l
UNIVERSITE DE MONTPELLIER 1
. 1
FACUL TE DE PHARMACIE
-i
IDENTIFICATION IMMUNOCHIMIQUE DES CANDIDA
PAR ANTICORPS POLYCLONAUX MONOSPECIFIQUES
Application au sérotypage de souches isolées
à Abidjan
THE S E
présentée à la Faculté de Pharmacie de Montpellier pour obt€nir
le grade de
Docteur d'etat es Sciences Pharmaceutiques
par
1
t
Moussa KONE
Pharmacien
Assistant à la Faculté de Médecine d'Abidjan
1
Docteur de 3ème cycle de Parasitologie Tropicale
Certificat d'Etudes Spéciales de Diagnostic Biologique Parasitaire
Diplôme d'Etudes Approfondies de Parasitologie Tropicale
1
soutenue le 12 juillet 1985 devant la Commission d'Examen
l
~
JURY
M.
J.M.
BASTIDE
Professeur Université de Montpellier l
Président
M.
A.
RAMBAUD
Professeur Université de Montpellier l
Mme
1.
FOURASTE
Professeur Université de Montpellier l
Assesseurs'
"
t
M.
L.
EUZET
Professeur U.S.T.L.
de Montpellier ri
..,......
<
~.,
Mme
N.
LEGER
Professeur Faculté de Pharmacie, Reims
...
._.}
-~_
UNIVERSITE DE MONTPELLIER l
FACULTE DE PHARMACIE
HONORARIAT
Professeur M. MOUSSERON
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EMERITAT
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INSTITUT DES SCIENCES PHARMACEUTIQUES ET BIOLOGIQUES
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INSTITUT DES SCIENCES APPLIQUEES A LA PROTECTION DE L'HOMME
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D E D I e
ACE
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At'ON PERE ET A MA MERE".
Pour leurs conseils et leurs encouragements
Ils ont consenti pour moi beaucoup de sacrifices,
leur dévouèment mériterait mieux que ce modeste
témoignage de mon infime
reconnaissance et de ma
profonde affection.
A TOUTE MA FAMILLE"
Avec toute mon affection.
A MA FEMME EMILIE"
Je salue son courage et sa patience son soutien
fut capital.
Qu'elle trouve ici le témoignage de mon amour.
A MON FILS MALICK"
A MA BELLE FAMILLE"
A MES AMIS"
A MONSIEUR LE DOCTEUR DOUCHET J
DIRECTEUR DU CENTRE MURAZ DE BOBO-DIOULASSO.
Il nous a inspiré le travail de cette thèse et nous
a donné toutes les facilités pour sa réalisation.
Nous étions surtout impressionnés par ses grandes qualités
humaines et combien notre joie était grande de travailler
aux côtés d'un homme aussi passionné et passionnant. Pour
son accueïl, son aide matérielle et ses conseils, nous le
remercions de tout coeur et nous l'assurons de notre pro-
fonde reconnaissance.
Son amitQé et sa sympathie resteront pour nous un
perpétuel stimulant intellectuel.
A TOUT LE PERSONNEL DU LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE
DE L'INSTITUT NATIONAL DE SANTE PUBLIQUE D'ABIDJAN
ET EN PARTIOULIER)
à Madame GELARD. Technicienne de Laboratoire,pour sa pré-
cieuse contribution à la réalisation de ce travail.
A MONSIEUR LE PROFESSEUR G, ASSALE~
-
CHEF DE SERVICE DU LABORATOIRE DE PARASITOLOGIE
DE LA FACULTE DE MEDECINE D'ABIDJAN.
Il nous a fait l'honneur de nous acceuillir dans
son service. Que la soutenance de cette thèse soit pour
nous l'occasion de vous témoigner de notre reconnaissance
pour vos conseils, vos
encouragements, ainsi que votre
extrême gentillesse.
A MADAME LE DOCTEUR M, FERLY-THERIZOL~
Qui nous a guidé, conseillé et aidé tout au long
de l'élaboration de cette thèse.
En témoignage de notre gratitude et notre profond respect.
A L'ENSEMBLE DE L'EQUIPE DU LABORATOIRE DE PARASTIOLOGIE ET
DE BACTERIOLOGIE DE LA FACULTE DE MEDECINE D'ABIDJAN, ET PLUS
PARTICULIÈREMENT~
A Madame DOSSO Mireille, Monsieur le Docteur OUHON Jean,
Madame MANGLE, et à Monsieur ZOZAN Emile.
Pour leur gentillesse et leur aide.
Qu'ils trouvent ici le témoignage de notre sincère
amitié.
A NOTRE MAITRE ET PRÉSIDENT PE IHESEJ
MONSIEUR LE PROFESSEUR J.M. BASTIDE J
-
PROFESSEUR D'IMMUNOLOGIE, VIROLOGIE ET PARASITOLOGIE!
A LA FACULTE DE PHARMACIE DE MONTPELLIER.
Il nous a fait l'honneur d'accepter la présidence de
cette thèse.
Notre séjour dans son service en tant que stagiaire, nous a
permis d'apprécier l'étenduede ses connaissances, la grandeur
de ses qualités humainep et la chaleur de son accueil,
En témoignage de notre respectueuse gratitude.
A NOS MAîTRES ET JUGES,
MONSIEUR LE PROFESSEUR RAMBAUD ANDRÉ,
-
PROFESSEUR D'HYDROLOGIE ET D'HYGIENE
A LA FACULTE DE PHARMACIE DE MONTPELLIER.
Vous nous avez fait l'honneur d'accepter de juger ce
travail. Nous avons pu apprécier durant les quelques ren-
contres que nous avons eues, vos qualités de coeur.
Veuillez croire à nôtre respectueuse reconnaissance.
MADAME LE PROFESSEUR FOURASTÉ ISABELLE,
-
PROFESSEUR DE PHARMACOGNOSIE A LA FACULTE
DE PHARMACIE DE MONTPELLIER.
Vous avez tout de suite accepté de participer au Jury
de cette thèse et chaque fois que l'occasion s'est pré-
sentée, vous n'avez pas hésité à nous prodiguer vos
conseils et vos encouragements, nous vous en remercions
infiniment et nous vous assurons de notre total dévouement
et de notre profond respect.
MONSIEUR LE PROFESSEUR EUZET LOUIS,
- PROFESSEUR DE PARASITOLOGIE COMPAREE
A L'UNIVERSITE DES SCIENCES ET TECHNIQUES DU
LANGUEDOC DE MONTPELLIER.
Nous vous remercions du grand honneur que vous
nous avez fait en acceptant de juger cette thèse et nous
vous assurons de notre profond respect.
MADAME LE PROFESSEUR LÉGER NICOLE,
- PROFESSEUR DE PARASITOLOGIE A LA FACULTE
DE PHARMACIE DE REIMS.
Vous nous avez initié à la Parasitologie. Vous nous
avez toujours appris que cette matière occupe une place
importante dans les pays comme le nôtre.
Pour votre enseignement de très grande qualité, vos
conseils et vos encouragements, nous vous exprimons notre
infinie gratitude, notre estime et notre amical souvenir.
SOM
M A I
RE
SOM
MAI
R E
1NTRODUCT l ON : . . . . . . . • • . . . . . . . . • • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
l, - LES MËTHODES IMMUNOCHIMIQUES APPLIQUÉES À LA CLASSIFI-
CATION DES; LEVURES ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 3 - 21
1. -
Détection immunochimi~ue aes antigènes
cytoplasmiques solubles._
1-1 . L'analyse irnmunoélectrophorétique
1-2. études irnmunoélectrophorétiques
bidimensionnelles.
2. -
Détection immunochimique des antigènes
pariétaux : la classification de
Tsuchiya.
1 I. - LES METHODES DE DIAGNOSTIC DES LEVURES •.•••••••••.••••••.• 22
A. -
LES METHODES CLASSIQUES······························
22-35
1. -
Les caractères culturaux
2. -
Les caractères morphologiques
2-1.
formation de pseudomycélium ou de vrai
mycélium.
2.2. formation de chlamydospores
2.3. blastèse
3. -
Caractères sexuels
(ascospores,
basidiospores)
4. -
Caractères physiologiques
4.1. utilisation des sucres
4.2. fermentation des sucres
4.3. utilisation des composés azotés
4.4. hydrolyse de l'urée.
5. - Les autres c~ractères
5.1. résistance à la cycloheximide
(actidione)
5.2. réduction du chlorure de Triphényl tétrazo-
liLIDl( C • T. T. )
5.3. Température d'étude
5.4. Pouvoir pathogène expérimental
. - B·.
._ fiES: .ME'L'HOeES RAPIDES
··.····· 36 - 47
1. -
Système API zymogramme et ~uxanogramme 20C
2. -
système API 20C auxanogramme
3. - The uni-yeast-Tek kit
4. - Mycotube Roche
5. - Nouveau Kit de l'Institut Pasteur
6. -
Sérotypage : Candida Check Kit
III. - TRAVAUX PERSONNELS···········································
48
A. - PREPARATION DES IMMUNSERUMS ...............••.... ·.··.··· 48 - 55
1. - Choix des animaux
2. -
Choix des souches
3.
Préparation de la suspension antigénique
4. -
Protocole et méthodologie d'immunisation
des lapins.
B. - PREPARATION DES SERUMS MONOSPECIFIQUES·
56 - 99
1. - Principe
2. - Préparation du sérum anti 1
3.
- préparation du sérum anti 4
4. - Préparation du sérum anti 5
5 .. -
Préparation du sérum ~nti 6
6.
- préparation du sérum anti 7
7. - Préparation du sérum anti 8
8. - Préparation du sérum anti 9
9.
- Préparation du sérum anti 10
10. - Préparation du sérum anti
11
11- - Préparation du sérum anti
13
12. - Préparation du sérum anti
13 b
13. - Préparation du sérum anti
34
C. -
UTILISATION DES ~ISER~
PREPARES DANS L'IDENTI-
FICATION DES SOUCHES DE LEVURES", .. " ,
,
, . " . ,100 - 112
D. -
SEROTYPAGE DES SOUCHES DE CANDIDA ALBICANS
RENCONTREES EN COTE D'IVOIRE,
,
,
··, 113 - 122
E. -
DI SCU SS ION .,.,
,
,
,.. 123
CONCLUSION ......................••••....•.•............•............. 128
BIBLIOGRAPHIE
134
l N T R 0 DUC T r 0 N
i
1
~
1
ijl
1
Les levures sont des champignons qui se reproduisent
asexuellement par des blastospores et sexuellement par des basi-
diospores ou ascospores et qui très fréquemment fermentent les
sucres avec dégagement de C~2 (146
).
Dans le cadre de notre étude, nous nous intéresserons
surtout au groupe des champignons imparfaits c'est-à-dire ceux
dont les formes de reproduction parfaite ne sont pas connues. Dans
ce groupe, nous nous
bimiterons
plus précisement au diagnostic
des levures du genre Candida et du genre Torulopsis.
L'identification précise d'une levure n'est pas toujours
aisée. L'article de DOBY et Coll.
(28
montre très bien les diffi-
cultés rencontrées dans l'identification des levures. En effet, pour
une même souche de levure, 14 laboratoiresde compétence reconnue
ont attribué une dizaine de noms d'espèces appartenant à deux genres
différents Candida et Torulopsis.
En pratique courante la distinction entre les levures du
genre Candida et les levures du genre Torulopsis est basée sur la
capacité de former du pseudomycélium pour les premiers et l'absence
ou la formation de pseudomycélium rudimentaire pour les seconds
( 176)
A priori ces résultats discordants sur le genre ne de-
vraient pas exister. LODDER et KREGER RIJ
(
90
)admettent l'utilité
de ce critère pour différencier le genre Candida du genre Torulopsis
mais soulignent que la formation de pseudomycélium peut être affec-
tée par des facteurs externes. Ce fait
es~ mis en évidence
par DOBY et Coll.
(28) qui mentionnent que sur les 14 laboratoires
ayant étudié la même souche, certains d'entre eux obtenaient des
2
résultats diamétralement 0ppo$és sur des milieux théoriquement
identiques. Il se pose donc le problème de la standardisation
des milieux d'isolement et des méthodes de travail, cela a fait
l'objet d'un article paru dans le bulletin de la Société Française
de Mycologie Médicale (
1 0 ) .
Pour le diagnostic des levures le laboratoire dispose
de tout un arsénal de méthodes. La plupart d'entre elles font in-
tervenir classiquement des caractères morphologiques et physiolo-
giques, c'est avant tout la classification de LODDER. Cependant
d'autres critères basés sur l'étude génétique et sur la structure
antigénique et pariétale des levures permettent de préciser la
taxonomie
de certains genres et de certaines espèces. Dans ce tra-
yail, nous avons choisi pour l'identification des levures la méthode
immunologique d'agglutination sur lame, pour sa rapidité, sa faci-
lité d'exécution et pour les résultats satisfaisants obtenus par
plusieurs auteurs.
Dans une première partie, nous nous intéresseron$ aux méthodes imm~
nochimiques appliquées à la classification des levures., ensuite nous
verrons dans une deuxième partie les méthodes de diagnostic des levures
(méthodes classiques et méthodes rapides), et enfin dans une troi-
sième partie nous ferons état de nos travaux personnels ,travaux
personnels qui ont trait à la préparation des sérums monospécifi-
ques et à leur utilisation dans l'identification des principales
levures d'intérêt médical.
3
1. - LES MËTHODES IMMUNOCHIMIQUES APPLIQUÉES À
LA CLASSIFICATION DES LEVURES
A côté des méthodes faisant intervenir les critères mor-
phologiques, physiologiques et génétiques la taxonomie des levures
est basée également sur l'étude de la structure antigénique soit
des antigènescytopla~es solubles soit des antigènes de la paroi
des levures.
1. -
Détection immunochimique des antigènes
cytoplasmiques solubles.
1-1. l'analyse immunoélectrophorétique
En étudiant différentes espèces de Candida
(Candida albicans,
C.stellatoidea, C.tropicalis, C.zeylanoides, C.krusei, C.pseudotro-
picalis et C.macedoniensis) Biguet et Coll.
( 14-15) montrent l'hé-
térogénéité du genre Candida et l'existence de fractions antigéniques
spécifiques à chaque espèce.
L'analyse
immunoélectrophorétique rapproche C.stellatoidea, de
C.albicans, permet de voir que C.tropicalis et C.albicans possèdent
deux fractions spécifiques, que Candida zeylanoïdes contient 7 frac-
tions majeures dont l'une semble particulière, que Candida krusei
a une fraction mineure caractéristique, et que Candida macedoniensis
et Candida pseudotropicalis ont un diagramme immunoélectrophorétique,
avec une fraction spécifique que ne possèdent pas les autres Candida.
L'étude immunoélectrophorétique des antigènes de C.robusta
et de
S.cerevisiae
(cette dernière levure étant la forme ascosporée de la
4
précédente fait la preuve de leur étroite p~renté antigénique (16)
mais non de leur identité totale,
( 131-132) comme l'a montré les
travaux de l'école Japonaise de Tsuchiya.
Ces remarques ont conduit les auteurs
(15)
à faire des
rapprochements taxonomiques. Ainsi ils confirment la parenté anti-
génique de Candida macedoniensis et de Candida pseudotropicalis
[parenté signalée par les auteurs Japonais utilisant la méthode séro-
logique d'agglutination (143)], le rapprochement sur le plan antigé-
nique de Candida stellatoidea et de Candida albicans, à un moindre
degré
. de Candida tropicalis et de C.zeylanoides, mais distin-
guent nettement ces deux espèces de C.krusei, C.macedoniensis et de
C.pseudotropicalis.
Biguet et Coll. ( 15)
pensent que sur le plan taxonomique,
la méthode irnmunoélectrophorétique en mettant en évidence un plus
grand nombre de fractions antigéniques, présente l'avantage de pou-
voir séparer des espèces très proches antigéniquement, ce que ne peut
pas toujours faire les méthodes explorant la structure pariétale des
levures, c'est le cas de C. macedoniensis et de C.pseudotropicalis
qui ont la même structure antigénique par la méthode d'agglutination
de Tsuchiya et Coll~ ( 143 ), mais qui diffèrent par les fractions
antigéniques 47 et 48 par la méthode irnmunoélectrophorétique de
Biguet et Coll.(15).
1-2. études immunoélectrophorétiques
bidimensionnelles.
Des études d'irnmunoélectrophorèse bidimensionnelles appli-
quées à l'analyse des antigènes cytoplasmiques solubles a permis à
Guinet et Coll. de comparer C. albicans sérotype A et B (Ha~.senclever
et Mitchell ont montré en 1961
(70)
en utilisant des réactions
d'agglutinations que C. albicans pouvait être divisé en 2 groupes
-
5 -
C. albicans sérotype A et C. albicans sérotype B)
et C.
tropicalis.
Cette méthode a permis de montrer la complexité des antigènes cyto-
plasmiques des levures
(65 à 78 fractions antigén:. ~iques différen-
tes), une meilleure séparation des composants antigéniques spéci-
fiques à chaque espèce et à chaque sérotype de C.
albicans et surtout
elle a permis de montrer que C.
tropicalis est plus proche antigé-
niquement du groupe A de C. albicans que du groupe B, et que f.
albicans groupe A est plus proche du groupe B que de C.
tropicalis
(64,
65, 66, 67). Récemment l'équipe du Pro Bastide
(89 bis)
a
étudié la structure antigénique de C. albicans sérotype A par une
nouvelle technique d'immunoélectrophorèse bidimensionnelle. Après
la première séparation électrophorétique du mélange protéique, une
quantité déterminée d'antisérum spécifique est déposée sur la couche
d'agarose puis répartie uniformément à la surface à l'aide d'un
film P.V.C. En utilisant cette technique l'équipe a pu révéler 77
arcs de précipitation sur la même plaque.
Cette technique a également permis de démontrer la présence
de constituants antigéniques solubles d'origine pariétale dans les
extraits cytoplasmiques solubles de C. tropicalis et ils ont
montré que ces antigènes sont spécifiques de C. tropicalis
(63-67).
Ces auteurs pensent que l'analyse immunologique en immuno-
électrophorèse bidimensionnelle des antigènes pariétaux solubles
peut permettre une nouvelle approche taxonomique des levures.
Gabriel et Guinet
(54)
en utilisant llimmunoélectrophorèse bidi-
mensionnelle ont étudié différentes activités enzymatiques
(acti-
vité phosphatase acide, estérase alpha et bêta)
sur les pics de
précipitation. Ils ont étudié 10 espèces de Candida avec le sérum
anti C. tropicalis et ont montré que l'estérase alpha est commune
laux espèces étudiées, que la phosphatase acide est commune aux es-
pèces dont le taux de GC % est voisin de celui de C. tropicalis et
Ique 11 estérase bêta est spécifique de c.
tropicalis.
6
L'étude en~ymatique des antigènes des levures en immuno-
électrophorèse quantitative peut donc être utile dans la taxonomie
des levures.
2. -
Détection irnrnunochimique des antigènes
pariétaux : la classification de
Tsuchiya.
Les antigènes de surface des levures sont surtout consti-
tués de polysaccharides
(120, 8
). Plusieurs auteurs ont montré
que la structure pariétale des levures possède des propriétés anti-
géniques d'une grande valeur taxonomique
(119-76, 6).
Fukazawa et Coll. (51) et Summer et Coll.( 120) ont démontré
que ce sont les composants antigéniques de la paroi qui sont spé-
cifiques de sérotype A et B de C. albicans
(Hasenclever
(1961
a et
1961 b)
a démontré que C.albicans répond à deux sérotypes A et B).
Déjà Benham en 1931
( 12) en utilisant la réaction d'agglu-
tination en tube montrait des similarités antigéniques entre plu-
sieurs souches de Candida, et entre Willia anomala et Saccharomyces
cerevisiae,deux espèces produisant des ascospores, prouvant des
relations antigéniques entre 2 souches morphologiquement et cultura-
lement semblables. Il rapportait que les anticorps sériques peuvent
servir dans la distinction entre C. albicans et C.stellatoidea et
entre plusieurs espèces de levures.
7
Martin D.S. en 1942 ( 94), en utilisant le test d'agglu-
tination avec des sérums de lapins hyperimmunisés, obtenait avec
C. albicans et C. tropicalis des résultats qui ne montraient aucune
différence antigénique entre ces deux espèces, il concluait que
la réaction d'agglutination n'était pas fiable et ne devrait être
utilisée que pour confirmer une identification par d'autres moyens.
D'autres chercheurs Jonsen, Thjotta, et Rash en 1953 (77)
ont obtenu des résultats fiables et reproductibles avec l'agglu-
tination. Les travaux les plus importans sur la réaction d'agglu-
tination ont été effectués par Tsuchiya et Coll.(143-145) qui ont
étudié plus de 140 espèces ascosporées et anascosporées et ont
proposé un nouveau système de classification des
levures basé sur
les résultats sérologiques obtenus. Dans leur classification les
auteurs ont tenu compte de certains caractères morphologiques (as-
cospores), de certains caractères biochimiques (fermentation et
assimilation du glucose, du galactose, du saccharose, du maltose
et du lactose, de l'assimilation du nitrate de potassium, de la
présence d'uréase) et de la formation de pigments caroténoides (Tb
l et II). Dans ce travail nous allons souvent nous référer aux
tableaux l et II de Tsuchiya et Collaborateurs, qui ont trait à la
structure antigénique de diverses espèces de levures étudiées.,l:ie
tableau l est celui publié en 1965
(143) et le tableau II celui
publ ié en 1974
(145) ..
Nous avons volontairement mis ces deux tableaux en
annexe, à la fin du texte, pour permettre au lecteur de se
retrouver facilement.
8
Dans cette classification les antigènes thermostables
sont représentés en chiffre arabe et les antigènes thermolabiles
en lettre alphabétique. Les noms d'espèces suivent la classifica-
tion de LODDER. Les espèces analysées antigéniquement sont réparties
en 5 groupes sur la base d'antigènes spécifiques à chaque groupe.
Les 5 groupes se répartissent comme suit
(Tab.
III).
-
Le groupe de Candida albicans appartenant à la sous-
famille des Saccharomycetoideaede Tsuchiya et Coll, dans ce groupe
on rencontre des espèces appartenant à la sous-famille des Saccha-
romycetoideae et à la sous-famille des Cryptococcoideae de LODDER.
-
Le groupe de Schizosaccharomyces pombe appartenant à
la sous-famille des Endomycetoideae de Tsuchiya mais également de
LODDER.
- Le groupe des Sporobolomyces appartenant à la sous-
famille des Sporobolomycetoideae de Tsuchiya et à la sous-famille
des Sporobolomycetaceae de LODDER.
-
Le groupe de Rhodotorula appartenant à la sous-famille
des Sporobolomycetoideae de Tsuchiya et à la sous-famille des Cry-
ptococcoideae de LODDER.
-
Enfin le groupe de Cryptococcus neofOtmans qui comprend
C.curvata et Torulopsis aeria appartenant à la sous-famille des
Cryptococcddeaede Tsuchiya mais également de LODDER.
Il n'y a pas de réactions croisées entre les espèces
des différents groupes, par conséquent les antigènes symbolisés
9
en chiffres arabes tels que les antigènes 1,2,3, etc ..• de
C. albicans, de Schizosaccharomyces, de Rhodotorula, de Sporo-
bolomyces et de Cryptococcus sont différents dans les 5 groupes
même si les chiffres représentant les antigènes sont identiques.
Le groupe de C. albicans est divisé en 7 sous-groupes
sur la base d'antigènes communs et spécifiques.Ces 7 sous-groupes
ont en commun la présence de l'antigène 1 de C. albicans,
l'absence d'uréase ; la répartition en sous-groupe se fait sur la
présence d'antigènes spécifiques de sous-groupe tels que les
antigènes 6,9,10,11,13,16, (18),24 et
(28). Les antigènes entre
parenthèses
indiquent des antigènes qui existent en petite quantité
et qui peuvent éventuellement manquer. Dans ce groupe de c. albicans!~.
on a les subdivisions suivantes. (voir tableaux l
et II).
Groupe l
: c'est le groupe de C. albicans proprement
dit. Il est appelé Groupe Castellania; mais chaque espèce garde
son nom de genre reconnu par Lodder.
Groupe II : c'est le groupe Saccharomyces, i l comprend
3sous-groupes : le sous-groupe Saccharomyces proprement dit,
le
sous-groupe Hanseniaspora et le sous-groupe Kluyveomyces. Les
antigènes spécifiques du groupe II sont les antigènes thermo-
stables 8 et 10 et /
ou 18,
le sous-groupe Hanseniaspora est
caractérisé en plus par l'antigène thermostable 28 et l'antigène
thermolabile L ; le sous-groupe Kluyveomyces par'l~ antigènes 28,
31, et a ou 28 et 32 ou 14 et 31. Le sous-groupe Saccharomyces par
l'antigène 35.
Groupe III
: c'est le groupe Pichia
Groupe IV : le groupe Mycocandida. Mais chaque espèce
de ces deux groupes garde
son nom de genre reconnu par Lodder.
Ainsi ~ dans le groupe IV, C. parg,psilosis
ne s'appelle pas Myco-
10
.Tableau III :
La classification des levures selon TSUCHIYA et Coll.
(143) •
"0
Subfamily
Group
or Genus
" ..c '0
<Il
()
C
"
0"
Spccics
...
]
:.>
ol
B
(TSUCHIYA
""
Z
...
...
et al.)
~
~ 0
<i
~
01
0..
u
Pichia Group
Al, 11
l'. IIItlllbrallae/acitllS
2+
.L
.L
RH
..... (III)
C. Ill}'COdtrllla
1'. illconspiclIa
Hansellllia Gr.
H. allomale
+
2+
m
HS
..... (YI)
:\\1, 16
C. pclliCIIlosa
T. Iltilis
Saccharo-
. - - - - - - - - - - - - -
mycetoideae
Dtha'')'olllFts
D. hUUSCHii,
l;r . . . (\\')
. \\ I , ! l
C. gllilliermolldii
-
-
(+)
.L
w
Rw
1'. /alllata
Saccharo-
Jl)'cocalldida
c. parapsilosis
Illycetoidcdc Gr . . . . (1 \\')
.\\ l, 13
li. holstii
.L
w
H
r. rI'JlOhii
- _ . _ - - - --- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Cailcllallia
S. t'xiguus
Cryptococc-
Cr ... (1)
C. ath/caus
m
R
oideae
T. h(l/Jllii
SaccltaroJll \\'Ct.'5
."'-, iraglll$
Cr ... (li)
Al, III
c. pSi'lIdolropi((/lis
.L
S
RK
Sacchar-
T. spllllt'lïrll
mycetoideae
T .. l'Itla,.pom
S. /"{JSU',
C';r. ... (\\'JI)
.\\1, 24
T. roll lor/osa
m
R
T. "t,lI"ta
....rh/:. puwln'
Endomycct-
Endoll1\\Tct- .,....( hi':\\I.C'(lCc!'<1-
.L
__
SI
('. li pOll·t/(/
\\\\'
1{
oiL1cae
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/ UIJl)'(.'
r. hrrflllrlJ'l."
,
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:""pnrQb%-
1\\1
:''''-p. _
... a/wollico/ùr
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-
~ï
h- )
13
Sporoholo-
/;1 re{ ..;
.......". orfo ri t...;
mycctaceae
l{~
.";1', gracills
1-
B
-------Sporobolo-
JllycetoidvfI(; Uhodn/rJll!/a
1\\1
R. e:!lttI11ÎS
.L
+-
(-;-)
Il. HllfLlla!.{iJl{J,~a
1{4
H.llliJlll/a
J..
+
Cryptococc-
Il. !,lIlIi,la
oit1cae
CrypfO(I/(('/(S
Cr. lI(u/fnll/(lIl,'
Cryptococc.
( .
LÎIiTala
(+)
oidcae
T. at:rÎa
.\\ l, SI, ln, R" and Cl meall antigcn 1 or ~ of C. a/bicall5, .",.liI c. l'''JIII,,', R. r:lllil/lis, R. mill"ta and C.·. "CO·
/or",a".<, respectively. H, Il, S, I{""
K mean round, hat·, saturn-shap"d, re,und and warty or kitlney like asco-
~porcs. respectiveJy. B nlcans uallistospores, and \\\\., Jn, s nlcan \\\\'L:'ak, IlH'Ùeratc or strong {cnnentation r('action.
11
candida paraps~losis.
Groupe V : il désigne le groupe
Debaryomyces
Groupe VI : le groupe Hansenula
groupe VII
: le groupe ~orulaspora
Cette classification appelle plusieurs remarques i
on constate
que les genres Geotrichum et Trichosporon ne sont pas classés.
selon les auteurs, ces genres présentent des formes trop com-
pliquées pour intervenir dans cette classification. Au cours
de notre travail nous avons remarqué que les souches de ces deux
genres étaient souvent autoagglutinables, c'est peut-être égale-
ment une autre raison qui a amené les auteurs a ne pas les utiliser
dans leur classification i d'autre part on remarque que chaque
groupe ne renferme pas forcément des espèces d'un même genre.
Si l'on prend le groupe III de C. albicans)c'est-à-dire le groupe
Pichia,on rencontre bien entendu des espèces du genre Pichia,
mais également des espèces du genre Candida, du genre Hansenula
et du genre Torulopsis.
Quelles sont les relations entrè les structures antigéniques et
les caractères morphologiques et biochimiques des espèces classées ?
a) Les espèces sérologiquement identiques, malgré des diffé-
rences dans leur morphologie et leurs caractères biologiques sont
classées dans le même groupe. Deux
cas se présentent :
- Les espèces ascosporogènes et les espèces asporogènes
correspondantes sont classées dans le même groupe. A quelques
exceptions près, i l a été confirmé que toutes les espèces asporogènes
sont sérologiquement identiques aux espèces ascosporogènes corres-
pondantes. Ainsi, Pichia pijperi est sérologiquement identique à
C.
solani, le premier étant la forme parfaite de la seconde,
12
de même, Picpia Kudriavzevii et C. k,rusei ont la même structure
antigénique, Pichia kudriavzevii étant la forme parfaite de
c. krusei (100-143).
Jones et coll.
76
) ne partagent pas ce point de
vue, ils démontrent en utilisant la réaction d'agglutination en
tube, que les levures ascosporogènes possèdent des antigènes qui
n'existent pas dans les levures asporogènes correspondantes et
vice versa, et ils donnent l'exemple de 1<loeckera
apiculata qui
est la forme asexuée de Hanseniaspora valbyensis mais est séro-
logiquement distincte. Tsuchiya et coll. (143 l,en utilisant la
même méthode d'agglutination mais sur lame, ont démontré que ces
deux espèces ont la même structure antigénique (Tb 1).
Des espèces présentant des différences dans la formation
de pseudomycélium et 1 ou de vrai mycélium mais ayant des struc-
tures antigéniques semblables sont classées dans le même groupe.
Ainsi Torulopsis sake et C. tropi~alis antigéniquement identiques
appartiennent au groupe Castellani a(Tb 1).
De même C. robusta et Saccharomyces cerevisiae qui ont
les âritigène:;therrrostables ~ 1,2,3,10, 14,18 et31 et les ~t~igènes the:mo-
labiles a et e appartiennent;':au même groupe, le groupe II de Saccha-
romyces.
b) Des esp~ces q~i pos~~dent des structures antig4~i~ues
et des caractères biologiques qui les rapprochent des espèces de
genre différent sérologiquement sont transféréès
dans ce genre.
Ainsi, C. curvata, c. humicola, Torulopsis aeria qui hydrolysent
l'urée, assimilent l'inositol et synthétisent l'amidon sont plus
étroitement apparentées sérologiquement à Cryptococcus néoformans
qu'à d'autres espèces du genre Candida ou du genre Torulopsis.
Elles fpnt partie du groupe de Cryptococcus neoformans
13
c) Des espèces qui sont identiques ou étroitement apparentées
biochimiquement, mais différentes sérologiquement sont considérées
comme des espèces différentes.
Ainsi Saccharomyces chevalieri et Saccharomyces fruc-
tuüm considérées comme des synonymes, Saccharomyces bisporus et
S. mellis, S. carlsbergensis et s. uvarum acceptées comme
des
variétés,sont considérées comme des espèces différentes vue leur
structure antigénique.
Cependant, Tsuchiya et coll. (145)
admettent que S. uvarum
et S.
logos
soient fusionnées en une seule espèce en regard de
leur structure antigénique
(S.
logos et S. uvarum
étant considérées
comme des synonymes par Lodder ( 90
). Ces résultats sont corrèlés
par le spectre PMR des polysaccharides de ces espèces
( 61
d) Lorsqu'une espèce d'un genre donné est plus étroitement
apparentée antigéniquement à plusieurs espèces d'un autre genre,
cette espèce est transférée dans cet autre genre. Exemple
Pichia
- - -
vini, du genre Pichia au lieu de faire partie du groupe III c'est-
à-dire celui de Pichia, appartient au groupe Debaryomyces,o~ les
espèces lui sont antigéniquement plus proches.
e) Les espèces ayant deux antigènes spécifiques de groupe
sont classées en tenant compte d'autres critères.
Exemple : C.
intermedia a deux antigènes spécifiques de groupe :
l'antigène 6 spécifique du groupe l (groupe Castellania) et l' antiqène
24 spécifique du groupe VII Torulaspora. Candida intermèdia a été
rangé dans le groupe VII compte tenu de la présence de l'antigène
24, et du taux en GC du D.N.A qui est en rapport avec les autres
espèces de ce genre. Mais les auteurs font remarquer que le spectre
PM~ des polysaccharides de l'espèce Candida intermedia ressemble
à la fois à celui des espèces du groupe l
et VII.
14
Cet exemple démontre bien qu'une classification pour être
acceptable doit tenir compte de plusieurs critères qui doivent
se recouper.
f)
Identification sérologique des espèces difficileS à
identifier par les caractères biochimiques.
Van Der Walt J.P dans «the yeast»
1971
(147 )
mentionne que Saccharomyces vafer qui de par la fermentation de
certains sucres
ressemble à Saccharomyces exiguus et Saccha-
romyces~chevalieri est considérée comme très voisine de Saccha-
romyces delbrueckii, Saccharomyces microellipsodes et Saccha-
romyces pretoniensis. De même Saccharomyces dairensis ressemble
à Saccharomycesunipporus, Saccharomyces delbrueckii, Saccha-
romyces globosus
etc •..
Saccharomyces delbrueckii ressemble à Saccharomyces
unisporus, Saccharomyces dairensis, Saccharomyces globosus etc!!
et est
considérée comme très apparentée à Saccharomyces vafer.
Quant à Saccharomyces rosei elle est étroitement apparentée à
Saccharomyces inconspicuus et à Saccharomyces fermentati.
Van Der Walt J.P (147
) considère Saccharomyces delbrueckii
comme une espèce métastable difficile à classer •
Kudriavrev cité par IDdder (90) dans sa description de plusieurs
espèces du genre Saccharomyces mentionne
que certaines souches
changent leur propriété d'assimilation et de fermentation après
culture prolongée sur des milieux renfermant certains sucres,
elle acquièrent la capacité d'assimiler et même de fermenter les
sucres avec lesquels elles sont en contact. De tellessouches sont
difficiles à classer.
Tsuchiya et coll. après analyse de la structure anti-
génique de Saccharomyces delbrueckii, Saccharomyces vafer,
"'I"a::m::~u:
.l V :
Classification sérologique de diverses espèces de levures très proches sur le plan taxonomique, d'après TSOCHIYA et Coll.(l45).
Species
Serological
Species
Fennentaticn
Àntigenic
Ul
~
labelled
identificaticn
after 1970
.~
-,-i
and assiroilaticn structure -
(in 1964)
(van d. Walt)
~ Ul a1
or 1973)
Ul~()~
(l)
8.
(l)
Ul
(l)
(l)
(l)
lH
Ul
.B Ul Ul Ul
~ 0 ~ ]
0
e.B.B
o
,~(l)8~~r-l()
~ ~ ~ ~ 8 ~ 8' ~ ~
- - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - -
S. delbrueckii
1
9
+
+
3,4,4,6,10,23
S. de1brueckii
S. unisporus T.
2
3
+
-
+
+
3,4,5,6,10,23
S. delbrueckii
S. unisporus
3
1
+
+
3,4;5,6,10,26
S. exiguus
S. dairensis
4
1
+
+
3,4,24
S. roseu
S. delbrueckii"
5
3
+
+
+
3,4,24
S. rosei
S.. delbrueckii T.
S. exiguus
6
6
+
+
+
3,4,5,6,10,26
S. exiguus
S. exiguus T.
7
3
+
+
3,4,5,6,10,23
S. delbrueckii
S. unisporus
8
1
+
+
+
3,4,24
S. rosei
S. vafer T.
......
U1
S. rosei
9 11
-
-
+
-
+
3,4,24
S. rosei
S. rosei T.
10
1
+
+
+
+
+
+
2,3,10,14,18,
S. cerevisiae
S. cerevisiae
31,a,e,
S. fennentati
11
1
+
+
+
3,4,24
S. rosei
S. fennentati
S. uniporus
12
3
+
+
3,4,5,6,10,23
S. uniporus
S. uniporus
S. exiguus
131
+
+
+
3,4,5,6,10,26
S. exiguus
S. exiguus
S. dairensis
14
2
+
-
+
+
3,4,5,6,10,26
S. exiguus
S. dairensis
S. vafer
15
1
+
+
+
+
3,4,24
S. rosei
S. vafer
1
l
1 S. rosei
16
2
-
-
+
-
+
-
-
3,4,24
S. rosei
S. rosei
S. inccnspicuus
17
2
+
+
3,4,24
S. rosei
R. inccnspicuus
18
1
+
3,4,24
S. rosei
S: inccnspicuus
16
Saccharomyces inconspicuus
Saccharomyces ferrnentati et Saccha-
_r_o_m~y~c~e~s~r~o~s~e~i,indiquentque ces espèces sont très voisines, voire
identiques (135-139-142-1'45).
Ces résultats sont confirmés par le spectre PMR des
polysaccharides et du contenu en GC des chaînes d'A.D.N de ces
différentes espèces (
61
). Les auteurs proposent que ces
espèces soient considérées toutes comme des représentantes de
Saccharomyces rosei, et pensent que la capacité d'assimilation et
de fermentation des sucres ne convient pas à la distinction des
espèces du genre Saccharomyces.
Discussion
Dans la classification de Tsuchiya, C. albicans séro-
type B n'ayant pas l'antigène 6 spécifique du groupe Castellania
n'aurait pas dft figurer dans ce groupe.
Les travaux de Poulain (107
indiquent que des sérums de lapins
infestés par des souches de C. albicans de sérotype B ont encore
une réactivité anti-sérotype A même après adsorption poussée avec
des souches homologues ou hétérologues de sérotype B. Ainsi des
antisérurns spécifiques du sérotype B totalement adsorbés par des
blastospores de la souche homologue continuent de réagir avec des
blastospores de souches de C. albicans sérotype A et de Candida
tropicalis
,ainsi qu'avec les formes parasitaires des souches de
s~rotype B recueillies in vivo. Un tel antisérurn réagit également
avec des tubes germinatifs émis in vitro par des blastospores de
sérotype B alors que les cellules-mères sont dépourvues de cette
propriété. Mais quand ces antisérurns étaient adsorbés par des
souches de sérotype A ils perdaient leur réactivité anti-Candida
albicans.
1 7
Ces observations suggèrent que les cellules de Candida
albicans sérotype B dans certaines conditions et à un moment
donné de leur cycle cellulaire sont susceptibles d'exprimer in
vitro et in vivo des antigènes jusqu'ici considérés comme spé-
cifiques du sérotype A. Autrement dit, les travaux de Poulain
démontrent que C. albicans sérotype B dans certaines conditions,
soit synthétise soit laisse appara!tre un antigène 6 spécifique
du sérotype A. Ceci montre bien que les sérotypes A et B de Candida
albicans ne peuvent être dissociés, réconfortant ainsi la position
taxonomique de C. albicans B dans le groupe de Castellania de
Tsuchiya.
De même l'étude de la pathogénicité chez le lapin des
sérotypes A et B de C. albicans, montre
gue ces deux sérotypes
ont le m~me pouvoir pathogène (
72
). D'autre part, les travaux
de Poulain (106
) montrent oue les levures fra!chement isolées
sont plus réactives en Immunofl'uorescence indirecte (IFI) que les
levures entretenues par cultures depuis plusieurs mois au labo-
ratoire, cette différence de réactivité est due à la présence
chez les levures fra!chement isolées d'antigènes dénommés P. Ces
antigènes sont susceptibles de dispara!tre au moins en partie
quand les souches sont entretenues in vitro par repiquage suc-
cesslls. Ils arrivent à la conclusion que les variations de struc-
ture pariétale observées
pourraient provenir d'un phénomène de
compétition entre les clones riches et pauvres en antigènes P.
Les premiers se dével. oppant préférentiellement dans les tissus
de l'h8te et les seconds lorsque c. albicans est cultivé in vitro
(104-105). Les auteurs ont démontré que ces antigènes P sont plus
abondants chez les souches ayant l'antigène 6 telles que Torulopsis
glabrata
et C. tropicalis et que les sérums de lapins infestés
18
avec des souches de sérotype_B, réagissaient plus fortement avec
de telles souches, qu'avec les souches homologues de C. albicans
ayant servi à l'inoculation.
Ces observations ont des implications sur le diagnostic
sérologique des candidoses. En effet, si une souche de levure a
la capacité d'exprimer in vivo des antigènes différents de ceux
trouvés dans la souche in vitro, cela peut entrainer une identi-
fication erronnée.
Les travaux de Guinet (63
) montrent que des anti-
sérums de lapins préparés par inoculation de parois purifiées de
C. tropicalis révèlent en immunoélectrophorèse bidimensionnelle
des :antigènes pariétaux présents dans les extraits cytoplasmiques
solubles de C. tropicalis. Tout se passe comme si des antigènes
pariétaux induisaient la fabrication par le lapin d'anticorps
contre les constituants cytoplasmiques de la levure.
Des résultats analogues ont été obtenus par Hasenclever
et coll. (71
) qui ont observé que l'adsorption d'un antisérum
anti- C. stellatoidea avec des suspensions de cellules entières
de C. stellatoidea ou de C. albicans B ne supprime pas toutes les
propriétés agglutinantes de ce sérum contre C. albicans groupe A
ou C. tropicalis mais cette adsorption supprime toutes les pro-
priétés agglutinantes contre les souches homologues et les souches
de C. albicans B. Par contre l'adsorption avec une suspension de
cellules broyées de C. stellatoidea ou de C. albicans B supprime
tous les anticorps contre C. albicans A ou C. tropicalis.
Il semble que le lapin fabrique des anticorps contre
des anti.9ènes résidant en profondeur et non sur la paroi de Candida
stellatoidea et donc l'absorption avec des cellules entières ne
supprime pas ces anticorps. C. albicans A et C. tropical~~
19
posséderaient ces antigènes sur leur surface ce qui e~plique
qu'elles.
agglutinent avec de tels antisérums.
Ces observations appellent une remarque importante :
l'inoculation au lapin d'une levure donnée, entrainerait - elle
la formation d'anticorps réagissant contre une autre espèce de
levure ? Cette remarque a une implication directe dans la pré-
~aration des sérums monospécifiques, comme nous verrons dans le
chapitre concernant ce sujet, et par voie de conséquence une
influence sur les réactions d'agglutination utilisant des sérums
monospécifiques.
Bastide et coll. (7, 7bis, 7ter), en êtud-iant la structura anti-
génique des protoplastes de C. macedoniensis
(selon Tsuchiya la
forme levure de C. macedoniensis présente les
Ag.
8-10-28 et
31) et en utilisant les antisérums 3-4-:-6-8-9-et10, ont remar-
qué que les protoplastes obtenus par l'action du mélange lytique
chlorhydrate de mercaptoé~hylamine + bêta 1-3-D glucanase révé-
laient une fluorescence très forte des sites antigéniques 8 et10
et une
fluorescence faible des sites antigéniques 3-6 et 9.
Tout se passe comme si l'action de ce système enzy-
matique dévoilait des sites antigéniques nouveaux.
Imaginons que
les .. Ag.
3-6 et 9 existent effectivement chez C. macedoniensis
et qu'ils soient situés en profondeur sur la membrane cytoplasmique.
Si ces antigènes induisent la fabrication d'anticorps correspondants
i l y aura donc une réaction croisée entre un tel antisérum et les
levures ayant ces antigènes.
Ces mêmes auteurs
(68
}Jen comparant par irnrnunoélec-
trophorèse des antig~nes de C. albicans et de sa forme protoplaste~
ont mis en évidence 13 fractions antigéniques dont 11: sont
communes.
Il y a 2 fractions antigéniques spécifiques de la forme
20
protoplaste. Ces deux fractions spécifiques peuvent éventuelle-
ment induire la fabrication d'anticorps.
D'autre part Coudert et coll. ( 25 ), en utilisant du
sérum humain prélevé au cours d'une septicémie à C. albicans,ont
testé plusieurs levures du genre Candida.
Ils ont étudié de
façon quantitative ce sérum par l'agglutination et l'immunofluo-
rescence en déterminant le taux d'anticorps pouvant être mis en
évidence en employant comme antigène différentes levures.
Pour C. krusei et C. zeylanoides, ils trouvent
des taux en agglu-
tination qui sont contradictoires avec la structure antigénique
de ces levures selon Tsuchiya
(143-145
).
En effet, pour C. zeylanoides et C. krusei ils trouvent
un taux en agglutination et en immunofluorescence identique à
celui obtenu avec C. albicans sérotype A,
(taux de 1/160). La
classification de Tsuchiya
(Tb -1)
permet de noter que C. zeyla-
noides et C. krusei ont respectivement 4 et 3 fractions anti-
géniques sur 7 de communes avec C. albicans.
Ils arrivent à la conclusion que l'étude antigénique
comparée de diverses levures ne peut s'appuyer sur la seule déter-
mination qualitative des fractions antigéniques communes, màis
il- faut considérer la réactivité antigénique de chaque fraction
et son importance quantitative pour chaque espèce considérée.
Nous partageons ce point de vue et nous pensons comme .UULLER
(98 )
qu'il n'y a pas de corrélation directe entre le nombre
d'antigènes communs et le degré de réactivité croisée entre deux
espèces, et qu'un antigène donné peut être très immunogène dans
une espèce, et ne se comporter que comme un antigène accessoire
dans une autre espèce.
Tsuchiya dans sa classification ne tient pas compte
21
de l'importance quantitative de chaque antigène,mais il mentionne
les antigènes existants en très faible quantité entre parenthèses.
Pour notre partnous ne pensons pas que l'importance quantitative
de chaque antigène puisse entraîner des résultats différents dans
la classification de Tsuchiya.
LOrsqu'un Ag. est présent, quelle
que soit son importance, ce qui compte c'est son existence, et sa
présence oriente vers l'appartenance à tel ou tel groupe.
A propos de la classification de Tsuchiya,
Lodder
(90)
fait remarquer que C. pulcherrima et C.
reukaufii
qui sont très
voisines, voire identiques par leurs propriétés biochimiques sont
rangéesdans des groupes différents,
respectivement les groupes IV
et III des Candida
(Tb 1). Lodder pense que la méthode sérologique
est utile dans la classification des levures, mais qu'un système
de classification basé uniquement sur la sérologie est inacceptable.
Pour Lodder "la plus parfaite des classifications doit
être naturelle c'est-à-dire basée sur la phylogénie". En ce qui
concerne les levures il n'ya pas de classification naturelle adéquate
ce qui explique la multitude des critères proposés. En définitive,
la meilleure classification serait celle qui regrouperait le maximum
de caractères, mais tous ces caractères doivent se recouper i de
plus cette classification doit comporter au moins deux des méthodes
suivantes :
le spectre PMR de la paroi polysaccharidique,
les caracté-
ristiques sérologiques,
la quantité en guanine-cytosine de l'A.D.N,
l'hydrolyse enzymatique de la paroi en plus des propriétés physiolo-
giques usuelles, car ces méthodes analysent la structure pariétale
et génétique des levures, caractères qui,
selon nous,
sont fonda-
mentaux à une classification acceptable.
II - LES METHODES DE DIAGNOSTIC DES LEVURES
22
II - Les méthodes de diagnostic des levures
Avant d'entreprendre toute identification, il est
indispensable de partir de souches pures. Plusieurs techniques
de purification, notamment l'ensemencement sur milieu de Raulin
ont été préconisées. Dans notre travail, nousavons procédé de
la façon suivante: nous choisissons une colonie isolée dans la
primoculture et nous l'ensemençons sur boite de Pétri gelosée,
nous isolons une nouvelle colonie que nous réensemençons sur
gelose inclinée.
A - Les méthodes classiques
1) Les caractères culturaux
Toutes les levures peuvent pousser en milieu liquide
ou en milieu solide. L'aspect macroscopique des cultures peut
quelquefois orienter vers le diagnostic de telle ou telle levure.
En milieu liquide,
les caractères fondamentaux sont la présence
ou l'absence de sédiment, d'anneau et d'un voile aéré ou mem-
braneux. En milieu solide,
les colonies de levures peuvent être
bombées ou plates, crémeuses à surface ~isse ou rugueus~,d'aspect
brillant et humide ou mat et sec,
les bords des colonies régu-
liers ou festonnés. La couleur des colonresblanche, chamoise,
beige ou franchement pigmentée. Il faut reconnattre que ces carac-
tères culturaux ont un intérêt limité dans l'identification des
levures.
2) Les caractères morphologiques microscopiques
2 -
Formation de pseudomycélium ou
de vrai mycélium
Le pseudomycélium est un mycélium bourgeonnant, i l
est formé de bourgeons qui sont attaché~les uns aux autres,
23
i l n'y a pas de véritables cloisops
( 8 9 ) .
Le mycélium vrai est formé de tubes plus ou moins ramifiés,
i l peut ~tre cloisonné ou non (89
). L'étude de la formation de pseu-
domycélium et
1 ou de vrai mycélium se fait sur des milieux pauvres
(renfermant la quantité minima indispensable de protides et de glu-
cides)
tels que le milieu de Taschdjian à la crème de riz, agar et
au tween
(R.A.T.)
ou le milieu
à base de pomme de terre carotte
et bile
(P.C.B.) (milieu de Pavlatou et Marcelou).
La distinction entre le genre Candida et le genre Torulopsis
se fait sur la capacité de former du pseudomycélium par les levures
du genre Candida et l'absence ou la formation de pseudomycélium rudi-
mentaire pour les levures du genre Torulopsis
(2-10-89-116-146).Une
atmosphère enrichie en co2
(20 %)
favorise la formation de pseudo-
mycélium
(
2
). Cependant,
i l faut avoir présent à l'esprit qu'il
a été démontré que certaines espèces et Torulopsis' -' telle que Toru:..:
lopsis sake,produisent du pseudomycélium
(90 ~CeCritère peut donc
conduire à une identification absurde. D'autre part à l'intérieur du
groupe des Candida chez quelques espèces la formation de pseudomycé-
liurn est très variable. Par exemple i l est bien connu que certaines
souches de Candida pseudotropicalis donnent un pseudomycélium abondant,
alors que dans d'autres souches le pseudomycélium est rare, voire
absent
(108). De plus i l faut noter que ce caractère dépend largement
du milieu de culture, d'où la nécessité de standardiser les techniques
et les milieux de culture. Ce problème a fait l'objet de la préoccu-
pation d'un groupe de travail réunissant 10 laboratoires de mycologie.
Ce groupe d'études a proposé des milieux standards pour l'isolement
et l'identification des levures et des dermatophytes et i l a fait des
recommendations utiles pour améliorer la qualité des analyses
(10
Kamaya T
( 79
) dans des conditions expérimentables bien
définies arrivent à différencier sur Corn-meal-agar C. albicans qui
ne donne que des formes levures de C.
stellatoidea qui donne de longs
filaments fins.
( le test de Kamaya consiste à inoculer un milieu
liquide de Sabouraud au dixième avec les organismes à tester, on
incube à 37 Oc. pendant une heure, ensuite on ensemence par inondation
24
la surface du milieu corn-meal-agar avec cette suspension de blas-
tospores et la culture est incubée à 37°C pendant 24 heures ).
2 -
2 -
Formation de chlamydospores
Les chlamydospores selon LANGERON
(89
) sont des spores
volumineuses à paroi épaisse et à contenu lipidique dense. Elles
peuvent être terminales ou intercalaires, et les protochlamydos-
pores, sont des articles renflés sur lesquels naissent chez les
levures, du groupe C. albicans une ou deux rarement trois chlamy-
dospores.
La recherche de chlamydospores se fait sur des milieux
pauvres en glucose et riches en polysaccharides. Pour certains auteurs
~es monosaccharides, essentiellement le glucose, inhibent la forma-
tion de chlamydospores, alors que les polysaccharides favorisent leur
développement
( 44-96-98). Un certain nombre de milieux sont utilisés,
citons le milieu R.A.T et le milieu P.C.B.
Les facteurs favorisant la chlamydosporulation sont
un pH alcalin, une légère anaérobiose, l'épaisseur du milieu, une
tension superficielle faible
(rÔle du tween 80 dans le milieu R.A.T.I,
(46-47-48-96). Cependant, WALKER et HUPPERT
(1501
pensent que si le
tween augmente la formation de chlamydospore, i l induit la chlamydos-
poration chez certains Candida tel que C. tropicalis.
La formation de chlamydospore est favorisée par une incu-
bat ion à l'obscurité, une dilution appropriée de la levure
(environ
6
10
cellules
Iml)
des cultures jeunes etc .•.
(3-4-44-45).La tempé-
rature optimale d'incubation se situe entre 20 et 28° C, à 37 c on
note une inhibition de la chlamydosporulation
(89).
25
L'étude de la chlamydosporulation peut se faire par cul-
ture sur lame, par ensemencement en strie et en profondeur, par la
technique de DALMAU (27)
qui selon plusieurs auteurs donne d'excel-
lents résultats, ou par la technique décrite par ANDRIEU et THERIZOL
(2) qui est une variante de la technique de DALM~O .
Seuls C. albicans et C. stellatoidea produisent des chla-
mydospores/90 à 95 % des souches donnent des chlamydospores sur des
milieux appropriés
(2-96).
2 -
3 -
La blastèse
Le phénomène de germination des levures en un long tube
germinatif a été signalé par LANGERON et TALICE en 1932
(88).
c'est LANGERON et GUERRA qui l'ont décrit en 1940 sous le
nom de blastèse
(87). TASCHDJIAN en 1960 (124) montre que la forma-
tion de «germ-tubes»
peut être utilisée en routine pour l'identifi-
cation de C. albicans et de C. stellatoidea. Il a été montré par cer-
tains auteurs
(95) que quelques souches de C.tropicalis provenant de
la cavité buccale produisent des «germ-tubes», mais que ce phénomène
regresse avec les subcultures repétées in vitro de ces souches.
BOWMAN et AHEARN dans l'un de leurs travaux
(17)
souligent
que quelques souches de C.tropicalis peuvent former des éléments pseu-
domycéliens qui ressemblent grossièrement à des «germ-tubes», mais
qu'à la différence des «germ-tubes»
typiques de C.albicans,ce sont
des cellules allongées présentant par endroit des constrictions. Ces
auteurs font remarquer que quelques souches de C.albicans peuvent
produire des tubes germinatifs
clbisonnés mais que seuls les «germ-
tubes»
sans cloisons posent le diagnostic de C. albicans.WARWOOD(151)
proposent le milieu à base de crème de riz
+ agar pour différencier
les germ-tubes de Candida albicans et les pseudomycélium de Candida
tropicalis.
Ce procédé d'identification de C.albicans est basé sur la
rapide formation de tube germinatif par les levures dans le sérum
humain, animal ou dans des milieux appropriés. L'incubation se fait
à 37 0 C et la germination est obtenue en moins de 4 heures.
La production de «germ-tubes»
est influencée par le pH
(favorisée par un pH voisin de la neutralité), la densité d'ensemen-
cement
(le pourcentage de tubes germinatifs est directement propor-
tionnel à la concentration en sérum et inversement proportionnel .
à la concentration en blastospores, 10 5 à 10 6 cellules
/ ml consti~
tuent l'inoculum optbnum), la température d'incubation
(la germi-
nation n'est pas influencée par
26
une incubation à 32 c C,
37°C ou 42~C, mais elle est réduite
quand l'étude est effectuée à 4~C, 25~C ou 45~C), une contami-
nation bactérienne, le milieu utiliséUe
sérum humaiQ peut
contenir de la ferritine. qui diminue le développement de «germ-
tubes», l'âge de la colonie de levure
(de préférence des colonies
jeunes), l'adjonction·
\\ d'une petite quantité de glucose ou de
proline favorise la formation de «germ-tubes», par contre,
l'adjonction d'antifongiques tels que l'amphotericine B et la
nystatine réduisent le taux de «germ-tubes»
( 96-5-26-86-49-92).
3) Caractères sexuels
Nous ne citerons que la recherche d'ascospores.
L'ascospore est caractéristique des Ascomycètes. C'est une spore
qui prend naissance dans une enveloppe particulière: l'asque.
L'une des étapes dans l'identification d'une levure est de savoir
si oui ou non une levure est capable de former des ascospores.
Quelques levures Ascomycètes forment volontiers des ascospores
sur le premier milieu d'isolement, d'autres par· contre exigent
des milieux spéciaux. La capacité de former des ascospores varie
d'un isolement à l'autre et peut être complètement perdue chez
des vieilles souches de laboratoire.
Les milieux spéciaux pour ascospores diffèrent des
autres milieux car ils contiennent très peu de sucre. Plusieurs
milieux ont été proposés, entre autres le milieu Gorodkowa agar,
le milieu V-8 juice agar et le milieu YM agar. Le milieu doit être
incubé en aérobiose à une température de 20 à 25° C et i l faut
partir de souches jeunes. Certaines levures donnent des ascospores
en 2 ou 3 jours, d'autres demandent un temps beaucoup plus long
trois à six semaines.
27
4) Les caractères physiologiques
Le diagnostic d'espèce de levures repose essentiellement
sur les caractères biochimiques tels que l'étude de l'assimilation
et de la fermentation
des sucres ainsi que l'étude des substances
azotées.
4 -
1 Utilisation des sucres
(auxanogramme
du carbone)
L'assimilation désigne la possibilité pour une levure
de se développer en utilisant tel ou tel sucre pur.
Les· milieux pour l'étude de llutilisation des sucres sont des
milieux synthétiques à base de sulfate d'ammonium, de vitamines
et de sels minéraux mais exempts de sucre. Ces milieux doivent
avoir un pH voisin de 5,8 et doivent être incubés à 25 ou28° C.
Il faut éviter l'incubation à 37 0 C car à cette température
beaucoup de disaccharides peuvent être dissociés en leur sucre
respectif. Plusieurs méthodes ont été préconisées pour étudier
l'assimilation des sucres, elles sont toutes des variantes des
techniques auxanographiques de Beijerinck cité par Langeron (89).
Lodder
(90)
préconise l'emploi d'au moins 7 sucres qui
sont : le glucose,
le' galactose,
le saccharose,
le maltose,
le
lactose,
le mélibiose, et le raffinose. Les résultats de l'assimi-
lation auxanographique sont lus en 2 ou 4 jours par l'apparition
d'un halo laiteux autour du point de dépÔt du sucre considéré,
traduisant une prolifération des blastospores.
Selon Lodder
(
90 ) i l faut avoir présent à l'esprit
que certaines souches de certaines espèces de levure peuvent
acquérir la capacité d'utiliser certains sucres après maintenance
prolongée sur des milieux tel que le milieu malt-agar.
28
4 -
2 Fermentation des sucres
(zymograrnme)
C'est la désintégration des sucres en anaérobiose
accompagnée de la formation d'acide carbonique
(formation de
bulle de gaz). Le milieu de base pour la fermentation doit con-
tenir une quantité adéquate de composés nitrés, de vitamines et
d'éléments minéraux. La présence d'un indicateur de pH tel que
le réactif d'Andrade, le bleu de bromothymol ou autre est souvent
utile.
Un changement de couleur de l'indicateur traduit soit
une désintégration du sucre, soit une contamination bactérienne,
soit les deux.
Dans le test de fermentation le virage de l'indicateur
ne doit pas être lu comme ~e fermentation positive mais primiti-
vement comme une assimilation du sucre, car si un sucre est fer-
menté
i l est aussi assimilé. C'est l'une des lois des fermentations
de Kluyver-Dekker. Ces lois sont les suivantes
:
1) Toutes les levures assimilent le glucose.
2) Toute levure qui fait fermenter un sucre l'assimile
nécessairement.
3) Toute levure qui ne fait pas fermenter le glucose,
ne fait fermenter aucun sucre.
4 Toute levure qui fait fermenter le glucose fait fer-
menter aussi le fructose et le mannose.
5) Aucune levure ne fait fermenter en même temps le
maltose et le lactose.
C'est la production de gaz qui indique que la fermentation est
positive. Les milieux doivent être incubés à 25
-
3üoc; et comme
pour l'assimilation i l faut éviter une incubation à 37ccar à
29
cette température les disaccharides ainsi que d'autres sucres
peuvent être dissociés en leur sucre de base et ces derniers
peuvent être fermentés. Pour beaucoup d'auteurs la fermentation
est moins stable que l'assimilation (20,60,125). Langeron et
Guerra (87) ne partagent pas ce point de vue, pour eux les diver-
gences des résultats proviennent de 3 causes principales.
â) Emploi de souches contaminées par des bactéries.
b) Emploi de souches impures.
c) Emploi de sucres impurs.
les propriétés enzyrratiques des levures sont dues â la constatation
selon KalstrèSm d'après Langeron (89) qu'il Y a deux types principaux
d'enzymes :les enzymes de constitution qui sont formés par les
microorganismes quel que soit le substrat, et les enzymes d'adap-
tation qui résultent d'une stimulation chimique. La capacité de
former les enzymes d'adaptation se transmet de souche à souche,
mais peut disparaitre si l'on modifie la composition du milieu.
Cette dernière hypothèse semble confirmer par plusieurs auteurs
qui ont vu les caractères fermentaires de levures modifiées après
entretien prolongé sur le milieu malt-agar
(90).
Pour Rhoades d'après Langeron (89) une nutation pourrait eri.tra!ner
des rrodifications stables dans la
formation des enzymes. Il semble que
les aptitudes fermentaires d'une levure soient très sensibles aux
phénomènes d'adaptation et de mutation.
Pour étudier les propriétés fermentaires d'une levure
Lodder (90 ) préconise dans un premier temps l'emploi de six
sucres qui sont : le glucose, le maltose, le lactose, le saccha-
rose, le galactose et le raffinose.
30
4 -
3 L'utilisation de composés azotés
L'assimilation des composés azotés peut être utile dans
l'identification des levures._pJusieurs d'entre elles sont capables
d'utiliser le sulfate d'ammonium',
l'asparagine,
la peptone,l'urée
etc . . . Comme seule source d'azote, par contre le nitrate de pota-
sim,
le nitrate de sodium et quelques acides aminés sont utilisés
sélectivement par différentes levures. Pour l'étude, de l'utilisa-
tion des composés azotés on peut pratiquer la méthode auxano~raphi-
que,
4 -
4 L'hydrolyse de l'urée
C'est un caractère biochimique important dans l'identifi-
cation des levures. Presque toutes les levures sont capables d'assi-
muler l'urée, mais elles ne possèdent pas toutes une uréase.
L'hydrolyse de l'urée a été proposée par Seeliger
(115) dans l'iden-
tification des levures. Les levures uréase + appartiennent à quelques
genres afermentatifs tels que Cryptococcus, Rhodotorula, Sporobolo-
myces, Trichosporon et Candida. Ce test permet une différence de
genre, mais les diverses espèces et leurs variétés ne peuvent pas
être distinguées l'une de l'autre sur la base de l'hydrolyse de
l'urée. De peu d'intérêt dans l'identification d'espèce, ce test a
l'avantage de permettre une séparation rapide des Cryptocoques, des
autres levures afermentatives.
Pour la recherche de l'uréase on peut utiliser soit le milieu gélosé
à l'urée de Christensen, soit le milieu liquide, urée-indole.
L'incubation se fait à 30 ou 37° C. Le test est positif si le milieu
vire du jaune ou rouge violacé.
31
5) Le& autres caractères
5 -
Résistance à la Cyclphexirnide (actidione)
L'actidione est un antibiotique isolé de streptomyces
griseus. D'après IDàder (90), c'est Whiffen qui le premier en 1948 a rapporté
que les levures variaient dans leur sensibilité à l'actidione.
La sensibilité à l'actidione est un bon «test d'approche»
dans
l'identification des levures, plus particulièrement dans l'iden-
tification des levures du genre Candida, il faut souligner que
Cryptococcus neoformans est sensible à l'actidione. Selon plu-
sieurs auteurs (147 ) dans certaines conditions des souches
entretenues en laboratoire peuvent acquérir la propriété de
résister à l'actidione, ce phénomène est plus volontiers observé
avec des souches de Saccharomyces cerevisiae (147
). Cependant
ce test garde sa valeur sur les souches de primoculture, repiquées
sur milieu de Sabouraud + actidione. L'incubation est effectuée
à 25° C et la lecture 24 à 48 heures plus tard, mais seul le
résultat de 24 heures a une importance taxonomique (- 37 ).
5 - 2 Réduction du chlorure de triphényl
tétrazolium (T.T.C)
L'étude de la réduction du T.T.C se fait sur le milieu
de Pagano, Levin et Trejo. Le groupe d'études de la société Fran-
çaise de mycologie médicale sur la standardisation de l'utilisation
des principaux milieux d'isolement et d'identification en analyse
mycologique, souligne qu'on peut utiliser indifféremment le T.T.C
à la concentration de 50 ou 100 p.g / ml
toutes les levures se développent sur ée milieu, mais
certaines réduisen~~chlorure de triphényl tétrazolium et cela se
traduit après 48 heures à 26°c(
10 )
par le virage de la colonie
32
du blanc au rouge plus ou moins foncé suivant les espèces.
Ce groupe d'études préconise d'interprêter l'intensité du virage
du T.T.C selon l'échelle suivante.
Pas de coloration -
rose pâle
+
rose franc
+
rouge à saumon
+ +
lie de vin
+ + +
Cette échelle est similaire à celle proposée par Mallie et coll.
( 93
) après 24 heures de culture à 26° C.
Selon ce groupe d'étude$, la réduction du T.T.C est
très utile pour améliorer la rapidité de l'identification des
levures. Ceci est cor.firmé par les travaux de Mallie et coll ( 93)
sur la valeur de ce miliéu pour l'identification rapide des levures
des genres Candida, Saccharomyces, Torulopsis et Hansenula.
Parmi les souches non réductrices .on trouve des espèces
fréquemment isolées comme C. albicans et C. krusei. Par contre,
C. stellatoidea, C. pseudotropicalis, C. macedoniensis, Torulopsis
glabrata réduisent nettement le T.T.C , enfin, C. tropicalis et
C. guilliermondii et de nombreuses espèces de Saccharomyces le
réduisent intensément. Pour cette étude il est utile d'ajouter
du chloramphénicol au milieu au T.T.C, afin d'éviter d'éventuelles
contaminations bactériennes qui fausseraient les résultats ; en
effet, les bactéries réduisent intensément le T.T.C.
S - 3 L'étude de la température de développement
En plus des propriétés physiologiques et morphologiques
l'identification de quelques levures peut être orientée par la
détermination de la capacité à pousser à température élevée.
33
La plupart des levures ont une température optimale
de croissance située entre 20° C et 28° C. Du point de vue taxo-
nomique, il est intéressant de déterminer si oui ou non une levure
est capable de pousser à 37° C.' Cryptococcus neoformans, espèce
pathogène peut être distinguée de la plupart des autres membres
du genre Cryptococcus par sa propriété de croître à 37° C.
Une autre espèce Cryptococcus lactativorus est capable de pousser
à 37° C,
mais c'est une espèce non pathogène isolée de l'eau de
mer.
Saez et coll t~13) étudiant la température maximale de
développement de 3 Cryptococcus : Cryptococcus neoformans, Crypto-
coccus uniguttulatus, et Cryptococcus luteolus, font observer que
Cryptococcus neoformans et Cryptococcus uniguttulatus (espèce
pouvant être isolée chez l'homme) ne peuvent se différencier en
testant simplement le développement de la souche à 37° C, car cette
dernière espèce tolère des températures allant de 32° C à 37° C.
Ces résultats sont en contradiction avec ceux de Phaffet FeIl (lO~
qui trouvent une température maximale de développement de 34°C
pour Cryptococcus uniguttulatus.
L'étude de la température de développement à elle seule
ne suffit donc pas à identifier l'espèce Cryptococcus neoformans,
il faut faire intervenir d'autres caractères tels que la présence
d'uréaseJI'assimilation de l'inositol etc •..
S - 4 Etude de la pathogénicité chez l'animal
C'est un caractère important, qui peut serv.ir au diagnos-
tic de C. albicans et de Cryptococcus neoformans.
L'animal de choix pour l'étude du pouvoir pathogène des
Candida est le lapin. Toutes les souches de C. albicans, inoculées
34
par voie intra-veineuse provoquent la mort de l'animal en 3 à 7
jours, suivant la concentration de l'inoculum (37 ).
C. albicans se présente dans tous les tissus sous forme
filamenteuse et sous forme de levures rondes ou ovales, bourgeo-
nnantes. On t~ouve de nombreux abcès surtout dans le rein et le
cerveau ( 37).
L'injection sous cutanée peut provoquer un abcès en 48
heures. C. tropicalis est à un moindre degré, pathogène pour le
lapin. Les autres espèces ne le sont pas.
Drouhet fait remarquer que les lésions anatomo-patholo-
giques du lapin dues à C.
tropicalis
sont semblables à celles
provoquées par C. albicans,
la seule différence résidant dans la
forme des parasites. Dans l'infection à C. tropicalis, ce sont les
formes levures qui prédominent{37tpour certains auteurs
(91-152), la
formation de filaments dans les tissus doit être considérée, comme
un accroissement de la pathogénicité, car les filaments sont phago-
cytés plus difficilement que les formes levures
(152 ). Cette hypo-
thèse semble confirmer par l'expérience de Drouhet qui montre que
3 souches de C. tropicalis non mortel15pour le lapin provoque
néanmoins des lésions rénales et cérébrales avec des parasites
levuriformes. Cependant, Gresham et coll
(:62) ont démontré que
C. albicans peut provoquer chez le lapin une infection mortelle,
même quand la formation de filaments est inhibée par l'administra-
tion d'Isoniaside.
Hasenclever et coll. (72
) ont montré que la sensibilité
des lapins aux souches de C. albicans sérotype B est considérable-
ment plus grande que celle, de C. stellatoidea. Bien qu'il y ait
une étroite ressemblance antigénique entre ces deux organismes
(60-71-74-77), cette similarité n'est pas reflétée dans la virulence
35
chez le lapin. D'autre part
la virulence des souches de Candida
albicans sérotype A ou B est nettement plus élevée que celle de
C. tropicalis. Les auteurs
(72
concluent que la pathogénicité
chez le lapin est un moyen fiable pour séparer C. albicans de
C. stellatoidea et C. tropicalis, et que cette pathogénicité est
d'une signification taxonomique importante.
Parmi les Cryptococcus seul Cryptococcus neoformans est
pathogène (116). L'animal le plus sensible est la souris. L'inocu-
lation intracrânienne à cet animàl d'une émulsion légèrement opa-
lescente d'une culture de Cryptococcus néoformans provoque la mort
de la souris en 3 à 8 jours avec atteinte du système nerveux
central
( 116). A la ponction ou à l'autopsie on trouve dans les
méninges écrasées entre lame et lamelle des levures encapsulées.
36
B - Les méthodes rapides
L'identification précise d'une levure par les méthodes
classiques demande parfois plusieurs jours voire un mois, cela
du fait de la variabilité éventuelle des propriétés biologiques
mais également des propriétés morphologiques. L'ascosporogenèse,
la chlamydosporulation ou la formation de pseudomycélium et/ou
de vrai mycélium pouvant faire défaut.
Or en clinique, 0 u en milieu industriel on ne peut pas
toujours se permettre d'attendre trop longtemps pour une~r~utigœ
ou pour interrompre une chaîne de fabrication. Ceci est particu-
lièrement vrai lorsqu'on se trouve en présence de septicémies à
Candida (101),
à Torulopsis glabrata
(13)
ou à d'autres lèvur.es(1l4).
Septicémies relativement fréquentes
avec l'utilisation intensive
d'antibiotiques et d'irnmuno-suppresseurs, d'où la nécessité de
disposer d'une méthode de diagnostic fiable et rapide. Plusieurs
chercheurs ont mis au point divers kits de diagnostic ~apide des
levures; après présentation de ces différentes méthodes, nous
étudierons la fiabilité et la rapidité de chacune d'entre elles.
1)
Le système API zyrnogramme et auxanogramme 20 C
Ce système comprend huit microtubes destinés à l'étude
de la fermentation du glucose, du galactose, du saccharose, du
lactose, du raffinose, du tréhalose, du mélibiose, et dix micro-
tubes destinés à l'étude de l'assimilation de ces mêmes sucres
plus l'inositol et le cellobiose. Un autre tube permet d'apprécier
la croissance en présence d'actidione.
Pour pallier à l'insuffisance de cette méthode, Gille
et Guinet
5 9 ) ont proposé les modifications suivantes:
- adjonction à ce système de la recherche de la
réduction
37
du trichlorure de triphényl tétrazolium, modification de la
grille de lecture en considérant que Geotrichum canàjduID et
Trichosporon cutaneum acidifient
le glucose
et le galactose et
poussent en présence d'actidione
( ces deux levures connues pour
leur résistance à l'actidione ont poussé en présence de l'anti-
fongique dans plusieurs cas).
- utilisation d'un inoculum faible pour les assimilations
et plus dense pour les fermentations.
Avec ces modifications, les auteurs obtiennent de bons résultats
en 48-72 heures.
Le système API zymogramme et auxanogramme 20 C est un
système utile en pratique courante, mais l'étude de la résistance
à l'actidione et surtout les fermentations des hydrates de carbone
étant insuffisantes
(98
), ce système peut dans certains cas être
à l'origine de résultats erronés. L'adjonction à ce système de
l'étude des caractères morphologiques et d'autres modifications
sont certainement nécessaires pour obtenir des résultats satisfai-
sants.
La difficulté de lecture et la variabilité des résultats
du zymogramme, ont obligé la firme à abandonner les caractères
zymographiques et à n'utiliser que des caractères auxanographiques
plus stables. Ainsi a été conçu le nouveau système API 20 C auxa-
nogramme.
2) Le système API 20 C auxanogr.w~e
La galerie API 20 C auxanogramme est conçue pour l'iden-
tification précise des levures les plus rencontrées en pathologie
humaine,dans un délai assez court 48 à 72 heures au plus.
Ce système se compose d'une galerie de 20 cupules con-
tenant des substrats déshydratés et d'un milieu d'inoculation
38
permettant l'identification des principales levures du genre
Candida et des autres genres rencontrés en clinique tels que
Cryptococcus, Torulopsis, Geotrichum, Trichosporon, Rhodotorula
et Saccharomyces
L'identification de la levure se fait à l'aide d'un
tableau de résultats, ou à l'aide d'un index comportant la liste
des levures dont les caractéristiques ont été codées.
Un inconvénient majeur de ce système est qu'il n'est pas rare
qu'on obtienne des résultats qui ne correspondent à aucune levure
dans le tableau des résultats, ou dans l'index. D'autre part, pour
une levure donnée i l arrive qu'il y ait plusieurs profils dans
l'index. C'est le cas de Saccharomyces cerevisiae qui a plus d'une
dizaine de profils dans l'index, ceci peut conduire à des confu-
sions.par exemple
Dans l'index, Saccharomyces cerevisiae et
Rhodotorula rubra ont des profils identiques. Ces deux levures
différent
uniquement par la formation d'ascospores.
Ce système à lui seul ne suffit donc pas toujours à
identifier une levure donnée, i l faut lui associer certains carac-
tères morphologiques, et cela peut nécessiter plus de 72 heures.
Douchet et coll
(32)
ont obtenu de bons résultats avec ce système
dans l'identification des levures de détermination difficile c'est-
à-dire des levures qui n'ont pas pu trouver un nom précis à l'aide
des tests courants de laboratoire. Ils ont mis en évidence un
groupe important de levures
: Torulopsis Candida, très souvent
isolées sur la peau en cas de dermatoses. Il faut souligner que
les auteurs n'ont pas pu mettre en évidence Torulopsis Candida
avec le système API zyrnogramme et auxanogramme 20 C. Shinoda et
coll
(117
) ont cependant obtenu de très bons résultats
(95 % de
IdiagnOstic précis) avec cette microméthode.
39
Le système API 20 C auxanogramme, est un kit fiable
de manipulation et d'interprétation facile à condition de
travailler dans les normes préconisées par le fabricant et sur
des souches purifiées. Cependant, ces
microcupules ne per-
mettent pas de noter les mélanges de souches, tels qu'on peut
les voir avec la méthode classique. D'autre part, ce kit relati-
vement rapide, résultat en 72 heures, durée parfaitement compatible
avec le travail de routine, donne de meilleurs résultats lors-
qu'on l'associe aux caractères morphologiques.
3) The uni-yeast-tek kit
Le uni-yeast-tek kit est composé de plusieurs microtubes,
7 d'entre eux contiennent de la gelose avec 7 composés carbonés
pour l'assimilation du Saccharose, du lactose, du maltose, du
raffinose, du cellobiose, du trehalose,et de l'amidon soluble,
un tube renferme de la gelose plus de l'urée pour la recherche de
l'uréase, un autre du nitrate de potassium pour étudier l'assimi-
lation de ce produit, un microtube contient de la farine de mals
avec du tween 80 pour la formation de pseudomycélium et de chlamy-
dospores, enfin, un dernier tube contient de l'extrait de boeuf
et du glucose pour la production de germ-tubes.
Ce kit est conçu pour l'identification de 16 levures
communément isolées en médecine humaine
(7 levures du genre Candida
4 du genre Cryptococcus, 2 du genre Rhodotorula, Saccharomyces
cerevisiae, Torulopsis glabrata et Trichosporon cutaneum.
En utilisant ce kit Bowman et Ahearn, obtiennent 99,8 % d'identi-
fication correcte sur 436 levures communément rencontrées en
clinique. Pour les auteurs en dehors des seize levures prévues
par le kit, l'identification des autres levures isolées doit être
40
considérée comme présomptive et nécessite donc une étude plus
complète des caractères morphologiques et physiologiques.
Pour BOWAN et AHEARN (17), ce kit est pratique, de manipu-
lation facile,
relativement rapide puisqu'il donne des résultats
fiables en 3 à 4 jours dans la plupart des cas. Cependant l'iden-
tification précise de certaines espèces telle que Cryptococcus
neoformans nécessite l'étude d'un plus grand nombre de caractères.
Pour notre part, nous pensons que les caractères utilisés dans ce
kit sont insuffisants pour une identification précise.
4). -
"Mycotube"
Roche
Le "Mycotube" Roche est une galerie prête à l'emploi pour
l'identification biochimique des levures les plus importantes en
médecine.
Il comporte huit compartiments renfermant des milieux spécifiques
qui permettent de mettre en évidence simultanément 10 caractères
biochimiques différents: fermentation du glucose et la production
de gaz, la fermentation du xylose, la fermentation du saccharose
et production de gaz, la fermentation du raffinose, la fermentation
du lactose, la fermentation du tréhalose, l'utilisation du citrate
et la présence d'uréase.
Tous les 8 compartiments sont ensemencés en une seule manipulation
et l'interprétation des résultats s'effectue après 2 à 3 jours
d'incubation à 30 °-37 oc.
Les laboratoires Roche préconisent d'associer à cette galerie,
l'étude des caractères morphologiques
(Chlamydospores, tubes ger-
minatifs, arthrospores, capsule, pseudomycélium)
et la détermination
41
de la sensibilité à la cycloheximide (actidione). Ce kit fait
intervenir surtout les caractères fermentaires des levures. Plu-
sieurs auteurs ont évoqué le faible stabilité de la fermentation
par rapport à l'assimilation (60-125-133). Nous n'avons pas l'ex-
périence de ce kit, mais les laboratoires Roche soulignent la
fiabilité des milieux spécifiques utilisés.
5). - Nouveau kit de l'Institut Pasteur ( 43 )
Ce kit comprend une galerie en boite plastique avec 7
minitubes en un seul bloc pour l'étude des caractères morphologiques
(1 0 milieu P.C.B. pour l'étude du pseudomycélium et' / ou des formes
levures, 2 0 milieu sérum pour l'étude des tubes germinatifs) et
physiologiques (3 0 milieu urée-indolepour la recherche de l' uréase,
4 0 milieu de Sabouraud + actidione, 5 0 milieu de Sabouraud + tétra-
zolium + chloramphénicol pour la recherche de la réduction du tétra-
zolium, 6 0 milieu pour l'étude de la fermentation du glucose, 7 0
milieu pour l'étude de la fermentation du maltose.
A côté de ces 7 minitubes, le système comporte des boites
carrées de 12 cm de côté en plastique et des milieux appropriés
pour l'étude de l'assimilation de 16 produits carbonés et de 2 prcxluits
a~otés (nitrate de potasium et sulfate d'ammonium).
Selon les auteurs, ce kit permet l'identification de toutes les
levures d'intérêt médical ou industriel. La galerie des 7 micro-
tubes permet l'identification des principaux genres de levure et
de l'espè~e C. albicans. L'auxanogramme des éléments carbonés et
42
azotés permet de déterminer les espèces une fois que le genre
a été reconnu, et permet également de confirmer certains genres.
Ce nouveau kit est plus rapide, plus performant, plus
sensible et plus reproductible que la galerie auxanographique à
20 caractères (
), et en utilisant à la fois les caractères
morphologiques des levures et surtout en utilisant beaucoup plus
de composés carbonés que la plupart des kits qui associent ces
deux caractères, cette nouvelle méthode augmente les chances d'une
identification plus précise.
6°) Sérotypage : Candida check kit
Jusqu'à un passé récent, les tests sérologiques ont été
peu utilisés en routine pour l'identification des levures. Cela
s'explique d'une part par les réactions croisées existant entre
diverses levures, et par les difficultés rencontrées pour obtenir
les sérums monospécifiques.
Ces réactions croisées ont été mises en évidence entre
les espèces de levure du même genre mais également entre des
espèces de genres différents. Plusieurs méthodes ont été utilisées
pour détecter ces parentés antigéniques : l'immunoélectrophorèse
( 16 ), l'immunofluorescence (6-82), l'agglutination directe (22 -137),
la déviation du complément (76)ffi3.is également des tests d 'hypersensi-
bilité immunitaire. Gargani et coll ( 56 ) en utilisant cette
dernière méthode ont étudié les éventuelles réactions croisées
entre C. albicans, C. maltosa, C. utilis et C. lipolytica par
inoculation intradermique au cobaye, ils ont démontré la présence
de réactivité croisée entre C. albicans, C. utilis et C. maltosa
en ce qui concerne la réponse du cobaye sensibili~é à l'inoculation
intradermique.
43
La souche de C. lipolytica est dépourvue de réactivité
croisée avec les autres espèces. Ces résultats rejoignent ceux
obtenus par Tsuchiya et coll. En effet, C. albicans et C. utilis
appartiennent au groupe de C. albicans de Tsuchiya alors que
C. lipolytica appartient au groupe de Schizosaccharomyces pombe,
groupe tout à fait différent du point de vue antigénique du groupe
Candida. Il n'y a donc pas de réaction croisée possible entre ces
2 groupes ( 145 ) .
Bastide et coll (
9
) ont obtenu des résultats analogues
Ils ont observé chez le lapin une hypersensibilité retardée croisée
entre C. albicans et Saccharomyces cerevisiae. Ces résultats con-
cordent également avec la classification de Tsuchiya, ces deux
levures faisant partie du groupe de C. albicans.
Tsuchiya et coll, grâce à un travail approfondi, utili-
sant la méthode d'agglutination sur lame, ont établi la structure
antigénique de plus de 140 espèces de levures (143-14~ Ils ont
préparé dès 1905, des sérums monospécifiques, par des procédés
d'immunisation de lapins, et d'adsorption des irnrnunsérurns obtenus
par des antigènes hétérologues adéquats.
(Nous étudierons ces
procédés dans la troisième partie de ce travail).
Ces auteurs ont montré l'intér~t de la méthode d'agglu-
tination sur lame, dans l'identification des espèces du genre
Candida en utilisant des sérums monospécifiques.
Sweet et Kaufman en 1970, en utilisant également leurs
propres sérums monospécifiques ont démontré la fiabilité de la
méthode d'agglutination dans l'identification de diverses espèces
de Candida. (121)
Fukazawa et coll (52)ont montré en 1968, la haute spéci-
ficité des fractions IgG dans les réactions antigène-anticorps
44
où interviennent les levures du genre Candida. Ces travaux très
importants ont permis aux laboratoires Iatron de mettre au point
un kit le «Candida check»
renfermant des sérums monospécifiques
préparés à partir des fraction IgG.
Le «candida check»
est conçu pour identifier S espèces
de Candida d'importance médicale ce sont
C. albicans,sérotype
A et B, C. tropicalis, C. stellatoidea, C. guilliermondii, ~para
psilosis, C. krusei, C. pseudotropicalis et Torulopsis glabrata.
(Dans la classification de Tsuchiya Torulopsis glabrata fait
partie du groupe des Candida).
Ce kit se compose de 10 sortes de sérums monospécifiques
qui détectent les antigènes 1-4-5-6-S-9-11-13-13b et 34 du groupe
des Candida de Tsuchiya. Ce kit comprend également un test pour
l'assimilation du saccharose et un test pour sa fermentation.
l'agglutination s'effectue avec les blastospores.isolés
d'une culture de 24 à 48 heures
sur milieu de Sabouraud,une
grosse 5se de culture de levure est émulsionnéedans un 1/2ml de
sérum physiologique dans des tubes à hémolyse. Sur des plaques en
verre pour agglutination, on dépose une goutte de sérum monospéci-
fique.
Ensuite, à l'aide d'une pipette fine, on dépose une goutte
de suspension de levures ; puis, on agite la plaque pendant 30
secondes à 2 minutes d'un mouvement lent et rotatif. La lecture
est faite dans les 5 minutes qui suivent.
Les sérums sont utilisés dans l'ordre indiqué par la
figure 1. En cas d'autoagglutination les levures sont portées au
bain marie bouillant pendant 2 heures et le test d'agglutination
est repris. Le test d'assimilation
du saccharose permet de diffé-
rencier C. tropicalis de C. albicans sérotype A, ces deux espèces
ayant la même structure antigénique
(antigènes1-2-3-4-5-6,
i l faut
Fi~~, l
Clé d'identification des principales levures
pathogènes à l'aide du "Candida check".
_GiJ
~
---(---Y_I)
----y--------
(+)
l'GJ J
(~)
5
' r - - - -L! - - - - ; .
(+)
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1
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6
1
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(YellcM) (Yellow)
~1
(+)
(-)
"
r
1
SA Iœditnn
137"C 4 hr
.
r=
(~~î~
(~)
C. gui.l~ier-
'C. a1lbicans A
liT.g1abrata/ 1C.~eu~tro-
~.Tropicalisl. L-----'...."'--__
_ I t Q n d u .
pl.ca11.s
46
noter que quelques souches de C. albicans sérotype A peuvent
posséder l'antigène 13b, dans ce cas le diagnostic est facile
Ce test est constitué par des disques imprégnés d'une
solution concentrée de saccharose ; le test consiste à introduire
dans un tube à hémolyse renfermant 0,5ml d'eau distillée un disque
ensuite on émulsionne 2 anses de platine d'une culture de levures
de façon à avoir une suspension épaisse·. On incube à 37°C pendant
4 heures. Les souches de Candida tropicalis attaquent le saccharose
au bout de 4 heures, cela se traduit par une acidification du
milieu et un changement de couleur du milieu
du rose au jaune
(l'indicateur de pH n'est pas indiqué par le fabricant).
Le test de fermentation du saccharose permet de distin-
guer C. albicans B de C. stellatoidea. Ces deux espèces ont la
structure antigénique suivante: antigènes: 1-2-3-4-5-(7) et 13b
pour C. albicans B et les antigènes 1-2-3-4-5-10 et 32 pour
C.
stellatoidea (Tb l
et II)
; i l faut noter que le Candida check
n'a pas les antisérums 7-10 et 32, et que
certaines souches
de C. albicansB-peuvent manquer l'antigène 13b.
Ce test consiste à inoculer la surface d'une bande de
papier imprégnée de gelose et de saccharose, avec une suspension
épaisse de levures, et à incuber le tout à 37°C pendant 4 heures.
Au bout de ce temps, la bande de papier imprégnée de la suspension
de C. stellatoidea change de couleur, elle passe de la couleur
jaune à la couleur rose,
témoignant de l'assimilation du saccharose
par cette espèce.
En pratique,
les souches réagissant avec les antisérums
1-4-5-6 sont soit des souches de C. albicans A soit des souches de
C. tropicalis, de telles souches sont identifiées par la fermen-
tation du saccharose.
47
Les souches réagissant avec les sérums monospécifiques
1-4-5 mais pas avec les antisérums 6 et 13b sont soit des souches
de c. albicans B soit de C. stellatoidea : de telles souches
sont identifiées par le test de l'assimilation du saccharose.
III - TRAVAUX PERSONNELS
-
48 -
A- PREPARATION DES IMMUNSERUMS
1)
CHOIX DES ANIMAUX
Nous avons utilisé des lapins mâles ou femelles de
poids variant entre 3 à 5 kg qui provenaient du même élevage.
Nous n'avons pas jugé utile de vérifier la présence d'aggluti-
nines anti-Candida chez nos animaux, comme le préconisent SWEET
et KAUFMAN
(121), car nos conditions de travail ne nous permet-
taient pas d'éliminer systématiquement les lapins positifs.
2)
CHOIX DES SOUCHES
Les souches utilisées pour la préparation des
sérums monospécifiques doivent être des souches dont l'analyse
antigénique a été effectuée avec soin. Les souches retenues
doivent donc répondre à une structure antigénique bien définie.
Cette étape est très importante dans la préparation des sérums
monospécifiques, car d'elle dépendra le résultat final.
Nous tenons à exprimer nos remerciements au Docteur
SHINODA qui a eu l'extrême obligeance de nous adresser les
souches suivantes
:
- Candida albicans sérotype A
IFO* 1060
Candida norvegensis
IFO
0734
- Candida catenulata
IFO
0720
- Candida guilliermondii
IFO
0679
- Saccharomyces bisporus
IFO
0723
- Saccharomyces cerevisiae
FIO
0718
* IFO
Institut for Fermentation, Osaka, Japan.
-
49 -
De même,
les souches suivantes, utilisées dans
ce travail, proviennent de l'Institut Pasteur de Paris, grace
à l'amabilité du Pro DRüUHET, que nous tenons à remercier:
-
x
Candida claussenii
Ip
807
- Candida zeylanoides
IP
46
- Candida tropicalis
IP
857
-
xX
Candida pulcherrima
CBS
622
IP
Institut Pasteur
XX CBS
Central Bureau voor Schimmelcultures, Baarm
(Nederland).
Les souches ci-après proviennent de l'Institut
Pasteur de Lyon, grâce au Docteur GUINET :
x
-
Candida tropicalis
IPL
81 7633
-
Candida pseudotropicalis
IPL
82 4694
-
Candida krusei
IPL
82 2782
- Candida parapsilosis
IPL
82 3371
-
Candida guilliermondii
IPL
83 838
- Torulopsis glabrata
IPL
82 3311
x
IPL
Institut Pasteur de Lyon
Les souches de référence :
- Souche 3153
Candida albicans A
-
Souche V W
Candida albicans A
-
Souche 3656
Candida albicans B
-
50 -
proviennent du laboratoire du Professeur BIGUET et nous ont
été fournies par Monsieur POULAIN.
- Les autres souches
-
x
Candida albicans B
INSp
6 BR
- Candida albicans B
INSP
5412
- Candida albicans A
INSP
2 BR
- Candida tropicalis
INSP
697
- Candida tropicalis
INSP
911
- Candida krusei
INSP
2930
- Candida pseudotropicalis
INSP
2071
- Candida guilliermondii
INSP
2830
- Torulopsis glabrata
INSP
2058
x INSP
Institut National de Santé Publique d'Abidjan
ont été isolées dans nos laboratoires et identifiées par les
méthodes biologiques classiques.
La structure antigénique de chacune des souches,
sans exception, a été contrôlée plus de trois fois par les dix
sérums monospAcifiques du "Candida check" des auteurs Japonais.
Il faut souligner que le "Candida check" n'ayant pas le sérum
monospécifique anti 7, i l ne nous a pas été possible de vérifier
Nou~ ~enon~ à ~eme~cie~ ici ~ou~e~ te~ pe~~onne~ qui on~
con~~ibué à ta ~éati~a~ion de ce ~~avait.
51
la présence de l'antigène 7 dans la souche de Candida claussenii
l
pa07, ainsi que dans les souches de Candida albicans sérotype A
----_.
et B.
Tout au long de cet exposé,
nous allons très souvent
ramener le lecteur aux deux tableaux
(Tableau l
et Tableau II)
de TSUCHIYA, qui se trouvent à la fin decetexte et qui rappellent
la structure antigénique de
différentes levures.
Le tableau l étant celui publié en 1965
(143)
et le
tableau II celui publié en 1974
(145).
3)
PREPARATION DE LA SUSPENSION ANTIGENIQUE
Les levures sont cultivées sur milieu gélosé de Sabouraud
à 20
p.
1000 additionné de chloramphénicol pendant 48 h à 37°c
sur boîte de Roux ;
les levures sont récoltées dans du sérum physio-
logique stérile et lavées trois fois par centrifugation; on rejette
le surnageant et le dernier culot est mis en suspension
de façon
à obtenir une concentration équivalente à l'échelle n09 de Mac
FARLAND. L'échelle de Mac FARLAND est utilisée dans la préparation
des autovaccins.
Le principe de cette méthode est de comparer
l'opacité de la suspension microbienne à celle d'une gamme de sus-
pension de sulfate de baryum d'opacité croissante.
La gamme étalon est préparée comme suit (75):
- On prend une série de 10 tubes semblables, dans lesquels
on mettra respectivement des solutions aqueuses d'acide sulfurique
et de chlorure de baryum à l p. 100 dans les proportions suivantes
52
--
TUBES N°S
l
2
3
4
5
6
7
8
9
10
-
3
cm 3
cm 3
cm 3
3
3
3
3
cm
3
cm
cm
cm
cm 3
cm
cm
Sol c12Br Ip.lOO
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6 0,7
0,8
0,9
l
~ol S04H2 l p.lOO
9,9
9,8
9,7
9,6
9,5
9,4
9,3
9,2
9,1
9
1
La suspension de levure correspondant à l'opacité n09
7
dans l'échelle de Mac FARLAND contient approximativement_ 5.10
levures/ml.
La suspension ainsi obtenue est portée au Bain-marie
bouillant pendant 2 h.
4}
PROTOCOLE ET METHODOLOGIE D'IMMUNISATION DES LAPINS
TITRAGE DES SERUMS BRUTS.
Plusieurs protocoles d'immunisation ont été proposés
(14-111-81-69-125)~OUS avons utilisé le protocole d'immunisation
préconisé par
KANNO et SUZUKI
( 81 ). Dans ce protocole les lapins
sont immunisés contre les diverses souches de levures par injection
I.V. dans la veine marginale de l'oreille de la suspension anti-
génique bouillie de concentration égale à l'échelle nO 9 de Mac FAR-
LAND,
selon le schéma suivant :
53
Les lapins reçoivent 0,5,1,2,4,4 ml
de suspension
antigénique à 3 jours d'intervalle
JI
---'> 0,5 ml
J
- - - > l ml
4
J
- - - > 2 ml
7
J
- - > 4 ml
IO
_ _ > 4 ml
Les lapins sont saignés 7 jours après la dernière injec-
tion. Le sérum brut est recueilli et les anticorps agglutinants sont
titrés par une technique d'agglutination en tube décrite par
SWEET et KAUFMAN
(121)
et modifiée par DOUCHET et MÜLLER C30.).
Préparation de la suspension antigénique pour.agglutination
A 10 ml de sérum physiologique on ajoute 15 gouttes de la
suspension antigénique ayant servi à l'immunisation
(suspension
antigénique d'opacité nO 9 dans l'échelle de Mac FARLAND). On
obtient ainsi une suspension antigénique pour agglutination de
concentration voisine de 6.106 levures/ml.
Technique
Dans des tubes à hémolyse identiques on met 0,25ml de cha-
que dilution du sérum à tester
(l/IO
1/20 . . . . . 1/5120)
en contact
avec 0,25 ml de la suspension antigénique pour agglutination. On
centrifuge les tubes à 3000tr/mn pendant 5mn (modification que nous
avons apportées par rapport à la méthode initiale de DOUCHET et coll.)
Après centrifugation, on remet le culot
en suspension par simple
54
agitation et on fait une première lecture,
une deuxième lecture
est effectuée après 24 h d'incubation à la température du labora-
toire.
Un tube témoin négatif est toujours effectué. Un bon sérum doit
avoir un titre voisin de 1000 ou plus.
Les sérums titrés sont conservés + 8°C avec adjonction d'a~ide de
sodium à la concentration l 0/00 pour éviter les contaminations
bactériennes.
Résultats et commentaires
Nous avons obtenu des antisérums de titre élevé c'est-à-
dire supérieur à 1000 avec les levures suivantes
Candida albicans B
INSP
(6 Br)
1/1280
Candida albicans A
INSP
(2
Br)
1/1280
Candida claussenii
1/2560
Candida guilliermondii
1/1280
Candida krusei
1/1280
Candida tropicalis
1/1280
Torulopsis glabrata
1/2560
Antisérums de titre moyen
Candida pseudotropicalis
1/640
Antisérums de titre faible
Candida para krusei
1/160
Candida pulcherrima
1/80
Saccharomyces bisporus
1/320
Nous tenons à faire remarquer que certaines levures donnent
volontiers des titres élevés; c'est le cas de Candida albicans,de
Candida tropicalis, de Candida guilliermondii et de Torulopsis
glabrata dont nous nous sommes servis à plusieurs reprises pour
préparer des antisérums.
55
Ce n'est pas le cas des levures Candida pseudotropicalis
et Candida pulcherrima qui nous ont toujours donné des titres peu
élevés.
Lors du titrage des sérums bruts nous faisons toujours deux séries
de tubes; dans l'une d'entre elles nous utilisons comme antigène
la levure ayant servi à l'immunisation, et dans l'autre série nous
utilisons comme antigène une autre levure. C'est ainsi que lors du
titrage du sérum anti Candida tropicalis nous avons utilisé dans
la deuxième série de tubes, comme Ag. Candida albicans B.
Nous avons obtenu deux types d'agglutinats très distincts.
Dans la série de tubes où l'Ag
était la levure Candida
~ibicans B,
t
';
nous avons obtenu une agglutination sous forme de particules, c'est
ce type d'agglutinat que nous avions l'habitude d'obtenir.
Dans la 1ère série de tubes où l'Ag utilisé était C. bxpicalis,
nous avons obtenu
une agglutination en flocons.
Pour le titrage du sérum anti candida albicans B (INSP 5412)
nous
avons utilisé dans la 2ème série de tube comme Ag une suspension de
levure Candida tropicalis. Nous avons obtenu un titre de 1/1280
avec Candida albicans B (INSP 5412)
et un titre légèrement plus
élevé 1/2560 avec Candida tropicalis.
Ce résultat tend à confirmer
l'hypothèse selon laquelle les mêmes antigènes varient quantitati-
vement d'une espèce à l'autre.
56
B - PREPARATION DES SERUMS MONOSPECIFIQUES
1) PRINCIPE: Purification des antisérums par absorption
A un volume de sérum brut dilué ou non suivant la richesse
en anticorps, nous avons ajouté un volume de culot à 50 % de
levures hétérologues (levures préalablement bouillies pendant 2h)
Dans la majeure partie des cas nous avons utilisé pour absorption
è
des sérums de titre voisin de 1/256 , titre préconisé par FUKAZAWA
et coll.(53 )mais, nous avons volontairement utilisé parfois des
sérums de titre supérieur, pour avoir des sérums monospécifiques
de titre intéressant, ceci pour pallier à un inconvenient majeur,
celui de la baisse du taux des anticorps agI utinants avec le temps
(.1,31.)
C'est pour cette même raison que nous n'avons pas retenu
le titre de 1/12S è comme titre de départ, titre proposé par plusieurs
auteurs (1tü-131-1}l3).L' antisérum était absorbé avec un égal volume
de cu~ot' de levures bouillies. L'absorption
était exécutée à
l'étuve à 37°c pendant 3h puis toute la nuit au refrigérateur. Le
lendemain le mélange est centrifugé et le surnageant est à nouveau
traité comme précédemment. L'absorption est répétée jusqu'a élimi-
nation complète:
des anticorps non spécifiques.
Plusieurs combinaisons (entre espèces pour immunisation
et absorption) sont possibles pour préparer les sérums monospéci-
fiques
(127, 128, 129, 130, 136, 143).
Nous avons choisi à quelques variantes près les combinaisons
préconisées par KANO et collaborateurs ( 81
).
Les tableaux suivants N, a,b etc résument les combinaisons
r
préconisées par TSUCHIYA et collaborateurs 1974 (145
), KANO et
collaborateurs 1975 (81
et nos combinaisons qui sont très
proches de celles de KANO
et collaborateurs.
57
Il est important de connaître parfaitement la structure
antigénique de la levure qui sert à faire l'antisérum
ainsi
si l'on veut préparer un sérum monospécifique anti 13 8 à partir
d'un sérum anti Candida para krusei qui contient l'antigène 13B
on risque d'être géné par les anticorps dirigés contre les autres
fractions antigéniques 14-15 et 13 qui doivent être éliminées
par une levure ayant ces motifs antigéniques. Ainsi en pratique,
il faut bien choisir la levure ayant la structure la plus simple,
Candida albicans sérotype B par exemple, l'immunsérum
correspon-
dant, neutralisé par un Candida tropicalis
donnera un bon sérum
monospécifique anti 13 b (voir tableau II de TSUCHIYA) .
58
Tableau IV a : Préparation des sérums monospécifiques
par absorption selon TSUCHIYA et Coll.
(145).
III
III
~
~
ANTISERUM FOR
ORGANISMS FOR ABSORPTION
~m
(lJ
l/l
0 ~
~
§,B
B
o 0
0
~ III
l?~
&
Al
C. albicans (1060 )
none
0
-.-1
6
C. albicans
C. ste llatoidea (0692
~
-.-1
8
C. pseudotrop. (0586)
C. albicans
~ 9
C. guillierm. (0679)
C. albicans
11
C. catenulata (0720)
C. albicans
13
C. pulcheriima (0561)
C. albicans
§'
16
C. pelliculosa (0677)
C. parakrusei (0640)
0
~
24
S. rosei (0428)
C. albicans,C. parakrusei
l?
7
C. albicans
C. tropicalis (1070)
10
S. bisporus (0723)
C. albicans
§'-~ 12
C. ~coderma . (0734)
C. krusei (0584)
O~
18
C. robusta (0718)
C. alb.,C.parakr.C.pseudotr.
~-.-I
(0586)
~~ 20
C. pelliculosa
C. alb.,C.utilis (0619),C.
robusta
40
K. antillarum (0669)
C. alb., C. guillierm
4
C. albicans
C. parabrusei
5
C. albicans
C. guillierm.
13b
C. albicans B(NIH 792)
C. tropicalis
~
o 0
19
C. rugosa (0591)
C. alb., C. krusei
'.-1
O~
21
H. saturnus (0117)
C. !ab, C. utilis, C.pellicul.
-.-1 -.-1
~a 23
S. unisporus (0724)
C. albicans
~: 25
C. melinii (0747)
C. alb. ,C.utilis,C. pellicul,
C. pseudotr.
(lJ
26
S. bisporus
C. alb., C. pseudotr.
:>i -.-1
~~ 34
T. glabrata (0005)
C. alb., C. pseudotr.
35
'l'. anomala (1223)
C. alb., C.pse~otr.,S.melis
& l/l
(0485)
0
SI
Schiz.pombe (0358)
none
-.-1
g.~
Rl
R. glutinis (0559)
none
~~ R4
R;11linuta (0387)
none
Cl
C. curvata (0732)
none
Al, SI, Rl, R4 and Cl mean antigen 1 of C. albicans, Schiz, panbe, R. glutinis,
and Cr. neof. respectively. Strain number is as per IFO (Institute for fermen-
tation, Osaka) except C. albicans B.
59
Tableau IV b : Préparation d'anticorps spécifiques
- p o u r 1-' identification de levures d' intérêt médical,
d'après KANO et Coll.
(81).
Factor
IgG fraction
Absorption
Antigenic
of
with
factors
N°
antisera for
l
C. albicans
-
1 - 6 ....
-
4
"
C.parakrusei
4, 6 ••••
5
"
c. gui11ierrn.
5, 6 ••••
-
6
"
C. ste11atoidea
6 ••••
-
8
c. pseudotrop.
c. albicans
8,10.••
-
9
c. gui11ierrn.
"
9
11
c. krusei
"
11
13
c. parakrusei
"
13 ••••
Db
c. parakrusei
c. tropicalis
or
or
13, Db•.••
c. albicans B
c. gui11ierm.
34
T. glabrata
C. albicans
34 •••
60
Table~u_~c:. : Combinaisons _uti.lisées pour
préparer nos sérums monospécifiques.
SERUMS MONOSPECIFIQUES
ANTISERUM
ABSORPTION
N°
CONTRE
AVEC
1
candida albicans
-
4
Candida albicans B
C. parakrusei
5
Candida albicans B
C. guillienrondi.
ou
Candida trcpicalis
T. glabrata + C. guillienrondi
6
candida tropicalis
C. albicans B.
7
candida claussenii
C. trcpicalis
8
Candida pseudotrcpicalis
C. albicans A + S. cerevisiae
9
Candida guillienrondi
C. albicans B.
10
candida pseudotrcpicalis
C. albicans A.
ou
Saccharanyces bisporus
C. albicans B.
11
Candida krusei
C. albicans B.
13
Candida pulcherrina
C. albicans A ou B + S. cere-
visiae
ou
Candida parakrusèi
C. albicans B.
13 b
candida albicans B
C. albicans A.
ou
Candida albicans B
C. trcpicalis
34
T.glabrata
C. albicans A + C. pseudo-
trcpicalis.
61
2)
PREPARATION DU SERUM ANTI 1
L'antisérum 1 est du sérum anti Candida albicans con-
venablement dilué.
Le sérum brut donne une agglutination trop intense avec
les diverses souches de levures.
Il faut donc trouver une dilu-
tion adéquate. Dans les divers articles des auteurs Japonais que
nous avons lus, on ne parle nulle part du mode de préparation
du sérum anti 1.
Dans notre expérience nous avons préparé l'antisérum 1
à partir du sérum anti Candida albicans B
INSP
(6Br)
de titre
1/1280. Ce sérum dilué au 1/15e nous donne des agglutinations
très fortes,
floconneuses.
La dilution au 1/20è nous donne une agglutination assez
forte
(++++), mais la dilution au 1/25e nous donne une bonne
agglutination pour toutes les espèces de levures sauf avec Candi-
da krusei
ou nous n'obtenons pas d'agglutination. Ce résultat
confirme ceux de DOUCHET et ColL (canmunication personnelle)qui ont démontré
que l'Ag 1 de C.
krusei
est très faible.
Nous avons donc choisi
la dilution 1/20è comme celle de notre antisérum nO 1.
L'antisérum nO 1
est donc un sérum anti Candida albicans
suffisamment dilué de telle sorte que les anticorps correspondant
aux autres antigènes de Candida albicans
ne puissent pas s'ex-
primer.
3) PREPARATION DU SERUM ANTI 4
Pour la préparation de l'an~isérum 4, comme pour la
préparation de tous les autres antisérums nous avons obtenu des
agglutinations inattendues lors de nos contrôles ~ c'est-à-dire
que si nous partons d'un antisérum X, que nous absorbons avec
des levure Y,
nous obtenons des agglutinations avec des levures
Z qui ont/soit la même structure antigénique que les levures Y,
62
soit une partie des Ag des levures Y, soit des Ag supplémentaires
par rapport aux levures Y.
Antisérum utilisé: sérum anti Candida albicans B (INSP 6Br) 1/1280.
Suspension antigénique utilisée pour absorption
Candida
parakrusei
Après 4 absorptions de l'antisérum dilué au 1/3 nous
avons obtenu un antisérum qui n'agglutinait plus avec les levures
Candida parakrusei. Nous avons ensuite contrôlé la spécificité
de notre antisérum 4 en effectuant des tests d'agglutination sur
lame avec les autres espèces de Candida. Ce contrôle nous permet
d'arrêter ou de poursuivre les absorptions.
Tableau
:. V :
Vérification de la spécificité du sérum anti 4
par agglutination sur lame
Antisérum C. albicans B
Puis 2 x avec
Ag
absorbé 4 x avec C. pK.
C. pt.
INSP 6Br (C.albicans B)
+ + +
+ + +
C. tropicalis
+ +
+ +
C. pseudotropicalis
+ +
-
C. krusei
-
-
C. parakrusei
-
-
C. guillierrrondii
++
+.+
T. glabrata
+ + +
+ + +
C.
pk.
C. parakrusei
C. pt.
C. pseudotropic~li~
L'intensité de l'agglutination est chiffrée de la façon
suivante :
+ Agglutination faiblement positive
+ + Agglutination moyennement positive
+ + + Agglutination fortement positive
- Agglutination négative.
63
La vérification de la spécificité des sérums monospécifi-
ques est indispensable, car elle permet de
décel'er
des agglutina-
tions non spécifiques.
Dans le cas du sérum anti 4 on s'explique mal
l'agglu-
tination positive avec les levures C. pseudotropicalis qui n'ont
pas l'Ag 4 et qui ont une structure antigénique très simple
Ag
l,
8
(10),
28,
31, a.
Trois hypothèses sont susceptibles d'expliquer cette agglutination
inattendue.
La première résulte des observations de HA SENCLEVER et collabora-
teurs
(71)
qui ont remarqué que l'absorption d'un antisérum Candida
stellatoidea
avec des suspensions de cellules entières de C.
stellatoidea
ou de C.
albicans B
ne supprime pas toutes les
propriétés agglutinantes de C.
albicans A
ou de C. Tropicalis,cette
absorption supprime les anticorps contre les souches homologues et
contre les souches de C.
albicans B. Par contre l'absorption avec
une suspension de cellules broyées de C.
stellatoidea
ou de C. al-
bicans B
supprime tous les anticorps contre C.
albicans A ou C.
tropicalis.
Il semble donc que le lapin fabrique des anticorps
contre des antigènes résid'ant en profondeur et non sur la paroi
de Candida stellatoidea et donc l'absorption avec des cellules
entières ne supprime pas ces anticorps.
Pour revenir à notre exemple,
l'inoculation au lapin de levures
C. albicans B a-t-elle entrainé la fabrication d'anticorps réa-
gissant contre les levures Candida pseudotropicalis ?
La 2ème
hYJXlthèse découle des travaux de MARTIN
( 94 ).
MARTIN fait remarquer que les différents Ag contenus dans une subs-
tance peuvent différer camplèterent dans leur capacité de stimuler
64
la formation d'anticorps si bien que le nombre relatif d'anticorps
individuels produit par injection d'une substance
complexe n'est
pas nécessairement proportionnel à la quantité relative de chaque
Ag dans le matériel de départ.
Ainsi i l a observé qu'un sérum anti C. albicans absorbé avec des
levures C. albicans réagissait encore avec des levures C. tropicalis
et C. parakrusei.
MARTIN explique cette anomalie en suggérant que les différents anti-
corps produits par injection de levures C. albicans n'étaient pas
dans les mêmes proportions que les Ag dans le matériel injecté, si
bien que la quantité minimale de levures C. albicans nécessaire pour
absorber tous les anticorps du sérum anti C. albicans, ne supprimait
qu'une partie des anticorps. Un tel sérum peut donc réagir avec des
levures d'une autre espèce, ayant un ou plusieurs Ag communs avec
Candida albicans, à condition que l'Ag ou les Ag communs trouvent
dans le sérum un surplus d'anticorps correspondant aux Ag communs,
qui n'auront donc pas été absorbés par les levures Candida albicans.
MARTIN a observé le même phénomène avec le sérum anti C. stellatotdea
qui, absorbé avec des lévures C. stellatoidea, réagissait encore avec
des levures C. tropicalis et C. albicans
(cette observation rejoint
celle d'HASENCLEVER
71
Cette deuxième hypothèse appelle une remarque
: un sérum anti C. al
bicans absorbé plusieurs fois avec des levures homologues C.albicans
conserverait -
i l toujours un surplus d'qnticorps- ~
La 3ème hypothèse résulte de nos observations :
La structure antigénique de C. pseudotropicalis possède l'Ag 10,
65
celui-ci possède une certaine parenté avec l'Ag 7, ce point parti~
culier sera développé en détail quand nous parlerons du sérum anti 7.
Nous sommes partis de l'antisérum anti 6 B r
~ un Candida albicans
qui possède l'Ag 7, celui-ci n'est pas neutralisé par C. parakrusei
(qui n'a pas l'Ag 7 ), pour l'éliminer il est donc nécessaire d'avoir
recours au C. pseudotropicalis; mais comme i l y a parenté antigénique
entre ~ et Ag 10, on fait baisser les anticorps correspondant à
l'Ag 7.
Cette observation renforce l'hypothèse sur l'antigène 7 voisin de
l'antigène 10, comme nous l'avons observé lors de la préparation du
sérum anti 7.
66
4) -
PREPARATION DU SERUM ANTI 5
KANO et SUZUKI
(Tableau IV a)
et TSUCHIYA et Coll. (Tableau Nb)
préconisent pour la préparation du sérum anti 5 la combinaison sui-
vante: sérum anti Candida albicans absorbé par des levures C.guillier-
mondii .
Structure antigénique des différentes levures
Candida
albicans
A
1
4,
5 ,
6
(13b)
2,3
- - - - - - -
Candida
albicans
B
4,
5
( 7 )
1 3b,
2-3
Candida
guillierm()~9ii.
4
9
2-3
-------=---
Si nous partons du sérum anti C. albicans A
absorbé avec des levures
C. guilliermondii, nous remarquons qu'après absorption il subsistera
dans le sérum des anticorps anti 6, et éventuellement les anticorps
anti 13b.
SI nous choisissons le sérum anti c. albicans B
absorbé avec des
levures C. guilliermondii, nous remarquons qu'après absorption il
restera des anticorps anti 13b, et éventuellement des anticorps anti 7.
Cette deuxième combinaison peut être retenue car,
l'anticorps anti
13b est peu gênant dans la mesure ou l'antigène 13b est rare parmi les
levures, et toutes les levures qui ont l'Ag 13b ont également l'an-
tigène 5.
( tableau II). Mais cette combinaison ne permet pas d'obte-
,nir un sérum monospécifique.
\\Dans le souci
d'avoir un sérum monospécifique, nous avons pensé à
Ila combinaison suivante, sérum ant1 C.trop1calis absorbé avec des
\\leVUres ~orulop~is
glabrata qui n'ont pas l'Ag 5. Il est très impor-
I~nt de vérifier l'absence d'Ag 5 chez la souche de T.glabrata choi-
s~e car certaines souches possèdent l'Ag 5.
67
Après absorption du sérum avec cette souche de Torulop§is
glabrata,
resteront les Ac correspondant aux Ag 4 et 2 qu'on supprimera par
des levures C. guilliermondii
Structure antigénique des différentes levures
C. tropicalis
-
4 -
5 -
6
,
2,
3
T. glabrata
6
3
10 34
C. guilliermondii
4
9,2, 3
Malheureusement nous n'avons pas pu obtenir un bon antisérum 5 avec
cette combinaison. De même la combinaison proposée par les auteurs
Japonais ne nous a pas donné plus de succès. Ci-dessous la descrip-
tion de nœ,différentes tentatives d'obtention du sérum anti 5.
Notre combinaison :
- Antisérum ... utilisé : sérum anti., c. tropicalis:. l' / 1280 ,
~uspension antigénique utlisée pour absorption
ToruloRsis
glabrata qui n'a pas l'Ag 5 :
K7
Après 3 absorptions
de l'antisérum C. tropicalis dilué au 1 '/3
nous avons obtenu
un antisérum qui n'agglutinait plus avec les
levures K 7.
Contrôle de la spécificité du sérum anti 5, et poursuite éventuelle
des absorptions avec d'autres espèces de levures.
68
Tableau VI :
VERIFICATION DE LA SPECIFICITE DU SERUM ANTI 5 PAR LA METHODE
D'AGGLUTINATION SUR LAME
Antisérum C. tropicalis
Puis 1 x avec C. guillierrrondii
Ag
absorbé 3 x avec K 7
6 B r
-
-
C. albicans A
3 +
2
+
C. tropicalis
3 +
2
+
C. pseudotropicali
-
-
C. krusei
+
-
C. Parakrusei
3 +
2
+
C. guillienrondii
+
-
K 7
-
-
S. œrevisiae
-
-
C. catenulata et
+
-
C. norvegensis
+
-
Pour comprendre ce tableau nous demandons au lecteur de se
reporter aux deux tableaux de TSUCHIYA relatifuà la structure anti-
génique des levures, et situé avant la bibliographie.
Ce tableau nous montre qu'après 3 absorptions du sérum anti C.tropi-
calis
par les levures K 7 (T. glabrata sahs Ag 5), on note une absence
d'agglutination avec les levures 6 B r
(C. albicans B) ce qui est
anormal., une faible agglutination avec les levures C. guilliermondii
ce qui est normal puisque C. guilliermondii possède les Ag 4 et
2
69
dont les Ac correspondants n'ont pas été supprimés par K 7, une
faible agglutination avec les levures C. krusei,C. catenulata et
C. norvegensis et une forte agglutination avec C. albicans A et
C. tropicalis.
Cet antisérum absorbé une fois avec C. guilliermondii, ne donne plus
d'agglutination avec C. guilliermondii, mais ne donne plus non plus
d'agglutination avec les levures C. krusei,C. catenulata et C. nor-
vegensisipar contre/il
donne.
de bonnes agglutinations avec C. al
bicans A, C. tropicalis et C. parakrusei· Cet antisérum ainsi pré-
paré ne permet donc pas la détection de toutes les levures ayant
l'Ag 5. Cette expérience nous permet de nous poser la question de
savoir s ' i l y a deux sous-groupes d'Ag 5~un sous-groupe spécifique
de C. krusei, C. catenulata et C.norvegensis et un sous-groupe spé-
cifique de C. albicans A, C. tropicalis et C. parakrusei.
L'absence d'agglutination avec les levures l
N S P 6 B r
après 3
absorptions avec K 7 peut laisser supposer que C. albicans--B
( 6 B r)
a un Ag 5 assez faible,
de même on pourrait dire que C. krusei,
C. catenulata et C. norvegensis ont un A g 5 relativement faible; mais
les travaux de TSUCHIYA (143-145
) ne nous permettent pas d'affirmer
cela car l'Ag 5 de ces différentes levures n'a jamais été mis entre·
parenthèses.
Des résultats similaires ont été obtenus par SWEET et KAUFMANN
(121
qui ont obtenu après absorption d'un sérum anti C. tropicalis avec
des levures C. guilliermondii,un sérum qui agglutine bien les levures
C. albicans A et C. tropicalis mais qui n'agglutine plus C. krusei
C. albicans B, C. stellato!dea et même C. parakrusei. Ceci démontre
bien la difficulté de préparation des sérums monospécifiques.
70
Il faut noter qu'avec le sérum anti 5 du "Candida check" on n'obtient
pas d'agglutination
avec toutes les levures C. parakrusei
(
33
) qui
possèder,t pourtant l'Ag 5 normal dans le tableau de TSUCHIYA ( Tab&eau
l
et II). Malgré l'absence d'agglutination sur lame, C. parakrusei
a quand même l'Ag 5.
Pour revenir à notre expérience
pour préparer le sérum anti 5,
nous avons absorbé l'antisérum C.
tropicalis avec la levure K 7
(Torulopsis glabrata sans Ag 5), cette levure a peut-être UR Ag 5,
très faible, qui peut faire baisser le titre du sérum anti. C.tropi-
calis
mais qui ne permet pas d'obtenir une agglutination sur lame.
L'antigène 5 de C. albicans B
est souvent très faible
(34
).
On
peut faire les mêmes remarques pour C. parakrusei et pour T.gla-
brata
. Ces observations nous permettent de souligner une fois de
plus que la structure antigénique d'une levure n'est pas uniforme.
Nous avons déjà observé lors de la préparation du sérum anti 1 que
l'Ag 1 de C. krusei est très faible alors qu'il est très fort chez
C. albicans. Cet aspect a été bien observé par MULLER et Collabora-
teurs
(communication personnelle)
avec des anticorps marqués à la
ferritine et l'observation au microscope électronique,
l'Ag 1 de
C. albicans, montre un gros amas d'anticorps anti 1 marqué à la fer-
ritine
visible au microscope électronique alors que celui de
C. krusei est presque invisible.
2ème tentative de préparation du sérum anti 5 avec la
combinaison préconisée par les auteurs Japonais
- Antisérum utilisée
sérum anti C. albicans B (6 B r):
1 ' / 1280.
-
Suspension antigénique utilisée pour absorption: C. guil-
liermondii
71
Après 4 absorptionsde l'antisérum C. albicans
( 6 B r )
dilué au 1 n sur C. guilliermondii nous avons obtenu un antisérum
qui n'agglutinait plus les levures C. albicans B
(6 B r ) .
Contrôle de la spécificité du sérum anti 5 et poursuite éventuelle
des absorptions avec d'autres espèces de levures.
72
Tableau VII :
VERIFICATION DE LA SPECIFICITE DU SERUM ANTI 5 PAR LA
METHODE DIAGGLUTINATION SUR LAME
Antisénnn 6 B r absorbé
Puis 4 x avec
K 7
Ag
4 x avec C:quillienrondii
6 B r
+ + +
+ ( tardif)
C.aJbicans A
+ +. +
+
C.tropicalis
+
+ +
+
C. pseudotropicalis
-
-
C.krusei
+
+
C.parakrusei
+ +
+
+
C. guillienrondii
-
-
K 7
+
+
-
Tg. 2058
+
+
-
S.cerevisiae
-
-
C. catenulata
+
+
C. no:rvegensis
+
+
Ce sérum anti 5 préparé selon la combinaison des auteurs
Japonais ne nous a pas donné les résultats escomptés. En effet après
4 absorptions par C. guilliermondii nous avons un sérum qui agglutine
curieusement
les levures K 7 ( T. glabrata) qui nlont pourtant
pas llAg 5
le sérum obtenu agglutine assez fortement les levures
K 7 car il faut 4 absorptions pour supprimer toute agglutination
avec les levures K 7.
73
Après ces 4 absorptions nous obtenons un sérum très moyen car celui-ci
agglutine tardivement 6 B r, et agglutine faiblement C. albicans A,
C. tropicalis, C. krusei, C. parakrusei, C. catenulata et C.norvegensis
5) - PREPARATION DU SERUM ANTI 6.
Les auteurs Japonais proposent la combinaison suivante: sérum
anti Candida albicans A absorbé par des levures C. stellatoIdea. Nous
avons préféré partir d'un sérum anti C. tropicalis que nous avons
absorbé avec des levures C. albicans 8, car plusieurs travaux montrent
que l'Ag 6 de C. tropicalis est très immunogène.
Antisérum utilisé: sérum anti C.tropicalis l ' /1280.
Suspension anti9éniq'ue utilisée pour absorption C. albicaas 6 B r .Après
5 saturations de l'antisérum dilué au 1 a (nous sommes partis volon-
tairement d'un sérum anti C. tropicalis de titre assez élevé 1/640
dans le souci
d'avoir un très bon antisérum 6
nous avons obtenu
un sérum qui n'agglutinait plus les levures C. albicans B
(6 B r).
Contrôle avec les autres espèces de levures, et poursuite éventuelle
des absorptions.
74
Tableau VIII :
VERIFICATION DE LA 'SPECIFICITE DU SERUM ANTI 6
PAR AGGLUTINATION SUR LAME
Antisérum C. tropicalis
Puis 2 x avec
Ag.
absorbé 5 x avec 6 B r
C. guilliermondii
6 B r
-
-
C. albicans A
3+
3+
C. tropicalis
3+'
3+
C.pseudotropica-
lis
-
-
C.krusei
-
-
C.parakrusei
-
-
C. guilliernondii
3+
-
T.glabrata
2+
2+
S.cerevisiae
-
-
C.catenulata
-
-
C.norvegensis
-
-
C.'zeylanoides
-
...
6 Br: C. albicans B
Nous avons rencontré très peu de difficultés dans la pré-
paration du sérum anti 6 i néanmoins nous nous expliquens très mal
la forte agglutination du sérum anti C.tropicalis
privé
des Ag communs à
C. albicans
avec C. guilliermondii.'C.guillenoc>ndii
ayant tule struct~ antigénique très si.nple; 1 - 4 - 9 - 2 - 3, nous nous
sommes demandés si l'Ag 4 de C. guilliermondii n'était pas particu-
lièrement très agglutinogène/c'est l'hypothèse què nous retenons i
75
mais cette anomalie peut également s'expliquer par les hypothèses
d'HASENCLEVER et de MARTIN que nous avons développées lors de la
préparation du sérum anti 4.
Pour terminer nous diIons que nous avons préparé un très
bon sérum anti 6, sérum très sensible et d'une très grande spéci-
ficité.
6) -
PREPARATION DU SERUM ANTI 7
Avant d'entamer la préparation du sérum anti 7, nous tenons
à faire quelques remarques i
le sérum anti 7 n'existe pas dans le
"Candida check" des Japonais .• S'il existait, ce sérum nous aurait
permis d'identifier avec plus de précision un certain nombre de
levures et plus particulièrement C. albicans C et C. claussenii.
D'autre part ce sérum nous aurait permis de distinguer rapidement
C. clausenii de C. albicans A
et C. tropicalis qui n'ont pas l'an-
tigène 7.
Nous tenons à mentionner la communication orale que nous
avons eu
avec le Pro DROUHET, communication selon laquelle les auteurs Japonais
seraientrevenussur le sérotype C. Le sérotype C n'existerait donc pas
et par conséquent l'Ag 7 ne serait pas spécifique de ce sérotype.
Pour la préparation du sérum anti 7, TSUCHIYA et Coll
(145
) pro-
posent la combinaison suivante : sérum anti C. albicans absorbé avec
des levures C. tropicalis. Les auteurs ne précisent pas le sérotype
de Candida albicans à utiliser. Il faut souligner que tous les pre-
miers travaux des auteurs Japonais
(143-145
) ont toujours fait cas
de la présence de l'Ag 7 chez tous les Candida albicans.
76
Dans le tableau de TSUCHIYA de 1974
145
) sur la structure
antigénique des différentes espèces de levures,il ressort
que
le sérotype C de C.albicans a toujours l'Ag 7, que le sérotype B a
l'Ag 7 mais que celui-ci peut
manquer, et que le sérotype A n'a
jamais l'Ag 7. Il serait donc plus logique de préparer le sérum anti
7 à partir du sérotype C de Candida albicans
• Pour contournercette
difficulté nous avons choisi comme levures immunisantes le Candida
claussertii qui a toujours l'Ag 7 et comme levures absorbantes C.tro-
picalis
- Antisérum utilisé
: sérum anti C. claussenii
1 12560. Il
faut souligner le haut titre de ce sérum .
• Suspension antigénique utilisée pour absorption: C.tropicalis. Après
3 absorptions de l'antisérum dilué au 1 ~ nous avons obtenu un anti-
sérum qui n'agglutinait plus les levures C.tropicalis
77
Tableau IX :
VERIFICATION DE LA SPECIFICITE DU SERUM ANTI 7
PAR AGGLUTINATION SUR LAME
A.S
. C.claussenii
Puis 2 x éNec
Puis 3 x éNec
Ag
absorbé 3 x éNec
C. pK.
T. glabrata
C. tropicalis
C.albicans B
2 +
+
+
( 6 Br)
C.albicans A
+
-
-
C.tropicalis
-
-
-
C.pseudotropicalis*
2
*
+
2+
+(tardif)
C.krusei
-
-
-
C.parakrusei
2
+
-
-
C.guilliemondii
-
-
-
C.claussenii
+
+
+
T.glabrata*
2
*
+
2 +
-
S.cerevisiae*
2
*
+
2 +
+
A. S
antisérum
* Les levures C.pseudotropicalis,
C.tr
C. tropical~s_
T.glabrata et S.cerevisiae ont
C.pI<
C.par~~i.
l'antigène 10.
Pour comprendre ce tableau, il est utile de rappeler la structure anti-
génique de quelques unes des levures utilisées comme antigènes'
Candida
claussenii
Ag
1 - 2 - 3 - 4 - 5 - 6 - 7
"
!=J:'<>picalis
1 - 2 - 3 - 4 - 5 - 6
"
pseudotropic~_i.~
1
8 (10)
28-31
"
parakrusei
1
2 - 3
5
13 13b, 14-15
Torolopsis
glabrata
1
3
10
34
saccharanyces
cerevisiae
1
2
3
10 18 14
31
78
Nous ne sommes pas parvenus à préparer un sérum anti 7
monospécifique à partir de l'antisérum C. claussenii, qui avait
pourtant un titre très élevé
( 1 aS60). En effet cet antisérum
agglutine toujours les levures ayant l'Ag 10 (C. pseudotropicalis
T. glabrata et S. cerevisiae )
Ce talbeau appelle 4 remarques
La première, c'est qu'il semble y avoir une parenté anti-
génique très étroite entre les Ag 7 et 10.
La deuxième, c'est que l'antisérum anti 7 ainsi obtenu
agglutine les levures C. albicans B, mais pas les levures C.al-
bicans A . Ce résultat est en accord avec ceux de TSUCHIYA, qui
mentionne la présence de l'Ag 7 dans les levures C. albicans de
sérotype B, mais pas dans le sérotype A.
La troisième remarque c'est que l'antisérum C. claussenii
absorbé 3 fois avec C. tropicalis, agglutine faiblement les lè-
vures homologues C. claussenii. L'Ag 7 de C. claussenii est-il peu
immunogène
7
La quatrième remarque c'est l'agglutination inattendue du sérum
anti C. claussenii privé d'anticorps correspondant à C.tropicalis,
avec les levures C.parakrusei.
Pour les auteurs Japonais i l y a pour l'espèce C.albicans
3 sérotypes A - B -
C.
Le sérotype C est un sérotype A qui a l'Ag 7 ou bien le sérotype A
est un sérotype C qui n'a pas l'antigène 7. D'après tous les
tra-
YsUx
antérieurs à 1974 les C. albicans avaient tous l'antigène 7
(plus de 2000 exemples). Les auteurs Japonais n'arrivent pas à
79
fabriquer un bon sérum monospécifique anti 7 à partir de C.al-
bicans
(52-136);
ils ont pu obtenir un antisérum 7 à partir de
fractions polysaccharidiques de C.albicans couplé à l'adjuvant
complet de FREUND
( 51 ).Dans ce travail les auteurs ne parlent
pas de la spécificité de l'antisérum obtenu. Nous nous demandons
si cet antisérum n'avait pas la même spécificité que le nôtre.
L'antigène 7 a une certaine communauté avec l'antigène 10.
D'ailleurs nous avons obtenu à partir de l'antisérum C.albicans B
( l N S P
6 B r)
un sérum anti 7 qui agglutinait aussi C.pseudo-
tropicalis.
80
7. - Préparation du sérum anti 8
Pour préparer cet antisérum, nous avons retenu la cornbinai-
son proposée par les auteurs Japonais mais en y apportant une lé-
gère modification. En effet TSUCHIYA et Coll, (145), ainsi que KANO
et Coll. (8.1) utilisent comme levure immunisante C.pseudotropicalis
et comme levure absorbante C. albicans.Ces deux levures ont les
structures antigéniques suivantes:
C. pseudotropicalis
1 -
8 -(10)
28,31, a
C. albicans A :
1 -
4-5-6
(13b)
2,3
Nous remarquons qu'après absorption du sérum anti C.pseudotropicalis
par des levures C. albicans A, il restera dans l'antisérum C.pseudo-
tropicalis des anticorps correspondant aux Ag (10), 28 et 31. Nous
avons introduit la modification qui consiste à réabsorper l'anti-
sérum C. pseudotropicalis par des levures S. cerevisiae,ce qui aura
l'avantage de supprimer les anticorps correspond~nt aux Ag ( 10 ) et
31.
S. cerevisiae: 1 -
10 -
18 2,3-
(14
),
31, a, e.
Après absorption avec S. cerevisiae, il restera éventuellement dans
le sérum anti C. pseudotropicalis des anticorps correspondant à l'Ag
28, mais ces anticorps ne nous gènent pas car les levures d'intérêt
rédical n'ont pas l'antigène 28.
III faut noter que nous n'avons pas pu vérifier la présence des Ag 10,
1
128 et 31 dans notre souche de C.pseudotropicalis, par manque d'anti-
lérum correspondant.
81
- Titre du sérum anti C.pseudotropicalis : 1/640
Suspension antigénique ayant servi à l'absorption: C. albicans A.
Après 3 absorptions de l'antisérum C.pseudotropicalis non dilué nous
avons obtenu un sérum qui n'agglutin~nt plus les levures C.albicans A.
Ensuite 2 absorptions par les levures S. cerevisiae ont permis d'é-
liminer du sérum tous les anticorps correspondant à S. cerevisiae.
Tableau X :
Vérification de la spécificité du sérum anti 8.
Par agglutination sqr __ la,!TIe.
Sérum anti C. pseudotropicalis
Ag
Abso:rbé 3 X avec C. albicans A
Puis 2 X avec S. cerevisiae
6B r
-
-
C. albicans A
-
-
C.tropicalis
-
-
C. pseudotropica-
lis
3+
3+
C.krusei
-
-
C.parakru. .sei
-
-
C.guillienrondii
-
-
T.glabrata
+
-
S.cerwisiae
+
-
6 B r, C. albicans B
Nous avons préparé assez facilement le sérum anti 8. Nous avons
obtenu un bon sérum, sensible et relativement spécifique ( il subsis-
te éventuellement les anticorps correspondant à l'Ag 28).
82
Les agglutinations observées avec les levures S. cerevisiae et
T. glabrata après 3 aborptions par les levures C. albicans s'expli-
quent par la présence de l'antigène 10 chez ces deux levures.
8. -
Préparation du sérum anti 9
La combinaison proposée par les auteurs Japonais est l'ab-
sorption d'un sérum anti C. guilliermondii avec des levures C.albicans.
Pour notre part nous avons adopté cette combinaison, mais nous avons
non seulement utilisé comme levure absorbante Candida albicans B, mais
également C. tropicalis.
Structure antigénique des différentes levures.
C. guilliermondii
1- 4 -
9
2,3
C. albicans A
-
4-5-6
(13b), 2,3
C. albicans B
1 -
4-5
(7)
13b, 2,3
C. tropicalis
1 -
4-5 6
~,3
Titre du sérum anti C.guilliermondii 1/ 1280
-
Suspension antigénique ayant senti à l'absorption : 'C;.' .albicans B.
Après 2 absorptions de l'antisérum C.guilliermondii dilué au 1 p nous
avons obtenu un sérum qui n' agglutin.ent plus des levures C. albicans B
( 6 B r).
83
_Tableau XI :
Vérification de la spécificité du sérum anti 9.
Sérum anti C. guilliermondii
Ag
absorbé 3Xavec6Br
Puis 3 X œvec C. tropi<;alis. Puis 2 X avec
-T .Qlabrata?05
C.albicansB( 6 B r)
-
-
-
C.albicans A
3+
-
-
C.tropicalis
3+
-
-
C.pseudotropicalis
-
-
-
C.krusei
-
-
-
C.parakrusei
-
-
-
C. guillienrondii
3+
3+
-
T.glabrata
2+
2+
-
2058
6 B r: C. albicans B
Cette première tentative de préparation du sérum anti 9 a donc
échoué; nous avons pensé à une erreur de manipulation qui se situerait
au niveau de l'utilisation du T.glabrata 2058. Pour la 2ème tentative
de préparation du sérum anti 9 nous avons changé d'antigène pour la
première absorption, car l'utilisation de C.albicans B (6 B r ) comme
levure absorbante ne supprime pas du sérum anti C.guilliermondii tous
les anticorps dirigés contre C.albicans A et C.tropicalis, ce qui ne
s'explique pas par les différentes structures antigéniques.
2è tentative de préparation du sérum anti 9.
- sérum anti C.guilliermondii
1/1280
- Levure absorbante: C.tropicalis
Après 4 absorptions du sérum anti C.guilliermondii dilué au 1 13
nous obtenons un sérum qui n'agglutine plus C.tropicalis
84
Tableau XII :
Contrôle de la spécificité du sérum anti 9
par agglutination sur lame
Sérum anti C. guilliermondii
Ag
Absorbé 4 X éNec C. tropicalis
Puis 3 X éNec T.glabrata ( K 7)
6 B r
-
-
- -
C. albicans A
-
-
G.tr"i'icalis
-
-
C.pseudotrgeicalis
-
-
C.krosei
-
-
C~oorakrusei
-
-
Cs guillierm:mdii
3+
2+
T.qlabrata (K 7)
2+
-
.s.cerevisiae
-
-
Nous obtenons
des résultats similaires en utilisant à la place de
C.tropicalis, C.albicans A
comme levure absorbante.
Cette deuxième tentative de préparation du sérum anti 9 semble réussie,
mais malheureusement lors de nos identifications de levures avec ce
sérum anti 9 que nous pensons monospécifique, nous avons trouvé 2 ano-
malies : 2 souches de T.glabrata que nous avons vérifiées
à l)aide des
caractères sérologiqueset biochimiques agglutinaient avec notre sérum
anti 9. L'absorption de notre sérum par ces 2 levures, a entra1né la
perte de son pouvoir agglutinant vis-à-vis non seulement de ces 2 sou-
ches de Torulopsis glabrata mais également de C.guilliermondii.On retrouve
donc ce qui s'est passé avec la souche de Torulopsis glabrata 2058 lors
de la première tentative de préparation du sérum anti 9.
85
Après ces deux expériences on peut se demander s ' i l n'y a pas une
parenté antigénique étroite entre les Ag 9 et 34.
Pour notre part nous avons préparé un sérum anti 9 qui conserve
une certaine activité anti T. glabrata.
Nous tenons à faire remarquer que SWEET et KAUFMAN
(121), pour pre-
parer leur sérum anti 9, ont absorbé l'antisérum C.guilliermondii
successivement avec C.albicans A, Candida albicans B,C.stellatoidea
et C.tropicalis; ces différentes absorptions rappellent les étapes
que nous avons suivies lors de la première tentative de préparation
du sérum anti 9.11 faut souligner que
SWEET et KAUFMAN n'ont pas vérifié
la spécificité de leur sérum anti C.guilliermondii vis-à-vis des
souches de T.glabrata.
9. -
Préparation du sérum anti 10.
Ce sérum monospécifique n'existe pas dans le "Candida check"
des Japonais. Pour préparer le sérum anti 10,TSUCHIYA et Coll
(145)
proposent l'absorption d'un antisérum S.bisporus avec des levures
C.albicans.
Nbus nous s~servis de cette combinaison pour préparer notre sérum
anti 10.
Rappel de la structure antigénique des souches choisies:
Saccharomyces bisporus:
1 -
3 -
4 -
10 -
26
C.albicans B:
1 -
-
4-5
(7), 13b, 2,3
Nous remarquons qu'après absorption de l'antisérum S.bisporus avec
C.albicans B, il restera dans l'antisérum des anticorps correspondant
à l'Ag 26. Ceci n'est pas gènant car toutes les levures qui ont l'Ag
26 ont également l'Ag 10; mais en fin d'absorption nous n'aurons pas
un sérum monospécifique.
-
Titre du sérum anti S.bisporus:1
/320
Après 3 absorptions de l'antisérum S.bisporus non dilué nous obtenons
un sérum qui n'agglutine plus les levures C.albicans B ( 6 B r ) .
86
Tableau XIII :
Vérification de la spécificité du sérum antf 10
~ar agglutination sur lame
Sérum anti S. bisporus
Ag
AbsOI:bé 3 X avec 6 B r
Puis 2 X oyec C. krusei
6 B r
-
-
C.albicans A
-
-
C.tropicalis
-
-
C. pseudotropi-
calis
3+
-
C.krusei
2+
-
C. parakrusei
-
-
C.guilliernondi
-
-
T.glabrata
3+
3+
S.bisporus
3+
3+
S.cerevisiae
3+
-
C. catenulata
2+
-
Après 3 9,bso~tions~ C. gl hicans B ( 6 Br) nous remar-
quons que notre sérum anti 10, agglutine toutes les levures qui ont
l'Ag 10 (C.pseudotropicalis, T.glabrata, S. cerevisiae et S.bisporuè)
mais curieusement il agglutine également C.krusei et C.catenulata,
qui sont étroitement apparentées sérologiquement. Nous avons donc
saturé à nouveau notre sérum avec des levures C. krusei ; après 2
absorptions avec ces levures notre sérum n'agglutine plus les levures
C. krusei et C. catenulata, mais il n'agglutine plus également S.cere-
visiae.
87
Nous avons cru
à une erreur de manipulation et nous avons recom-
mencé à 3 reprises la préparation du sérum anti 10, mais nous avons
obtenu les mêmes résultats.
Si nous expliquons en partie l'absence d'agglutination de ce sérum
avec les levures C.pseudotropicalis par le faible pouvoir agglutino-
gène de l'Ag 10, nous ne nous expliquons pas par contre ce phénomène
avec les levures S.cerevisae.
En ce qui concerne T.glabrata,nous avons testé plusieurs souches de
cette espèce vis-à-vis du sérum anti 10 et nous avons toujours obtenu
de bonnes agglutinations.
Le sérum anti S.bisporus doit certainement renfermer une trop
faible quantité d'anticorps dirigés contre l'antigène 10. De plus nous
avons souligné la parenté antigénique étroite entre les Ag 7 et 10
(voir la préparation du sérum anti 7). De ce fait,
l'absorption du
sérum anti S.bisporus, avec C.albicans B ( 6 B r)
qui a l'Ag 7
(36
),
a dÜ entrainer une baisse des Ac anti 10.
10. -
Préparation du sérum anti 11:
Pour préparer ce sérum, nous avons choisi la combinaison de
KANO et Coll
(81) qui proposent l'absorption d'un antisérum C.krusei
qui a l'Ag 11
spécifique du groupe Pichia de TSUCHIYA
avec des
levures ·C. albicahs.
Structure antigénique de C. krusei et de C.albicans B.
C.krusei
1-2 -5
(11) b
C.albicans B
1-4-5
(7)
13b,
2,3
- Titre du sérum anti C.krusei
1/ 1280.
Après 3 absorptions de l'antisérum C.krusei dilué au 1 P nous obtenons
un sérum qui n'agglutine plus les levures C.albicans B.
(C.albicans
(6 B~) et d'autres souches de C.albicans B ).
Ensuite nous avons procédé au contrôle de l'agglutination sur lame
de ce sérum avec d'autres espèces de levures.
88
Tableau XIV :
Résultat de la vérification de la spécificité du sérum
anti 11.
Sérum anti C. krusei
Ag
Absorbé 3 X avec 6 Br
Puis 3 X êNec T. glabrata
C.alhicans B
-
-
( 6 Br)
C.alhicans A
-
-
C.t.ropicalis
-
-
C.pseudotropicalis
-.
-
C.krusei
3+
3+
C.parakrusei
-
-
C.guillienrondii
-
-
S.cerevisiae
-
-
T.glabrata
2 ++
-
C.catenualata
3+
3+
Après 3 absorptions avec C. albicans B (6 Br), on devrait s'atten-
dre à une agglutination uniquement avec les levures ayant l'Ag 11,
c1est-à-dire les levures du groupe Pichia de
TSUCHIYA (C.krusei et
C. catenulata font partie
de ce groupe).
Mais on observe une agglutination assez forte
( 2+) avec ~.glabrata.Il
a fallu 3 absorptions avec des culots de levures T.glabrata pour suppri-
mer cette agglutination non spécifique. Cette agglutination inattendue
avec T.glabrata rejoint les travaux d'HASENCLEVER et MITCHELL (69) qui
ont obtenu l'agglutination de T.glabrata avec des antisérums de C.knœei
C.parakrusei et C.pseudotropicalis après absorption avec des levures
C.albicans.
HASENCLEVER et MITCHELL expliquent cette anomalie par la présence à la
surface des levures T. glabrata des Ag communs avec les Ag profonds de
89
C. krusei, C.parakrusei et C. pseudotropicalis. Cette hypothèse
rejoint les travaux de HASENCLEVER et Coll.
(71)
qui ont démontré
que l'absorption de l'antisérum C.
stellatoidea (très proche du
groupe B de C.albicans) par une suspension de cellules entières de
C.
stellatoidea ou de C. albicans ne supprime pas toutes les proprié-
tés agglutinantes des levures C. albicans A ou C. tropicalis vis-à-vis
d'un tel sérum. Par contre, l'absorption avec une suspension de cel-
lules broyées de C.
stellato !dea ou de C.albicans B supprime tous les
anticorps contre C.albicans A ou C.tropicalis.
Nous avons également effectué des contrÔles avec d'autres souches de
de C. albicans A ou B et de T. glabrata mais nous n'avons obtenu au-
cune agglutination.
-
Nous avons réussi à préparer un bon sérum anti 11, très
sensible et très spécifique.
11. -
Préparation du sérum anti 13
Pour préparer cet antisérum 2 combinaisons sont possibles. Celle
de KANO et Coll
(81)
qui absorbent l'antisérum C. parakrusei avec des
levures C. albicans, et celle de TSUCHIYA et Coll.
(45) qui saturent
l'antisérum C. pulcherrina. avec des levures C. albicans.
Nous avons utilisé les deux combinaisons.
Structure antigénique des différentes levures
C. parakrusei:
1 -
5
13- 13b
2, 3,
(14)
(15) c
C. pulcherrine.:
1
5
13
2,3
14
(15)
d.
C .albicans B:
1 -
4-5
(7) Bb 2,8
90
Première combinaison:
- Antisérum
C. parakrusei : 1 / 160
- Levure absorbante C. albicans B
Nous remarquons qu'après absorption par les levures C. albicans B
il
restera éventuellement dans l'antisérum des anticorps dirigés contre
les Ag 14 et 15. Pour avoir un sérum monospécifique, il serait sou-
haitable d'absorber ces anticorps avec des levures qui ont les Ag
14 et 15, telle que Hansenula anomala.Malheureusement nous n'avons
pas cette souche, nous avons donc absorbé notre antisérum par des
levures s. cerevisiae pour éliminer les anticorps dirigés contre l'Ag
14.
- Après 3 saturations de l' antisérum
C .parakruse,i non dilué
'nous obtenons un antisé~um qui n'agglutine plus les levures Ç.ali~ B
Tableau XV :
Vérification de la spécificité de l'antisérum 13
par agglutination sur lame.
sérum anti C. parakrusei
Ag
~sorption 3 X éNec 6 B r
Puis 1 X ëNeC s. cerevisiae
c.alb1.eans B (6 B r)
-
-
C.albicans A
-
-
C.trq>icalsis
-
-
C.pseudotropicalis
-
-
C.krusei
-
-
C. parakrusei
2 +
2+
C.guillienrondii
-
-
T.glabrata
-
-
S.cerevisiae
-
-
C. zeJ'ian:>ides
2+
2+
6 B r: C. albicans B
91
Nous remarquons qu'après 3 absorptions de l'antisérum C.parakrusei
avec des levures C.albicansB(6 Br), nous obtenons un sérum spéci-
fique qui n'agglutine qu'avec C. parakrusei et C.zeylanoides
(ces
2 levures ayant l'Ag 13). Ce sérum n'agglutine pas S.cerevisiae mais
nous l'avons
nemmoins saturé avec cette levure, pour éliminer d'é-
ventuelles agglutinations non spécifiques avec d'autres souches de
S.cerevisiae.
-
Nous n'avons pas pu tester la spécificité et la sensibilité
du sérum 13 obtenu avec plusieurs souches de C.zeylanoides car nous
en manquions, mais nous tenons à souligner la facilité avec laquelle
nous avons obtenu ce sérum anti 13.
Deuxième combinaison:
-
Antisérum C. pulcherrima : 1
/ 80
- Levure" absorbante
: C. albicans A
La même remarque faite dans la première combinaison a propos des
anticorps dirigés contre les Ag 14 et 15 est valable ici également.
Après 2 absorptions de l'antisérum C. pulcherrima non dilué nous
obtenons un antisérum qui n'agglutine plus
C. albicans.
- Cette deuxième combinaison, ne nous a donc pas donné
•
les résultats escomptes. Le titre très bas de notre antisérum C.pul-
cherrima y est peut être pour quelque chose.
92
12) -
PREPARATION DU SERUM ANTI 13b
Pour préparer cet antisérum Tsuchiya et Coll. proposent
l'absorption d'un antisérum C. albicans par des levures C.tropi-
calis , KANO et Coll.de leur ceté proposent 2 combinaisons: soit
l'absorption d'un antisérum C. parakrusei par des levures
C.tropi-
calis, soit l'absorption d'un antisérum C.
albicans B par des le-
vures C. guilliermondii.
Structure antigénique de ces différentes levures.
C. albicans B
1 - 4 -5
(7)
13b,
2,3
C. t:r:opicalis
1 - 4 -5 - 6
2,3
C.
guillienrondii:
1 -
4
9
2,3
C.
parak-t'usei
1 -
5
13- 13b,
2,3
(14) (15)
Nous avons opté pour la proposition de Tsuchiya et Coll.
mais en y apportant une légère modification.
En regardant le tableau de Tsuchiya et Coll. sur la structure anti-
génique des levures, on remarque que C. albicans B peut avoir l'Ag 7,
donc après saturation de l'antisérum ~ albicans B par des levures
C. tropicalis,
i l peut subsister les a.nticorps correspondant à l'Ag. 7;
nous avons donc trouvé nécessaire d'absorber
le sérum anti C.albi-
cans B privé des anticorps dirigés contre C. tropicalis par des culots
de levures C. claussenii
qui ont l'Ag 7. Ainsi on aura un sérum
monospécifique.
93
Les deux combinaisons de KANO et Collaborateurs ne per-
mettent pas d'obtenir un sérum monospécifique anti 13B. En effet,
la première,c'est à-dire. l'absorption de l'antisérum C. parakrusei
par des levures C. tropicali~,laisse
subsister des anticorps anti
13 et 13B., la deuxième
combinaison/c'est à dire l'absorption d'un
antisérum C. albicans B par des levures C. guilliermondii,rappelle
celle de Tsuchiya et collaborateurs, et nécessite par contre une
éventuelle absorption avec des levures C. claussenii.
Nous tenons à faire remarquer que Tsuchiya et collaborateurs préco-
nisent l'utilisation du C. albicans B r e f NIH 792. Cette levure dont
nous ne connaissons pas la structure antigénique
exacte n'a peut.
être pa s I ' Ag 7.
D'autre part nous avons utilisé comme souche de C.albicans B, la
souche de référence INSP 6 Br., malheureusement le "Candida check"
ne nous a pas permis,par manque d'antisérum correspondant/de véri-
fier la présence ou l'absence d'Ag 7 dans cette souche, mais notre
antisérum anti 7 nous permet d'affirmer que C. albicans
(INSP 6 Br.>
possède
l'Ag 7.
Nous avons tenté de préparer notre antisérum 13b, en par-
tant du sérum anti C. parakrusei, absorbé par des levures C. tropicalis
Nous n'avons malheureusement pas pu obtenir un bon antisérum 13b,
avec cette combinaison, nous attribuons cet
. échec à la structure
antigénique assez complexe de C. parakrusei.
Notre expérience dans la préparation du sérum anti 13 b.
Sérum anti C. albicans B
(6 B r)
1/1280
Levure absorbante C. tropicalis
94
Après 4 absorptions du sérum anti C. albicans B dilué
au 1/2 on obtient un sérum qui n'agglutine plus avec C.tropicalis.
Nous avons volontairement utilisé un sérum peu dilué (1/640) dans le
souci.- d'avoir un très bon anti-sérum 13b ,.
Vérification de la spécificité de l' antisérum 13b.
Tableau XVI :
Vérification de la spécificité de l'antisérum 13b.
par agglutination sur lame
Sérum anti C. albicans B
Ag.
absorbé 4 x ëNec
Puis 2 x ëNec C.albi-
Puis 2 x ëNec
é. tropicalis
cans A+ C.guillienrondii
T.glabrata.
6 B r
2 +
..
~
C. albicans
+
-
-
C. tropicalis
-
-
-
C. pseudotro-
-
-
-
calis
C. krusei
-
-
-
C. Parakrusei
3 +
3 +
3 +
C. guillierrron-
+
-
-
dii
T. glabrata
2+
2+
-
C. zeylamides
-
-
-
..,~
95
Ce tableau
montre qu'après 4 absorptions par des
levures C.tropicalis on obtient un antisérum C.albicans B qui agglu-
tine bien toutes les levures ayant l'Ag 13b (6 B r
et C. parakrusei).
mais cet antisérum donne une bonne agglutination avec T.glabrata,
et i l donne une légère agglutination avec C.albicans A et C.guilliernon-
dii.
Après saturation par un mélange de culot de levures C.albicans A
+ C. guilliermondii, on obtient un sérum qui agglutine toujours très
bien les levures C. parakrusei et T.glabrata, mais on note une baisse
du pouvoir agglutinant de ce sérum vis-à-vis des levures C. albicans B
(INSP 6 B r).
Une dernière absorption avec les levures T.glabrata nous
a permis d'obtenir un antisérum qui agglutine très bien C.parakrusei
et très moyennement C. albicans B (INSP 6 B r).
Nous avons testé cet antisérum avec plusieurs autres souches de
C.albicans B mais nous avons obtenu une agglutination semblable.
Nous tenons à faire remarquer que SWEET et KAUFMAN
(121)
après absorption d'un antisérurn C.albicans B avec des levures C.tro-
picalis ont obtenu un sérum qui agglutinait toujours C.stellatoidea.
Torulopsis glabrata et C. stellatoidea ayant l'Ag 10, on peut con-
clure que ces résultats confirment la parenté antigénique entre les
Ag 7 et 10. En effet toutes les souches de C. albicans sérotype B à
Abidjan ont l'Ag 7
r 36
). On peut donc considérer que le sérum
96
anti C. albicansB(INSP6 B r)
absorbé avec C.
tropicalis qui n'a
jamais l'Ag 13 B et l'Ag 7 garde encore des anticorps contre l'Ag
13B et l'Ag 7. Et ce sont ces anticorps anti 7 qui expliquent l'agglu-
tination avec T. glabrata.
Malgré plusieurs tentatives nous n'avons pas pu obtenir
un très bon antisérum 13 B.
Devant ce résultat très moyen nous nous sommes posés plusieurs
questions: L'Ag 13 B de C. albicans est-il faible ou a-t-il
un
pouvoir immunogène très faible· ?nous avons envisagé cette possi-
bilité, car nous avons eu à préparer d'autres antisérums C.albicans
dans le but d'avoir un bon sérum 13 B, mais malgré les hauts titres
obtenus avec ces souches
(1 /1280
nous n'avons pas pu obtenir de
meilleurs résultats.
Nos souches de C. albicans A (IFO, ,INSP 2B r, V W ) ont-
elles un Ag 13 B non décé .lable par l ' antisérum 13 B du, "Candida
check"; cette éventualité n'est pas à écarter car après absorption
de l'antisérum C. albicans B avec des levures C. albicans A,on note
une baisse du pouvoir agglutinant de cet antisérum vis. à-vis de
C. albicaris B (INSP
6' B r),
cette hypothèse est confirmée
en partie
par le tableau II de Tsuchiya qui montre que C. albicans A peut avoir
l'Ag 13 B mais en quantité variable.
97
13) -PREPARATION SU SERUM ANTI 34.
Pour préparer cet antisérum,KANO et Coll. préconisent
d'absorber l'antisérum T. glabrata par des levures C. albicans;
Tsuchiya et Coll. utilisent la m~me combinaison, mais réabsorbent
l'antisérum T. glabrata par C. pseudotropicalis., Nous avons retenu
la méthode de Tsuchiya, car elle permet d'éliminer les anticorps
correspondant à l'Ag 10.
Structure antigénique des différentes levures.
T. glabrata
1- 3
6
10
34
C. albicans A:
'
1- 4-
5- 6
(13b), 2,3
C •
pseuàotropicalis
1
f
•
- *
8
(10)
28,31 a.
Il faut noter que T.glabrata peut posséder l'Ag 4 ou l'Ag5
ou
les deux à la fois.
Comme première lenrrè absordante nous avons choisi C. albicans A car
sa structure antigénique comporte les Ag 4 et 5;
notre expérience dans la préparation du sérum anti 34.
sérum anti
T. glabrata
1 /2560
levure absorbante C. albicans A
(2 B r)
Après 4 absorptions de l'antisérurn T. glabrata dilué
au
1/4, nous obtenons un antisérum qui n'agglutine plus C. albicans A.
98
Tableau XVII :
Vérification de la spécificité de l'antisérum 34
par agglutination sur lame.
Sérum anti T. glabrata
Ag
absorbé 4 X
Puis 2 x avec
Puis 4 x éNec
Puis 1 x ëNec
éNec C. aThi-
6 B r
C. guillienoon-
S.cerelTisiae
cans A.
dii
6 B r
+
-
-
-
C. aThicans A
-
-
-
-
C. tropicalis
-
-
-
-
C. pseudotropi-
-
-
-
-
calis
C. krusei
-
-
-
-
C. parakrusei
-
-
-
-
C. guillier:rron-
2 +
2+
-
-
dii
T. glabrata
3 +
3 +
2+
2+
S. cerevisiae
+
+
.. +
-
Le tableau
ci-dessus nous montre qu'après 4 absorptions
avec des culots de levures C. albicans A, nous obtenons un antisérum
T. glabrata qui agglutine très bien T. glabrata, mais cet antisérum
agglutine de façon inattendue C. guilliermondii (2
+)
et C. albicans B
(6 B r)
(
+
l, on n'obtient pas d'agglutination avec C. pseudotro-
picalis
Ce résultat peut s'expliquer par le faible pouvoir agglu-
99
tinogène de l'Ag 10 de C. pseudotropicalis, antigène mis entre·
parenthèses dans les tableauxI et II de Tsuchiya), mais on obtient
une agglutination avec S. cerevisiae
par l'Ag 10. L'agglutination
avec C. guilliermondii , rappelle la préparation du sérum anti 9
où nous avons remarqué qu'après absorption du sérum anti
C. guil-
liermondii
par des culots de levures C. albicans et C. tropicalis
on obtient toujours une forte agglutination avec les levures
T.
glabrata.
De même l'agglutination de cet antisérum avec C. albicans B
(INSP G Br) fait penser à la préparation du sérum anti 13B où nous
avons obtenu après absorption de l'antisérum C.albicans B par
C. tropicalis,
un sérum qui agglutinait très bien T. glabrata.
Cette constatation peut faire penser à une éventuelle relation entre
les Ag 10 et 13 B. Mais nous avons démontré la faiblesse de l'Ag 13B •
Plusieurs
auteurs l'ont également observé
3 4 ) , sauf les auteurs
Japonais qui n'insistent pas. Cette dernière observation doit plutôt iai-
're penser à l'interférence de l'Ag 7. En effet C. albicans B
(6 Br)
a l'Ag 7, et le sérum anti T. glabrata saturé avec C. albicans A
qui n'a pas llAg 7, peut encore agglutiner C. albicans B,
du fait
de la parenté antigénique entre les Ag 7 et 10.
Après absorptionssuccessivespar des
culots de levures
C. albicans B
(INSP GBr) , C. guilliermondii, et S. cerevisiae, on
obtient un sérum anti T. glabrata
qui agglutine très bien les
levures T. glabrata.
100
C - UTILISATION DES ANTISERUMS PREPARES DANS L'IDENTIFICATION
DES SOUCHES DE LEVURES
Plusieurs auteurs ont utilis~ avec succ~s le "Candida
check" des Japonais
(31,
33,
81, 117, 122, 123, 145). Dans plus
de 95 % des cas les résultats de l'identification sérologique
correspondaient aux résultats de l'identification par les carac-
t~res biologiques. SWEET et KAUFMAN (121) ont pu préparer 13
antisérums dont six sont monospécifiques. Ces six s~rums monospé-
cifiques leur permettaient d'identifier par
la méthode d'agglu-
tination sur lame C. guilliermondii, C. krusei, C. parapsilosis
et C. pseudo tropicali~, mais il ne pouvaient pas séparer anti-
g~niquement C. albicans s~rotype A de C. tropicalis, ou C. albicans
s~rotype B de C. ste llatoidea
Pour chaque antis~rum SWEET et KAUFMAN ont d~termin~ la
sensibilité et la spécificité en r~p~tant les agglutinations avec
diverses souches de levures d'esp~ces différentes et déjà iden-
tifiées, la sensibilité est la mesure de la capacit~ de l'anti-
sérum à détecter un antig~ne quand celui-ci est présent, et la
spécificité
est
la mesure de son incapacité à réagir avec des
Ag hétérologues.
Comme ces auteurs,
nous avons tenté d'appr~cier ces diff~rents
param~tres pour nos antisérums.
Avant d'entamer l'identification proprement dite des
diff~rentes souches de levures par nos antis~rums, il faut noter
que FUKAZAWA et coll
(52) ont montré la haute sp~cificité
des fractions IgG dans les réactions sérologiques avec les diffé-
rentes espèces de Candida.
-
101 -
Les différents sérums monospécifiques du "Candida check"
sont préparés à partir de fractions IgG.
Les travaux de SWEET et KAUFMAN
(121)
ainsi que nos tra-
vaux font intervenir des antisérums préparés à partir de sérum
brut
(mélange d'IgG et d'IgM).
MATËRIEL ET MËTHODES
-
LES SOUCHES
Nous avons retenu pour cette étude 520 souches de levures
provenant de prélèvements divers
: prélèvements vaginaux, prélève-
ments cutanés,
les urines et les crachats.
Toutes les souches proviennent de malades africains de
l'agglomération Abdijanaise. Les souches d'origine vaginale, uri-
naire et digestive proviennent de malades ayant consulté au service
de gynécologie et de médecine du C.H.U. de Cocody, ainsi que de la
consultation de l'Institut National de Santé Publique d'Abidjan.
Les souches d'origine cutanée ont été isolées chez des patients
provenant du service de dermatologie du C.H.U. de Treichville ~
enfin,
les souches isolées des crachats proviennent de malades
hospitalisés au service de Pneumophysiologie du C.H.U. de Cocody.
Les prélèvements ont été effectués au service de Micro-
biologie de l'Institut National de Santé Publique d'Abidjan et
au service de Parasitologie-Mycologie de la Faculté de Médecine
d'Abidjan pour les souches urinaires, vaginales et digestives,
et exclusivement au laboratoire de Parasitologie et Mycologie
pour les souches issues des crachats et de la peau.
Hormis ces 520 souches, nous avons utilisé certaines
souches de référence de l'Institut Pasteur de Lyon, de l'Institut
Pasteur de Paris ou du service du Pro Percebois à Nancy pour
tester nos antisérums.
Pour avoir des souches pures, nous avons procédé de la
façon suivante
nous choisissons une colonie isolée dans la
primoculture, et nous l'ensemençons par épuisement sur gélose
de Sabouraud en boîte de Pétri, puis nous isolons une nouvelle
colonie que nous réensemençons par épuisement sur milieu de
-
102 -
Sabouraud additionné de chloramphénicol.
Après 48 h de culture à 37°C nous soumettons les levures
à un test de blastèse et une recherche d'uréase. Les levures
blastèse (-)
et uréase
(-)
subissent un test de chlamydosporu-
lation sur milieu R.A.T.
(Rice-Agar-Tween).
Compte tenu de nos moyens matériels limités, nous avons
considéré que toutes les levures Blastèse
(+)
ou chlamydosporula-
tion
(+) et uréase
(-)
étaient identifiées comme C. albicans.
Les levures blastèse
(-), chlamydosporulation
(-)
et
uréase
(-)
sont traitées par le système API 20 C auxanogramme et
par la sérologie. D'autre part les souches identifiées comme C.
albicans subissent un contrOle par les sérums monospécifiques pour
vérifier leur structure antigénique et pour préciser leur sérotype.
-
LES SERUMS MONOSPECIFIQUES.
Nous avons utilisé nos propres antisérums. Nous avons
retenu les sérums monospécifiques permettant de détecter les
Ag 1-4-S-6-8-9-11-13-13b et 34 du groupe des Candida de Tsuchiya
(Tableaux l
et II).
- MODE OPERATOIRE
- Agglutination sur lame
Une grosse Ose de culture de levure de 48 h est émulsionnée dans
un 1/2 ml de sérum physiologique dans un tube à hémolyse. Sur des
plaques en verre pour agglutination, on dépose une goutte de
chaque sérum monospécifique. Ensuite, à l'aide d'une pipette fine
on dépose une goutte de suspension de levures dans chacun des 10
compartiments, puis on agite pendant 30" à 2'
les plaques d'un mou-
vement lent et rotatif. La lecture est faite dans les S'qui suivent.
N.B.
L'émulsion de la levure dans du sérum physiologique présente
l'avantage de déceler les souches autoagglutinables, qui
peuvent être récupérées après ébullition pendant 2 h.
103
Nous n'avons pas retenu la méthode préconisée par le
"Candida check" qui consiste à faire une identification par élimi-
nation en utilisant les sérums dans un ordre précis
(voir chapitre
"Candida check"). Cette méthode permet certes une économie de temps
et de réactif, mais elle ne permet ni la détection de souches à
structure antigénique aberrante, ni de déceler une souillure éven-
tuelle. En utilisant simultanément ces 10 sérums monospécifiques
nous avons déceler
un mélange de levures C.krusei et T.glabrata.
Ce mélange n'a pu être détecté par le système API 20C Auxanograrnrne;
ces deux levures présentant beaucoup de caractères auxanographiques
négatifs
(84).
- La recherche de l'uréase.
La recherche d'uréase est effectuée sur le milieu urée
indole de l ' Insti tut Pasteur.
Dans des tubes à hémolyse contenant 0,5 ml de ce milieu on ajoute
3 gouttes de la suspension de levures en sérum physiologique à étudier.
Le test est interprètable au bout de 4 h. Si le test est positif le
milieu vire au rouge violacé.
-
Les résultats
. Le test de recherche de l'uréase.
Toutes les levures sont uréase négative; et toutes les
levures agglutinent le sérum anti 1. Ces 2 résultats nous permettent
de continuer nos identifications par nos sérums monospécifiques, car
ces 10 sérums permettent d'identifier les levures du groupe des
Candida de Tsuchiya, et toutes les levures de ce groupe sont uréase
négative et agglutinent le sérum anti 1.
104
- Le test de Blastèse ou de chlamydosporulation.
Sur les 520 souches, 361 avaient une blastèse
+ ou une chlamydos-
porulation
+ • Il faut noter que la plupart d'entre elles avaient
plutôt une blastèse + ce qui permet donc de penser que ce sont bien
des Candida albicans.
Nous rendrons compte des résultats de l'identification sérologique
de ces levures dans la partie de ce travail consacrée aux résultats
des sérotypes des souches de C.albicans rencontrées en Côte d'Ivoire.
- Résultats de l'identification des souches a~res que
C.albicans. Avant de voir en détail les principaux résultats, il est
bon de rappeler la structure antigénique des espèces de Candida
pouvant être identifiées par les 10 sérums monospécifiques préparés.
105
Tableau
XVIII:Structure antigénique des principaux Candida
d'intérêt médical selon KANO et SUZIKI.
!
ESPECES OU SEROTYPES
STRUCTURE ANTIGENIQUE
C. albicans A
l
4
5
6
13b**
*
C. albicans B
l
4
5
13b
*
C. tropicalis
l
4
5
6
C. stellatoidea
l
4
5
C. guilliermondii
l
4
9
*
11
C. krusei
l
5
*
C. parakrusei
l
5
13
13b
C. pseudotropicalis
l
8
**
T. glabrata
l
4
5
6
34
* exceptionnellement absent
* * exceptionnellement présent.
Remarque : On note dans ce tableau que C. stellatoidea, C. pseudo-
tropicalis et T. glabrata n'ont pas l'Ag 10, mais cela s'explique
par le manque d'antisérum 10 dans le "Candia check".
D'autre part dans le Candida check, il ya 2 tests bio-
logiques qui permettent de distinguer C. albicans A de C. tropi-
calis et C. albicans B de C. stellatoidea.
- Comparaison de l'identification par nos sérums monospécifiques
avec l'identification par la galerie API 20c auxanogramme.
- Par la méthode sérologique sur les 159 souches autres que
C. albicans, 146 ont été identifiées 13 n'ont pu être identifiées.
106
Parmi ces 13 souches, 10 ont été ièl.E'ntifiées
comme des Candida
~, l'une était
autoagglutinable et les 2 autres avaient une
structure antigénique aberrante ne permettant pas leur identifi-
cation.
- Par la méthode auxanographique (Api 20c i sur les 159 souches autJre.s que
C.albicans 149 ont été ;tdentifiées préciserrent 10 n 1ont-. pu être identifiées r
parmi ces 10 souches 2 ont été identifiées, parmi ces 10 souches
2 ont été identifiées comme des Saccharomyces sp, 4 comme des
Candida sp
et 4 n'ont pu être identifiées.
Par ordre de fréquence décroissant on a: C.tropicalis, T.glabrata
C.krusei, C.pseudotropicalis, C.guilliermondii et C. parakrusei
Tableau XIX :
Identification sérologique et auxanographiques des souches
Autres que C.albicans.
Identification
Espèces
Identification sérologique
auxanographique
%
%
C.tropicalis
61
38,3
56
35,2
T.glabrata
37
23,2
39
24,5
C.krusei
23
14,4
24
15,0
C. pseudotropicalis
11
6,9
11
6,9
c. guillienrondii
8
5,0
8
5,0
C. Parakrusei
6
3,7
6
3,7
C.rugosa
-
-
5
3,1
Sacchal:'ar!fœssp
-
-
2
1,2
candida sp
10
6,2
4
2,5
Inconnues
3
1,8
4
2,5
Total
159
100 %
159
100 %
107
Tableau
'XX
Nombre de souches identifiées comme la même
espèce par la méthode
sérologique et la méthode
auxanographique.
N::MBRE DE SOlOiES IDEN-
NOMBRE DE SOUCHES
ESPECES
TIFIEES CCM-1E lA MEME
IDENI'IFIEES PAR lA SEROUXIE
ESPECE PAR LES 2
MEJl'HODES
C. tropicalis
61
56
T. glabrata
37
37
C. krusei
23
23
C. parakrusei
6
6
C.pseudotropicalis
11
11
C.guilliermondii
8
8
Il est à remarquer que nos sérums monospécifiques ne peuvent pas
permettre l'identification sé~ologique de C. rugosa et des espèces
de Saccharomyces. D'autre part les la candida Sp auraient pu être
identifiés si. l'on disposait d'un nombre plus élevé de sérums mo-
nospécifiques.
La concordance entre l'identification sérologique et
l'identification auxanographique est de 141 souches ce qui représen-
te 88,6 % des 159 souches autres que C. albicans.
Cependant la
concordance des résultats passe de 88,6% à 93,3% ~i on enlève
des 159
souches , les souches ne pouvant être identifiées par nos la sérums
monospécifiques c'est-à-dire: C. rugosa (5 souches)
Saccharomyces
Sp (2 souches) et la souche autoagglutinable totalisée dans les
inconnues.
Nous allons voir en détail les résultats de l'agglutina-
tion sur lame avec nos sérums monospécifiques. Dans le tableau
récapitulatif nous n'avons pas figuré volontairement les Candida
~qui le plus souvent n'ont agglutiné qu'avec le sérum anti l,
ainsi que toutes les souches qui ont présenté une agglutination
aberrante ne permettant pas leur identification sérologique.
108
Tableau
XXI: Résultat de l'agglutination sur lame avec nos
sérums monospécifiques.
NCMBRE DE sotOŒS
SERUMS
MONOSPEClFlQUES
Notre identification
l
4
5
6
8
9
11
13
Db
34
l
+
+ +
+
+
c. tropicalis
6
+
+
+
c. tropicalis
5
4
+
+ +
+
c. tropicalis
3
+
+ +
+
+
+
l 5
+
+
+
+f
+f
+
T.glabrata
l 9
+
+
+
+
2 0
+
+
+
l
+
+
+
+
c. krusei
2
+
+
9
+
+
C. pseudotropicalis
2
+
+
+
6
+
+
+
+
2
+ +
+
+
C. guillierrnàooii
4
+
+ +
C. parakrusei
2
+
+
+ +
+f = faible agglutination
109
COMMENTAIRE:
Les souches que nous avons
identifiées comme C.tropicalis
avaient toutes l'Ag 6,
6 d'entre elles n'avaient pas l'Ag 5,
mais nous avons remarqué lors de la préparation du sérum anti 5
que ce sérum était assez faible;
l'une d'entre elle avait l'Ag 13b;
on peut éventuellement penser à une souche de C. albicans A ayant
l'Ag 6 et l'Ag 13b, comme cela a été observé par KANNO et SUZUKI(Sl),
mais il s'agit d'une souche qui a une blastèse
(-)
et une chlamydos-
porulation (-). Parmi les souches identifiées comme T. glabrata,
3 avaient l'Ag 5 et l'Ag 13b qui n'existe normalement pas chez
T. glabrata. C'est la présence de l'Ag 34 qui nous a orienté dans
notre identification car cet Ag est spécifique de T. glabrata, 15
d'entre elles avaient les Ag 9 et 13ben faible quantité; nous attri-
buons ces agglutinations aberrantes au
peu de spécificité de ces
2 antisérums.
Dans l'ensemble la structure antigénique de C.
krusei par
nos antisérums est la même que celle de TSUCHIYA : Ag l
-
5 et Il.
l
souche avait l'Ag 13b, et les 2 autres n'avaient pas l'Ag 5.
Ces anomalies s'expliquent par la faible spécificité de ces anti-
sérums.
L'identification de ~. pseudotropicalis n'a pas posé
beaucoup de problèmes puisque sur les Il souches,
9 avaient une struc-
ture antigénique conforme à celle de TSUCHIYA : Ag l-S.
3 avaient
l'Ag 5, mais la présence de l'Ag S nous a orienté vers l'identifi-
cation de C. pseudotropicalis. Cependant Saccharomyces elegans
à
l'Ag 5
(Ag
1,S
(10)
4,5)
(Tb. lI.) • On peut donc se demander s ' i l
faut mettre cela sur le compte du
peu de spécificité de l'antisérum 5
ou si l'on a plutôt
affaire à une espèce de Saccharomyces,
(il faut
noter que S.
fragilis,
s. marxia~us et C. pseudotropicalis ont la
même structure antigénique
(132 -
143- 145).
110
En ce qui concerne C.
guilliermondjj,
2 de nos souches avaient
l'Ag 6, on s'explique mal cette anomalie.
Dans le groupe Debaryo-
myces de TSUCHIYA
(Tb II)
caractérisé par l'Ag 9,
aucune levure
n'a l'Ag 6. C'est la présence de l'Ag 9 qui nous a orienté vers
l'identification de C.
guilliermondii.
La structure
antigénique de C.
parakrusei est la
suivante: Ag
1
5 13
l3b,
l'Ag 5 est exceptionnellement absent
d'après KANNO
( 81 ).
Sur nos 6 souches 4 n'avaient pas l'Ag 5.
Il faut noter que DOUCHET et MULLER
33 ) ont déjà noté l'absence
de l'Ag 5 dans plusieurs souches de C.
parakrusei
identifiées avec
les sérums du "Candida check"
des auteurs japonais.
Au vue de nos résultats,
nous avons essayé de déterminer
la sensibilité et la spécificité de nos différents antisérums.
La sensibilité
est
la mesure de la capacité de l'antisérum à
détecter un Ag quand i l est présent et la spécificité
est· la
mesure du manque de réaction avec des Ag hétérologues.
AntiSérum:1:Sa sensibilité est très bonne,
toutes les levures
testées ont présenté l'Ag 1.
(sté 100 %).
Sa spécificité est
difficile à préciser car dans cette étude nous n'avons pas de
souches qui n'ont pas l'Ag l, mais il faut noter que nous avons eu
des souches de Trichosporon et de cryptococcus qui n'ont pas
agglutiné avec notre sérum anti 1.
Antisérum 4 :
Sa sensibilité est très bonne, de l'ordre de 100 %
car toutes les
levures qui ont l'Ag 4
(C.
tropicalis, C. guillier-
mondii
et T. glabrata)
ont été agglutinées par cet antisérum.
Sa spécificité, on peut également l'estimer à 100 % car aucune
levure dépourvue de l'Ag 4 n'a agglutiné avec cet antisérum.
111
Antisérum 5 :
6 souches de C.
tropicalis
sur 61 n'ont pas
l'Ag 5,
4 souches de C. parakrusei sur 6 n'ont pas l'Ag 5 et 2
souches de C.
krusei
sur 23 n'ont pas l'Ag 5, au total 12 souches
sur 90 souches n'ont pas l'Ag 5, on a donc une sensibilité de
l'ordre de 86,6 %.
:Sa spécificité:
3 souches de T. glabrata sur 37 ont l'Ag 5, mais l'Ag 5
peut être présent
81
),
2 souches de C. pseudotropicalis sur
Il ont l'Ag 5. Si l'on considère le total des souches n'ayant pas
l'Ag 5 (T. glbrata,:
37, C. guilliermondii 8 et C. pseudotropicalis
Il), on a 5 souches sur 56 qui ont l'Ag 5, ce qui représente une
spécificité de 91 % ; mais si l'on admet que T. glabrata a l'Ag 5
on obtient 2 souches sur 56 qui n'ont pas l'Ag 5, ce qui représente
une spécificité de 96,4 %.
Antisérum 6 : sa sensibilité est très bonne, on peut l'estimer à
100 %, car toutes les levures qui ont l'Ag 6 ont été agglutinées
par cet antisérum.
Sa spécificité est également très bonne, car seules
deux souches de C. guilliermondii, qui n'ont
normalement pas l'Ag 6
ont été agglutinées par l'antisérum 6.
Antisérum 8 : sa sensibilité et sa spécificité sont très bonnes car
l'Ag 8 de toutes les souches de C. pseudotropicalis a été détecté
par cet antisérum, et aucune souche, autre que c. pseudotropicalis
n'a été agglutiné par l'antisérum 8.
Antisérum 9 : toutes les souches de c. guilliermondii ont présenté
l!Ag
9,
sa sensibilité est donc très bonne.
112
Spécificité : 15 souches de T. glabrata ont présenté
l'Ag 9 sur les 138 souches de levures n'ayant pas l'Ag 9(C. tropicalis
61, T.glabrata :
37, c. parakrusei 6, c. krusei 23, C. pseudotropicali~
Il),
sa spécificité est donc de l'ordre de 89 %.
Antisérum Il : sa sensibilité et sa spécificité sont très bonnes, car
l'Ag Il de toutes les souches de C.
krusei a été décelé, et aucune
souche autre que C.
krusei n'a été agglutinéepar le sérum anti Il.
Antisérum 13 :
l'Ag 13 de toutes les souches de C. parakrusei a été
détecté, et aucune souche autre que C. parakruse i
n'a présenté l' A·g 13.
On a donc une bonne sensibilité et une bonne spécificité.
Antisérum 13 b :
toutes les souches de C. parakrusei ont présenté
l'Ag 13 b, mais la sensibilité de cet antisérum ne pourra @tre
jugée qu'après le sérotypage des souches de C.
albicans car le
sérotype B de C.
albicans a l'Ag 13 b.
Spécificité
l
souche de C.
tropicalis
sur 61,18
souches de T.
glabrata sur 37 et 2 souches de C.
krusei sur 23, soit
21 souches sur les 146 souches de levures n'ayant pas l'Ag 13 b,
(C. parakrusei, C. pseudotropicalis et_Co guilliermondii n'ont pas
l'Ag 13 b)
ont présenté cet Ag. On a donc une spécificité de l'ordre
de 85 %.
Antisérum 34 :
l'Ag 34 de toutes les souches de T. glabrata a été
détecté, et aucune souche autre que ~labrata n'a présenté l'Ag 34.
On a donc une bonne sensibilité et une bonne spécificité.
Dans l'ensemble nous avons préparé des sérums d'une
bonne sensibilité et d'une bonne spécificité.
113
D - SEROTYPAGE DES SOOCHES DE CANDIDA ALBICANS RENCONTREES
EN COTE D'IVOIRE
HASENCLEVER et MITCHELL en 1961,(70)
ont montré par des
réactions d'agglutination que Candida albicans répondait à 2 séro-
types: Candida albicans sérotype A et C. albicans sérotype B. Candida
albicans sérotype A est très proche antigéniquement de C. tropicalis,
et C. albicans sérotype B de C.
stellatoidea
(60-71-74-77-120).
Les deux sérotypes de C. albicans ont des propriétés mor-
phologiques, physiologiques et pathologiques identiques
( 55-57-70-72)
La distribution des sérotypes A et B de C. albicans varie
selon l'origine anatomique des prélèvements, la race,
la région
géo-
graphique. En France et en Europe le sérotype A prédomine 75 à plus
de 90 % selon les auteurs
(38-42-58-102- 118).
Aux U.
S. A., au
contraire HASENCLEVER trouve une proportion beaucoup plus élevée de
sérotype B parmi les femmes noires Américaines,60 % de sérotype B
( 73) •
DROUHET
(42
l,au Sénégal, sur 64 souches de femmes sénégalaise§15
étaient de sérotype B soit 23,4%, ce taux assez élevé est cePendant loin de la :
haute prévalence dans la population noire Américaine. L'origine
anatomique des prélèvements intervient très peu. dans la distribution
des sérotypes
(42-76-73) ..
Plusieurs auteurs ont observé que néan-
moins le sérotype B apparaissait plus fréquent parmi les souches
isolées de la sphère génitale
(313'-39-58-'102)
D'autre part les 2 sérotypes de C. albicans n'ont pas la même sensi-
bilité vis-à-vis de la 5 fluorocytosine
( 5 F C ).
114
DROUHET et Coll.en 1973
( 39 ) ont observé que les souches appar-
tenant au sérotype B sont fréquemment résistantes à la 5 F C tandis
que les souches de sérotype A sont très sensibles à cet antifon-
gique. Plusieurs autres travaux
(35-36-40-42-~02
' ) ont confirmé
ces observations. Il faut noter que la haute prévalence des séro-
types B dans les souches vaginales africaines est associée à la haute
prévalence de résistance à la 5 F C.
( 35, 36,41 ') ~ Il faut souligner
également qu'à Dakar, on note un taux de résitance plus faible qu'à
_ Abidjan parmi les souches d'origine vaginale
( 35, 41 ).
L'existance de ces 2 sérotypes soulève le problème de la s~ructure
pariétale de ces 2 types de C. albicans.
Les mannanes sont les constituants antigéniques essentiels
de la paroi de C. albicans et même des autres levures 19 (24-60-74-120)
pour
HASENCLEVER et Coll.
( 7CH'20) Les mannanes de C. albicans A
renferment tous les déterminants antigéniques des mannanes de C. al
bicans B plusun.ou
plusieurs antigènes supplémentaires. Les travaux
de TSUCHIYA
143 -
145
) infirment cette hypothèse; car les
tableaux de classifications des levures du genre Candida de TSUCHIYA
rrontrent la présence de 1~g13 B présent chez le sérotype B et habi tuelle-
ment absent chez le sérotype A, ce désaccord doit être interprété
dans le choix des souches initiales des auteurs Américains.
L'étude des mannanes de C. albicans sérotypes A et Bél
démontré
qu'ils ont des polymères très ramifiés contenant des liaisons~2J
O(
1 --~ 3) et
0 ( 1 --~ 6 ) et que les deux sérotypes diffèrent
L . . .
dans leur degré de polymérisation (42,74).
115
MATERIEL ET METHODES
Les souches.
361
souches de C. albicans ,
identifiées par le test de
blastèse dans la plupart des cas et quelquefois par le test de
chlamydosporulation sur R.A.T.,ont fait l'objet de cette étude.
Toutes les souches proviennent de malades africains de l'agglomé-
ration abidjanaise, originaire de la Côte-d'Ivoire ou des pays limi-
trophes .
Répartition des 361 souches suivant l'origine des prélèvements
urinaire et vaginale
217
cutanée
95
digestive
30
crachats
1 9
Le sérotypage des souches .
Le sérotypage de C. albicans a été effectué avec les 10
sérums monospécifiques, précédemment utilisés c'estrà-dire les anti-
sérums 1, 4, 5, 6,
8,
9, 11,
13,
13b et 34, et le sérum anti 7. Nous
avons vu dans le chapitre, concernant la préparation des sérums
monospécifiques, que nous n'avons pas pu obtenir un sérum monospéci-
fique anti 7, mais que nous avons obtenu un sérum anti 7 qui agglu-
tinait encore les levures possédant l'Ag 10. L'Ag 7 doit certainement
avoir une parenté antigénique avec l'Ag 10 ce qui explique la diffi-
culté d'obtenir un sérum menos~cifique. Néanmoins ce sérum anti 7
qui agglutine les levures ayant l'Ag 10 ( C. pseudotropicalis et
Saccharomyces cerevisiae)
n'agglutine pas les levures C. albicans A
116 -
mais il agglutine les levures C. albicans B ; ce résultat rejoint
un peu les résultats des auteurs Japonais. En effet pour les auteurs
Japonais le C. albicans B a l'Ag 7 en faible quantité,
le C.albicans A
n'a pas l'Ag 7, par contre le C. albicans C a un Ag 7 très marqué
( 52,
145).
Mode opératoire
Nous avons procédé comme précédemment en utilisant
simultanément les
11 sérums monospécifiques.
Il faut souligner que
toutes les souches autoagglutinables
ont pu être -récupérée:; après ébul-
~ition pendant 2 heures.
Les résultats
Pour interpréter les résultats,
i l est utile de
rappeler la structure antigénique des différents sérotypes de
C. albicans selon TSUCHIYA et collaborateurs
145) •
Sérotype A
:l\\g.
1-2-3-4-5-6
(13b
Sérotype B
1-2-3-4-5-
(7
13b
Sérotype C
1-2-3-4-5- 6
7
117
Tableau
XXII :
Résultat du sérotypege des 361 souches de C. albicans
sans distinction de l'origine du prélèvement.
Nombre de
l
4
5
6
7
8
9
Il
13
13B
34
souches
206
+
+
+
-
+
+
l
13
+
+
-
-
+
+
(225)
3
+
-
-
-
+
+
3
4-
+
+
-
+
-
85
+
+
+
+
+
+
II
(103) 18
+
+
+
+
-
0+-
111(17)
17
+
+
+
+
-
-
IV
13
+
+
+
-
+
-
(16)
2
+
+
-
-
+
+
l
+
+
+
+
+
+
0+-
361
Ces résultats globaux nous permettent de répartir les blas-
tospores (le C. albicàn~3' rencontrés à Abidjan en 4 groupes.
Le groupe l , c'est le groupe le plus important,
il comporte
225 levures. Ce groupe est caractérisé par l'absence de l'Ag 6 et
par la présence des Ag 7 et 13 B.
Le groupe II 1c'est le 2ème groupe en importance,
i l compor-
te 103 souches. Ce groupe est caractérisé dans l'ensemble par la
présence des Ag 6,
7 et 13 B.
118
Le groupe
III
qui comporte 17 souches est caractérisé par la pré-
sence de l'Ag 6 et par l'absence des Ag 7 et 13 B.
Enfin le groupe IV, comporte des levures à structure antigénique par-
ticulière. Dans ce groupe on rencontre des souches qui n'ont ni l'Ag6,
ni l'Ag 13b, mais qui ont l'Ag 7 ; on trouve également des souches
qui ont une structure antigénique aberrante, par exemple présence
simultanée des Ag S,
6, 9,
13 et 13 B.
Ces résultats d'ensemble,
font apparaître que aans le groupe des C.al-
bicans
étudiés, nous avons rencontré très peu d'agglutinations non
spécifiques avec nos antisérums,
i l n'y a que 3 souches de C. albicans
qui nous ont donné une agglutination erronée. D'autre part on remarque
que dans le groupe l,
on a certainsC. albicans qui n'ont pas l'Ag S,
et d'autres qui n'ont ni l'Ag S, ni l'Ag 4. On peut attribuer ce man-
que d'agglutination à la faible sensibilité des antisérums 4 et S,
mais i l faut souligner que nous avons déjà observé
(36) qu'en général
le sérotype B qui n'a pas l'Ag 6 comme les levures du groupe A était
globalement moins riche en Ag 4 et 5. Ce point a été également sou-
ligné par VERNES et Collaborateurs
(149)
. On note également que
très peu
de levures n'ont pas l'Ag 7, ceci rejoint les 1e~travaux
des auteurs Japonais qui ont observé l'Ag 7 chez tous les C. albicans.
Dans un deuxième tableau nous allons faire intervenir uniquement les
différents antisérums,
permettant de typer les Ci. albicans. Dans ce
tableau n'.interviendront pas les 3 souches à structure. antiqéniqu~
aberrante.
119
Tableau
XXIII
Résultats du sérotypage des 358 souches de C. albicans
_...
A.S n C'{)
A.S. Ncr;
A.S. N°B B
Nanbre de souches
%
-
Sérotype
A
+
-
-
17
4,7
Sérotype
B
-
+
+
222
62,0
-
+
-
3
0,8
Sérotype
+
+
+
85
23,7
A. B
+
-
+
18
5,0
Sérotype
-
+
-
13
3,6
indétenninablE
Total
358
100 %
A. S
Antisérurn
Ces
résultats font apparaître la très grande fréquence du
sérotype B:62,8 % des 358 souches. Le sérotype A qui n'a pas l'an-
tigène 7 ( 145
apparaît ici très rare 4,7 % , par contre on note
un pourcentage assez élevé de sérotype AB. Nous avons été tenté d'ià6r
tifier les levures de sérotype AB, comme des levures de sérotype C,
mais la plupart des levures de ce groupe ( 23,7 %) ont l'Ag 7 carac-
téristique du sérotype C mais ces levures ont en plus l'Ag 13 B qui
n'existe pas dans le sérotype C (145
). Les levures de sérotype AB
seraient probablement des C. albicans de sérotype A ayant l'Ag 7.
120
Ces levures de sérotype AB~ rappellent les travaux de POULAIN et
collaborateurs
(107
qui ont montré que les sérums de lapins
infectés avec des souches de sérotype B ont encore une réactivité
anti sérotype A même après absorptions poussées avec des souches
homologues où hétérologues de sérotype B, mais quand ces sérums
étaient absorbés avec des souches de sérotype A,
ils perdaient leur
réaction anti C. albicans. De même VERNES et collaborateurs
( 149
ont montré que la sérotypie sur cultures monospores de C. albicans
permettaient de mettre en évidence au sein d'une souche de sérotype A,
un clone de sérotype B. Le sérotype qu'ils ont dénommé intermédiaire
se rapproche du sérotype A par la présence de l'Ag 6 en quantité
plus faible et du sérotype B par sa pauvreté en Ag 4 et 5 ; mais
dans ce travail VERNES et collaborateurs ne parlent pas de l'antigène
13 B qui/à notre avis/est caractéristique du sérotype B.
Ces résultats mettent en évidence un faible pourcentage
(3,6 % ) de
C. albicans qui n'ont pu être typés par manque des Ag 6 et 13 B.
Toutes ces levures ont l'Ag 7 retrouvé chez tous les Candida albicans
dans les 1~s travaux des auteurs Japonais. Nous avons voulu expli-
quer l'absence de l'Ag 13 B par la faible sensibilité
(voir chapitre
concernant la préparation des antisérums ) de notre antisérum 13 B •
mais nous avons testé ces mêmes souches avec les sérums de référence
du "Candida check ll mais nous n'avons pas pu mettre en évidence la
présence de l'Ag 13B. Les levures C. albicans ni A, ni B ne sont
pas forcément des levures de sérotype B qui ont perdu l'Ag 13 B.
Nous insistons sur l'Ag 13 B car nous avons remarqué au cours de ce
travail que certaines souches de C. albicans B avaient parfois un
Ag 13 B à faible pouvoir agglutinogène.
121
Nous revenons sur un point très important, c'est la fréquence élevée
du sérotype B:62 % des 361 souches à Abidjan. Ce taux élevé est com-
parable à celui trouvé par HASENCLAVER et Collaborateurs parmi les
femmes noires Américaines
(60 %)
73
). Ce taux est nettement
supérieur à celui rencontré en Europe qui ne dépasse pas 15 % (41 -83 ) .
Dans un 3ème tableau nous allons voir la distribution des sérotypes
en fonction de l'origine des prélèvements.
Il faut noter que les 3 souches a structure antigénique aberrante pro-
viennent des prélèvements vaginaux et urinairesices 3 souches ne figu-
reront pas dans le tableau ci-dessous.
Tableau XXIV :
REPARTITION DES SEROTYPES SUIVANT L'ORIGINE ANATOMIQUE
DU PRELEVEMENTS
Origine
Total
A
B
AB
ni A ni B
Urinaire
et
vaginale
214
4 (1,8 %)
133(62,1%)
64(29,9%)
13(6 %
Cutanée
95
5 (5,2 %)
65(68,4%)
25(26,3%)
-
Digestive
30
1 (3,3 9 %)
19(63,3%)
10(33,3%)
-
Crachats
19
7
(36,8%)
8 (42,1%)
4 (21
%)
-
Total
358
17
225
103
13
Hormis les crachats, les résultats ci-dessus montrent que l'origine ana-
tomique des prélèvements ne semble pas en cause dans la distribution
des sérotypes. En effet on note très peu de différence dans la propor-
tian de sérotype5A et B'
de sérotypes A et AB, et de sérotyPES B et AB
122
en fonction de la nature des prélèvements. Si l'on compare nos ré-
sul tats avec ceux de plusieurs autres auteurs
38 - 49 - 83
on
peut conclure que c'est l'origine raciale qui a plutôt une importance
capitale dans la distribution des sérotypes.
Nous retrouvons le pourcentage le plus élevé de sérotype B (68,4 %)
dans les prélèvements cutanés. Nos résultats rejoignent ceux de
KOENING et Collaborateurs
(83
) à Strasbourg qui ont montré que le
sérotype B était plus fréquent au niveau de la peau et des ongles
(13 %). Il est intéressant de noter que la clinique dermatologique
de Strasbourg a un recrutement important de malades d'origine afri-
caine.
Au niveau des crachats on retrouve le pourcentage le plus faible en
sérotype B (42,1%)et le pourcentage le plus élevé en sérotype A
(36,8 %). Nos prélèvements de crachats ont été éffectués
sur
des ma-
lades chez lesquels on soupçonnait une tuberculose pulmonaire. Ces
résultats discordants demandent à être confirmés, sur un échantillon-
bage beaucoup plus élevé
(19 souches dans cette étude).
123
-
E - DISCUSSION
Avec 4 ou 6 sérums spécifiques CAMPBELL réussit à
iden-
tifier les espèces de Saccharomyce~ et à distinguer ou à grouper
les espèces des autres genres par des réactions d'agglutination
sur lame
( 18-20-21-22-23).
SWEET et KAUFMAN
(121)
avec leurs propres antisérums,
sont arrivés
à identifier les principaux Candida d'intérêt médical par cette
même méthode d'agglutination sur lame.
Dans ce travail nous avons réussi à préparer les différents sérums
du "Candida check" des auteurs Japonais. Ces sérums nous ont permis
par la réaction d'agglutination sur lame d'identifier avec un succès
relatif les diverses espèces de Candida d'importance médicale.
Ces résultats montrent l'utilité de cette technique dans l'identifi-
cation des levures. Mais cette méthode sérologique nous donnerait
des résultats bien meilleurs,
si on l'associait systématiquement à
l'étude des caractères morphologiques des levures. En effet,
l'étude
de la blastèse, de la chlamydosporulation, de la réduction du chlorure
de triphényl tétrazolium, de l'aspect morphologique des levures sur
milieu R.A.T. ou sur milieu P.C.B.,
nous fourniraient des renseigne-
ments précieux qui complèteraient ceux obtenus avec les divers sérums
du "Candida check". Dans le groupe des Candida de Tsuchiya
(143-145),
on retrouve des levures qui appartiennent aux genres Candida,
Pichia ,
Debaryomyces, Saccharomyces, Torulopsis etc ...
Toutes ces levures ont en commun l'Ag 1. L'étude morphologique de ces
levures nous orienterait dans notre diagnostic.
Il faut cependant
souligner que l'on a trouvé la forme parfaite de certains Candida
124
qui se trouve être une autre espèce. Donc la notion d'espèce n'est
pas bien établie.
Le travail de Tsuchiya et Coll., de Bastide et Coll.
par des techniques d'hydrolyse enzymatique de la paroi des levures
arrivent aux mêmes résultats
Candida curvata n'est pas un Candida
malgré la filamentation mais un Cryptococcus.
De même dans le genre
Torulopsis, de nombreuses espèces sont actuellement identifiées à des
Ascomycètes ou à des Basidiomycètes.
La filamentation est certes un caractère utile mais i l est
de peu de valeur taxonomique, car i l dépend trop du milieu de culture.
Les caractères antigéniques sont importants tout comme les caractères
biochimiques.
Lors de l'identification des levures non c. albicans,
nous avons rencontré un certain nombre de levures que nous avons
étiquetées Candida sps ; ces résultats nous montrent que les 10 sérums
du "Candida check" sont insuffisants si l'on veut identifier précisé-
ment un nombre beaucoup plus élevé de levures du groupe des Candida
de Tsuchiya.
Il serait donc utile, de préparer en dehors des 10 sérums
du "Candida check"
un certain nombre d'antisérums monospécifiques, et
le choix de ces sérums monospécifiques serait orienté par la nature
des prélèvements à étudier. Les résultats du sérotypage des C. albicanE
nous ont montré un taux très élevé de C. albicans sérotype B (62,3 %),
un taux assez élevé de C.
albicans de sérotype AB
(28 %)
et quelques
C. albicans ni A ni B. Hormis VERNES et collaborateurs, (149) qui ont
signalé la présence de C.
albicans de sérotype intermédiaire,
la plu-
part des auteurs qui ont étudié les sérotypes de C.
albicans, n'ont pa~
fait état de ces sérotypes. Cela peut s'expliquer par le fait que la
plupart d'entre eux ont utilisé pour typer les C.albicans,
un sérum
anti C.
albicans A,
et tous les C.
albicans, qui n'agglutinent pas
125
avec ce sérum sont étiquetés C.
albicans B et ceux qui agglutinent
avec ce sérum c. albicans A.
Nous avons tenté de préparer le sérum anti 10, mais sans
succès. Ce sérum ne figure pas dans le "Candida check", pourtant ce
sérum nous aurait rendu d'énormes services dans l'identification des
levures du genre Saccharomyces, mais également dans l'identification
de C.
stellatoidea et de C.
pseudotropicalis ;
nous avons montré
l'étroite parenté antigénique entre les Ag.
10 et 7. C'est peut-être
cette similarité antigénique qui ne permet pas la préparation de
l'antisérum 10. Nous avons préparé un sérum anti 7, qui n'est pas
monospécifique car il réagissait avec les levures ayant l'Ag 10,
mais ce sérum agglutinait les C.
albicans B, mais pas les C. albicans
du groupe A.
Tous les travaux des auteurs Japonais jusqu'en 1974
(125-126-127-128-129-130-133-134-135-136-137-138-139-140-143-144-145) .
notent.
la présence de l'Ag.
7 chez tous les Candida albicW; plus précisé-.
ment chez les C.a.lbicans du groupe C qu'ils rencontraient fréquemment.
Ce sérum anti 7, ne figure pas également dans
Le"Candida check"
pourtant il est très utile dans l'identification de C. claussenii
et de C.
albicans C.
Le sérotype C existe -
t -
il ?
Si l'on regarde les combinaisons de Tsuchiya et Collaborateurs pour
la préparation des sérums monospécifiques, on note que pour obtenir
le sérum anti 7,
ils utilisent un antisérum C.
albicans qu'ils
absorbent avec C.
tropicalis,
ils ne précisent pas le sérotype du
C.
albicans à utiliser car il ne rencontre que du sérotype C, et on
peut se demander si pour eux tous les C. albicans n'ont pas l'Ag 7.
FUKAZAWA et collaborateurs ont montré l'importance des fractions 19i
126
-
, dans la spécificité de sérotype et dans la préparation des sérums
monospécifiques
(52). Ces auteurs n'ont pu obtenir un bon sérum
anti 7 à partir des fractions Ig G.
Après extraction par différents solvants de polysaccharides solubles
de C. albicans, FUKAZAWA et collaborateurs
(51)
ont pu obtenir une
fraction qui semble spécifique de l'Ag 7.
Ils ont préparé chez le
lapin un sérum anti7 à partir de cette fraction couplée avec l'adju-
vant complet de Freund. Après absorption avec des levures C.
tropi-
calis ,
ils ont obtenu un bon antisérum 7. Ces auteurs font remarquer
que le sérum anti 7 est très utile mais difficile à préparer.
Pour notre part nous pensons que la difficulté d'obtenir le sérum
anti 7 s'explique par l'étroite similarité antigénique entre les Ag 7
et 10. Nous pensons également que le sérotype C n'a pas d'existence
propre, c'est plutôt un sérotype A avec l'Ag 7,
et ce sont certaine-
ment les plus nombreux.
D'ailleurs dans le 1er tableau de Tsuchiya
(143)
sur plus de 1500 souches de C. albicans ,
ils avaient tous
l'Ag 7,
ils n'avaient pas de sérotype B, qui semble être spécifique
à la race noire, comme l'ont montré plusieurs travaux (34-35-36-73).
Dans l'article de Tsuchiya de 1974
(145),
il souligne qu'il ne faut
pas multiplier les sérotypes de C. albicans. En effet, si l'on
regarde de près nos résultats sur le sérotypage des C. albicans, on
peut imaginer qu'il y a de nombreux sérotypes.
l
er exemple :
les Ag 6 et 13 B permettent de noter 4
sérotypes
A (Ag 6), AB
(Ag 6 et 13 B), B (Ag 13 B), 0
(ni Ag6 ni-
Ag 13 B). Avec le sérotype 7 on augmente
encore le nombr~ et l'on
créé le sérotype C.
De même tous les C.
tr~picalis n'ont pas toujours l'Ag 6, on peut
127
-
Donc décrire 2 sérotypes A et B,
il en est de même de T. glabrata
dont certaines souches ont l'Ag 5 et d'autres pas.
Il est peut être important de connaître ces variétés car ceci permet
de mieux comprendre la structure antigénique des levures.
Cette notion de sérotype A, B et C doit être bien élucidée.
FUKAZAWA
et collaborateurs (5?, 143) mentionnent qui ils ont étudié une souche
de C. albicans B fournie par BIGUET et qu'ils se sont posés la
question de savoir si C. albicans n'étaient pas monotypique, car cette
souche de C. albicans B avait une petite quantité d'Ag 7,
et surtout
une faible quantité d'Ag 6. Ces auteurs pensent que les souches de
C.
albicans qui nlont pas l'Ag 6 mais qui produisent des chlamydos-
pores doivent être étudiées minutieusement.
Nous pensons que le sérotype B doit être conservé, car il garde
une autre propriété,
l'existence d'une résistance à la SFC.
C O N
C
L U S
l a
N
128
CONCLUSION
Les auteurs Japon~is ont mis ~u point un kit d-identi-
fic~tion sérologique par agglutination sur l~me des principaux
Candida rencontrés en Médecine. Ce kit : le "Candida check"
comporte 10 sérums monospécifiques.
Plusieurs études ont montré que ce kit donne des résultats satis-
faisants en 1 /4h à 4h de temps.
Nous avons préparé les 10 sérums du "Candida check", ainsi que les
antisérums 7 et 10 qui ne figurent pas dans ce kit. Pour l'iden-
tification des levures nous avons utilisé en plus de nos 12 sérums,
le test de blastèse, la chlamydosporulation et la recherche d'uréase.
Notre étude portant sur 501 souches, 361 de C.albicans et 140 de
Candida divers, nous a permis de juger de la valeur de chaque sérum
monospécifique du point devue spécificité et sensibilité. Nous avons
comparé l'identification par le"Candida check"et par le système
API 20c auxanogramme. Nous avons obtenu une concordance de plus de
88 %.
Le sérotypage des souches de C. albicans, nous a donné un'~' très
élevé de sérotype B: 62 % • Ce résultat semble confirmer la haute
prévalence du sérotype B, dans la race noire.
Nous avons trouvé un % de sérotype A et B, non négligeable (13%).Ce
résultat nous amène à poser le problème de la réalité des divers
sérotypes de Candida albicans.
Si l'on testait simultanément toutes les souches de C.albicans typées
à l'heure actuelle avec les antisérums 6 (spécifique du sérotype A)J
et 13 B (spécifique du sérotype B) allions-nous obtenir les mêmes
résultats?
129
La classification des levures est en perptétuel remaniement direc-
tement en rapport avec les découvertes apportées par l'utilisa-
tion de nouvelles techniques d'étude.
TSUCHIYA a proposé une nouvelle classification utile car elle a
permis de mettre certaines espèces dans le groupe qui leur con-
venait, l'exemple des Candida est caractéristique: C.curvata a la
structure antigénique d'un Cryptococcus. Cette levure possède une
uréase, un GC % semblable à celui des Cryptococcus, de plus la lyse
enzymatique de sa paroi ne peut se faire qulavec des enzymes qui
attaquent les Cryptococcus. De même C. pseudotropicalis est la forme
imparfaite de S.fragilis, ces 2 levures sont antigéniquement iden-
tique s.
La structure antigénique des levures par la méthode de TSUCHIYA
permet donc le rapprochement ou l'éloignement_ de deux espèces; mais
il faut souligner que les différents sérums du "Candida
check"
ne permettent pas toujours une identification d'espèce, mais ils
permettent une identification de groupe. Si lion prend l'exemple
du S ~ III de Candida albicans c'est~à-dire le groupe Pichia{tableau
I},nous remarquons que C.krusei, C.catenulata, C.mycoderma et
C.
solani ont les Ag 1, 5, 11.Au vue c'lela présence des Ag 1,5 et 11
(Antisérum figurant dans le Candida check)
on est tenté de dire que
nous sommes en présence de C. krusei car clest l'espèce la plus
communément rencontrée en Médecine, mais si l'on veut. être plus
précis, i l serait souhaitable de faire appel à
d'autres sérums
130
monospécifiques ne figurant pas dans le "Candida check" soit d'iden-
tifier notre levure comme un'Candida du groupe krusei.
Tout cela pour souligner l'intérêt d'adjoindre l'étude
des carac-
tères biologiques aux caractères antigQnique '.
D'autre
part plusieurs auteurs ont évoqué la faible stabilité des
sérums monospécifiques ; pour notre part nous avons remarqué qu'après
un an de conservation dU réfrigérateur
à
+ 4 0 c, on notait une
baisse du pouvoir agglutinant des sérums. Nous pensons qu'une utili-
sation plus accrue du "Candida check" passe par la préparation de
sérums très stables, mais également par l'introduction des antisérurns
7 et 10 dans ce kit. Car ces 2 antisérums permettraient d'améliorer
sa performance.
-
130
b i s -
A N N E X E
Tableau l
Structure antigénique des levures étudiées
d'après Tsuchiya et coll. (143).
Tableau II
Structure antigénique des levures étudiées
d'après Tsuchiya et Coll. (45) •
Tableau II
(suite)
: Structure antigénique des levures
étudiées d'après Tsuchiya et Coll. (145).
Tableau 1: Structure antigénique des levures étudiées dl après Tsuchiya et Coll.
(43)
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132
Tableau II: Structure antigénique des levures étudiées dl après
Tsuchiya et Coll.
(145)
Scrological and biological characlcrislics of various yeasl species
Group of Gcnus
Spccies
Antigenic structure
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1,11,12,20;
5,21 ;
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P. poperi
1,11,12,20;
5,21 ;
2,37,e
H
Co timet. v.
diversa
1,11,12,18;
5;
2,14,3) ,c
P. lerricola
1,11,12,18;
5;
2,14,31,c
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Hansenula Gr.
H. bimundalis
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2,14(15)17
+
H
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H. fabianii
](16)20;
(21 );
2,14(15)17
+ H
H. petersonii
1(16)20;
21;
2(14)15,I7,p
-1-
H
H. anomala
1,16,20;
2,14,15(17)
+
H
H. ciferrii
1,16,20;
2,14,15(17)
+ H
H. minula
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5;
2,45;
+ H
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5,25
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H. wingei
1,18;
5,25
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H. beckii
1,18;
5,25
2,17,31,48
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O. couder Iii
1,9;
4'
2,3,14
Rw
Gr ... (V)
P. vini
1,9;
4;
2,3,14
Rw
D. marama
1,9;
4;
2,3( 14)
Ow
D. han~enii
](9);
4;
2,3,14
Rw
C. gui\\lier-
mondii
1,9;
4'
2,3
P. haplophila
1,9;
4;
2,3
H
C. lenuis
1,9;
4,5;
2,3
- - - - - - - - -
Torulaspora
S. rosti
1,24;
4;
3
It
Gr ... (VII)
S. dclhrueckii
1,24;
4'
3
R
S. vafc!
1,24;
4;
3
R
D. franciscac
1,24;
3,27,i
R
D. globosus
1,10,24;
3,27.i
Rw
C. inlcrmcdia
1,6,24;
4,5;
2,3,38
Castella nia
S. uni~porus
1,6(10);
:4.5;23;
3
R
Gr ... O·)
S. cxiguus
1,6,10;
~(5 )26;
3,32
R
C. bovina
1.10;
4;
2,3,32,39
T. sake
1,6;
~.S;
2,3
C. lropicalis
1,6;
4,5;
2,3
C. lrop. v.
Jambica
1,6;
4,5;
2,3
C. 'llbicans C
. 1,f',7;
4,5;
2,3
C. albicans A
1,6;
4,5,ll3b); 2,3
C. albicans D
l,t7]:
4,5,13b;
2~3
C. c1all~scnii
1,6,7;
4,5;
2.3
Kloeckcra
K. ma~na
1,(,(1)40;
5;
2,3
Subgr.... (1.)
K. africana
1,6(7)40;
5;
2,3
K. cOl\\ici~
1,6(7)40;
5;
2,1
K. Iln5illarum
1,6(1)40;
5;
2,3
Ils. osmophila
1,6(1)40;
5;
2,3
R
Ils. vineac
1,6(1)40;
5;
2,3
R
K. javanica
1,(,(7)R,IO,40
5;
2,J,2R
K. icn~cnii
1,6(7)R,IO,40
5:
2,3,2R
K. lararii
1.(,(1 )H.III,40
5;
2,J,2K
133
Tableau II: (Suite) Structure antégénique des levures étudiées
dl après Tsuchiya et Coll. (145)
Group or genus
Species
Anligenic struclure
è
(Tsuchiya et aL)
~
.. "
~
Ô
ë
::>
~
.. Z "
~
V
~
'"
<
Mycocandida
C. parapsilosis
1,\\3;
S,Db;
2,3(14)( 1S)c
Gr •.. (IV)
C. opsil. v.
intcrmed.
1,13;
5;
2,3,I4,I5,t
-
P. pscudopoly·
morpha
1,13;
4,5
2,3,I4,I5,c
R
D. l"astellii
1,\\3;
(5)
2,3,14(15)a
Rw
D. tantarellii
1,13;
(5)
2,3(14)15
Rw
HanseniujJora
K. alliculata
1,8,10;
28.1
Subgr.•.. (l1r)
Hs. valbyensis
1,8,10;
28,1
H
Hs. uvarum
1,8,10;
28.1
R
Hs. guillier·
mOlldii
1,8,10;
28,1
H
Kluyve)omyccs
S. fragilis
1,8,10;
28,31,a
K
Subgr..• , (II·)
C. pseudotropi.
talis
1,8UO);
28,31,a
S. fruttuum
1,8,10;
2,14,28,31
R
S. mellis
1(8)(10);
(28)(31 )(32)
R
S. bailli
1,8(10);
28,32
R
S. rouxii
1(R)(IO);
28,32
R
S. carlshcrgensis
1(8)(10);
28,32
R
S. pastorianus
1,8(10);
28.32
R
S. dcgans
1,8(10);
4,5;
28(32)
R
S. vcronac
1,8,10;
2,14,28(32)
R
S. italiclls
\\,8,IOCl8);
(2)(3)14,28,31
R
S. chevalieri
1(8)(10)18;
2,3(14)31
R
Saccharomyces
S. hcterOl:eniclIs
1,10,18;
2,3,14\\31 )
R
Gr.... (II.)
S. diastaticus
1,10,18;
2,3,14,31
R
S. oviformis
1,10,18;
2,3,14,31
R
S. baya nus
1,10,18;
2,3,14,31
R
S. logos
1,10,18;
2()14,3\\
R
S. uvarum
1,10,18;
2,3,14,31
R
S. norenlinus
1,10,18;
2,3,14,3\\
R
S. cerevisiac
1,10,1~;
2,3( 14131,a,e
R
S. cllipsoiucus
1,10,18;
2,3( 14)3 I,a,e
R
S. stcineri
1,10,18;
2.3,14,31,e
R
Saccharomyccs
T. magnoliae
1,10;
35:
2
+
Subgr. ,. , (11-)
T. vcrsatilis
1,10;
35;
36
+
Schizosacch.
Sehiz. pombc
1;
3;
+
R
Gr.
C. lipolytica
1;
2'
4, ...
+
C. petrophilum
1;
2;
4, ...
+
T. pctrophilllm
1;
2'
+
Sporobolomyces
Sp. salmoni·
colpr
l'
8;
9
+
+
+ R
Gr.
Sp. gratilis
(4 );
(6);
+
+
B
Rhpdoloruln
R. glutinis
1;
8;
2,5
+
+. +
Gr.
R. palliua
4'
6;
10
of
+-
.._-_. -
Cryptoc. Gr.
Cr. ncoformnns
J;
2,4;
6.8
+
Arabie numeral show thermoslahle nntigens, alphabelicalleuers indieale thermolahile antigens excepl
fnr nntil\\en 13b. Anligens for which agl:lulinoj;enit C:lp..cilies are very wcuk, are indieated in paren-
Ihe~i~. R. H. Rw, Ow and K mean rnllnd, hnl.shaped, round and warly, oral and warty, kidney like
ll~cnllsnres, re~pettively. 1\\ me"n' hallislospores. A'cn~pnres were exnmined hy the nlllhor~, unll sorne·
limes werc Î1lllicnlellnC\\:onhng III l.'HIII,,· el ni. ",hen nul furnll'.1.
BI
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QG
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DOUCHET (CH, ) e t MULLER (J,),
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41
DROUHET (E.) ~ MERC 1ER SOUCY (L,)
et MONTPLA 1SIR (S,) 1 -
Sensibilité et résistance des levures pathogènes
aux 5 fluoropyrimidines.
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la densité d'ensemencement sur la production des
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DUJARDIN (L.)" WALBAUM (S.) et BIGUET (J.). -
La chlamydosporulation de Candida albicans:
influence de la densité d'ensemencement et de la
concentration de glucose, d'azote, de biotine et
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Influence de l'épaisseur du milieu de culture et de
la densité d'ensemencement sur la production de
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Chlamydosporulation de Candida albicans: avec ou
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Bull. Soc. Fr. Mycol. Méd.
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Vague de chlamydosporulation de Candida albicans
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Bull. Soc. Fr. Mycol. Méd. 1981, Tome X nO 1,53-56
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Influence de la températare et du PH sur les
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