...'~
......
MINISTERE
DE
L'AGRICULTURE
ECOLE NATIONALE SUPERIEURE AGRONOMIQUE DE MONTPELLIER
THESE
présentée à l'Ecole Nationale Supérieure Agronomique de Montpell fer
pour obtenir le grade de :
DOCTEUR·INGENIEUR en AGRONOMIE
Option: Physiologie de la nutrition des végétaux
INFLUENCE DE L'AZOTE f:OMmNE ET nu RECYCLAGE DE L'HYDROGÈNE
SUR L'ACTIVITE ET L'EFFICACITf, RElATIVE DANS LA SYMBIOSE
,GLYf:INE MAX RHIZOBIUM JAPONICU~»
par
K/MOU AKOMlAN
soutenue le 5 ju il let 1984 devant la Commission d'Examen
JURY, M. P. GRIGNAC
M.
MACHEIX
M.
OBATON
I~~
MùrHANGE
r.~
SALSAC
OODJS'

---

LISTE DES PRINCIPALES ABREVIATIONS
=z=======z===a===========~=.===~=_
ADP
Adénosine Diphosphate
ANR
Activité Nitrate Réductase
ANR
ANR spécifique
s
ARA : Activité Réductrice d'Acetylène
ARA : ARA spécifique
s
ATP : Adénosine triphosphate
CETIOM
Centre Technique Interprofessionnel des Oléagineux Métropolitains
CNEARC
Centre National des Etudes Agronomiques des Régions Chaudes
CT
: Cycle Tricarboxylique
EDTA : Acide Ethylene diaminetétracétique, sel dissoclique
ENSAM : Ecole Nationale Supérieure Agronomique de Montpellier
ER
Efficacité Relative
ERa
ER apparente,
ETM
Evapotranspiration maximale
F
Floraison
Fd
Fer't"edoxine
FG
Formation des Gousses
Fld
Flavodoxine
GOGAT
Glutamate synthase
GS
Glutamine synthétase
lRAT
Institut de Recherches d'Agronomie Tropicale et des Cultu't"es Vivrières
Lb
Léghémoglobine
MF
Matière fraîche
MG
Maturité physiologique des gousses
MS
Matière Sèche
NAD+
Nicotinamide Adénine Dinucléotide
forme oxydée
NADH
Nicotinamide Adénine dinucléotide
forme réduite
NR
Nitrate Réductase
N,e
Nitrogénase
NNEDD
N-l-Naphythyl-Ethylenediamine dihydrochloride
PEP
Phosphoenolypyruvate
RG
Remplissage des Gousses
USTL
Université des Sciences et Techniques du Languedoc
YEM
Yeast Extract Mannitol

---

REMERCIEMENTS
Ce mémoire a ~t~ rendu possible grâce à l'environnement scien-
tifique et moral dont J"/ai bënëfi-cié au Laboratoire des Symbiotes des
Racines de Montpellier (I.N.R.A. - E.N.S.A.M.J.
Ce Iaboratoi re m'a ét~ propoeé par le Professeur GHIGNAC. qui
s'est toujours -intëreeeé au su.;;'et tirai të, Pa:!' ses aoneei le cone'tantie i l
a, en grande partie, orientt ce travail. J'ai trouvt ici l'oooasion de
lui exprimer ma gratitude.
Monsieur le Proteeeevr BALSAC dirige le laboratoire où s'est
effec~ le travail; il s'y est partiouli~rement inttresst et n'a oe8st
de l: 'orienter par ses aoneei.le et ses enoouraqementie, Je le remercie de
m'a'Voir fait bénéficier de sa competence,
Monsieur OBATON, Mattre de Recherche à l: 'INRA, a dirigé mon
travail depuis deux ans, en ne ménageant ni tBmps ni peine. Ses critiques
et eoneei le m'ont été partrioul-iërement: prëoieux dans La proqreeeion de
• ce rravail., Je Le remercie de m'avoir tant donné,
Je remercie ëqalement: Monsieur MA.CHEIX~ Profeeeeur à L 'VSTL et
Moneieur POULAIN~ Di-reateur pëdaçoqi-que au C.N.E.A.R.C. à Mont:peLZier~ de
e 'Lntéreeeer ci mon travaiL et de troU7Jer Le temps néoeeeaire pour juger
ee mémoi-re,
Je euie reoonnaissarlt à Monsieur DREVON~ Cha:rg4 de Beoherohe
à L'INRA de s'être -intiéreeeé à ce tvaoai.l: et d'avoir Le p lue souvent
participé d L 'él-aboratnon des espërieneee et d 'La. discussion des rëeul-iate,
Je tiene a exprimer ma reoormaieeanae d Madame BRODIN qui a
daC'tyLographié ce doC'ument aveC' beaucoup d'appLication.
Qu'iL me eoi», enfin permis d'exprimer ma reconnaissance à tous
ceux qui, d'une manière ou ât une autre" m'ont aidé et que je ne puis cite'!"
indivi-due Llement.

---

SD~MAIRE
a - 1NTROWCT ION GËNËRALE • • • • • • • • • • • • • • • • • < , • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • , • • • • •
1 - DDNNËES BIBLIOGRAPHIQUES
.... . ..... . ... ....... . .. . ...... ...... .
,
.. ........ 2
l,O. INTRODuCTION
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , • • . • .. • • .. .. • • . . •
2
.............. . ... . ......... . ......... J
1.1. LA SYMEIOSE lEGUMINEUSE-RHIZOBIU~
............. .., ............ .... ............. J
\\ 1 • l
Les deux partenair~s
111.1
La
légumineuse
1: 1.2
Le Rhizobium
:1.2
~a
nodosité .•..•........••.............• '...............••..•.....
6
J 12. 1 F~rmation
J \\2.2 Fonctionnement
]~22. : Approvisionnement dE :a nodos~t~ en carbo~e
J122.2 A?pro~isionr.ement dee bactéro~àes er. origène
~122.3 1r~nsfert de L'a2ote :~=é à la plante-hôte
1.2. MECANISME BIOCHIMIQUE DE LA fiXATION DE L'AZOTE MOLECULAIRE............
12
....................
12. J
la nitrogénase
, . . .. .... . ... ... . .. . . .... ... ..
12
121. l
Constitution
121.2
Fonctionnement
1212.1
Réduction de Z'c2c~e moZ~c~Z2ire
1212.2
Production d'hydro?~ne
1212.3
AU~res sub9tr2ts et facteurs de ré~~ZQtion
du fon~tionn€ment cie la nitrogérase
12.2
Bilan énergétigue et ac:ivfté hydrogënase
.
J B
122.1
Energie nécessaire pour la rêduction de N2
122.2
Coût de la réduction des protons
J22.3
Hydrogénase et recyclage de l'hydrogène

---

Pages
1.3. INFLUENCE DU NITRATE SUR LA FIXATION DE L'AZOTE MOLECULAIRE ••••••••••••••
22
13.1
L'activitê nitrate réductase .......•.•....•.......••.........•.....
22
131.1 Absorption et distribution du N0 3
131.2 Réduction des nitrates
13.2
Effets du N0
sur la fixation
..•..•......•..........•.•...........
24
3
132.1
Effet sur la nodulation
132.2
Effet sur la fixation de N2
13.3
Relation entre activitê nitrate rêductase et nitrogênase ..•..•.....•
27
1.4. INFLUENCE DES FACTEURS DU MILIEU SUR LA FIXATION DE L'AZOTE MOLECULAIRE
29
14.1
L'acidité du sol· ••• ······••·...••.......•..•......•.....•.••.....•.
29
14.2
La température
••••..... : ........••..•..••.•••..•..••.•••••...•.....
31
14.3
Les contraintes hydriques
31
14.4
La matière organique du sol
32
1.5 OBJET ET PROGRAMME DE TRAVAIL ••••••••••••••••••••••••••• · ••••••••••••••.•••
32
- MATERIELS ET METHODES
.
35
2.1. MATERIELS ••.•••• •·· .•.•.•...•••••• · ••• ·••·········•······••••.•.••••••••••
35
21.1 Choix des isolements de Rhizobium ... · .... ·•···· ......... ··· ..... ·····
35
21.2 Matériel végétal.....................................................
37
2.2. METHODES
37
37
22.1 Purification et préparation d1inaculum •••••••.••....•....•.•.•.•••••
22.2 Culture du soja en serre· .•..•••.••.•.....••...••...•.....•.•.•.•...•
37
ZZ2.1 Culture
illonoxénique
en tu~es de GID30N
222.2 Culture
monoxénique en pot
222.3 Culture hydroponique
222.4 Culture sur sable
40
22.3 Culture au champ ...........................•.•...........•...••••.....

---

2.3. MESURES EFFECTUEES ..................
.
41
23.1 Mesure de la croissance des bactéroïdes
41
23.2 Quantification du matériel biologique
42
23.3 Mesure de l'efficadté relative apparente des nodosités. •••.
42
23.4 Mesure de l'activité réductrice d tacétylênav i n sitû H • • • • • • • • •
44
23.5 Mesure de l'activité hydrogénase des bactéroides • •......•••.
46
23.6 Mesure de , 'activité nitrate réductase ••...
46
Ill-INFLUENCE DU RECYCLAGE DE L'HYDROGENE SUR L'EFFECTIVIIE DE LA SYMBIOSE
"SOJA - R. JAPONICUM ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••
48
3.0. INTRODUCTION.....................................................
48
3.1. RESULTATS............................. .••..•••••.•..•...•.••....•
50
31.1 La croissance en milieu Y.E.M.
50
31.2 L'infectivité des isolements de Rhizobium
52
31.3 Nodulation et t tect tvf te réductrice d'acétylène
54
.
31.4 Efficacité relative et activité hydrogénase
.
58
3.2. DISCUSSION •.•••••••..•...••••.••.••••......•.•••....•••.••.••••••
61
IV - INFLUENCE DE LA TENEUR EN NITRATE DU MlLIEU OE CULTURE SUR LA FIXATlON DE
L IAZOTE MOLECULAIRE........................ •.•••.•••.. •••••••••.• •••••. •....•
63
4.0. INTRODUCTION •••••..••. ••••..•.•.. ••••.•.•••••.•..•.•••.•• •.••••••
63
4.1. RESULTATS ••••••••••••....•.•••••.••.•••.....••••••....••••••..•••
63
41.1 Influence de la dose du N0
sur le développement et la
3-
nodulation du soja en culture hydroponique •....•••••••••••••
63
41.2 Influence de la dose du N0
sur l'activité nitrate
3-
réductase '(ANR) ....•.••.•.••..•••••••...••••••.•.•.•.•••...•
65
41.3 Influence de la dose du N0 - sur l'activité nitrogénase .....
67
3
41.4 Inhibition de 'ltac t tv i té nitrogénase par une dose de N0 -
71
3
4.2. OISCUSSlON ........
. 71
.../ ...
.

---

Pages
EVOLUTION CDMPAREE DES ACTIVITES NITRATE-REDUCTASE ET NITROGENASE DU SOJA .•.. ,
75
5.0. INTRODUCTION............... ....•.•......••.......•.....•..• •.....
75
5.1. RESULTATS ....•................•.•..... ~ .•.....•. ~................
77
51.1
Activité nitrate-réductase.............................
77
S1.2
La nodulation
81
51.3
Activité nitrogénase
~
~.................
85
513.1 Evolution de l'activité réductrice d'acétylène au
cours du cycle de développement du soja . . . . . • . . . . . . . .
513.2 Evolution de l'efficacité relative apparente de la
nitrogénase au cours du cycle de dév~loppement du soja.
51.4
Croissance et rendements du soja en fonction des différents
traitements agronomiques ....................................
89
5.2. DISCUSSION .•.••..•••.•....•......•••..•.•••.....••...•.••....•....
93
1 - CONCLUSION .•....••.••..••••...•.•••..••••••.•••••...••••..••••.•.•• ,............
96
BIBLIOGRAPHIE ........................................
.
99
ANNEXE •••••••••••••••••••••• , • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •
127

---

-1-
INTROWCTION
GËNËRALE
Le développement de l'industrie des engra~s azotés a été l'un des
principaux facteurs de l'augmentation de la production agricole dans les
pays ayant une agriculture moderne. L'azote représente actuellement le
plus coûteux des engrais et son utilisation est délicate. Le problème de
la fertilisation azotée est particulièrement important dans les pays tro-
picaux où les engrais sont chers, les coûts de transport élevés et où les
données sur l'utilisation des engrais et leur devenir sont peu nombreuses.
La fertilisation minérale est l'un des moyens privilégiés d'inter-
ven1r physiquement dans une culture. Or, à la différence de la fertilisa-
tion phosphopotassique qui, en général, permet de compenser de façon pro-
longée les carences du sol, l'apport de nitrate, anion lessivable, peut
s'avérer inutile s'il n'est- pas rapidement assimilé par la plante et surtout
la nitrification transforme l'ammonium en nitrate. La fertilisation nitri-
que doit donc être effectuée en fonction des besoins de la culture.
La croissance de la population mondiale et l'augmentation des
prix des engrais chimiques surtout des engrais azotés suscitent un regain
d'intérêt pour la recherche de méthodes det'Ee r t i.Li s a t i on économique" com-
me les techniques de restitutions organiques et l'utilisation de la fixa-
tion biologique de l'azote atmosphérique.
Notre étude s'inscrit dans le cadre de l'amélioration de la
fixation symbiotique de l'azote moléculaire. L'intérêt d'une légumineuse
comme le soja ne réside pas seulement dans sa grande valeur nutritionnelle
(richesse en protéine) mais aussi dans son aptitude à fixer l'azote molé-
culaire lorsqu'elle est en association avec une bactérie du genre Rhizo-
bium. Cette fixation symbiotique de l'azote moléculaire n'exclut pas l'as-
similation de l'azote nitrique du sol qui est le mode de nutrition le plus
répandu chez les végétaux supérieurs. C'est pourquoi nous étudierons si-
multanément l'assimilation du nitrate et la fixation symbiotique de l'azote
chez le soja.
L'assimilation du nitrate est appréciée par la mesure de l'acti-
vité nitrate réductase in vitro et la fixation par la mesure de l'activité
nitrogénase in situ
ou in vivo sur racines excisées.

---

-2 -
1 - DONNtES
BIBLIOGRAPHIQUES
1.0 INTRODUCTION
Le sol est un écosystème complexe au sein duquel la microflore
occupe une place prépondérante. Il se comporte, en effet, comme un milieu
où se produisent des transformations biologiques dont les conséquences ne
sont pas toujours bien perçues en agriculture. L'intervention des microor-
ganismes dans les cycles biologiques des .éléments majeurs et oligoéléments
est capitale notamment pour le carbone, l'azote et le soufre dont l'inac-
tivité entraîne un blocage de ces trois cycles (BONNEAU et SOOCHIER. 1979).
La connaissance des interactions qui se manifestent d'une part entre les
microorganismes et le sol, d'autre part entre les microorganismes et la
végétation dans le sol agricole peut permettre de résoudre un certain nom-
bre de problèmes agronomiques. En effet, de nombreux facteurs limitants
(source d'énergie, humidité, température, pH etc ••• ) contrôlent cette
activité (DOHMERGUES, 1977).
La rhizosphère et la litiè~e appa~aissent non seulement comme
zones préférentielles d'apport d'énergie, mais aussi comme mi~ieux sélec-
tifs des populations microbiennes. Les relations microorganismes - plantes
sont encore plus spécifiques dans le cas particulier de la microflore
symbiotique (Mycorhizes et Rhizobium).
Depuis Bo~s;i~;~lt (1838) qui mit pour la première fois en
évidence la fixation de l'azote atmosphérique par les légumineuses. nos
connaissances se sont considerablement enrichies grâce à l'utilisation
des méthodes modernes c~e le ISN et la réduction de l'acétylène.
2
Les plantes capables de fixer l'azote moléculaire appartiennent
essentiellement à la famille des Légumineuses. En fait, dans ce cas, la
capacité fixatrice est due à une association entre la plante et une bacté-
rie tellurique du genre Rhizobium qui a pour conséquence la formation
des nodosités racinaires. L'efficacité de cette symbiose dépend des deux
partenaires et des facteurs du milieu.

---

- 3 -
1.1.
LA SYMBIOSE LEGUMINEUSE . RHIZOBIUM
11.1 les deux partenaires
111.1. La Légumineuse
Les légumineuses constituent l'une des plus importantes familles
des plantes a fleurs, après les Composées et les Orchidées. Cette famille
se divise en trois sous familles : Mimosaceae, Caesalpinaceae, Pa?iliona-
ceae et comprend 750 genres et )6 000 à ,19000 espèces. La sous-famille
des Papilionaceae est de loin la mieux représentée puisqu'elle forme 505
genres et 14000 espèces (ALLEN ct AlLEN, 1961). Parmis ces milliers d'es-
pèces, moins de vingt sont cultivées de façon importante pour l'alimenta-
tion humaine et elles appartiennent essentiellement à la sous famille des_
Papilionaceae.
La nodulation des légumineuses est un phénomène très fréquent.
Cependant certaines espèces ne peuvent être infectées par des Rhizobium
et ne fixent clone pas l'azote coléculaire. Les observations ont montré que
93 % des Papilionaceae portent des nodosités contre 87 % des Mimosaceae
et seulement 23 % des Caesalpina~eae. (ALLEN et ALLEN, 1961).
Sur le plan nutritionnel, les graines des Légumineuses sont
très riches en protéines
qui représentent 20 à 40 % de leur poids sec.
On trouve généralement dans ces graines la plupart des acides aminés né-
cessaires à l'alimentation humaine; seuls, les acides aminés soufrés sont
peu abondants. Grâce aux glucides et éventuellement aux lipides qu'elles
contiennent, les graines de Légumineuses représentent également une e~cel­
lente source de calories (300 à 400 cal/l00 g en moyenne) (HUIGNARD, notes
personnelles) •
Sur le plan cultural, des légumineuses cultivées peuvent cons-
tituer de bons précédents pour les céréales. En effet, elles améliorent la
structure du sol par leur système radiculaire et la teneur en azote de
celui-ci par les reliquats importants d'azote qu'elles laissent après la
récolte. (MARTY et HILAIRE, 1979).

---

-4 -
111.2. Le Rhizobium
Le genre Rhizobium appartient à la famille des Rhizobiaceae, de
l'ordre des Eubacteriales.
L'importance de cette bactérie réside dans le
fait qu'elle est capable de fixer de l'azote atmosphérique en symbiose
avec certaines Légumineuses. A l'état libre dans la solution du 901 ou adsor-
bé sur le complexe argile-humique, le Rhizobium est incapable de fixer
l'azote lui-même.
Morphologiquement, les Rhizobium se présentent SOus la forme
de bâtonnets gram négatif, de 0,5 à o,a' x 1:-
à 1&~, généralement mobiles.
En cultures artificielles, ils prolifèrent facilement lorsque
le~ milieux nutritifs contienent du mannitol comme source de carbone et
de l'extrait de levure (VINCENT, 1970).
Sur une gélose nutritive, ils donnent des colonies blanchâtres
ou crèmes et d'après leur vitesse de croissance on peut les séparer en
deux types qui se distinguent également par des différences physiologiques
et biochimiques :
un groupe est constitué par des bactéries dont la croissance
est rapide. On obtient après quelques jours d'incubation des colonies de
plusieurs millimètres de diamètre. Ces Rhizobium produisent le plus souvent
d'importantes quantités de substances gommeuses et ils s'accommodent de
nombreux sucres. Ils acidifient leur milieu de culture •
• un autre groupe est constitué par les bact€ries
dont la crois-
sance est lente. Les colonies formées ont un diamètre inférieur à J mm. Ces
Rhizobium sont plus exigeants vis à vis des hexoses et des pentoses. Ils
alcalinisent le milieu de culture.
Parmi les propriétês des Rhizobium, nous retenons :
- L'infectivité : qui est la capacité de la bactêrie ~ pénétrer
dans la racine, d'induire la formation d'un cordon d'infection puis d'une
nodosité.
- L'efficience caractérise l'aptitude à fixer l'azote moléculaire.
La spécificité d'hôte ne permet qu'à certaines souches d'entrer
en symbiose avec une légumineuse donnée.

---

Tableau Il
Groupe de spécificité d'hôtes des bactéries du genre Rlrizob ium (d'après Rhizobium News Letter 1971)
Groupe de Rhùobium
Espèce
de légumineuse infectable par les souches du groupe de Rhi.eobium
croissance rapide
R. meliloti
Medicago sp. ; Trigonella foenum-çraeoum
u. tl'i/olii
TI'ifolium sp.
R. LequmirU..Jsal'wn
Piswn sp. • Vl.c1:a sp . j Iathsprue sp • i Lena eeoulenta
(Cial3l' avie tinwn)
R. phaceol.i:
Phaaeolua vulgaria i Phaseolus ooooineua
1
-----------------------~---------------------------------------_._--------------------------------------------------------~
croissance lente
R. lupini
Iupinue sp. ; Orni.thopue eat ivùe i serroâetla sp.
R. [apowioum
Glyaine nua:, Glyoine usur-ieneie
R. "ooiapea"
Vigna sp , i (phaseolus lunatue j; Phaeeolue aconitifolius ; Deem odium sp , ;
Crotalaria sp. • Lespedi3za sp. ; Indigofera sp. i Alizicarpus sp. ; Araohia
hypogeae ; caicnus cajan ; Glycine javanica ; Stylosanthea sp. ; Acaoia sp.
[çenta-oeema pubesae1W).
Les espèces indiquées entre parenthèses ont une spécificité d'hôte plus restreinte que les autres espèces
pour les souches de Rhizobiwn classées dans le même groupe. Certaines souches des groupes Cowpea et Japonicurn,ont une
croissance rapide sur milieu VEM.

---

- 6 -
c'est sut cette dernière propriété qu'a été établie la classifica-
tion des espèces de Rhizobium. Pour chacune de ces espèces, la spécificité
d'hâte est plus ou moins large (voir tableau Il)'
11.2. La nodositê
112. J Formation
La formation d'une nodosité sur une racine de Légumineuse suppose
la présence dans la rhizosphère de Rhizobium capables d'infecter la légumi-
neuse en question.
La symbiose s'établit en plusieurs étapes. Dans un premier temps,
les excrétions racinaires, à proximité d'un Rhizobium, activent la multi-
plication du microorganisme. Celui-ci se fixe à la surface de la racine par
l'intermédiaire de récepteurs chimiques complémentaires localisés sur
chacune des cellules en présence. La spécificité d'hôte qui conduit à la
dêfinition des groupes
d'inoculation croisés. serait la résultante d'in-
teractions entre des glycoprotéines végétales, des lectines et des polysac-
charides acides de surface, localisés sur chaque symbionte. C'est cette
substance qui provoquerait l'adsorption de la bactérie sur les poils absor-
bants. Un schéma du mécanisme d'adsorption est présenté par DAZZO et ,HUBBELL
(1975)
(figure .i ) .
l
C'est durant cette phase que le poil absorbant s'incurve pour
prendre sa forme caractéristique.
A ce stade la paroi de la cellule végétale peut s'invaginer au-
quel cas il y a pénétration d'Une bactérie dans le co~don d'infection ainsi
formé. Celle-ci va se multiplier parallèlement à la progression du cordon
d'infection. qui se ramifie dans la racine.
Dès l'entrée du Rhizobium dans la racine le processus de formation
de la nodosité démarre. Cette formation semble liée à la multiplication d'un
petit nombre de cellules tétraploides présentes dans le tissu radiculaire
(TRUCHET, 197'.S)
Une fois constituée, la nodosité représente une troisième entité
ayant des propriétés différentes de la plante-hôte et de la bactérie. Les
Rhizobium sont libérés dans le cytoplasme par une invagination du plasma-

---

-
7 -
pluIe,
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' .. ,
holl
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RhilObiuftl
'n,
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'.cl".'r.
fiEe
li Reprëeentatrion schématique du mécarvieme de reconnaissance de Z. 'Mte
paP le Rhizobium, sel-on Z'hypothèse de DAzza et iJV§§;./LL l1J?75J l.p. leot-ine as-
sure La Zi2ison formant Ze compZeze antigène-Zectine-antig~ne qui permet
Z1adhëeion spAcifique des baotér-iee d l-a paroi: des poiZs raoiruriree ,
(in BLONDEAV
1980).
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Figure l 2: s~Mm:1 d 'W'1e section 7.ongi-tudinaZe du. nodule ('type pois)
(en == conte::te noduZaire ; l
= zone mtri8t~matique, II:= zone d'acc1'oissement
et d'invasion; III == zone baatés-ienne fixatrice; Il' ==
zone de déçënëreeoen-«
ce.)
in BLONDEAU~ (1980)

---

- 8 -
lemme du cordon d'infection qui constituera la membrane enveloppe des bac-
téries. Ces dernières se transforment ensuite en bactéroides tandis que
des canaux vasculaires se différencient dans le cortex des nodosités
(PATE et al.,
1969) et que se met en place une spécialisation physiologi-
que des cellules végétales (SCHUBERT et BqLANDT 1984).
Finalement, la nodosité acquière une structure hautement organi-
sée dans laquelle l'activité fixatrice d'azote moléculaire par les bactéroi-
des est favorisée grâce à l'environnement privilégié qu'elle constitue
(figure 1 2),
112.2 Fonctionnement
La nodosité constitue un milieu favorable à la fixation de l'azote
moléculaire. En effet
- elle permet l'approvisionnement en énergie qu~ est assuré par
une structure interne bien adaptée
- elle protège les Rhizobium contre la compétition d'autres organis-
mes et la nitrogénase contre l'oxygène grâce à la léghémoglobine qu'elle
contient.
- en fin, elle permet d'assurer grâce à un système efficace, le
transport des produits de la fixation vers la plante-hâte. Le schêma simpli-
fié (figure 1
résume le fonctionnement de la nodosité.
3)
L'énergie nécessaire à la formation et au fonctionnement de la
nodosité est fournie par la photosynthèse. La proportion des produits de
la photosynthèse transférés dans les nodosités varie de façon importante
en fonction des espèces (MINCHIN et PATE, 1973 ; ATKINS et al'
1978) et
I
selon le stade végétatif (ATKINS et al'
1978). Ces produits arrivént
aUJ[
I
nodosités par le phloème essentiellement sous forme de saccharose (PATE et al.:
1979 ); (SINGH et al'
1980) ; STREETER (1980). D'autres hydrates de car-
I
bone tels que le glucose. le fructose, le tréhalose, l'inositol et le pinito1
sont également présents dans les nodosités de soja, mais en quantités très
faibles (STREETER, 1980).
Cette abondance de saccharose serait liée à la présence d'une
invertase dans le cytosol (partie végétale) des nodosités

---

Fig~I.3.
schema
simplifié du mécanisme de la fixation de "azote
moléculaire dans la
nodosité
CT (c ycle des acides t ric ar bc xylique s ); Nse (nitrogenase)
Hse( hydrogenase); Lb (Iéghémoglobine)
ATMOSPHERE
COz
Oz
NZ
CE LLULE
Phbtosynthétats
CHLOROPHYLIENNE
CELLULE
DE
LA
NODOSITE
N
....9 - - - - - -1,- - --1
ESPACE PERI_
.c .c
BACTEROIDE'
\\1
BACTEROIDE
ESPAC E PERI-
BACTEROIDE
CELLULE DE LA
NODOSITE
PLANTE- HOTE
ATMOSPHERE
COz
HZ

---

-
JÙ
-
SINGH et al.,
1980). Le métabolisme des hydrates de carbone
.
....
est réalisé par_Ja voie _classique de._la .~lyçol'y.se_dans _Le.C:YJ;osol__
.puisque 1_' invertase _.e:t_. ~_~f,!"y.ctase_
_~ 1, ê-ddphcsphar e aldolase
sont
absentes des bactéroides (RAWSTHORNE et al., 1980). Par contre, les enzy-
mes du cycle· des acides tricarboxyliques ont été mises en évidence dans
des cultures de Rhizobium et dans les bactéroides (STOVALL et COLE, 1978).
Dans ces conditions, la nature exacte des substrats énergétiques qui arri-
vent aux bactéroides reste à déterminer. Il n'est pas exclu que des acides
organiques participent à cette fourniture d'énergie. (BERGERSEN et TL1iNER,
1967; WILCOKSON et WERNER, 1979).
Une autre source de carbone non négligeable pour la nodosité
est constituée par la fixation de COZ par les racines et par les nodosi-
tés. Chez le soja, les quantités de COz fixées peuvent varier de 0,2 !
_-1
-1
.
-
-
-- ---- -F---·
- ,
l,t mg.h
g
de tissu (COKER et SCHUBERT, .~~8q C02J_LX~_~_S_~_ util~_~~ dans
les nodosités grâce aux fortes activités PEP carboxylase du cytosol
(LAY2ELL et a~., 1979). Les nodosités contiennent également de fortes quan-
tités d'acide poly-
-hydroxybutyrique utilisables par les bactéroides.
(WaNG et EVANS. 1971).
Les bac té roides semblent présenter des exigences contradictoires
vi à vis de l'oxygène: des besoins importants sont requis pour la pro-
duction d'ATP par la phosphorylation oxydative tandis que la nitrogénase
présente une très grande sensibilité à ce gaz. Les trois processus sui-
vants semblent participer à la résolution de cette contradiction :
- des ba~rières de diffusion des gaz dans le cortex des nodo-
sités abaisaent la pression partielle de l'oxygène dans ces organes
(TJEPKEMA et YOCUM, 1974 ; SINCLAIR et GOUDRlAAN, 1981)
- la respiration intense des bactéroides épuise rapidement l'oxygène
libre.
- dans ces conditions d'hypoxie à l'intérieur des nodosités,
la Lêgbêmcg l.ob i.ne facilite:.,-
la diffusion de l'oxygène vers les accepteurs
terminaux d'électrons de la phosphorilation oxydative qui sont localisés
dans la membrane des bactéroides (BERGERSEN, 1981).
Le terme de léghémoglobine désigne des nodulines de faible poids
moléculaire (LEGOKI et VERMA, 1980) ; il en existe différents types chez
une même plante-hôte (APPLEBY et az',
1976 et 198Z). Ce sont des hëœoprc-'
téines dont la partie protéique est d'origine végétale et le groupement

---

-
11 -
prosthétique d'origine bactérienne. Leur coloration rouge ou rose indique
le bon fonctionnement de la nodosité.
Après l'assimilation de NH + en glutamine, étape du métabolisme
4
azoté commune à toutes les plantes supérieures, le transport et la mise
en réserve de l'azote sont assurés par une série de composés organiques
différents selon les plantes.
Les composés les plus abondants et les plus fréquemment rencon-
trés dans la sève de la plupart des plantes sont l'asparagine, la glutami-
ne, Lvespar t ar e et le glutamate (BOLLARD, 1957;
ZENGBE, 1984).
Chez les légumineuses en particulier, le transport de l'azote
est surtout assuré par les acides aminés et les amides dont l'asparagine
et la glutamine et dans certains cas par les uréides. La voie d'assimilation
de l'ammonium et la nature des composés impliqués dans le transport de
l'azote chez ces plantes ont permis de distinguer deux groupes de légumineu-
ses :
- les légumineuses à amides (essentiellement d'origine t~pérêe)
transportent l'azote sous forme d'amides et d'acides aminés. Chez ces
légumineuses, la forme principale de transport et de stockage est l'aspara-
gine (PATE et al.~ 1969 et 1979 ; ROBERTSON et si.;
1975: B.BnmLDs fit al.~
1982 J.
- les légumineuses à uréides
utilisent les uréides glyoxyliques
(allantoine et acide allantolque) comme principale forme de transport de
l'azote. Les deux catégories de composés, les uréides d'une part, les
amides et les acides aminés d'autre part, coexistent dans la sève des légu-
mineuses mais dans des proportions qui varient avec l'espèce (ZENGBE, 1984).
Chez le Soja (MATSUHOTO et al.~ 1976 ; Mc CLURE et ISRAEL, 1979
STREETER, 1979 ; PATE et al.~ 1980) ; le Vigna (HERRIDGE et al.~ 1978
PATE et al.~ 1980) et le Haricot (PATE, 1973;
COOKSON et aZ.~ 1980). les
uréides représentent près de 80 % de l'azote en solution dans la sève.
lorsque leur production est maximale.

---

-12 -
1.2
MECANISME BIOCHIMIQUE DE LA FIXATION DE L'AZOTE MOLECULAIRE
12.1 La nitrogênase
121./ Constitution
La nitrogénase. enzyme responsable de la réduction de l'azote
moléculaire, est en réalité un complexe enzymétique formé de deux protéines
séparables par chromatographie sur DEAE cellulose :
- la première protéine, communément appelée composant l, contient
du fer et du molybdène. C'est une grosse molécule tétramérique de masse
molaire variant de 200 000 à 300 000 daltons selon les organismes d'origi-
ne. Il porte un cofacteur peptidométallique, à Molybdène (LOWE et aZ.,
1950) qui serait le site actif de la réduction de NZ'
- la deuxième protéine ou composant II ne contient que du fer.
C'est un dimère de masse molaire variant de 50 000 à 70 000 daltons. Il
porte un site actif
d'hydrolyse de l'ATP-Mg.
Ces composants peuvent être dénommés respectivement dinitro-
génase et dinitrogénase réductase (HAGEMAN et BURRIS, 1978).
La nitrogénase a été isolée chez plusieurs organismes fixateurs
de l'azote moléculaire et la tendance actuelle est de désigner tes deux
composants par les initiales des organismes dont est issue la nitrogénase
(EADY et «i., 1972 ; POSTGATE, 1974; YATES. 1980). On a ainsi cp]
• CP2
AV l' AV 2 ; AC • AC
; Kp 1 KP2 ; Rj l' Rj 2 pour désigner respectivement
I
2
les composants l et II des nitrogénases de CL08tridium pasteurianum,
Azotoba~ter vineLandii, Azotoba~ter ~hroo~oaum, XZebsieLLa pneumoniae et
Rhizobium [aponi oum,
Les deux composants de la nitrogénase sont inactivés par l'oxygl-
ne. Une protection de l'enzyme contre l'oxygène est donc nécessaire dans
les manipulations in vitro.
Chez les microorganismes aérobies, la protection contre l'oxygène
est assurée par un système très complexe. (EADY et POSTGATE. 1974).

---

-13 -
PHOTOSYNTHETAT
4ADPM9(... :J)
'NI
fd. OJll:.
2(Prot.Fe 2ATPM91
Prot.Mo F.
,pd.
OZ.
fd. nkI.
2(Prot.Fe 2ADPMg)
Proto Mo,.
OK.
"d.
4ATPMglx.3)
4 Pi(a3)
MITA801l5MI
Fiqu:re I(>!~caYl.iame de ta réduotrùon ch Z'azote moléculaire par z.a ni troçénase
des noèosit~s de l~gumineuse6.
Si= t:r>c:r.sferts successifs â ï ël-eotrone sont néoeeeairee pOU!' obtenir
la r~d~ction de N2 en NH3(à'après A~ZINS et PA171BIRD.19R~J

---

-14 -
DanS les nodosités des légumineuses) cette protection est assu-
rée par la léghémoglobine sous sa forme ferreuse CPUPPD, 1981) et par
l'intense respiration des bactéroides (BERGERSEN et TURNER, 1975).
121.2
Fonctionnement de la nîtrogénase
1212.1 R~duction de l'azote moZ4cuZaire
Le fonctionnement du complexe nitrogénase est schématisé par
la figure 1
(ATKINS et RAINBIRD, 1982), La réaction générale de la for-
4,
mation de NB) peut s'écrire de la manière suivante:
+
8 e
Mg
N ·
8 H+
2 +
ATP
Au cours de cette réaction, il ya transfert de 8 électrons et
8 protons et hydrolyse de 4 ATP par paire d'électrons alloués à la forma-
tion de NH + . L'ATP intervient sous forme d'un complexe ATP-Mg. Les élec-
4
trons sont d'abord transférés au composant II (Prat. Fe), puis au composant l
(Prat. Mo Fe) et enfin au substrat. Un abaissement du potentiel d'oxydo-
réduction et une modification de la conformation de la nitrogénase inter-
viennent pour permettre ce transfert. Les deux composants de la nitro-
génase passent successivement de l'état réduit à l'état oxydé et il faut
trois transferts de deux électrons (6e-) pour assurer la réduction de NZ•
L'énergie et le pouvoir réducteur sont fournis par le catabo-
lisme respiratoire des photosynthétats produits par la plante-hôte sous
forme d'hydrates de carbone. Chez le Rhizobium, le système réducteur est
essentiellement constitué de NADPHZ",et lë- transfert des 'éleetrons entre
le NADPH
et le composant II de la nitrogénase est assuré .par la ferre-
Z
doxine (Fd) ou la flavodoxine (Fld.) (WONG et ar.,
1971 ; CARTER et ar.,
1980).
1212.2 Production d'hydrogJne
Comme l'indique la figure 1 , il ya en plus de la réduction de
4
N
une production d'hydrogène moléculaire par la nitrogénase. Cette
2,
production d'hydrogène a été mise en évidence pour la première fois par

---

..
., 1
"1'
-o-' -'---,'
,,--,,-~. -, . ','-,-_.-..- "-"'---'--_' ..
Tableau J2: : Principaux substrats réductibles par la lIitl·ùgêna:;.e (d'après NUIIOl'~ et al lYii~ el ~!\\L~J\\L - notes
d'enseignement)
Substrat
Réaction
Produits
+
-
Azote molêculai re
NE N + 6 H + 6 - ) 2 NH
Arnrooniac
J
Aci de cyanhydrique
H - CS N + 6 H+ + 6 e - - l CH
"'!éthane. AlTU110niac
4+NH 3
Il - CSN + 411+ + 4 e--,CII
Nethylamine
3-NII 2
Azoture d1hydrogène
H - N - N:::N + 2H+ + 2 e----N
Azote moléculaire. Arrmoniac
2+NH 3
Protoxide d'azote
.. -
+
-
N :: N-Q + 2H
+ 2e - ) N
Azote moléculaire; Eau
2+H20
1
Isocyanure de mêthy1e
11
=ë + 6H+ + 6e--,CH
Methylamine, Méthane
-
3C-N
3-NII 2+CH4
~
Acrylonitrile
+
-
Hl = CH-C • N + 8H
+ 8e - , CH
Propane, Ammoniac
3-CII=CII2+NH 3
Acetyl êne
+
-
H~ • CH + 211
+ 2e
- , C
Ethyl ène
2H4
Hydrazi ne
HN= NH + 2H+ + 2e- ---a tl,H
Diimide
4
Protons
2H+ + 2e- --+ HZ
Hydrogène moléculaire
1 .:

---

-16-
ROCH et al-, ,
(1957 in ZENGBE, 1984) sur des nodosités de Soja. Elle est
dite ATP-dépendante parce qu'elle n'a pas lieu en l'absence d'Arp dans
les expériences in
vitro (BURNS et ButEN. 1965).
Depuis sa découverte, la production d'hydrogène a été très étu-
diée par les biochimistes, parce qu'elle semble être associée au fonction-
,
.
nement même de l'enzyme. En effet, il n'a pas été trouvé jusqu'à présent
des conditions expérimentales dans lesquelles moins d'une molécule d'hydro-
gène est synt.hétisée par molécule d'azote réduit (HADFIELD et ButEN.
1969 ;
HAGEMAN et BURRIS, 1978).
Cette compétition entre la réduction de NZ et celle des protons
dépend du flux d'électrons et des concentrations de ces substrats. En
effet. à faible flux d'électrons. la réduction de N serait déprimée
Z
(ATKINS et RAINBIRD, 1982).
1212.:3 Autres substrats e.t facte.urs M ~guZation du fonction-
•
nement de la ni trogb1ass •
Outre NZ et HZ' la nitrogénase peut catalyser la réduction d'un
certain nombre de molécules à triple liaison telles que l'azide (N3-),
l'acide cyanhydrique (HCN). l'isocyanure de méLhyle(CH
l'ac€ty~ène_
3NC),
(CZH
(voir tableau l
Z)
Z)'
L'acétylène a fait l'objet d'une étude plus approfondie (DILWORTH,
1966). Sa réduction en étbylè~·- mesurée par chromatographie en phase gazeu-
se (HARDY et aZ.,
1968) constitue actuellement la méthode la plus courante
pour déterminer l'activité nitrog€nase.
Tous les facteurs nécessaires au fonctionnement de la nitrogénase
(composés réducteurs, transporteurs d'électrons. ion magnésium (Mg++).ATP •••• )
peuvent par leur concentration contrôler le taux de réduction de l'azote mo-
léculaire. C'est ce qu'on appelle le contrôle physiologique de la fixation,
mais il existe également un contrôle ~nétique de la fixation exercé par
l'ion ammonium (NH
qui intervient en mettant en oeuvre une régulation
4+)
génétique
au niveau de la synthèse de la nitrogénase. On pense actuelle-
ment que c'est la glutamine synthétase (GS)( enzyme qui catalyse l'incorpo-
+
ration de l'ion NH ) qui joue le rôle de régulateur.
4

---

.
--17 -
Fig I
â'oprëe SALSAC (cours EN8AM) et iVEWTON et al., , 19?7.
S'
N
H
2
2
,
_13kcal l
,
N2 H4
--_.1
,
'1
,
,
1
1
1
1
1
1
,
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
+51kcal
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
N2
T,3 H2
1
T H 2
-----~J~~:~:~_l__ 2NH3
rt

---

-18 -
12.2
Bilan énergét;que et activité hydrogénase
122.1 Energie nécessaire pour la réduction de NZ
La nitrogénase catalyse la réduction de N
en deux molécules de
2
NH
Cette réaction pourrait s'effectuer en trois étapes. (STIEFEL, 1977) •
3,
•
•
ZR
•
+ 2e
2R
• 2,,>
2H
-+-
2e
Enz. + N
)
200
Z
•
4
2
3
Cette séquence de trois réactions successives permet d'évaluer le
coût énergétique théorique de la réduction biologique de N
En effet, seu-
Z'
le la première réaction. formation de la diimide n~cessite de l'énergie
(51 Keal). Les deux autres étapes, la réduction de la diimide puis celle
de l'hydrazine. sont spontanées.~t exergoniques.
Les électrons fournis par les réducteurs biologiques classiques
devront subir une remontée très importante de leur potentiel d'oxydo-
réduction. Le diagramme de la figure 1
représente les enthalpies libres
5
sFandard des réactions chimiques. Ces données indiquent les étapes obliga-
toirement endergoniques et la valeur minimale de cette dépense d'énergie
mais elles ne donnent pas le coût réel de la réduction catalysée par la
nitrogénase.
Sur le plan biochimique, cette réduction s'accompagne d'une con-
sommation d'ATP. Le nombre d'ATP nécessaire varie avec les conditions d'en-
vironnement (pH, température, proportions des composants l et II de la ni-
trogénase ••. ).
(MINCRIN et ar.~ 1981 ; SCHUBERT et WOLK, 1982, WAREMBOURG
et ar.~ 1982). Dans les conditions optimales, on admet que deux moles d'ATP
sont hydrolysées par électron transféré à l'enzyme pour réduire une mole de
La fixation de l'azote moléculaire est , --.
très coûteuse en é-
nergie, on comprend donc pourquoi les systèmes biologiques tr~s efficaces
sont ceux qui aSSurent un couplage de cette réduction avec la photosynthè-
se (SCHANMUGAN et al..,
1978).

---

,
li'
- r,"'---" "~"" .. _- -"1~' - ....--...-r'"f"'·1,.·iTr- T'TT'''T1,,-
~-
r-'T'----,.-- ,-.,-
'II'
''']
1
Tableau l
: Présence et rôle physloiùgh-lUé des hydruqcuus es chez dtvet s IIlknJur!janlslUes {J'dpI es IIU/IH$
-
3
et rt:lRTENSEN ]98])
Procaryotes
Bactéries anaérobies
(a)
. ,-
Clostridiw71 paet eurianum
211
+ 2 __ HZ
les protons jouent le rôle d'accepteurs J'électrons
Rumi.nocoocue al bue
par exemple du NADII • leur réduction tevortse la synthèse
Klebaiella pnoumoMiaea
d' II.TP.
Paraeoacue denitrificalUJ
(b) H2~2H+ + 2e
l'oxydation de Hl est couplée à une
le nitrate:2NO; + 12H+--)N
+ GH
Z
20
IJe8ulfovibrio gigas
pncsphcryf arton cxyo active dont l'ac- le sulfate:S0
:0
15H+-.,.H S + 4H 0
4
2
2
MethanobaoteriWII
cepteur terminal d'êlectrons est:
le dioxide de carbone:
CO
+ BH+ ...,. CH
+ 2H
2
4
20
Bactéries facultatives
Escherichia coli •••
les deux réactions a et b peuvent avoir lieu
selon les conditions de l'environnement
Bactéries photosynthétiques
Chromatiaceae
les deux réactions a et b peuvent avoir lieu
Rhodoospirillaceae
la rêaction b a lieu a l'obscuritê
~
Bacteries aérobies
autotrophe facultatif pour H
seule la réaction b a lieu
2
et CO2
gram- Alcaligènes. PsEludOmonae
Paracoceue , tanthobao,
gram+ Nocrœdia. Myaobacterius
Baaillus
fixateur d'azote: Rhiaobium
la réaction (a) est catalysêe par la nitrogênase.
A,aotobactEll'. SpizoiUum
l'hydrogênase ne catalyse que la rêaction (b)
üyanobectërf es
AnabaelUl. Nostoa, Anaoystis
lIa réaction (il) est catalysée par la nt troqênese •
nadulane
Parfois les deux types d'hydrogénase sont présents.
les réactions (a) ou (b) peuvent avoir lieu.
Eucaryotes
Algues rouges, brunes et
les deux rêactions a et b ont lieu uniquement via une hydrogénase
vertes
puisque ces organismes n'ont pas de nitrogénase.
Trichonomades

---

IZZ.Z Coût de la réduction des protons
La réduction de l'azote moléculaire déjà très coûteuse en éner-
gie et en pouvoir réducteur s'accompagne obligatoirement d'une réduction
de protons qui peut représenter 30 à 60 % du flux d'électrons transférés
par la nitrogénase (SCHUBERT et EVANS, 1976 ; RUIZ-ARGUESO et al., 1978 ;
EVANS et al.,
1980) : le dégagement de H hors des nodosités constitue une
2
perte d'énergie.
Pour un niveau donné d'approvisionnement en photosynthétats, il
en résulterait une fixation d'azote plus élevée chez les associations sym-
biotiques dégageant moins d'hydrogène. Par conséquent, minimiser le déga-
gement d'hydrogène serait un moyen d'améliorer le rendement
énergétique de
la fixation.
L'efficacité relative (ER), (SCHUBERT et EVANS, 1976) est le con-
cept défini par :
vitesse de dégagement de H
ER '" 1 -
vitesse de réduction de c à
2 2
Ce terme mesure la proportion d'électrons effectivement alloués
à la réduction de N
La réduction de C
à une pression partielle de
Z•
2H 2
10 % de C
mesure l'activité totale de la nitrogénase puisqu'à cette
2H 2
pression d'acétylène, tous les électrons fournis à la nitrogénase sont
utilisés pour la réduction de l'acétylène (DILWORTH, 1966 ; SCHOLLHORN et
BURRIS, 1966).
Certains microorganismes fixateurs et surtout les souches de
Rhizobium dites Hup+ (hyarogen uptake positive) sont capables de recycler
une partie de l'hydrogène gazeux provenant de la réduction des protons
grâce à leur hydrogénase membranaire.
122.3 Hydrogénase et recyclage de l'hydrogène
,
Les hydrogénas es sont des enzymes qui peuvent se rencontrer aussi
bien chez les microorganismes fixateurs d'azote que chez les non fixateurs
(tableau
1.). Leur structure et leurs propriétés biochimiques sont très
.
3
van.ables
• elles sont soit solubles, soit membranaires

---

• unidirectionnelles ou bidirectionnelles (SCHEGEL, 1976)
Elles contiennent du fer et du soufre.
Chez Rh~zob~um, l'hydrogénase est membranaire et unidirection-
nelle (DIXON, 1972). A l'état purifié, elle peut catalyser la réaction de
synthèse d'hydrogène mais uniquement dans des conditions extrêmes d'envi-
ronnement (ARP et BURRIS, 1981). In vivo, seule la réaction d'oxydation de
l'hydrogène semble possible; dans les nodosités, elle exige la présence
d'oxygène comme accepteur d'électrons (DIXON, 1968).
Des phosphorylations oxydatives ont lieu lors du transfert des
électrons de l'hydrogène à l'oxygène (DIXON, 1972 ; EMERICH et al'
1979
I
RUIZ-ARGUESO et al.
1979). Ces réactions sont couplées à une production
1
d'ATP (DIXON, ]968 ; RUIZ-ARGUESO et al.
1979) et s'accompagnent d' une
1
diminution de la consommation de substrats carbonés (DIXON, 1972 ; EMERlCH
et al-, , 1980).
La synthèse de l'hydrogénase semble liée au gène Bup (hydrogen
uptake). Ce gène apparait être lié au gène Nif (n~t~ogen fixation)
chez
R.
leçuminoearum
(BREWIN et al.
1980) et serait porté par un plasmide;
1
il a pu être transfêré avec le plasmide d'une souche de R. leguminosaPUm
à une souche de R. phaseoli.
(DEJONG et al., 1982). Chez R. japoni~#
le gène Eup pourrait être localisé sur un méga plasmide (Mc. CANTRELL et al' I
1982). Chez R. japoniaum divers types de mutants pour ce g~ne ont été pro-
duits (MAIER et al.
1978 ; MAIER et MERBERG, 1982 ; HAlER et MUSTAFTSCHEV,
1
1982) et en particulier des mutants isogéniques Hup+/Hup- (LEPO et al.#
1981). DIXON (1972) suggère trois rôles bénéfiques de l'activité hydrogê-
nase sur la fixation symbiotique de l'azote:
- en utilisant l'oxygène lors de l'oxydation de l'hydrogène,
l'hydrogénase participerait à la protection de la nitrogénase contre
l'oxygène.
- par le recyclage de l'hydrogène, l'hydrogénase pourrait éviter
l'inhibition de l'activité de la nitrogénase par une éventuelle accumula-
tion de ce gaz dans les nodosités.

---

-22 -
- à l'oxydation de l'hydrogène est associée une formation d'ATP.
Ce qui compense en partie la perte d'énergie provoquée par la synthèse de
l'hydrogène par la nitrogénase.
Les perspectives d'amélioration de la fixation de l'azote grâce
à l'économie d'énergie due au fonctionnement de l'hydragénase (DIXON,
1976)
et l'importance du dégagement d'hydrogène par plusieurs associations
(SCHUBERT et EVANS, 1976) ont suscité de nombreux travaux sur l'activité
hydrogénase des nodosités des légumineuses. Les résultats actuellement
publiés montrent que l'hypothèse d'une augmentation de l'activité nitrogé-
+
nase par les souches Hup
par rapport aux souches Hup
est contreversée.
En effet. EMERICH et al-, , (1979) ; PAffilA et al-, ,
(1981) ; LEPO et al.,
(1981), ont trouvé un effet bénéfique du recyclage de l'hydrogène sur la
fixation de l'azote alors que de leur câté, GIBSON et al., (1981), NELSON
et SALMINEN (1982) ; SEPPO et ~~LSON (1984) n'ont trouvé aucun effet.
Le niveau de la fixation de l'azote moléculaire est contrôlé
à la fois par la souche de Rhizobium, et par la plante-hâte. En effet,
si la capacité d'induire le gène Hup dans les bactéroides d'une associa-
tion Rhizobium-lêgumineuse est une propriété de la souche du Rhizobium,
la plante contrôle la synthèse de l'hydrogénase et influence son expres-
sion (DIXON,
1972 i GIBSON et al., 1981 ; KEYSER et al., 1982, NELSON et
SALMlNEN, 1982 ; DREVON et aL., 1983 ; LOPEZ et al'
1983 ; SEPPO et NELSON
J
1984) •
1.3. INFLUENCE DU NITRATE SUR LA FIXATION DE L'AZOTE MOLECULAIRE
13.1 l'activité nitrate réductase (ANR)
131.1
Absorption et distribution du N03
Dans les conditions naturelles de culture, les légumineuse~ se
développent toujours sur un milieu contenant de l'azote minéral (N0
au
3
+
NH
) et peuvent bénéficier simultanément de deux sources d'azote lorsquel-
4
les sant nodulées : l'azote combiné et l'azote gazeux.
Les légumineuses, à l'in.tar de 1. plupart des vegetaux supérieurs,
absorbent l'azote minéral essentiellement sous forme nitrate: la nutrition
ammoniacale n'est prépondérante que dans des conditions édaphiques très
particulières.

---

-23
Absorbé par la racine. excrété dans les vaisseaux du xylè~ et
transporté par la sève brute, l'ion nitrate peut être soit accumulé tempo-
rairement dans les organes métaboliquement peu actifs, soit directement
réduit (ROBIN, 1983). Ainsi les racines contiennent 60 % du nitrate de
la plante entière (RADIN. 1978) ; à l'intérieur des nodosités la réparti-
tion nlest pas uniforme: le tissu central qui représente 40 à 45 7. du
volume total de la nodosité contient seulement 20 7. du nitrate de la
nodosité (HUNTER. 1983).
131.2 Réduction du nitrate
n'une façon générale, lorsque l'ion nitrate est absorbé, il
doit être réduit en ammonium avant d'être incorporé dans les squelettes
carbonés. Cette réduction du nitrate se fait en deux étapes selon le sch~­
ma suivant
+
H 0
+
2H
+ 2e
L
2
NO
6H
+ 6e
+
NH
7 """ ·
4
2
7'"
NADH
NAD+
Fd ox
Les 2 étapes sont catalysées respectivement par la nitrate réduc-
se et la nitrite réductase. De ces deux enzymes. la nitrate réductase (NR)
est la plus êucd Lêe par les physiologistes et les agronomes parce que la
réaction qu'elle catalyse constitue l'étape limitante de l'assimilation
de l'azote nitrique.
La NR est présente aussi bien chez les végétaux que chez les
bactéries. Sa structure est maintenant assez bien connue: c'est une molybdo
'flavo -
protéine de masse molaire d'environ 200 000 Daltons. Elle est
inductible par son substrat (N0
et elle est très dépendante de la
3-)
photosynthèse. source des glucides pour la fourniture de substrats réduc-
teurs et d'énergie.
Les deux électrons nécessaires à la réduction du nitrate en nitri-
te proviennent, dans tous les exemples connus actuellement du NADH ou du
NADPH ; le premier nucléotide est utilisé généralement chez les végétaux
supérieurs alors que le deuxième est spécifique de la nitrate réductase
des bactéries et des champignons.

---

Chez le Soja, NADH et NADPH sont tous les deuX donneurs d'é-
lectrons de la nitrate réductase (EVANS et NASON, 1953 ; CAMEBELL, 1978,
G. CONEJERO.1U11
La signification physiologique de cette par-
ticularitê n'est ~a~ encore comprise.
L'activité nitrate réductase peut se rencontrer dans les feuil-
les, dans les racines et dans les nodosités. Mais cette activité est inéga-
lement répartie dans ces différents organes. Chez le Soja, l'ANR des racines
mesurée par la méthode in vivo représente 10 % de l'activité totale alors
que les racines contiennent 60 i. des nitrates de la plante (RADIN, 1978).
Cette ANR spécifique reste faible par rapport à celle mesurée dans les nodo-
sités(HUNTER,I9-83)"
'nais elle est presque équivalente à celle des nodo-
sités lorsqu'elle est ramenée à la plante ~ cause de la masse importante
des racines (HUNTER,' 1983).
L'ANR des nodosités est essentiellement d'origine bactérienne:
la part de l'ANa provenant des bactéroides représente 90 % de l'ANR des
nodosités (HUNTER, 1983).
13.2 Effet du N0
sur la fixation de l'azote molécUla~.
3
Les travaux de SEMU et HUME (1979) ont montré que l'azote miné-
ral n'a pas d'effet significatif sur les niveaux de populations mais
affecte la distribution des sérogroupes dans les nodosités et l'efficacité
de la fixation. Les processus de nodulation et de fixation s'avèrent donc
beaucoup plus sensibles à ce facteur que la survie des Rhizobium (NUTMAN,
1975, EVANS.
1982).
132.1 Effet sur la nodulation
L'effet du nitrate dépend à la fois de sa concentration dans le
milieu de culture, de la plante-hôte, de la souche de Rhizobium utilisée
et de la période d'application (VINCENT, 1965 ; DIXON, 1969 ; DAR! et al.#
1974; WYCH et RAINS, 1979 ; HARPER et GIBSON, 1983).
DAR! et al.~(1977 ), ont montré que l'augmentation de la concen-
tration du N0
dans le milieu de culture réduit progressivement l'élonga-
3
tion des racines et la formation des poils absorbants chez Mediaago. Le
nitrate empêche aussi l'induction des nodosités et leur développement

---

-25 -
(GIBSON. et ~JTMAN, J960 ; GIBSDN et PAGNAN, 1977). Plusieurs hypothèses
ont été fo.mulées pou" expliquer l'inhibition de la nodulation par le nitra-
te, nous en retenons deux qui semblent vrais~e~blables.
- un effet direct du nitrate par inhibition de la synthèse des
lectines qui pe~ettent l'adsorption des bactéries sur les poils absorbants.
(DAZZa et BRILL,
1978 ; DE~ARIE et TRUCHET,
1979).
- la destruction de l'acide indol-3-acétique (ArA) par le nitrite
provenant de la réduction du nitrate paT les Rhitobi~ (TA11ŒR et ANDERSON,
1964 ; MUNN5. 1968, RIGAUD et aL., 1980).
En effet cette phytohormone, AIA. serait responsable de l'initia-
tion et du développement des nodosités. Elle est produite par les Rhizobium
à partir du tryptophane très abondant dans les e xude t s ra.cJ13a~re&
des H;-
gumin@uses (TRUCHET, 1976).
•
132.2 Effet sur la fixation de N2
L'apport du nitrate provoque le plus souvent, une diminution de
la fixation d'azote atmosphérique des légumineuses bien pourvues de nodosités
efficientes (PATE et DART, 1961, OGHOGHORIE et PATE, J971 ; JOltNSO~_!~~4t:.
1975, GIBSON,
1976, MUmlS,
1977, M.ANHJŒT et 'WONG,
1980; STREETER, 198!).
Cette inhibition ne semble pas être générale puisque ~~IBER (1966), WYCH et
RAINS (1979), MC NEIL (1982) ont pu observer un effet bénéfique des faibles
doses sur la. fixation et même sur la nodulation, lorsque l'application du
nitrate a lieu avant la nodulation.
La cause de l'inhibition de la fixation de l'azote moléculaire
serait un détournement d'ATP et de pouvoir réducteur par l'activité nitrate
réductase (GIBSON et PAG&~, 1977, MJLVJRART et 'WO~G, 1979) ; ou l'accumulation
de nitrite dans lea nodosités (RIGAUD et at., 1973 ; KE]EDy et aZ.~ 1975 ;
RIGAUD, 1976 ; STREETER. 1981 : STEFHENS et NEYRA, 1983). Cet ion agirait
soit sur la léghéwoglobine en la bloquant sous une forme inactive (RIGAUD
et PUPPO.
1977) soit directement sur la nitrogénase (TRINCHANT et RIGAUD
1982) •
L'effet bénéfique, à faible dose de N0
• sur la s~iose s'expli-
3
querait par un meilleur état physiologique de la plante dû à une stimulatioc

---

-26 -
NITRATE
R(DUCTASE
m>lieu
ce b ut
N ITROGENASE
ll'°'l_
grol5.
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•
..
JOURS
APRES
'"
S'E"'lS
Activitê nitrate réductase ( • ) et ni txogêneae ( •
)
chez le Soja. cv. HODGSOt;:
au cours du cycle végétatif
(OBATON et al....
1982).
-

---

-27 -
de la photosynthèse (BETHLENfALWAY et a:.~
1978a ; JATlliILTANSKY et aZ.,
1983). Ceci est vrai particulièrement en début du cycle de développement
de la plante, lorsque l'azote cotylédonnaire est épuisé et la fixation
d'azote encore trop faible
(LARRY et PHILLIPS,
1981). Un effet direct du
NO)
sur le fonctionnement de la nodosité n'est pas impossible. En effet,
une utilisation probable du nitrate par les bactéroides comme accepteur
d'électrons dans les nodosités a été suggérée par RIGAUD et a~.,(1973.)
Selon ces auteurs, la réduction du nitrate pourrait libérer une énergie
suffisante pour permettre la réduction de l'azote moléculaire par la
nitrogénase.
13.3 Relation entre l'activité nitrate réductase et l'activité nitro-
génase.
Le cycle végétatif du Soja dure 4 mois avec des variations plus
ou moins grandes selon les variétés et le type de climat. D'après de nom-
breux auteurs (HARPER, 1972, DECAU et û.L.'
1975 ; RIGAUD 1976 ; OBATON
3
et aZ'
1982, EAGLESHAH et al-, ,
1983) l'activité nitrate réductase et l'activité
3
nitrogénase paraissent antagonistes. Les résultats précédents en particu-
lier ceux de HARPER (1972) et OBATON e:!- aZ'
(1982) sur le Soja montrent
3
que les deux activitês, Nitrate réductase et Nitrogénase, se succèdent au
cours du cycle végétatif de la plante (Figure T6) •
L'activitê nitrate réductase par plante atteint Son max1mum au
début de la floraison, puis décroît par la suite : ce qui Jonne une courbe
en cloche observée par HARPER et aZ.} (1972).
L'activité nitrogénase mesurée par la réduction de l'acétylêne
(ARA) par plante ne commence qu'au moment où l'ANR a atteint son activité
maximale soit 20 à 30 jours après le semis lorsque les nodosités sont deve-
nues fonctionnelles. La fixation symbiotique de l'azote moléculaire est
maximale au stade du remplissage des gousses alors que l'assimilation du
nitrate est presque nulle.
HARPER et aZ'
(1972) expliquent la diminution de l'activité
3
nitrate réductase par une baisse de la teneur en nitrate de la plante suite
à un appauvrissement du sol en cet élément. WYCH et RAINS (1979) signalent
une diminution de l'absorption de N0
au même stade de développement chez
3
le
Soja ncdu l ê.
ou non. Or, selon MATSUMOTO( 1977)et PAL et SEXENA (1976),

---

-28 -
NADP
NAOPH
• Cttovlub.rat.
~~:
,.ox.~
Il
~
_
NADP
O~.~" cl ,mOUMon
Figure 1 - Assimilation de NB4"'". Que le r;B4+~ pl'ov"':enne de Z. 'azote fixt~ de zc réduatrion
7
de N0
ou ab8ol'b~ du milieu. exurieta"~ il. est assinriU par 'Les voiee I et
3-
II.
ra voie l est aat:az.ys~e pcz:ro la gz.lJ.=-~aU d~8hyd:roglt1a.se (1) et la
g1.u.taJrr':ne sythAtase (2) et la voie II ;:~ z.a g1.utemr':ne synthAtase (2) et
Za glutamate synthc.se (:3).
(D'apl'~8 MIFLIN et LEAJ 1976 ; ZENGBE~ 1984).

---

-29 -
les sojas nodulés ou non accumulent plus de 60 % du total d'azote sur leur
cycle de développement après la période où l'activité nitrate réductase
cesse alors que l'activité réductrice d'acétylène devient minimale. S'agit-
il d'un antagonisme ou d'une simple complémentarité entre ces deux voies
de nutrition azotée chez les légumineuses ?
Contrairement à la succession des deux activités enzymatiques
observée chez le soja (HARPER 1972 ; OBATON et al., 1982) et chez le h&ri-
co t
(FRANCO et al. ~
1979), i l a été montré que ces deux enzymes peuvent
fonctionner simultanément chez la luzerne WERY, (1983) et chez le fénugrec
(DESPERRIER;
1984). La disparité de ces observations est due à la complexi-
té des facteurs de régulation eux-même soumis à des fluctuations au cours
de la vie de l'association symbiotique.
o
La réduction de N
coûte autant d1énergie que la réduction du
Z
N0
Dans les deux cas, le produit de réduction, NH + . est assimilé dans
3-.
4
les réactions glutamine synthétase -glutamate-synthase qui nécessitent la
disponibilité des mêmes squelettes carbonés (Figure 1 ) , S'il Y a compéti-
7
tion, elle se ferait donc vis-à-vis des glucides de la photosynth~se, source
d'énergie et de molécules carbonées acceptrices de NH +
4
1.4. INFLUENCE DES FACTEURS OU MILIEU SUR LA FIXATION DE L'AZOTE MOLECULAIRE
, ," ,
En deh~rs de l'az~te minéral du sol. la fixati~n symbiotique'
de l'azote moléculaire peut être influencée par d'autres facteurs pédocli-
matiques (Tableau 1 ) parmi lesquels nous retiendrons l'acidité du sol. la
6
température, les contraintes hydriques et la matière organique du 501.
14.1 l'acidité du sol
La phase initiale de la nodulation est déprimée par un faible
pH, une carence en calcium et un excès de chelate de fer et d'aluminium
dans la solution du sol. L'effet dépressif de l'acidité du 501 sur le sys-
tème symbiotique est bien co~nu. (VINCENT, 1965; MULDER et al.~197~).
Un pH bas peut perturber la pénétration de la bactérie dans
la racine de la plante. Le nombre de Rhizobium à croissance rapide (R. pha-
eeoli ; R. melitoti ; R. leguminoearum; R. tr{foliiJ est très faible
dans les sols à pH inférieur à 5.5 (ANDERSON
et al.~ 1975 et AHARGER, 1980).

---

-30 -
Tableau
1
Facteurs pédoclimatiques li~itants de la fixation symbiotique
6:
d'azote.
(It; DREVO~. 198~)
F2cteur
Bibliographie (indicative)
température du sol
DART et DAY (1971), GRALE et HEICHEL (1982)
humidité du sol
SPREIIT (1971), D8ATDN (1982)
pH du sol
HUI'iNS (cité par WERY, 1983) DREVON et
DIA8AYE (1979)
teneur du sol en macroéléments
azote
Hr,RPER (1974)
pct as s i um
COLLHIS et DUKE (1981)
phosphore
IIUNNS (cité par WERY, 1983) GRAHAM et
souffre
ROSAS (1979)
calcium
JANSEN et VITOSH (1974), 80ROELEAU (1981)
Na C1
I!UI'iNS (cité par 'IERY 1983) et EVANS
1,IUliNS (cité par HERY 1983)
teneur du sol en microéléments
ool ybdène
cuba 1t
bore
teneur du sol en matière organique
microflore du sol autre que Rhizobium
nématodes
BETHLENFALWAY et al 1983
mycorhizes
OUCZEK et 8UCHAN, SNITH et al (cités par
produits phytosanitaires
,JERY, 1983)
Les facteurs physico-chimiques décrits ici peuvent être bénéfiques
ou toxiques selon leur concentration. Les nématodes sont généralement nuisibles
et parfois utiles, les mycorhizes favorisent la nutrition phosphatée des légumi-
neuses. La toxicité des produits phytosanitaires varie selon le produit actif.

---

- 31 -
La perte de la capacité fixatrice d'azote de souches de Rhizobium
en milieu acide a été évoquée par HOLDING et al., (1971). En dehors de
son action directe sur la fixation, l'acidité est accompagnée d'un ex~ès
d'aluminiuc, .de fer et de manganèse libre provoquant une toxicité alumino-
mang3niQUe ou alumina-ferrique néfaste pour la croissance des racines
(KAMPRATH et al.,
1971).
Une carence en calcium provoque chez les légumineuses une divi-
sion cellulaire anormale avec la formation de cellules ayant une séparation
incomplète des chromosomes ce qui est préjudiciable à l'initiation de la
nodulation (LONERAGAN et al:«,
1970 et LIE, 1974).
14.2 La température
La température élevée des sols tropicaux peut agir sur la popu-
lation de Rhizobium dans le sol. Une étude faite par NDRRIS (1970) en pays
tropicaux montre qu'à une profondeur de 2,5 à 5 cm, la température de cer-
tains sols peut alterner
de 40 à ~oC pendanc une période de 5 heures.
En pays tempêrés, les basses températures peuvent aussi limiter la
fixation de l'azote. La température minimale pour la symbiose dépend de
la plante-hôte mais elle peut être modifiée par la souche de Rhizobium
utilisée (ROUGRLEY. 1970).
14.3
Les contraintes hydrigues
Un sol engorgé d'eau entraîne un manque d'oxygène. Or, cet oxy-
gène est nécessaire au bon fonctionnement du système racinaire. Un film
d'eau autour de la nodosité en freinant la diffusion d'oxygène, perturbe
l'activité de cette nodosité (SPRENT, 1969 ; SCHWINGHAHMER et al., 1970).
Le dâficit hydrique peut iO'~~lencer la fixation de l'azote à des
'."
,.".,.,,---
-,.' -
",',--
degrés plus ou moins importants (SPRENT, 1969). L'activité de la nitrogénase
peut être inhibée par le manque d'eau (OBATON ét al., 1980). En ,plus de son
effet direct sur la fixation au niveau de l'activité de la nitrogénase, le
déficit hydrique peut accentuer son effet par une baisse de l'activité
photosynthétique de la plante (SPRENT, 1972).

---

14.4 La mat~ère organique du sol
La matière organique joue un rôle important dans la fixation
de l'azote en améliorant le rendement du soja nodulé (NORMAN et aL.~ 1946).
Dans les sols tempérés où les conditions du milieu sont rela-
tivement favorables au maintien de la matière organique pendant toutes
les saisons, les souches de Rhizobium survivent en nombre élevé toute
l'année (CROZAT et aZ.~ 1981).
Dans les sols tropicaux, par contre, la température élevée fa-
vorise une minéralisation rapide et la teneur en ~tière organique du
sol reste très faible. Ce qui influence fortement l'évolution de la popu-
lation ba~térienne au cours des alternances sèches et pluvieuses de ces
régions (ODU. 1977).
De nombreux travaux sur le râle de la matière organique, montrent
qu'elle favorise la vie microbienne et le développement des racines par
son action sur la structure, le pH, la rétention d'eau et des variations
de la température du sol (CfuL~INADE. 1965 ; CHARREAU et NICOU, 1971 ;
AKINOLA et al., 1980).
1.5. OBJET ET PROGRAMME DE TRAVAIL
Cette étude bibliographique indique que la fixation de l'azote
moléculaire dépend non seulement des deux partenaires de la symhiose (lé-
gumineuse et Rhi~obium) mais aussi du milieu pédoclimatique par conséquent,
les voies de recherches nécessaires pour améliorer cette fixation symhio-
tique sont nombreuses. Celle-ci peuvent se situer à plusieurs niveaux :
- ~i~E2~i21~&!~_: Inoculation des semences pour apporter des
Rhizobium très efficients dans les sols où les souches naturelles sont
peu nombreuses ou non fixatrices. Etude de la dyn~ique de ces souches. de
leur pouvoir de compétition. de l'influen~e des facteurs du milieu et de
la plante-hôte sur l'équilibre entre souches et leur efficience dans la
plante.
- ~h1~i212si~_~~_S§g§~ig~~ : Etude des facteurs physiologiques
limitants de la fixation et création de nouvelles associations

---

-33 -
très fixatrices pour réduire l'utilisation des engrais azotés.
- ~~2~gi~~~:
Etude des phénomènes biochimiques pouvant influer
sur la réduction de l'azote moléculaire.
- ~g!~~2~i~:
Recherches des facteurs limitants dans les sols
où la fixation est faible.
Le travail présenté dans ce mémoire se décompose en trois parties
- La prem~ere porte sur l'influence du métabolisme de l'hydro-
gène sur l'effectivité de la symbiose soja x R. japonicum en serre.
La deuxième étape a pour objectif de prec~ser les effets du
nitrate sur la fixation de llazote moléculaire et sur llefficacité relati-
ve de la symbiose soja (c.v. HODGSON) avec le Rhizobium japonicum (G3)
et enfin) la troisième étape nous permettra de suivre au cours
du cycle de végétation. l'évolution des activités des deux enzymes respon-
sables de la fixation de l'azote moléculaire et de l'assimilation du nitra-
te. en serre et au champ.
Nous espérons que les éléments de réponses apportés par ce travail
nous permettront de mieux connaître 1e.!l,_typé:s d~_ relation qui existent entre
les mécanismes physiologiques de la nitrate réductase et de la nitrogénase
et de préciser l'influence des engrais azotés sur la fixation afin d'en
tirer meilleur profit.

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- 35 -
II - MATER lE cS ET METHODES
2.1. MATERIELS
21.1 Choix des fsolements de Rhizobium
Une collection de Rhizobium d'origines diverses a été consti-
tuée dans le laboratoire dépuis quelques années en vue de sélectionner
des isolements destinés à l'inoculation du soja. Nous avons choisi quelques
uns de ces isolements pour notre travail. Ces derniers sont présentés
dans le tableau III' et se répartissent de la manière suivante:
- 6 isolements de Rhizobium japonicum à croissance lente et de bon-
ne efficience.
- 6 isolements de R. japonicum à croissance lente et d'efficience
faible.
- 2 isolements de R. japonicum d'origine tropicale à croissance rapide.
- 1 mutant de R. japonicum à croissance lente et non efficient.
- Il isolecents de R. japonicum provenant de différentes ~égions de
la Côte d'Ivoire isolés pa~ ZENGBE en r980 •
• 1 isolement d'origine tropicale ca~able d'induire des nodosités
sur le Vigna.
• 1 isolement provenant des nodosités de Sesbania rostrata ~rélev€es
sur le fleuve sénégal par DREFtS (1982).
L'efficience des 12 premiers isolements a été testée en ser~e et
au champ sut le Soja (cv. AMSOY) par le Laboratoire de Microbiologie
des sols de l'INRA à Dijon. Elle a été. par la suite, confirmée par de
nombreux travaux de sélection ?ar le même Laboratoire et le CETIOM
(CENTRE TECHNIQUE INTERPRDFESSIDNNNEL DES OLEAGINEUX METROPOLITAINS)
depuis 1972 sur d'autres cultivars de Soja dans différentes zones écologi-
ques de F~ance (LAGACHERIE, 1979).

---

- 36 -
Figure
I I I
Différentes étapes de la préparation
d'un
inoculum
de Rhizobium à partir d'une souche
de collection.
COflserv.atioll à
.. ac
c e n s e r v atle n
ll.
sur pl.n gélose
in.
,4°c
a
l'etat
J yo_
c li fie
Phylise
---
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Pureté
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souche
Repiquage
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Ln c c u j a t t o n
du
mi-
lieu
YEM
liquide
avec
des
colonies
prelevee'
dans
un
tube
.II
rlli'-
piquage
Le a l e h e m e n t
ptiparé

---

-37 -
Les isolements Ont été conservés à 4°C à l'état lyophilisé ou sur
milieu de culture gélosé.
21.2 Matériel végétal
Pour des raisons expérimentales, nous avons choisi une seule plante-
hâte: le cultivar HODGSON. D'origine américaine, ce cultivar est assez
bien connu par les sélectionneurs du CTPS (comité technique pennanent de
la sélection) et inscrit actuellement au catalogue français
(TASSOT,
1983).
Il est bien adapté aux conditions de culture méditerranéenne.
2.2. METHODES
22.1 Purification et préparation d'inoculum
•
La purification des isolements est réalisée par étalements succes-
sifs (deux au moins par isolement) (fig. II1)en bOlte de pétri à deux
dilutions par isolement (1/100 et 1/1000) sur milieu YEM (Yeast extract
mannitol) gélosé (VINCENT, 1970)
(annexe
). Les bottes de Pétri inocu-
lées sont incubées à l'étuve à Z8 D-30 Dc et ....les observations sont faites
toutes les 24 heures.
Après purification, chaque isolement A multiplier est introduit sté-
rilement dans un erlen de 250 ml contenant 50 ml de milieu rEM liquide
stérile. Le milieu YEM ainsi inoculé est disposé sur table d'agitation
à 28 Dc pendant une durée qui dépend de la vitesse de croissance de l'i-
solement.
22.2 Cultures du soja en serre
222.1 Culture· monoxénique en tubes de GIBSON
Les graines de Soja (cv. HOGDSON) désinfectées à l'hypocblQrlte
de calcium (annexe 5A~-" ) puis prégermées sur la vermiculite, sont trans-
plantées sur milieu nutritif "Pochon-Jensen" (annexe q)gélosé incliné
dans des tubes à essai de 22 mm de diamètre. La radicelle de la plantule est
introduite dans le tube à essai de manière à rester relativement asepti-
que et de telle sorte que la partie aérienne soit à l'air libre (fig. 1I ) .
2

---

Figu:re
Zee
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... buu.hun ,h
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Dispositif de c r ib l açe pour la culture de légl.l~,~~eJse5 jusq;.r'';
35 jours.
\\
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ve Icce de
5i!.'::1.e pc:.::" '
vol~es de ve~icu~i:e).
Figure
Zes plantes en pot.
_____._Pol
de
pvC
(vo 1v m e
51)
"

---

Les tubes sont inoculés avec la suspension de chaque isolement à tester
et disposés en serre en blocs de Fisher à raison de 4 répétitions par
isolement avec 4 témoins non inoculés.
Les plantes reçoivent la solution nutritive diluée au quart
au fur et à mesure des besoins. Cette solution est de même composition
que le milieu gélosé.
222.2 Culture monoxénique en pots
Les graines prégermées comme précédemment sont inoculées par
trempage en boîte de Pétri (pendant la mn) dans 20 ml de suspension de
chaque isolement à tester. Les graines ainsi inoculées sont repiquées au
nombre de 2 dans un pot el'. verre de 220 ml sur mélange " s able-vermiculite"
stérile. Les graines sont ensuite recouvertes de sable hydrofugé (annexe5B)
pour éviter toute contamination. Le dispositif (fg. 11 ) est ensuite placé
3
en serre.
Les plantes reçoivent régulièrement une solution nutritive stérile
diluée deux fois) à raison de 15 ml par pot. (solution nutritive de LEFEVRE
modifiée par ZENGBE
annexe 2)
ème
Le 7
jour après le semis, le nombre de plantules est ramené à
e
1 par pot et le 20
jour. les cotylédons sont supprimés pour que la fixa-
tion soit la seule source dl alimentation en azote.
Les pots sont disposés en 4 blocs randomisés constituant 4
répétitions par souche.
222.3 Culture hydroponique
Les graines prégermées sont ensuite transférées sur milieu
liquide dans des pots en matière plastique de cinq litres; à raison de 4
graines par pot. La culture est effectuée en prenant des précautions
pour éviter la contamination par des Rhizobium étrangers. L'inoculation
a été faite le jour même du transfert en pots. Les racines sont aérées
par bullage (200 ml/mn) et reçoivent différentes doses de nitrate :
a j 1,5 j 3 j 6 et 15 milliéquivalents de N0
par litre. La solution
3
nutritive de base est le milieu de HOAGLAND modifié (voir composition en
annexe.)) Cette solution nutritive est renouvelée tous les 7 jours.

---

-40 -
222.4 Culture sur sable
Pour cette culture, les graines désinfectées à l'hypochlorite de
calcium puis prégermées dans la vermiculite, sont transplantées sur sable
dans les pots en plastique de 5 litres avec drain (Fig. 11
L'inocula-
4),
tion a été faite le jour de la transplantation.
Les plantes, généralement au nombre de 4 par pot, reçoivent une so-
lution nutritive de base dite de LEFEVRE et modifiée paT ZENGBE (annex.~
contenant 0 ou 1,5 meq N0
/1. Cette solution est renouvelée chaque jour.
3
Pour tous les essais en serTe les conditions sont les mêmes.
La photopériode est de 16 h. Lorsque cela est nécessaire, un complément
de lumière est apporté aux plantes de~ h à 8 h et de 18 h à 20 h. à l'aide
2/h).
de lampes à décharge A vapeur de mercure de \\000 W (200 uEinstein/m
La température est alors maintenue à environ 18°C minimum et 30°C maximum.
22.3 Culture au champ.
L'essai au champ a été conduit sur une parcelle du domaine ex-
périmental de l'ENSAM. Le sol est de texture argilo-calcaire à pH 7,2
avec une teneur en azote total faible (0.96 ~NTKjeldahl). Situé en bas de
2,
pente, il draine mal en période de fortes pluies. D'une superficie de 200 m
la parcelle recouvre une zone dont la fertilité est relativement homogène.
Le climat est du type méditerranéen caractérisé par
une sécheres-'
se estivale et de fortes températures en été, une pluviométrie irrégulière
avec un maximum en automne et au printemps et l'existence de gelées hiver-
nales.
Une fumure de 100 kg/ha d'engrais binaire (P.K.) de composition
18-18 est apportée au moment de la préparation du sol.
La parcelle a été subdivisée pour recevoir des traitements dif-
férents

---

-41 -
Tl:
témoin non inoculé et sans azote
N R
+ -
1
témoin non inoculé et reçevant de l'azote
N R
2:
- +
T
témoin inoculé et sans azote
N R
3:
T,: traitement principal inoculé et reçevant de l'azote
N+R+
+
L'azote est apporté sous forme d'ammonitrate 35,5 7. à la dose de
135 kgN/ha. Cette dose est fractionnée en 9 apports soit 15 kgN/ha touS les
12 jours sur le cycle du Soja (cv. HODGSON) qui dure 130 jours.
L'inoculation des graines a été faite avec une suspension de
Rhizobium japonicum
G
(311 B 138 USDA. Beltsville USA) fraîchement
3
préparée.
Le semis est réalisé manuellement à la densité de 40 gra~nes
par mètre-linéaire et les lignes séparées de 40 cm. Par la suite, le
peuplement est ramené à 20 plantes par mètre linéaire soit 400 000 plantes
/ha. lors de l'éclaircissage.
La parcelle est irriguée pour compenser le déficit pluviométrique
à cette période de sorte que l'humidité du sol soit maintenue à l'ETH.
Deux désherbages ont été effectués
par binage le 15 JU~n et
le 12 juillet.
2.3 MESURES EFFECTUEES
23.1 Mesure de la croissance des bactéries
La croissance des bactéries est évaluée par turbidité (mesure
de la densité optique de la culture) à l'aide d'un spectrophotomètre
(type MULTTSKAN) à 405 nm.
Les différentes suspensions de Rhizobium ont été réalisées par
incubation de 50 ml de Solution YEM liquide contenue dans des erlens de
150 ml puis incubées à 28°C à l'étuve sur une table d'agitation.

---

-42 -
La lecture de la densité optique est faite deux fois par jour
à 10 h et à
17 h.
Le temps de génération qui est le temps de doublement d'une
population bactérienne est calculé pendant la phase exponentielle de
la croissance (AUBERT, 1974).
23.2 Quantification du matériel biologigue
Les parties aériennes (parties situées au-dessus du noeud
cotylédonnaire) et les racines sont pesées après 48 h de séchage à 75-BODC.
Les poids sont expr1mes en gramme de matière sèche par plante et notés
respectivement gMSs pl-l pour les parties aériennes et gHSr pour les racines •
•
Les nodosités sont pesées, soit juste après excision ou après
incubation, soit après séchage à l'étuve à 75-BO°C. Le poids est alors
exprimé soit en gramme de matière fraîche (gMF nod.) soit en gramme de
matière sèche (gMS nod.).
23.3 Mesure de l'efficacité relative apparente des nodositês
Les mesures sont réalisées sur des racines nodulées excisées et
incubées sous une atmosphère contrôlée dans des flacons à antibiotique fermés
hermétiquement avec des bouchons à jupe. Le volume du flacon dépend de
la taille de l'échantillon à incuber.
Les échantillons pour la mesure du dégagement de l'hydrogène
(DH
sont incubés sous une atmosphère composée de 7Z % N
18 % Oz et
Z)
2,
10 %A • Au bout de 15 mn d'incubation, un échantillon de 0,5 ml de
l'atmosphère est prelevé à la séringue et sa teneur en hydrogène est
mésurée au catharomètre à conductivité thermique équipé d'une colonne
de tamis moléculaire (si\\. ) contenant du p. rapak T. La température du four
est de 70°C et le gaz 'vecteur est l'azote à la pression de 2 bars.
Les échantillons pour la mesure de l'activit€
r€ductrice
d'acé-
tylène (ARA) sont incubés sous une atmosphère de 72 % N
; 18 % Oz et
Z
10 % CZR
La teneur en
Z'
ê
tbyl.êne de l'échantillon de 0,5 ml prélevé est
mesur€e
au chromatographe en phase gazuse équipé d'un détecteur à ioni-
sation de flamme avec une colonne remplie de porapak R (50-100 mesh). La
température du four est de 90°C et le gaz vecteur est l'azote à la pression
de Z bars.

---

- 43 -
~JOintde
Bouc non septum.L;_ _~
mastic
Plaque
de
PVC
o-+-_Gorge remplie
d'eau
_ _ _ Cylindre
rnetallique
nc .u,
DISPOSITIF DE
MESURE
IN
SITU
DE
L'ACTIVITE
REDUCTRICE
D'ACETYLENE
AU
CHAMP

---

- 44 -
Les incubations sont réalisées à la température du laboratoire
ou, lorsque cela est nécessaire, à 30°C dans un bain-marie.
L'efficacité relative apparente (ER) est calculée selon la
a
formule
DRS
ER
'"
1 -
a
AllAs
DH
est la quantité d'hydrogène dégagé hors de la nodosité et exprimée
S
en micromoles de HZ par heure et par gramme de matière fraîche de nodosités
-1 -\\
Cu moles H
g
MF nad.)
2h
ARAS mesure la quantité d'acétylène réduit et expr1meepar heure et par
1g- 1
gramme de matière fraîche de nodosités (umoles C
MF nad.)
2H4h-
23.4 Mesure de l'activité réductrice d'acétylène IN SITU
Suivant le dispositif de BALANDREAU et DOMMERGUES (1971) les
plantes sont isolées de l'atmosphère extérieure d'une part par un cylin-
dre métallique de 30 cm de diamètre et 20 cm de haut, enfoncé de 15 cm
dans le sol et d'autre part par un sac en polyéthylène maintenu par un
anneau métallique s'encastrant dans la gorge du cylindre. L'étanchéit~ du
système est assurée par de l'eau versée dans la gorge métallique. L'in-
jection d'acétylène et le prélèvement des gaz de l'enceinte se font par
un bouchon septum, à l'aide d'une seringue hypodermique.
La méthode utilisée au champ est une amélioration de cette métho-
de. En effet, le sac en polYét~l!~!,est remplacé par deux demis plaques
maintenues par du mastic de sorte que les parties aériennes des plantes
soient laissées à l'air libre (fig. IlS)'
En serre. les plantes restent isolées de l'atmosphère extérieure
par le sac en polyéthylène mais le temps de mesure est suffisamment court
pour que l'état physiologique de la plante ne soit pas affectée. (fig. 11 6),
Dans les deux dispositifs de mesures. la concentration de l'acé-
tylène injectée dans l'enceinte est d'environ 10 % v/v, condition consi-
rée comme saturante pour la nitrogénase (BALANDREAU et DOMMERGUES. 1971).

---

Sac en potyéth.y~e.........,
_Bouchon
septum
Scotch
•
Pot
de
PVC
+----Sable
5 L
Tuyau d'èvacuation
Graviers
bouché
FIGdl,
DISPOSITIF
DE
MESURE
IN
SITU
DE
L'ACTIVITE
REDUCTRICE
D'ACETYLENE
EN SERRE

---

- 46 -
Après 30 mn (au champ ,Jou 15 mm (en serre) d'incubation. des
prélèvements de 5 ml de l'atmosphère de l'enceinte de chaque cylindre
ou pot, sont effectués toutes les 15 mn (pendant
heure au champ
ou 45 mn en serre). Les échantillons de gaz sont stockés dans des tubes "ve-'
no jec t" de 13 ml, où un vide partiel a été réalisé au préalable. Ces échan-
tillons sont analysés au chromatographe en phase gazeuse Ccf. 233).
L'activité réductrice d'acétylène (ARA) est exprimée en
umoleC
formé par heure et par plante. L'activité spécifique est expri-
2H4
mée en umoles de C
formé par heure et par g de MS de nodosités (cf.
2H 4
annexe 8~calcul de l'activité réductrice d'acétylene).
23.5 ~esure de l'activité hydrogénase des bactéroi'des
La mesure de l'activité hydrogénase est basée sur l'évaluation de
la consommation d'hydrogène d'une suspension de bactéroides. Cette
suspension est préparée en aérobiose à partir de nodosités excisées (an-
nexe 6)le polyvinyl pyrolidone est ajouté pour protéger l'extrait enzy-
matique contre les
polyphénols libérés par le broyage des cellules végé-
tales. Après préparation et centrifugation de l'extrait, un échantillon
.
d.
de 5 ml de suspension/bactéroides est mis à incuber dans un flacon ~ an-
tibiotique en présence de 200 pl d'hydrogène, à 30°C dans un bain-marie.
A l'instant t , un échantillon de 0,5 ml de l'atmosphère
o
du flacon est prélevé pour déterminer la quantité de H au catharomètre
2
(cf. 232). Après un temps t
(60 mn) 0,5 ml de l'atmosphère évoluée est
l
de nouveau prélevée et sa teneur en H mesurée au catharomètre. La différence
2
Q = Q 1 - Q
(où Q . représente la quantité de HZ mesurée au temps ti
t
to
tl.
d'incubation) donne la disparition de HZ due à l'activité de l'hydrogénase.
23.6 Mesure de "acthité nitrate réductase
L'activité nitrate récuctase des différents organes de la plante
est mesurée selon la méthode in vitro. Cette méthode consiste à broyer
le matériel végétal dans un milieu tamponné. L'enzyme est protégée contre
une éventuelle inhibition par des métaux lourds grâce â l'EDTA ainsi que
contre l'action de protéases et de composés phénoliques grâce à la caseine
et à la cystéine.

---

47
La réaction enzymatique est réalisée en présence des deux subs-
trats NO)
et NADH en concentrations saturantes. Après 15 mn d'incubation
à 30°C, la réaction est arrêtée par l'acétate de zinc qui précipite les
protéines. Les nitrites produits par suite de la réduction du nitrate
sont dosés par diazotation (adjonction de sulfamine amide et de N-Naphtyl-
éthylène diamine dichlorure) puis mesurés par colorimétrie à 540 œn ,
(voir méthode de calcul en annexe 7)
(CONEJERD, 1981.)
•

---

- 48 -
III - INFLUENCE DU RECYCLAGE DE L'HYDROGENE SUR L'EFFECTIVITE
DE LA SYMBIOSE "SOJA-R. JAPONICUM"
3.0. INTRODUCTION
Dans l'association symbiotique Rhizobium-légumineuses, de
l'énergie p~oduite par photosynthèse est utilisée pour fixer l'azote
moléculaire. Toutefois, l'efficacité de l'utilisation de cette énergie est
très variable suivant les partenaires de cette symbiose et les [acteurs
du milieu sans oublier l'incertitude liée aux méthodes de mesure (HINCHIN,
1984).
La nitrogénase a la propriété de réduire l'azote moléculaire en
ammoniac et simultanément les protons en hydrogène moléculaire. Cette
dernière réaction peut utiliser 30 à 60 % du flux d'électrons transféré
par la nitrogénase (SCHUBERT et EVANS,
1976 ; RUIZ ARGUESO et aZ.~ 1978
EVANS et al.~ 1980 ; BERGElISEN. 1980). Ceci constitue donc une perte du
pouvoir réducteur.
Certaines souches de Rhizobium peuvent synthétiser une hydrogé~
nase uni.dd rec ci.onne l Je", membranaire qui catalyse l'oxydation des molé-
•
cules d'hydrogènes formées dans les bactéroides (PHELP5 et WILSON,
1941 ; DIXON, 1968). Ce système qui, selon son niveau d'activité réduit
partiellement ou totalement l'émission d'hydrogène par les bactéroide~,
permet de récupérer une partie de l'énergie dépensée dans la synthèse de
l'hydrogène par la nitrogénase et d'économiser des glucides (DIXON, 1972
EMERICH et'al." 1980; PHILLIPS,
1980; EVANS et al-, ,
1981).
DIXON (1972) suggère trois mécanismes hypothétiques par lesquels
l'hydrogénase pourrait bénéficier à la fixation de l'azote moléculaire
protéger la nitrogénase contre l'oxygène
- empêcher l'inhibition de la nitrogénase par l'hydrogène
- récupérer une partie de l'énergie dépensée par la nitrogénase
L'objet de ce chapitre est de rechercher si la présence d'une
gydrogénase active bénéficie à la fixation d'azote par la symbiose R.
japonicwn-So j a.

---

FIG. 111-1- - Courbes
comparatives de croissance de differents isolements
de Rhiz.obium en milieu YEM liquide
à la.JO·C
-
--_. i -
-,
- -- -----,-----
--,---- ---- -,
---.-
0
0
0
r
........... GA,
0
0
0
1
1,0
1
1
•
GA,
YSL U 1
,1B"G, 5" Gu
5,
CBn.
G"
5,
•
G..
1
1
~:G.. G.. G"
•
.
•
G..
Gu
G"
9
J
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9 "
•
9
0,5 J
l7v 9
Y
9
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0.
L-
0
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Il
9
,~
~
.-•c
~
0
0.0 t:= • ~..-:
"
,
.
o
50
75
100
150
200
Temps d'incubation(h.)

---

- 50 -
La méthode utilisée consiste à comparer avec une même plante-
hâte, ici le cultivar HODGSON, les résultats obtenus par plusieurs isolements
HuP+ d'un côté et de l'autre des isolements HUP- ; les autres gènes qui
ont un effet sur la capacité fixatrice d'atote étant supposés distribués éga-
lement dans les deux groupes.
Les isolements de Rhizobium utilisés, ont été caractérisés aupa-
ravant en prenant comme critère la croissance en milieu YEM et l'infectivi-
té
vis à vis du cultivar HQDG50N. Nous ent~ndons par infectivité. la canacit€
d'un isolement à ind~ire des nodosités chez le .cultivar considéré. Quant à
l'effectivité d'une symbiose Rhizobium-Soja, c'est la capacité fixatrice du
système symbiotique en question.
3.1. RESULTATS
31.1. la croissance en milieu YEM
Les différents isolements ont été étalés sur milieu nutritif YEM
(Yeast Extract Mannitol) gélosé en boîtes de Pétri et incubés à 28-30°C • •
Le contrôle journalier nous a permis de remarquer que la plupart des iso-
lements ont formé des colonies homogènes sauf GA et G62. Ainsi donc, à partir
de GA,
nous avons distingué :
-~
isolement formant de grandes colonies blanches et
1
bombées
- GAZ
isolement formant de petites colonies blanches cristal-
lines.
De même. à partir de G
nous avons distingué deux isolements:
62,
- G62 A
isolement formant des colonies blanches à bord brillant
- G62 B
isolement formant des colonies cristallines
L'hétérogénéité de ces deux isolements peut avoir pour origine
soit une instabilité de la souche (perte de plasmide) soit une contamina-
tion survenue au cours de différentes manipulations.
Selon les dates d'apparition des colonies, nous distinguons deux
groupes de croissance :

---

- 51
Tableau III}. : Récapitulatif des caractères des différents isolements
testés.
les isolements ont
tê incubés en milieu"minéral-eau",
ê
levure - mannitol"
(Sa ml) à 28"-30"C.
Le pH a été mesuré après 172 h d'incubation
L'infectivité est évaluée sur soja (cv. HODGSON) en tubes de
GIBSON
Chaque valeur est~la moyenne- de 3 à 4 répétitions
~om5 de cat a- Type de
Temps de
nombre_ 1
1
logue INRA
croissance
génération
pH après 172h
nod.pl
53
rapide
5 h 30 a
4,g8
O·
b c
GAI
"
8 h 46 a
5 la
13
•
59
b
lente
17 h 50 b
6, 8
20'
G1
"
b
18 h DJ b
7, 7
16b
G3
b
"
18 h 05 b
7.6
15b
G7
"
18 h 05 b
b
cd
6,8
8
GIS
"
b
18 h 04 b
6,5
11c:
G20
"
18 h 05 b
7 1b
cd
,
9
G46K
"
18 h 07 b
b
d
) 8
6
•
b
G49
b
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18
0) b
7,7
14
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"
b
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6,5
9
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"
b
18 h 05 b
c
7, 2
12
G62A
"
18 h 04 b
)
.b
c
12
• •
G62B
"
c
18 h 07 b
6,9
IO
G63
"
18 h 07 b
) 1b
,
Il c
G69
"
18 h 07 b
7,Sb
d
7
BIS
"
b
b
18 h 03 b
6,5
15
CB)56
b
"
18 h 06 b
6, 5
O·
GA
d
,
2
"
18 h 07 b
7 1b
4
5)
"
b
18 h 07 b
d
6,8
6
512
b
"
18 h 07 b
c
6,8
12
YSL5)
"
lS'h 16 b
b
6,8
O·
,
SUllJUI
Dans chaque colonne, les chiffres Ide la même lettre ne diffèrent pas
au seuil de 5 % ( Méthode Newman-Keuls).

---

- 52 -
1) groupe à croissance rapide:
53 et GAI' form~nt des
colonies de 1 à 2 mm de diamètre 2 à 3 jours après l'étalement en boîte
de pétri.
- 2) groupe à croissanc~ lente : ce sont tous les isolements
autres que 53 et GAI' Après 8 à Il jours d'incubation. ces isolements formen~
des colonies de diamètre inférieur ou égal à 1 mm.
Cette distinction a été confirmée, par la suite, par l'essai de
croissance en milieu YEM liquide. La figure 111
représente les cour-
1
bes de croissance des différents isolements. La plupart de ces isolements
présentent des courbes de croissance analogues : si bien que seule la courbe
moyenne a été tracée, toutefois, les points correspondants à chaque isole-
ment ont été indiqués sur le graphique. Par contre, les isolements GA] et
presentent des courbes différentes.
Le calcul du temps de génération donne, pour la majorité des
isolements qui sont à croissance lente, une valeur moyenne comprise entre
17h30 (Sg) et lB h 15 (YSL 756) et pour :es isolements à croissance ra-
pide 5 h 30 (S3) et 8 h 45 (GA,). Les valeurs élevées des temps de généra-
tion sont probablement duas à une mauvaise oxygénation du milieu de cul-
ture.
Le pH faible (4,9 à 5,1) mesuré en fin de culture pour les
isolements à croissance rapide
S3 et GAl confirme le caractère acidifiant
des souches de Rhizobium à croissance rapide (JORDAN et al'
1974 ;
3
HAROLD et al.,
1982).
31.2 L'înfectivîté des îsolements de Rhîzobîum
L'infectivité (ou pouvoir infectieux) désigne l'~ptitude
du Rhizobium à induire la nodulation sur la légumineuse 3 laquelle il
est associé.
L'infectivité des isolements testés, en tubes de G1BSON, sur le
cultivar HODGSON est appréciée par le nombre de nodosités formées
par plante.
Le résultat (tableau 111-1) montre que cette infectivité varie
très nettement suivant les isolements. En effet, sur les 22 iso:ements

---

TAHLEAU llI.2
: Pe r f ormancea de la symbiose de G. max
(cv. HODGSON) avec differents isolements de R.
japonicum.
Plantes âgée s de 30 jours (culture racnoxén i que en pots)
chacunes des valeurs est la moyenne de 4 répétitions.
ISOLEMENTS
ARA G
ARA S
H dégagé
1
ERa
Rendement
-1
Nombre nad.
gHF nod.pl
"",01. C
urne les C
umat.HlCZpJ-
2H
NOM DE
Phéno
1
zH4
-1
-1
-1
-
-1
-1
-1
gMSa pl
-, pl
cot Iec-
types
h
• pl
h
g
MF nad. h
tion
HUP
INRA
b
8
e
g
a
G69
-
35
0,216
l .64
7 , Sg
0,46
o 73
O,339
•
e
d
e
a b
GI7
+
1g
0,1 n b
1 .64
1 l , 12
0,41
o 7g
O,334
•
c
b
bd
a
ab c
G7
+
30
O,I66
1/I,64
2, "'
0,07
0, tH)
0.324
c
a
d
bc d
GAI
-
30
O,213
2,35
JI,02
0,60
o, n f
O,319
1
b
c d
a b
bc d
G46"
+
36
D,l'RAb
2,3 /1
12 , 4S
0,16
O,94
O,317
c d
a b
d
c d
1
GI5
+
2B
0.2343-
4,44
IB,98
0,71
o 84
O,313
•
c
b
bc d
g
c de
G60
-
30
O,I80
2,60
14,44
0,67
o, 74
O,309
.
d
b
bc
e
de
~
G63
-
25
a,IB9
3,02
IS 97
0,56
O,Bl
o 30é
•
•
'"
a b
h
d e f
1
59
-
"c
O,i8l b.
3,42
1B 90
0,97
o 72
o 30l
•
•
•
8
a
b c
c
d e f
G51
-
40
a,228
3,39
14 ,B5
0,46
D,87
O,299
d
b
a
f gh
G62
+
6
25
O,I78
3,47
19,50
0, 17
0.9S
O,294
e
b
d
g
GA2
-
f gh
IB
a,I76
l ,99
II :l4
0,50
O,7S
O,2lU
•
d
b
g
gh
G
-
26
O,l42
3,00
21 , 1o"
0,79
o, 74
O,26/
3
c
b
c q
C
g h
G20
+
26
O,I72
2, 11
J 2 , 27
0,28
a 86
o 276
•
•
b
d
b
gh i
BIS
+
42"
0,16a
l ,84
Il,50
0,13
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O,27S
b
b c d
h i
512
-
3)b
a,162
2,24
13 , 83
0,67
a 71 e
O,269
i
•
b
a b
a
i
G4'
+
36
o 204
3,43
16,81 b
0,07
O,!}6
O,257
•
c
a b
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-
27
O,l90
2,48
'3 OSbcd
,
0,60
o 68l.
0,201 k
•
b
f
c
e
"'
+
43"
0.189
0,87
4 , 59
0,1 1
O,BB
0,150.
-
-
-
-
0,23J 1
T
-
-
Dans chaque colonne,
les chiffres suivis de la même lettre ne diffèrent pas au seuil de
5 % (méthode uNEWMAN-KEULS II )

---

- 54
testés, 19 ont induit une nodulation. Le nombre de nodosités par plante
diffère significativement chez certains isolements. Ceci permet de noter
que les deux isolements obtenus à partir de G62 présentent des infectivités
-1
-1
semblables (G62 A 12 nod.pl
et G62 B
JO nod.pl
). Par contre, les i50-
---
-1
-\\
lemen~s_~~t(t3 nod.pl ,)et GAZ (4 nad. pl
) donnent lieu à une nodula-
tion significativement différente.
Cette dernière constatation montre que la vitesse de croissance
peut avoir une influence sur la nodulation. En effet, ceci vient d'être
signalé par STDWERS et EAGLESHAM (sous-presse) chez deux isolats obtenus
à partir d'une souche à croissance rapide USDA 214 dont l'un, 214 B, à -
croissance rapide présente une infectivitê plus élevée que celle de Z14 A(l'
autre isolement}obtenu i partir de USDA 214) à croissance lente, lorsque
-les deux sont associées aux mêmes plantes-hôtes.
31.3 Nodulation et l'activité réductrice d'acétylène
Le nombre et le poids des nodosités formées par plante nous
permettent d'apprécier l'infectivité de chaque isolecent chez le Soja
(CV HODGSON) oulti.vt en pot de 220 ml.
Dans l'ensemble, nous avons obtenu une bonne nodulation du Soja,
pour tous les isolements testés. Comme 11indique le tableau (111-Z)
le nombre de nodosités par plante varie de 18 à 43, avec une différence
significative entre certains isolements ; la masse de matière fraîche
des nodosités varie également entre les différentes associations de
-1
0,14 à 0,2 g MF nad. pl
•
L'isolement GAZ' classé dernier parmi les isolements ayant
induit la nodulation sur le cultivar HODGSON dans l'essai en tubes de
GIBSON (tab. 111.1) se maintient en dernière place j toutefois avee un
nombre de nodosités par plante beaucoup plus élevé (18 conrre 4 en tubes
de GIBSON).
L'activité réductrice globale d'acétylène (ARA
varie suivant
G)
les associations entre 1,64 et 4,44 umoles C
par heure et par plante ave
ZH4
une différence significative entre certaines associations.

---

- - - - - - - - - - _ .__._-
55 -
Fig·'''.2"
Relation entre le
poidl de m..tiere fraîche
d,u
nodolite$ el
.:
Iac.ljyile redLtctriCIl de
l'aclltylene
pour ['en,.mble
des
ilolements
d. l'eu.;'
'1 = 0,015x-D.\\31
r , Il.11
4
../ 1
• • •
~
..,
• • • •
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• •
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•
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a:
•
•
i
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•
1
1
j
1
oJL----------::-r::------:::-:-------
0,10
0,t5
0,20
1
g MF nad. pr

---

- 56 -
Pour llensemble des traitements. nous observons une corrélation
linéaire positive (y = 0,015 K - 0,138) entre llARA
et la MF nod. avec
G
un coefficient de corrélation linéaire (r = 0,807) hautement significatif
(fig. 111-2). Par contre aucune relation n'apparaît entre l'ARP.
et le
G
nombre de
nodosités.
De façon générale, le niveau de la nodulation et celui de l'ARA
dans notre dispositif de culture sont 20mparables à ceux obtenus le plus
souvent dans les pots de cinq litres sur sable dans les mêmes conditions de
e
serre juqu'à la date du 30
jour après l'inoculation. Le dispositif rete-
nu pour cette expérimentation n'aurait donc aucun effet négatif ni sur
e
la nodulation des plantes ni sur l'ARA des nodosités jusqu'au 30
jour
après le semis.
..
._. ~ -
L'effectivité de chaque association est appréciée par la va-
riation du poids de m~tière sèche des parties aériennes (MSa) exprimé
en gMSa.pl-l
En effet. dès la germination, la seule source dTalimenta-
tian en azote des plantules est constituée par les réserves azotées des
e
cotylédons. A la suppression de ceux-ci, au 20
jour après le semis,
seules les plantules possédant des nodosités fixatrices peuvent s'ali-
menter en azote grâce à la fixation symbiotique et donc continuer
de croître. Llexpresssion de cette différence d'alimentation azotÉe
se traduit par une différence de la masse de matière sèche produite par
chaque plante.
Le tableau de résultats (Tabl. 111-2) montre que le poids de ma-
tière sèche des parties aériennes des plantes varie suivant les asso-
-1
ciations de 0,15 à 0.34 gMSapl
•
Le témoin non inoculé donne un poids moyen de 0,23 gMSapl-1
significativement inferieur au poids de presque toutes les associa-
tions i à l'exception de celles des associations avec 57 et G
G
I•
I"
mutant de G62, induit une~ro.e très p~ononcée sur les plantes aux-
quelles il est associé. 57 êgalement inéfficient (nodosités non fixa-
trices) ne révèle pas de chlorose à ce stade.

---

Fig '"·3' Relation entre le poids de matiere fraîche des nodosites et
la croissance de la plante-hôte pour l'ensemble des isolements
de l'esaa l.
0.25
0.12
0.16
0.20
0.24
gMFnod. pr'

---

Dans cette série de mesures, nous observons que le poids de
matière sèche des plantes est hautement correlé au poids de matière
fraîche des nodosités, en considérant l'ensemble des traitements (fig. 111-3)
Ceei est la preuve que l'azote est le facteur limitant de la croissance
des plantes dans notre expérimentation.
Il n'apparaît aucune relation entre l'ARA et la variation de
matière sèche des parties aériennes. Cela n'est pas surprenant puisque
l'ARA est une mesure instantanée alors que l'évaluation de la quantité
d'azote fixée par son effet sur la croissance de la plante intègre la
fixation de l'azote dépuis son début jusqu1à la date du prélèvement.
L'ARA varie au cours de la journée et au cours du eycle de la pl?nte
ainsi quren fonction des paramètres du milieu. Sa mesure instantanée peut
ne pas refléter l'activité moyenne de l'enzyme pendant la période de la vie
de la plante jusqu'au moment de la mesure. Par ailleurs, l'ARA ne permet
d'évaluer que le pouvoir réducteur potentiel de l'enzyme sans distinguer
la part d'électrons effectivement allouée à la réduction de l'azote molé-
culaire qui est responsable de la fixation symbiotique.
31~ Efficacité relative et activité hydrogénase
L'efficacité relative réelle (ER)' d'un système symbiotique
r
correspond au flux d'électrons effectivement utilisé pour la réduction de
l'azote moléculaire. En l'absence d'hydrogénase, si la quantité de H
dé-
2
gagée est égale à la production de ce gaz, l'ER équivaut au coefficient
d'allocation des électrons à l'azote: d'où sa signification énergétique
(SCHUBERT et EVANS, 1976). En présence d'hydrogénase, la quantité de H2
dégagée ne correspond pas à la totalité des électrons utilisés pour la
réduction des protons, puisqu'une partie de H
formé est recyclé. On
2
mesure alors une efficacité relative apparente: ER
(AR1MA,
1982,
a
DREVON, 1984). C'est ce terme qui est utilisé dans notre étude pour la
mesure de l'ER des nodosités puisqu'il n'est pas certain que l'hydrogène
dégagé correspond effectivement à l'hydrogène synthétisé par la nitrogé-
nase.
Les résultats présentés dans le tableau 111-2, montrent que
l'ERa des nodosités varie suivant les isolements de 0,68 à 0,96.

---

- S9 -
A l'exception de GSI, G63 et GAI, les isolements dont les
nodosités présentent une ERa supérieure à 0.75 se sont avérées avoir
une hydrogéna se active. Les valeurs élevées
des ERa s'expliquent donc
dans ce cas par l'oxydation d'une partie de l'hydrogène formé par la
nitrogénase. Le cas des isolements dont l'ERa est supérieure à 0,75
et pour les_quels aucune activité hydrogénase n'a .: .: été détectée mérite
d'être approfondi car une ERa supérieure à 0,75 en l'absence d'hydrogéna-
se est peu vrais_emblable. En effet dans les conditions optimales
de fonctionnement au moins une molécule de HZ est synthétisée par molécule
de N
réduit (HADFIELD et BURRIS, 1969 ; RlVERA-ORTIZ et BURRIS.
1975 ;
2
HAGEMAN et BURRIS.
1978 ). La proportion d'électrons alloués à la synthèse
de H est d'au moins 25 % ce qui correspond à une ER maximale de 0,75
2
lorsqu'aucune molécule d'hydrogène formé n'est recyclé. I l est possible
que la quantüé d'hydrogène dégagée ait été sous-évaluée par rapport à
l'ARA ou encore qu'une activité hydrogénase était effectivement présente
dans les nodosités mais qu'elle ne soit pas détectée in vitro.
Finalement, parmi les 18 isolements de Rhizobium japonicum~
en excluant G
qui est un mutant de G62 et qui a la propriété d'induire
1
une chlorose chez la plante-hôte. 8 isolements ont le phénotype Hup·
soit 44 % des isolements testés. Le poids moyen de matière sèche des par-
ties aériennes des plantes inoculées avec 8 isolements n1est pas diffé-
rent de celui des plantes inoculées avec les isolements de phénotype
Hup-. De même il n'y a pas de différence significative entre les niveaux
d'ARA des deux types d'isolement de
R. japonicum comme le montre le
tableau 1II-3.
Tableau 111-3. Influence des phénotypes HUP+ et HOP
sur l'effectivité
de la symbiose : Soja (cv. HOGDSON)-Rhizobium japonicum
ARAg
ARAs
Phénotypes
umoles C
H
umoles C
2,
4
2H4
ERa
Msa
-
-1
de,
fonnés 'pl 1. h
fonnésg-!MF
-]
nod. h- l
g. pl
.
isolements
2,76 .... 0,50
14.7 + 2,60
0,90 + 0.04
HUP
2,41 .... 0,50
14,2 + 2,40
0,75 ..... 0.01
0,291 .... 0.01
Les valeurs sont les moyennes de 8 X 4 répétitions pour les isolements
Hup+et la X 4 répétitions pour les isolements Hup: Les: représentent l'é-

---

- 6 0 -
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•
•
•
-

---

- 6
3.1. DISCUSSION
Dans le classement des isolements selon leur effectivit€
(fig. 111.4), ~'isolecent le plus efficient (G69) provoque une augmenta-
tion de rendement de 45 % et le moins efficient (Gq9) seulement 10 I.
Le mutant Gl à cause de la chlorose qu'il provoque sur la plante-hôte
a entrainé une baisse de renùement d'environ 36 % par rapport au témoin
non inoculé. Les huit isolements de phénotype HUP+ parmi les dix-huit
testés se répartissent de la façon suivante pour leur effectivité dans
cet essai
- quatre sont, parmi les huit isolements, les plus efficients.
- deux sont dans le groupe de S1X isolemants,d'efficience moyenne.
- deux sont parmi les quatre souches, de plus faible efficience.
La fréquence du phénotype HUP+, environ 44 7. dans cet échan-
tillon de dix huit isolements de R. japQni~um de la collection de l'INRA
est supérieure A celle de 2S 7. trouvée sur l'ensemble des souches isolées
dans les sols nord-américains (URATSU et at., 1982).
Il apparaît que l'ERa des nodos~tés varie selon l'isolement
de Rhizobium, en restant toutefois supérieure a 0,75 chez les isolements
possédant une hydrogénase. Ceci indique donc que chez ces isolements,
aU moins une partie de l'hydrogène formé est recyclé par l'hydrogénase •
•
Malgré ce recyclage de l'hydrogène, le phénotype HUP
est distribué avec
la même fréquence parmi les isolements les plus efficients et les moins
efficients sur le cultivar HODGSON. On remarque de plus que dans le cri-
blage réalisé au champ (LAGACHERIE,
1979). la fréquence du gène Hup n'est
pas plus élevée parmi les isolements les plus efficients que parmi ceux
qui ont l'efficience la plus faible.
Des résultats opposés ont été trouvés avec d'autres cultivars
de Soja dans des conditions différentes en serre (ALBRECHT et aL,
1979
ZABLOTOVITCH et aL,
19BO) ou au champ (HANUS et aL,
19B1), ainsi qu'avec
Vigna radiata (PAHWA et DOGRA, 1981).
L'hypothèse d'un effet ~énéfique du recyclage de l'hydrogène
dans ces associations n'apparaît pas en accord avec les observations

---

dans les essais que nous avons réalisés. Il est toutefois possible que les
résultats obtenus sur un type d'association ne soient pas transposables
à d'autres associations.
~éanmoins, des résultats similaires aux notres ont été obtenus
sur d'autres espèces de légumineuses inoculées avec divers isolements
de Rhizobium de phénotype Hup+ et Hup
du groupe correspondant de spéci-
ficité. Sur le pois (~sum sativum) , le rendement et la teneur moyenne en
azote de douze associations Hup+ ne sont pas différentes de ceux de seize
associations Hup
(NELSON et CHILD, 1981). Ce résultat a été confi~é
récemment dans un essai du même type- avec d'autres isolements de Rhizobium
L4guminosarum (NELSON, 1982). Sur le pois d'angole (Cajanus cajan)/ seul
un isolement parmi
les trois isolats Hup+ testés a une effectivité
supérieure à l'isolement Hup- de référence (LAFAVRE et FOCHT, 1983).
e
Dans cet essai où les plantes sont récoltées au 30
jour après
l'inoculation, la durée d'effet de l'activité nitrogénase est brêve
e
puisqu'elle ne débute généralement que vers le 20
jour. La précocité
ou l'intensité de la nodulation, plutôt que l'activité spécifique des
nodosités, seraient les facteurs déterminants de la nutrition azotée
des plantes dans ces conditions. C'est ce que semblent indiquer les cor-
rélations observées
d'une part entre la matière fraîche des nodosités
et l'activité réductrice d'acétylène (fig. III-2) et d'autre part entre
la matière fraîche des nodosités et le poids de matière sèche des parties
aériennes.
Cette dernière corrélation montre que la quantité totale
de nodosité est un facteur essentiel de la quantité totale d'azote fixé.
Ainsi, sans toutefois négliger l'importance de l'activité hydrogénase dont
le rôle physiologique n'est pas encore compris, il apparaît nécess~ire
de prendre en compte d'autres facteurs génétiques comme la précocité ou
l'intensité de la nodulation dans la sélection de souches sauvages en vue
d'améliorer la fixation symbiotique de l'azote moléculaire.

---

- 63 -
IV - INFLUENCE DE LA TENEUR EN NITRATE
DU MILIEU DE CULTURE SUR LA FIXATION DE
L'AZOTE MOLECULAIRE
4.0. INTROOUCTION
Chez le Soja, l'assimilation de l'azote minéral surtout du nitrate
pourrait être concurr~te de la fixation_.symbiotiaue de l'azote.
moléculaire. L'hypothèse d'une inhibition de la fixation par_.,la fumure
azotée est le plus souvent évoquée pour expliquer la faible activité
fixatrice du soja dans les conditions du champ.
Les quelques travaux qui portent sur ce sujet montrent l'exis-
tence d'une relation très complexe intéressant de nombreux facteurs (la
plante-hôte, le Rhizobium, la forme ou la teneur de l'azote minéral.
la période d'apport de cet azote minéral et l'environnement pédoclimati-
que).
Dans ce chapitre, nous avons donc trouvé intéressant d'étudier
les types de relations qui peuvent exister entre d'une part, la concen-
tration d'azote minéral du milieu de culture et la nodulation, d'autre
parS la forme et la teneur de l'azote minéral du milieu de culture sur
la fixation de l'azote moléculaire chez le cultivar HODGSON en associa-
tion avec la souche G
de R. japoniaum.
3
4.1. Résultats
41.1 Influence de la dose d~ N0
sur le développement et
3
la nodulation du Soja en culture hydroponique.
L'influence du nitrate sur le développement et la nodulation
a été évaluée sur des plantules de soja (cv. HODGSON) cultivées sur
milieu liquide aéré en association avec la souche G
de R. japoniaum
3
(cf. 222.3) en présence de différentes doses de N0
depuis le semis •
3
•
Le 28
jour après l'inoculation, les plantes ont été récoltées
et les racines examinées pour évaluer la nodulation. La croissance des

---

r
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o
3
6
1
,.1
mEq HOj

---

plantes est apprec~ee par la mesure du poids des matières sèches des
parties aériennes (MS a) et des racines (MSr). La matière sèche totale
(MSt) est la somme de MSa et MSr.
Le poids de matière sèche des racines et des parties aériennes
augmenteNrégulièrement avec la dose de~nitrate jusqu'à la dose de 6 meq
NO) /1. Au dessus de la dose de 6 meq. N0
l'accroissement du poids
3-,
des plantes devient presque nul'
Le poids de matière sèche obtenue
avec la dose de 15 m Eq. N0
(4,61 ! D,Il) gKSt/pl) ne diffère pas
3-/1
significativement de celui des 6mEq.N0
(4,49 ! 0,12 gKSt/pl). (fig. IV.
3-/1
Les doses de 1,5 et 3 mEq.N0
stimulent la nodulation alors
3-/1
que 6 et 15 m Eq.N0
l'inhibent sévèrement (figure IV-2). si le nom-
3-/1
bre de nodosités (128 ! 10) par plante obtenu avec 1,5 me q.N0
n'est
3/1
pas significativement différent de celui obtenu avec la dose de 3meq.N0 3-/1,
le poids de la matière sèche des nodosités induites en présence de
1,5 meQ.N0
est significativement supérieur à celui obtenu en présen-
3-/l
ce de 3 meq.N0
/1. Cet~e différence est certainement dûe à un effet
3
dépressif des 3 meq.N0
sur le développement des nodosités (HARPER et
3
COOPER, 1971 ; MILLER et al: J ' 1982).
41.2 Influence de la dose de NO)
sur l'activité nitrate réduc-
tase (ANR).
L'influence de la dose de NO)
sur l'ANR a été évaluée sur des
plantes nodulées et cultivées en hydroponique en présence de différentes
doses de NO)
dépuis le semis (âge des plantes 30 jours).
L'1L~ exprimée en g de matière fraîche (Fig. IV-3) augmente avec
la teneur en nitrate de la solution nutritive comme l'ont déjà signalé
de nombreux auteurs (BEEVERS et HAGEMAN, 1969 ; ROBIN et aZ., 1979 ;
HATAM, 1980). Sans apport de nitrate. l'ANR spécifique est très faible
mais elle n1est pas nulle. Cette présence dlANR chez les plantes ne rece-
vant pas de nitrate peut s'expliquer soit par l'existence d'Une enzyme
constitutive en faible quantité, soit par nos conditions de culture qui
n'exclu~pas la présence de trace de nitrate suffisante pour induire une
ANR faible chez ces plantes.
Le poids des plantes nodulées est fortement correlé à l'ANR
alors qu'aucune relation entre la croissance et la nodulation n'a été

---

- 66 -
Fig.
IV.)
Relation entre l'activité nitrate-réductase spécifique
(A~~s) et la d~se de N03-.
10
-
-,'"-'.c,N0Z-QE5'"~•'"Z..
o
3
6
15
Fig.
IV.4
1
o
2
4
6
a
10
1
ANRs (~mQI. 'loi! 111.g- )

---

observée. Cela signifie qu'à l'âge où les plantes sont récoltées,
la fixation de l'azote est encore insuffisante pour permettre la crois-
sance des plantes.
41.3 Influence de la dose du N0
sur l'activité nitrogénase
3
Les mesures ont été effectuées sur des plantes de soja (cv.
HODGSON) inoculées avec la souche G
et cultivées sur sable dans des
3
pots en plastique de S litres munis d'un dispositif de drainage (cf. 222.4).
Pour maintenir toutes les plantes dans les mêmes conditions physiologi-
ques. Nous avons apporté une dose de \\,5 meq. N0
Il dans chaque pot de-
3
puis le semis. Les diff~rentes doses de N0
sont apportées aux plantes
3-
48 h avant les mesureS après avoir abondamment rincé le sable. Seule
e
la mesure du 34
jour (essai du 7/4/83 et du 8/6/83) échappe à cette rè-
gle, puisque dans ce cas, les échantillons du traitement sans azote sont
des plantes qui n'ont reçu aucun apport de N0
' contrairement aux au-
3
tres traitements où toutes les plantes ont reçu \\,5 mEq.N0
depuis
3-/1
le semis. Toutefois à cet âge toutes les plantes sont analogues et donc
les résultats peuvent être comparés entre eux.
Les résultats de deux essais (A : essai du 7/4/83 au 8/6/83
et B : essai du 2919/83 au 411184) montrent que la réponse aux différentes
doses de N0
varie suivant les stades de développement des plantes.
3
Avarit la floraison, stade V
(fig. IV.sA) ou V
(fig. IV.sB)
2
3
nous observons une baisse de l'ERa sous 3 ; 6 et 12 m.EQ.N03-/1.
A la floraison (V
et V
lIERa est peu affectée par les
4R1
7R2),
différentes doses de N0 3
A la formation des gousses (V
et V
nous observons une
SR3
1sR4),
augmentation de lIERa sous 1,5 mEq.N0
tandis que les doses élevées
3-/l,
de N0
provoquent une baisse de l'ERa.
3-
Les variations de l'ERa s'expliquent pour \\,5 mEq.N0
par
3
une augmentation de l'ARAs (fig. IV.6
A et B) plus forte que le dégage-
ment d'hydrogène moléculaire (fig. IV- 7 A et B) ; pour les doses supé-
rieures ~ 3 mEq.N0
par une inhibition forte· de l'ARAs tandis que l'émis-
3

---

-68
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o
J
6
9
12
1
B
o
3
6
9
12
mEq NOjr
Fig.IV.?
Effet du NO)
sur le dégagement de H
2
A
essai du 7/4/83 au 8/6/83
B
essai du 2919/83 au 411184

---

1
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3
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4
•
1 1
10
Do. . .
mlq r
fig.IV.8
Effets comparés du N0
+
et de NH
3
4
-e
o
c 30
"-
:lE
" " ,
. " ,
•
:r 20
~
u
o
E
.. 10
~
oL_~_~_~_--::,:""""_--=_-:::
_ _~
o
20
40
60
80
100
120
Nbre d'heures depuis le 1·' apport de NOj
Fig.IV.9
Evolution de l'ARA en présence (0 ) ou en l ' ab~An~._'-. )
de 22,5 mE~.N03 1 i ( arret.après éD heures)
.
1
_

---

- il
sion de H
est peu affectée par les doses croissantes de ~03 .
2
Dans un autre essai, l'effet de doses croissantes d'azote
combiné sur l'ERa est mesuré sur des nodosités prélevées Sur des plantes
âgées de sa jours, en début de la formation des gousses. Nous avons
distingué, cette fois, la forme nitrique de la forme ammoniacale de
l'engrais azoté.
L'effet inhibiteur de NH + sur l'ERa est moins fort que celui
4
du NO]
pour une même dose; de pl~s il ne devient significatif qu'à
partir de 7,5 mEq.NH + dans :a solution nutritive, tandis que dès
4
2,5 mEq.NO) , liERa des nodosités ~aisse. (Fig. IV.8).
4\\.4 Inhibition de l'activité nitrogénase par une dose élevée
de NO)
Les mesures sont faites sur des plantes en début de floraison.
cultivées sur sable avec I,S mEq NO) /1. ~ix jour~ avant les mesures,
le sable est abondammeat rincé et l'apport du NO)
arrêté. Le jour mê-
me des premières mesures, la moitié des pots reçoivent une dose de
22,5 mEq.N0
Cette dose est maintenue co~stante pendant t~ois jours
3-/l.
de suite puis l'apport est arrêté mais le sable n'est pas rincé.
Les rêsultats montrent que l'inhibition de l'activité de la
nitrogénase n'est significative que 24 heur-es après le cêbut de l' apport.
du nitrate (fig IV.9). Cette inhibition disparatt 24 heures après
l'arrêt de l'apport du nitrate (fig. IV.9).
4.2. Discusion
Les réSultats présentés dans ce chapitre indiquent que dans
les conditions de nos essais :
- les doses supérieures à ) meq.No)-/l inhibent la nodulation
et l'activité nitrogénase.
- la dose èe 3 meq.NO) /1 n'inhibe pas l'induction de la no-
dulation mais inhibe la croissance des nodo~ités.

---

- 72 -
- la dose de \\,5 meQ.N0
stimule la nodulation et dans
3-/1
certaines conditions l'activité nitrogénase.
HERRIDGE ( 1982) signale une inhibition de la nodulation
-
et de la fixation de N par
Z
1• 5 et .3 mM NO} /1 chez le Soja (cv. BRAGG) cul-
t Lvê sur du sable et inoculé avec R. jerponicwn. souche CB 18Dg.Cette
différence est due soit aux techniques de culture soit à une différence
de sensibilité au nitrate des souches utilisées dans les deux cas.
Néanmoins, une stimulation de la nodulation du SOJa par les
faibles doses a été mentionne par plusieurs auteurs (DART, 1974
THIBODEAU
et JAWORSKI,
1975 ; TANNER et HUME. 1978, FRANGO et aZ.~ 1979
JATIMI-
LIANSKY et az..~ 1982; Mc NEIL, 1982). Cet effet bénéfique du nitrate
sur la nodulation a été également signalé par HEICHEL et VANCE (1979) chez
la luzerne, par BOURGUIGNON (1981) chez la féverole.
Les mécanismes par lesquels le nitrate agit sur la nodulation
sont mal connus. Certains auteurs pensent que le nitrate agirait en faibles
doses, en favorisant la photosynthèse (WILLIAMS et PHILLIPS, 1980;
JATIMILIAN5KY et al-...
1982) ou par une action directe en favorisant la
multiplication du Rhizobium dans la rhizosphère (HERRIDGE et ROUGHLEY,
1975).
L'inhibition de la nodulation par les fortes concentrations
en nitrate du milieu d~ culture a été fréquemment observée. DAZZO et
BRILL (1978) notent une inhibition par le nitrate de la nodulation du
trèfle blanc inoculé avec R. trifoLii et suggèrent que cet ion agirait
sur le taux ou la composition des lectines responsables de l'adsorption
des bactéries sur les poils absorbants des racines. La destruction de
l'AIA (acide indol.3.acétique), l'auxine qui interviendrait dans le
processus de nodulation, en présence des ions N0
issus de la réduction du
2
nitrate par les Rhizobium est aussi évoquée C~~-
RIGAUD, 1976).
D'après certains auteurs, le nitrate inhiberait pl~'tSt la croissance
et le développement des nodosités que l'infection des racines par le
Rhizobiwn (HARPER et COOPER, 1971 ; MILLER et al:...
1982).
Si l'effet inhibiteur des doses élevées de N0
sur l'ARA
3-
spécifique et l'ERa des nodosités apparaît bien établi, il n'en est pas
de même d'un éventuel effet stimulateur de cet ion en doses faibles

---

- 73 -
(fig. IV-5 et IV-6) : celui-ci pourrait dépendre du stade de développe-
ment des plantes puisqu'il nta été significatif qu'au stade de formation
des gousses.
Dans ces essais où les plantes n'ant reçu le nitrate que 2~ heure~
avant le début des mesures, l'effet négatif des doses élevées pourrait
s'expliquer par une compétition entre la fixation symbiotique et l'assi-
milation du nitrate pour l'énergie. En présence de N0
• l'activité nitra-
3
te réductase de la plante, qu'elle soit localisée dans les feuilles ou
dans les racines, provoquerait une baisse de la fourniture des glucides
aux nodosités (GIBSON et al.~ 1981). Le ralentissement consécutif de la
synthèse d'ATP et de NADPH dans les bactéroides serait la cause de la
baisse de l'activité nitrogénase (ALLISON et LUDWIG, 1939).
Cette compétition entre les activités nitrogénase et nitrate
réductase pourrait s'exercer également au niveau des nodosités. En effet,
en présence de nitrate, on observe une forte activité nitrate réductase
dans les nodosités (STREETER, 1982
HUNTER, 1983). L'utilisation de NADPH
et d'ATP par cette activité pourrait ralentir l'accumulation d'électrons
par le composant l de la nitrogénase et il en résulterait une baisse de
l'ER de l'enzyme (STREETER, 1982).
Selon une autre hypothèse, l'activité nitrogénase serait inhi-
bée par une accumulation d'ions NO
due à une activité nitrate réductase
Z-
dans les nodosités. L'ion N0
agirait soit par inhibition spécifique
2-
du composant l de la·nitrogénase (TRINCHANT et RIGAUD, 1981) soit par
inhibition de la léghémoglobine, responsable du transfert de l'oxygène
aux bactéroides (RIGAUD et PUPPO, 1977).
L'effet positif des doses faibles sur l'activité nitrogénase
des nodosités, observé 24 heures après l'apport s'expliquerait par l'in-
duction d'une activité nitrate réductase dissimilatrice des bactéroldes
dont le substrat jouerait le rôle d'accepteur d'électrons de la chaine
respiratoire (WHATLEY,
1978). Dans ce cas, le nitrate constitue un ac-
tivateur de la synthèse d'ATP, dans la mesure où celle-ci est limitée
par le manque d'oxygène dans les nodosités incubées dans l'air (RIGAUD
et aL.# 1973 ; DREVON, 1984). L'augmentation de la synthèse d'ATP qui
en résulterait favoriserait l'activité nitrogénase et son allocation d'é-
lectrons à l'azote moléculaire. Toutefois, cette hypothèse suppose que
l'effet inhibiteur de N0
sur la nitrogénase pour une telle concentration
3

---

- 74 -
soit inférieure à cette stimulation.
A dose égale, l'ion ~03- n'a pas le même effet sur l'activité
nitrogénase que l'ion NH + . Une fois absorbê, l'ion ffi1 + est immédiate-
4
4
ment incorporé dans un squelette carboné. En absorbant directement ce
cation la plante évite une dépense énergétique de 15 ATP nécessaire à
la réduction du NO)
Ce coût de réduction du ~03
serait voisin de
celui de la réduction de N pour une efficacité relative de 0,75 (SAL5AC
Z
et al., 1984).
Par contre, en nutrition purement ammoniacale la plante ne dis-
pose pas de N0
anion minéral qui s'accumule en abondance (avec K+)
3-,
dans la vacuole. Par ailleurs Ifabsence de réduction du nitrate conduit
à une forte diminution de la synthèse des acides organiques (essentiel-
lement l'acide malique). Dans
ces conditions ce sont des acides aminés
provenant de l'incorporaticn directe de ~~4+ qui s'accumulent dans la
vacuole. Cette accumulation d'azote aminé et amide soluble correspond
donc à un détournement du carbone réduit provenant de la photosynthèse
ou de l'azote réduit provenant de l'absorption de NH + ou de la fixation
4
ce détournement est sans doute responsable des diminutions de croissance
souvent observées en nutrition ammoniacale comparée à la nutrition ni-
trique (KIRBY et MENGUEL. 1967), Ce processus explique sans doute que,
malgré son avantage énergétique (économie de la réduction de N0
l'a-
3-)
limentation ammoniacale soit généralement inférieure à l'alimentation
nitrique.
Néanmoins en ce qui concerne l'inhibition de la fixation, la
réduction du nitrate outre son action directe sur la physiologie des
nodosités, par exe~ple la production de N0
qui bloquerait la fonction
2-
de transport d'oxygène de la léghémoglobine. consomme une très forte
quantité d'énergie. Cette consommation excédentaire pourrait aussi expli-
quer les dioinutions de l'activité nitrogénase plus importantes en ali-
mentation nitrique qu'en alimentation ammoniacale.

---

- 75
v- EVOLUTION COMPAREE DES ACTIVITES NITRATE-REDUCTASE ET NITROGENASE DU SOJA'
-------------------------------------------------------------------------
5.0 INTROOUCTION
A l'instar des autres légumineuses, la nutrition azotée du
Soja ne dépend pas uniquement de la fixation symbiotique mais aussi de
l'assimilation de l'azote minéral, surtout du nitrate du sol. Après
épuisement des réserves de la graine, l'alimentation azotée de la plantule
est assurée par le nitrate avant que la symbiose ne soit efficace (HARPERe~
~AGÉMANJI972). L'étude de ces deux voies d'utilisation de l'azote par
la plante est importante, car l'azote minéral du sol peut être complé-
mentaire ou concurrent de la fixation de l'azote atmosphérique.
Cette étude concerne les résultats observés sur des plantes
cultivées en serre et au champ. En serre deux semis sont effectués dont
l'un en avril et l'autre en septembre. L'inoculation est effectuée avec
la souche G
Les traitements sont les suivants :
3,
N+
-
. pour le premier essai
apport continu de 1.5 mEQ N0
/1
3
dépui s le semis
-
N l , arrêt de l'apport de 1,5mEq. NO
/1
e
3
à partir du 60
jour après le semis
N 0: Aucun apport de N0
dépuis le sema
3
pour le deuxième essai : la seule modification apportée aux
traitements précédents est le remplacement de la dose de l,5mEQ.N03-/1
par 3mEq.N0
/1.
3
Au champ le semis est effectué en mai et les traitements sont
les suivants
apport de 135 kgN,
/ha (15 kg tous les 12 jours) dépuis le semis
inoculation avec la souche G3•
+ -
N R
apport de 135 k~~.
/ha (15 kg tous les 12 jours) d~puis le semis
pas d'inoculation
- +
N R
pas d'apport d'azote; inoculation avec la souche G3
N R
pas d'apport d'aZote ; pas d'inoculation

---

- 7n.
A
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MG
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1 panir du 60" jOl>t
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Boune. ; RG , rnrpU
de. go ..nu ... tIC , ...""riol
phy.iologiq ... dei go"
.
)

---

- 77 -
5.1 RESULTATS
51.1 Activité nitrate réductase
1 b 1
i
f
"lles mesurée selon la
L'activité nitrate r~ductase g 0 a e
es
eu~
méthode in vitro présente, en serre co~ au champ, une évolution sou-
vent observée (HARPER, 1972 ; OBATDN et al., 1982) avec un maximum en fin
de floraison ou pendant la période de formation des gousses (fig. V1A et
V2A).
Les plantes nodulées et ne recevant pas de fumure azotée ont
une activité nitrate réductase moins élevée que celle des plantes recevant
de l'azote. Au champ, l'activité nitrate réductase des plantes n'ayant
pas reçu de fumure azotée n'est inférieure à celle des plantes fertili-
e
e
sées qu'entre le 50
et 85
jour après le semis, soit pendant la phase
de formation des gousses.
L'activité nitrate réductase spécifique des feuilles semble
présenter deux maxima: le premier à la phase cotylédonnaire (fig. V1B~'
et le deuxième à la fin de la floraison ou au début de la formation des
gousses (fig. V
et V
Mais ces deux maxima sont d'intensité très
1B
2B).
inégales dans ces conditions expérimentales.
Les nodosités possèdeot une activité nitrate réductase spécifi-
que beaucoup plus importante que celle des racines et même que celle des
feuilles, au début du remplissage des gousses (fig. V
Mais compte
3A).
tenu de la masse de ces différents organes, l'activité des feuilles devient
évidemment très supérieure à celle des nodosités qui est pratiquement
identique à celle des racines (fig. V B). Des résultats semblables
3
ont été observés par HUNTER (19~3) chez un autre cultivar de soja (cv.
Tracy) inoculé avec la souche de Rhizobium jcpon~ USDA ItO et cultivé
sur Perlite en présence de 0,75 mM N0
Comparée à l'activité nitrate
3-/l
réductase globale des feuilles, l'activité de l'ensemble des organes sou~
terrains (racines et nodosités) est très faible pendant la majeure partie
du cycle de développement des plantes. Toutefois, nous observons qu'elle
n'est pas négligeable pendant la phase -de remplissage des gousses où l'ac-
tivité globale foliaire ne représente plus que 75 % de l'activité nitrate
réductase globale de la plante (tableau V.l).

---

."
RG
7B.-
MG
15
-....Q.
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<1>
-0E
•
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0-
•
0
r-r-r-:
• ,
,
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20
40
60
80
100
1 0
.
Jours
apres
semis
F
FG
15
B
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~'"'" 10
n
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z
•
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0
5
E
"
o
20
40
60
80
100
120
Jours
après
semis
hg. V.2
Evolution de l'activité nitrate réductase g:obale ( A ) et
spécifique (B) au =aurs du cycle de développement du soja
(cv. HODGSON) cultivê au champ en fonction de traitements
c- ) apport de 135 kg N
Iha (15 kg tous les 1Z jours) et
inoculé avec la souche G) •
( ..
apport de \\35 kg N
Iha (15 kg tous les 12 jours) .c
non inoculé.
(':])
ON
Ihs {Le sol contient 0,96 % N total Kjeldahl)
et inoculé avec la souche G ,
J
F : floraison; FG : formacioo des gauss ••
RG
remplissage
des gousses ; MG : ~aturité physiologique des gousses.

---

Tableau V.l:
Répartition de l'ANR des différents organes du Soja (cv. HODGSON)
inoculé avec R. japonicum (G3) cultivés sur sable en présence de 3 meq oN0 - / 1 depuis le semis.
3
Les valeurs sont les moyennes sur 6 répétitions (2 p Len t e s X 3 0.0.) par échantillon.
Age des
stades
part. des
plantes jours phênc l ogd quesl
nodosités
Racines
Feuilles
1 feuilles en
après semis
%del'ANRT.
31
V
0,54 :: 0,10
L,51 ~ 9,23
8,44! 1,31
8qr,5! 1,6
3
'"
...
43
V
3,/3:0,10
5,78 ± 0.4]
40,65 ± 2,4
82,0
! 2,9
7R2
65
VII R
6, 96 ~ 0.56
3,87 + 0,82
50,60 + 4,0'
82,5 + 4,5
3
90
V 16R5
6,34: 0.72
2.52 ~ 0.20
26,36 ± 4.0
75,0 +: 2,4
: x représente l'écart type
Les stades phénologiques sont dêcrits suivant le modèl~ de FEHR. Crop. Sei. nO Il (6) pp. 929-930,
1971. (voir annexe 9)

---

-80 -
6
'lsR •
A
V.
V'7RZ
Vul1.a
Nodosites
~
~
:lE
~ '" 4
- " ,
, N
0Z
ci
Feuilles
E
2
a
-~'"
0
Racines
Z
<l
0
20
40
60
80
100
Jours aprè s
semis
50
B
•
40
,
-rQ.
i
,
-:co 30
Ô
•
Feuilles
z
o
~ 20
1
'"
'"
Z
\\
<l
.
10
:Nodosltés 1
Racines
1
1
,
,
~-~-~~~'::--
o
==:::-::-;;--
100
80
o
20
40
60
Jours apres
semis
Activité nitrate réduct~se des différents organes chez le
soja (cv. HODGSON) inoculé avec la souche Rhizobium japonicum
(G
à différents stades de développement
V
stade feuilles):V
3)
3(
7
R
adultes pleine floraison) ;V
des
2(feuilles
11R3(formation
gousses)
;V
(remplissage des gousses)
16RS
(A) activité nitrate réductase spécifique (ANRs)
(B) ANR globale

---

- BI
ème
L'arrêt de l'apport de NO)
au 60
jour après le semis n'en-
traîne pas une chute immédiate de l'activité nitrate réductase foliaire
(fig. V.l), Ceci pourrait sl exp l i quer par une remobilisation des ions
NO)
accumulés dans les vacuoles.
La comparaison de l'activité nitrate réductase des feuilles si-
tuées à différents étages sur une même plante indique que :
- les feuilles situées au sommet de la plante ont une activité
spécifique très élevée. Mais, à cause de leur faible masse. celle-ci
ont une activité nitrate réductase par feuille plus faible que celles
situées en dessous (fig. V4).
•
- la part des trois premières feuilles situées au sommet de
la plante baisse régulièrement au cours du cycle de développement de la
plante pour devenir presque insignifiant par rapport à l'activité nitra-
te réductase foliaire globale au stade remplissage des gousses (fig. VS).
51.2 La nadulation
Le nombre et le poids de matière sèche des nodosités par plan-
te à différentes périodes du cycle de développement permettent de suivre
l'état de la nodulation des plantes soumises aux différents traitements.
En serre, les pre~eres nodosités sont visibles 10 jours après
e
l'inOculation mais elles ne deviennent fixatrices qu'à partir du 20
jour
(coloration rose de la section). Pour les traitements N - et N+, le
O
nombre de nodosités par plantes n'est pas différent et reste constan~
jusqu'à la fin de la floraison puis une deuxième vague de nodulation
apparaît 70 Jours après le semis. La suppression de l'apport de NO)
(Nt) induit une troisième nodulation (fig. V.6A). Quant à la matière
sèche des nodosités, elle augmente régulièrement jusqu'à la fin de la
deuxième vague de nodulation pour le traitement NO
et pour les autres
"traitements jusqu'à la fin du remplissage des gousses (fig. V.6B).
Au champ, les prem1eres nodosités sont observées sur le trai-
tement sans azote-engrais (N-R+) 22 jours après la levée et )0 jours
après pour le traitement avec apport d'engrais azoté. Cette nodulation
est restée très faible jusqu'à la fin de la floraison, puis elle démarre

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Fig. V
Activité nitrate réductase de chaque feuille chez une plante
4
donnée au champ (A) ou en sene (H). Chaque point représente une
moyenne sur deux plantes. Les feuilles sont numérotées du sommet
v~rs le bas (Je ln !Ilnnte.

---

1007.
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Jours après
semis
Fig. VS:
Part des trois premières feuilles par rapport à l'a~tivitébitra~
reductasefoliaire globale de la plante de soja (cv. HODGSON)
.() serre semis au printemps (apport continu de 1.5meq.N0 /1)3
( 0 )
. serre semis en automne (apport continu de 3 meQ.N03-/1)
(
)
culture au champ
Culture soja
Les stades phénologiques sont notés selon le modèle de FEHR,1971,
N" 11. vol. 6 pp. 929-930.
(voir annexe. 9)

---

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- 85 -
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à la fin de la floraison pour N
R
et a partir du milieu de la fo~a-
tion des gousses pour N+R+ soit avec un décalage de la jours
entre
les deux traitements. Pour le traitement N-R+ une troisième vague de
nodulation a lieu à la fin de la formation des gousses.
(fig. V7A).
Les plantes non inoculées ne portent aucune nodosité
ce qu~
indique que ces sols ne portent pas de Rhizobium spécifique.
Le poids de matière sèche des nodosités croît régulièrement
en fonction du nombre de nodosités formées par plante sur le cycle de
développement jusqu'à la maturité physiologique des gousses. (fig. V.7B).
51.3 l'activité nitrogénase
513.1 Evolution de l'activité réductrice d'acétylène au cours
du cycle de développement du soja.
En serre comme au champ, l'êvolution de l'activité réductrice
d'acétylène au cours du cycle de développement du soja présente un pro-
fil similaire avec un maximum bien marqué. Dans les deux cas l'activité
fixatrice diminue rapidement pendant la période du remplis6age des gous-
ses (fig.V8 etV9) ce qui est en accord avec de très nombreuses observa-
tions antérieures (HARPER, 1972
DECAU et al., 1975 ; RIGAUD 1976 j
DBATON et aZ., EAGLESMAN, 1983).
Malgré cette tendance, l'activité fixatrice montre des différen-
ces d'intensité selon les conditions de culture et les traitements.
En serre, l'apport continu de 1,5 meq. de NO)
ne semble pas
diminuer la fixation et semble même la favoriser pendant la période de
formation des gousses (fig. V.BA). L'arrêt de l'apport de nitrate à par-
e
tir du 60
jour semble même favoriser celle-ci. Ce résultat est confirmé
par les expériences réalisées avec des solutions contenant) meq.1-1 de
nitrate: l'apport continu modifie peu l'activité réductrice d'acétylène
e
sur l'ensemble du cycle; un apport temporaire jusqu'au 60
jour de
culture l'augmente sensiblement (fig. V.BB).
Au champ, l'activité réductrice d'acétylène est maximale à la
phase de formation des gousses (en l'absence d'apport d'engrais azoté) ou
au début de la formation des graines (en présence d'engrais azoté) et ce

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Jours
après
semis
Fig. V.ID
Evolution de l'efficacité relative apparente (ERs) des
nodosités de l'association R. japonicum CG
x soja cv. HODGSON
3)
Culture sur sable en serre en présence de ],5 meq.N0 3-/1
depuis l'inoculation.
F : floraison ; FG : formation des gousses ; RG : remplissage
des gousses ; MG : maturité physiologique des gousses •
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- 39 -
maximum se maintient jusqu'à la fin de la formation des graines (fig. V.9).
513.2. Evolution de l'efficacité relative de la nîtrogénase
au cours du cycle de développement du soja.
Les mesures sont faites seulement sur des nodosités des plan-
tes recevant continuellement 1,5 mEq.N0
/1 d~puis le semis à cause
3
de l'état physiologique excellent de ces plantes.
Les résultats obtenus permettent de distinguer trois périodes
du cycle de développement du soja pendant lesquelles l'efficacité re-
lative apparente (ERa) des nodosités diffère significativement (fig. V.10):
Au stade de développement végétatif jusqu'au début de la
floraison
période pendant laquelle l'ARA croît régulièrement, liERa
croît aussi.
- A la floraison jusqu'à la fin de la formation des gousses,
période d'ARA maximale; l'ERa est maximale.
Au stade de remplissage des gousses jusqu'à la maturité phy-
siologiques des gousses, LIERa baisse.
Des résultats semblables ont été observés par DREVON (1984)
sur la même association (R. japonicum G3 x G.max cv. HODGSON) au champ.
51 .4 Croissance et rendements du soja en fonction des trai-
tements agronomiques.
La croissance des plantes est mesurée par la masse de matière
sèche de la partie aérienne (MSa). Cette partie aérienne comprend les
organes végétatifs (tiges, feuilles, pétioles) et les organes reproduc-
teurs (gousses). En serre comme au champ, la croissance évolue selon
une courbe classique (fig. V.11 et V.12). Elle est assez régulière en
début de végétation, présente une phase exponentielle pendant la période
de reproduction (floraison, formation et remplissage des gousses.)
Cette croissance rapide est suivie d'un ralentissement à la fin du re~
plissage des gousses, puis dlune baisse coincidant avec la chute des
feuilles.

---

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Tableau V.2
Récapitulatif des rendements en graines de soja (cv. HODGSON) en fonction des différents
traitements. Les valeurs sont les moyennes de la ou ,20 plant~s.
Champ
serre l
serre II
semis au printemps
semis en automne
inoculation
non inoculation
- '
inoculation
inoculation
Traite-
135kgN/
OkgN/ha
135kgN/
OkgN/ha
1,5meq.
Omeq.
Omeq.
3meq.N0
Omeq~NO; Omeq.N0 Ï1
3
3
ha
- /1
o -/1
/l
ha
N0 - /1
N0
depufs /1 après depuis
ments
+
+
3
3 .
3
epU18
semis
60 jours semis
inoculat inoculat.
après 60j emi ....
Rende-
_14,64
16,08
6,21
4,39
13,56
J3.39
3.09
24,la3
22,92
2,75
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ments en
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+
+
+
+
+
+
+
+
+
graines
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-
-
-
-
-
-
-
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1.64
o 60
o 74
3 0
2.20
o 59
-r u
o 00
n '.0
•
+
233,5
266,3
41.5
-
338,8
333,3
-
788,la
733,5
-
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+ Variation des rendements par rapport aux témoins (%)

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En serre, l'apport continu de 1,5 mEq.N0
Il depuis le semis
3
présente un effet favorable sur le développement des plantes (fig. V.l1A)
et sur le rendement en gousses (fig. V.11B) comparativement au traite-
ment sans nitrate. Lasuppression de l'apport du nitrate à partir du
e
GO
jour après le semis ralentit le développement des gousses (fig.V.l1B)
et accélère la chute des feuilles.
(fig.V.11A).
Au champ, la croissance des plantes recevant une fumure azotée
e
e
(N+ R+ et N+R-) est relativement plus rapide entre le 57
et 85
jour
après le semis, que celle des plantes ne recevant pas d'engrais azoté.
Cette différence de croissance est sans doute dûe à une insuffisanee
e
de la nutrition azotée. Au delà du 85
jour après le semis, la différence
devient très nette entre les courbes de croissance des plantes en fonc-
tion des traitements (fig. V.12A).
L'évolution de la matière sèche des gousses, au cours de la
phase de reproduction des plantes, montre une influence très nette de
l'inoculation par rapport à l'apport de l'azote sous forme d'engrais
chimique (fig. V.12B).
5.2 DISCUSSION
Les résultats obtenus en serre montrent que les activités
nitrate réductase et nitrogénase par plante augmentent parallèlement
à la croissance des plantes jusqu'à la fin de la floraison puis chutent
au moment du remplissage des gousses (fig. V.13 et V.14). La présence
simultanée de ces deux activités suggère que dans certaines conditions
lorsque l'énergie disponible est suffisante l'activité nitrate réductase
et l'activité nitrogénase ne sont pas antagonistes.
La chute d'activité nicrogénase pendant la période de remplis-
sage des gousses est classiquement interprétée comme un détournement
des photosynthétats au profit de la formation des graines et au détriment
de l'approvisionnement des nodosités (LAWRIE et WHEELER, 1974 ; LAWN et
BRUN, 1974 ; HARPER, 1976 ; HERRIDGE et PATE, 1977 j YOUNG, 1982). Cette
explication est difficilement acceptable pour l'activité nitrate réduc-
tase qui diminue simultanément
à l'activité nitrogénase : en effet, la
réduction du nitrate chez le Soja se produit essentiellement dans les
feuilles et la réduction du nitrite dans les chloroplastes mêmes

---

- 95 -
vent pas de l'azote depuis le semis. Néanmoins à te stade de dévelop-
pement le rendement est gravement compromis pour ces plantes vu leur
mauvais état
physiologique.
Les variations de l'efficacité relative apparente au cours
du cycle de développement pourraient être dûes à la plante-hâte. Celle-
ci fournit l'énergie nécessaire au système fixateur de l'azote moléculaire
sous forme d'hydrates de carbone. Cet approvisionnement varie au cours
du cycle de développement; il est en particulier faible au moment du
remplissage des gousses (PATE, 1966). La faible efficacité relative ap-
parente pendant cette période-ci s'expliquerait donc par un manque d'ATP
dans les bactéroides ce qui induirait une allocation plus élevée des
électrons à la synthèse de l'hydrogène par la nitrogénase (DREVON, 1984).
La nécrose des nodosités peut être une autre explication de
la baisse de l'efficacité relative apparente en particulier en fin de
cycle. La nécrose s'accompagne en effet d'une dégradation de la léghé-
moglobine dont il résulterait une moindre fourniture d'oxygène aux
nodosités (PLADYS et RIGAUD, 1982). Or, l'insuffisance de l'approvison-
nement en oxygène est un facteur limitant de l'activité nitrogénase des
nodosités incubées dans l'air (BERGERS EN , 1962).
VI - CONCLUSION
Pour assurer sa nutrition azotée, le soja comme les autres
légumineuses, peut utiliser la fixation symbiotique de l'azote molé-
culaire ou l'assimilation
de l'azote combiné, nitrate ou ammonium.
Mais la fourniture de cet azote combiné par le sol estpa~fois. très
insuffisante pour obtenir un rendement satisfaisant des plantes culti-
vées, l'apport d'engrais azoté devient alors une nécessité agronomique.
La possibilité pour les légumineuses d'utiliser directement l'azote de
l'air peut$dans une large mesure, diminuer le recours aux engrais de
synthèse, facteur de production d'une grande efficacité mais coûteux.
L'amélioration de la fixation symbiotique est donc un objectif d'un
réel intérêt agronomique.
Pour atteindre cet objectif, plusieurs stratégies semblent pos-
sibles

---

(CONEJERO. 1981). Il est possible que ces baisses d'activités soient
une conséquence de la senescence de la plante. L'approvisionnement en
azote des gausses se ferait alors par remobilisation des réserves
protéiques.
La séparation des deux activités observée' au champ est due soit
à un appauvrissement rapide des nitrates du sol soit au retard de no-
dulation des plantes (fig. V.ls et V.t6).
L'activité nitrate réductase avolue parallèlement à la teneur
en N0
du milieu de culture et le niveau de l'activité nitrate réduc-
3
tase à un stade donné du développement de la plante pourra être augmentée
par l'apport de N0
(fig. V.t et V.2). Mais la fertilisation azotée
3
ne modifie pas l'évolution générale de l'activité nitrate réductase
foliaire au cours du cycle de développement du soja. Cette évolution
parait propre au végétal et ne peut donc pas être le reflet de la four-
niture du nitrate par le milieu à la plante. En autre l'activité nitrate
réductase des racines et des nodosités élevée en fin du stade végétatif
(fig. V.3) pourrait jouer un rôle important dans l'assimilation du nitra--
te en fin de cycle de développement des plantes.
Les premiers apports d'azote affectent peu l'activité nitrogé-
nase qui est diminuée essentiellement par les apports à la floraison
et au remplissage des gousses (fig. V.8A et B). Ceci est en accord avec
les observations de nombreux auteurs. Un apport précoce de nitrate est
bénéfique à la nutrition azotée de la plante et à la formation des nodo-
sités (HATFIELD Bt at'
1974 ; HEICHEL et VANCE, 1979
JONES et aZ., 1981
J
LARRY et al., ~981
EAGLESHAM et al., 1983). ~ais par la suite, lfinhi-
bition de l'activité nitrogénase augmente avec l'âge des nodosités
(RIGAUD, 1976 ; BOURGUIGNON, 1981).
Nos expériences en serre montrent que la suppression des ap-
ports de N0
à la fin de la floraison augmente l'activ.ité nitrogénase
3
mais ne donne pas de rendement en graines significativement supérieur
à celui des plances qui continuent dlen recevoir (tab. V.2). Toutefois.
DECAU et al., (1975) pour le Soja, FRANCO et al.,
(1979) pour le haricot
signalent un effet bénéfique d'un apport de nitrate en fin de cycle végé-
tatif. Ceci peut être certainement vrai chez les plantes qui ne reçoi-

---

rechercher des souches efficientes adaptées aux variétés
cultivées.
rechercher les conditions d'environn~ment qU1 favoriseraient
l'activité physiologique des nodosités.
- rechercher des V01es permettant d'améliorer l'efficacité
de la nitrogénase.
Les deux premières approches auraient principalement pour
effet d'accroître la masse du tissu fixateur. Alors que la troisième ap-
proche
vise surtout à augmenter l'activité spécifique des nodosités en
utilisant au mieux l'énergie disponible dans ces organes pour la fixa-
tion de l'azote moléculaire.
Le dégagement d'hydrogène peut représenter jusqu'à 80 7. de
l'énergie dont disposent les bactéroïdes. Or, cette énergie est perdue
par l'émission de ce gaz hors des nodosités.
L'existence d'une hydrogénase membranaire chez certaines sou-
ches de Rhizobium a suggéré que le recyclage de l'hydrogène représentait
une économie d'énergie pour la symbiose. De plus. elle participerait
à la protection de la nitrogénase contre l'oxygène et elle empêcherait
l'inhibition de la nitrogénase par l'hydrogène.
Les résu Lt a t s obtenus dans n06 conditions expérimentales
chez le soja (cv. HODGSON) semblent indiquer que ce recyclage n'a
pas d'effet bénéfique sur la capacité fixatrice de la symbiose: le
gène Hup qui code pour la synthèse de l'hydrogénase est aussi fréquent
chez les isolements de Rhizobium japonicum les plus efficients que
chez les moins efficients. Des résultats semblables ont été obtenus
chez les symbioses de Rhizobium avec Cajanus cajan; Vigna unguicutata ;
Pisum sativum ; et Mèdicago sativa.
Par contre, l'augmentation de l'efficacité de la nitrogénase
dans la symbiose "soja (cv. HODGSON) x R. japonicum" semble possible
en agissant sur les conditions du milieu: un apport de 1,5 mEq.N0 - / 1
3
au semis et à la formation des graines augmente l'efficacité de la nitrogé-
nase et la capacité fixatrice de la symbiose. Alors que les doses supé-

---

- 9
Il a été montré également que l'efficacité relative apparente
des nodosités varie en fonction du stade de développement de ~a plante.
Ceci confirme les résultats de plusieurs autres chercheurs.
L'étude en serre de l'influence de la teneur en azote minéral
du milieu de culture sur la fixation de l'azote moléculaire permet de
constater que:
• les doses supérieures à 3 mEq,N0
inhibent la nodulation
3-/1
et l'activité nitrogénase.
• la dose de 3 mEq.N0
n'inhibe pas la nodulation mais
3-/1
inhibe la croissance des nodosités et l'activité nitrogénas e•
·
la dose de 1,5 mEq.N0 - / 1
stimule 'la nodulation et dans
3
certaines conditions. l'activité nitrogénas€.
La comparaison de l'effet du nitrate ~ celui de l'ammonium
,
.' ~
indique qu'à dose égale, le nitrate inhibe beaucoup plus l act1v1te
nitrogénase que l'ammonium.
-
-1
En serre, un apport modéré de nitrate (1,5 m.Eq.N0 1
) pen-
3
dant toute la durée de la végétation stimule la nodulation et l'acti-
vité nitrogénase. L'arrêt de cet apport après la floraison ne semble
pas avoir d'effet dépressif sur le rendement du soja, sans doute parce
que la fixation biologique assure alors une nutrition suffisante. Par
contre, lorsque les plantes ne reçoivent aucun apport de nitrate durant
tout le cycle de développement,le rendement est gravement compromis,
du fait du faible développement initial de la plante.
Au champ, le sol contenant 0,96 %~ d'azote total (méthode
Kjeldahl), l'apport fractionné de 135 kgN/~a (15 kg N/ha tous les 12
jours, sous forme d'ammonitrate) ne permet pas d'améliorer sensiblement
le rendement en graines du soja inoculé comparé au témoin inoculé et ne
recevant pas d'azote-engrais. Par contre, l'inoculation du soja permet
d'augmenter considérablement le rendement du soja comparé à celui des
plantes non inoculées même fertilisées avec 135 kg N/ha. Ceci suggère que

---

la quantité d'azote ainsi fournie est insuffisante pour assurer un
développement maximum de la plante ou bien que la répartition uniforme
des apports fractionnés pendant tout le cycle végétatif ne correspond
pas aux exigences physiologiques de la plante.
Enfin, nos observations indiquent que les activités nitrate
réductase et nitrogénase ne sont pas deux fonctions antagonistes puisqu'el-
les peuvent agir simultanément. Ce résultat confirme celui obtenu par
DESPERIER (1984) chez le fénugrec cultivé au champ.
Il est donc important de chercher à utiliser à l'optimum ces
deux propriétés des légumineuses : la fixation biologique apporte de
l'azote gratuit pour l'agriculteur qu'il importe de favoriser au maximum
en utilisant des associations Légumineuses-Rhizobium très fixatrices et
en améliorant les conditions du milieu de culture. Mais cette fixation
biologique nlest pas toujours suffisante et il est important de définir
des stades physiologiques oU l'agriculteur peut avoir intérêt à apporter
un engrais azoté pour augmenter et régulariser le rendement. Ce travail
ouvre plusieurs voies de recherches appliquées. Par exemple :
- lorsque le sol est tr~s pauvre en azote minéral, apporter
de l'engrais azoté en dose faible au début du cycle de développement de
la plante pour favoriser la nodulation.
- lorsque le sol est riche en azote minéral, cas des sols de
zones tropicales humides caractérisés par un coefficient de minéralisation
de 3,1 à 3,70 % au début des saisons pluvieuses (CHABALIER, 1976 ; KIMOU,
1982), il faudrait rechercher des associations capables de tolérer les
fortes teneurs en azote minéral.
- rechercher la phase du développement végétatif où l'apport mini-
mum d'engrais favorise le développement de la plante sans diminuer de
façon significative la fixation biologique.
- Sélectionner des variétés de légumineuses ayant une forte
activité nitrate réductase potentielle.
Dlapr~s notre étude, et contrairement aux idées généralement
admises, le rendement maximum des légumineuses ne peut être obtenu avec
la seule fixation biologique. Il faudrait donc utiliser à lloptimum les
deux voies de nutrition azotée
des légûmineuses pOur améliorer le rendement

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"
ANNEXE 1
TabZeau 1
MiLieu. Y.E.M.
REALISATION PRATIQUE
a) Solution minérale toncencrée la fois (pour 5 litres)
(identique à celle du milieu de WRIGHT)
K
P0
25 g
2H
4
HgS0
7H
10 g
4"
2O
NaCl
10 g
Caco)
5 g
eau pe reut êe ou distillée
5 litres
à conserver ~ température ambiante et récipient opaque •
•
b) Milieu final ..••••••••••.• 1 litre
- eau permutée ••••.••••••• 700 ml
- solution minérale
(de WRIGHT) concentrée 10 fois 100 ml
- eau de Levure ...
. 200 ml
- mannitol
10 t
ajuster il pH 7,0 avec NaDR
géloser éventuellement
15 g
sétriliser
120"20 m'O.

---

- solutions nutritives (Légumineuses)
A - Solution de LEFEBVRE (sans azote)
a - Solutions-mères (g,l-I)
K
580,6
2HP04
MgS04
246,5
CaC1
443,6
2
K S0
87,6
2
4
Versénate de fer
(sequestrëne)
16,6
Ci tra te de fer
60
b - Solution d'oligoêlêments (g,l- l)
H
2
3B03
MnS0 4,H
1,8
20
ZnS0 ,7H
•
0,2
4
20
CuS0 , 5H
D,Da
4
20
Na
, 2H
0,25
2Mo04
20
Co(N0
1 microcristal
3) 2, 6H20
c - Préparation de la solution finale (quantités pour
ID litres
K
2,4 ml
2HP04
flgS0 4
8
"
CaCl
5
"
2
K S0
2 4
8
"
Versénate de fer
10
"
Citrate de fer
2,5 "
Solution d'oligoê1êments (b)
10
"
Le pH est ajusté a 6,5 si nécessaire
Le citrate de fer est utilisé au début 'de la culture. Il est
ensuite remplacé par le versénate aprés 1 linstal'atian de la nadulation.

---

Composition du milieu de HOANGLAN modifié pour l litre.
CaC1
2,50 mM
2
KZS0
1,25 mM
4
MgS04
l,OOmM
P0
0,25 mM
4J1[{Z
Oligoéléments
CuS0 , 5H
12,5 pM
4
20
MnS0
O
Z,5 pM
4,H Z
H
12,5 pM
3B04
(NH
0,007 )lM
4'ZMo,ZHZO
·1,00)lM
Versenate de fer (0,5g )
100 pA Fe
•
(SequestrBne )

---

ANNEXE 4
Mi lieu POCHON-JENSEN
Composition globale pour 1 litre
P0
Ca
g
4H
P0
H K
0,2 g
4
2
504 Mg,
7 H
0
0,5 g
2
Cl Na
0,2 g
C1
Fe
0,01 g - 0,03 ~l de perchlorure en solution .
3
gflo!ile
15
g
R€alisation
pratique.
a) Solution m~re concentrée la fois
P0
H Ca (dicalc.ique)
50 s
4
P0
H K
10 g
4
Z
•
50
Mg,
7
25 g
4
HZ 0
Cl Na
10 g
C1
Fe
1,5 ml de perchlorure en solution d ·1,26
3
eau permutée
5 litres
b) Milieu final.
-
eau permutée
900 ml
- solution min€rale
concentrée la fois
100 ml
-
pH ajusté), 7 avec NaDH-
- 15 g de gélose (poudre) jetée en pluie sur milieu chaud en tournant.
- Répartition \\8 ml par tube de 22 mm de diamètre
- boucher au coton cardé
- stérilisation 20 mn à 30 ma l
120~
•

---

ANNEXE S.
A-
STERILISATION SUPERFICIELLE DES GRAINES DE SOJA.
Préparation de la solution stérilisante
peser la g d'hypochlorite de calcium, les mettre dans un Erlen conte-
nant 150 ml d'eau
• boucher (caoutchouc)
agiter sur l'agitateur œagnétique 15 mn
· filtrer sur papier
Stérilisation
• placer 3 à 4 fois le nombre de graines nécessaires dans un erien stérile
• verser la solution d'hypochlorite
agiter à la main pendant 30 mn
rincer 4 à 5 fois à l'eau stérile.
PREPARATION DU SABLE HYDROFUGE
B
rincer abondamment le sable
Sous hotte~ faire le mélange en brassant soigneusement
- 20 ml de réactif : 6 ml hydrofugeant (Rhodorsyl) -
14 ml benzêne
- 1 kg de sable
laisser évaporer le solvant ; répartir en erlen ou flacon pour la
stérilisation (12DOC pendant 20 mn).

---

ANNEXE 6
PURIFICATION DES BACTEROIDES
· Peser 10 grammes de nodosités fraîches
· les placer dans un mortier
ajouter le polyvinyl pyrolidone (PVP) lavé à llacide à raison de 1/3
du poids des nodosités
ajouter 15 ml de tampon DIXDN
MgC1
7H
D,51 g Il
2,
2O
•
K
2,90 g/l
1HP04
KH
1 .85 g/l
2P0 4
broyer, puis filtrer
• centrifugation à 37 000 g pendant 20 mn (27 000 G
15 OOOt/lIII1)
remettre le culot en suspension dans 5 ml du tampon DIXON. (Le culot
est constitué surtout de bactéroldes. mitochondries et le surnageant
essentiellement de léghemoglobine).
Séparation des différentes fractions par gradient de saccharose
• Le gradient de saccharose est réalisé dans
des tubes à ultra
centrifugation:
2,3 ml de solution de saccharose à 57 %
- 2,7 ml
"
"
à 52 %
2,7 ml
"
"
à 50 %
-
2,3 ml
"
"
à 45 %
- 1 ml de la suspension précédente est déposé au-dessus de la dernière
couche
• l'ultra centrifugation est conduite à 100 000 x g pendant 3 heures.

---

saccharose
mitochondries
b ac té ro Ïdea
bactéries en différenciation
~;.,.:-,. ~.
bactéries nodifférenciées
'-"
Schéma indiquant la répartition des différentes fractions après ultra-
centrifugation.
• La couche correspondant à la fraction de bactéroide est ressuspendue
dans 20 ml de tampon DIXON.

---

ANNEXE 7
CALCUL DE L'ACTIVITE NITRATE REDUCTASE
(ANR) IN VITRD
Le spectrom~tre
donne des valeurs de D.C.
(densité optique)
à 540 nm proportionnelles à la quantité de nitrite diffusé dans le
milieu.
D.a "" C.1.
C • concentration en NOl
r = épaisseur de la cuve = l cm
•
3
• 51,53 10
La quantité de NOl
diffusée en moles par heure et par gramme
de matière fraîche se calcule suivant la formule suivante
60
v'
J
_.
- b-J
-1
.0.0
Q"'CxVx
x - x
moles de N0
g
MF.
avec C
t
x
p
2
1.
Vi '" volume d'extrait
3
V z volume de réaction ~ 3.10-
X
3
= volume d'échantillon prélevé ~ 0,2 10- 1
t
'" durée d'incubation en minutes
P = poids du matériel végétal frais en grammes

---

·- ~-
ANNEXE 8
CALCUL DE L'ACTIVITE REDUCTRICE D'ACETYLENE (ARA)
Le nombre de ~oles de gaz présentes j un ins~ant donné dans le
'Jol~me exploré est égal au produit de la conc~ntration de ce gaz par ce
'10 l Li/Te.
l - Calcul de V. volume exploré
n
n = nombre de moles de C2 H2 injectées
V =
C2 H2 : ~olarité en moles par litre
x x T
x = débit de la bouteille d'acétylène (ml/s)
n =
22400
T'" temps d'injection (s)
la concentration en acétylène est déterminée au cbr-oma toqr-aphe
VI
C2 H2
= K. hl ac
x
- -
V2, V3
avec hlac '" surface fournie par l'intégrateur du pic d'acétylène contenu
dans l'échantillon.
K
'" coefficient de conversion entre surface du pic et concentra·
tion en gaz
VI
:=
Volume du tube de stockage
V2
= Volume de prélèvement de gaz au champ
V3
'" Volume injecté dans le chromatographe
le coeffi ci ent de con.... er s ion K est calculè d'après un étalon
V3 x V4
1
K. h2ac =
x
V6
22 400
h2ac
= surfac~ du r-te de C2H2 contenu dans l'étalon

---

'1 4 ~
volume de C2 "2 injecté dans le flacon étalon
'1
~
Volume au flacon êta l on
6
x T
'16
V '1
h
d'cù
V
~
x - - x 22 400 x ~ X Zac
22 400
"'3'Y4
VI
hl ae
h2dC
'16' V2
V
,
(X. T) x - - x - -
hlac
V4' V1
2 - Calcul du nombre de moles d'êthylëne
Le nombre d'? ma1es Cl' è thy l êne dans ce ',I~ l ume V à J' i ns tant
t sera égal à :
•
li (t) ~ V x
C2 H4 (t)
'Il
k 1 hl
th x
ê
V2· V]
h.1 eth : surface du pic de CZH4 contenu dans l'échantillon
K' = coefficient de conversion entre surface du pic de concentration
en gaz.
1
K' • h2 éth •
22 400
Vs = volume d'éthylène injecté dans le flaccln étalon
hl êth
1
h2 ëth
22 400
x.T
hZac
hl êth
V5
~ (t) ~
x - - x
x -
(t)
22 400
hlae
h2 Hh
'1 4
x.T
V
h2ac
A •
x 2. x
22 400
'1
h2 éth
4
La constante A ne dépend que de l'étalon et de 1.1 quantité

---

d'acètjlêne injectê.
:. (t ) • A x .ch...
] ...;é:..;t"h (t )
hl a'
Les valeurs du rapport hl
( h l ' pour les ct-è l èveo.ent s â 30. 45.
e tn
ac
60, 75 et 90 ~in. donnent une draite de rêgression de pente b.
L'ARA pour une 1eure est donc:
ARA • b x A x 60
L'ARA est exprimêe en ~Moles d'êthylène formé par heure et
•
par plante.

---

REPERAGE DES STADES VEGETATIFS CHEZ LE SOJA
-.-----------*---.--------~---------.-.--
Les stsdes v~gét&tif~ ~ont d~terminE. en ç0mFtant l~ no~b~e de noeuds
sur la tige p~incipale en commençant pa~ le noeud "unifolié" qui a uoe
feuille complètemeot d4~oulée. Une feuLlle est considérée comme complètement
dl!i~oulée quand la feuilla du noeud imm~di&tement 5uFêrieu~ est d'~oulle
suffiument pour que ln deU31 bords de chaque fo!iolIlLn~ touchMt PloPli.
Au noeud terminal sur la tige principale la feuille est considérée co~
complètement d'rouI'. quand le. folioles sont pla;s
et similaires ee apparen-
ce aux feuill~s plus vieillea de la pIao te.
DESCllIPlION
VI
feuille coœplètement d'roulée au ooeud unifolié
feui Ile
"
"
·or
au 1
noeud au-ëeeeue
V
trois noeuds sur la tige princ.ipale cOlDl!lll!oçant avec le eoeud u.nifoli'
3
V(N)'
N noeuds sur la tige principale 1 partir du noeud unifali"
(iDclua)
STADES DE IIPRODUCTlON
RI
une fleu~ 1 o'importa quel Doeud
R
fleur au noeud i~diatement sous le deroier noeud l feuille compll-
2
te1:lent déroulle
R
gousae de 0,5 cm. l l'Un des ooeuds lei plui hauts ayant Utl& feuille
3
complltement déroulée •
R,
gouaee de 2 cm.
"
"
"
"
"
"
R
graiDes commençaDt l se dfvelopper (peut -ftTe senti en tStAot lA
5
gOU8se) 1 l'un des 4 Doeuds les plus hauts ayant des feuilles COlllpU-
teeen t dé roulées.
R
goue see cootenaot des graiol verts de taille normale. 1 l'uD des 4
6
noeudl les plua
hAuts ayaDt de. feuilles cOlllpl~temeDt déroulées.
R
gounes jaunissantes: SO % du feuillu jautles
7
maturitê physiologique
R.
9S % de a gOUUel lOtit brunes: -œâturid de récolte.
FEHR
cree , sei. nO 11 vol. 6. pp. 929--930. 1971.

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- ANNEXE 10-
TEST DE Cm·'PARAISO,j "ULTIPLE DE MOYEWŒS
METHODE DE NE".v~·1 et KEULS
La rè thode consiste à comparer s ucce s s i vernent toutes les paires possibles de
traitements. La quantité à laq~el1e on compare une différence entre deux moyennes
Xl - s: d ver re en fonction du nombre de moyennes qui sont comprises entre~' ,1:. Xj
Cette quantité. qui est appelée la plus petite amplitude significative vaut:
PPAS = q
(êr;.
f _..t.
1
•
La valeur q'~.c( ayant été calculée de telle sorte que pour p populations normales
de même va,iance. la probabilité de dépasser la PPAS soit précisément égale a ~
'-61.. est la variance résiduel le
~
est l'effectif des échantillons

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ANNEE : 1984
NOM DE L'AUTEUR: KnlOU AKOMIAN
ECOLE NATIONALE SUPERIEURE AGRONOMIQUE DE MONTPELLIER
RESUME
La nutrition azotée du sOJa comme celle des autres légumineuses,
peut être. assurée paT Iii fixation de l'azote mol~culaire rie. l'atmos[1hère
grâce il la svmb i.os c que cette plante
t ab t i t
ave c des Rhi z ob i rm et par
ë
l'assimilaLic)1l dll nitrate du sol.
l.vé ne rg i e disponible dans les no.Ios i t s issues de c e t t e symbiose
ë
e s t
sans
ûout e
lm
f a c t e u r
l i.mi r cn t moj e u r
d e
la fixation s ymb i.o t i que,
L'émission d'hydrogène est Ilne cause importante de perte d", l'énergie
dont disposent
les bact ro Ide s . La notion d Le f f i ca r j t
ê
é
r el a r ive permet
ù'a[lprêcier cette perte.
L'étude po r t e sur l'influence de
l'allmentation n i t r i q ue sur la
fixation s ymb i n ri q ue
et sur les valeurs de
l'efficacité relative de
la n t r-
t r ogénas c ,
Les fo r t es concentrations en NO
diminuent
la f i xat i on
symbioti-
j
que et
l'efficacit~ relative. Au C()11tr~ir~ l~s f~iblPH concentrations en
NO)
• à certains stades de développement
de la p l an t e , aemb l en t
favoriser
cette fixation.
Les activités rri t r-a t e r cd uc t a s e et ui t r ogéna s c chez le so j a no-
du lé peuvent avoir
lieu Silllultéin~mprll, sans doutf' lorsque les ptlotosynth~­
tats ne constituent pas un fêlctellr limitant. Le déc<'Ilage entre les m<lxima
de 'ces de ux activités signalé p a r plusieurs auteurs ne semble pas être nn
phénomène général:
en serre où le cycle de
dévelo p pernent des plantes est
plus court qu'au champ,
les maxima des ac t i v i t cs cOlncident pratiquement.
Enfin,
l'ilctlvîl;:; nitrate réductase par gramme de ma r i
r-e
ê
ï
r aî>
che est max ime l e au début du cycle et t oc a Li s
dans
les feuilles du somme t •
ê
A la fin IIll cycle,
cette ill·ti,·it0 nitrate récluctase est répartie sur l'en-
semble des étages foliaires ct l'activitt nitrate r éduc t as e par p l ant e
reste impnrtante.
MOTS eLES:
Nut r i t i on e eo t ée ;
So j a
(Glycine max.
L.
Ne r r , )
;
Fixation
,
symbiotique;
Nitrate
rôd uc r a s e ;
Ni t rogêna s e ;
Hydr o g èna s e ; Efficacité
-e La t i ve •

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