sert du cosmide 9-3HlO
(fig.7). Le site BamHI utilisé pour le sous-clonage a servi pour superposer les
deux cartes et définir l'orientation du fragment 1,25 kb par rapport aux fragments
voisins.
4. ANALYSE DU GENE DE tRNASer(UGA)
a) Analyse de la partie codante du gène
La structure secondaire en feuille de trèfle déduite de la partie codante du
gène de tRNASer(UGA) est représentée sur la figure 9. Le gène compte 87 nucléotides et
il se caractérise par la présence d'un appariement inhabituel U 10-A26 dans le bras
dihydro-U. En effet, on retrouve généralement à cette position, un appariement GlO-C26
ou plus rarement GlO-U26 et le nucléotide GlO est très conservé dans tous les tRNA. De
plus, ce gène comporte une boucle variable très grande contenant 18 nucléotides dont 10
sont capables de s'apparier. Cette caractéristique, fréquente parmi les tRNASer, est
retrouvée aussi dans le gène de tRNASer(GCU) de la mitochondrie du maïs (WINTZ et
coll., 1988-b). Un seul appariement de faible énergie G50-U64 est retrouvé dans le bras
de la boucle 'V. Le gène ne code pas pour la séquence CCA 3' terminale caractéristique
des tRNA matures.
Comparé aux autres gènes de tRNASer(UGA) décrits dans la littérature
(SPRINTZL et coll., 1989), le gène de tRNAScr(UGA) est identique à celui de la
mitochondrie du blé (JOYCE et coll., 1988-b) et présente une homologie de séquence
d'environ 72% avec les tRNASer(UGA) chloroplastiques. TI n'est homologue qu'à 49%

---

34
II. SEQUENÇAGE ET ANALYSE DES GENES DE tRNA
.A. ETUDE DES GENES DE tRNA DU COSMIDE 9-3Hl 0
1. PRESENTATION DU COSMIDE
Le cosmide 9-3H10 (Cl: fig.4-c) contient une insertion de DNA mitochondrial de
maïs WF9-N qui mesure environ 35 kb. Il est localisé sur le cercle maître entre les
positions 360 et 400 kb (fig.7), c'est-à-dire entre la région où a été localisé le gène
codant pour la sous-unité 1 de la cytochrome oxydase (ISAAC et coll., 1985) et celle
contenant le gène du rRNA 26S (DALE et coll., 1984). Ce fragment de DNA s'est révélé
intéressant parce qu'il s'hybride aux tRNA totaux extraits de la mitochondrie du maïs. Il
ne s'hybride pas aux tRNA chloroplastiques. Nous avons entrepris son sous-clonage
dans le but d'identifier et établir la séquence nucléotidique des plus petits fragments
portant des gènes de tRNA.
370
1
- ••- - - - - - - - - - cosmide C7 ----------------4
100pb
FIGURE 7: Localisation et stratégie de séquençage du gène de tRNA~(UGA)
Les grandes flèches réprésentent la stratégie de séquençage du fragment SmaI de 1.25 kb. La petite flèche désigne le
sens de transcription du gène de tRNASer . Les tailles sont indiquées en kb. Les chiffres inscrits au dessus de la ligne
supérieure indiquent la position sur le cercle maître.
2. ANALYSE DU COSMIDE
9-3HIO ET IDENTIFICATION DU
FRAGMENT PORTANT UN GENE DE tRNA
La carte de restriction Sma! de la région où se localise l'insertion du cosmide 9-
3HlO (fig.7) a déja été publiée (LüNSDALE et coll., 1984). La digestion par SmaI du
DNA du cosmide est montrée sur la figure 8-a. Les fragments de restriction Sma! du
cosmide ont été transférés sur un filtre de nylon et hybridés avec une sonde de tRNA
mitochondriaux totaux. Les résultats d'hybridation montrent (fig.8-b) que ce cosmide
contient un fragment SmaI de 1,25 kb comportant au moins un gène de tRNA.
L'ensemble des fragments SmaI du cosmide a été sous-cloné dans le vecteur Ml3 mp19

---

0
0
CJ)
0
CJ)
0
I
N
~
N
I
N
.....
N
,
,
,
. , .
C'?
C'?
,
1'-
1'-
1'-
,
1'-
1'-
1'-
CJ)
0
0
0
CJ)
0
0
0
kb
12
4
3
2
- -
a)
b)
FIGURE 8: Analyse du cosmide 9-3HlO
a) : Electrophorèse sur gel d'agarose des fragments SmaI du cosmide
9-3HlO et des sous-clones C7-19, Cl-20 et C7-21
b) : Hybridation des fragments SmaI avec une sonde de tRNA
mitochondriaux totaux

---

36
aux tRNASer(UGA) de la mitochondrie de drosophile et qu'a 59% à celui de la
mitochondrie de la levure. Les tRNASer(UGA) et les gènes de tRNASer(UGA) de
différentes bacteries lui sont homologues à 67% tandis que le gène de tRNASer(UGA)
cytoplasmique de la levure ne l'est qu'à 54%. Nous avons comparé la séquence primaire
des gènes de tRNASer (GCU) et tRNASer(UGA) dans le but de voir si les deux gènes
pouraient avoir la même origine. Cette analyse a montré que:
-si l'on ampute les boucles variables des deux gènes, ils ont une homologie
de séquence de 70%.
-par contre, si l'on tient compte de ces boucles, l'homologie se réduit à
63%.
Ce degré de ressemblance ne plaide pas pour une origine commune
"récente" des deux gènes car il se range dans la catégorie des homologies retrouvées avec
les tRNASer(UGA) chloroplastiques étudiés (SPRlNTZL et coll. 1989)
13) Etude des régionsjlanquantes du gène de tRNASer(UGA)
Nous avons comparé les régtons flanquantes des deux gènes de
tRNASer(UGA) mitochondriaux du blé et du maïs ( fig.lO ) et on trouve (sur 150
nucléotides), près de 95% d'homologie en amont de leurs régions codantes. En fait, pour
les séquences connues, une seule transition à la position -69 remplaçant un C (blé) par un
T (maïs) est observée dans cette région en plus d'une
délétion de 8 nucléotides
(5'CGCfAACC 3')à la position -107. Cette délétion prend place 3 nucléotides en amont
d'une "séquence consensus" (5' CfACCGGAAAAG 3') désignée par Cons-l décrite par
JOYCE (JOYCE et coll., 1988-b) dans le blé et retrouvée aussi dans le maïs (fig.lO).
Cependant, il faut signaler que nous avons trouvé une séquence 5' ATATAGAAAGA 3'
(appelée Cons-2) située à quelques nucléotides en amont de cette séquence consensus,
qui ressemble plus à la séquence d'initiation de la transcription de la levure prise comme
référence par JOYCE (JOYCE et coll., 1988-b) , que Cons-l. En prenant le signal
d'initiation de la transcription de la mitochondrie de la levure ( 5'ATATAAGTA 3')
comme un motif de base, JOYCE avait trouvé un très bon alignement (le meilleur parmi
toutes les autres séquences comparées) entre cette séquence et une séquence en amont du
gène de tRNAAsP du blé (5' ATATAAGAAAAG 3'). La séquence consensus Cons-2 que
nous avons retrouvée en amont du gène de tRNASer(UGA) du maïs s'aligne mieux avec
la séquence identifiée en amont du gène de tRNAAsp, que celle de JOYCE (fig.11). Une
autre séquence de type consensus ( appelée Cons-3 ) est retrouvée à environ 400 pb du
début du gène ( fig. 10 et fig. Il ). A part ces séquences, dont la fonction reste à prouver,
nous n'avons pas trouvé de séquences consensus "-10" et "-35" caractéristiques des
régions promotrices des gènes procaryotiques et identifiés également en amont de
certains gènes de tRNA chloroplastiques (STEINME1Z et coll. 1983).

---

FIGURE 10: Séquence nucléotidique du fragment SmaI de
1,25kb du cosmide 9-3HIO(C7)
SmaI
CCCGGGCTAGCTTCTTCATTCATCCATTTAGGTCAGGGGCGGGCTTCTTCCCTTATATACGATGACATAG
ATAGAGCCTCCTTCTTTGATCCATTCATTGATAAAATAAAGTAGTCTTCGGGGGCAGTTTACCTTTTGAA
TCGACAGTAGAGTAGGTTTGATCTTGCTTTCTCAATCTTTCTCTGATCCTAGCCGTGTAGTAGATCCGGC
TTTATTCGGCTAAAAAGAAGTGTGTGCCCGTCGATCTGCTCGCCCCCTTCTTCATTCATCCATTTAGGTC
AGAATGGATCCAGGGAACCTGGCTCGGGAACAGCCCTGAAAAAACACAGTAAGAGAGTCCAATCTCTGAA
ATTTAGCATTTTATCTCCTAACCTAAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGAAGGCTTAGTATCTGACTTGATCCA
ATAGAGTAAGAACACACAGTAGATCCAGATTCCACACCTTGCTGTGGACTGGGGAGAGAGCAGCTCTGCG
AACGTGGGCGTTCTGTGTGATTATGGAGGAACTGTAGTACTCGCCCCAAAATGCAAGCCGGGATAGATAC
TT~~GqGGGAGCGGTGGGCCTTC~GGAGCGAGGGAGTGATGGGCAACCTTAGTCTATATGT
TGCTCGTGAGCCGCCAAGTACCAGTCTCGCAACAGTACTGGCGTTAAAGGATCGGTCCTTCACTTGCGGA
TCGTTCGCGAGTCGAACTCGCTCTCTTGCCACGCCTTTGACCACGAACTCGAGTCGGACTCATTCACTGC
TTACTTTTTTTAGGATCGTTCGTTCTTCACTCTCTTGCTATTACCCGCAGGGAGCGCAGCAACCGACGGT
cons-2
cons-1
CGCTAAC(-107)
GCATATTAT~TATAGAAAG8AGCGAAGCGTAGCGATTCGT~CTACCGGAAAAgTGTGCTAGGCAATAGA
1
C (-69)
GTCAGCTTACGGGGTGGGGCGCAAGTAAGCGTAGCGAATCACATAGAGTTGCCCCTACCTGCCAGCGCGC
.
.
- 1 .
.
.
.
.
AGATAGATAGGGCGGGCGAGCGCAqGG~$~rGWC%G~GCGG~m~GAG~CGGWçWW~çq~
T
IGT~TTGAtA~T~PbGGGG$wr~G~wcÇQ$c.T.çÇAïqGqCGAGGGCATAAGTTCTCTCTTGCCTTAT
T
A
G
CTATAGATAAGAACGAATCTCCTCGACTCGACGGATATGATGGATGGAATGGGT.GAAGGTTTAGGTTAT
TGTGTGTTGATTTAGTTAGGACTTTGTCTCCCTTTCGTTATGTTCCGCÇCGGG
1
SmaI
La partie codante du gène trnS est montrée par une boite grisée. Les séquences consensus alignées sur la
figure Il sont encadrées. Les nucléotides differents dans la séquence de la même région du blé sont
inscrits au dessus de la séquence du maïs. Les barres verticales en gras indiquent la fin de la séquence publiée
par Joyce et coll. pour le blé.
FIGURE Il : Alignement des séquences consensus trouvées en
amont du gène tmS de la mitochondrie du maïs
cons-Levure
cons-2
cons-Asp
cons-3
Consensus
Les séquences consensus sont alignées avec la séquence promotrice des gènes mitoehondriaux de la
levure et la séquence consensus trouvée en amont du gène trnD de la mitochondrie du blé.
cons-2 et cons-3 sont les deux autres séquences consensus potentielles différentes de celle publiées
par Joyce et coll.(cons-l) pour le blé.

---

37
--
En aval de la partie codante du gène, on trouve plus de 95% d'homologie
, ' .
.,'
avec la région en aval du tRNASer(UGA) du blé sur environ 150 nucléotides.
r) Transcription du gène de tRNASer
Nous n'avons pas trouvé d'autre gène de tRNA sur le fragment SmaI de
1,25 kb codant pour le gène de tRNASer (UGA) décrit dans ce travail. Puisque ce
fragment s'hybride aux tRNA totaux mitochondriaux, le tRNA correspondant se trouve
donc dans la mitochondrie. Noùs avons' par ailleurs hybridé un oligOflucléotide de
synthèse complémentaire au gène de tRNASer(UGA) avec un filtre comportant du DNA
nucléaire du maïs hydrolysé par divers enzymes de restriction. Ces expériences ont
montré qu'il n'y avait pas de gène nucléaire homologue au gène séquencé dans ce travail.
Le tRNA mitochondrial qui s'hybride au fragment SmaI de 1.25 kb ne peut, par
conséquent, provenir que de la transcription du gène mitochondrial. En outre, il n'y a
qu'un exemplaire de ce gène dans la mitochondrie du maïs. Ce gène de tRNASer(UGA)
est donc transcrit.
f •
~

---

38
B. ETUDE DES GENES DE tRNA DU COSMIDE N8Al
1. PRESENT ATlON
Le cosmide N8Al (figA-a) contient une insertion de DNA mitochondrial de maïs
B37-N à cytoplasme mâle fertile qui mesure environ 35 kb. Cette insertion s'étend sur le
cercle maître entre les coordonnées 120 et 165 (fig.12). Elle contient environ 4 kb de
l'une des deux copies de la répétition inversée de 14 kb et porte le gène codant pour
l'URF 25 (DEWEY e.t coll., 1986 ; STAMPER et coll., 1987). Notre intérêt s'est porté
sur le" cosmide N8Al parce que des expériences préliminaires ont montré que son
insertion s'hybride à la fois aux tRNA totaux mitochondriaux et aux tRNA totaux
chloroplastiques du maïs.
120
140
160
. --,:-------------:------------:
...- - - - - - - - - C o s m i d e N8A1----"-------.
1 . 1
1.4
1
...... ....
1
......
1
......
1
...... ......
1
......
1
100pb
" tRN,t(\\sn
i'll!
1 1
1 1
EHd
Hd E
.. ..
HdH
E: EcoRI; H: Hindlll; Hd: Hindll; X: XhoJ
FIGURE 12 : Localisation et stratégie de séquençage des gènes de tRNA
du fragment BarnHI de 2.7 kb.
Les grandes flèches réprésentent la stratégie de séquençage et les petites flèches. le
sens de transcription des gènes. Les tailles sont indiquées en kb. Les chiffres inscrits au
dessus de la ligne supérieure indiquent la position sur le cercle maître.
2. IDENTIFICATION DU FRAGMENT
PORTANT DES GENES DE
tRNA
Le cosmide N8A 1 a été hydrolysé par l'enzyme de restriction BamHI. Les
fragments issus de cette hydrolyse ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose
avant d'être transférés sur un filtre nylon. Ce filtre a ensuite été hybridé avec une sonde

---

IG - C 1
U-G
C-G
70
A -
U
G-C
G -
C
60
A
A -U
U
A
u
.G.
A
10
U
-l
U
G
G
U
C
't
A
u
C
U
C
G
1 1
1
1
1
A
1
1
1 1
A
C
C
A
G
G
C
G
A
G
C
C
50
U
A
A
U
U
G
G-C G
U
G
A _
U
U
20
G_C
FIGURE 14 : Structure secondaire en feuille de trèfle déduite de la
séquence du gène trnF de la mitochondrie du maïs
Les nucléotides très conservés dans les gènes trnF sont encadrés.
Les purines soulignées, A (9; 26; 73) et G (15) sont aussi très conservées
parmi les gènes trnF.
j
1
1
1
!·1
1
j
J
1
~
l
1

---

[
40
4. ANALYSE DES GENES DE tRNA PRESENTS SUR LE
FRAGMENT BamHI
DE 2,7 kb
a) Etude du gène de tRNA~(GAA)
a )Analyse de la partie codante du gène de tRNAPhe(GAA)
I~
La structure secondaire en feuille de trèfle déduite de la séquence du gène de
tRNAPhe(GAA) codé par le fragment BamHI-XhoI de 300 pb est montrée sur la figure
14. Ce gène comporte 73 nucléotides et ne présente pas de caractéristique particulière par
rapport aux tRNAPhe(GAA) ou gènes de tRNAPhe(GAA) déjà connus. Au contraire, il
conserve tous les points communs à ces tRNA tels que les appariements du bras dihydro-
U. Il garde aussi la purine A aux positions 9, 26 et 73 comme la plupart des
tRNAPhe(GAA), ainsi que le G en position 15. A ces traits communs s'ajoutent, d'une
part l'appariement G1-Cn, et d'autre part l'ensemble des nucléotides très conservés qui
constituent la boucle et une partie du bras de l'anticodon (fig. 14). Le gène ne code pas
pour le CCA 3' terminal. Un seul appariement de faible énergie U2-G71 est présent dans
la molécule. On retrouve ce même appariement à la même position dans le
tRNAPhe(GAA) de la mitochondrie de haricot (MARECHAL et coll., 1985-a).
La comparaison du gène de tRNAPhe(GAA) avec les tRNAPhe(GAA) et les
gènes correspondants décrits dans la littérature (SPRINTZL et coll., 1989) a montré que
ce gène est identique au gène de tRNAPhe(GAA) chloroplastique du maïs. Par contre, il
n'a que 78% d'homologie avec le tRNAPhe(GAA) mitochondrial de haricot
(MARECHAL et coll., 1985-a). Il est peu probable que cette homologie rende compte
d'une origine commune récente entre les deux tRNAPhe(GAA) mitochondriaux. Il faut
rappeler à ce sujet que le tRNAPhe(GAA) purifié de la mitochondrie de haricot
(MARECHAL et coll., 1985-a) s'hybride à une région du DNA mitochondrial du maïs
différente et très éloignée de la région codant pour le tRNAPhe(GAA) décrit ici, et que le
gène correspondant y est non fonctionnel. Il a été démontré en effet, que la région du
DNA mitochondrial du maïs homologue au tRNAPhe(GAA) de la mitochondrie de haricot
comporte un pseudogène de tRNAPhe (WINrZ et coll., 1988-b).
La similitude observée entre le gène de tRNAPhe(GAA) mitochondrial et
son homologue chloroplastique nous a incité à comparer les régions flanquantes de ces
deux gènes dans leur environnements respectifs.
f3 )Analyse des régionsflanquantes du gène de tRNAPhe
Nous avons utilisé le programme de comparaison des séquences d'acides
nucléiques "WüRDSEARCH" (UWGCG) pour rechercher des.ho~ologies de séquences
eptre le fragment XhoI-BamHI de 300pb contenant le gène de tRNAPhe(GAA)
mitochondrial décrit dans ce travail et la séquence nucléotidique du fragment "Barn 5" du
DNA chlorop1astique du maïs (STEINMETZ et coll., 1982) codant pour les gènes de
tRNASer3 (GGA), tRNAThr2(UGU), tRNALeu2(CAA) et tRNAPhe(GAA). Le résultat de
Il

---

FIGURE 15:
Comparaison des séquences mitochondriales et
cWorop1astiques dans la région codant pour le
gène trnF du maïs
ATTAATTCGTTTTTTTTAAGTATTATTAAGTAAGCCATCCACAATGCATA
Il
Il
Il 1
1
1111/
111111
Il 1
1 1
Il
2
ATGAACATATTATAGTATAGTATAGGCAAGTAATCCCTTATTATTAAGTA
1
GG .. ACTACCCCTCCC .... CATTTCCTAATTTTGA .. ATGGAATACTTT
1
1 11 1
1
1
11111 11Il
1
j
1 Il 1111111
2
AGTCATTATCATTATCCTGACATTTACTAAGTCCAATTTTAGAATACTTT
"-35"
1
ATTGATTTTTTAGTCCCTTTAATTGACATAGATGCAA .... ATACTTTAC
11
111111111111
11111 11 111
1Il 1 1
2
.TTTCTTTTTTAGTCCC
ACATACATACAAGTACGTACTCTAC
"-10"
5'
1
TAAGATGATGCACAAGAAAGCJI":':'-·T.-C-A-GG""':""""A-TA-G-C':"""T-CA---G-T-T-G-G-T-A-GA-G':"""C-A-G-A-G
Il
1111111111111111111111111111111111111111111111
2
TAGGATGATGCACAAGAAATGGTCAGGATAGCTCAGTTGGTAGAGCAGAG
1
GACTGAAAATCCTCGTGTCACCAGTTCAAATCTGGTTCCTGGCA~AGAAA
11111111111111111111111111111111111111111111111
Il
2
GACTGAAAATCCTCGTGTCACCAGTTCAAATCTGGTTCCTGGCACAG.AA
+109-<-_ _
1
AAAAGGATCTACTGAATAGATATTGATACAAATATT
TTGAGA
1111111
III
111111
Il
11111
Il
1
III
Il
2
AAAAGGA .. TACCGAATAG .. GTTACTACAATTACTCGAGAGGATTGGGA
+l3~2,,-
_
1
TGGATTGGGGTAAATATTTATTAAAAATëiAëTTAGTëiT~
1
11
Il Il
1
11
1
11 111 1 11 1
2
TACATATTCTAGAATAATATAGAAGGAAGTA.TTATTTTTAA
1: séquences chloroplastiques
2: sequences mitochondriales
Les parties codantes des gènes trnF mitochondrial et chloroplastique sont encadrées.
La séquence homologue au consensus AAGAANRR est soulignée en gras. Les séquences
importantes pour la transcription du gène chloroplastique sont représentés par des
lignes au dessus des séquences. Les lignes en pointillés désignent le début de la
structure secondaire impliquée dans la terminaison et/ou la stabilisaùon du transcrit
chloroplastique.

---

41
cette analyse est présenté sur la figure 15. L'homologie entre la région comportant le gène
de tRNAPhe(GAA) mitochondrial et celle codant pour le gène de tRNAPhe(GAA)
chloroplastique du maïs, s'étend en dehors de la partie codante. En effet, la comparaison
montre que les séquences sont conservées sur 160 nucléotides en amont de la parti~
codante du gène (environ 70%). L'analyse de ces homologies fait apparaître qu'il s'agit
en fait de blocs d'homologies allant de 2 à 16 nucléotides communs entre les deux
séquences. De même, sur 50 nucléotides en aval des deux régions codantes, on observe
une assez forte homologie (plus de 60%) entre les deux DNA. Un certain nombre de
remarques peuvent être faites à la suite de ces observations:
1°) Les deux domaines (-35 et -10) représentant potentiellement les
séquences promotrices de la transcription du gène de tRNAPhe(GAA) chloroplastique
sont détruits en amont du gène mitochondrial . En effet, la séquence "-10" (STEINMETZ
et coll., 1983) est partiellement modifiée par la transition du A à la position -19 en un G
(fig. 15). En outre, le bloc "-35" perd 3 nucléotides sur 6 par suite d'une délétion
enlevant 8 nucléotides en amont du tRNAPhe mitochondrial.
2°) Comme ce qui est observé en amont, le gène mitochondrial présente en
aval des altérations affectant des régions importantes pour la transcription du gène
chloroplastique. C'est ainsi que la séquence répétée AAATATIT aux positions +109 et
+132 du gène chloroplastique est détruite en aval du gène mitochondrial. Cette séquence
qui est impliquée dans la terminaison de la transcription du gène chloroplastique
(STEINMETZ et coll., 1983) ne semble pas être fonctionnelle dans la mitochondrie. A
cela s'ajoute le remaniement presque total des séquences impliquées dans la mise en place
de la structure secondaire en épingle à cheveux qui serait le signal d'arrêt potentiel de la
transcription du gène chloroplastique (STEINMETZ et coll.,1983). Il a toutefois été
démontré que ce signal servirait plutôt à la stabilisation des gènes chloroplastiques
L
(STERN et GRUISSEM, 1987) qu'à la terminaison de la transcription. Dans tous les
cas, la fonction éventuelle de ces structures est abolie pour le gène mitochondrial.
3°) Immédiatement en amont de la région codante du gène chloroplastique,
on trouve une séquence riche en purine 5' AAGAAAGG 3', semblable au consensus
5' AAGAANRR 3' décrite par JOYCE. Cette séquence est conservée devant le gène
mitochondrial à part une transversion ( fig. 15 ) remplaçant un G (chloroplaste) par un T
(mitochondrie) .
Ainsi, en faisant la synthèse de toutes ces observations, il apparaît que le
gène de tRNAPhe(GAA) mitochondrial que nous avons étudié provient très probablement
d'une insertion du DNA chloroplastique dans le génome mitochondrial du maïs mais que
ce gène a subi des modifications dans les régions flanquant sa partie codante. Le fait que,
d'une part les tRNA totaux mitochondriaux s'hybrident au fragment BamID-XhoI de
300 pb, et d'autre part que l'on n'ait trouvé que ce gène de tRNAPhe(GAA) sur ce
1
~..

---

G
U -
A
C -
G
C _
G
70
U -
G
C _
G
A
-
U
60
A
G -
U
U
G
A
U
A
10
U
C A U
C
C
r - - - - - - - - , A
G
G
e u e
G
G
U
A
G
G
C
G
50
G
A
G
C
C
U
U
U
U
A
~
@
G -
C
U
G
G
U _
A
C
G
30
G -
U
40
FIGURE 16 : Structure secondaire en feuille de trèfle déduite de la
séquence du gène tmN de la mitochondrie du maïs
Les nucléotides conservés dans les gènes trnN sont encadrés.
Le nucléotide 20 encerclé est absent du gène.

---

42
fragment montre que ce gène est transcrit dans la mitochondrie du maïs. Nous savons par
ailleurs que les tRNA mitochondriaux totaux de maïs que nous utilisons comme sonde,
ne sont pas contaminés par des tRNA chloroplastiques (cf chap./l- II). De plus, les
essais d'hybridation avec un oligonucléotide complémentaire à la partie 5' du gène de
tRNAPhe(GAA) sur le DNA nucléaire du maïs ont montré que ce gène n'est pas présent
dans le noyau.
Il est remarquable que le gène soit exprimé et qu'il ait conservé beaucoup
d'homologies dans les régions flanquantes avec le gène chloroplastique d'origine. Ceci
montre que l'insertion du DNA chloroplastique contenant le gène de tRNAPhe(GAA) est
récente et s'est produit très probablement dans la même "période" que l'insertion des
gènes de tRNACYs (WINTZ et coll., 1988-b) et de tRNAHis (IAMS et coll., 1985) qui
ont aussi conservé leurs environnements chloroplastiques. Ces séquences
chloroplastiques insérées auraient subi des pressions de sélection suffisantes pour rendre
les gènes qu'ils comportent fonctionnels mais non suffisantes pour rendre leurs
environnements méconnaissables. Dans la mitochondrie du blé, les séquences flanquant
le gène de tRNAPhe sont mieux conservées (C. AUBRY, C. HARTMAN :
communication personnelle) par rapport au maïs et il sera intéressant de déterminer si ce
gène est aussi transcrit. En fait, on sait que le fragment KI du DNA mitochondrial du blé
(QUETIER et coll., 1985) comportant le gène de tRNAPhe s'hybride aux tRNA totaux
mitochondriaux et chloroplastiques du blé, mais on ne sait pas si le gène de tRNAPhe est
le seul gène de tRNA présent sur ce fragment.
b) Etude du gène de tRNAAsn(GUU)
a) Analyse de la partie codame du gène
Le gène de tRNAAsn(GUU) porté par le fragment EcoRI-HindII de 400 pb
est présenté sur la figure 16. Ce gène est long de 72 pb et on peut déduire de la séquence
du DNA, la structure secondaire en feuille de trèfle caractéristique des tRNA. Du point de
vue de sa séquence primaire, ce gène présente un certain nombre de caractéristiques
communes avec d'autres gènes de tRNAAsn(GUU) décrits dans la littérature (SPRINZL
et coll., 1989). En effet, la comparaison de ce gène aux tRNAAsn(GUU) et gènes de
tRNAAsn(GUU) de différents phages et divers espèces bactériennes connus, fait
apparaître que tous les nucléotides impliqués dans la constitution du bras dihydro-U sont
conservés chez toutes ces espèces. Cette caractéristique se retrouve chez certains gènes
(mais pas tous) de tRNAAsn-(GUU) des mitochondries animales et de champignons.
Dans tous les cas analysés, les nucléotides GlO et Cu sont conservés. De la même
manière, on observe une très forte conservation des nucléotides de la boucle de
l'anticodon à l'exception du nucléotide 32. En ce qui concerne les appariements de faible
1'0'
énergie, on en observe deux à savoir les paires G7-U66 et U4-G69. Ces appariements

---

43
sont fréquents dans les gènes de tRNAAsn(GUU) chloroplastiques. Par contre, chez
Halobacterium sp., la paire U4-G69 est remplacée par l'appariement G4-U69 tandis que
l'appariement G7-U66 n'existe pas.
L'absence du nucléotide 20 dans la structure secondaire du tRNAAsn(GUU)
est la caractéristique frappante de ce gène.
En fait, l'analyse et l'alignement des
séquences de différents gènes de tRNAAsn(GUU) nous a pennis de constater que ce
caractère se retrouve dans tous les gènes de tRNAAsn(GUU) mitochondriaux,
chloroplastiques et cytoplasmiques connus (fig. 17). La seule exception rapportée est
observée non pas au niveau d'un gène de tRNAAsn mais sur un tRNAAsn. Il s'agit du
tRNAAsn(GUU) cytoplasmique de Lupinus lutéus
(BARCISZEWSKA et JONES,
1988) qui comporte un nucléotide modifié X (acp3U) au niveau du nucléotide 20. Ceci
est d'autant plus surprenant que le gene de tRNAAsn(GUU) cytoplasmique de Petunia sp
(BAWNIK et coll. 1983) qui est aussi une dicotylédone, ne comporte pas le nucléotide
20. Chez le lupin, le nucléotide 20 (qui est un U modifié) serait-il ajouté au tRNA puis
modifié
après la transcription du gène? Seule, la détennination de la séquence
nucléotidique du gène nucléaire du lupin permettrait de répondre à cette question.
La recherche d'homologies de séquences entre le gène de tRNAAsn(GUU)
décrit dans ce travail et d'autres gènes de tRNAAsn(GUU) décrits dans la littérature
(SPRINZL et coll., 1989) a montré qu'il est très peu semblable aux gènes de
tRNAAsn(GUU) phagiques ( moins de 50% d'homologie) et qu'il a une homologie
d'environ 65% avec les gènes bactériens. n a environ 60% d'homologie avec le gène de
tRNAAsn(GUU) de la mitochondrie d'Aspergillus nidulans alors que le tRNAAsn(GUU)
de la mitochondrie du rat ne montre que 52% d'homologie.
Par contre, ce gène de tRNAAsn(GUU) présente une homologie parfaite
(100%) d'une part avec le gène de tRNAAsn(GUU) de la mitochondrie du blé
(CRUZALEGUI et coll., 1989) et d'autre part avec le gène de tRNAAsn(GUU)
cytoplasmique de Petunia sp. (BAWNIK et coll. 1983). Ce gène a 99% d'homologie
avec le gène du chloroplaste de maïs; la seule différence entre les deux gènes étant la
délétion du nucléotide 47 (qui est un U dans le tRNA mitochondrial) de la boucle variable
du gène chloroplastique. Cependant, le nucléotide T47 (U47 sur le tRNA) est retrouvé
dans le gène de tRNAAsn(GUU) du chloroplaste de Pisum sativum (SHAPIRO et
TEWARI 1986) .
Il s'agit là d'un cas particulier où les trois compartiments cellulaires
comportent des gènes montrant une telle res~emblance. En analysant d'autres gènes de
tRNAAsn(GUU) des plantes superieures, il est apparu que chez Lupinus luteus, le
compartiment mitochondrial comporte un gène de tRNAAsn(GUU) qui est homologue à
89% à son équivalent du noyau et ce gène a 97% d'homologie avec le gène de tRNAAsn
décrit ici (fig. 11). Il semble donc que les gènes de tRNAAsn(GUU) mitochondriaux chez

---

44
les plantes supérieures dérivent d'un ancêtre commun avec ceux du noyau et du
chloroplaste. Ceci pose évidemment le problème de l'origine du gène et de son évolution.
Pour disposer d'un minimum de données pouvant nous permettre d'aborder ce problème,
nous avons entrepris:
a) de vérifier si un gène homologue au tRNAAsn(GUU) mitochondrial était
présent dans le noyau du maïs. Les tRNAAsn(GUU) et les gènes de tRNAAsn(GUU)
nuc~éaires qui ont été décrits jusqu'à présent proviennent de deux dicotyléd0.nes (lupin et
pétunia ). Il serait par conséquent utile de voir si le gène nucléaire de tRNAAsn(GUU)
des monocotylédones (répresentés ici par le maïs) ressemble à ses homologues nucléaires
et mitochondriaux des dicotylédones.
b) d'étudier les régions avoisinant les différents gènes de tRNAAsn(GUU) à
notre disposition afin d'établir les relations qui existent.
[3) Le noyau du maïs comporte-t-ille même gène de tRNAAsn(GUU) que la mitochondrie?
En tenant compte de la fone homologie qui existe entre le gène de tRNAAsn
de la mitochondrie du maïs et le tRNAAsn du noyau de Petunia sp , il nous a paru utile de
chercher dans le génome nucléaire du maïs la présence d'un gène qui aurait la même
origine que le gène mitochondrial. Pour cela, nous avons utilisé un oligonucléotide de
synthèse (26-mer) complémentaire à la partie 3' du gène de tRNAAsn mitochondrial du
maïs. Cet oligonucléotide a été marqué en S avec du y_[32p] ATP à l'aide ··de la
polynucléotide-kinase et hybridé avec du DNA nucléaire du maïs (variété INRA)
hydrolysé par divers enzymes de restriction. Les hybridations ont été faites dans des
conditions de stringence variées. On a ainsi fait une hybridation à SO°C et une autre à
37°C. Les résultats de nos hybridations ont montré qu'aucune hybridation n'est obtenue
dans ces deux conditions.
Bien qu'il soit difficile d'interpréter l'absence d'hybridation, on peut tout
de même affirmer que le gène de tRNAAsn(GUU) mitochondrial n'est pas homologue à
100% à son équivalent nucléaire.
Notons à ce sujet que nous avons obtenu
l'hybridation de cet
oligonucléotide décrit plus haut avec le DNA mitochondrial de pétunia (résultats non
montrés), ce qui suggère (compte tenu de l'homologie entre le gène de tRNAAsn
mitochondrial du maïs et le gène nucléaire chez le pétunia), que le gène mitochondrial est
identique au gène nucléaire chez le pétunia. Ainsi, chez le maïs, le compartiment nucléo-
cytoplasmique, au contraire de ce qui est observé chez Petunia sp, n'a pas le même gène
que la mitochondrie et le chloroplaste.

---

FIGURE 17:
Analyse et comparaison des séquences mitochondriales,nucléaires
et chloroplastiques codant pour des gènes tmN de différentes espèces
et du tRNAAsn cytoplasmique du lupin
rot Ble
CCGCCGCC CCCCTTGTCC TG
CCGGC
rot Maïs
CCGCCGCC CCCCTT TCC TGTCCTGGGG GCTCCC GGC
rot Lup
AATTAGTA TATGGGTGGA ATATAATGAA ATAGAGCCAC
rot Ble
GGGGATTG CTATCGTCAC CCTTTCTCCC GGTGTATGTG AAAGA.GrV~
rot Maïs
GGGGATTG CTATCGTCAC CCTTTCTCCC GG
A AAAGAG
rot Lup
CCTATGAAAT GAGGCATGGA ACGGAGCCAC TGCGAAGAAG TTCCACGAGT
rot Ble
rot Mais
rot Lup
cp Maïs
nu Pet
GG.CC .
rot Ble
rot Maïs
... ...Ii AAG TCC G.TTC
. . . . . . T
AAG
TCC G.TTC
rot Lup
---~'~rl~G AG. TC .. GAAGATTTCC CGTTG
cp Maïs
G
CTA
GGTC GAA .. TCTCC CCTTG
nu Pet
CC. ..
. .. ~TTL.:.,:.AA::..:....;:G.:,....:....:....:.T:....:C:...:C~..=.GT:.,:T:.,:G:.:Jc.
nu Lup(tRNA
rot Ble
CAGTAGCTCl\\.GTGGT.AGAG CGGTCGGCTG TTMCTGACT GGTCGTAGGT
rot Mais
CAGTAGCTCAGT.GGT,AGAG CGGTCGGCTG TTAACTGACTGGTCGTAGGT
rot Lu -
CAGTAGCTCAGTGGT.AGAG CGGTCGGCTG TTAACTGACT GGTCGTAGGT
cp Maïs
CAGTAGCTCA..GTGGT;AGAG CGGTCGGCTGTTAACTGACT GG.CGTAGGT
nu Pet
êAGTAGCTêA}GtGGt~AGAG CGGTCGGCTG TTAACCGATT GGTCGTAGGT
nu Lup
CAGTAGCTCAGTGGTTAGAG CGGTCGGCTG TTAACCGATA.GGTCGTAGGT
rot Ble
TCGAATCCTACTTGG
TTT .. GA. T
C.A. T'OCAGA r T : l JGAAI
rot Mais
TCGAATCCTACTTGGG
TTT .. GA. T
C.A. TTCTGA ATT .. GAA
rot Lup
TCGAATCCTACTTGGGG
TTT .. GA.T
A.A.TTCTGA AT
G. GAA
cp Maïs
TCGMTCCTA ··CTTGGGG
TTT .. GA. TT C. A. TTCTTT AATGT
GAA
nu Pet
TC~~TCCTA CTTGGG .~~T~T~T~T~T~G~A~G~T~ ATCGCTTTTC TGACCTAGCG
nue Lup
TCGAGCCCTACTTGGGG
rot Ble
rot Mais
rot Lup
cp tJ'..aïs
nu Pet
rot Ble
......... C CCCTGTCCTT
rot Mais
. . . . . . . . . . . . . TGTC. TT
rot Lup
ACCTGTTCCC CCCTGTCTTT
cp Maïs
ACCCGTTCGC TA
TCCTT G
.
nu Pet
AAAGCGGTAA GTTGATTGTT GGTTTTTATT
rot Ble
ro Maïs
rot Lup
cp Maïs
rot Ble
rot Maïs
rot Lup
La boite grise représente la partie codante des gènes. Les boites blanches indiquent l'extension des homologies en
dehors de la partie codante. La séquence consensus 5'AAGAANRR3' est soulignée en gras. La position du nucléotide
20 est indiquée au dessus du gène. Pour la séquence du tRNA. les U et les nucléotides modifiés ont été remplacés par
les désoxyribonucléotides correspondants.

---

45
.r) Etude des régions flanquantes du gène de tRNAAsn (GUU)
L'analyse de la partie codante des différents gènes de tRNAAsn(GUU) ou
du tRNAAsn(GUU) correspondant ayant montré une forte conservation des séquences de
ce gène dans différents compartiments cellulaires d'une même plante (cas du lupin et du
pétunia), nous avons comparé les régions entourant ces gènes. Puisqu'on dispose d'un
échantillon de séquences correspondant aux trois compartiments cellulaires, nous avons
effectué la comparaison des régions flanquantes du gène de tRNAAsn(G UU)
mitochondrial du maïs avec, séparément, les gènes de tRNAAsn(GUU) mitochondriaux
(blé, lupin), de tRNAAsn(GUU) chloroplastique (maïs) et de tRNAAsn(GUU) nucléaire
(pétunia).
Comparaison entre les régions flanguantes des gènes de tRNAAsnCGUU)
des mitochondries des plantes supérieures
. Gènes de tRNAAsn(GUU} mitochondriaux du blé et du maïs
Entre les deux monocotylédones, l'homologie de séquence s'étend au
delà de 200 pb en amont et en aval des parties codantes des gènes ( plus de 80% ). Les
différences observées sont essentiellement liées à des délétions et/ou des insertions et à
quelques substitutions de bases (fig.17 ).
Il a été décrit en amont du gène de tRNAAsn de la mitochondrie du blé
(CRUZALEGUI, 1987), une structure secondaire en "épingle à cheveux" à environ 50
pb en amont du gène de tRNAAsn(GUU) (fig.18). Cette structure est retrouvée devant le
gène du maïs. Elle se caractérise par le fait qu'elle ressemble à un signal de terminaison
de la transcription procaryotique et/ou à une structure de stabilisation des transcrits
chloroplastiques (STERN et GRUISSEM, 1987). Cette structure précédée par une phase
de lecture ouverte (dont la séquence complète est en cours de détennination au laboratoire
) est exprimée dans la mitochondrie du blé. Il a été postulé (CRUZALEGUI, 1987) que
cette structure de terminaison de transcription et/ou de stabilisation des transcrits,
appartiendrait à une unité de transcription indépendante de celle du gène de
tRNAAsn(GUU). Si on admet cette hypothèse, on peut en déduire que la région
promotrice de la transcription du gène de tRNAAsn(GUU) de la mitochondrie du blé et
du maïs se situerait entre ce signal et le début du gène de tRNAAsn(GUU) (en admettant
aussi que le promoteur n'est pas interne au gène). Il est remarquable que la partie
.
comprise entre ce signal et le début du gène de tRNAAsn(GUU) soit aussi très conservée
'
devant les gènes mitochondriaux des deux organismes. En analysant cette région, on peut
remarquer qu'une séquence S'AAGAACGA3' conforme à la séquence consensus 5'
AAGAANRR 3 (JOYCE et coll., 1988-b) est présente à 25 nucléotides du début de la
partie codante des gènes du maïs et du blé (fig.17). L'homologie stricte entre les régions

---

FIGURE 18:
Structure secondaire déduite de la séquence nucléoLidique de
la région en amont du gène tmN
T
G G T
AT
A
G
T
G
G
G
G
G
T
A
G
A G
GA
G-G
G-G
A-T
G-T
G-T
G-G
5'CCCC<rIX,G- TCCCG
GGTTGGTTGGTCGAAAGAAG@ _~~e~ t RNA Asn
G-G
A-T
A-T
A-T
A-T
G·G
A·T
G-T
A-T
A-T
A-T
A-T
A-T
G-G
T
A
G
A
A
G
G
La boite représente la séquence ronsensus S'-AAGAANRR-3'
FIGURE 19:
Struture secondaire déduite de la séquence du DNA en aval
du gène trnN du chloroplaste du maïs (Donnann et col., 1986)
trnN- AnTG
-----3'
A-T
T-A
T-A
G-G
A-T
T_AT
T-A
G-G
T-A
T-A
T-A
A-T
A
A
T
A
G
G
T
A A

---

46
en amont des deux gènes s'achève seulement Il pb en amont de la séquence s'
AAGAACGA 3'. Ces observations renforcent l'idée selon laquelle cette séquence pourrait
avoir un rôle dans l'initiation de la transcription des gènes de tRNA des mitochondries
des plantes supérieures. Soulignons toutefois que ces interprétations ne sont fondées que
sur des analyses de séquences et qu'elles demandent à être confirmées par des études
fonctionnelles de ces gènes (transcription in organello, mutagénèse dirigée, etc...).
. Comparaison des gènes de tRNAA~n(GUU) mitochondriaux des
monocotylédones à celui du lupin
Les régions avoisinant le gène de tRNAAsn(GUU) de la mitochondrie de
Lupinus luteus montrent aussi des homologies avec celles des deux gènes
mitochondriaux du blé et du maïs (fig.17). En amont des gènes, les deux
monocotylédones divergent du lupin au même point, c'est-à-dire à 10 pb en amont de la
séquence S'AAGAANRR 3'. Cette dernière séquence est légèrement remaniée chez
Lupinus sp par la transition du A en S'en un G. En aval des gènes, des blocs
d'homologies sont retrouvés sur au moins 100pb.
Comparaison entre les trois gènes de tRNA~(GUU) mitochondriaux et le
gène ~ tRNAAsnCGUU) du chloroplaste de maïs
L'alignement des
séquences entourant
les différents gènes
mitochondriaux analysés ci-dessus (maïs, blé et lupin) avec les régions flanquantes du
gène de tRNAAsn(GUU) du chloroplaste du maïs montre que:
- l'homologie de séquence dans ces
régions entre les gènes
mitochondriaux et chloroplastiques s'étend très loin en dehors des parties codantes. En
effet, en amont du gène, des blocs de séquences homologues séparées par des délétions
et/ou insertions sont observées sur environ 90 pb ( fig.17). De plus, on retrouve la
séquence consensus s' AAGAANRR 3' devant le gène chloroplastique mais elle s'aligne
mieux sur les séquences du lupin que celles des deux monocotylédones. La même
situation est rencontrée en aval de la partie codante du gène où des blocs d'homologie
sont retrouvés au delà de 130 pb. La structure en épingle à cheveux flanquant la partie 3'
du transcrit primaire (fig. 19) du gène de tRNAAsn(GUU) chloroplastique (DORMANN
et coll., .1986) est détruite au niveau des gènes mitochondriaux. Ceci est une indication
que la terminaison de la transcription des gènes de tRNAAsn(GUU) dans les deux
organites se fait suivant des processus différents confirmant ce qui a été montré pour le
gène de tRNAPhc(GAA).
- Les séquences des gènes mitochondriaux
du lupin sont plus
conservées par rapport au gène chloroplastique que celles des deux monocotylédones.

---

47
Ainsi, au regard de ces observations, on peut conclure qu'à l'instar de ce
qui a été montré dans le cas du tRNAPhe (ce travail), du tRNACys (WINTZ et coll.,
1988-b) et du tRNAHis (IAMS et coll., 1985), le gène de tRNAAsn(GUU) de la
mitochondrie du maïs dérive d'une insertion du DNA chloroplastique dans le génome
mitochondrial. Les homologies de séquences trouvées dans les régions environnantes du
gène font penser que cette insertion s'est faite après cell~ des ,séquences codant pour les
gènes de tRNAmMet(ce travail) et tRNACys mais probablement dans la même "période"
que celle du gène de tRNAHis et du tRNAPhe(GAA). Notons à ce propos que les gènes
de tRNAHis et de tRNAAsn(GUU) sont situés chacun, à une extrémité de la séquence
répétée inversée du chloroplaste du maïs. Nous verrons plus tard (chap.III-II.B) que
plus de 90% de cette séquence répétée sont retrouvés dans la mitochondrie du maïs et que
très probablement, l'ensemble d'une des deux copies de cette séquence y a été transféré
en une seule fois. Ce transfert aurait été suivi d'une redistribution de ces séquences
chloroplastiques dans le DNA de la mitochondrie et les blocs de séquences redistribués
auraient évolué indépendamment. Par ailleurs, s'il semble que les gènes de tRNAAsn et
de tRNAHis aient été impliqués lors du transfert d'une des copies de la répétition
inversée, il est difficile d'associer ce transfert à celui qui concerne le gène de tRNAPhe,
car il ne s'agit pas de la m~me région du DNA chloroplastique. On peut par conséquent
.
,
.
supposer que plusieurs transferts de séquences choloroplastiques ont eu lieu à des
époques différentes dans la mitochondrie du maïs au cours de l'évolution. Cette
hypothèse a par ailleurs été confirmée
par l'analyse des différentes insertions
chloroplastiques dans le DNA mitochondrial chez plusieurs crucifères (NUGENT et
PALMER,1988).
-'- Comparaison entre les gènes de tRNAAsnCGUU) mitochondriaux et
chloroplasriques d'une part et nucléaires d'autre part ~
Les analyses précédentes ont montré que, d'un côté les tRNAAsn(GUU)
et les gènes de tRNAAsn(GUU) de la mitochondrie et du chloroplaste ont une origine
commune, et de l'autre côté que ces gènes de tRNA sont très homologues aux gènes
correspondants du noyau de pétunia et du lupin. Nous avons été tentés comparer les
environnements nucléotidiques de ces gènes de tRNAAsn(GUU) dans les trois
compartiments et d'établir des relations permettant de déterminer la chronologie des
transferts à partir du gène original. Pour cela, nous avons comparé les séquences
flanquantes du gène de tRNAAsn(GUU) du noyau de pétunia aux régions entourant les
gènes mitochondriaux et chloroplastiques. Les résultats globaux des comparaisons de
séquences sont consignés sur la figure 17 et montrent que:
- En amont et en aval du gène, on retrouve de très fortes homologies
entre les séquences nucléaires, mitochondriales et chloroplastiques. Il est remarquable

---

48
-'.
qu'en amont du gène, les séquences issues des trois compartiments conservent à peu près
les mêmes blocs de séquences et dans le même ordre. Ces blocs sont mis en évidence
sur la figure 17. Devant le gène nucléaire aussi, le bloc contenant la séquence consensus
est conservé mais cette séquence ressemble plus à la séquence consensus des gènes
mitochondriaux du blé et du maïs qu'à celui du gène mitochondrial
du lupin et
chloroplastique de maïs.
Au vu des observations faites plus haut, il apparait que tous les gènes de
tRNAAsn(GUU) cités dans ce travail dérivent probablement du même ancêtre. Chez les
dicotylédones, il est difficile avec les données dont on dispose, d'établir avec certitude le
compartiment d'origine de cet ancêtre mais il semble toutefois que le chloroplaste ait joué
un rôle central dans le processus du transfert du gène d'un compartiment à l'autre. En
effet, deux alternatives plausibles peuvent être envisagées: soit, le gène est à l'origine
nucléaire et dans ce cas le premier transfert aurait impliqué le noyau et le chloroplaste,
soit le gène est chloroplastique au départ et dans ces conditions, il y aurait eu deux
événements distincts ayant entraîné l'insertion du gène d'une part dans le noyau et d'autre
part dans la mitochondrie. En effet, on peut admettre que le gène n'est pas mitochondrial
à l'origine puisque nous avons des données suggérant que le ,tRNAAsn(GUU) a été
transféré du chloroplaste vers la mitochondrie.du maïs. En se référant aux homologies
trouvées entre les gènes de tRNAAsn(GUU) de la mitochondrie du lupin et du
chloroplaste du maïs, on peut dire que ce gène a aussi été transféré du chloroplaste vers la
mitochondrie chez les dicotylédones. On peut alors penser que c'est le même évènement
qui a entrainé l'insertion du gène chloroplastique dans la mitochondrie d'un organisme
qui serait l'ancêtre commun des monocotylédones et des dicotylédones. 11 faut rappeler à
cet effet que les séquences environnantes du gène mitochondrial du lupin sont plus
homologues aux régions flanquantes du gène chloroplastique du maïs que celle du gène
mitochondrial du maïs.
Le fait que toutes les plantes supérieures ne semblent pas avoir le même
gène de tRNAAsn(GUU) dans leur noyau (comme le maïs) alors que tous les gènes
mitochondriaux sont identiques, indique que:
- le transfert du gène du noyau au chloroplaste ou du chloroplaste au
noyau n'a probablement pas été un phénomène général a toutes les plantes supérieures. Il
est peut être limité aux dicotylédones ou seulement au lupin et pétunia. Ces indications
impliquent par conséquent que les deux types de transferts (chloroplaste-noyau et
chloroplaste-mitochondrie) se sont déroulés indépendamment l'un de l'autre.
- le gène nucléaire provient très probablement du chloroplaste. En effet,
si c'etait le gène de tRNAAsn(GUU) nucléaire qui avait été transféré, on devrait trouver
ce même gène (au moins homologue à 90%) dans le noyau de toutes les plantes
supérieures. Le cas du maïs prouve le contraire.
L

---

49
Par ailleurs, puisque:
a) les tRNA mitochondriaux totaux s'hybrident au fragment de 400pb
EcoRI-HindII comportant le gène de tRNA Aso(GUU) et que nous n'y avons identifié
que ce gène,
b) nos préparations de tRNA mitochondriaux ne sont pas contaminés
par des tRNA chloroplastiques (chapitre II-II),
c) l'oligonucléotide de synthèse complémentaire au gène mitochondrial
ne s'hybride pas au DNA nucléaire, .
on peut affIrmer que le gène de tRNA étudié dans ce travail est transcrit.
De même, BAWNIK et coll. (1983) et DORMANN et coll., (1986) ont montré que les
gènes de tRNAAso(GUU) sont transcrits respectivement, dans le noyau de pétunia et
dans le chloroplaste du maïs. Les gènes de tRNAAso(GUU) des trois companiments
cellulaires chez le pétunia sont par conséquent homologues et fonctionnels.
Les travaux de Tllv1MIS & SCOTI (1983) avaient déja mis en évidence
la présence de séquences chloroplastiques dans le DNA nucléaire de l'épinard mais ces
études n'avaient pas permis, ni d'établir le sens dans lequel les évènements se sont
déroulés, ni de démontrer que ces séquences pourraient avoir des rôles au point de vue
fonctionnel. L'exemple du gène de tRNAAso(GUU) est le premier montrant l'existence,
dans les trois compartiments cellulaire de certaines plantes, de séquences de DNA
fonctionnelles ayant une origine commune "récente",

---

50
C. ETUDE DES GENES DE tRNA DU COSMIDE N7F3
1. PRESENTATION DU COSMIDE
Le cosmide N7F3 (cf fig A-a) contient une insenion de DNA mitochondrial
d'environ 40 kb issu de la souche de maïs normal B37 (B37-N). Cette insertion contient
la totalité d'une des copies de la répétition inversée de 14 kb. Elle est située sur le cercle
maître entre les positions 85 et 130 (fig.20). Des études préalables faites sur le cosmide
N7F3 ont montré qu'il s'hybride aux tRNA totaux rnitochondriaux et aux tRNA totaux
chloroplastiques de maïs. De plus, cinq oligonucléotides de synthèse, dont chacun est
complémentaire à un gène caractérisé et déjà publié dans la littérature, s'hybrident à ce
cosmide. li s'agit des oligonucléotides complémentaires aux gènes de tRNAmMet1 et de
tRNAAsp du maïs (PARKS et coll., 1984; PARKS et coll., 1985), de tRNAGlu de soja
(WINTZ et coll., 1987), de tRNAPro du blé (RUNEBERG-ROOS et coll., 1987) et de
tRNAAsn décrit dans le paragraphe précédent. Ces gènes sont répétés sur le cercle maître
car ils font panie de la répétition inversée de 14 kb (l4-A). Outre le gène de tRNAAsn (ce
travail), les gènes de tRNAAsP et de tRNAmMet1 de la mitochondrie du maïs ont déja été
séquencés. Ces derniers sont situés sur un fragment EcoRI de 4kb dont la séquence
nucléotidique a été établie par PARKS (1985) et ce fragment ne contient que ces deux
gènes.
Nous nous sommes intéressés au cosmide N7F3 pour plusieurs raisons:
1°) Notre objectif étant dans un premier temps de caractériser l'ensemble des
gènes de tRNA fonctionnels de la mitochondrie du maïs, il nous a paru indispensable de
déterminer la séquence nucléotidique des fragments de DNA qui s'hybrident
aux
oligonucléotides de synthèse car l'hybridation de ces derniers sur des fragments de DNA
ne saurait être la preuve que les séquences correspondantes comportent des gènes entiers
et fonctionnels de tRNA.
2°) En plus de la séquence de la région codante des gènes, il est important d'avoir
la séquence des régions flanquantes de ces gènes. En effet, ces données peuvent être,
utiles d'une part pour la recherche d'éventuelles séquences consensus pouvant être
impliquées dans l'initiation de la transcription de ces gènes, et d'autre pan pour étudier
les réarrangements que pouraient subir ces régions.
3°) Enfin, il s'agit dans notre étude, de s'assurer du nombre exact de gènes de
tRNA codés par cette partie du génome mitochoridrial.

---

51
80
100
120
1
1
1
- .......
..--------Cosmide N7F3------I.~·- -
14Kb I.A.
Smal
9.7
Xhol
BamHI
22
Lys
tRNA
tRNATyr
... ...
... ...
... ...
... ...
... ...
... ...
...
... ...
tRNAPro
..
1
1
1
Sa
Hd Sa
...
..
FIGURE 20 : Localisation et stratégie de séquençage des gènes de
tRNA du 'fragment BamHI de 3,5kb
B: BamHI; Hd: Hindll; Sa: Sacl; St: Stl1l; x: Xhol; Xb: Xbal
Séquence répétée ailleurs dans le génôme N
Les grandes flèches réprésentent la stratégie de séquençage et les petites flèches, le sens de
transcription des gènes. Les tailles sont indiquées en kb. Les chiffres inscrits au dessus de
la ligne supérieure indiquent la position sur le cercle maître. 14 kb tR.: répétition inversée
de 14 kb A
2. ANALYSE DU COSMIDE N7F3 ET IDENTIFICATION DES
FRAGMENTS COMPORTANT DES GENES DE tRNA
Nous disposons des cartographies complètes BamID (FAURON et HAVLIK,
1988), SmaI (LONS DALE et coll., 1984), et partielles XbaI, EcoRI (PARKS et coll.,
1985) de la région du DNA mitochondrial couverte par le cosmide N7F3. L'hybridation
des tRNA totaux mitochondriaux avec les fragments BamHI du cosmide N7F3 révèle (cf
chap.ll-II fig.3-a, piste nOS) trois bandes (16 kb, 4 kb et 3,5 kb).
Le fragment BamHI de 16 kb comporte le vecteur (PHC79) et les deux extrémités
de l'insertion correspondant d'une part, à la région du DNA mitochondrial codant pour

---

52
les gènes de tRNALys et de tRNATyr et d'autre part, à celle codant pour le gène de
tRNAAsn (fig.20).
En comparant les cartes Smal, Xbal et EcoRl à la carte BamHl de la région
contenant l'insert du cosmide N7F3, nous avons pu déduire que le fragment de 4 kb
BarnHl qui s'hybride aux tRNA totaux, chevauche presque totalement le fragment de 4
kb EcoRl comportant les gènes de tRNAAsp et de tRNAmMetl décrits par PARKS. Nous
avons hybridé avec la sonde de tRNA totaux, les fragments de restriction correspondant
aux régions qui ne se recouvrent pas entre ces deux fragments de 4 kb . Aucun de ces
fragments ne comporte des genes de tRNA. Ainsi, le fragment de 4 kb BamHI ne
comporte-t-il que les gènes de tRNAmMetl et de tRNAASP.
La bande à 3,5 kb contient en réalité deux fragments BamID. Le cosmide contient
en effet deux fragments BamHl de 3,5 kb (fig.20 ) qui contiennent tous les deux des
gènes de tRNA. La région contenant un des deux fragments sera caractérisée dans le
chapitre II.I.E et comporte le gène de tRNAmMe~ (cosmide 8-3B2). L'autre fragment
correspond à la région qui s'hybride aux oligonucléotides complémentaires aux gènes de
tRNAGlu du soja (WINTZ et coll., 1987) et de tRNAPro du blé (RUNEBERG-ROOS et
coll., 1987). Nous avons entrepris de cloner ce dernier fragment dans le but, de
caractériser les gènes correspondant aux oligonucléotides précités et de voir si ce
fragment contient d'autres gènes de tRNA.
3. SOUS-CLONAGE DU FRAGMENT BarnHI 3,5 kb DU COSMIDE
N7F3
Nous avons effectué le sous-clonage de l'ensemble des fragments BamHl du
cosmide N7F3 dans le vecteur M l3mp 19. La banque de phages recombinants a été
criblée en utilisant comme sonde la bande de 3,5 kb isolée du gel d'agarose et marquée.
Cinq clones positifs ont été obtenus. Les DNA plasmidiques extraits des bactéries de ces
clones ont été digérés par BamHl et les fragments de restriction ont été séparés par
électrophorèse sur gel d'agarose pour vérifier qu'ils contiennent bien le fragment BamHI
de 3,5 kb. Cependant, (comme on l'a signalé plus haut) puisque la bande à 3,5 kb de la
digestion BamHI du cosmide N7F3 contient deux fragments distincts, la sonde qu'on a
utilisée révèle donc deux types de clones correspondant chacun à un des deux fragments
BamHI de 3,5 kb . Par cartographie, on sait que le fragment de 3,5 kb qui comporte le
gène de tRNAmMet contient un site SmaI situé à 750 pb de l'un des sites BarnHI
(fig.20). Nous avons par conséquent utilisé la présence ou l'absence de ce site pour
différencier les clones contenant un fragment de 3,5 kb. Ainsi, deux clones ont été
sélectionnés parce qu'ils ne contenaient pas le site Smal décrit plus haut.

---

()
C13
0
C13
.D
L
C13
0
0
C13
Cf)
X
X
.D
L
L
E
~
~
~
:::::
x
x
x
Cf)
Q)
"0
"0
"0
"0
~
:::::
' -
:::::
L
()
()
()
~ ~
0
C
C
C
C
( )
l
l
C13
C13
C13
.D
.D
r:.
kb
w
:r:
:r:
Cf)
Cf)
Cf)
X
X
X
::l
2
1.6-
0.5
a)
()
~
0
C13
.D
L
C13
0
0
C13
Cf)
X
X
.D
L
L
E
.E2
:::::
:::::
:::::
x
x
x
Cf)
Q)
:::::
:::::
~
:::::
"0
"0
"0
"0
L
~
c
C
c
c
()
()
()
C13
0
( )
l
l
C13
C13
C13
.D
.D
L
W
:r:
:r:
Cf)
Cf)
Cf)
x
x
x
•
•.- -- • •
•
•
••
•
..
•
b)
FIGURE 21 :
Analyse du fragment BamHI de 3.5 kb du cosmide N7F3
a) Electrophorèse sur gel d'agarose 1.5% des fragments de restriction
b) Hybridation des fragments de restriction avec une sonde de tRNA
mitochondriaux totaux

---

53
4. CARTOGRAPHIE DU FRAGMENT BarnHI 3.5 kb
ET
IDENTIFICATION DES REGIONS CODANT POUR DES GENES
DEtRNA
Le clone contenant le fragment BamHl de 3.5 kb a été baptisé "3.5B ". Une
cartographie du clone 3.5B utilisant plusieurs enzymes de restriction a été établie
(fig.20). Les enzymes utilisés pour cette cartographie ont servi pour le fractionner et les
fragments de restriction résultants ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose
(fig.21-a) avant d'être transférés sur une membrane de nylon. Ces fragments de
restriction ainsi fixés sur la membrane ont été hybridés avec la sonde de tRNA totaux
mitochondriaux. Les résultats de cette hybridation montrent (fig.21-b) qu'un fragment
SacI-HindI! de 1,25kb et un autre, BamHI-Xhol de 750 pb, codent pour des gènes de
tRNA. Le dernier fragment cité est situé à l'une des extrémités du fragment de 3,5 B
alors que le premier est interne à ce fragment (fig.20).
En utilisant le fragment 3,5 B dans l'orientation adéquate, nous avons établi la
séquence nucléotidique du fragment de 750 pb BamHl-Xhol sur 600 pb (jusqu'au site
Stul montré sur la figure 20) et nous y avons identifié un gène de tRNAGlu(UUC). Ce
gène est identique à cel ui de la mitochondrie de soja (WINTZ et coll., 1987).
Par ailleurs, l'hybridation de l'oligonucléotide complémentaire à la partie 3' du
gène de tRNAPro (UGG) de la mitochondrie du blé (RUNEBERG-ROOS et coll., 1987),
avec les fragments de restriction du clone 3,5 B a montré que le gène correspondant du
maïs est situé sur le fragment Sad-HindI! 1,25 kb cité plus haut. Nous nous sommes
servi de cet oligonucléotide pour déterminer la séquence de la partie S' du gène et de la
région en amont. A l'aide de cette séquence, nous avons synthétisé un nouvel
oligonucléotide complémentaire cette fois-ci à la séquence en amont du gène. Cet
oligonucléotide nous a permis d'établir la séquence nucléotidique de la région en aval du
gène de tRNAPrO(UGG) (fig.20).
5. ANALYSE DES GENES DE tRNA PRESENTS SUR LE
FRAGMENT 3.5 kb BarnHI
a) Etude du gène de tRNAQluCUUC)
a) Analyse de la partie codante du gène
La structure secondaire en feuille de trèfle déduite de la séquence
nucléotidique du gène de tRNAGlu(UUC) codé par le fragment de 750 pb Barn Hl-Xho l
est représenté sur la figure 22. Ce gène est long de 72 pb. Il se caractérise par la présence
dans le bras de l'anticodon, d'un appariement U30*U40. Cette caractéristique retrouvée
dans le gène de tRNAGlU(UUC) de la mitochondrie de soja, est absente dans les

---

, ..... ''!~!'' h
A .... G (soja)
G-U
U-A
C - G 70
A (blé)
C - G
~
C - G
60
'\\
U-A
UA
U GA
10
J-J-AUGCCCU
G
CCUG C
1
1
1
1 1
G
G
1
I l
1
ACGGG U
C
GGA C A
A C'so
U
U
U A
U - ft:. GA
20
C-G
G-C
30 U· U 40
C-G
U
U
U
A
U U C
FIGURE 22 : Structure secondaire en feuille de trèfle
déduite de la séquence du gène trnE du maïs
L'appariement U30-U40 est désigné par une étoile.
La düférence avec les gènes unE des mitochondries du blé et
du soja sont indiquées par une flèche.

---

54
tRNAGlu(UUC) des bactéries, des mitochondries des champignons et des animaux, et du
chloroplaste des plantes supérieures. En outre, le nucléotide 9, qui est en principe semi-
invariant et généralement une purine est remplacé par un C. Cette dernière caractéristique
n'est pas particulière au tRNA décrit ici, car le gène de tRNAGlu(UUC) de la
mitochondrie du soja et le tRNAGlu(UUC) d'E.coli ont un C à cette position.
Un appariement de faible énergie, est présent sur la molécule à la position
GI-Un, et le gène ne code pas pour la séquence CCA 3' terminale.
Comparé aux gènes de tRNAGIU(UUC) décrits dans la littérature
(SPRINZL et coll., 1989) le gène de tRNAGlu(UUC) de la mitochondrie du maïs montre
une homologie de 99% avec le gène de tRNAGlu(UUC) de la mitochondrie du soja. En
fait, la seule différence entre les deux gènes est due à la transition du A73 (maïs) en un
G73 (soja).
Ce gène de tRNAGlU(UUC) a 73% d'homologie avec le tRNAGlu(UUC)
d'E.coli et 70% d'homologie avec le gène de tRNAGlU(UUC) de la mitochondrie de la
levure. Il est plus proche de ces derniers que de ses homologues chloroplastiques des
plantes supérieures (65-66%).
13) Analyse des régions flanquantes du gène
Nous avons comparé les séquences entourant les gènes de tRNAGlu(UUC)
de la mitochondrie du maïs (ce travail), du soja (WINTZ et coll., 1987) et du blé
(GUALBERTO et coll., 1989). Ces analyses (fig.23) montrent que:
- en amont des gènes du soja et du maïs, on observe plus de 95%
d'homologies sur 120pb. Les différences sont dues à des délétions et/ou insertions
impliquant au maximum 4 nucléotides, et à des substitutions de bases. L'homologie que
l'on a observée continue jusqu'à la fm de la séquence publiée par WINTZ (1987). Il est à
noter qu'en amont du gène de tRNAGlu du soja il y a une séquence s' AAGAATGG 3'
conforme à la séquence consensus de JOYCE, qui est située à 7 pb du début du gène
(fig.23). Dans la mitochondrie du maïs, un nucléotide de cette séquence a subit une
transversion, donnant une séquence s' AAGAATTG 3' qui dévie quelque peu de la
séquence consensus. Cependant, 53 pb en amont du gène du maïs, il y a une séquence s'
AAGAAAAG 3' conforme au consensus. En amont du gène de soja, la même région
présente une séquence S'AACAAAAC 3' qui, elle, n'est pas conforme à la séquence
consensus.
L'homologie entre ces deux gènes et le gène mitochondrial du blé s'arrête
83 pb en amont de la séquence codante. Une délétion de 10 nucléotides (par rapport au
maïs) ou 5 nucléotides (par rapport au soja) intervient 36 nucléotides avant le gène. Le
gène du blé a la même séquence consensus que son homologue du maïs.
- en aval des trois gènes, l'homologie s'arrête après seulement 19 pb.

---

FIGURE 23:
Analyse et comparaison des séquences flanquantes des
gènes tmE mitochondriaux du maïs, du blé et du soja.
o
MAIS
CGTATGGGCT GGAGTCAAAG GAGCTTTCAT AGACATAGAA ATGATAATAG
MAIS
AAAGAGCAGG CCTGCGAGCA GCGAGTGCCC TTTGTAAGTT GCGAGCCTGC
MAIS
CTGTCAAACC ATAGCGCCTT ACCGCCCCCC CTTTCTTTTT TGAATTAGAA
BLE
CTGGAGCGT TTTACCCTCG TGTCACTAGC
MAIS
AGGAAGGGAT GAAAGACAAA GAAAGAGATC AGGTTATTTA TGATCGGAGA
BLE
GCAACACGAG CCATTCAAAA AAAAGTCTTG GAACTGAAGA GAAATCCATC
MAIS
AAAGGAAGGG GCGTGGTTGA TGTGTCACTG GGAACCCGTA GGAAGGGGAG
BLE
TCTATACAAA CTCTTTATGT TCTTGATATT GATTGAGTTA CGAGAATGAA
SOJA
GAATTCACAT CAGAAATCGC CA .... GAAC ACAAACGAAA
MAIS
ACGACCGGCC TCATTCACAT CTGAAATCGC CAACATGAAC ACAAACGAAA
BLE
GAAGCGTAGC A~CCTTTTë - TcTCAA-TTCA- AGTTTCCATT -CA.ii:TAAGTGC
1
_
SOJA
TC.TTGAATT GCGTATAGAA ACAAAACGAA CCAC ..... T TCTATTCTCG
MAIS
T~G..T.ÇçzJldl.l'I _T,Ç~'tAl'aGM_~Gh.Yg\\Ç~JIdI._ ÇÇ,A,ÇI'tC1'8't l'Ç'tCl'IÇ,T,ÇI
BLE
ATCAAGTATT TCGTATAGAA AGAAAAGGAA CCAC
TTCTCT
SOJA
GAGëTGAPGT ATATGAAGAA TGGCTTTTTG GTCCCTTTCG TCCAGTGGTT
MAIS
1:'cr~1:U\\T;Gr: 'AT.Itr.G~ :rl'GO'l'!~-
'1"
BLE
TCTCTTAAGT ATATGAAAAA TAGCTTTTTG GTCCCTTTCG TCCAGAGGTT
SOJA
AGGACATCGT CTTTTCATGT CGAAGACACG GGTTCGATTC CCGTAAGGGA
MAIS
1\\GGAClITCGT' t:TT'l"I'CRI'GT "t:G~C~
BLE
AGGACATCGT CTTTTCATGT CGAAGACACG
CCGTAAGGGA
SOJA
TG.GCTACTC TTTCCCGGCC GCTTTCAGTT AGTGTTCATT GCTGAGTGAT
MAIS
TA .. TTACTT CATCCTGGCC TTCAAATCGT TGGTGCTGAT TATCATATAA
BLE
JAG.TAëTT-ATTCëcGGëc-qGCGGTATCA AGAACCCGGA TAGTCAGTAG
1
549
SOJA
u::GC:r.AT_O'.GGO'.G~ l:tAGGTGGTCC GGAAGCTT
MAIS
TGTCCTTGCT TTGGAGTGAA GAAAAGAAGT TCGATCAG
Les région codantes des gènes sont encadrées en traits pleins. L'extension
des homologies entre les séquences flanquantes est indiquée par des boites
~en pointillé. Les séquences soulignées désignent' la séquence consensus
5'AAGAANRR 3'

---

55
b) Etude du gène de tRNAE!:QCUGG)
a) Analyse de la région codante du gène
Le gène de tRNAPro(UGG) de la mitochondrie du maïs (voir fig.26) est
entièrement homologue au gène de tRNAPro(UGG) de la mitochondrie du blé et au
tRNAPrO(UGG) de la mitochondrie du haricot. Toutes les caractéristiques de ce gène,
qui semble être très conservé dans les mitochondries des plantes supérieures, ont été
décrits par RUNEBERG-ROOS et coll. (1987).
f3) Analyse des régionsflanquantes du gène
Cette partie du travail sera traitée dans le chapitre suivant en comparaison
avec les régions flanquantes d'un gène de tRNAPro incomplet localisé dans une autre
région du cercle maître
i.

---

56
D. ETUDE DU PSEUDO-GENE DE tRNAEm DU COSMIDE N7B7
1. PRESENTATION DU COSMIDE
Le cosmide N7B7 (cf figA-a) contient une insertion de DNA mitochondrial de
maïs B37-N (FAURON et HAVLIK, 1988) mesurant environ 35 k!J. Cette insertion est
localisée sur le cercle maître entre les coordonnées 205 et 250 (fig.24). Elle précède la
région contenant une des copies de la répétition directe de 5 kb . Notre intérêt s'est porté
sur ce cosmide parce que son insert s'hybride aux tRNA totaux extraits de la
mitochondrie du maïs.
210
230
250
. - - - - - - + 1 - - - - - - - 1 1 - - - - - - - - - + 1 - - -
.. - -4et--------Cosmide N 7 B 7 - - - - - - . - -
1.8
0.4
Smal
Xhol
BamHI
11.9
--~-L.-,;".,;,.:.----L..~---:~---:.~~~----7-L.Y------J"P--.Lf_I_----I...-----..J....;".......I...--
#
# # , .
5
# #
# ..
#
#
#
# ..
#
#
#
#
#
#
#
pseucfb
tRNAPro
100pb
l'~
...
FIGURE 24:
Localisation et straté~e de sé<.Iuença~e du fra~ment BamHI de
1.25kb
Les grandes flèches réprésentenlla stratégie de séquençage et la petite flèche désigne l'orientation
du pseudo gène de tRNAPro. Les tailles des fragments sont indiquées en kb. Les chiffres inscrits
au dessus de la ligne supérieure indiquenlla position sur le cercle maître.
.
2. ANALYSE DU COSMIDE ET DETERMINATION DU FRAGMENT
PORTANT UN GENE DE
tRNA
Nous disposons de la carte SmaI, XhoI (LONSDALE et coll., 1984) et BamHI
(FAURON et HAVLIK, 1989) de la région contenant l'insertion du cosmide N7B7.
L'hybridation des fragments BamHI du cosmide N7B7 avec les tRNA totaux

---

57
mitochondriaux a révélé qu'un fragment de 1,25 kb comporte au moins un gène de
tRNA. Nous avons constitué une banque des fragments BamHI du cosmide N7B7 dans
le vecteur M13 mp19. Le fragment BarnHI de 1,25 kb a été sélectionné par la méthode
décrite dans le chapitre 1 .
Nous avons aussi sélectionné des clones ayant le fragment inséré dans les deux
orientations opposées par la métllode d'analyse directe des phages (chapitre!).
3. DÉTERMINATION DE LA SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE DU
FRAGMENT BamHI 1,25 kb
ET IDENTIFICATION D'UN GENE
INCOMPLET DE tRNAPro
Le fragment Bam:m de 1,25 kb a été sous cloné par la méthode de délétion
séquentielle (cyclone) utilisant la T4 DNA polymérase. La stratégie de détennination de la
séquence nucléotidique du fragment BamHI de 1,25 kb est montrée sur la figure 24.
Nous avons trouvé sur ce fragment un gène de tRNA spécifique de la proline mais qui est
amputé de la boucle du dihydro-U, d'une panie constituant le bras dihydro-U et de la
partie 5' du gène (fig.25 et fig ..26).
4. LE DNA MITOCHONDRIAL DU MAIS A T-IL PERDU LA PARTIE
5' DU DEUXIEME GENE DE tRNAPro ?
Dans le blé, le cercle maître déduit de la cano graphie du DNA mitochondrial
comporte deux gènes de tRNAPro (JOYCE et coll., 1988-c). Ces deux gènes ont des
environnements différents mais leurs parties codantes sont totalement conservées. Il
n'est pas surprenant par conséquent que l'on retrouve un deuxième gène de tRNAPro
dans la mitochondrie du maïs qui est évolutivement proche du blé. En fait, dans le maïs,
il y a trois régions codant pour des gènes de tRNAPrO : le gène complet est répété dans
les variétés fertiles de maïs B37 et WF9 car il fait partie de la répétition inversée de 14 kb
alors que le gène incomplet est présent dans une autre région (N7B7). Ces données
laissent penser que, dans le cercle maître du maïs, la partie 5' du gène de tRNAPro
incomplet pourrait exister ailleurs dans un autre environnement. Pour vérifier cette
supposition, nous avons hybridé un oligonucléotide complémentaire à la partie 5' du
gène de tRNAPro avec un filtre comportant des cosmides représentatifs du cercle maître.
Les résultats de ces expériences ont montré qu'aucune autre région à part celles contenant
les gènes complets ne s'hybride avec l'oligonucléotide. Le maïs a donc perdu la partie 5'
du deuxième gène de tRNAPro.

---

f1GURE 25: Séquence nucléolidique et org~misalion des régions COd:Ull
pour les gènes U11P comp!ct et illlcompict Je !:.llllILCc~lcIIJric du 111~U"S
o
ProCOMP
TAACCCTACG TTCGCCTAAG ATCGAAAATG CGATGTGACA TCACTCTTCA
TTCAGTTCAG TCCATTTGCT TAACACATGC ATGTCCAAAG AGATGGCGAT
100
GATCTGTCAA ATCGAGATTG TGTGGGTGTT CAGTGGATCA AACCCTGTAT
Tx
~~;~~TC~~
~CCCTT~
GGCGAGCTGC TGGCGTGGGA CTTCTTTCGC
.
200
IGGAGTCTAAA TCCTTCCGGA GTGAGTGTTTCGAT7CCACT CTCAGAAC4A
D
250
TCAAGTCATT efGAAAGAAA ATGCAAGTGA AACGAGlfGA GAATCAAATA
E
.~
300
AAATTGTAGG CTT~TTCCTAAAAGCGGTG GTTCTFGCCT CCCTGTGCCG
" ~
F
350
---'- .- - - - - - - - - - - - - - ,
CGGGGTGGGC GACTGc#GTT CGAGTCTTTTTCGATCGGGT AGATCCATAC 1
18
400
1
l'ROINC
GGATCCATCC CTCCAGGGGG TCAGCGCATC
l'roCOMP
CATATGTTCCGGGGGGGAGA CGAGGTGTAGCGCAGTCTGG TCAGCGCATC
450
TGTTTTGGGT ACAGAGGGCC ATAGGTTCGA ATCCTGTCAC CTTGATGTGG
TGTTTTGGGT ACAGAGGGCC ATAGGTTCGA 'ATCCTGTCAC CTTGATGTGG
500
TATTCACAGG GGCCGAAGTT GCAAAGCCCC GTAGCCTATC CGTGGTCGGG
TATTCACAGG GGCCGCCGTT GCAAAGCCCC'GTAGCCTATC CGTGGTCGGG
--------~-------~-----------------------
550
AAGGCAGGCG AAAAGCACGC ACCAAAAAAA AAGAAAGCTA TAATTTTCTT
----------------------------------------
ËG:9~-cr~~~~~C~~_A~~_~~~~~~~:~.:~~!!
600
!T_T:n:'C_T!!T_ f!TS!!T..: §! AGTACACGAG TGAAATIGGT TACGGTGGTA
TTTTTCTTTT CTICTTTCGT GTTTCAAACC CATTATCAGG CTTTTGCTTT
La description des séquences encadrées est donnée dans le lCxte. Les séquences soulignées indiquent la région codante du
gène troP et l'extension de l'homologie entre les séquences en aval des gènes complet et incomplet tmP est montrée par
des lignes en pointillés. proComp et prolnc désignent les séquences contenant respectivement les gènes complet et
incomplet de troP. Le nucléotide du tRNA au niveau duquel s'arrête l'homologie entre les deux séquences est montré (18).
La séquence rappelant le consensus AAGAANRR est soulignée en gras dans le bloc D

---

A
C -G
G-U
A _ U
70
G -C
G -
C
U -A
60
U
G-C
U
A
G
C
A
A
10
U
U
G
U
C
C
A
C
G
C
G
U
G
1
1
1
.-
1 1
1
1
A
U
A
G
G
G
G
C
G
C
C
C
50
U
A
C
U
G
A
C
U-A
G
G
U
G
C _ G
20
U_A
30
G_C
40
U-A
U
U
U
G
U
G
G
FIGURE 26 : Structure secondaire déduite de la séquence nucléotidique
du gène trnP de la mitochondrie du maïs.
La flèche indique la limite de l'homologie entre les gènes trnP complet et incomplet

---

58
S. ANALYSE DES REGIONS FLANQUANTES DU GENE DE
tRNAPro(UGA) ET DU GENE INCOMPLET DE tRNAPro
a) Comparaison entre les régions flanquantes des deux gènes du maïs
L'alignement des séquences des gènes complet et incomplet de
tRNAPro(UGA) a montré que l'homologie entre les deux séquences s'arrête en 5' au
niveau du nucléotide 18 du tRNA codé par le gène complet (fig.25 et fig.26). En amont
du nucléotide 18, on ne retrouve plus aucune homologie entre les deux séquences
jusqu'à la fin du clone 1,25 kb BamHI qui contient le gène incomplet. Par contre, en
plus de la partie 3' de la région codante, l'homologie entre les deux régions en aval du
gène continue sur 120 pb. Elle s'arrête après une séquence riche en résidus T.
b) Comparaison entre les régions flanquantes des gènes de tRNAfu2(UGA) du
blé et du maïs
Comme on l'a indiqué plus haut, le cercle maître du DNA mitochondrial de blé
comporte deux gènes de tRNAPro(UGA) identiques qui sont cependant dans des
environnements différents. L'organisation des régions flanquantes des deux gènes qui a
été décrite par JOYCE et coll., (l988-c) est représentée sur la figure 27 -a . Pour
peImettre une meilleure compréhension, nous appellerons HP-1 la région du DNA de blé
codant pour le tRNAfMet, un des gènes de tRNAPro(UGA), les gènes rrn18 et rrnS
(fig.27a). L'autre région s'appellera HP-2, (nous utilisons en fait la nomenclature de
JOYCE). En comparant les séquences entourant les deux gènes du blé, JOYCE avait
remarqué que malgré la divergence des séquences, on pouvait retrouver (entre HP-1 et
HP-2) des blocs d'homologies situés à des distances variées. Il avait alors désigné ces
blocs par les lettres D, E et F. Les positions de ces blocs sont indiquées sur la figure 27-
a. Outre ces blocs, il a identifié des séquences baptisées "T éléments" qui peuvent
adopter une structure secondaire en feuille de trèfle rappellant la snucture des tRNA. Ces
"T éléments" sont appelés Tl, T2, T3 ... etc. (fig.27-a). Ils se ressemblent tous mais
sont différents à des degrés divers et sont présents sur HP-1 et HP-2. De plus, JOYCE a
mis en évidence le caractère très recombinogène de la région HP-2 en y identifiant des
.
.
séquences homologues à des séquences contenues dans les gènes rrn26 et atp6 (fig.27-
a).
Nous avons comparé la séquence des régions entourant les gènes de tRNAPro
de la mitochondrie du maïs avec les séquences des régions HP-l et HP-2. Les résultats
de ces comparaisons sont représentés sur la figure 27-a. Nous avons retrouvé en amont
du gène complet du maïs, la même structure que la région HP-2 du blé. Les blocs D, E et
F sont situés aux mêmes endroits et on retrouve une région correspondant à un "T

---

.,::.}~(.
°o.:.:\\~\\:i:
FIGURE 27 -a: Réprésentation schématique de l'organisation des régions flanquantes
des gènes trnP du maïs et du blé
T5
tRNA Pro
W*M*?*W
c::=:J
atp6
rrn26
0
E
F
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
1
0
0
1
1
1 --------- HP-2(blé)
1
1
1
1
Tx
1
1
:'NPWonw
~
:
I D E
, F
1
1
1
1
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 1
0
0
I i i
1
_
3.5 B(maïs)
1
1
1
e:t::::l
trnfM
rrn18
rrn5
T1
T2
T3
0
E
1 F
:
"
1
1
nssssSSSSSSSSSS'f __ rzzJ
IlliI
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IIJI_
Cl
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1
1
HP.1(blé)
1
1
: pseudo tRNt Pro(3')
c::J
1
D E I F'
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- - ,
r -
1
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _1_ _ I _ _ --=--...r_- r
1
_ _
N7B7(maïs)
Les boites nommées atp6 et rm26 sont homologues à des séquences contenues dans les gènes atp6 et rm26
Les gènes trnfM • rml8 et rm5 et les éléments T sont réprésentés à des échelles plus réduites par rapport aux
autres séquences schématisées.

---

FIGURE 27-b: Schéma théorique des recombinaisons qui seraient à l'origine
de la structure actuelle des régions codant pour le gène tmP
de la mitochondrie du maïs
rec.!
rec.2
HP-! X HP-2
•
3.5 B
X
Autres séquences
- . N7B7
+
~
pseudo tRNAPro
tRNA Pro
Tx
(5 ')
c::::=J
&&&
c::::J
0
E
F
0
F"
Cl
0
~
i l
Eliminés du génome mitochondrial du ma'is (B37 -N)
rccl: recombinaison probable dans le maïs entre les séquences (ancêtres) de type HP-l et HP-2. Celle recombinaison
aurait engendré la structure retrouvée dans le fragment 3,5B en plus d'une autre structure qui, elle, a été éliminée par la
mitochondrie du mais.
rec2: deuxième recombinaison entre les séquences du type 3,5B avec d'autres séquences (n'ayant pas de parenté avec les
séquences impliquées dans la première recombinaison). Cette recombinaison aurait été à l'origine du gène incomplet et
s'est probablement déroulé à l'intérieur du gène. La partie 5' du gène incomplet ainsi que les régions en amont auraient
été aussi éliminés par la mitochondrie du maïs.

---

FIGURE 28: Structure secondaire en feuille de trèfle
déduite de la séquence du DNA de l'élément Tx
trouvé en amont du gène troP de la mitochondrie du
maïs
G
G - e
T - A
T
A
e
G
T
A
G - e
G
G
G
G
TI/
T
G
A
G - T
T
T
e
A
e
G
e
e T e A e
A
e
T
A
A
T
e
G
G
G
A
T
1 1
A
G
T
G
G
T
e
e
e
e e
e
T
G
T
T
e
®
T
T
e
T
G
T •
(D(Ç)
G
T
A
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e
G
e
T • CD
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G
---A-
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G - e
G e TG
A
T
G
--G
G
G_ e
t
A -
T
e
e
A
T
A
e
A
T
t
G
Les flèches désignent les nucléotides substilués par rapport au T5 du blé.
Les cercles indiquent les nucléotides absenLS du T5 alors que les séquences
absentes du maïs mais présentes sur le T5 du blé sont représentés par des
accolades

---

59
élément". La structure secondaire de ce "T élément" désigné par Tx est représentée sur la
figure 28. Il a les mêmes caractéristiques que TS identifié sur HP-2 mais en diffère par
des particularités qui sont montrées sur la figure 28. L'homologie entre HP-2 et la région
du DNA du maïs en amont du gène complet de tRNAPro s'arrête immédiatement après la
séquence Tx et on n'y observe donc pas les homologies avec les gènes rrn26 et atp6.
L'analyse des régions en aval du gène a montré qu'au lieu de retrouver des homologies
entre la région en aval des gènes (complet et incomplet) du maïs avec celle de HP-2, on
en retrouve plutôt avec HP-1 (fig.27-a). Le gène complet du maïs comporte donc en
amont des régions homologues à HP-2 et en aval, des régions homologues à HP-l.
Toutes ces observations nous amènent à tirer les conclusions suivantes:
1) Les gènes de tRNAPro du blé et du maïs dérivent sans aucun doute du même
ancêtre.
2) Dans le maïs, une recombinaison intervenue dans le bloc F entre les ancêtres
des séquences du maïs équivalents à HP-l et HP-2 a donné la structure actuelle. Le
schéma de cette recombinaison est montré sur la figure 27 -b. Il est probable que la
recombinaison est intervenue à l'intérie.ur du gène de tRJ.'·lAPro car la présence d'un gène
incomplet de tRNAPro dans le maïs met en évidence le caractère recombinogène de ce
gène.
3) Les blocs D, E et la séquence "T élément" ont probablement une importance
au niveau de la transcription car on les retrouve devant tous les gènes de tRNAPro, même
si leurs positions changent d'un gène à l'autre. Notons à ce sujet que dans le maïs, le
bloc D contient une séquence S'AAGAAAAT3' rappelant la séquence consensus mais
comportant un T en 3' au lieu d'une purine. Cependant, dans le blé, deux séquences
S'AAGAAAAA 3' et S'AAGAAGAA3' sont retrouvées en amont du gène de tRNAPro
codé par le fragment HP-l et ce, dans des régions différentes des blocs D et E.
,.-t.. ~.-;.---r"""'-"'---"------'---- __ - _

---

h()
E. ETUDE DES GENES DE TRNA DU COSMIDE 8-3B2
Présentation d'un article sous presse à CUITent Genetics
Le cosmide 8-3B2 contient une insertion de DNA mitochondrial de maïs de la
variété WF9-N. Cette insertion est localisée sur le cercle-maître entre les coordonnées 85
et 120 (figA-c). Nous nous sommes intéressés à ce cosmide parce que son insertion
s'hybride à la fois au tRNA totàux mitochondriaux et chloroplastiques. La cartographie
de restriction de ce cosmide a été établie et l'hybridation des différents fragments de
restriction avec les tRNA totaux mitochondriaux a montré que 3 fragments comportent des
gènes de tRNA. Ces fragments ont été sous-clonés et leur séquence nucléotidique a été
établie. Des gènes de tRNATyr, tRNALys et tRNAMet ont été identifiés respectivement sur
des fragments HindIII de 335 pb, RsaI-EcoRI de 295 pb et SstI-Sau3A de 324 pb.
Le gène de tRNALys mitochondrial qui est le premier décrit chez les plantes
supérieures a une homologie de 63 à 81 % avec des gènes de tRNALys chloroplastiques et
bactériens.
Le gène de tRNATyr de mitochondries de ma'is est identique à son homologue du
blé (JOYCE et coll., 1988-b) et il ne diffère du tRNATyr de mitochondries de haricot
(MARECHAL et coll., 1987) que de 2 nucleotides (positions 16 et 47; 1).. Le nucléotide 16
est l'~ne dés positions qui différencient les 2 isofom1es du tRNATyr mitochondrial du
haricot (MARECHAL et coll., 1987-c).
Le gène de tRNAMet a 95% d'homologie avec les gènes de tRNA
chloroplastiques. La comparaison de la région comportant ce gène avec celle comportant
son homologue chloroplastique du maïs a montré que l'homologie entre ces 2 régions est
limitée à la partie codante des 2 gènes. Ce gène qui a probablement une origine
chloroplastique provient donc d'une ancienne insertion de DNA chloroplastique dans le
génome mitochondrial du ma'is.

---

Current Genetics
© Springer- Verlag 1989
sous presse
Sequence Analysis of the tRNATyr and tRN!'lys genes and evidence for
the transcription of a chloroplast· Iike tRNAMet in maize mitochondria.
Abdourahamane SANGARE, David LONSDALE1, Jacques-Henry WEIL and
Jean-Michel GRIENENBERGER*
Institut de Biologie Moléculaire des Plantes, 12 rue du Général ZIMMER,
67084 STRASBOURG - Cedex (FRANCE)
1- Institut for Plant Research, Maris lane, TRUMPINGTON
CB2 2LQ CAMBRIDGE (UK)
*Corresponding author
KEYWORDS
Maize mitochondria, tRNA genes, transcription

---

2
SUMMARY
The nucleotide sequences of three tRNA genes and their flanking regions
fram the maize mitochondrial genome is reported. These genes are located in the
same region of the genome between the 14 kb inverted repeats. These genes which
are transcribed in the mitochondria, are coding for tRNALys (anticodon UUU)
tRNAMet(CAU) and tRNATyr (GUA). Because of its very high homology with its
chloraplast counterpart, the tRNAMet gene prabably originates fram a chloraplast
DNA insertion. The analysis of the upstream regions of these genes show that the
tRNATyr and the tRNALys genes possess the consensus sequence AAGAANRR
which could act as a pramoter sequence in higher plant mitochondria.

---

3
1NTROOUCTION
Mitochondria possess ail the components necessary to perform protein
synthesis. In higher plant mitochondria (mt) , it has been shown that the genome
encodes the 268, 188 and 58 rRNAs, sorne ribosomal proteins (Gualberto et al.,
1988) and a number of tRNAs (for a review, see Lonsdale, 1988). Except for the
rRNAs (258, 188 and 58), the genes coding for the other components of the higher
plant mitochondrial protein synthesyzing system have not been fully described. This
is particularly the case for the genes coding for the set of tRNAs which are
necessary for protein synthesis.
A number of tRNA genes have been sequenced in the maize mitochondrial
genome, namely the genes coding for tRNAHis, (Iams et al., 1985), tRNAAsp (Parks
et al., 1985), tRNAmMet and tRNAfMet (Parks et al., 1984), tRNASer and tRNACYs
(Wintz et al., 1988) and tRNATrp (Maréchal et al., 1987). It has not been proven that
ail these genes, especially not in the case of tRNAHis, tRNAAsp and tRNAmMet are
expressed in the mitochondrion into mature tRNAs which are active in protein
synthesis. Because of the complexity of the molecular organization of higher plant
mitochondrial genome which are subjected to recombination events, there are a
number of tRNA - pseudogenes which are not expressed in the mitochondria (Wintz
et al., 1988; Oron et al., 1985 ). It is therefore quite important, when describing tRNA
genes, to be sure that these genes are functional.

---

4
Some mt tRNA genes and in their flan king regions, are very similar to their
chloroplast (cp) counterparts. It has been postulated that they originate fram
chloroplast DNA insertions in the mt DNA (Iams et al., 1985). In some cases, they
are expressed from these insertions and this has been demonstrated for the maize
mt tRNATrp and tRNACys genes ( Maréchal et al.,1987; Wintz et al.,1988 ).
ln addition, the import of cytoplasmic tRNAsLeu into bean mitochondria has
been reported and it has been postulated that a number of other tRNAs could be
imported as weil (Maréchal et al.,1988). This phenomenon which also occurs in
Chlamydomonas reinhardii (Boer and Gray, 1989) and in Tetrahymena pyriformis
(Suyama et al., 1986) may be a feature common to many eukaryotes.
It is therefore of great importance to determine the total number of tRNA
genes which are encoded in the mt DNA of higher plants. The identification of ail
these mt tRNA genes will give an idea of the number and the identity of the mt tRNAs
which are coded outside the mitochondria and are imported.
Because of the diversity of the origin of the tRNAs which are involved in the
decoding of mitochondrial messenger RNAs in higher plants, the minimal number
of tRNAs which are necessary for mt pratein synthesis is not known. According to the
wobble hypothesis, this number should be 31, but in mammalian or in fungal
mitochondria, there are only 22-24 tRNAs (Heckman et al., 1980 ) and the rule of
"two out of three" should be used (Lagervist, 1978).
ln order to identify the tRNA genes which are encoded in the maize mt
genome, we have been analysing the restriction fragments of the maize
mitochondrial genome which hybridize with total mt tRNAs.
Recently, by comparison with the sequences of yeast mitochondrial
promoters, Joyce et al., (1988) detected a purine-rich sequence AAGAANRR,

---

5
which could be a consensus sequence for the promoters of wheat mt tRNA genes.
This sequence is also present upstream of the maize mt tRNATyr and tRNALys genes
described in this report and it will be interesting to see whether this consensus
sequence is also present in other higher plant mitochondria.
ln this paper, we present the nucleotide sequence of three maize mt tRNA
genes and the analysis of their flanking regions. These genes, encoding a
tRNALys, a tRNATyr and a tRNAMet , are transcribed and are therefore functional
genes.

---

6
MATERIAL AND METHODS
Total mitochondrial tRNAs have been extracted from 5-7 days old etiolated
seedlings of Zea mays (WF9-N) as previously described (Runeberg-Roos et
al.,1987). Chloroplast tRNAs were extracted as already described (Wintz et al.,
1988).
Purified mt and cp tRNAs have been specifically labeled at their 3' end with
[32P]_ Cl ATP using yeast tRNA nucleotidyl transferase (Silberklang et al., 1979).
Total RNAs of the soluble fraction were labeled at their 3' end with [32p]_pCp using
T4-RNA Iigase as described by Bruce and Uhlenbeck (1978).
Cosmid and plasmid DNAs were prepared by the alkaline Iysis method
(Birnboin and Doly, 1979). DNA was digested with restriction enzymes using the
conditions specified by the manufacturer, analysed by agarose gel electrophoresis
and blotted onto nylon membranes as described (Maniatis et al., 1982).
Hybridization procedures were as described (Wintz et al., 1988).
DNA sequencing has been carried by the dideoxynucleotide chain
termination method (Sanger et al., 1977) using M13 single stranded DNA as
template. The templates were obtained by subcloning the fragments of interest in
M13mp18 and M13mp19 phages and creating a set of nested deletion as described
(Dale et al. , 1985).
Nucleotide sequences were analysed using the programs obtained
from the University of Wi~consin Genetic Computer Group (Devereux et al., 1984).
Sequence comparison were done using the EMBL, Genbank and NBRF data banks
on a Digital MicroVax Il computer.

---

7
RESULT8 AND DISCUSSION
Specificity of the mt tRNA probe
ln order to localize the tRNA genes on the genome of maize mitochondria, a
complete set of cosmids covering the master circle (Lonsdale et al., 1984) was
hybridized with total mt tRNAs extracted fram sucrase-gradient purified maize
mitochondria. Because these tRNAs were obtained fram the LiCI-soluble fraction of
mt RNA, they are Iikely to be contaminated by 5S rRNA and by degradation
fragments of rRNAs and mRNAs. The tRNAs were labeled by a-[32p] ATP using the
yeast tRNA nucleotidyl transferase. This enzyme is specifie for tRNAs, in contrast to
T4 RNA ligase which can add P2P]_pCp to every 3'OH end. This is shown in Figure
1B where, by using T4 RNA ligase, it is possible to label 58 rRNA, in contrast with
the specifie labeling of tRNAs shown in Figure 1A. This specifie labeling is due to the
fact that tRNA nudeotidyl transferase recognize the tRNA structure in order to add
or to exchange the 3' terminal CCA sequence (Orozco, 1982). The specificity of this
enzyme has been confirmed, on maize mt tRNAs, because it has not been possible
to obtain any labeling, in the same conditions, using a-[32p] GTP which is not
incorporated into the CCA end of tRNAs, or [32P]pCp instead of a-[32p] ATP,
indicating that the enzymatic preparation is not contaminated by any aspecific RNA
polymerase and/or RNA ligase.

---

CD
CIl
CIl
.!?
CD
~
<
ü
z
ü
Cl:
55
+
tRNA
+1_.-..
a
b
Figure 1.
Comparison of the labeling pattern of maize mt soluble RNAs with either tRNA
specifie tRNA nueleotidyl-transferase (A) or T4 RNA Iigase (B). The labeled
RNAs were separated on a 15% polyaerylamide gel and autoradiographed.

---

8
Homologous hybridization of such specifically labeled maize mt tRNAs to a
maize mt DNA fragment containing only one tRNA gene, is the proof that this gene
is transcribed. It should be noted that this is not always the case when heterologous
hybridizations are performed, as in the case of the hybridization of mt tRNAPhe in
bean (Maréchal et al., 1985) and the corresponding tRNAPhe pseudo-gene in maize
and wheat (Gualberto et al.,1988).
That the maize mt tRNAs probe was not contamined by chloroplastic tRNA
was tested as described earlier (Wintz et al., 1988).
Location and sequence of tRNA genes on the cosmid 8-382.
. The cosmid 8-382 is located. between the t~o ,14 kb inverted repeats of the
master circle of maize mt DNA (Lonsdale et al., 1984). This cosmid which is about
40 kb long spans from map coordinates 85 to 120 as shown in Figure 2. Total
specifically labeled maize mt tRNAs have been hybridized with the DNA fragments
obtained by restriction of this cosmid with Bam HI, Eco RI, Hind III, Sma 1and Sst 1
(Figure 3). These hybridization experiments indicate that three Eco RI fragments
contained at least one tRNA gene each. These three Eco RI fragments (A,B,C) are
respectively 3.0 kb, 5.0 kb and 4.0 kb long and their positions on the map are shown
in Figure 2. When the same digests were hybridized with specifically labeled maize
cp tRNAs, one of these fragments, namely the Eco RI fragment C (4.0 kb) was
shown to contain a tRNA gene with homologies with the chloroplast tRNAs
(Figure 3).
The localization of the tRNA genes was further refined after c10ning DNA
subfragments (obtained from the Eco RI fragments A, Band C) into the M13mp19

---

1111
10
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100
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• •
•
•
B
c
Figure 2.
Restriction map of cosmid 8-3B2. The position of one of the 14 kb repeats is
indicated on the top of the figure (open box). The Eco RI fragments which
hybridize to total mt tRNAs (dotted boxes) and total mt and cp tRNAs (hatched
box) are indicated. The respective positions and orientations of the tRNA
genes (arrowhead) which are described in this paper are indicated on the
extension of these Eco RI fragments. Restriction sites are abbreviated as
follows : B = Bam HI, H =Hind III, P = Pst l, S = Sst 1. The restriction fragment
containing the gene coding for tRNAMet1 is indicated as weil as the orientation
of the gene.

---

9
vector. Each of these subclones hybridizing with mt tRNAs was entirely sequenced
and was found to contain only one tRNA gene indicating that the three tRNA genes
are expressed in the maize mitochondria. The tRNAs encoded by these three genes
can be folded into the typical clover-Ieaf secondary structure of tRNAs (Figure 4).
A tRNALys gene was found in a 295 bp Rsa 1- Eco RI subfragment of Eco RI
fragment A. A tRNATyr gene was found in a Hind III - Hae III subfragment of 335 bp
of Eco RI fragment B and a tRNAMet gene was found in a Sst 1 - Sau 3A subfragment
of 324 bp of fragment C. The location of these tRNA genes is shown in Figure 2.
The tRNALys and tRNATyr genes are coded for by the same DNA strand, whereas
the tRNAMet gene has the opposite orientation. These sequences have been
submitted to the EMBL data bank and have been respectively given the following
accession numbers : X15681 ,X15682, X15680
The tRNALys (UUU) gene
On the basis of its anticodon (UUU), the tRNA gene which is contained in
fragment A is specifie for lysine. The gene is 73 nucleotide long and the 3' terminal
CCA sequence is not coded for by the gene. This tRNALys is the only one which is
necessary to decode both codons specifying lysine (AAA and AAG) according to the
wobble hypothesis.
This is the first tRNALys gene found in higher plant mitochondrial DNA.
When compared with other tRNAsLys and tRNALys genes, the maize mt tRNALys
gene has only 35 to 60% sequence homology with the mammalian and fungal
~
mitochondrial tRNALys genes and between 63 to 81% sequence homology with

---

mttRNA
cptRNA
FIGURE 3. Hybridisation of the 3' labeled maize total mt and cp tRNAs
on a restriction digest of cosmid
8-382

---

10
bacterial and chloraplastic tRNALys genes. These levels of similarity are commonly
found between these tRNA genes and higher plant mt tRNA and tRNA genes.
The tRNA Tyr (GUA) gene
Fragment B contains a tRNATyr gene according ta its anticodon GUA.
The tRNATyr gene is 86 nucleotide long. When compared with ta the other plant mt
tRNAsTyr or tRNATyr genes, this gene is fully homologous ta the mt tRNATyr gene
which has been sequenced in wheat (Joyce et al., 1988) and therefore has the
same large 0 loop and a low energy base pairing in the D stem.
The maize mt tRNATyr gene sequence is very homologous ta the tRNATyr
sequence which has been purified 'fram bean mitochondrial (Maréchal et al.,
1985). It is therefore Iikely that this tRNATyr is also encoded in the mitochondrial
DNA in bean. There are only two differences between the bean mt tRNATyr and the
wheat and maize mt tRNATyr genes. One of them is the change of T in position 47;1
in the variable loop of bean mt tRNATyr ta a G in the maize gene. The second
difference is the change of the U (or D) into a C at position 16. This is one of the
positions which differentiate the two isoforms of bean mt tRNATyr.
On the other hand, the maize mt tRNATyr gene has only 46% of sequence
homology with the mt tRNATyr gene of Arabidopsis thaliana .This mt tRNATyr gene
(which has the same anticodon GUA) is thought ta have arisen fram a pseudogene
of tRNAPhe, following a number of DNA rearrangements (Chen et al., 1989). It has
not been established whether this gene is expressed or whether A. Thaliana
mitochondria also contains another tRNATyr gene similar ta the one identified here. It
should be noted that the same pseudogene of tRNAPhe has been found in wheat

---

A
A
G- C
G- C
G_ C 70
T-A
Rsal
~il
G- T
GTACGAGCCCCATACAGAGCCGCGCCCTTGTGATATGA§A
T - A
60
G
10
A -
T
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GGGCCAGGCCACCCTCTTTTCTTTTCCGCACCAAGCCTTCTTGTAAAATA
T
A
T
CG TCC
T
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A
150
l ' I I
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GGGTGTATAGCTCAGTTGG1'TlGAGCATIGGGCTTTTMCCTMIGGTCGC
G
A GA GC A
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G 50
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T-A
G
20
G-T
TGCGGGACAAAGACCCTAATCACATGCATCCATTTAGGTCAGAATTC
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C
A
T
A
T
T
T
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B
G-C
G-C
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G -
C 70
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A - T
T
G_C
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A_T
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G _ C
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C G T
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G A G CCG G
CTTAACTTAACTiAAGAA11$?AAC§tGGCCGCCATCCTTCTTATTCAG
l
,
l , 1
G
200
G
G
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C
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A A
G
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C
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G
C
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C -G
A
T
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20
A- T
A
T
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G G T
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1 T
C
-A
T
T
A
GCGGMGCCTAGGAGGI:::I:-CAACCGAGCGAAGCTCTTTCTTITTTTGGCC
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G TA
A
A _ T
c
C - G
SstI
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C - G 70
CCGCGGGAACTCTGGTTGCGCTTTGGTTGGCTTTCTCTTTTTTTCTATTT
T - A
100
A - T
C - G
60
TCTCTGACTTGACTCAGCTTGTlCCTACTTGACICAOCC,GTTAGAGTAICG
150
CG
10TT-ATAACCTAA
CTTTCATACÇÇÇGAGAGTCA'l'TGGTTCAMTCCAAIAGTAGGTMA.ACCG
A CTCA G
1 1 1
l I A
G
200
1 1 l I A TT G G T
C
G
GAGT A C "
T
GCCGAAACCCCCGCTTT1'GCCAGCATGACAGCAAGCACAGACTGGCATCA
A
TT
T_AG
TSO
250
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C - G
AG
AGGAGTCGAATGACCAAAGCATCGGTTGCTTCCACGAGACTAAACAATCA
G-C
300
30 C - G 40
ATGACCAAT AAAAGACCAACGAAACGACGAGTGAGAAAGATAAAGAACGC
C-G
T
C
GACGTGGTTCATTCAAGTAGAGGTTTGATC
T
A
Sau3A
CAT
Figure 4.
Nucleotide sequence of the fragments and deduced cloverleaf secondary
structures of the three maize mt tRNA genes. A : tRNALys gene ; B : tRNATyr
gene ; C tRNAMet2 gene. In the sequences. the genes are underligned. The
putative consensus sequences are boxed. On the mt tRNATyr gene secondary
structure, the two nucleotides which are different between this gene and the mt
tRNATyr of bean (Maréchal et al., 1985) are indicated.

---

1 1
and maize mitochondria and is not expressed in the two organelles (Gualberto et
al., 1988).
Ali mt tRNATyrgenes sequenced up to now have a GUA anticodon which is
is able to decode both codons of tyrosine (UAU and UAC) according to the wobble
hypothesis. In bean mitochondria the anticodon was found to be NUA, N being an
unknown modified nucleotide (it is probable that N is a modified nucleotide derived
from G).
The tRNAMet (CAU) gene
Fragment C was shown to hybridize with both total maize mt tRNAs and total
ma.ize cp tRNA. Upon sequencing, one tRNA gene was found in this fragment. When
folded (figure 4), the deduced tRNA has a CAU anticodon and the gene was then
identified as coding for a mitochondrial tRNAMet . When compared with other
tRNAsMet or tRNAMet genes, the sequence of this gene appears to be identical to
the sequence of bean mt tRNAMet (Maréchal et al., 1986) as weil as to the
sequence of the mt tRNAMet genes from soybean and A. thaliana (Wintz et
al.,1988). The maize mt tRNAMet gene displays a high level of homology (90-
95 %) with the chloroplast elongator tRNAMet genes described so far (Sprinzl et
al., 1989).
Tilis tRNAMet gene is the only gene which could be found in fragment C and
hybridization to total mt tRNAs shows that it is expressed in the maize
mitochondrion. This has not been demonstrated for the similar mt tRNAMet genes
which have been found in soybean and A. thaliana (Wintz et al., 1988)
The near complete homology of this maize mt tRNAMet with the
corresponding maize cp tRNAMet (95 %) (Steinmetz et al., 1983) and with other cp

---

Asp (Wheat)
AAGAAAAG
Lys 1
AAGAAGAA
...-53 n-----.
Lys 2
AAGAAAAG
. - 5 0 n---.
Tyr 1
AAGAATAA
. - 6 3 n---.
Tyr 2
AAGAACGA
...-57 n-----.
CONSENSUS
AAGAANRR
Figure 5.
Comparison of the putative consensus sequences found upstream of the
maize mt tRNA genes compared with the sequence described by Joyce et al..
(1988) upstream of wheat mt tRNAAsp. The distance of these sequences to the
first nucleotide of the tRNA genes is indicated.

---

12
tRNAMet genes could be explained if one assume that this tRNA originates fram a
chloraplast DNA insertion into the mitochondrial genome. To study this assumption,
we have compared the flanking regions of the three mt tRNAMet genes with their
chloraplast counterpart. Ail mt tRNAMet genes are completely homologous up to 24
nucleotides in the upstream region, in the coding region and the 17 nucleotides
downstream except for a 4 nucleotides deletion in A. thaliana . The homology with
the immediate flanking regions of the corresponding gene in cp DNA is low « 50
%). It is therefore difficult to say that this gene originated fram a cp DNA insertion.
However, in rice mitochondria, it has been shown (Moon et al., 1988) that a
fragment of cp DNA inserted into the mt genome does contain the gene of cp
tRN~Met together with rbcl, atp~, atpE and trnV. Furthermore, Nugent and Palmer
(1988) have studied the regions of the mt genome which contain fragments
homologous to the cp genome of 6 species of the crucifer family. One of these
regions consisted of a small restriction restriction fragment (Sac l, 1.6 Kb) containing
the atpE and the tRNAMet genes. This small fragment is present in ail mt genomes
studied by these authors. Considering these two exemples, it seems quite clear
that this region constitutes a "hot spot" of the cp genome for insertion into the mt
DNA. It can thus be considered that the mt tRNAMet genes fram maize, soybean and
A.thaliana were inserted into their respective mt genome fram the corresponding
cp DNA fragment and that their flan king regions have been deleted or transposed
as a result of genome rearrangements. The fact that the mt tRNAMet gene is
expressed in maize mitochondria could explain why these tRNAMet genes keep
such high sequence homology with their cp counterparts.
ln addition to the maize mt tRNAMet gene (trnM2) reported in this paper,
another tRNAMet gene (trnM1) has been sequenced in the maize mitochondrial

---

13
DNA (Parks et al., 1984). The expression of this gene has not been documented. By
hybridization with an oligonucleotide complementary to the 3' end of trnM1 , this
gene was mapped on the maize mt genome. It is present in two copies in the 14 kb
inverted repeat in a Sma 1- Bam HI restriction fragment of 2.7 kb fram ordinate
39.3 to 42 and 122 to 127.7 respectively (one of these inverted repeats is shown in
Figure 2). Specifically labeled maize total mt tRNAs hybridize to this restriction
fragment which conta.ins only this genet showing that trnM1 is also expressed in
the mitochondria. According to their anticodon and sequences, both trnM1 and
trnM2 are coding for an elongator tRNAMet. It would be interesting to understand
why such a situation exists. It has been shown in spinach chloraplast DNA that a
tRNA gene having a CAU anticodon can encode a tRNAlle, because of an unknown
modification of the C at the wobble position (Kashdan and Dudock, 1982 ). The
same phenomenon has been described in E.coli where Iysidine. a novel type of
modified cytidine (with a lysine moiety) has been found at the first nucleotide of the
anticodon of a tRNA with the anticodon LAU (Muramatsu et al.. 1988). In this tRNA,
the presence of Iysidine at the wobble nucleotide allows the tRNA to decode AUA
(isoleucine) and not AUG (methionine). The tRNAMet coded for by the trnM2 gene
which is reported in this paper has been found to accept methionine in bean
mitochondria (Maréchal et al., 1986). One can wonder whether the tRNA encoded
by trnM1 is able to accept isoleucine. Up to now, no tRNAlie gene or tRNAlle has
.
.
. .
been found in higher plant mitochondria. It would be of interest to isolate the praduct
of trnM1 in sufficient amount to see whether this tRNA has a modified anticodon
allowing it to function as a tRNAlie.

---

14
Analysis of f1anking regions.
When analysed ( Joyce et al., 1988) the upstream regions of five wheat mt
tRNA genes reveal a purine-rich motif wt1ich has som~ homology with the yeast mt
DNA promoter (Tabak et al., 1983). From these studies, it was possible ta derive a
consensus sequence AAGAANRR which is likely ta act as a promoter sequence in
higher plant mitochondria. When the upstream regions of the maize mt tRNA genes
coding for tRNATyr, tRNAMet and tRNALys were examined for such a purine-rich
motif, it was found for tRNALys and tRNATyr, as shawn in figure 4 and figure 5. Two
motifs with a perfect homology with the consensus sequence are present 53
nucleotides and 50 nucleotides upstream of the tRNALys gene and 63 and 57
nucleotides upstream of the tRNATyr gene (Figure 5). This motif was not found
upstream of the tRNAMet gene at least in the determined sequence. However, it has
been shawn that this region of the maize mt genome contains a transcribed protein
gene (unpublished results) and it is possible that the tRNAMet gene is
co-transcribed with this protein gene. In this case, the consensus sequence could
be present far away from the tRNA gene.

---

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---

61
III. ORGANISATION DES GENES DE tRNA SUR LES
CERCLE-MAITRES DES GENOMES MITOCHONDRIAUX DE
MAIS DES VARIETES B37-N ET B37-CMST
Comme nous l'avions signalé plus haut (Introduction), il existe de très
grandes différences structurales entre les génomes mitochondriaux B37-N et B37-cmsT.
Comme cela a été décrit par FAVRON et coll., (1989), ces différences peuvent être mises
en évidence par la réorganisation de la structure linéaire du cercle maître (fig.29). En
outre, le génome B37-cmsT comporte des séquences de DNA qui ne sont pas retrouvées
dans le génome B37-N et réciproquement. Ces pertes (ou gains) et ces réarrangements de
séquences pourraient être à l'origine du phénotype de stérilité mâle de type T (DEWEY et
coll., 1986).
Dans ce travail, nous avons entrepris de voir si les réarrangements génomiques
observés affectent aussi l'organisation et/ou le fonctionnement-des gènes de tRNA
mitochondriaux et si, en particulier, les deux génomes N et T contiennent les mêmes
- gènes de tRNA spécifiques des mêmes amino-acides .
.A. HYBRIDATION AVEC DES OLIGONUCLEOTIDES DE
SYNTHESE
Nous avons utilisé des oligonucléotides de synthèse qui correspondent à la séquence
de gènes de tRNA publiés dans la littérature et/ou à ceux dont les structures ont été
déterminées dans notre laboratoire. Ces oligonucléotides ayant des tailles qui varient entre
17 mer et 27 mer, les hybridations ont été faites en tenant compte de la température
optimale d'hybridation des oligonucléotides les plus courts (entre 42°C et SO°C).
Dans un premier temps, nous avons fait des hybridations avec l'ensemble des
oligonucléotides disponibles. Cette expérience avait pour but de voir si on pouvait
observer des différences entre les génomes mitochondriaux normaux B37-N et WF9-N
en ce qui concerne et la nature et la distribution des gènes de tRNA connus. Dans un
deuxième temps, nous avons utilisé individuellement chaque oligonucléotide que nous
avons hybridé avec des filtres comportant les cosmides recombinants réprésentatifs du
génome mitochondrial B37-cmsT. L'objectif de cette expérience a été de localiser les
gènes de tRNA connus sur le cercle maître du génome mitochondrial B37-cmsT.
Les résultats de ces hybridations sont résumés sur le tableau A du chapitre 11.1.

---

FIGURE 29: Comparaison des struc~ures linéarisées des cercles maîtres
des génômes mitochcndriaux B37-N et B37-cmsT
(Fauron et col.. 1989)
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....
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V
GO
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Les blocs de séquences transférés par des rccombinaisons multiples sont représentés en traits ~ras et désignés par
des lettres capitales. Les séquences répétées sont indiquées par des boites hachurées et les boitcs blanches dési~nenl
les insertions chloroplasLiques identifiées dans les deux génômes. Les gènes connus sont localisés (boites noires).
La posilion sur le cercle maîlre est montrée au dessus des cartes.

---

62
.B) ANALYSE DE L'ORGANISATION DES GENES DE tRNA
MlTOCHONDRIAUX
.1) COMPARAISON ENTRE LES GENOMES B37-N ET WF9-N
L'hybridation des tRNA totaux mitochondriaux avec le DNA mitochondrial du
maïs WF9-N a été faite dans notre laboratoire par WINTZ (1988). De même, les gènes
de tRNA connus ont été localisés sur ce génome en utilisant les oligonucléotides de
synthèse correspondant à ces gènes.
En comparant les hybridations obtenues avec le génome B37-N ( chap.Il.I:
fig.6-a) à celles obtenues avec le génome WF9-N (WINTZ, 1988) il est apparu qu'il n'y
a pas de différence fondamentale dans l'organisation et la localisation des différents
gènes de tRNA entre ces deux génomes fertiles. On a pu simplement observer une
"micro-hétérogenéité" entre ces deux génomes. En effet, en aval du gène du rRNA 18S,
le génome WF9-N contient une séquence de DNA qui s'hybride à un oligonucléotide de
synthèse complémentaire à la partie 5' du gène de tRNAASP. Nous ne savons pas si cette
région comporte un pseudogène, un gène incomplet ou un gène de tRNAAsp ayant une
structure primaire légèrement différente de celle du gène de tRNAAsp décrit par PARKS
et coll. (1986). Nous savons cependant que les tRNA mitochondriaux totaux
ne
s'hybrident à la région contenant ce gène que dans des conditions de stringence faible
(50°C) ; ce qui semble indiquer qu'il pourrait s'agir d'un pseudogène ou au moins d'un
gène incomplet.
2) COMPARAISON ENTRE LES GENOMES B37-N ET
B37-cmsT
La comparaison de l'organisation des gènes de tRNA mitochondriaux du génome
mâle stérile B37-cmsT par rapport au génome fertile B37-N montre que:
a) Conformément à l'importante réorganisation de l'ensemble du génome, il y a
une nouvelle distribution des gènes de tRNA mitochondriaux dans le génome B37-cmsT.
Tous les gènes de tRNA portés par les génomes normaux (B37-N et WF9-N) sont
retrouvés dans le génome B37 -cmsT. Dans la plupart des cas, ces gènes de tRNA
conservent leur environnement nucléotidique immédiat (sur au moins 1kb) ce qui fait que
la majeure partie des fragments BamHI du génome B37-N comportant des gènes de
tRNA sont retrouvés dans le génome B37-cmsT. Ce qui change, c'est la position relative
de ces fragments sur le cercle maître. Le cas des gènes de tRNAPhe, de tRNAAsn et de
tRNASer illustre bien ces remaniements (fig.30). Dans le génome normal B37-N, le gène
de tRNAAsn est répété car il est situé dans la répétition inversée de 14 kb. Une des copies
de ce gène se trouve sur le même fragment (2,7 kb Bamm) que le gène de tRNAPhe
(chap.II.II.B ; chap.II.I: fig.6-a, piste 6). Par contre, le gène de tRNASer est contenu

---

FIGURE 30: Exemple de recombinaison entrainant la réorganisation
des gènes de tRNA entre les génomes fertiles
et mâle-stériles T
B
N7D1Ü
Ser
B
1<
1
....
1
Lignées fertiles
1
Phe
1
Asn
Asp
mMet-1
( B37-N)
N8A1
..
s ..
1
x 41
1
1
4
B
S
BI
Asn
Asp
mMet-1
T3E3
1( 4 B S .. S 4
Lignée mâle-stérile T
1
Phe
1
Ser
(B37-cmsT)
T3G5
...
1
)(
1
4
1
B
B
B
B: BarnHI; S: SmaI
Les petites flèches indiquent le sens de transcription des gènes de tRNA
Les noms des cosmides portant les fragments réarrangés sont inscrits
en face et à gauche des lignes correspondantes.
Les croix représentent les régions potentielles de recombinaison

---

63
dans un fragment BamHI de 3.2 kb, qui est situé sur le cercle maître à environ 250 kb de
ce fragment
BamHI de 2,7 kb (chap.lI.ILA ; chap.lI.I: fig.6-b, piste 14). Dans le
génome B37-cmsT, le gène de tRNAAsn est séparé du gène de tRNAPhe d'environ 350
kb (sur le cercle maître). Le gène de tRNAPhe est rapproché du gène de tRNASer et ils
sont portés par deux fragments BamHI contigus ( chap.lI.I: fig.6-b piste 3).
b) Un bloc de DNA mitochondrial B37-N comportant des gènes de tRNA
disparait dans le génome B37-cmsT. En effet, la séquence répétée inversée de 14 kb du
génome B37-N codant pour les gènes de tRNAAsp, de tRNAmMeL 1, de tRNAGlu, de
tRNAPro et de tRNAAsn, n'est plus présente qu'en un seul exemplaire dans le génome
B37-cmsT. Tous les gènes de tRNA qui étaient par conséquent dupliqués dans le
génome N ne le sont plus dans le génome T. Cette perte relative d'information, bien que
concernant une grande région de DNA (plus de 14 kb) ne semble pas dramatique pour la
mitochondrie. Cependant, nous ne savons pas si la disparition d'une des copies de la
répétition inversée de 14 kb a une influence sur l'expression des gènes qu'elle comporte.
Dans les chloroplastes, on a observé que les concentrations des tRNA codés par des
gènes présents en deux exemplaires (car situés dans la région inversée répétée) ne sont
pas supérieures aux concentrations des tRNA codés par un gène unique (PFITZINGER
et coll., 1987). Par ailleurs, dans le génome B37-cmsT, on retrouve l'hybridation du
gène de tRNAAsp en aval du gène de rRNA 185. Nous n'avons aucune donnée qui
puisse nous permettre d'expliquer pourquoi les génomes WF9-N et B37 cms-T
contiennent ce gène ou pseudo-gène de tRNAAsp alors que le génome B37-N ne l'a pas.
c) Tous les gènes de tRNA qui sont retrouvés sur le cercle maître du génome B37-
cmsT sont transcrits dans la mitochondrie du maïs B37-cmsT. En effet, on obtient le
même profil d'hybridation sur les filtres comportant le DNA mitochondrial B37-cmsT,
quels que soient les tRNA totaux mitochondriaux utilisés (B37-cmsT, B37-N ou INRA).
De même, les tRNA de la mitochondrie du maïs B37-cmsT révèlent toutes les régions du
génome B37-N comportant des gènes de [RNA. La réorganisation génomique n'affecte
donc pas la transcription des gènes de tRNA.

---

ETUDE D~UTRES REGiOfNJS DU ([)fNJA
MiTOCHOfNJDfPJAL DES VARiETES DE
MAiS 837=fNJ ET 83'l=(Cm~T
( '

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[Q)~~~[N]~

---

64
I. ETUDE DE 2 FRAGMENTS DE DNA MITOCHONDRIAL DE
MAIS
S'HYBRIDANT À LA FRACTION 4S
DU
RNA
MITOCHONDRIAL MAIS NE COMPORTANT PAS DE
GENE DE TRNA
A.ETUDE DU FRAGMENT 1,25 kb )(hoI DU COSMIDE 9-1E8CA2)
1. PRESENTATION DU COSMIDE
9-1E8
Le cosmide 9-1E8 (cf fig.4-c) contient une insertion de DNA mitochondrial de
maïs à cytoplasme fertile de la variété WF9-N. Cette insertion mesure environ 35 kb. Elle
est située entre les positions 0 et 40 du cer;cle maître (fig.31). Nous nous sommes
intéressés à ce cosmide parce qu'il s'hybride aux tRNA mitochondriaux totaux du maïs
marqués au [32 P] pCp (à l'aide de la T4 RNA ligase) ou avec de l'a.-[32p]ATP (à l'aide
de la tRNA nucléotidyl transférase: CCAse).
2. SOUS-CLONAGE
ET SEQUENCAGE D'UN FRAGMENT XHOI
DU COSMIDE 9-1E8
Nous disposons de la cartographie XhoI (LüNSDALE et coll., 1984) de la région
du DNA mitochondrial couverte par le cosmide 9-1E8. Nous avons utilisé cette
cartographie pour rechercher les fragments du cosmide qui s'hybrident à la fraction 4S du
RNA mitochondrial du maïs. Les fragments XhoI de ce cosmide ont été clonés dans le
vecteur Ml3 um31. La figure 32-a montre l'électrophorèse sur gel d'agarose d'une
selection des clones qui représentent tous les fragments XhoI de ce cosmide. Ces
fragments ont été hybridés avec la sonde constituée par la fraction 4S (enrichie en tRNA
totaux) marquée au a.-[32p]ATP à l'aide de la CCAse. La figure 32-b montre que cette
sonde s'hybride à un fragment XhoI de 1,25 kb.
Nous avons établi une cartographie fine du fragment XhoI de 1,25 kb . A l'aide
de cette cartographie nous, avons pu obtenir des sous-clones de ce fragment pour le
séquençage. Dans les régions où nous ne disposions pas de sous-clones adéquats nous
avons aussi utilisé des oligonucléotides de synthèse pour compléter la séquence
nucléotidique du fragment étudié.
3. ANALYSE DE LA SEQUENCE DU FRAGMENT XHOI DE 1,25kb
La recherche de gènes de tRNA sur le fragment XhoI de 1.25kb, en utilisant les
caractéristiques qui permettent leur identification (recherche de la boucle 'P) a été
infructueuse. Par contre, en utilisant le programme d'analyse de séquences UWGCG,
nous avons pu identifier sur ce fragment une phase de lecture ·ouverte d~ 240 acides
aminés. Cette URF (pour Unidentified Reading Frame) s'étend du nucléotide 1 du
fragment XhoI de 1,25 kb (1259 pb) au nucléotide 720 pb (fig.33). Nous avons cherché
dans les banques de données, des homologies de séquences entre l'urf du fragment

---

FIGURE 31:
Localisation et représentation schématique de la structure
chimérique du fragment XhoI de 1,25 kb du cosmide 9-1E8
0
20
40
60
1
5
1
0.7
14
~
CJ
CJ
.
-
cosmide 9-1 E8
•
0.96
2.4
Smal
26
Xhol
14.8
11.8
19.5
"
,
--
0.6
... -
~
~-,~-
"
... -
J
-~,~
1
~-~
,
-~~-
1 ,,"
147
306
720
............ _
1259
Ut" "<;sh5$3~s s
I--J-..._---...-.......
S sS S S <S S S s <
~J
S
S
urt24 0
urf138
•
Régions homologues au fragment 2.7Kb du cosmide 9-2C4
~
insertion
atp6
ES]
urf240
o
insertion
coxll
CJ
séquences répétées ailleurs dans le génôme (les chiffres inscrits au dessus de ces boites
indiquent la taille des répétitions)
Les tailles des fragments sont indiquées en kb. Les coordonnées ( en nucléotides) désignant les
extrémités des différentes composantes de la structure chimérique sont indiquées au dessus du
fragment XhoI de 1.25 kb. Les chiffres inscrits au dessus de la ligne supérieure désignent la
position des fragments sur le cercle maître.

---

65
XhoI de 1,25 kb et d'autres gènes de protéines connues (code universel). Les résultats
de ces recherches sont schématisés sur les figures 31 et 33 et montrent que:
- Du nucléotide 1 au nucléotide 306 (soit 102 acides aminés), on observe une
homologie de plus de 95% entre le fragment XhoI de 1,25 kb et la région située en
amont du gène coxII de la mitochondrie du maïs (FOX and LEAVER, 1981). Cette
région correspond en outre à une partie de la séquence répétée de 0,7 kb (LaNSO ALE et
coll., 1984) dont une copie se trouve en amont du gène coxIf (fig.31)
- Du nucléotide 147 au nucléotide 306 (53 acides aminés) le fragment XhoI de
1,25 kb a une forte homologie avec une séquence interne au gène atp6 (DEWEY et coll.,
1985a). Cette séquence est entièrement incluse dans la région précédente contenant les
séquences en amont du gène coxIf.
- Du nucléotide 306 au nucléotide 720, correspondant au reste de l'url, on
n'observe aucune homologie avec les gènes connus dans la banque de données.
Au vu de ces observations, il apparaît que la région du DNA mitochondrial étudiée
comporte une structure chimérique contenant une partie des gènes coxIf et atp6 et une
partie inconnue. II nous a donc paru utile de déterminer si cette structure chimérique est
exprimée dans la mitochondrie du maïs. La phase de lecture ouverte de 240 acides aminés
sera appelée urf240 et la partie inconnue (138 acides aminés) sera nommée urf138 .
. L'wj}38 est-elle ex,primée dans la mitochondrie du maïs?
Pour étudier la transcription de l'urlI3 8, nous avons tenté d'identifier des
transcrits correspondants à cette urfpar hybridation du fragment XhoI de 1,25 kb avec
l'ensemble des RNA mitochondriaux. De manière à faire la différence entre les transcrits
de l'atp6 et du coxII (qui vont être mis en évidence par les séquences homologues
contenues dans le fragment XhoI de 1,25 kb) et les transcrits spécifiques de l'urf138,
nous avons utilisé deux sondes différentes: l'une correspond au fragment entier
(comportant donc tout l'urj24D ) et l'autre à un fragment de restriction BamHI-StuI
(fig.34) ne contenant pas les insertions des gènes coxIl et atp6 et spécifique à l'urf138.
Ces sondes ont ainsi été hybridés séparément avec du RNA total de la mitochondrie du
maïs extrait des variétés B37-N et B37-cmsT. Les résultats de ces hybridations sont
présentés sur la figure 34. L'analyse de ces hybridations montre que:
- Le fragment entier XhoI de 1259 pb s'hybride à plusieurs grands transcrits
distincts de la variété normale B37-N en plus de certaines petites molécules de RNA de la
fraction "5s-4s". Il s'agit de transcrits ayant 6.5 kb, 4.2 kb, 3.5 kb, 2.6 kb, 2.3 kb, 1.9
kb, 1kb, 0.8 kb et 0.65 kb (fig.34-a, piste N). Les transcrits de 3.5 kb, 2.6 kb et 0.65
kb correspondent à des RNA qui s'hybrident aussi avec une sonde du gène coxIf du maïs
(FOX et LEAVER, 1981).
Par contre, le fragment XhoI de 1259 pb s'hybride à beaucoup plus de transcrits
de la mitochondrie de la variété stérile B37-cmsT par rapport à la variété fertile. Les

---

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kb
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2
1.6
0.5
•
a
b
FIGURE 32: Analyse des sous-clones du cosmide 9-1E8
a) Elecrrophorèse sur gel d'agarose 0.8% des fragments de
restriction XhoI des sous-clones du cosmide 9-1E8
b) Hybridation des fragments de restriction aVrr la fraction
4S du RNA mitochondrial marqué au ex -[ P] ATP à l'aide de
la CCAse

---

FIGURE 33: Séquence nucléotidique du fragment XhoI de 1,25kb
du cosmide 9-3E8
XhOI
CTCGAGGAGATTCACACACCT~AGGGACGTAGTTGTTTTGGTgAGAGAATAgAAr,ATCTGCACGCCCG~
IIY>E<E(·:tH
T:··P:/·:·····G ·:#:sc:#H::d:(R
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147
TCTCAACAGCCCGTTGGATCAATATCAATTTGGAATTCACCCAATTCTGGATCTGAATATTGGTGAGTAC
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1
3'--CUAAGUUAGGTGGG--5'
TATGTCTCATTCACA AA TCTATCCIIGTCI8IGTCI8IGCT8CICaCTCTCGGITTGGTCIT8CTTCTG8
ly.v••S(piHT:':·'>··'N::::n.:i§::·f;?,@:M.fS:'ff.':.iH?ïPfTL.G··;r;··.:·::V.:::t··•••·····L.·····I{·.·.•··'r.
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306
IS0~~j~t~;:'~r~~<~~2~~s,ijGcgAG~~GGgG~GA~CC~AT~CT~TC~TA~AG~CC~CG~CG~G
TGCTTCCGCTACGCCTAATTCTGAGGATGATGATAAGCGGAAAAAAGTGTCCCGCCAAGACGCCAATGGC
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T
K
R
*
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AGCAAAGGéATCGCGGCG~ATCAACACCAGACTAGTTGéTGATTCAATAGCTGACTTCéfrTTCAAATATGI
IATATGAT+ACACAT~~GCTCGGCACCCTTGTTTCCeAAACTAACTACTëATCTAGCTAGATCCGGATCAG
AAATGGTAGGAACTAGATCAAGAAATACGAGACTTTTCCTTCACTGGAAACTCCCGAGCCCGAGTCATCA
CCCTAGCCCGACTCATCCATTGAAGCGAGCCAGGTGGCAAATCCATTAATATAACTTCTGGAATCCCAGC
AATAGAGCTGGCAAGGTTGAAGTGAAGCTGGAATGGATCCGATCTTCAGTGTGGAAAGAGCTTCAATCCT
CTGTAGCAAGGAAAAGCCG~CCGCTCTTGTCTTGCCTTAAATAGCTGGAAGCGAAAGCAGiTCTCGAG
XhoI
..
La séquence peptidique de l'urf'240 et de l'urfl38 est représentée en dessous de la séquence nucléolidique.
Les boites en pointillé indiquent les séquences homologues à la région en amont du gène coxII. Les limites
de l'insertion d'une partie du gène atp6 sont indiquées (147; 306). La séquence de type Shine et Delgarno de
la séquence 3' du rRNA l8s du maïs est montrée au dessus de la séquence qui lui est complémentaire en amont
de l'urf138. Les nucléotides T-ATC au dessus de la séquence indiquent la différence par rapport au gène coxI!.
La séquence ATGGAA inserée comparativement ail gène coxII est montrée par une barre au dessus de la séquence.
La méthionine initiatrice potentielle est encerclée
Les boites blanches représentent des séquences homologues au fragment BamHI-XhoI de lkb du cosmide
9-3C4(chapJll-II.B)

---

X
coxlllatp6
St
urft38
x
~
1
~«««««l~ssssssssssss<'d
\\
urf24 0
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6.5
6.8
. ~ -, ._.~
4.2
4.6
3.3 4.0
3.5
2.6 2.3 2.2
1.9
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0.8
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a
b
FIGURE 34 : Etude de la transcription de l'urf138
a)
Hybridation du fragment XhoI de 1.25 kb du cosmide 9-lE8
comportant lDutl'urf240 avec les RNA mitochondriaux totaux
b) Hybridation du fragment StuI- XhoI comportant seulement
l'urfl38
avec les RNA mitoehondriaux totaux
N: RN A total extrait de la mitoehondrie du mals de la
variété normale 837-N
T: RNA IDtal extrait de la mitochondrie du mals de la
variété mâle stérile 837-cmsT
La taille des transcrits est indiquée en kb
r:zJ insertion coxlltalp6
IS::J ur/240
o
urf138
X: XhoI; St: Stul

---

66
transcrits de 2.6 kb, 2.3 kb, 1.9 kb, 1 kb et 0.8 kb de la variété nonnale sont retrouvées
alors que de nouveaux transcrits de 6.8 kb, 4.6 kb, 4.1 kb, 3.3 kb et 1.6 kb apparaisent
dans la variété mâle stérile (fig.34-a, piste T). Parmi tous ces transcrits, ceux de 6.8 kb,
4.6 kb, 4.1 kb, 3.3 kb, 2.5 kb, 2.2 kb, 1.9 kb et 1.6 kb s'hybrident à une sonde du gène
atp6 de la mitochondrie du maïs (DEWEY et coll., 1985).
- La sonde correspondant à l'urfI38 seule révèle dans la variété fertile, les
transcrits de 3.3 kb, 1.9 kb, 1 kb, 0.8 kb et 0.6 kb ainsi qu'un transcrit spécifique de 1.3
kb.
Dans la variété stérile, les 5 premiers transcrits identifiés dans la variété nonnale
sont retrouvés en plus des transcrits de 6.8 kb, 4.6 kb et 1.6 kb.
En récapitulant toutes ces informations, on peut dire que:
1°) L'wf138 est transcrite dans la mitochondrie du maïs. On trouve en effet au
moins un transcrit spécifique de 1.3 kb qui ne s'hybride ni à la sonde coxI! ni à la sonde
atp6.
2°) Il est probable que le transcrit primaire contenant l'uifI38 contienne des
séquences homologues aux gènes atp6 et coxI! car la sonde correspondant à l'urf240 et
celle correspondant à l'urf138 révèlent des transcrits communs quelle que soit l'origine
des RNA sur lesquels les hybridations ont été réalisées.
3°) L'urf240 fait partie de d'unités de transcription différentes dans les lignées de
maïs à cytoplasme nonnal et à cytoplasme stérile. Ceci suggère que la région codant pour
ces urf subissent des remaniements importants d'un type de cytoplasme à un autre.
L'analyse des régions codant pour l'urf240 et l'urfI38 au niveau des différentes cartes de
restriction des génomes B37-N et B37-cmsT (FAURON et HAVLIK, 1988, FAURON
et coll., 1989 ) confirment ces observations.
Ces résultats de transcription nous ont incités à analyser la séquence
nucléotidique de l'urf138 et des régions qui l'entourent. Sachant que la partie en amont
du coxII que l'on retrouve dans l'urf240 n'est pas contenue dans la protéine mature de
COXII (FOX et LEAVER, 1981) nous avons supposé que l'urf138 pourrait coder elle
aussi pour une protéine indépendante.
L'analyse des séquences en amont de l'urfI38 montre que:
- Le codon ATG (en position 284 sur la fig.33) qui spécifie la méthionine
initiatrice du gène coxII est détruit devant l'uifI38. Ce codon ATG est transformé en
AAG.
- A 5 nucléotides en aval du codon ATG potentiel du coxII, on observe
l'insertion d'une séquence 5'ATGGAA3' ( par rapport à la séquence du gène coxII ).
Cette séquence conserve la phase de lecture mais crée un nouveau codon ATG. Ce codon
ATG pOWTait servir de codon initiateur pour l'urfI38.

---

67
- 16 nucléotides en amont du nouveau codon initiateur potentiel, on a pu identifier
une séquence de type SHINE et DALGARNO capable de s'apparier avec la région 3' du
rRNA 18S de la mitochondrie du maïs. Cette séquence est montrée sur la figure 33.
Ainsi, si l'on tient compte de toutes ces données, on peut soutenir l'hypothèse
suivant laquelle l'urf138 coderait pour une protéine indépendante du reste de l'urj240.
Nous ne savons toutefois pas s'il y a un intron qui intervient avant le codon stop
commun aux deuxurf ou si cette phase ouverte represente le dernier exon (extrémité
carboxy-terminale) d'une protéine plus grande. La taille du plus petit transcrit
correspondant à l'urf138 étant d'environ 650 pb (fig.34) alors que la taille de cette urf
représente 414 nucléotides (138 aa) il est difficile d'imaginer que cette urf code pour une
proteïne entière. Cependant, une autre méthionine est présente au niveau du nucléotide 69
de l'urf240 et si elle correspondait au début de la protéine, le transcrit mature
comporterait alors 651 nucléotides. Cette taille coïncide avec celle du plus petit transcrit
révélé par les différentes sondes. De plus, cette possibilité expliquerait pourquoi la sonde
spécifique à l'urf138 s'hybride avec des transcrits révélés par des sondes atp6 et coxII.
En effet, le RNA correspondant à cette urf(qui coderait pour une protéine de 217 aa)
comporterait des séquences homologues à ces deux gènes. Le seul problème à ce niveau
est qu'on ne trouve pas de séquence de type SHINE et DALGARNO en amont de la
méthionine en position 69. Des études sont en cours pour élucider ces problèmes. Dans
tous les cas, l'analyse de la transcription de l'urf138 suggère q util existe des grand
transcrits de .plus de 8 kb impliqués dans des processus de maturation complexes.

---

68
B. ETUDE DU FRAGMENT SmaI DE 2.7 kb DU COSMIDE <9-2C4)
1. PRESENTATION DU COSMIDE
Le cosmide 9-2C4 ( cf figA-c) contient une insertion de DNA mitochondrial de
maïs à cytoplasme nonnal de la variété WF9-N. Ce fragment est situé sur le cercle maître
entre les positions 295 et 235. Il contient les régions codant pour les gènes cob
(DAWSON et coll., 1984), atp9 (DEWEY et coll., 1985-b) et de tRNAfMel (PARKS et
coll., 1984). Il comporte une partie de l'insertion chloroplastique de 12 kb dans la
mitochondrie du maïs (STERN et LONS DALE, 1982). Nous nous sommes intéressés à
ce cosmide car son insertion s'hybride aux tRNA totaux mitochondriaux. En fait,
l'objectif de cette étude a été de rechercher les gènes de tRNA qui pourraient être codés
par ce cosmide en plus du gène de tRNAfMet
2. SOUS-CLONAGE DES FRAGMENTS DU COSMIDE 9-2C4
Le cosmide 9-2C4 a été hydrolysé par l'enzyme de restriction SmaI et les
fragments de restriction obtenus ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose,
puis transférés sur un filtre Nylon. Ces fragments ont alors été hybridés à une sonde de
tRNA totaux (plus précisément la fraction 4S enrichie en tRNA) marquée au a-[32P]ATP
à l'aide de la CCAse. Les résultats de ces expériences ont montré qu'en plus du fragment
SmaI de 7,4 kb codant pour le gène de tRNAfMet ( PARKS et coll., 1984) un fragment
de 2,7 kb s'hybride à la fraction 4S marquée au a-[32P]ATP à l'aide de la CCAse. Ce
fragment code aussi pour le gène atp9. Nous avons pensé que le gène atp9 pouvait être
proche d'un gène de tRNA.
Nous avons donc cloné spécifiquement le fragment SmaI de 2,7 kb dans le
vecteur M 13 mp 19 et nous en avons établi une carte de restriction fine. Par des séries
d'hybridation des différents fragments de restriction du fragment de 2,7 kb avec les
tRNA totaux mitochondriaux, nous avons pu identifier un fragment BamHI-XhoI de 1
kb qui s'hybride à la sonde. Ce fragment de 1 kb a été sous-cloné dans le vecteur Ml3
(um30 et um31) et sa séquence nucléotidique a été déterminée par la méthode de
SANGER.
3. ANALYSE DE LA SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE DU
FRAGMENT BamHI-XhoI DE 1 kb
L'analyse de la séquence du fragment BamHI-XhoI de 1 kb
n'a révélé la
présence d'aucun gène de tRNA reconnaissable. En effet, à l'image du cas du fragment
1,25 kb XhoI du cosmide 9-1E8 (chap.llI-I.A), la recherche des gènes de tRNA à l'aide
des caractéristiques classiques de ces gènes a été infructueuse. On ne retrouve sur ce

---

69
fragment, que le gène de l'atp9 . Nous essayerons, dans un chapitre consacré à cet effet
(chapitrelV), de savoir pourquoi des fragments de DNA mitochondrial ne contenant
aucun gène de tRNA s'hybrident à des molécules de tRNA marquées spécifiquement en
utilisant la CCAse.

---

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---

FIGURE 35: Organisation du fragment 5,7 TB
~ - - - - - - DNA commun
- .
aux génomes N et T
. .Insertion -~
chloroplastique
tmA
235
DNA unique au génOme T
cp
cp
1.5
::;:::::::::::;::::;:::;:::::::;:::::
10
I~
. - 1 . 7 k b - - .
1--~II-+I------1II--------+I-----:11-I-1
250pb
---il
B
X
S
X
H
HX
B
~~~~~~]
Séquences chloroplastiques
]:::::: 1
Séquences retrouvées seulement dans le génome T
c=J
Séquences répétées ailleurs dans le génome T
1.5 :
Séquence répétée de 1.5Kb
10
Séquence répétée de 10 Kb
Intron du gène trnA chloroplastique
E2
Deuxième exon du gène trnA chloroplastique
B: BamHI; H: HindllI; S: Sma!; X: XhoI
La séquence répétée de 1,5 kb est entièrement contenue dans celle de 10 kb mais elle est
répétée 3 fois dans le génôme T. La croix entre la région contenant du DNA unique au
génôme T et celle comportant l'insertion clùoroplastique indique la zone probable de
recombinaison

---

71
partie 5' du gène de rRNA 23S chloroplastique du maïs. Cette insertion chloroplastique
mesure environ 1,2 kb.
Ces observations nous ont conduits à nous poser certaines questions:
a) L'hybridation observée est-elle due à la présence de l'exon 2 du gène
de tRNAAla chlorop/astique ?
Avant de répondre à cette question, il faut rappeler que les tRNA
mitochondriaux (ou la fraction 4S) utilisés dans nos expériences sont exempts de
contaminants chloroplastiques (cLchapitreII-I). Par conséquent, admettre que
l'hybridation sur le fragment est liée à l'exon 2 du gène de tRNAAla chloroplastique
suppose que ce dernier est transcrit dans la mitochondrie. Dans la mesure où le gène
complet (les deux exons et l'intron entier) n'existe pas de manière continue dans le
génome mitochondrial, cette hypothèse est peu probable (sauf si on suppose un
phénomène de trans-splicing dans mitochondrie impliquant d'une part cet exon et d'autre
part, l'exon 1 du gène de tRNAAla présent dans l'insertion chloroplastique de l2kb
situés à environ 250 kb l'un de l'autre). Néanmoins, pour plus d'assurance, nous avons
tenté de voir si dans nos conditions expérimentales d'hybridation (65°C; lM NaCI ; 1%
SOS) il est possible d'obtenir une hybridation entre l'exon 2 du gène de tRNAAla et le
tRNA chloroplastique correspondant. Nous avons ainsi hybridé les fragments de
digestion du plasmide 5.7TB avec les tRNA chloroplastiques totaux du maïs marqués.
Comme témoin, nous avons utilisé le fragment de DNA codant pour le gène de
tRNAmMet mitochondrial (cosmide 8-3B2) qui a 95% d'homologie avec son équivalent
chloroplastique. Les résultats de ces hybridations ont montré qu'aucune hybridation n'est
observée sur les fragments comportant l'exon 2 du tRNAAJ.a chloroplastique alors que les
fragments comportant le tRNAmMet mitochondrial s'hybrident. L'interprétation de ces
résultats est simple: il n'y a pas de tRNAAla chloroplastique dans la mitochondrie du
maïs et même s'il y en avait, ce tRNA ne pourrait pas s'hybrider au fragment 1,7 kb dans
nos conditions d'hybridation. Par conséquent, l'hybridation observée sur le fragment 1,7
kb n'est pas due à la présence, sur ce fragment, de l'exon 2 du gène de tRNAAIa.
f3) L'hybridation est-elle liée à la présence de séquences ch/orop/astiques
ou à la présence des gènes de rRNA ?
Pour répondre à cette question, nous avons pensé qu'il fallait élargir les
hybridations de la fraction 4S du RNA mitochondrial à l'ensemble des génomes
mitochondriaux B37-N et B37-emsT. Nous avons donc utilisé des filtres comportant des
cosmides (digérés par BarnHI) représentatifs des génomes entiers des mitochondries des
maïs à cytoplasme fertile (B37-N) et à cytoplasme stérile (B37-cmsT). Ces filtres ont été

---

FIGURE 36-a : Séquence nucléotidique du fragment HindlII-XhoI
de 1,7 kb du plasmide 5.7TB
.
.
.
CTCGAGCCCAGATATCGATTTACCATGGATGTCCGAAACGGGAAACAAGAAAAGTAATAGAAATCGTGTG
.
.
CCAGCGGGAGATACGAAATTCACTGGCAGACCGAGTTGGGCGCAGGTGCCAGATCCTCAAAGTATCGTAA
.
.
.
AGTTAAGTTAAGTATCGTAAAGTATCGATCAGCCTAGTGTACCAACCACGTGGTACGACGGGCACTCAAA
.
GACCTGGCGAATGAGGGCCCACCCAAGAGCGCTTATGTCATATGGGAACTCTTGGCTGGAAACAATCCTT.
ATGGTTTTTATACCGGTTAGAATAATAAGAAAGAATCAAAGTCCAGGTTGGTTGGTGAGCCTAGTGATAG
.
.
GAGACTATCTkGCTTGGTTCGGAGAGCACTTGTTGGGTTTAGATTAGTTTTGCAAATGTTACGGCCTAAA
TGCTGAACTATTGACCCTACTTGTTCGGATGGGTGTTCACCCCAAAGTGTTCCCGGACTGCATGCATACA
TCCGTAAGTAACTTAGTGCAACATGGCAAATTTCATTGAGAGGAATCAGCAAAGAAAAG88ATÇTTÇ~Çç
GGGTGACTGGATCSCCCCGGAACCACAAGAATCCTTAGAATCCCATTCCAACTCAGCACCTTTTGTTTTG
GGATTTTGAGAAGAGTTGCTCTTTGGAGAGCACAGTACGATGAAAGTTGTAAGCTGTGTTAGGGGGGGAG
TTATTGCCTATCGTTGTCCTCTATGGTAGAACCCGTCGGGGAGGCCTGAGAGGCGGTGGTTTACCCTGTG
GCGGATGTCAGCGGTTCGAGTCCGCTTATCTCCAGCCCGTGAACTTAGCGGATACTATGATAGCACCGAA
GTTGCCAATTCGTCAGTTCGATCTATGATTTCGCATTCATGGACGTTGATAAGATCCTTCCATTTAGTAG
CACCTTAGGATGGCATAGCTTAACGTTAATGGCGAGGTTCAAAAGAGGAAAGGCTTGCGGTGGATACCTA
GGCACCCAGAGACGAGGAAGGGCGTAGCAAGCGACGAAATGCTTCGGGGAGTTGAAAATAAGCATAGATC
CGGAGATTCCCAAATAGGTCAACCTTTTGAACTGCCTGCTGAATCCATGAGCAGGCAAGAGACAACCTGG
CGAACTGAAACATCTTAGTAGCCAGAGGAAAAGAAAGCAAAAGCGATTCCGTACCGTACGTAGTAGCGGC
GAGCGAAATGGGAGCAGCCTAAACCGTGAAAACGGGTTGTGGGAGCAATACAAGCGTTGTGCTGCTAGCA
AGCGGTTGAGTGCCGCACCCTAGATGGCTAAAGTCCAGTAGCCGAAAGCATCACTACGTTACGCTCTGAC
CCGAGTAGCATGGGGCACGTGGAATCCCGTGTGAATCAGCAAGGAAAGGACCACCTTGCAAGGCTAAATA
CTCCTGGGTGACCGATAGCGAAGTAGTACCGTGAGGGAAAGGTGAAAAGAACCCCCAGTGGGTAGTGAAA
TAGAACGTGAAACCGTGCTGAGCTCCGCGGAGGGGAAGTGATCTCTGACCGCGTGCCTGTTGAAGAATGA
GCCGGCGAGTGATAGGCAGTGGCTTGGTTAAGGGAATGGAACCCACCGGAGCCGTAGCGAAAGCGAGTCT
TCATAGGGCGATTGTCACTGCTTATGGACCCGAACCTGGGTGATCTATCCATGACCAGGATGAAGCTT
FIGURE 36-b: Séquence nuc1éotidique de l'extrémité de l'insertion
chloroplastique de 12kb comportant l'intron du gène trnA cp
trnA
.
GGATCCCTGGGGAATAGGATCAAGTTGGCCCTTGCGAATAGCTTGATGCACTATCTCCCTTCAACCCTTT
·
.
GAGCGAATGTGGCAAAAGGAAGGAAAATCCATGGACCGACCCCATTGTCTCCACCCCGTAGGAACTACGA
·
GATCACCCCAAGGACGCCTTCGGCGTCCAGGGGTCACGGACCGACCAT.GATTCCTCTTCAATAAGTGGA
·
.
.
ACACATTAGCCGTCCGCTCTCCGGTGGGCAGTAAGGGTCGGAGAATGGCAATCACTCGTTCTTAAAACCA
ATCTAAGTAGTAGATTGCTTCCC
Les séquences homologues aux séquences chloroplastiques sont encadrées et les séquences alignées sur la figure
39 sont soulignées en gras.

---

72
hybridés avec la fraction 4S du RNA mitochondrial marquée au a-[32PJATP à l'aide de
la CCAse. Deux types de résultas ont été obtenus:
-Si on élue d'une colonne RPC-S la fraction 4S marquée à la CCAse à une
force ionique comprise entre O.7M NaCl et 1 M NaCl, on obtient le profil d'hybridation
déja étudié dans le chapitre 11-1 (fig.6-a et fig.6-b). Toutes les hybridations observées
correspondent à des fragments de DNA comportant des gènes de tRNA et ces fragments
ont été étudiés dans les chapitres précédents (chapitre In
-Si on élue la fraction 4S marquée à une concentration saline supérieure à
lM NaCl, on obtient le profil d'hybridation montré sur la figure 37.
En comparant les deux profils d'hybridation obtenus, on note la présence de
plusieurs bandes additionnelles sur les filtres hybridés avec la fraction 4S marquée et
éluée à une concentration saline supérieure à lM NaCl. On peut classer ces bandes
additionnelles en deux catégories. Certaines bandes présentent des signaux d'hybridation
très forts, suggérant que les RNA correspondants sont soit très abondants dans la
mitochondrie, soit des substrats privilégiés pour la CCAse. D'autres bandes
additionnelles ont des signaux d'hybqdation beaucoup plus faibles. La nature des RNA
correspondant à ces derniers signaux sera discutée plus tard (ChapitreV).
En utilisant la cartographie de restriction des deux génomes N et T et en se
servant de la localisation des différents gènes connus, nous avons pu établir que toutes
les bandes de forte intensité correspondaient à des régions comportant des gènes de
rRNA. Dans le génome N, l'hybridation révèle les fragments suivants:
- le fragment BamHI de 5,2 kb du cosmide N7D4 (piste N°4) correspond à
la région du génome T que nous avons étudié c'est-à-dire au fragment S,7TB. Comme ce
dernier, il s'hybride à la fraction 4S et contient la partie 5' du gène du rRNA 23S
chloroplastique.
- le fragment de 3,2 kb du cosmide N8D Il (piste N° 13) comporte le gène
du rRNA l6S chloroplastique. Il fait partie de l'insertion des 12 kb chloroplastique
(STERN et LONSDALE, 1984) dans le génome mitochondrial.
- le fragment à environ 14 kb du cosmide NSF6 (piste N°lS) comporte le
gène du rRNA 26S mitochondrial (DALE et coll., 1984)
- le fragment à environ 16 kb du cosmide N8Bl (piste N°16) contient les
gènes des rRNA 5S (CHAO et coll., 1983) et rRNA l8S (CHAO et coll., 1984)
mitochondriaux.
-le fragment de 5,5 kb du cosmide N7E8 (piste N°18) comporte la partie 3'
du rRNA 23S chloroplastique. La séquence nuc1éotidique de la région comportant cette
insertion chloroplastique a été récemment établie par FElES et coll. (1988).
Tous les fragments détectés dans le génome N ont leur équivalent dans le
génom~ T à l'exception du fragment BamH1 de 3,2 kb contenant le gène de rRNA l6S

---

a)
kb
16
14
5.5
5.2
3.2
b)
kb
~------~
--- --.- -. -- ---
18
-
16
•
•
5.7 5 .5
5.2
.-.- ~.
3
2
: -
-'
•
FIGURE 37:
Hybridation des fragments BarnHI : a) de cosmides représentatifs
du DNA mitochondrial du maïs de la variété B37-N; b) de cosmides
représentatifs du DNA mitochondrial du maïs de la variété B37-cmsT,
avec la fraction 45 totale marquée au a-e2p]ATP à l'aide de la CCAse

---

73
chloroplastique. En fait, l'insertion chloroplastique de 12 kb présente dans le génome
mitochondrial du maïs fertile, a perdu environ 9 kb par une délétion inteIVenue lors du
passage du génome N au génome T (FAURON et coll., 1989; Cf cartes respectives N et
T ). Le fragment de 3,2 kb fait partie de ces 9 kb perdus.
A l'issus de ces analyses, il ressort que les fortes hybridations que nous
avons obtenues avec la fraction 4S du RNA mitochondrial du maïs sont beaucoup plus
liées à la présence de gènes de rRNA qu'à la présence de séquences d'insertion
chloroplastique. En effet, les autres fragments BamHI contenant des séquences
chloroplastiques ou des séquences homologues à des gènes chloroplastiques ne sont pas
systématiquement révélés lors de nos expériences d'hybridation. Par contre, tous les
fragments qui montrent des signaux d'hybridation très forts comportent des gènes de
rRNA. Ces obseIVations posent des questions auxquelles nous tenterons de répondre
dans le ChapitreIII.ILB.
B. LE GENOME MITOCHONDRIAL DES VARIETES NORMALES
CONTIENT LA QUASI TOTALITE DE LA SEQUENCE REPETEE
DU DNA CHLOROPLASTIQUE DU MAIS
Les obseIVations et les analyses faites précédemment ont montré que le
DNA mitochondrial contient plusieurs insertions d'origine chloroplastique. Pour notre
part, nous avons établi la séquence nucléotidique d'une région du DNA mitochondrial
comportant la partie S' du gène du rRNA 23S, l'exon 2 et une partie de l'intron du
tRN A AJa chloroplastique. Cette région se situe, dans la séquence du DNA
chloroplastique, entre d'une part, la région séquencée par FElES et coll. (1989)
comportant la partie 3' du gène du rRNA 23S, les gènes codant pour le rRNA 5S, le
rRNA 4.5S et le tRNAArg ( gène incomplet dans la mitochondrie) et d'autre part
l'insertion chloroplastique de 12 kb. Autrement dit, on retrouve presque toute la séquence
répétée inversée du DNA chloroplastique dans la mitochondrie du maïs. A ces régions,
on peut ajouter les deux gènes de tRNAAsn (GUU) (ChapitreII-B) et de tRNAHis (lAMS
et coll., 1985 ) qui sont situés chacun à
une extrémité de la séquence répétée
chloroplastique. L'ensemble de ces régions et leur localisation dans les génomes
mitochondriaux N sont montrés sur la figure 38. Tout se présente comme si la séquence
répétée avait été transférée en une seule fois dans le DNA mitochondrial du maïs mâle
fertile. Cette insertion aurait été suivie d'une redistribution des blocs de séquences
chloroplastiques probablement à travers des recombinaisons et/ou des insertions de DNA
mitochondrial. Il est possible d'imaginer ce scénario car on connait maintenant plusieurs
exemples de remaniements qui sont inteIVenus dans la mitochondrie du maïs:

---

FIGURE 38: Schéma montrant la redistribution des séquences
chloroplastiques inserées dans le DNA mitochondrial
• ••. ;0 •.••
. ..~-.:-
des souches fertiles de maIs.
f.::::l
E::::J
Séquences S 1 et S2
1
Gènes connus (cf introduction)
D Séquences chloroplastiques insérées
~ Séquences répétées
Les séquences chloroplastiques d'origine sont réprésentées au centre et l'orientation de la
séquence répétée chloroplastique est indiquée par la flèche. Les séquences d'origines ainsi
que leur localisation sur le cercle-maître du génome mitochondrial B37-N sont montrées.

---

74
(a) lors du passage d'un type de cytoplasme à un autre (N vers T par
exemple; voir FAURON et coll., 1989),
(b) lors de la réversion des cytoplasmes stériles vers la fertilité (SMALL et
coll., 1988; FAURON et coll., 1987)
(c) entre différentes souches de maïs et un ancêtre du maïs appelé Téosinte
(SMALL et coll., 1987).
Ce type de réarrangement a aussi été remarqué lors de la culture de
protoplastes de diverses lignées de blé (RODE et coll., 1987). Cette hypothèse est, de
plus, supportée par le fait que le maïs à cytoplasme stérile T a perdu 9 kb des 12 kb
d'insertion chloroplastique à travers des recombinaisons intramoléculaires (FAURON et
.
coll., 1989) montrant le caractère recombinogène de ces séquences chloroplastiques
étrangères. Plusieurs insertions et/ou recombinaisons ont certainement été nécessaires
pour aboutir à l'organisation actuelle de ces séquences chloroplastiques dans la
mitochondrie. Nous ne sommes pas en mesure de définir la chronologie de ces
événements mais on peut supposer que les premières pressions de sélection qu'ont subies
ces séquences étrangères ont'Opéré essentiellement aux extrémités de la séquence répétée.
Cela peut être remarqué par l'analyse des parties flanquantes des gènes de tRNA
(tRNAAsn et tRNAHis) qui sont localisés aux extrémités de la séquence répétée
chloroplastique. Ces derniers, (qui ont fini par être fonctionnels dans la mitochondrie),
ont conservé leur environnement immédiat mais ne se trouvent pas dans un grand
ensemble d'insertion chloroplastique.
Restent cependant les questions suivantes dont les réponses sont par ailleurs
liées:
- y a -t-il eu vraiment un seul événement ayant entraîné le transfert de la
séquence répétée chloroplastique ?
- Si c'est le cas, y a-t-il eu un ou plusieurs événements ayant entraîné la
redistribution des séquences chloroplastiques dans le génome mitochondrial ?
En fait, deux possibilités existent pour rendre compte de la présence de
toute la séquence répétée chloroplastique :
- Soit, comme nous le supposons, il y a eu un seul transfert et par
conséquent, les différentes panies de la séquence répétée chloroplastique retrouvées dans
la mitochondrie doivent pouvoir se juxtaposer linéairement.
- Soit, il y a eu plusieurs transferts et on devrait retrouver les différentes
parties de la répétition avec des séquences manquantes et/ou des chevauchements entre
les différentes parties.
Il est très difficile en effet d'imaginer que le transfert se soit produit en
plusieurs étapes et qu'en fin de compte, tous les éléments transférés puissent être
ordonnés bout à bout de manière à reconstruire toute la séquence répétée.

---

75
Exemple de !'intron dy cène de tRNAAla...çhlo[oplastigye
Pour essayer de vérifier, à un niveau plus fin, l'hypothèse du transfert
unique, nous avons entrepris de voir si on pouvait aligner bout à bout les séquences de
l'intron du gène de tRNAAla chloroplastique inséré dans la mitochondrie. Pour ce faire,
nous avons cloné le fragment BamHI de 1,5 kb du DNA mitochondrial B37-N contenant
la fin de l'insertion de 12 kb chloroplastique (qui contient une partie de l'intron du gène
de tRNAAla). Nous avons détenniné la séquence nucléotidique de la région où s'arrête
l'homologie entre la séquence chloroplastique insérée et la séquence d'origine (fig.36-b).
Par la suite, nous avons aligné ces séquences avec d'une part, le gène chloroplastique
complet de tRNAAla et d'autre part avec la séquence du fragment HindIT-XhoI de 1,7 kb
du plasmide 5,7 TB. Les résultats de ces comparaisons sont montrées sur la figure 39 et
indiquent qu'il ya une continuité entre les deux séquences insérées par rapport au gène
d'origine.
Seulement 17 pb semblent avoir été perdus lors des recombinaisons
successives ayant entraîné d'une part la séparation des deux exons du gène et d'autre
part l'intégration du fragment de DNA spécifique au génome T. Cependant les
substitutions de bases sont relativement fréquentes sur 100 pb autour de la région de
recombinaison.
12kb
CGGGCGGAAAAAGGGG TATCCTcnc--
Intron trnAcp CGGGCGGAAAAAGGGG GAGCTCCCCGnCCT
nCTCCTGTAGCTGGATTCCCCGGAA--
••
• ••
1,7kb
CTCCGGG -CTGGTCGCCCCGGAA---
FIGURE 39:
Comparaison des extrémités des insertions chloroplastiques
contenant l'intron du gène trnA chloroplastique avec la
séquence du gène d'origine
12kb: Extrémité de l'insertion chloroplastique de 12 kb. 1,7 kb: Séquence du fragment
HindlII-XhoI de 1,7 kb au niveau de l'insertion chloroplastique. Ces séquences sont extraites
de celles
montrées sur la figure 36. Les 17 nucléotides délélés lors des recombinaisons sont encadrés. L'étoile montre
les nucléotides substitués.
Ainsi, il apparaît que la coupure du gène de tRNAAla s'est produite dans la
mitochondrie après le transfert du gène entier. Le site de coupure situé dans l'intron
semble justement très actif dans la mitochondrie car c'est au niveau de la même séquence
que l'insertion du DNA spécifique au génome T s'est produite.

---

CHAPiTRE IV
QUELQUES ANALYSES SUR LES HYBRIDATiONS
DE RNA MARQUES A L~iDIE DE LA CCA~~ AVEC
DES FRAGMENTS DE DNA NE COMPORTANT PAS
DE GENE DIE tRNA

---

76
-::=:
Dans les chapitres précédents, nous avons étudié trois fragments de DNA
mitochondrial qui sont situés à de très grandes distances les uns des autres sur le cercle
maître, mais qui partagent néanmoins un certain nombre de caractéristiques. li s'agit des
fragments de:
1,25 kb XhoI (Cosmide 9-1E8 ) qu'on nommera A, (chap.III.LA)
1 kb BarnHI-XhoI (Cosmide 9-2C4) appelé fragment B (chap.III.LB) et,
1,7 kb HindIII-XhoI (plasmide 5.7 TB: chap.III.ILA).
Ces fragments ont en commun les caractéristiques suivantes:
1°) Ils s'hybrident tous à la fraction 45 extraite de la mitochondrie du maïs et
marquée au a-[32P]ATP à l'aide de CCAse.
2°) Aucun de ces fragments ne contient un gène de tRNA mitochondrial
identifiable.
3°) lis comportent, par contre, soit un gène codant pour une protéine, soit un gène
codant pour un rRNA.
Ces observations sont assez troublantes car elles mettent en cause la spécificité du
marquage des tRNA avec la CCAse. En fait, plusieurs hypothèses peuvent expliquer ces
"hybridations aspécifiques":
- la fraction enzymatique que nous avons utilisée contient une autre activité (RNA
ligase, RNA polymérase...) qui permettrait la fixation d'un (des) ribonucléotide(s) sur les
RNA,
- les tRNA marqués s'hybrident à des séquences homologues contenues dans les
gènes des rRNA et/ou des protéines,
- nous ne disposons pas d'informations suffisantes pouvant nous permettre
d'identifier certains gènes de tRNA (présence d'introns séparant des régions non
reconnaissables, pseudogènes ou tRNA bizarres, n'ayant pas les caractéristiques
classiques, notamment au niveau de la boucle 'f).
- la CCAse de levure n'est pas assez spécifique pour discriminer les tRNA
mitochondriaux parmi d'autres molécules de RNA dans des conditions de réaction
hétérologue et in vitro,
- la CCAse marque spécifiquement les tRNA mais est aussi impliquée dans
d'autres mécanismes de maturation des RNA mitochondriaux.
Npus avons tenté de répondre·à certaines des' questions posées :

---

QJ
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'QJ
;;::
""id
~
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~
:::>
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u. <Il
FIGURE 40 : Analyse par électrophorèse monodimensionnelle sur gel
de polyacrylarnide de la fraction 45 marquée au a- [32 P] ATP à l'aide de la CCAse
Les RNA contenus dans la fracùon 4s ont été marqués a l'aide de la CCAse. Une partie a été
directement déposée sur le gel et une autre a été purifiée sur une colonne RPC-S avant d'être
déposée. Le résultat d'électrophorèse a été exposé pendant deux jours au contact d'un film
de grande sensibilité.

---

77
1) L'EXTRAIT ENZYMATIQUE UTILISE DANS NOS REACTIONS
POSSEDE-T-IL UNE AUTRE ACTIVITE?
Nous avons pensé que la fraction enzymatique utilisée dans nos réactions pouvait
contenir d'autres enzymes qui seraient à l'origine de marquages non spécifiques d'autres
petits RNA. Cependant, nous ne sommes jamais arrivé à marquer la fraction 45 ni avec
du [32p] pCp, ni du a-[32p] GTP en utilisant l'extrait enzymatique contenant la CCAse.
Cela montre que cette fraction ne contient ni RNA-ligase, ni RNA polymérase-DNA
indépendante. Par ai,Heurs, nous n'avons jamais remarqué de différence, dans les
expériences d'hybridation, effectuées avec des tRNA marqués au a-[32p] CTP (avec
l'ATP froid) et avec ceux marqués au a-[32p]ATP (avec' du CfP froid) en utilisant le
même extrait de CCAse. Cela montre que le marquage obtenu n'est pas lié à la présence
d'une polyA polymérase incorporant spécifiquement de l'ATP.
L'ensemble de ces observations nous ont conduit à admettre que la préparation de CCAse
ne contenait pas d'autres activités enzymatiques susceptibles de provoquer des
marquages aspécifiques. Par conséquent, il est probable que les molécules de RNA qui
s'hybrident aux fragments de DNA cités plus i)aut, aient été effectivement marquées par
la CCAse,
2) LES MOLECULES MARQUEES SONT-ELLES DES tRNA ?
Le problème qui s'est posé à 'propos de ces rparquages éta~t de savoir si les
hybridations observées étaient liées à la présence ou non de gènes de tRNA. Il est donc
important de savoir si les molécules marquées par la CCAse sont exclusivement des
tRNA.
al Analyse de la fraction 4S marquée au a -[.32P1ATP à l'aide de la CCAse
Si l'on surexpose la fraction 45 extraite de la mitochondrie du maïs et marquée
à la CCAse et séparée sur gel de polyacrylamide monodimensionnelle, on observe le
profil montré sur la figure 40. L'analyse de ce profil montre que plusieurs molécules de
RNA (plus grandes que les tRNA) sont aussi marquées. Ces marquages sont très faibles
mais leur intensité concorde avec les signaux observés lors des hybridations de la
fraction 45 avec les fragments A et B. Ces "grands" RNA marqués ne sont pas présents
dans la fraction 4S purifiée sur une colonne RPC-S (fig.40).
bl Analyse des régions de DNA s'hybridant à la fraction 4S
Dans le chapitrelll-II, nous avons montré que certaines hybridations étaient
liées à la présence de séquences codant pour des rRNA. Dans ce paragraphe, nous nous
sommes focalisés sur les deux fragments codant pour des gènes de protéines (A et B).
L'intensité d'hybridation des RNA marquées à la CCAse avec ces fragments est très
faible. Plusieurs questions se posent:

---

5'
orf24 0
3'
1
h
l' s s s S S S S $ S S f S S S S S s S S S $ S S S S \\1
- lE FragmentA
1
x
St
B9
Ba
x
1
- h
3'
atp9
5'
J
Ir
l''V"
III ! 11111111111111
1
1
1
Fragment B
B
Bs
X
FIGURE 41 : Carte de resniction des fragments A et B
B: BarnHI; Ba: BanI; Bg: BglII; Bs: BstN1; Hd: H.indlI; St: SluI; X: Xhol
Les boites noires nommées h, i et j réprésentent les séquences homologues
entre les fragments A et B.
1 - - A --"- B ---'
r- A --..rB---j
1
1
1
=c:;~=o
Cl
CIl
-
<1)
.S
~~~~~
."
.:.'"
.:,
1100
930
570
470
340
200
a}
b}
FIGURE 42: Analyse des fragments A et B:
a)
Electrophorèse sur gel d'agarose 1.8% des
fragments de resniction des fragments A et B
b)
Hybridation des fragments de restriction avec
une sonde de tRNA mitochondriaux totaux marquée
au u- [32p]ATP à l'aide de la CCAse

---

78
ex) Y a-t-il des séquences communes entre les fragments A et B comportant
les gènes arp9 et urj240 ?
On peut penser que l'hybridation, observée sur les régions codant pour des
gènes de protéines est due aux mêmes RNA qui reconnaitraient alors une séquence
commune. Nous avons donc comparé les séquences nuc1éotidiques des deux fragments
A et B en utilisant le programme d'analyse de séquences WORDSEARCH (UWGCG).
Ces recherches ont révélé la présence de certaines homologies qui sont représentées sur la
figure 41. Aucune des séquences homologues ne se localise dans les parties codantes des
gènes atp9 et urf240.
/3) L'hybridation est-elle liée aux séquences communes?
Dans le but de mettre en évidence les parties de ces clones qui s'hybrident,
les fragments A et B ont été purifiés et analysés par restriction. Les fragments de
restriction ont ensuite été séparés sur gel d'agarose avant d'être transferés sur un filtre
Nylon. Ce filtre a été hybridé avec la fraction 45 marquée au a-[32P]ATP à l'aide de la
CCAse. Les résultats de ces hybridations sont montrés sur la figure 42
L'analyse de ces hybridations montre que dans les deux cas (A et B), les
hybridations sont confinées dans la partie codante des gènes. Par conséquent, elles ne
sont pas liées aux séquences communes aux deux fragments comportant les gènes atp9 et
urf240 puisque ces séquences sont localisées en dehors des parties codantes.
c) Hybridation des fragments A et B avec la fraction 45
Dans le but de savoir si les hybridations obtenues sur les fragments A et B sont
dues à des molécules de RNA différentes des tRNA mais contenues dans la fraction 4s
du RNA mitochondrial du maïs, nous avons fait l'expérience suivante:
La fraction 45 du RNA mitochondrial a été fractionnée par électrophorèse
monodimensionnelle sur gel de polyacrylamide et transféré sur filtre nylon (chapitre!).
Ce filtre a ensuite été hybridé avec des sondes radioactives constituées par les fragments
A et B purifiés. Le résultat de ces hybridations est montrés sur la figure 43. Les profils
d'hybridation obtenus montrent que pour le fragment B, il y a principalement une
molécule de RNA d'environ 150 nucléotides qui s'hybride. Cette molécule est beaucoup
plus grande que les tRNA et semble relativement abondante. Pour ce qui concerne le
fragment A, plusieurs molécules sont mis en évidence mais elles sont toutes plus grandes
que les tRNA. La taille des molécules révélées est compatibles avec les "grands RNA" de
la fraction 45 qui sont marqués par la CCAse.

---

a
b
c
FIGURE 43: Hybridation des fragments A et B avec la fraction 4s
du RNA mitochondrial:
a):
Electrophorèse monodimensionnelle sur gel de polyacrylamide 15%
en condition dénaturantes de la fraction 4s.
Les bandes de tRNA sont révélées par incubation du gel dans un
tampon contenant du Bromure d'éthidium.
b)
Hybridation du fragment A avec la fraction 4s
c)
Hybridation du fragment B avec la fraction 4s
.. -",:,,:
'
j

---

79
3) DISCUSSIONS
En résumant les expériences et les observations décrites plus haut, il apparait que
la CCAse est susceptible de marquer d'autres molécules de RNA de la fraction 4S
mitochondriale du maïs, différentes des tRNA. Ceci est confmné par le fait qu'il est
possible de séparer sélectivement les tRNA de ces molécules par fractionnement sur une
colonne hydrophobe RPC-5. Il faut cependant remarquer qu'aucune de ces molécules de
RNA n'est fortement marquée par la CCAse. Cela contraste avec la forte hybridation
obtenue pour les régions qui comportent des gènes de rRNA. Les ~olécules de RNA qui
s'hybrident aux gènes de rRNA ont très certainement le même comportement
électrophorétique que les tRNA mais elles sont probablement plus hydrophobes que ces
derniers car elles ne s'éluent pas à 1 M NaCl.
L'objectif de cette étude, c'est de montrer que toutes les hybridations obtenues en
utilisant une sonde constituée par la faction 4S marqués à la CCAse ne correspondent pas
forcément à des régions de DNA comportant des gènes de tRNA. Puisque toutes les
hybridations que l'on obtient en utilisant les tRNA totaux purifiés sur une colonne RPC-5
correspondent à des régions comportant des gènes de tRN~, pour l'étude de
l'organisation des gènes de tRNA mitochondriaux nous n'avons tenu compte que des
fragments de DNA qui s'hybrident dans ces conditions.
. En ce qui concerne les hybridations non-spécifiques, on peut penser qu'il s'agit
de pseudo-gènes de tRNA ou de gènes de tRNA comportant des introns. Cependant,
comme nous l'avons démontré dans le cas du gène de tRNAAla chloroplastique, dans nos
conditions d'hybridation (65°C, 1 M NaCl, 1% SDS), il est impossible de détecter une
hybridation avec la moitié d'un gène de tRNA. Aucun exon ne peut donc être détecté
dans des conditions d'hybridation aussi stringentes. Par conséquent, ces hybridations ne
sont pas liées à la présence de pseudo-gènes ou de gènes morcelés. Reste alors la
possibilité qu'il puisse y avoir des gènes codant pour des tRNA bizarres. Sans l'exclure,
nous n'avons aucune donnée permettant de supposer cette possibilité. Seule, l'analyse
complète des tRNA mitochondriaux peut confinner ou infinner cette possibilité.
De même, il est difficile de concevoir que les hybridations observées soient dues
au fait que des tRNA mitochondriaux reconnaissent des séquences contenues dans les
gènes de rRNA par exemple. Même si on admet la théorie de BLOCH (BLOCH et
coll.,1983; BLOCH et coll., 1985) suivant laquelle les tRNA et les rRNA auraient une
origine commune et par conséquent partageraient plusieurs séquences communes, on ne
peut pas expliquer pourquoi les tRNA élués de la colonne RPC-5 à 1 M NaCI ne
s'hybrident pas aux gènes de rRNA. Nous pensons plutôt que ce sont, dans ce cas-là,
soit des produits de dégradation des rRNA qui sont marqués par la CCAse soit des
molécules de RNA dont la structure est proche de celle des tRNA mais qui sont plus
hydrophobes que ces derniers. Ces molécules auraient aussi des homologies de séquence

---

80
avec les rRNA. On se rapprocherait du cas observé dans le RNA du virus de la mosaïque
jaune du navet (TYMV) décrit par HAENNI et coll. (1982) qui est en effet, capable
d'incorporer le CfP et l'ATP en présence de la CCAse. Cependant, il semble que les
situations soient différentes car le fait que les RNA marqués à la CCAse puissent
s'hybrider indifféremment à tous les gènes de rRNA (mitochondriaux et
chloroplastiques) implique qu'il y a plusieurs molécules de RNA différentes qui sont
concernées. En effet, le contraire supposerait qu'il y ait des homologies de séquences
entre les rRNA 23S/ 26S avec les rRNA 16S/ 18S ou 5S/ 4,5S ce qui n'a jamais été
rapporté. Par ailleurs, on observe des hybridations avec des gènes qui n'ont aucune
homologie de séquence. Ceci renforce l'idée suivant laquelle plusieurs molécules de
RNA différentes sont concernées par le phénomène.
A partir de ces informations, on peut émettre l'hypothèse selon laquelle, la CCAse
marque les tRNA de manière très spécifique, mais est peut-être aussi impliquée dans
d'autres processus biologiques propres à la mitochondrie. L'enzyme que nous avons
utilisée est extraite de la levure et plusieurs exemples d'enzymes polyfonctionnels codés
par le noyau et actifs dans la mitochondrie de la levure ont été décrits (LABOUESSE et
coll., 1987). Il ne serait donc pas étonnant que la CCAse puisse avoir d'autres rôles dans
le cas de la mitochondrie végétale notamment, même s'ils sont mineurs.

---

CHAPiTRE IV
CONCLUSiONS GENERALES SUR LES GENES DE
~RNA MliTOCHONDRiAUX DUJ MAiS

---

8 l
1. ORIGINES DES GENES MITOCHONDRIAUX
Du point de vue évolutif, le degré de parenté entre différents organismes ou entre
des gènes homologues provenant de diverses espèces, s'évalue généralement à l'aide de
la distance génétique qui est une valeur calculée à partir de différents paramètres
génétiques. Une des composantes essentielles de la distance génétique est la similarité
entre les gènes étudiés. Dans le cas des gènes de tRNA, cette similarité est évaluée à
travers le pourcentage d'homologie qui est lui même déterminé en faisant le rapport entre
le nombre de nucléotides conservés (entre différents gènes homologues) et le nombre de
nucléotides que comptent ces gènes. Le résumé des différentes homologies trouvées entre
les gènes de tRNA mitochondriaux du maïs et les gènes de tRNA bactériens et
eucaryotiques (nucléaires, mitochondriaux et chloroplastiques) est représenté sur le
Tableau G. L'analyse de ce tableau révèle deux caractéristiques:
1°) Si on compare les gènes de tRNA mitochondriaux du maïs aux tRNA
correspondants des autres organismes, on constate qu'ils sont en moyenne plus proches
des tRNA chloroplastiques (homologie supérieure à 75%) et bactériens (environ 75%)
qu'ils ne le sont des tRNA nucléaires (environ 60%) et des tRNA des mitochondries
d'animaux, d'algues et des champignons (homologie généralement inférieure à 50%).
Les gènes de tRNA de la mitochondrie du mais ont donc une nature procaryotique.
2°) Ces gènes mitochondriaux peuvent être classés en deux grands groupes:
a) Les gènes mitochondriaux rrès homologues à leurs équivalents
chloroplastigues: (entre 95 et 100%)
Il s'agit en l'occurrence des gènes de tRNAAsn, tRNAPhe, tRNA mMeL 2,
tRNAHis, tRNACys et tRNATrp. A la suite des différentes analyses effectuées sur ces
gènes (voir chapitre II), il est clair que ce sont en fait des gènes chloroplastiques qui ont
été insérés dans le DNA mitochondrial et qui ont évolué pour être fonctionnels dans la
mitochondrie.
b) les gènes mitochondriaux moyennement homologues à leur éguivalents
chloroplastigues : (entre 65 et 75%)
Dans ce groupe, on retrouve la majorité des gènes de tRNA mitochondriaux à
savoir les gènes de tRNAAsp, tRNAGln, tRNAGlu, tRNALys, tRNAfMet, tRNAPro,
tRNASer(UGA), tRNASer(GCU) et de tRNATyr. Ces gènes sont dans l'ensemble plus
proches des gènes bactériens que des gènes chloroplastiques.
Une seule exception à cette classification: le gène de tRNAmMeq qui est très
éloigné des gènes chloroplastiques et des gènes bactériens «50%). Ce gène pourrait
constituer une troisième classe de gènes de tRNA mitochondriaux.
En se basant sur les homologies et sur la classification précédente, on peut
soutenir l'hypothèse suivant laquelle les gènes de tRNA mitochondriaux de plantes
supérieures dérivent d'une part d'ancêtres procaryotiques et d'autre part de gènes

---

TABLEAU G
Homologies de séquences entre les gènes de tRNA mitochondriaux
du maïs et leurs homologues d'autres organismes procaryotiques
et eucaryotiques
Gènes
Gènes
Gènes
Autres gènes
Gènes d'
mt Maïs
nucléaires
cp
mt
eubactéries
Animaux
algues champignons
Asp
50.7
72
<50
..
55
71
.
Asn
50-100
98
52
60
65
..
Cys
<50
95
<50
40
65-88
Gin°
<50
75
<50
76
<50
75
Glu
65
65
<50
..
70
73
-
His
<50
98
<50
..
50
65
Lys
73
75
<50
..
60
75
fMet
<50
71
52
<50·
61
71
mMet·1
<50
<50
<50
<50·
61
60
mMet·2
<50
95
<50
50·
60
50
..
Phe
64
98
<50
60
73
Pro
52
75
51
"
<50
73
..
Ser(GCU)
65
63
<50
<30
61
..
Ser(UGA)
54
72
<50
<50
67
Trp
50
98
<50
52
52
63
Tyr
..
56
67
55
<50
67
Les homologies sont exprimées en pourcentage et les chiffres représentent des
moyennes calculées à partir des séquences de plusieurs gènes homologues.
Le petit cercle (0) indique les gènes de tRNA séquencés dans la mitochondrie du blé et
localisés dans le maïs par hybridation avec des oligonucléotides. La transcription de
ces gènes a été confirmée dans le maïs par hybridation des plus petits fragments les
comportant avec les tRNA totaux extraits de la mitochondrie du maïs.
L'étoile (.) signifie que les trois gènes trnM ont été comparés au même gène trnM de
de la mitochondrie de Chlamydomonas reinhardtii. Le signe (") indique qu'il n'y a pas
de gène correspondant publié dans la littérature.

---

chloroplastiques. Cette hypothèse est en faveur de la théorie endosymbiotique des
organites cellulaires et confirme l'idée désormais acquise du transfert de matériel
génétique entre les organites. Si on analyse les homologies des gènes mitochondriaux
des plantes supérieures par rapport aux gènes mitochondriaux des autres
embranchements, on voit qu'il est difficile de comprendre comment ces gènes
proviendraient du même événement endosymbiotique. Il y a en effet une très grande
différence entre les gènes des mitochondries des animaux, champignons et algues d'une
part et des plantes supérieures d'autre part. Il semble que les gènes du premier groupe
aient évolué pendant plus longtemps et/ou plus vite par rappon aux gènes procaryotiques
d'origine que ceux du deuxième groupe. De telles observations ont déjà été faites par
GRAy sur les gènes de rRNA (GRAY et coll., 1989) et d'après cet auteur, la grande
distance évolutive entre les gènes mitochondriaux des plantes supérieures et ceux des
autres mitochondries (algues, champignons, animaux) s'explique par le fait que l'ancêtre
des végétaux supérieurs aurait subit une deuxième endosymbiose. Cet événement serait
intervenu après la divergence entre les algues vertes et les végétaux supérieurs (fig.44).
Cette explication cadre parfaitement avec ce que l'on observe dans le cas des gènes de .
tRNA. En effet, dans la logique de deux endosymbioses successives, la présence de
deux génomes entraînerait (selon GRAY), une compétition entre le nouveau matériel
génétique (future mitochondrie) et l'ancien (issue de la première endosymbiose). Le
résultat de cette compétition serait alors l'élimination ou le transfen vers le noyau de
plusieurs gènes. Ceci pourrait évidemment provoquer un déficit en information génétique
dans les mitochondries des plantes supérieures. Dans le cas des gènes de tRNA, il
semble que tous les gènes issus de la première endosymbiose aient été éliminés. Le seul
vestige de ces anciens gènes de tRNA pourrait être le gène de tRNAmMeL I décrit par
PARKS. Ce qui explique la position complètement atypique de ce gène dans le tableau
d'homologie. Cependant, la compétition entre les deux matériels génétiques a peut-être
aussi pu entraîner la perte de gènes de tRNA "nouvellement acquis" après la deuxième
endosymbiose. La conséquence de cene perte est que la mitochondrie pourrait ne pas
posséder tous les gènes dont elle a besoin. A partir du moment où ce besoin existe, tous
les événements cellulaires et moléculaires pouvant permettre la "capture de nouveaux
gènes" seront favorisés dans l'organelle; d'où la mise à profit des évenements entraînant
l'insertion de séquences chloroplastiques dans le génome mitochondrial. De cette
manière, les gènes de tRNA chloroplastiques susceptibles de completer l'ensemble des
gènes existant déjà dans la mitochondrie subissent une pression de sélection favorable à
leur mise en fonction.
Nous avons décrit dans notre étude un certain nombre de gènes
mitochondriaux d'origine chloroplastique qui sont fonctionnels. Il est très intéressant de
noter à ce sujet la complémentarité presque parfaite entre les gènes de tRNA

---

blzher
Q.ÙlD.U
FIGURE 44: Arbre phylogénétique montrant les deux endosymbioses
probables qui seraient à l'origines des mitochondries.
( GRAY et coll., 1989 )
Première endosymbiose qui est admise comme étant à l'origine de toutes les
mitochondries.
Deuxième endosymbiose qui, selon GRAY, serait à l'origine des
mitochondries végétales, si l'on se base sur les homologies des rRNA .

---

83
chloroplastiques
qui sont encore non fonctionnels (contenus en particulier dans
l'insertion de 12 kb chloroplastique) et les gènes existant déjà dans la mitochondrie. Si
l'évolution suit son cours, on peut penser que ces gènes deviendront fonctionnels (voir
figure 38, chapitreIlI-ILB). Cette évolution serait certainement plus économique
(énergétiquement) pour la mitochondrie qui éviterait ainsi d'importer ces tRNA ce qui est
le cas actuellement (cf paragraphe suivant). Le seul gène dont on n'a trouvé aucune trace
(même comme gène inactif ou comme pseudo-gène) chez aucune plante reste le gène de
tRNAThr. Il est par conséquent possible que le tRNA correspondant soit importé dans la
mitochondrie de la plupart des plantes étudiés.
2.LE CODE GENETIQUE DANS LA MITOCHONDRIE DU MAIS
Selon la théorie du Wobble (CRICK, 1966), le nombre minimum d'anticodons
(donc de tRNA différents) nécessaires pour assurer la synthèse protéique est de 32.
Cependant, dans les mitochondries animales et de champignons, on ne trouve pas autant
de gènes de tRNA. Une autre théorie dite du "two out of three" a été proposée
(LAGERKVIST, 1978), selon laquelle, pour l'utilisation des codons dans le cas des
cases contenant 4 codons (tableau H), seuls les deux premiers nucléotides de ces codons
seraient indispensables. Cette théorie ramène le nombre minimal de tRNA différents
indispensables à 23; ce qui est en accord avec le nombre de gènes de t~~A trouvés dans
les mitochondries animales et fongiques (SIBLER et colL, 1986). Dans la mitochondrie
du maïs, le nombre de gènes de tRNA différents identifiés s'élève à 16. La détermination
de ce nombre repose sur l'hybridation de sondes spécifiques (tRNA marqués à la
CCAse) et/ou par le séquençage des gènes mis en évidence par ces hybridations. Ces 16
gènes correspondent à 13 acides aminés (cf tableau H) et portent 14 anticodons
différents. Par conséquent, la mitochondrie du maïs a besoin au minimum de 9 gènes de
tRNA supplémentaires pour mener à bien sa synthèse protéique. Logiquement, si ces
~. . .
gènes ne sont pas codés par la mitochondrie, c'est que les tRNA correspondants sont
importés dans l'organite. Le cas des tRNALeu imprtés dans la mitochondrie du haricot
(GREEN et coll., 1987; MARECHAL-DROUARD et coll., 1988) illustre cette situation.
Pour avoir une première information, nous avons effectué l'hybridation des
tRNA totaux extraits de la mitochondrie de maïs et purifiés sur une colonne RPC-5, avec
des fragments de restriction du DNA nucléaire du maïs. Les résultats de ces hybridations
sont montrés sur la figure 45. Au total, 4 fragments de restriction différents sont révélés
.
.
par les tRNA totaux mitochondriaux. Dans la mesure où ces hybridations correspondent
réellement à la présence de gènes de tRNA sur ces fragments nucléaires (nous avons vu
que n'est pas toujours le cas), ces résultats confinnent d'une part que tous les tRNA
mitochondrlaux ne sont pas codés par le DNA mitochondrlal et d'autre part, que certains
tRNA sont importés dans l'organite. Cependant, ces hybridations restent des indications

---

TABLEAU H:
Codons pour lesquels un gène de tRNA a été
identifié dans la mitochondrie du maïs.
···U UU ·······Ph ...
.:.:.
::.:.:~.:.:.
e .:.:.:
:.:.:.::::::::.(GAA):.:.:.:.:.:.:.:.:.:.
,·"·"'·C
···UU
..
--
._-------------_.
---
-._--_
.-----_ ....
.... ----
--.- ..
..
... _-_ .. _.. _--- •.....•...•..
UUA
Leu
(UAA)
UUG
..
..
.-
----- .. --- .. -.- .•..............
CUU
Leu
CGU
Arg
(GAG)
(GCG;
CUC
CGC
(!)
(!)
CUA
§
CGA
g
(UAG)
(uCG)
CUG
CGG
AUU
Ile
(GAU)
AUC
:;:)
AUA ("CAU) §
( UAU)
:::~j:tiG:~[~l~rM~t.~::~
.. _-
-.
---
GUU
Val
GCU
Ala
GGU
Gly
(GAC)
(GGC;
(GCC)
GUC
GCC
GGC
(,)
(,)
GUA
§
GCA
g
GGA
(UAC)
(UGC)
(ucC)
GUG
GCG
GGG
~:i=~:Z-:3
Codons correspondant à des tRNA homologues à leurs équivalents chloroplastiques
(95-100% )
.
~"\\."\\.~
Codons correspondant à des tRNA moyennement homologues à leurs équivalents
chloroplastiques (60-75% )
Codons pour lesquels aucun gène de tRNA n'a été identifié
Les anticodons représentés entre parenthèses sont ceux qui peuvent déchiffrer le code suivant
la théorie du Wobble alors que les anticodons nécessaires pour la lecture du code selon la
théorie du "two out of three" sont représentés en gras (verticalement)

---

·'
..,
>15
"
10
~.. " .'.
5
...
.. ..
>15
W'
a.
4
10.
~
5
4
•
0.5
..'
a
b
FIGURE 45: Hybridation des tRNA mitochondriaux totaux avec des
fragments de restriction du DNA nucléaire du maïs
a) Longue migration du gel d'agarose 0.7%: plus de 24 heures à 50V
b) Migration 15 heures à 50V
Les tailles sont indiquées en kb

---

FIGURE 46 : Séquences consensus trouvées en amont de différents gènes de tRNA
Gènes de tRNA
Espèces
Différents
Séquences
consensus
trouvés
trnC (GCA)-l
Maïs
AAGTCAAGAATAATAA
trnC (GCA)-2
Tomate
cons-l
GAAGGAAGAACl\\ACCG
cons-2
AGAAAAAGAAGGAGCG
trnD (GUC)
Blé
TATATMGAAAAGTAC
trnE(UUC)
Maïs
ATAGAAAGAAAAGGAA
Blé
ATAGAAAGAAAAGGAA
Soja
ATATGAAGAATGGCTT
trnF (AAA)
Maïs
TGCACAAGAAATGGTC
trnG (GCC)
Lupin
GAAAAAAGAGAAGTCG
trnH (GUC)
Maïs
GAAAAAAGAGAAAATC
trnK (UUU)
Maïs
cons-l
ATGATAAGAAGAAGAA
cons-2
ATAAGAAGAAAAGGGG
trnM(CAU)
Lupin
AAGAAAAGAAAGAGAA
Soja
CGAGTAAGAA}.ATAAG
Oenothera
AGTGAAAGAAGAGAAG
trnM (CAU)-2
Soja
GGTTTAAGAAGGAGGC
Arabidopsis
CAAAAAAGAAAGAAA4
trnN(GUU)
Lupin
TTACGAAGGAAACTTC
Phaseolus vulgaris
TGTCC~hGAACr-~GAG
Maïs
GTCCAAAGAACGAGCA
Blé
GGCCAAAGAACGAGAG
trnP (UGG)
Blé-l
GTAAGAAGAACGAGAG
Blé-2
cons-l
CAAGCAAGAAAAAGGT
cons-2
CGAAAAAGAA;.ACCTA
trnQ(UUG)
Blé-l
TTCGTAAGAAAGAACT
Blé-2
CGGGAAAGAAGGAbGA
trnS (GCU)
Blé
CAGTAAAGAAGAGTAC
Mars
CAGTAAAGAAGAGTAC
trnS (UGA)
Blé
ACTACCGGAAAAGTGT
Maïs
cons-l
ACTACCGGA&~AGTGT
cons-2
TCATATAGAAAGAAGC
cons-3
ACTTAAAGAA~GGGGG
trnS (GGA)
TATCAAAGAAAGTTCG
trnW(CCA)
Blé
GGCGTAAGAAAGCGCT
Maïs
G------GAAAGCGCT
trnY(GUA)
Blé
AACTTAAGAACGAAGG
Maïs
AGAATMGAACGAAGG
CONSENSUS
AAGAANRR
Les différentes séquences consensus sont trouvées à des distances diverses du début des différents
gènes. Pour le gène trnP, blé-l et blé-2 désignent des séquences consensus n:ouvées en amont de
2 gènes identiques qui sont dans 2 environnements différents. Pour le gène trnQ ces mêmes
appellations désignent 2 gènes qui diffèrent en plus d'un nucléotide.

---

84
grossières car elles peuvent paradoxalement constituer en même temps une surestimation
et une sous-estimation du nombre de gènes de tRNA nucléaires dont les produits
d'expression sont destinés à la mitochondrie: En effet, le même gène peut se retrouver
dans plusieurs environnements nucléotidiques différents et dans ce cas, plusieurs
fragments de restriction peuvent le poner. Cela conduit à une sur-estimation. A l'opposé,
la présence de plusieurs gènes différents sur le même fragment peut conduire à en sous-
estimer le nombre.
Ainsi, on peut penser que plusieurs tRNA sont imponés dans la mitochondrie du
maïs même si on n'en connait pas le nombre exact. Ceci expliquerait alors le fait que
seulement 14 gènes différents soient trouvées dans le génome mitochondrial.
Restent cependant encore deux ambiguïtés dans le code génétique de la
mitochondrie du maïs: ce sont des cas des gènes tRNAMeL 1 et de tRNATrp. En effet,
nous ne savons pas si le tRNAMeL 1 est spécifique de la méthionine ou de l'isoleucine.
De même, l'ambiguïté concernant le codon CGG qui spécifierait l'arginine et/ou le
tryptophane persiste. Rappelons que le tRNATrp trouvé dans la mitochondrie de haricot
(MARECHAL et coll., 1987) compone l'anticodon CCA et qu'un gène correspondant à
ce tRNA a été localisé sur le réplicon linéaire de 2.3 kb du maïs (MARECHAL et coll.,
1987 ; BEDINGER et coll., 1986).
On peut donc supposer que, bien que des tRNA de spécificités complémentaires à
ceux codés par la mitochondrie soient importés du cytoplasme, il existe probablement
dans le système de synthèse protéique mitochondriale, d'autres mécanismes de
reconnaissance codon-anticodon permettant le déroulement de la traduction. Signalons à
cet effet que dans le cas des deux cases à 4 codons pour lesquelles il existe un tRNA codé
par le génome mitochondrial du maïs (tRNAPro, tRNASer), la première lettre de
l'anticodon est un U, ce qui est aussi en accord avec l'hypothèse de LAGERKVIST
(tableau H).
3. SIGNAUX DE TRANSCRIPTION DES GENES DE tRNA
MITOCHONDRIAUX
al Recherche de séquences consensus dans les régions flanquantes des gènes de
tRNA
Dans le chapitre traitant des gènes de tRNA, nous avons noté la présence d'une
séquence riche en purine: 5' AAGAANRR 3' en amont de.s gènes de tRNA. Cette
séquence est apparue lors d'une analyse faite sur plusieurs
gènes de tRNA
mitochQndriaux de blé (JOYCE et coll., 1988-b) et on la retrouve devant la majorité des
gènes de tRNA mitochondriaux publiés dans la littérature (fig.46). Cependant, les
séquences retrouvées ne s'alignent pas toutes à 100% avec cette séquence et on retrouve
~ : :;
souvent d'autres séquences beaucoup plus riches en purines en amont de cenains gènes.

---

FIGURE 47: Alignement des séquences codantes des gènes de tRNA
mitochondriaux du maïs
1
10
20
30
40
50
60
70
Trp
GCGCTCT TA GTTC AGTTCGGT .. A GAAC G TGTGT CTCCAAA ACCCA .... C GTAGG TTCAAAT CCTAC AGAGCGT G
SerUGA GGATGGA TG ICTG AGC .. GGTTGA AAG~G TCGGT CTTGAAA ACCGA. '"
C GGGGG TTCGAAT CCCTC TCCATCC G
SerGCU GGAGGTA TG GCTG AGT .. GGCTTA AGGC A TTGGT TTGCTAA ATCGA .... C ATGGG TTCGAAT CCCAT TTCCTCC G
Pro
CGAGGTG TA GCGC AGTCTGGTC.A GCGC A TCTGT TTTGGGT ACAGA
C ATAGG TTCGAAT CCTGT CACCTTG A
Phe
GTCAGGA TA GCTC AGTT.GGT .. A GAGC A GAGGA CTGAAAA TCCTC
C ACCAG TTCAAAT CTGGT TCCTGGC A
Met2
ACCTACT TG ACTC AGC .. GGTT.A GAGT A TCGCC TTCATAC GGCGA .... C ATTGG TTCAAAT CCAAT AGTAGGT A
Metl
GGGCTTA TA GTTT AATT.GGTT.G AAAC G TACCG CTCATAA CGGTG .... T GTAGG TTCGAGC CCTAC TAAGCCC A
fMet
AGCGGGG TA GAGG AATT.GGTC.G ACTC A TCAGG CTCATGA CCTGA
T GCAGG TTCGAAT CCTGT CCCCGCC T
Lys
GGGTGTA TA GCTC AGTT.GGT .. A GAGC A TTGGG CTTTTAA CCTAA
C GCAGG TTCAAGT CCTGC TATACCC A
His
GGCGGATG TA GCCA AGT .. GGATCA AGGC A GTGGA TTGTGAA TCCAC
C GCGGG TTCAATT CCCGT CGTTCGC C
Glu
GTCCCTT TC GTCC AGT .. GGTT.A GGAC A TCGTC TTTTCAT GTCGA .... C ACGGG TTCGATT CCCGT AAGGGAT A
Gln
TGGAGTA TA GCCA AGT .. GGT .. A AGGC A TCGGT TTTTGGT ATCGG .... C AAAGG TTCGAAT CCTTT TACTCCA G
Cys
GGCGGCA TG GCCA AGC .. GGT .. A AGGC A GGGGA CTGCAAA TCCTT
C CCCAG TTCAAAT CTGGG TGTCGCC T
Asn
TCCTCAG TA GCTC AGT .. GGT .. A GAGC G GTCGG CTGTTAA CTGAC
C GTAGG TTCGAAT CCTAC TTGGGGA G
Asp
GGGGAAA TA GCTC AGTT.GGTT.A GAGT G CTGGT CTGTCAC GCCAG
C GCGGG TTCGAAC CCCGT TTTCCCC G
Tyr
GGGAAGG TG GCCG AGC .. GGTCAA AAGC G ACAGA CTGTAAA TCTGT
C GTAGG TTCGAAT CCTGC CCTTCCC A
CONSENSUS
TR RYYN ARY .. GGir
R RRRY R
C
RG TTCRANY CY
R
TR RYNN ARY .. GG
GG TTCRANT CC
BOITE A
BOITE B
Les boites A et B représentent les promoteurs internes des gènes de tRNA nucléaires et de certains gènes chloroplastiques.
Les nucléotides faisant exception à la séquence consensus sont soulignés. Le gène trnH comporte 8 nucléotides appariés dans
le bras de l'aminoacide.

---

85
Dans la mesure où aucune donnée expérimentale n'a été publ,iée concernant cette
séquence consensus, celle-ci n'est valable qu'à titre indicatif. De plus, les différentes
séquences consensus retrouvées sont situées à des distances très variables du gène lui-
même, qui vont de 0 nucléotides dans le cas du gène de tRNAPhe (chap.III.II.B) à plus
de 400 nucléotides pour le gène de tRNASer(UGA) (chapitre II.II.A). En dehors de cette
séquence 5' AAGAANRR 3', aucune autre homologie n'est décelable dans les régions en
amont des différents gènes de tRNA. La même situation existe en aval des gènes de
tRNA où aucun signal commun n'est observé. Dans certains cas, comme celui du gène
de tRNASer(UGA), on remarque de courtes séquences répétées directes ou inverses,
mais les structures secondaires que l'on peut déduire à partir de ces répétitions ne sont
pas thermodynamiquement stables. On peut donc difficilement leur assigner des rôles de
stabilisateur ou de signaux de terminaison des transcrits (STERN et coll., 1987).
b) Recherche de promoteurs internes
L'absence de mise en évidence de véritables signaux d'initiation de la
transcription des gènes de tRNA à l'image de ceux qui sont retrouvés devant les gènes
procaryotiques ou de mitochondrie de levure, nous a incité à analyser les régions
codantes de ces gènes. Dans les noyaux des cellules eucaryotes (SHARP et coll., 1985)
et pour certains gènes chloroplastiques (GRUISSEM et coll., 1986), la transcription des
gènes de tRNA se fait à partir de promoteurs internes constitués par deux blocs de
séquence nommées boites A et boites B. Les nucléotides impliqués dans la constitution
de ces blocs sont indispensables à la fois pour la transcription et la structure tertiaire de la
molécule de tRNA (Pour une revue, voir SHARP et coll., 1985).
Nous avons recherché ces blocs de séquences dans les gènes de tRNA de la
mitochondrie du maïs. L'alignement de ces gènes ainsi que les séquences consensus qui
en découlent sont montrés sur la figure 47. On peut constater sur cette figure que les
gènes mitochondriaux comportent eux aussi les boîtes A et B. Quelques déviations sont
observées dans la boîte A, mais la boîte B est très conservée.
La transcription des gènes de tRNA nucléaires est assurée par la RNA
polymérase III (FOLK et coll., 1982). Cette polymérase reconnait les promoteurs
internes A et B mais il semble que certains éléments extérieurs aux gènes soient aussi
impliqués dans l'initiation de la transcription des gènes de tRNA (DINGERMANN et
coll., 1982). Le fait qu'on retrouve les séquences correspondantes au promoteurs
internes dans les gènes de tRNA mitochondriaux amène à se demander si la RNA
polymérase III est impliquée dans la transcription des gènes de tRNA mitochondriaux.
Cette question mérite d'être posée car en plus des séquences rappelant celles des
promoteurs internes des gènes nucléaires, certaines observations ont été faites qui vont
j . '
dans le sens de cette hypothèse. Le cas le plus remarquable est celui du gène de tRNAAsn

---

86
du noyau de pétunia. En effet, BAWNIK et coll. (1983) ont démontré que ce gène de
tRNAAsn était transcrit in vitro par la RNA polymérase III. Or, ce gène est identique à
son homologue de la mitochondrie et comporte non seulement les boites A et B mais
aussi une séquence 5' AAGAANRR 3' située entre les nucléotides -38 et -30 (inclus).
Les gènes de tRNAAsn mitochondriaux qui lui sont homologues conservent aussi la
séquence 5' AAGAANRR 3'. Il serait donc important de voir si les gènes
mitochondriaux peuvent aussi être transcrits in vitro par la RNA polymérase III. On peut
signaler, par ailleurs les analyses faites par MARTIN et coll. (1987), montrant qu'il n'y a
pas plusieurs activités RNA polYmérasiques dans la mitochondrie du blé.
4. CONCLUSIONS
Un certain nombre de caractéristiques concernant les gènes de tRNA de la
mitochondrie du maïs peuvent être dégagées à l'issue de cette étude:
- Le génome mitochondrial ne code pas pour tous les gènes de tRNA nécessaires à
la synthèse protéique dans l'organite
- L'organisation des gènes de tRNA varie d'un génome à l'autre mais leurs
séquences sont toutes très conservées
- Il n'y a pas de déviation notable dans la structure secondaire des tRNA par
rapport au modèle classique en feuille de trèfle. Dans la majorité des cas, les nucléotides
invariants et semi-invariants sont conservés
- Aucun gène ne code pour la séquence CCA 3' terminale
- Ces gènes de tRNA ne sont pas organisés en familles. Ils sont tous indépendants
les uns des autres. Les plus proches (les gènes de tRNAAsp et de tRNAmMeLl) sont
codés par deux brins opposés. Leur expression n'est certainement pas coordonnée non
plus. Cependant, il est possible que certains gènes soient compris dans de grandes unités
de transcription et soient par conséquent co-transcrits avec des gènes de protéines (gène
de tRNAmMeL 2 par exemple).
- Aucun gène de tRNA ne contient un intron
- Il n'y a pas de séquence consensus typique en amont et en aval des gènes. La
seule séquence trouvée en amont (5'A AGAANRR 3') n'est pas retrouvée de manière
stricte devant tous les gènes. De plus cette séquence se retrouve assez fréquemment
ailleurs dans des régions totalement indépendantes des gènes de tRNA.
- On retrouve des séquences homologues aux promoteurs internes des gènes de
tRNA des noyaux eucaryotiques
- Le noyau code vraisemblablement pour une partie des gènes de tRNA
mitochondriaux. Il s'agit essentiellement de gènes codant pour les tRNA correspondants
à des acides aminés qui peuvent être spécifiés par 3, 4 ou 6 codons. Les deux exceptions
constituent les gènes de tRNAPro et de tRNASer.

---

\\-

---

87
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---

99
INTRODUCfION
1
CHAPITRE 1 : MATERIELS ET METHODES
1. Matériel d'étude; le maïs
6
II. Purification des acides nucléiq ues
6
A. Extraction des acides nucléique mitochondriaux
6
1. Principe
6
2. Purification des mitochondries
7
a) Croissance des plantes
7
b) Broyage
7
c) Centrifugations différentielles (Kolodner et
Tewari, 1972)
7
d) Purification des mitochondries sur gradient de
saccharose
8
3. Lyse des mitochondries et extraction des acides
n ucléiq ues
8
4. Purification des acides nucléiques
:
9
a) Purification des RNA de haut poids
moléculaire
9
b) Purification des tRNA
9
a) Dégradation du DNA
9
(3) Purification des tRNA par
.
chromatographie
;
9
5. Dosage des RNA
10
6. Analyse des RNA par électrophorèse
.1 0
a) Fractionnement des RNA de grandes tailles
10
b) Fractionnemen t des tRNA
11
B. Extraction du DNA nucléaire
.12
C. Extraction des tRN A chloroplastiques
12
1. Isolement des chloroplastes
12
2. Purification des tRN A
13
III. Méthodes de clonage et analyse des acides nucléiq ues
13
A. Méthodes de clonage
13
1. Réalisation et criblage des mini-banques
13
a) Digestion du DNA par les enzymes de
restriction
13
b) Analyse des fragments de restriction par
électrophorèse sur gel d'agarose
.14
c) Ligation des fragments de restriction avec le
vecteur de clonage
14
d) Transformation d'E.coli par les plasmides
recombinants
15

---

100
a) Souches d'E.coli utilisées
15
~) Transformation des bactéries par la
méthode de Hanahan
15
- Préparation des cellules
compétentes
15
- Transformation
16
- Sélection des bactéries
transformées
16
· Le vecteur M 13
16
· Principe
17
· Culture et sélection des cellules
recombinantes
17
e) Analyse des clones recombinants
.1 7
a) Analyse des phages
.1 8
- Analyse directe
18
- Analyse des phages après
purification du DNA
18
- Hybridation croisée des DNA
phagiques
19
~) Analyse des plasmides
19
- Méthodes de purification des
plasmides
19
· Méthode alcaline
19
· Méthode du lysat clair
.20
'Y) Autres méthodes de criblage de la mini-
banq ue
20
- Criblage par analyse des profits de
restriction
20
- Criblage par hybridation
21
2. Clonage de fragments purifiés
.2 1
a) Purification des fragments de restriction
21
a) Utilisation de gel d'agarose à basse
température de fusion
21
~) Filtration des morceaux d'agarose
contenant du DNA
22
b) Clonage des fragments purifiés
22
3. Sous-clonage des fragments de DNA en vue de leur
séquençage
22
a) Sous-clonage basé sur la cartographie de
restriction
22
b) Utilisation d'oligonucléotides de synthèse
.22
c) Sous-clonage par la technique du cyclone
23
B. Techniques de marquage radioactif des sondes
23
1. Marquage du DNA
23
a) Marquage à partir de DNA simple brin
23

---

l 0 l
b) Marquage du DNA double brin
24
c) Marquage des oligonucléotides de synthèse
24
2. Marq uage des tRNA
25
a) Marquage à l'extrémité en 3' à l'aide de la T4
RNA ligase
25
b) Marquage à l'extrémité 3' à l'aide de la tRNA
nucléotidyl
transférase
25
C) Techniques de transfert et d'hybridation
26
1. Méthodes de transfert
26
a) Transfert des acides nucléiques par capillarité
26
b) Transfert des tRNA sur membrane nylon
2 7
2. Techniques d'hybridation
2 7
a) Membranes comportant des fragments de
DNA
27
ex) Préhybridation
2 7
~) Hybridation
28
y) Lav age
28
b) Membranes comportant du RNA
28
c) Membranes comportant des tRNA
:
29
D. Séquençage du DNA
29
1. Principe
29
2. Les réactions
29
a) Hybridation de l'amorce
29
b) Elongation et arrêt de la synthèse
30
c) Electrophorèse verticale sur gel de
polyacrylamide
3 0
d) Analyse des séquences nucléotidiques
.30
Chapitre II : ETUDE DES GENES DE tRNA MITOCHONDRIAUX
DU MAIS
I. Détermination des cosmides portant des gènes de tRNA
31
A) Cartes de restriction des génomes mitochondriaux B37-N
et B37-cms T
3 1
B) Localisation des gènes de tRNA sur les cercle-maîtres des
génomes
N et T
32
1) Analyse des tRNA mitochondriaux
.3 2
a) Analyse sur gel d'agarose de la fraction 4S du
RNA mitochondrial.
32
b) Absence de contaminants chloroplastiques
32
2) Hybridation des tRNA mitochondriaux totaux
32
..'
(
iL
(,

---

102
Il. Séquençage et analyse des gènes de tRNA
34
A) Etude du gène de tRNA du cosmide 9-3HIO
34
1. Présentation du cosmide
34
2. Analyse du cosmide 9-3HI0 et identification du
fragment portant un gène de tRNA
34
3. Sous-clonage et séquençage du clone C7-20
35
4. Analyse du gène de tRNASer(UGA)
35
CI) Analyse de la partie codante du gène
35
~) Etude des régions flanquantes du gène de
tRNASer(lJGA)
36
y) Transcription du gène de tRNASer
37
B) Etude des gènes de tRNA du cosmide N8AI
1. Présentation
38
2. Identification du fragment portant des gènes de
tRNA
38
3. Cartographie du fragment
BamHI de 2,7 kb et
détermination de la séquence nucléotidique des gènes
de tRNAAsn(GUU) et de tRNAPhe(GAA)
39
4. Analyse des gènes de tRNA présents sur le fragment
BarnIII de 2,7 kb
40
a) Etude du gène de tRNAPhe(GAA)
.40
CI) Analyse de la partie codante du gène de
tRNAPhe(GAA)
40
~) Analyse des régions flanquantes du gène
de tRNAPhe
40
b) Etude du gène de tRNAAsn(GUU)
.42
CI) Analyse de la partie codante du gène
.42
~) Le noyau du maïs comporte-t-il le même
gène de tRNAAsn(GUU) que la
mitochondrie ?
44
y) Etude des régions flanquantes du gène de
tRNAAsll(GUU)
45
- Comparaison entre les régions flanquantes
des gènes de tRNAAsn(GUU) des
mitochondries des plantes supérieures
.45
. Gènes de tRNAAsn(GUU)
mitochondriaux du blé et du maïs
.45
. Comparaison des gènes de
tRNAAsn(GUU) mitochondriaux
des monocotylédones à celui du
lupin
46

---

103
- Comparaison entre les trois gènes de
tRN AAsn(GUU) mitochondriaux et le gène de
tRN AAsn(GUU) du chloroplaste de maïs
.46
- Comparaison entre les gènes de
tRNAAsn(GUU)
mitochondriaux et
chloroplastiques d'une part et
nucléaire d'autre part..
.47
C) Etude des gènes de tRNA du cosmide N7F3
50
1. Présentation du cosmide
50
2. Analyse du cosmide N7F3 et identification des
fragments comportant des gènes de tRNA
51
3. Sous-clonage du fragment BamHI 3,5 kb du cosmide
N7F3
52
4. Cartographie du fragment BamHI 3.5 kb et
identification des régions codant pour des gènes de
tRNA
;
53
.5. Analyse des gènes de tRNA présents sur le fragment
3,5 kb BamHI
53
a) Etude du gène de tRNAGlu(UUC)
.53
a) Analyse de la partie codante du gène
53
~) Analyse des régions flanquantes du
g è ne
5 4
b) Etude du gène de tRNAPro(UGG)
.55
a) Analyse de la région codante du gène
55
~) Analyse des régions flanquantes du
g è ne
5 5
C. Etude du pseudogène de tRNAPro du cosmide N7B7
56
1. Présentation du cosmide
56
2. Analyse du cosmide et détermination du fragment
portant un gène de tRNA
56
3. Détermination de la séquence nucIéotidique du
fragment BamHI 1,25 kb et identification d'un gène
incomplet de tRNAPro
57
4. Le DNA mitochondrial du maïs a t-il perdu la partie
1
5' du deuxième gène de tRNAPro ?
57
5. Analyse des régions flanquantes du gène de
1
tRNAPro(UGA) et du gène incomplet de tRNAPro
58
1
\\
a) Comparaison entre les régions flanquantes des
deux gènes du maïs
58
b) Comparaison entre les régions flanquantes des
1
i;
gènes de tRNAPro(UGA) du blé et du maïs
.5 8
(
E. Etude des gènes de tRNA du cosmide 8-3B2
60

---

104
III. Organisation des gènes de tRNA sur les cercle-maîtres
des génomes mitochondriaux de maïs des variétés B37-N et
B37-cmsT
61
A. Hybridation avec des oligonucléotides de synthèse
61
B. Analyse de l'organisation des gènes de tRNA mitoêhondriaux
62
1) Comparaison entre les génomes B37-N et WF9-N
62
Z) Comparaison entre les génomes B37-N et
B37cmsT
62
Chapitre III : ETUDE D'AUTRES REGIONS DU DNA
MITOCHONDRIAL DES VARIETES DE MAIS B37-N ET B37-
cmsT
1. Etude de deux fragments de DNA mitochondrial de maïs
s'hybridant à la fraction 4S du RNA mitochondrial mais ne
comportant pas de gène de tRNA
64
A. Etude du fragment 1,25 kb XhoI du cosmide
9-1E8 (A2)
64
1. Présentation du cosmide 9-1E8
64
2. Sous-clonage et séquençage d'un fragment XhoI du
cosmide 9-1E8
64
3. Analyse de la séquence du fragment XhoI de
1,25 kb
64
. L'urf138 est-elle exprimée
dans la mitochondrie du maïs ?
65
B. Etude du fragment SmaI de 2.7 kb du cosmide (9-2C4)
6 8
1. Présentation du cosmide
68
2. Sous-clonage des fragments du cosmide 9-2C4
68
3. Analyse de la séquence nucléotidique du fragment
BamHI-XhoI de 1 kb
68
II. Etude des régions du DNA mitochondrial du maïs
comportant des insertions chloroplastiques
70
A. Etude du plasmide 5.7TB
70
1. Présentation du plasmide
70
2. Sous-clonage et séquençage du fragment s'hybridant
aux tRNA totaux
70
3. Analyse de la séquence nucléotidique du fragment
HindIII-XhoI de 1,7 kb
70
a) L'hybridation observée est-elle due à la
présence de l'exon 2 du gène
71

---

;'1.
,",
105
~) L'hybridation est-elle liée à la présence
de séquences chloroplastiques
71
B. Le génome mitochondrial des variétés normales contient la
quasi totalité de la séquence répétée du DNA chloroplastique
du maïs
73
Chapitre IV : QUELQUES ANALYSES SUR LES HYBRIDATIONS
DE RNA MARQUES À L'AIDE DE LA CCAse AVEC DES
FRAGMENTS DE DNA NE COMPORTANT PAS DE GENE DE tRNA
1) L'extrait enzymatique utilisé dans nos réactions
'd
'1
. . , ?
77
posse e-t-l
une autre actlvlte
.
2) Les molécules marquées sont-elles des tRNA ?
77
a) Analyse de la fraction 4S marquée au
a-[32P]ATP à l'aide de la CCAse
77
b) Analyse des- régions de DNA s'hybridant à la
fraction 4S
77
a) y
a-t-il des séquences communes entre
les fragments
A et B comportant les gènes
atp9 et urf240 ?
7 8
~) L'hybridation est-elle liée aux. séquences
communes
?
:
78
c) Hybridation des fragments A et B avec la
fraction 4S
78
3)·Discussion
79
Chapitre V : CONCLUSIONS GENERALES SUR LES GENES DE
tRNA MITOCHONDRIAUX DU MAIS
1. Origines des gènes mitochondriaux.
81
2. Le code génétique dans la mitochondrie du maïs
83
3. Signaux de transcription des gènes de tRNA
mi toc ho nd ri au x.
84
a) Recherche de séquences consensus dans les
régions flanquantes des gènes de tRNA
84
b) Recherche de promoteurs in ternes
85
4. Conclusion
86
BffiLIOGRAPHIE
87

---

ANNEXE 1 : ORIGINE PHYLOGENETIQUE (PROBABLE) DU MAIS
Environ
-Origine américaine (centre du Mexique)
20.000 av. J.C.
-Découvert lors du creusement d'un gratte
1 maïs primitif
(dernière période
ciel de Mexico à 70m de profondeur
1
interglacière)
1
-Morphologie inconnue (grain de pollen
1
1
seuls découverts)
1
1
1
1
1
1
1
--------------------~-----------------------------------------
1
1
1
1
1
5000 av. J.C.
+
-monoïque
1maïs ancestral f-x---1 Tripsacum 1
-pér~~~e
-inflorescence
(mauvaise herbe
-ramlfl~e
apicale mâle
actuelle des champs -~onolque
-inflorescence
maïs -Mexique et
-Inflorescence
latérales femelle ou
Guatemala)
apicale hermaphrodite
-inflorescence
hermaphrodite
-épillets vêtus
latérale hermaphrodite
-taillage élévé
mâle à l'extrémité et
femelle
-épis de 2g environ
à la base
introgression
-plante annuelle
.....-------.
génétique
Téosynte
•
x- - i (Euchlaena ou
Zea maxicana)
,..~----x--ITripsacum
1
2n= 20 chromosomes
Lm.
/I\\~
Z.m
Z.m.
Z.m.
Z.m.
Z.m.
Z.m.
indunata
indentata
everta
saccharata amylacea
ceratina
tunicata
maïs corné maïs denté
pop-corn
maïs sucré
maïs farineux
maïs cireux maïs vêtu

---

ANNEXE 2: Milieux et tampons utilisés
Milieu S.O.B.:
par litre :
Bacto-tryptone:
20g
Yeast extract:
5g
NaCl:
O.5g
Ajuster le pH à 7,5 avec du KOH
et stériliser par autoclavage.
MilieuL.B.:
par litre:
Bacto-Tryptone:
lOg
Bacto-yeast extract:
5g
NaCl:
lOg
Ajuster le pH à 7,5 avec du KOH
MilieuL.B.-agar: par litre:
Bacto-agar:
l5g (15%)
Bacto-agar:
7g (7% )
dans le milieu L.B.
ajouter le bacto-agar juste
avant l'autoclavage.
Tampon TFB:
KCl(ultrapure):
lOOmM
MnCl,4H20
45mM
CaC12,2H20
lOmM
HACoC13
3mM
K-MES
lOmM
Filtrer et conserver à 4oC
Tampon TEA x 50 :
par litre:
Tris base:
242g
HO glacial
57, lm!
EDTA O,5M; pH 8
100 ml

---

77
1) L'EXTRAIT ENZYMATIQUE UTILISE DANS NOS REACTIONS
POSSEDE-T-IL UNE AUTRE ACTIVITE?
Nous avons pensé que la fraction enzymatique utilisée dans nos réactions pouvait
contenir d'autres enzymes qui seraient à l'origine de marquages non spécifiques d'autres
petits RNA. Cependant, nous ne sommes jamais arrivé à marquer la fraction 45 ni avec
du [32p] pCp, ni du a-[32p] GTP en utilisant l'extrait enzymatique contenant la CCAse.
Cela montre que cette fraction ne contient ni RNA-ligase, ni RNA polymérase-DNA
indépendante. Par ailleurs, nous n'avons jamais remarqué de différence, dans les
expériences d'hybridation, effectuées avec des tRNA marqués au a-[32p] CTP (avec
l'ATP froid) et avec ceux marqués au a-[32P]ATP (avec"du CfP froid) en utilisant le
même extrait de CCAse. Cela montre que le marquage obtenu n'est pas lié à la présence
d'une polyA polymérase incorporant spécifiquement de l'ATP.
L'ensemble de ces observations nous ont conduit à admettre que la préparation de CCAse
ne contenait pas d'autres activités enzymatiques susceptibles de provoquer des
marquages aspécifiques. Par conséquent, il est probable que les molécules de RNA qui
s'hybrident aux fragments de DNA cités plus l}.aut, aient été effectivement marquées par
la CCAse.
2) LES MOLECULES MARQUEES SONT-ELLES DES tRNA ?
Le problème qui s'est posé à propos de ces Iparquages éta~t de savoir si les
hybridations observées étaient liées à la présence ou non de gènes de tRNA. Il est donc
important de savoir si les molécules marquées par la CCAse sont exclusivement des
tRNA.
a) Analvse de la fraction 45 marquée au a -[32P1ATP à l'aide de la CCAse
5i l'on surexpose la fraction 45 extraite de la mitochondrie du maïs et marquée
à la CCAse et séparée sur gel de polyacrylamide monodimensionnelle, on observe le
profil montré sur la figure 40. L'analyse de ce profil montre que plusieurs molécules de
RNA (plus grandes que les tRNA) sont aussi marquées. Ces marquages sont très faibles
mais leur intensité concorde avec les signaux observés lors des hybridations de la
fraction 45 avec les fragments A et B. Ces "grands" RNA marqués ne sont pas présents
dans la fraction 4S purifiée sur une colonne RPC-S (fig.40).
b) Analyse des régions de DNA s'hybridant à la fraction 45
Dans le chapitreIlI-II, nous avons montré que certaines hybridations étaient
liées à la présence de séquences codant pour des rRNA. Dans ce paragraphe, nous nous
sommes focalisés sur les deux fragments codant pour des gènes de protéines (A et B).
L'intensité d'hybridation des RNA marquées à la CCAse avec ces fragments est très
faible. Plusieurs questions se posent:

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