THESE
DE
DOCTORAT DE L'UNIVERSITE
PIERRE ET MARIE CURIE PARIS VI
Spécialité: Biologie du Développement
présentée
par Melle Eléonore N'DA
pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE PARIS VI
Sujet de la thèse:
.-
..--
L'EXPRESSION GENIQUE DANS L'OVOCYTE DE PLEURODELES WAL TL
(AMPHIBIEN, URODELE). MODIFICATIONS INDUITES PAR LE FROID.
DONNEES STRUCTURALES ET METABOLIQUES.
Soutenue le
\\ CONSEIL AFRICAIN ET MALGACHE
POUR L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR
devant le jury composé de :
C. A. M. E. S. -
OUAGADOU~OU
Arrivée 009- JU1)019.\\:150 ...' ••.
, En reg istré sous n°
() .0 .5 .0 .6 .
-
Mme N. ANGELIER
.
- - - - - - - - - - - - -
. . '
Mr J.-C. LACROIX
MrM.MORANGE
Mr E. PUVION
Mr D. SANDOZ

2
lNANT- PROPOS

1
3
1
Ce mémoire
présente
les
résultats de
quatre années de
1
recherches effectuées au sein du groupe "Ovogénèse et Embryo-
génèse
précoce
des
Amphibiens",
dirigé
par
Madame
Nicole
1
ANGELIER
(Directeur
de
Recherche
au
C.N.R.S.),
à
qui
j'adresse mes plus sincères remerciements
pour
le dynamisme
1
avec lequel
elle a guidé mes efforts.
Ce groupe est intégré au Centre de Biologie Cellulaire
1
d'Ivry-sur-Seine
(laboratoire
du
C.N.R.S.),
dirigé
par
r
Monsieur Daniel SANDOZ,
Professeur
à
l'Université Paris VI,
que
je remercie pour
l'accueil chaleureux qu'il m'a réservé
et pour l'attention constante qu'il a portée à mon travail.
Je remercie les chercheurs et techniciennes du groupe de
Nicole ANGELIER pour leur collaboration amicale et efficace :
- Marie-Louise BONNANFANT-JAIS, pour m'avoir initiée aux
techniques de microscopie électronique ,
Nicole
MOREAU
et
Nicole
LAUTREDOU,
pour
l'aide
qu'elles
m'ont
apportée
dans
l'étude
biochimique
des
protéines ,
-
May
PENRAD-MOBAYED,
pour
les
nombreuses
discussions
critiques et fructueuses que nous avons eues ensemble ,
Patricia
SOURROUILLE
et
Renelle
BERGER,
pour
leur
soutien moral et technique.
Merci à Madame Denise MATTEI de l'Unité de Parasitologie
Expérimentale
de
l'Institut
Pasteur
(Paris),
qui
nous
a
aimablement fourni un anticorps monoclonal contre hsp7ü.
Je remercie également tous ceux qui, de près ou de loin,
ont
contribué
à
l'accomplissement
de
ce
travail,
et
tout
particulièrement
Monsieur
Alassane
N'DIAYE,
Professeur
à
l'Universi té
d' Abidj an
(Côte
d'Ivoire),
et
Ministre
de
la

4
Recherche Scientifique, qui m'a soutenue tout au long de mes
études et de mes années de recherche en France.
La réalisation technique de ce mémoire
a été effectuée
grâce
à
la
collaboration
de
Patricia
Gaudoin
et
Isabelle
Angelchic,
pour
la dactylographie,
et Michel
Louette,
pour
l'illustration
photographique,
à
qui
j'adresse
tous
mes
remerciements.
J'exprime
enfin,
toute
ma
reconnaissance
à
Madame
et
Messieurs les membres du Jury, pour avoir consacré du temps à
lire et à critiquer ce mémoire.

5
ABREVIATIONS
1. Générales
- ADN : Acide désoxyribonucléique
- ARN : Acide ribonucléique
- ARNm : ARN messager
- DNP : désoxyribonucléoprotéine
- D.O.
: Densité optique
- hsp(s)
: heat shock protein(s) ou protéine(s) du choc
hyperthermique
- MO : Microscopie optique
- ME : Microscopie électronique
- MET : Microscopie électronique à transmission
MEB : Microscopie électronique à balayage
- nh : nucléaire(s) hétérogène(s)
- RNP : Ribonucléoprotéine (-protéique)
II. Biochimigues
- BSA : "Bovin Serum Albumin" - BSA : "Bovin Serum
Albumin" ou albumine sérique bovine
- EDTA : A&ide éthylène diamino tétraacétique,
sel disodique
-
IgG
Immunoglobuline G
- PBS
"Phosphate buffered saline" ou tampon phosphate
salin
- PMSF : Phenylmethanesulfonylfluoride
- RNase :Ribonucléase
- SDS
Dodécyl sulfate de sodium
- TBS:
"Tris buffered saline" ou tampon Tris salin
- TCA:
Acide trichloroacétique
- Tris : HydroxYméthylaminométhane

6
INTRODUCTION

7
Dans
l'ovocyte
d' amphibien,
conune
dans
toute
cellule
eucaryote,
le
contrôle
de
l'expression
génique
s'exerce,
depuis la transcription jusqu'à la traduction,
à différents
niveaux :
-
au
niveau
de
la
sélection
des
séquences
d'ADN
qui
seront transcrites;
-
au
niveau
de
la
formation
des
complexes
actifs
de
transcription;
- au niveau de la maturation intranucléaire d'une partie
des
ARN
nucléaires
hétérogènes
(ARNnh),
et
de
la
formation des ARN messagers
(ARNm);
- au niveau du transport des ARNm vers le cytoplasme;
- et enfin,
au niveau de
la traduction de ces ARNm en
protéines.
L'un des moyens dont on dispose pour analyser
la régu-
lation
du
fonctionnement
des
gènes,
tant
au
niveau
transcriptionnel qu'au niveau traductionnel, est de perturber
la vie de la cellule pour déclencher la mise en route d'un
système
particulier,
dit
de
défense.
Les
chocs
thermiques
sont de bons éléments perturbateurs qu'ils soient hyper- ou
hypothermiques.
En
effet,
ces
méthodes
expérimentales,
en
modifiant
l'expression
des
gènes
à
l'aide
de
facteurs
épigénétiques,
permettent
de
mieux
en
comprendre
les
mécanismes.
Ainsi,
dans la plupart des organismes,
un choc hyper-
thermique ou "heat shock" induit :
la
répression
de
la
plupart
des
gènes
actifs
à
température normale ;

8
· - la transcription préférentielle de gènes particuliers
ou gènes "heat-shock"
- la suppression de la plupart des synthèses protéiques
normales ;
et
la
synthèse
active
de
protéines
particulières,
dites "heat-shock proteins"
(hsps
;
revues par Ashburner et
Bonner,
1979
;
Schlesinger et al.,
1982
;
Lindquist,
1986 ;
Lindquist
et
Craig,
1988).
Dans
les
glandes
salivaires
de
larves de Drosophile,
où ce phénomène a été décrit pour
la
première
fois,
les
modifications
transcriptionnelles
se
traduisent
au
niveau
de
la
structure
des
chromosomes
polytènes
par
la
régression
des
nodules
(ou
"puffs")
préexistants, et par le développement de nouveaux nodules en
des sites spécifiques (Ritossâ, 1962 ; revue par Ashburner et
Bonner, 1979).
Les
effets
d'un choc hyperthermique
ont également
été
étudiés dans l'ovocyte d'amphibien, et plus particulièrement
dans l'ovocyte de xénope
(Bienz et Gurdon, 1982 ; Voellmy et
Runger, 1982
; Rojas et Allende, 1983 ; Bienz, 1984 ; Baltus
et
Hanocq-Quertier,
1985
Guedon
et al.,
1985
Browder
et al.,
1987).
La
réponse
de
l'ovocyte
à
une
brusque
élévation
de
température
n'est
pas
régulée
au
niveau
transcriptionnel,
comme dans
la plupart des
autres cellules
eucaryotes,
mais plutôt au
ni veau traductionnel
des
ARNm
préformés
codant
pour
la
protéine
hsp70
sont,
en
effet,
préférentiellement
traduits
au cours du choc hyperthermique
(Bienz et Gurdon, 1982). De plus, dans l'ovocyte de Triturus
cristatus on assiste alors
à
un arrêt de
la transcription,
qui se manifeste par une condensation rapide des chromosomes
en écouvillon (Flannery et Hill, 1988).

9
Si
les
effets
de
l'hyperthermie
ont
été
abondamment
étudiés, ceux de l'hypothermie n'ont été analysés que chez un
nombre restreint d'organismes. Ainsi, en réponse à une baisse
saisonnière
de
température,
plusieurs
espèces
de
poissons
téléostéens vivant en eau polaire synthétisent de nouvelles
protéines protectrices ou "antifreeze proteins"
(Heu et Yip,
1976
Slaughter
et al.,
1981).
Le
froid
peut
également
induire
de
nouvelles
synthèses
protéiques
chez
Tetrahymena
pyriformis
(Fink
et
Zeuten,
1980),
ainsi
que
dans
des
cellules
en
culture
de
Rana
catesbeiana
(Ketola-Pirie
et
Atkinson, 1982). Toutefois, cette réponse ne semble pas être
une
propriété
commune
à
toutes
les
cellules,
puisque
les
cellules
épithéliales
du
xénope
ne
sont
pas
sensibles
à
l'action du froid (Ketola-pirie et Atkinson, --1982) .
Dans
ce
mémoire,
nous
décrivons
les
effets de
l'hypo-
thermie
sur
l'expression
génique
dans
l'ovocyte
de
Pleurodeles waltl. Ce travail avait plusieurs objectifs :
( 1)
montrer
que
l'ovocyte
répondai t
de
manière
spécifique à l'abaissement de température;
(2)
analyser les modifications induites par le froid à
différents niveaux de l'expression génique:
au
niveau
de
la
structure
des
chromosomes
en
écouvillon,
- au niveau des sYnthèses d'ARN dans ces chromosomes,
- au niveau des synthèses protéiques;
(3)
rechercher
les relations
pouvant exister entre ces
différentes modifications.

10
L'ovocyte
d'amphibien
et
en
particulier
celui
du
pleurodèle,
offre
plusieurs
avantages
pour
la
réalisation
d'une telle étude.
Premièrement,
l'ovocyte
de
pleurodèle
renferme
des
chromosomes
géants,
les
chromosomes en écouvillon,
dont
la
structure
particulière
permet
de
visualiser
les
gènes
en
activité, localisés au niveau des boucles latérales. De plus,
ces chromosomes peuvent être facilement identifiés grâce à la
présence
de
boucles
latérales
à
morphologies
distinctives,
les boucles-repères
(Lacroix,
1968).
Enfin,
comme celle des
chromosomes
polytènes
de
diptère,
la
morphologie
des
chromosomes
en
écouvillon
reflète
leur
activité
transcriptionnelle.
Les
modifications
structurales,
tout
comme~ les
modifications
des
synthèses
d"l ARN,
Y sont
donc
aisément analysables.
Deuxièmement, grâce à sa taille exceptionnelle, le noyau
de l'ovocyte peut être isolé manuellement du cytoplasme. Ceci
permet,
non
seulement
d'étudier
les
modifications
des
synthèses
protéiques
au
ni veau
de
l'ovocyte
in toto,
mais
aussi
d'analyser
avec
précision
la
répartition
nucléo-
cytoplasmique des protéines néosynthétisées.
Enfin,
notre
système
expérimental
permet
d'aborder
le
problème
de
l'adaptation
de
l'ovocyte
à
des
conditions
thermiques défavorables.
En effet,
le pleurodèle est,
comme
tous les urodèles, un animal poïkylotherme : tout abaissement
de la température ambiante est donc également subie par les
ovocytes.
De
ce
fait,
i l
est
possible
d'appliquer
l'hypothermie
à
l'ovocyte
in vivo,
c'est-à-dire
dans
un
contexte
physiologique
idéal.
Les
effets
du
froid
peuvent
ainsi être étudiés sur de très longues périodes, ce qui n'est

1
11
pas
permis
lorsque
le
stress
est
appliqué
à
des
ovocytes
isolés
en
culture.
Un
autre
intérêt
majeur
offert
par
l'application de l'hypothermie à l'ovocyte in vivo est que ce
trai tement
mime
un
phénomène
biologique
susceptible
de
se
produire dans la nature. Les femelles du pleurodèle sont, en
effet,
soumises
à
d'importantes
variations
saisonnières
de
température dans leur habitat naturel,
le pourtour du bassin
méditerranéen.
La première partie de ce mémoire est consacrée à l'étude
des modifications induites par le froid dans la structure des
chromosomes en écouvillon de l'ovocyte.
Cette
étude
a
d'abord
été
réalisée
en
microscopie
photoniqüe, ce qui nous a permis d'établir a~ec précision les
nouvelles caractéristiques morphologiques des chromosomes en
écouvillon traités par le froid.
Nous avons ensuite analysé l'ultrastructure des matrices
RNP des différents types morphologiques de boucles latérales,
en
faisant
appel
à
des
techniques
de
microscopie
électronique, à transmission et à balayage,
éprouvées sur ce
matériel (Gounon et Karsenti, 1981 ; Spring et Franke, 1981 ;
Angelier
et al.,
1984).
Cette
analyse,
ultrastructurale
et
comparative,
a
été
effectuée
sur
les
chromosomes
en
écouvillon isolés à température normale,
et après traitement
par
le
froid.
Les
résultats
de
cette
analyse
ont
permis
d'envisager les modalités de l'organisation des produits RNP
dans les différentes matrices des boucles latérales.
L'analyse
ul trastructurale
a
ensui te
été
complétée
et
approfondie
par
une
analyse
biochimique
des
complexes
RNP

12
nucléaires
hétérogènes,
dérivés
des
matrices
de
boucles
latérales avant et après traitement par le froid.
Dans la seconde partie de ce mémoire, nous décrivons les
modifications affectant
les synthèses de
l'ovocyte
soumis à
l' hypothermie
synthèses
d' ARN
dans
les
boucles
latérales
des chromosomes en écouvillon, et synthèses protéiques.
L'autoradiographie et l'utilisation de deux inhibiteurs
de la transcription,
l'actinomycine D et l'a-amanitine, nous
ont
permis d'analyser
les
synthèses d' ARN
dans
les
boucles
latérales, à 20°C comme à 8°C.
Les
synthèses protéiques dans
l'ovocyte
in toto,
d'une
part,
et
la
répartition
nucléocytoplasmique
des
protéines
néosynthétisées d'autrë-part, ont été étudiées avant et aprè~
traitement par le froid.
Les
relations
éventuelles
entre
les
modifications
structurales et les modifications métaboliques, induites dans
l'ovocyte par l'hypothermie, sont ensuite discutées.

13
~ATERIEL ET METHODES

14
1. MATERIEL BIOLOGIQUE.
Toutes
nos
investigations
ont
été
réalisées
chez
de
jeunes
femelles
de
l'espèce
Pleurodeles
waltl
(Amphibien,
urodèle) de provenance ibérique, élevées en laboratoire. Dans
des
conditions
normales
d'élevage,
ces
femelles
vivent
en
aquarium dans une eau maintenue à 2aoc.
Afin
d'analyser
les
effets d'un
stress
hypothermique
sur les ovocytes, nous avons placé des femelles dans une eau
très
froide
4
à
1aoc.
Comme
tous
les
urodèles,
le
pleurodèle est un animal poïkylotherme,
dont
la température
interne varie en fonction de la température ambiante. Deux à
quatre
heures
après
que
la
femelle
ait été
placée
en
eau
frôide,
la température de la cavité abdominale et des ovaires
atteint celle du milieu environnant : ceci a été vérifié par
l'introduction d'un microthermomètre
(Sensortek BAT-12) dans
l'abdomen de
l'animal,
puis dans les
ovocytes
immédiatement
après leur excision.
Des
études
préliminaires
ayant
montré
que
des
effets
optimaux sur
le métabolisme de l'ovocyte étaient obtenus
à
aoc,
cette
température
a
été
retenue
pour
toutes
les
expériences de stress hypothermique décrites dans ce mémoire.
2. CULTURE DES OVOCYTES
Le
marquage
radioactif
des
ARN
nucléaires,
ou
des
protéines ovocytaires, ainsi que les expériences d'inhibition
de
la
transcription,
sont
toujours
réalisées
in vitro,
sur
des ovocytes isolés.

15
Le terme culture est habituellement utilisé lorsque les
conditions
créées
sont
suffisanunent
proches
des
conditions
in vivo pour permettre aux cellules de se diviser. Le cas des
ovocytes
est
particulier
dans
la
mesure
où,
in vivo,
l'ovocyte
ne
se divise
pas.
Il n'est donc
pas
possible de
faire
appel
à
ce
critère pour
affirmer que
les
conditions
in vitro définies ici sont capables de maintenir les ovocytes
dans un
état
aussi
proche que
possible de
l'état
in vivo.
Toutefois,
dans
nos
conditions
artificielles,
et
à
20°C,
l'incorporation des précurseurs radioactifs est élevée; ceci
tend à prouver que le métabolisme de l'ovocyte est maintenu.
Nous avons jugé que ce critère était suffisant pour justifier
ici l'emploi du terme culture.
2.1. Isolement des ovocytes.
Cet
isolement
est
réalisé
à
partir
d'un
fragment
d'ovaire,
prélevé sur une femelle anesthésiée par immersion
dans une solution 1%.
de MS 222
(Sandoz).
Les ovocytes sont
ensuite séparés les uns des autres à l'aide de pinces fines,
sous loupe binocculaire. Pour les expériences nécessitant une
défollicularisation
préalable
des
ovocytes,
le
fragment
d'ovaire excisé est
incubé
30 minutes dans
une solution de
Steinberg
à
double
concentration,
privée
de
calcium et
de
magnésium, additionnée d'EDTA (375 mg/l) et ajustée à pH 7,1
(Masui,
1967).
Ce
milieu
dissocie
les
liaisons
inter-
cellulaires,
libérant
ainsi
l'ovocyte
de
ses
enveloppes
celles-ci sont éliminées à l'aide de pinces fines.
Toutes ces étapes sont réalisées à température ambiante
pour
les
ovocytes
issus
de
femelles
maintenues
à
20°C,
et

16
dans
une
chambre
froide
à
8°C
pour
les
ovocytes
issus
de
femelles soumises à un stress hypothermique.
Seuls
sont
retenus
pour
les
cultures
les
ovocytes
en
vitellogénèse
moyenne
et
tardive
(stades
IV
à
VI
Bonnanfant-Jaïs et Mentré,
1983);
ils sont caractérisés par
une distribution inégale du pigment entre l'hémisphère animal
et l'hémisphère végétatif,
et leur diamètre varie entre 0,5
et 1,5 mm.
A 20 ° C,
ces ovocytes présentent dans
leur noyau
des
chromosomes
en
écouvillon
aux
boucles
latérales
bien
développées,
témoins
d'une
activité
transcriptionnelle
importante.
2.2. Conditions de culture.
2.2.1. Définition des conditions standard:
Culture à 20°C.
Pour
l'analyse
des
synthèses
d' ARN
dans
les
ovocytes
isolés,
le
milieu
de
culture
utilisé
est
le
milieu
199
(Gibco) dilué par 20% d'eau tridistillée stérile.
Pour
l'analyse
des
synthèses
protéiques,
les
ovocytes
sont cultivés dans du milieu de Barth (Barth et Barth, 1959),
supplémenté en pénicilline-streptomycine (100 UI/ml).
Les ovocytes,
avec ou sans cellules folliculaires,
sont
maintenues
à
20°C,
en
atmosphère
saturée,
dans
un
bain
stérile du
milieu
approprié,
à
raison
de
10 ovocytes pour
100 l-Ll de
milieu.
Dans
ces
conditions,
ils
conservent
une
activité
de
synthèse
élevée.
Cependant,
leur
survie
est
limitée
au-delà
de
48
heures
de
culture
à
20°C,
le
métabolisme de
l'ovocyte est,
en effet,
profondément altéré

17
(Moreau,
1975).
Dans
toutes
les
expériences
réalisées,
la
durée de
culture
des
ovocytes
isolés
n'excède
donc
pas
48
heures.
2.2.2. Culture des ovocytes à 8°C.
Dans toutes les expériences de stress hypothermique, les
ovocytes
sont
maintenus
en
culture
à
SoC.
Hormis
la
température,
les
conditions
de
culture
sont exactement
les
mêmes que celles appliquées aux ovocytes isolés à 20°C.
2.2.3. Marqueurs radioactifs et substances
inhibitrices.
Le marquage des ARN est effectué soit par incorporation
in vitro
d'uridine
tritiée
(Uridine-H3
activité
spéci-
fique:
43 Ci/mMole)
ajoutée
au
milieu
de
culture
199
à
raison
de
500 J,.LCi/ml,
soit
par
microinj ection
de
ce
même
marqueur dans les ovocytes (cf. paragraphe 3).
Le marquage des protéines est effectué par addition de
Méthionine-S35 (Met-S35 ; activité spécifique : 800 Ci/mMole)
au milieu de Barth, à raison de 500 J,.LCi/ml.
Dans
les
expériences d'inhibition des
synthèses d'ARN,
les
inhibiteurs
sont
introduits
dans
l'ovocyte
par
microinjection (cf. paragraphe 3).
Après incubation, les ovocytes sont soigneusement rinçés
dans plusieurs bains du milieu de culture approprié.

18
3. TECHNIQUE DE MICROINJECTION
Les microinj ections d'ur idine
tr i tiée
ou d' inhibiteurs
de
la
transcription,
actinomycine-D
et
a-amanitine,
ont
toutes été effectuées dans
le noyau de
l'ovocyte,
selon la
technique décrite par Gurdon et Wakefield (1976).
Les
ovocytes
sont défollicularisés,
puis centrifugés à
500
g
pendant 10
minutes
sur
un coussin de Ficoll
à
50%
déposé
au
fond d'un
tube
en
verre.
Ce
tube
est
rempli
de
milieu
199
(Gibco)
dilué
à
20%
par
de
l'eau
tridistillée
stérile.
La
centrifugation
provoque
le
transfert
de
la
vésicule
germinative
jusqu'au pôle
animal
de
l'ovocyte,

elle est alors visible sous la forme d'une tache claire.
Cinq
à
10
nl
de
sübstance
sont
injectés
dans
chaque «-
noyau à
l'aide d'une
micropipette
en
verre,
montée
sur
un
microinjecteur
(Eppendorf,
5242).
Cet
appareil
permet
de
réaliser
des
microinjections
répétitives
de
volumes
constants.
Les ovocytes sont ensuite mis en culture dans
le
milieu 199.
L'uridine
tritiée
est
injectée
à
la
concentration
de
500 ~Ci/ml (activité spécifique :43Ci/mMole),1'actinomycine-D
à
la
concentration
de
50
~g/ml,
et
l'a-amanitine,
à
la
concentration de 100 ~g/ml.
Dans
chaque
type
d'expérience,
deux
lots
d'ovocytes
témoins sont également mis en culture : dans le premier, les
ovocytes
sont
simplement
défollicularisés,
dans
le
second,
les
ovocytes
défollicularisés
et
centrifugés
sont
injectés
avec du milieu 199, vierge de toute autre substance.

19
Toutes
ces
étapes
sont
réalisées
à
20°C
pour
les
ovocytes isolés dans
les conditions normales,
et à SOC pour
les ovocytes soumis à un stress hypothermique.
4. TECHNIQUES CYTOLOGIQUES
4.1. Préparation des chromosomes en écouvillon pour
l'observation en microscopie optique.
L'isolement
des
chromosomes
en écouvillon
est
réalisé
selon la technique mise au point par Gall
(1954)
et reprise
par
Callan
et
Lloyd
(1960).
Cette
technique
nécessite
les
manipulations suivantes :
- extraction manuelte d'un noyau,
à partir d'un ovocyte
ouvert
à
l'aide de
pinces
fines
dans
du
tampon
TBS
(Tris
Buffer Saline:
KCl 75 mM , NaCl 25 mM , MgC12 1 mM , CaC12
0,05 mM ajusté à pH 7,2 avec du Tris-HCl 10mM;
le Tris peut
être remplacé par de l'HEPES 10 mM).
-
transfert
du
noyau
dans
du
tampon
TBS,

il
est
débarrassé de toute trace de vitellus par pipettages répétés
à l'aide d'une pipette de petit calibre;
transfert
du
noyau
nettoyé
dans
une
chambre
d'observation contenant du TBS
cette chambre est constituée
d'une lamelle de verre perforée en son centre et obturée sur
une de ses faces par une lamelle scellée à la paraffine;
ouverture
manuelle
du
noyau
par
déchirure
de
la
membrane nucléaire à
l'aide d'une
paire de pinces
fines
et
d'une
fine
aiguille
de
tungstène
le
contenu
nucléaire,
chromosomes en écouvillon inclus, se dépose sur le fond de la

20
chambre
la
chambre
est
fermée
par
une
deuxième
lamelle
déposée sur sa face supérieure;
centrifugation
de
la
préparation
à
300
g
pendant
5 minutes,
puis 2 200 g pendant 30 minutes
les chromosomes
adhèrent
ainsi
parfaitement
au
fond
de
la
chambre
et sont
prêts à l'observation.
L'observation de
la préparation en
contraste
de
phase
est
réalisée
à
l'aide d'un microscope
muni d' un dispositif
inversé (Leitz, Dialux 20).
4.2.
Préparation
des
chromosomes
en
écouvillon
pour
l'observation en microscopie électronigue
4.2.1. Coupes fines
Les chromosomes sont isolés selon la
technique de Gall
(1954), puis inclus dans une résine appropriée:
les
préparations
de
chromosomes
en
écouvillon,
réalisées selon la technique précédemment décrite,
sont
photographiées
en
contraste
de
phase
(appareil
Lei tz,
Dialux 20) avant l'inclusion
ceci permet de repérer la
position de chaque chromosome,
ce qui est indispensable
pour
l'identification
ultérieure
en
microscopie
électronique.
- Une fixation par le glutaraldéhyde à 1% est réalisée ;
cette
fixation
est
suivie
de
3
rinçages
dans
le
PBS
(Phosphate Buffer Saline : Na2HP04 10 mM, NaH2P04 10 mM,
pH 7,2).
Une
post-fixation
au
tétroxyde
d'osmium
à
1%
est
ensuite effectuée en chambre humide, suivie d'un rinçage

21
dans
le
PBS puis
d'une déshydratation
par les
alcools
50 0 et 100 0 •
L'inclusion
dans
l'araldite
est
réalisée
selon
la
méthode
dite

plat"
("flat
embedding"
Gounon
et
Karsenti,
1981
Spring
et
Franke,
1981)
par
retournement
d'une
gélule
d'araldite
sur
la
lamelle
portant
les
chromosomes,
celle-ci
ayant
été
préalablement
détachée
de
la
chambre
d'observation
l'ensemble
est
ensuite
mis
à
polymériser
pendant
48
heures dans une étuve à GOoe.
La
lamelle
est
décollée
du
bloc
d'araldite
par
immersion dans de l'azote liquide.
- une coloration au bleu de méthylène de la surface du
bloc
d'araldite
permet
de
repérer
la
position
des
différents
chromosomes
et
de
choisir
le
groupe
de
chromosomes qui sera coupé.
- Les coupes fines sont réalisées sur un ultramicrotome
(Reichert
OM-U3),
a
l'aide
d'un
couteau
de
diamant
(Diatome),
et recueillies
sur des
grilles de cuivre
elles subissent alors une double coloration à l'acétate
d'uranyle à 50% dans l'éthanol absolu,
puis au citrate
de
plomb
l'observation
se
fait
à
l'aide
d'un
microscope électronique Philips 201, sous une tension de
80 kV.
4.2.2. Observation en microscopie à balayage.
Les chromosomes sont préparés comme
pour l'observation
en microscopie électronique sur
coupes.
Toutefois,
après la
fixation par le glutaraldéhyde et la post-fixation osmique,
les
échantillons
sont
déshydratés
par
passages
dans
les

22
alcools
30,
50,
70,
90
et
100,
puis
dans
l'acétone.
Ils
subissent ensuite une déshydratation plus poussée,
selon la
méthode du point critique, dans un appareil (Balzers CPD 010)
utilisant
le
gaz
carbonique
liquide
comme
fluide
intermédiaire.
Les
préparations
sont
immédiatement
transférées dans un évaporateur à vide
(Edwards,
S15 PA)
et
ombrées à l'or fin (ombrage rotatif, angle de 90°) pendant 1
à
2
minutes
à
20 mA,
dans une
atmosphère
saturée en argon
purifié et sous une pression de 7.10- 2 Torr.
La couche d'or
déposée
sur
les
préparations
a
une
épaisseur
de
10
nm.
L'observation
est
réalisée
à
l'aide
d'un
microscope
électronique à balayage (Philips 505).
5. TEC~IQUES AUTORADIOGRAPHIQUES
MICROSCO~IE
OPTIQUE
5.1. Préparation des chromosomes en écouvillon
Les
chromosomes
en
écouvillon
isolés
sont
centrifugés
dans
la
chambre
d'observation
(cf.
paragraphe
4.1.).
La
lamelle
inférieure
sur
laquelle
sont
attachés
les
chromosomes,
est
alors
détachée
de
la
chambre.
Les
préparations chromosomiques sont fixées par immersion dans de
l'alcool à 70°, puis déshydratées par passage successif dans
l'alcool
à
80°,
90°,
et
enfin
dans
de
l'éthanol
absolu
(100 0 ).Chaque lamelle est ensuite lavée dans du xylène, pour
éliminer toute trace de paraffine,
avant d'être rincée dans
de l'éthanol absolu, puis dans de l'acétone. Après séchage à
l'air libre,
la lamelle portant
les
chromosomes est collée
sur une lame histologique à l'aide d'araldite liquide.

1
23
r
5.2. Pose de l'émulsion photographique
!
Les
lames
sont plongées dans
l'émulsion
NTB2
(Kodak),
1
diluée à volume égal par de l'eau distillée et équilibrée à
une température
de 40°C dans un
bain-marie.
L'exposition a
lieu à 4°C, pendant 8 jours.
5.3. Développement
Après
8
jours d'exposition,
les
autoradiogrammes
sont
développés à 18°C. Le révélateur utilisé est le D19
(Kodak),
et
le
fixateur,
le
thiosulfate
de
sodium
(Na2S203)
à
la
concentration de 30% dans de l'eau distillée.
Les lames sont
ensuite séchées à l'air libre.
5.4. Observation en microscopie optique
Les
chromosomes
sont
colorés
10
minutes
dans
une
solution
de
Bleu
de
Coomassie
à
0,1 %-méthanol
50%,
additionnée d'acide acétique 14%
(Gall,
1981). L'observation
et les photographies sont réalisées en lumière naturelle, sur
un microscope Leitz Dialux 20, en utilisant des objectifs à
immersion dans l'huile. Pour l'observation en fond clair,
le
microscope est équipé d'un condenseur achromatique
(Leitz
;
0,90)
;
l'observation en fond noir est effectuée grâce à un
condenseur
plan
à
immersion dans
l' huile
(Lei tz
D l , 19-
1,44) .

24
6. TECHNIQUES BIOCHIMIQUES
6.1. Analyse des particules ribonucléoprotéiques
nucléaires hétérogènes (RNPnh)
6.1.1. Isolement des particules RNPnh
Cet
isolement
est
réalisé
selon
une
technique décrite
par Sommerville
(1973). 0,5 à 2 g d'ovaire sont prélevés sur
une femelle,
et les ovocytes sont mis en culture durant
48
heures
en
présence
d'uridine
tritiée
(500
}J.Ci/ml
dans
du
milieu 199 Gibco)
afin de marquer
les ARN.
Cette étape est
effectuée à
20°C pour les ovocytes contrôles,
et à 8°C pour
les ovocytes soumis à un stress hypothermique.
Les ovocytes sont ensuite rinçés dans plusieurs bains de
milieu
199,
avant d'être
homogénéisés
manuellement dans
un
potter
muni
d'un
piston
en
téflon.
L'homogénéisation
est
effectuée à
O°C,
dans
1 ml de tampon A (NaCl 0,1 M;
MgC12
5 mM;
2-mercaptoéthanol
5
mM
Tris-HCl
pH
7,5
10
mM
;
Sucrose 8,5%).
L'homogénat est centrifugé 5 minutes à
300 g et à
O°C
(rotor Sorvall HB4
; centrifugeuse Sorvall RC-2B).
Le culot
de centrifugation contient le vitellus,
les chromosomes
et
autres
structures
nucléaires,
ainsi
que
des
débris
membranaires (Sommerville, 1973).
Le surnageant est centrifugé
20 minutes
à
4000 g
et à
O°C.
Le
culot
obtenu
à
cette
étape
contient
les
RNP
nucléaires,
ainsi
que
des
ribosomes
contarninants
(Sommerville, 1973).

25
Ce culot est resuspendu dans 500 ~l à 1 ml de tampon d'
homogénéisation glacé,
additionné de
Na2 EDTA, à la
concen-
tration finale de 5 mM. Cette suspension est ensuite déposée
sur un gradient de sucrose
elle peut éventuellement être
conservée à - 20°C durant quelques semaines.
6.1.2. Purification des RNPnh sur gradient de
sucrose
Les gradients linéaires de sucrose d'un volume total de
14 ml,
sont
préformés
dans
des
tubes
de
nitrocellulose
(Beckman). Ces gradients ont une concentration de 25-55% dans
le tampon B:NaCl 0,2 M
EDTA 2 mM ; Tris-HCl 20 mM , pH 7,5;
2-mercaptoéthanol 5 mM (Kloetzel et al., 1981). La suspension
de RNPnh
est
centrifugée
à
travers
ce
gradient
pendant
1
heure
à
O°C,
à
la
vitesse
de
40
000
rpm
(rotor
SW
40
Beckman) .
Les
RNPnh
sédimentent
alors
sous
forme
d'une
bande
opaque,
visible
dans
le
tiers
inférieur
du
gradient.
Les
ribosomes contaminants 80 S restent au sommet du gradient.
Chaque
gradient
est
fractionné
par
volumes
de
400
à
500 ~l.
La radioactivité incorporée dans les ARN,
ainsi que
la
densité
optique
(D.a.)
sont
mesurées
dans
chacune
des
fractions recueillies.
6.1.3. Mesure de la radioactivité incorporée dans
les ARN
10
à
20 ~l de chaque
fraction du gradient de
sucrose
sont prélevés et dilués dans 400 ~l d'eau distillée glacée,

26
contenant 500 ~g/ml d'ARN-t de levure (Sigma), et 10% de TCA
(acide
trichloroacétique)
ce
traitement
a
pour
but
de
précipiter les ARN néosynthétisés contenus dans les RNPnh, ou
dans les ribosomes contaminants.
Après une incubation de 30
minutes à 4°C, les précipités sont recueillis sur des filtres
de
cellulose
(Whatman
GF/B).
Les
filtres
sont
rincés
plusieurs fois
au TCA 10%
glacé,
puis séchés,
avant d'être
placés dans des fioles à
scintillation contenant un liquide
scintillant à base de toluène. La quantité de radioactivité,
rapportée au volume total de chaque fraction, est comptée sur
un compteur à scintillation (LKB).
6.1.4.
Mesure
de
la
densité
optique
dans
chaque
fraction de grad~ent
10 à
20 ~l de chaque fraction sont prélevés et dilués
dans 400 ~l d'eau distillée. La densité optique est mesurée
pour une longueur d'onde de 260 nID,
et corrigée d'après les
mesures
effectuées
sur
des
fractions
correspondantes,
obtenues à partir d'un gradient "blanc"
(ne contenant pas de
RNP) .
Les
pics
de
radioactivité
et
de
densité
optique
indiquent
les
fractions
contenant
les
RNPnh,
et
celles
contenant les
ribosomes.
Ces
derniers sont conservés à
O°C
pour servir de marqueurs de sédimentation dans des gradients
ultérieurs.
Les
fractions correspondant aux RNPnh sont rassemblées
et
diluées
dans
3
volumes
du
tampon
B,
utilisé
pour
la
réalisation des
gradients
de
sucrose
(voir
composition
au
paragraphe 6.1.2.). Après une centrifugation de 30 minutes à

27
O°C et à 15 000 9
(rotor sorvall HB4
; 10 000 rpm), le culot
contenant
les
RNP
est
resuspendu
dans
100
lJ.l
de
tampon B
glacé.
Les
RNP
sont
alors
préparés
pour
l'observation
en
microscopie électronique (paragraphe 6.1.5.), ou traités par
la
ribonucléase
A
(RNase
A)
avant
d'être
centrifugés
à
travers un second gradient de sucrase (paragraphe 6.1.6).
6.1.5.
Préparation
des
RNPnh
pour
l'observation
en microscopie électronique
25
lJ.l
de
la
suspension
de
RNP,
obtenue
à
partir
du
gradient de sucrose (paragraphe 6.1.4), sont déposés sur une
grIlle
en
cuivre,
préalablement
recouverte
d'un
film
de
carbone
et
effluvée
pour
éliminer
l'électricité
statique.
Chaque grille est ensuite rincée dans une solution de NaCl
0,2 M, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, puis dans l'éthanol 70°.
Une
coloration par l'acétate d'Uranyle à 0,6% dans l'éthanol 70°
(15 secondes)
est effectuée
les grilles sont rincées dans
l'éthanol
70 °
puis
séchées
à
l'air
libre
(Kloetzel
et al,
1982).
Les
préparations
sont
observées
à
l'aide
d'un
microscope électronique à transmission Philips 201.
6.1.6.
Préparation
de
monoparticules
RNPnh
et
analyse en gradient de sucrose
Les
RNP
obtenus
après
purification
sur
gradient
de
suc rose 25-55% (paragraphe 6.1.2.) sont sous la forme de gros
aggrégats de particules RNP.
Afin d'isoler et d'analyser les
monoparticules RNP
individuelles,
les
aggrégats RNP doivent

28
être traités par une faible concentration de ribonucléase A
(RNase A ; Malcolm et Sommerville, 1977).
Les RNP resuspendus dans 100 ~l de tampon B (paragraphe
6.1.2.)
sont
additionnés
de
RNase
A
(Sigma)
à
la
concentration
finale
de
1
~g/ml.
Après
30
minutes
d'incubation à température ambiante,
les RNP sont fixés par
du
formaldéhyde
neutralisé,
à
3,5%
dans
le
tampon
B.
Le
mélange
est
alors
amené
à
un
volume
final
de
500
III
par
addition
de
tampon
B
glacé,
puis
déposé
sur
un
second
gradient
linéaire de sucrose
5-60% dans
le même
tampon.
Le
gradient est centrifugé durant
15 à
18 heures
à
O°C,
à
la
vitesse de 30 000 rpm (rotor Beckman SW 40).
Les
ribosomes
sont
centrifugés
en
parallèle
sur
un
gradient Ldentique.
Les
gradients
sont
fractionnés,
et
la
radioactivité
incorporée dans les ARN,
ainsi que la densité optique,
sont
mesurées dans chaque fraction comme précédemment décrit.
Les coefficients de sédimentation des monoparticules RNP
sont calculés selon la méthode de Martin et Ames
(1961), en
utilisant les ribosomes 80S comme marqueurs.
6.1.7. Détermination de la densité relative des
RNPnh dans le chlorure de césium (CsCl)
Les
fractions
de
sucrose
contenant
les
monoparticules
RNP sont
rassemblées et centrifugées
à
100
000
g durant
4
heures
à
O°C
(rotor
Beckman
SW
50) .
Le
culot
de
centrifugation est resuspendu dans 1 ml de tampon phosphate
(Phosphate de sodium 0,01 M,
pH 7,2
;
2-mercaptoéthanol,
5
mM)
et déposé sur un gradient linéaire de CsCl
24-60% dans

29
une solution de Tris-HC1,
10 mM, pH 7,5 ; Triton X 100 0,01%
(volume à volume). Le volume total du gradient est de 4 ml.
Après
une
centrifugation
de
16
heures
à
4°C,
à
la
vitesse de 40 000 rpm (rotor Beckman SW 50), chaque gradient
est fractionné par volumes
de 200 ~l. La radioactivité et la
densité
optique
sont
déterminées
pour
chaque
fraction
recueillie.
La
densité
de
chaque
fraction
(en
g/cm3)
est
calculée en pesant des échantillons de 100 ~l, prélevés dans
des tubes capillaires (Sommerville, 1974).
6.2. Analyse des protéines ovocytaires néoynthétisées
6.2.1. Préparation des fractions protéigues
ovocyt-aires
A
partir
d'un
ovaire
de
pleurodèle,
nous
pouvons
préparer des fractions correspondant
aux
protéines
de
l'ovaire
total
dans
ce
cas,
l'ovaire est broyé manuellement dans un potter téflon/verre.
Après
le broyage,
le
tampon d'homogénéisation
(KCl 120 mM,
MgC12 2 mM, Tris 20 mM-HC1, pH 7,5)
est ajouté (1 vol tampon
/
1 vol d'ovaire)
ainsi qu'un inhibiteur des protéases,
le
PMSF à
la concentration finale de 150 ~g/ml. Les homogénats
sont centrifugés 2 fois 15 min à 1 800 g puis les surnageants
sont repris et centrifugés
2 fois
30 min à 100
000
g.
Les
surnageants 100 000 g sont alors traités par un grand volume
(10/1)
d'éthanol
à
-20°C
pendant
12
h
pour
précipiter
les
protéines.
Les
protéines
précipitées
sont
reprises
par
centrifugation à 5 000 g pendant 15 min.

1
30
-
aux protéines cytoplasmiques
de
l'ovocyte
:
dans
ce
cas,
les
ovocytes sont défollicularisés,
puis énucléés dans
le
tampon
d'homogénéisation
décrit
ci-dessus.
Après
l'élimination des noyaux,
l'ensemble du milieu contenant les
ovocytes énucléés est homogénéisé par plusieurs passages dans
une pipette Pasteur et centrifugé 2 fois 30 min à 100 000 g.
Les protéines
des
surnageants
sont
précipitées
à
l'éthanol
(cf. paragraphe ci-dessus).
-
aux protéines nucléaires
:
les ovocytes sont ouverts
dans une solution de KCl 75 mM, NaCl 25 mM, MgC12 1 mM, CaC12
5.10-3
mM,
Tris
10
mM
-
HCl
(pH
7,2).
Chaque
noyau
est
extrait en moins de 20 secondes (ce qui limite les pertes de
protéines
par diffusion)
et
transféré dans
une
solution de
MgC12
10 mM,
Tris
20 mM-HCL
~pH 7,4),
éthanol absolu
(3/7,
vol/vol),
puis
conservés
dans
du Tris
20
mM-HCl
(pH
7,4),
éthanol, glycérol (1/4, 5/4, 5, vol/vol/vol). Les noyaux sont
récupérés par centrifugation : 5 000 g pendant 2 min.
6.2.2. Analyse des protéines par électrophorèse bi-
dimensionnelle
Les protéines sont dissoutes dans le tampon échantillon
décrit
par
Q'Farrell
(1975)
contenant
2%
d'urée
9,5
M,
2%
d'ampholines,
2% de NP40 et 5% de ~-mercaptoéthanol pendant
1 h à température ambiante.
Les protéines sont séparées dans une première dimension
par
isoélectrofocalisation
selon
un
gradient
de
pH
pré-
équilibré
(Q' Farrell,
1975)
en
présence
d' ampholines
permettant
une
séparation
optimale
des
protéines
dans
la

31
gamme
de
pH
de
4
à 7
Pharmalyte
(4-6,5),
(5-8),
(3-10)
(Pharmacia)
(V/V/V).
L'étalement des pH est mesuré au moyen d'une électrode
de contact.
Les protéines sont séparées dans la seconde dimension en
gradient 10-15% d'acrylamide-SDS selon la méthode décrite par
O'Farrell (1975).
6.2.3. Colorations des protéines
Deux
méthodes
de
colorations
des
protéines
après
l'électrophorèse ont été utilisées:
-
Lorsque
la
concentration
protéique
est
élevée,
les
protéines
sont colorées pendant 12 heures dans une solution
de
bleu
de
Coomassie
(R-
250),
0,25%,
méthanol
40%,
acide
acétique 10%. Les gels sont décolorés par plusieurs bains de
méthanol 20%, acide acétique 5%, glycérol 2,5%.
Lorsque
la
concentration
protéique
est
faible,
la
méthode de coloration au nitrate d'argent, plus sensible, est
utilisée. Nous avons utilisé la méthode décrite par Morrissey
(1981)
le
gel est fixé
30 min dans
une
solution aqueuse
contenant 50% méthanol,
10% acide acétique,
puis 30 min dans
une
solution
aqueuse
contenant
5%
méthanol,
7%
acide
acétique, et enfin 30 min dans une solution de glutaraldéhyde
10%.
Le
gel est
rincé pendant
2 h
dans
de
l'eau distillée
avec 7 changements de bain.
Il est alors incubé 30 min dans
une solution de nitrate d'argent 0,1%. Après 2 rinçages brefs
à
l'eau
distillée,
le
gel
est
traité
par
une
solution de
développement
(50
lJ.l
de
formaldéhyde
37%
dans
100
ml
de
carbonate de Na 3%).
La réaction est arrêtée par addition de

32
5 ml d'acide citrique 2,3 M.
Après la min, le gel est rincé
puis conservé à l'obscurité dans de l'eau distillée.
6.2.4. Analyse par radioautofluorographie
Les protéines radioactives,
séparées par électrophorèse
sur
gel
d' acrylamide,
sont
révélées
par
radio-
autofluorographie
après
imprégnation
du
gel
avec
un
amplificateur
de
radioactivité
(Amplify,
Amersham
International PLC),
séchage du gel et application d'un film
X-ray
(type
RX-Fuji)
à
-SO°C
pendant
plusieurs
jours
en
présence
d'un
écran
intensif icateur
Cronex
(Dupont
de
Nemours) .
6.2.5. Immunolocalisation sur transfert
Cette
technique
de
repérage
des
complexes
antigène-
anticorps
utilise
des
antigènes
liés
à
une
feuille
de
nitrocellulose,
ces antigènes sont préalablement séparés par
électrophorèse
bidimensionnelle,
leur
poids
moléculaire
et
leur point isoélectrique sont ainsi finement déterminés.
Les
éléments
antigéniques
d'une
fraction
complexe
sont
ainsi
parfaitement séparés et identifiés.
Les
protéines
séparées
par
électrophorèse
bi-
dimensionnelle sont transférées par électrophorèse à 500 mA
pendant 3 h dans un tampon Glycine 0,192 M, Tris 25 mM.
La
feuille de nitrocellulose est incubée dans le PBS-1% BSA 60
min à 40°C ; la BSA évite les adsorptions non spécifiques.
-
Après
traitement
à
la
BSA,
les
feuilles
de
ni tro-
cellulose sont rincées avec du PBS-Tween20 1% puis incubées

1
33
pendant
1
h
à
température
ambiante
avec
l'anticorps
dilué
dans du PBS-O,l% BSA.
- L'incubation est réalisée en sachet scellé. La nitro-
cellulose est rincée 3 fois 10 min dans 100 ml de PBs/BSA 1%.
L'anticorps est
révélé
par un anticorps
anti IgG de
souris
marqué à la peroxydase.
Les
anticorps
de
souris
associés
aux
protéines
transférées sur
nitrocellulose sont
révélés par un deuxième
anticorps
un
anti
IgG
de
souris
associé
à
la
peroxydase
(Institut Pasteur Production). Après 45 min d'incubation avec
cet anticorps dilué au
1/40,
les
feuilles
de nitrocellulose
sont rincées 3 fois 10 min dans du PBS-Tween20 1%, puis dans
du tampon 150 mM NaCl, Tris 0,1 M-HCl (pH 7,4). La peroxydase
est révélée en-incubant
la nitrocellulose dans un~-solution
composée de 1 vol. de chloro-naphtol 0,3% dans du méthanol et
5 vol. de tampon NaCl 150 mM,
Tris 0,1 M-HCl
(pH 7,4), H202
0,01%. La feuille est ensuite rincée à l'eau distillée puis
séchée.

34
PREMIERE PARTIE : MODIFICATIONS STRUCTURALES
INDUITES PAR LE FROID DANS L'ORGANISATION DES
CHROMOSOMES EN ECOUVILLON.

35
I.
MODIFICATIONS DE L'ORGANISATION GENERALE DES CHROMOSOMES
EN ECOUVILLON
1.
Organisation des chromosomes en écouvillon dans les
conditions normales de température
L'étude
descriptive
des
chromosomes
en
écouvillon
de
l'ovocyte
de
Pleurodeles
waltl
a
été
réalisée
par
Lacroix
(1968). Toutefois,
il nous paraît nécessaire de rappeler ici
les
principales
caractéristiques
de
ces
chromosomes,
observées en microcopie optique.
1.1. Généralités
Les chromosomes en écouvillon de
l'ovocyte d' amphibien
s'observent au stade diplotène de la prophase méïotique : les
chromosomes
homologues
sont
alors
appariés
en
bivalents
(fig. 1).
Les boucles
latérales,
qui confèrent à ces chromosomes
leur
aspect
caractéristique,
sont
la
manifestation
d'une
activité
transcriptionnelle
très
intense
(Gall
et
Callan,
1962 ; Izawa et al., 1963)
; il en existe plusieurs milliers,
uniformément distribuées dans le caryotype
(fig.
1). Chacune
de
ces
boucles
comporte
un
axe
d'ADN
double-brin,
et
une
matrice
au
sein
de
laquelle
de
nombreuses
molécules
d' ARN
néosynthétisées
sont
associées
à
des
protéines
acides
spécifiques
pour
former
des
complexes
ribonucléoprotéiques
(RNP ; Mac Gregor et Callan, 1962 ; Edstrëm et Gall, 1963).

1
36
1
Les boucles latérales se déploient en paires symétriques
r
à
partir
des
chromomères
axiaux.
La
chromatine
inactive,
condensée dans
ces
chromomères,
représente
95%
de
l'ADN
du
1
génôme
de
l'ovocyte
(Sommerville
et
Malcolm,
1976
Sommerville et al.,
1978).
Contrairement
à ceux des chromo-
t
somes
polytènes,
les
chromomères
des
chromosomes
en
écouvillon d' amphibien
ne
sont pas
toujours
des
structures
unitaires
distinctes
(Sommerville
et al.,
1978
;
Callan,
1982). En effet, chaque chromomère est fréquemment associé à
plusieurs paires de boucles latérales.
De plus,
le nombre et
le
diamètre
de
ces
chromomères
varient
au
cours
de
l'ovogénèse,
et
tout
comme
le
développement
des
boucles
latérales,
reflètent
le
niveau
de
l'activité
transcr-iptionnelle
de
l'ovocyte
lorsque
le
taux
de
transcription est
bas,
les
chromomères
adjacents
tendent
à
fusionner entre eux le long de
l'axe chromosomique
(Snow et
Callan, 1969).
Les
boucles
latérales
présentent
des
variations
morphologiques
liées
à
la
forme
et
à
la
densité
de
leur
matrice
RNP.
Par
leur
aspect
hautement
caractéristique
et
leur localisation constante
le
long de
l'axe chromosomique,
certaines
de
ces
boucles
sont
de
vér i tables
repères
permettant
l'identification
des
chromosomes
et
l'établissement
de
cartes
chromosomiques
chez
diverses
espèces
d'amphibiens
(Callan
et
Lloyd,
1960
Mancino
et
Barsacchi, 1965, 1966 ; Lacroix, 1968 ;
Callan et al., 1987).
Chez
Pleurodeles
waltl,
on
distingue
ainsi
à
côté
de
la
grande
majorité
des
boucles
de
type
"normal",
des
boucles
géantes,
granulaires,
ou
globulaires,
et
des
boucles

matrice dense"
(figs.
1
et
2).
La morphologie
et
les
sites

37
d'apparition
de
ces
boucles
constituent
des
caractères
néréditaires, ségrégés selon les lois mendeléiennes (Lacroix,
1968); leur structure semble donc déterminée génétiquement.
1.2. Caractérisation des différents types de
boucles latérales en microscopie optique
Chez Pleurodeles waltl,
on observe au microscope optique
quatre
principaux
types
de
boucles
latérales,
classées
en
fonction de leur morphologie et de la taille des éléments qui
constituent leur matrice RNP. Ces boucles ont été décrites en
détail
par
Lacroix
(1968) .
Nous
en
rappellerons
les
caractéristiques maieures.
1.2.1. Les boucles normales et géantes
Les boucles normales constituent l'immense majorité des
boucles
latérales
il
en
existe,
en
effet,
plusieurs
milliers
dans
le caryotype
de
l'ovocyte.
Leur taille
varie
entre
5
et
25 lJ.
(du
sommet
de
la
boucle
à
l'axe
chromosomique; Lacroix,
1968), et leur développement est le
reflet de l'activité transcriptionnelle de l'ovocyte.
L'axe de ces boucles,
observées au microscope optique,
est
parfaitement
déployé
et
leur
matrice,
faiblement
contrastée,
est
d'aspect
fibreux
(fig.
2a).
Cette
matrice
présente
fréquemment
une
asymétrie
très
nette,
liée
à
une
distribution
polarisée
de
ses
constituants.
Au
sein
d'une
même
boucle,
on
remarque
souvent
plusieurs
gradients
d'épaisseur
dans
la
matrice
RNP,
matérialisant
plusieurs
unités de transcription.

38
Certaines boucles normales se distinguent des autres par
leur
taille
exceptionnelle
ce
sont
les
boucles
géantes,
dont la
longueur peut atteindre
50 }J.
(fig.
2a).
Cependant,
ces boucles se rencontrent sur tous
les chromosomes et sont
peu utilisées dans l'identification des bivalents.
1.2.2. Les boucles granulaires
Leur matrice est composée de granules sphériques de 0,5
é1
1
}J.
de
diamètre
(Lacroix,
1968),
très
contrastés
en
microcopie optique et disposés en zig-zag par rapport à l'axe
de
la
boucle
(fig.
2b).
L'augmentation
brutale,
ou
au
contraire
progressive,
de
la
taille
de
ces
granules d'une
extrémité
de
la
boucle
à·- l'autre,
détermine
une
polarité
marquée de la matrice.
Ces boucles, plus ou moins développées, parfois isolées
mais
plus
fréquemment
associées
aux
boucles
de
type
globulaire, caractérisent 8 des 12 bivalents de l'ovocyte, et
constituent ainsi de bons repères topographiques. Toutefois,
les boucles granulaires peuvent être tansitoirement absentes
du caryotype.
1.2.3. Les boucles globulaires
Ces
boucles
caractérisent
5
des
12
bivalents
du
caryotype de Pleurodeles waltl
(Lacroix,
1968). Leur matrice
est constituée d'éléments
denses,
grossièrement
sphériques,
dont les plus gros
ont 3 à
4 }J. de diamètre
(f ig.
2c).
Ces

39
éléments, ou globules,
fusionnent parfois entre eux,
formant
un
manchon
rigide,
plus
ou
moins
étendu.
Bien
que
les
globules d'une même boucle soient de diamètres variables,
i l
est très rare d'observer une polarité au niveau de la matrice
globulaire. Les boucles globulaires sont souvent groupées en
amas
touffus,
sur
des
portions
restreintes
de
l'axe
chromosomique et il est
alors
difficile
d'en déterminer
le
nombre exact.
Par leur morphologie hautement caractéristique et leur
remarquable constance,
les
boucles
globulaires
représentent
les repères topographiques les plus fiables.
1.2.4. Les boucles à matrice dense
Dénommées
"boucles
de
type
D"
par
Lacroix
(1968),
les
boucles
à
matrice
dense
apparaissent
uniquement
sur
deux
bivalents du caryotype de Pleurodeles waltl. En effet, chacun
des chromosomes
II
et X porte
en position subterminale une
paire de ces boucles, dont la matrice adopte des morphologies
variées.
Sous
l'un
de
ses
aspects,
on
distingue
dans
la
matrice dense des granules
semblables à
ceux de
la matrice
granulaire,
qui
fusionnent
par
groupes
de
plus
en
plus
importants pour former un manchon rigide autour de l'axe de
la boucle (fig.
2d).
Sous un autre aspect,
lorsque la fusion
de ces granules est complète, chaque boucle est réduite à un
lobe compact, ovoïde, souvent vacuolaire (fig. 2d').
Dans de nombreux ovocytes,
les boucles à matrice dense
ne sont pas visibles, soit qu'elles ne se développent pas, ou
qu'elles
perdent
leur
morphologie
caractéristique
pour

40
acquérir,
selon
Lacroix
(1968),
une
morphologie
de
type
"normal".
2. Organisation des chromosomes en écouvillon traités par le
froid
2.1. Conditions expérimentales
Les
femelles
de
Pleurodeles
wal tl,
élevées
en
laboratoire, vivent habituellement dans une eau à 20°C. Dans
nos expériences de stress hypothermique, nous avons placé des
femelles
dans
une
eau
très
froide,
4
à
10 ° C,
durant
une
période
s'étendant
de
un
jour
à
plusieurs
semaines.
Le
pleurodèle
étant
un
animal
pôïkylotherme,
la
cavi té
abdominale des femelles,
et par conséquent les ovaires,
sont
sensiblement à la même température que le milieu environnant.
Ceci a
été vérifié en introduisant une microsonde thermique
dans l'abdomen de ces femelles,
et dans les ovocytes:
2 à 4
heures
après
l'immersion
de
la
femelle
en
eau
foide,
la
température du contenu ovocytaire atteint déjà la température
ambiante.
Nos premières observations
ont été réalisées à partir
de femelles placées arbitrairement dans une eau à 8°C. Par la
suite,
nous avons testé les réponses de l'ovocyte à 4°C et à
10°C.
Il
nous
est
apparu
que
les
résultats
les
plus
significatifs
et
les plus
reproductibles
étaient obtenus
à
8°C. Toutes les expériences que nous consignons ici ont donc
été effectuées à 8°C.
Les
ovocytes
prélevés
chez
des
femelles
soumises
à
l'hypothermie ne présentent généralement aucune modification

41
morphologique apparente : toute irrégularité dans la forme ou
la
pigmentation
d'un
ovocyte,
est
signe
d'une
altération
physiologique
et
entraîne
son
élimination.
Les
ovocytes
sélectionnés
sont
en
vitellogénèse
moyenne
ou
tardive
(stades IV, V et VI ; Bonnanfant-Jaïs et Mentré, 1983). Après
leur
excision
de
la
femelle,
les
ovocytes
peuvent
être
maintenus en culture plusieurs
jours à
8°C,
dans un milieu
approprié (cf "Matériel et Méthodes").
Lors
de
l'ouverture,
on
note
dans
ces
ovocytes
un
épaississement du cytoplasme et une viscosité accrue du suc
nucléaire.
Cependant,
contrairement
à
ce
qui
a
été
décrit
dans les ovocytes de Xénope soumis à
un choc hyperthermique
(Flannery et Hill, 1988), la vésicule germinative ne présente
pas dé-fragilité particulière après traitemënt par le froid:
elle
peut
être
isolée manuellement
ou
recevoir
des
micro-
injections
de
substances
de
même,
aucune
difficulté
particulière
n'est
rencontrée
dans
la
réalisation
des
étalements chromosomiques
(cf
"Matériel et Méthodes").
Pour
éviter
que
des
écarts
de
température,
même
minimes,
n'introduisent
des
distorsions
dans
les
résultats
expérimentaux,
toutes
les
manipulations
d'ovocytes
isolés,
ainsi que les préparations chromosomiques, ont été réalisées
dans une chambre froide à BOC.
2.2. Description en microscopie optique des chromosomes
en écouvillon traités par le froid
Après
quelques
jours
d' hypothermie,
plusieurs
modifications
importantes
surviennent dans
la configuration

42
des
chromosomes
en
écouvillon.
La
figure
3
présente
le
bivalent VII du caryotype de l'ovocyte, observé en contraste
de phase
dans
des
conditions
normales
de température
(fig.
3a) et après S jours d'hypothermie
(fig. 3b). La comparaison
de
ces
deux
images
met
en
évidence
les
changements
structuraux
induits
par
le
froid
dans
les
chromosomes
en
écouvillon.
On
remarque,
à
Soc,
le
développement
extraordinaire des
boucles
latérales
situées dans
la région
médiane du bivalent (fig.3b).
En
effet,
la
modification
la
plus
spectaculaire
est
l'apparition de boucles
latérales,
exceptionnelles par
leur
taille -
les plus grandes d'entre elles atteignent
300 ~ de
haut -
mais aussi
par la morphologie de leur matrice RNP
;
celle-ci
n'appartient
à aucun des
types
de matrice
décrits
précédemment
chez
le
pleurodèle.
Nous
avons
dénommé
ces
boucles
particulières
"boucles
du
froid".
Il
en
existe
plusieurs exemplaires dans
le caryotype,
celles
du bivalent
VII étant, sans conteste, les mieux développées (fig.
3b).
Parallèlement
à
l'hyperdéveloppement
des
boucles
du
froid,
on note une
régression importante de
l'ensemble
des
boucles
normales,
dont
la
taille
et
le
nombre
sont
considérablement
réduits,
ainsi
qu'un
raccourcissement
très
net de la longueur des chromosomes (fig. 3a,b).
Les
boucles
granulaires
sont
absentes
des
bivalents
qu'elles
caractérisent
ordinairement,
tandis
que
d'autres
boucles-répères
les boucles
globulaires et
les boucles
à
matrice dense,
se maintiennent à leur emplacement habituel.
Cependant, si la morphologie des boucles à matrice dense est
parfaitement
conservée,
i l
n'en
est
pas
de
même
pour
les
boucles globulaires qui présentent des modifications structu-

43
rales
notables,
et
contribuent
ainsi
à
l'aspect
hautement
caractéristique des chromosomes en écouvillon traités par le
froid- (fig. 3b).
Les effets du froid
sur
la morphologie des chromosomes
en écouvillon sont rapidement
et parfaitement réversibles
la disparition des boucles du froid est enregistrée une heure
après le retour de l'ovocyte à la température normale (20°C)
et toutes les structures sont restaurées dès quatre heures.
De
plus,
ces
effets
sont
intégralement
reproduits
in
vi tro :
lorsque
l' hypothermie
est
appliquée,
non
plus
à
la
femelle, mais directement aux ovocytes prélevés à température
normale,
puis
incubés
à
8°C,
les
mêmes
modifications
surviennent
dans
les
chromosomes
en
écouvillon.
Toutefois,
l'amplitude des boucles du froid est moins spectaculaire dans
ce cas,
et atteint
son
point
maximal
dès
le deuxième
jour
d'incubation.
2.2.1. Boucles du froid
Comme nous le montrerons plus loin, les boucles du froid
se
développent
sur
8
des
12
bivalents
de
l'ovocyte,
et
atteignent
leur
taille
maximale
après
huit
jours
d'hypothermie. Elles se déploient alors loin de l'axe chromo-
somique, révélant ainsi une matrice RNP dense et d'épaisseur
inégale.
En
effet,
la
matrice
des
boucles du
froid montre
toujours une polarité très marquée. La figure 4 présente deux
exemples de boucles du froid:
dans le premier (fig.
4a),
la
matrice s'épaissit graduellement d'une extrèmité de la boucle
à l'autre, selon une polarité unique; dans le second exemple

44
(fig.
4b),
l'épaisseur de la matrice croît depuis la portion
médiane
de
la
boucle
jusqu'aux points
d'insertion
dans
le
chromomère,
selon
deux
polarités
inverses.
Les
boucles
du
froid
peuvent
donc
comporter
une
ou
plusieurs
unités
de
transcription.
Le long d'une même boucle du froid,
la matrice RNP peut
adopter
plusieurs
configurations,
en
relation directe
avec
les contours
de
l'axe
de
la
boucle.
Dans
la
région
de
la
boucle où l'axe est rectiligne,
la matrice RNP constitue un
manchon fin et régulier
(fig.
Sa,a').
La matrice s'épaissit
ensuite, à mesure que le tracé de l'axe de la boucle se fait
sinueux,
décrivant
ainsi un
zig-zag,
puis
un solénoïde
aux
spires très resserrées
(fig.
Sb,b'). Dans la partie la plus
épaisse de lâ-boucle,
l'amplitude de ces spires est telle que
l'axe
semble
former
de
petites
boucles
secondaires,
uniformément recouvertes par la matrice RNP (fig. Sc,c').
L'importance
relative
des
différents
aspects
de
la
matrice RNP varie au sein d'une même boucle, mais aussi d'une
boucle
à
l'autre.
La
figure
6
illustre
la
variabilité
morphologique des boucles du froid,
à travers trois exemples.
Dans
le
premier
(fig.
6a),
la
matrice
RNP
passe
successivement par tous les états décrits plus haut : manchon
rectiligne, zig-zag, spirale et "boucles secondaires".Dans le
second exemple (fig.
6b), la matrice décrit un zig-zag sur la
quasi-totalité de la boucle.
Enfin,
dans le dernier exemple
(fig.
6c),
la
configuration
en
"boucles
secondaires"
est
prédominante.
La matrice RNP des boucles du froid est donc d'un type
morphologique hautement caractéristique, qui ne s'apparente à
aucun de ceux répertoriés chez le pleurodèle.
Quel que soit

45
celui
de
ses
aspects
sous
lequel
on
la
considère,
elle
diffère
radicalement
de
la
matrice
fibreuse
des
boucles
normales, comme des matrices à éléments figurés des boucles-
repères,
observés
dans
des
conditions
normales
de
température.
2.2.2. Boucles globulaires
De prime abord,
l'impression produite par l'observation
en microscopie optique des chromosomes en écouvillon traités
par
le
froid,
est
celle
d'un
déploiement
des
boucles
globulaires
(fig.
3b).
En
effet,
dans
les
conditions
de
température
normale,
les
boucles
globulaires
se
présentent
comme des amas touf-fus de globules,
au sein desquels on ne
distingue que très rarement le tracé des boucles
(fig.
3a).
Au
contraire,
après
hypothermie,
de
nombreuses
boucles
globulaires apparaissent bien individualisées,
et s'étendent
loin de l'axe chromosomique.
Le
degré
de
déploiement
des
boucles
globulaires
est
fonction
de
deux
facteurs.
D'une
part,
il
dépend
de
leur
origine chromosomique
l'ampli tude de ces boucles est plus
importante lorsqu'elles appartiennent à des bivalents qui, à
température
normale,
portent
déjà
des
boucles
globulaires
bien développées. D'autre part,
i l est fonction de la taille
des boucles du froid
:
les boucles globulaires d'un bivalent
donné sont d'autant plus déployées que les boucles du froid,
sur le même bivalent,
sont
longues.
Ainsi,
le bivalent VII
qui
réunit
ces
deux
conditions
présente
généralement
les
boucles globulaires
les
plus
spectaculaires
(fig.
3a,b).
A
l'inverse, sur les chromosomes qui présentent peu de boucles

46
globulaires
à
20°C,
ou
sur
ceux
qui
ne
développent
aucune
boucle du froid,
les globules restent étroitement accolés à
l'axe chromosomique après traitement par le froid.
La
matrice
RNP
des
boucles
globulaires
soumises
a
l' hypothermie
adopte
deux
types
de
configuration.
Dans
le
premier (fig. 7a), la matrice est constituée de globules bien
individualisés,
et
lorsque
l'axe
de
la
boucle
est
complètement déployé,
on dénombre
25
à
50
globules
le long
d'une même boucle. On remarque, cependant,
une altération de
la
forme
des
globules
sphéroïdes
dans
les
conditions
normales
de
température,
ces
globules
deviennent
grossièrement
polygonaux
après
traitement
par
le
froid
et
présentent
des
contours
dentelés
(fig.
7a).
De
grosses
vacuoles
sont
fréquemment- visibles
au
sein
des
plus
gros
globules.
Sous
un
autre
aspect
de
ces
boucles,
les
globules
fusionnent entre eux pour former un manchon RNP,
extrêmement
dense, qui recouvre la quasi-totalité de la boucle. La figure
7b montre
un faisceau de
boucles
globulaires
remarquables,
tant
par
leur
développement,
que
par
l'importance
de
la
fusion des éléments de leur matrice.
2.3. Carte des chromosomes en écouvillon traités par le
froid
L'établissement
de
cartes
cytogénétiques
est
la
base
indispensable
de
toute
recherche
expérimentale
sur
les
chromosomes. Ceci a été amplement démontré pour les cartes de
chromosomes en écouvillon d'amphibiens, qui ont permis nombre
de travaux ultérieurs sur la structure et la fonction de ces

47
chromosomes (Gall, 1954 ;
Callan et Lloyd, 1960 ; Mancino et
Barsacchi,
1965
,
1966
Lacroix,
1968
;
Callan
et al.,
1987) .
Il était donc essentiel de reporter avec précision sur
une
carte
les
modifications
affectant
les
chromosomes
en
écouvillon traités par le froid.
2.3.1. Critères permettant l'établissement de la
carte chromosomigue
Nous avons établi la carte des chromosomes en écouvillon
traités par le froid (fig. 8b), en nous inspirant de la carte
réalisée par Lacroix (1968
;
fig.
8a).
Afin de faciliter la
comparaison entre les deux~ cartes cytogénétiques,
nous nous
sonunes
efforcés
de
conserver
au
mieux
les
critères
d'identification,
de
classification
et
de
représentation
définis et utilisés par cet auteur.
a) Chacun des 12 bivalents du caryotype est affecté d'un
chiffre romain,
qui
fait
référence à
son correspondant
mitotique. Les chromosomes sont classés selon l'ordre de
grandeur de ce chiffre, et non par ordre de taille.
b)
Les chromosomes sont identifiés et orientés grâce à
la
présence de
structures
caractéristiques
granules
axiaux,
sphères,
nucléoles
intégrés,
mais
aussi
et
surout
grâce
aux
boucles-repères.
Les
boucles
globulaires, en se maintenant sur leurs sites d'origine,
facilitent l'identification des chromosomes traités par
le
froid.
De
même,
les
boucles
à
matrice
dense

•1
48
persistent dans la partie subterminale des bivalents II
1
et
X.
Nous
avons
rencontré
plus
de
difficultés
pour
1
l'identification des chromosomes qui sont habituellement
caractérisés
par
la
présence
de
boucles
géantes
1
(bivalent 1),
ou de boucles granulaires
(bivalents III
et VIII),
ces
deux
types
de
repères
disparaissant
au
1
cours
de
l' hypothermie.
Dans ces
cas
particuliers,
la
longueur
des
chromosomes
est
un
élément
important
de
reconnaissance. En effet, bien que l'hypothermie induise
une
réduction
de
la
longueur
ini tiale
de
l'axe
chromosomique,
nous
avons
constaté
que
la
taille
relative des chromosomes était généralement maintenue :
ainsi, les bivalents l, II et III restent les plus grands
du
caryotype,
et
le
bivalent
XII,
le
plus
petit.
concrètement,
le
bivalent
l
est
identifié
grâce
à
sa
longueur et à la présence de deux gros granules axiaux
dans sa région médiane
; le bivalent III est identifié
après
reconnaissance posi ti ve des
bivalents l
et II
enfin,
le
bivalent
VIII
est
identifié
après
reconnaissance des bivalents IX et X, qui sont de taille
semblable, mais portent des boucles-repères.
c)
Lacroix
(1968)
définit
la
position
des
différents
repères
sur
les
chromosomes
par
un
indice
"qui
représente le
rapport de
la longueur du segment d'axe
compris
entre
le
télomère
gauche
et
la
structure
considérée, sur la longueur totale du chromosome". Dans
le
cas
des
chromosomes
traités
par
le
froid,
un
tel
indice aurait une valeur discutable,
car
i l n'est pas
certain
que
la
condensation
de
l'axe
s'opère

49
uniformément sur toute la longueur du chromosome.
Pour
déterminer
avec
précision
les
sites
d'apparition
des
boucles
du
froid,
nous
avons
plutôt
considéré
leur
position par rapport à des repères immuables
:
boucles
globulaires, boucles à matrice dense, ou sphères.
d)
Sur la carte chromosomique modifiée d'après Lacroix
(1968 ; fig.
8a), et sur la nouvelle carte établie après
hypothermie
(fig.
8b),
seuls
figurent
les
repères
les
plus caractéristiques.
Il s'agit des boucles-repères et
des sphères à 20°C (fig. 8a), auxquelles s'ajoutent les
boucles
du
froid
à
8°C
(fig.
8b)
les
boucles
globulaires
sont
représentées
par
des
symboles
différents
dans
la
nouvelle
carte
chromosomique
(fig.
8b),
pour
indiquer
l'altération morphologique
qu'elles
subissent
au
cours
de
l' hypothermie.
D'autres
jalons,
qui apparaissaient sur la carte originale réalisée par
Lacroix (1968) ont été volontairement omis, en raison de
leur
caractère
secondaire ou irrégulier,
et par
souci
d'alléger les diagrammes.
La carte que nous avons dessinée
(fig.
8b),
ainsi que
les tableaux ou histogrammes suivants,
résument
les données
moyennes
provenant
de
l'examen
de
50
préparations
chromosomiques obtenues à partir des ovocytes de 4 femelles
soumises à une hypothermie de la jours.

50
2.3.2. Analyse comparative du caryotype de l'ovo-
cyte, avant et après traitement par le froid
L'examen des deux cartes chromosomiques,
réalisées à
la
même échelle
(fig.
Sa,b),
met
en
évidence
la
réduction
de
taille qui affecte les chromosomes en écouvillon traités par
le froid.
Dans
la plupart des
chromosomes,
cette
réduction
est de 1/2 à 1/3 ; la condensation maximale est observée dans
le chromosome XII,
qui ne mesure plus que le septième de sa
longueur
initiale
(tableau
1).
La
taille
moyenne
des
chromosomes
soumis
à
l ' hypothermie
s'échelonne
entre
25
et
175 lJ.ffi
;
dans des
conditions
normales
de
température,
elle
variait entre 160 et 500 ~ (Lacroix, 1968).
Tableau 1
Chromosome
Longueur à SOC
Paires de
Fréquence
Paires de
boucles
des boucles boucles
Longueur à 20°C
du froid
du froid
granulai-
à SOC
res à 20C
l
1/3
II
1/3
III
1/3
1
45%
2
IV
1/2,5
1(*)
50%
1*
V
1/3
1
100%
1
VI
1/3
VII
1/2
4
100%
4
VIII
1/3
1
100%
2
IX
1/3
1 ou 2
100%
3
X
1/3
1
70%
4
XI
1/3
1 ou 2
90%
3
XII
1/7
(* ) Les deux homologues du bivalent IV sont toujours hétéro-
morphes ( cf. texte) .
Les boucles du froid s'observent sur 8 des 12 bivalents
du caryotype:
les bivalents III,
IV, V, VII, VIII,
IX, X et

1
51
1
XI (fig.
8b et fig.
9). Si leurs sites de développement sont
constants, la fréquence d'apparition de ces boucles dans des
r
conditions
d'hypothermie
identiques
(10
jours à
aOC)
varie
1
d'un
bivalent
~
l'autre.
Le
tableau
1
illustre
cette
variabilité.
Les
bivalents
V~
VII~
VIII
et
IX
portent
1
toujours des boucles du froid
(f~équence : 100%)~ tandis que
le
bivalent
III
est
le
moins
constant
à
cet
égard
1
(fréquence: 45%).
Précisons
que
les
deux
homologues
du
bivalent IV sont toujours hétéromorphes, les boucles du froid
r
ne se développant que sur l'un des deux chromosomes (fig. 9).
1
Le degré de développement atteint par les boucles du
froid
varie
d'un
bivalent
a
l'autre,
mais
aussi
d'une
1
préparation chromosomique à
l'autre.
Les histogrammes de la
figure 10 représentent la~distribution de la taille relative
des
boucles
du
froid,
sur
chacun
des
huit
bivalents
concernés. La "taille relative" est le rapport de la hauteur
d'une boucle du froid donnée
(distance entre le sommet de la
boucle
et
l'axe
chromosomique)
sur
la
hauteur
moyenne
des
boucles
normales
adj acentes.
Deux
raisons
principales
nous
ont conduit à exprimer ainsi le degré de développement de ces
boucles :
-
Premièrement,
le
tracé
sinueux décrit par l'axe
des
boucles du froid, et le fait que la base de ces boucles
soi t
fréquemment
masquée
par
les
boucles
globulaires
contigües,
rendaient
fastidieuse
et
très
imprécise
l'estimation de leur longueur absolue;
Deuxièmement,
l'intensité
des
modifications
chromosomiques peut varier d'une préparation à l'autre,
dans les mêmes conditions d'hypothermie. En particulier,
nous
avons
constaté
que
la
régression
des
boucles

52
normales était moins accentuée dans les jeunes ovocytes
(stade IV)
que dans
les plus
âgés
;
à
l'inverse, c'est
généralement
dans
les
ovocytes
au
stade
VI
que
s'observent les plus grandes boucles du froid.
La taille relative des boucles du froid,
telle que nous
l'avons
définie,
reflète
donc
à
la
fois
la
sensibilité
individuelle des ovocytes à
l'agression subie, et l'aptitude
de chaque bivalent à développer des boucles du froid. Ainsi,
sur
les histogranunes que nous
avons
réalisés
(fig.
10),
on
remarque que
le bivalent III porte
les plus petites boucles
du
froid de
tout
le caryotype
(taille
relative de
1
à
3),
tandis que celles du bivalent VII
se singularisent par leur
amplitude (taille relative de 17 à
25) et par leur constance
(fréquence :
100%).
Nous
consië1érons
les
boucles
du
froid
situées
sur
le
bivalent
VII
comme
des
marqueurs
de
l'efficacité du traitement par
le
froid
les modifications
de l'ensemble du caryotype sont d'autant plus accentuées que
ces boucles sont longues.
3. Discussion: Caractéristiques des chromosomes en
écouvillon traités par le froid
Les
boucles
latérales
des
chromosomes
en
écouvillon
adoptent
des
comportements
variés
,
en
réponse
à
une
hypothermie prolongée.

1
53
1
3.1. Réqression des boucles normales
1
A l'échelle de la microscopie optique,
la structure de
~
ces
bouc les
n'est
pas modif iée .
Cependant,
on
observe
une
réduction très
nette de
leur
taille
et
de
leur
nombre.
La
!
régression
des
boucles
normales
est
très
probablement
responsable du raccourcissement de
l'axe chromosomique,
qui
1
affecte indifféremment tous les chromosomes.
3.2. Altération de la morpholoqie des boucles
globulaires
Les boucles globulaires se maintiennent sur leurs sites
hâbituels, mais subissent une modification de leur structure
initiale. Cette modification se traduit par une altération de
la
forme
des
globules,
qui
présentent
fréquemment
des
contours crénelés, mais aussi par un déploiement remarquable
de l'axe de ces boucles. Ce déploiement semble s'accompagner
d'une
augmentation
de
la
longueur
initiale
des
boucles
globulaires,
et
surtout,
d'une
augmentation
du
nombre
de
globules
qui
composent
chaque
boucle :
en
effet,
dans
les
conditions
normales
de
température
(20°C),
et
lorsque
la
configuration des boucles globulaires le permet, on dénombre
généralement
une
dizaine
de
globules
le
long
d'une
même
boucle ;
après traitement par le froid,
ces boucles peuvent
présenter
jusqu'à
50
globules
de
diamètres
variables.
Une
fusion
intensive
survient
fréquemment
entre
globules
adjacents, conduisant ainsi à la formation d'un manchon dense
dans la matrice des boucles globulaires ; bien que de moindre
ampleur,
une
telle fusion
s'observe
également
au niveau de

54
ces boucles, dans des conditions de température normales (cf.
paragraphe 1.2).
3.3. Maintien de la morphologie des boucles à matrice
dense
Après traitement par le froid, ces boucles ne présentent
aucune
altération
morphologique
en
microscopie
optique
(figure
9),
et
subsistent dans
la
partie
subterminale
des
bivalents
II
et
X.
Tout
au
plus
peut-on
remarquer
une
vacuolisation plus fréquente de la matrice dense, au cours de
l'hypothermie.
3.4.~Absence des boucles granulaires et hyperdévelop-
pement des boucles du froid
Ces
deux
évènements
sont
incontestablement
liés.
En
effet,
l'analyse
attentive
des
cartes
chromosomiques
présentées
sur
la
figure
a met en évidence la coïncidence
entre
les
si tes
de développement des
boucles
granulaire~ à
20°C, et ceux des boucles du froid à aoc. Cette assertion est
étayée par plusieurs observations.
(1)
Seuls les
chromosomes, qui dans
les conditions normales
portent
des
boucles
granulaires,
présentent
des
boucles du
froid
à
8°C.
Les
chromosomes
l,
II,
VI
et
XII,
qui
sont
dépourvus de boucles granulaires à
20°C
(Lacroix,
1968),
ne
développent jamais de boucles du froid (voir tableau 1).
(2)
Le nombre de boucles granulaires à 20°C et le nombre de
boucles du froid à 8°C localisées sur chacun des chromosomes
IV, V et VII,
sont parfaitement identiques (voir tableau 1).

55
Par
contre,
sur
les
cinq
autres
chromosomes
porteurs
de
boucles du froid,
le nombre de ces boucles apparaît inférieur
à celui des boucles granulaires correspondantes (voir tableau
1) •
Dans
son
étude
détaillée
du
caryotype
de
Pleurodeles
waltl,
Lacroix
(1968)
précise
que
les
différentes
boucles
granulaires d'un bivalent donné sont de constance
inégale ;
la valeur de ces boucles en tant que repères dépend de leur
constance, mais aussi de l'importance de leur développement.
Ainsi,
selon
cette
étude,
et
comme
nous
l'avons
souvent
constaté, les boucles granulaires des chromosomes III et VIII
sont rares ou très discrètes ; or, comme on peut le voir sur
les histogrammes
(fig. 10), les boucles du froid portées par
ces deux chromosDmes sont parmi les plus petites du c~ryotype
(taille
relative
de
1 à
5),
et leur fréquence
d'apparition
sur le chromosome III est très basse (45%).
Toujours
selon
Lacroix
(1968),
une
seule
des
trois
paires de boucles granulaires du chromosome XI
a
réellement
valeur de marqueur
:
i l s'agit de la paire de boucles située
entre
la
sphère
médiane
et
les
boucles
globulaires,
localisation en tout point identique à celle de la principale
paire de boucles
du froid observée sur ce chromosome
(f ig.
8b)
le deuxième exemplaire de boucles du froid,
mentionné
sur la carte (fig. 8b), est beaucoup plus rare. Une situation
similaire prévaut dans le cas du chromosome IX,
où le
site
contigü aux boucles globulaires est le plus apte
à produire
des boucles du froid,
et dans le cas du chromosome X qui ne
~résente qu'une
paire
de
boucles
du
froid.
Il
est
donc
hautement probable que les boucles du froid observées à aoc
soient équivalentes à celles des boucles granulaires qui sont

56
les
plus
fréquentes,
et
les
mieux
développées
dans
les
conditions de température normales.
(3)
Le cas particulier du bivalent IV constitue un argument
supplémentaire.
Comme
nous
l'avons
souligné,
les
deux
homologues de ce bivalent sont toujours hétéromorphes à
8°C,
une paire de boucles du froid
apparaissant sur un seul des
deux chromosomes
(fig.
9)
; or,
un hétéromorphisme affectant
la partie
de ce
bivalent
qui
comporte
le
site des
boucles
granulaires, a également été décrit à 20°C (Lacroix, 1968).
(4)
Enfin,
les
boucles
du
froid,
comme
les
boucles
granulaires
sont
plus
importantes
dans
les
gros
ovocytes
(stade VI), que dans les plus jeunes.
La question majeure-qui se pose désormais, est de savoir-
si
les boucles granulaires
et
les
boucles du
froid
ont
en
commun plus que leurs sites de développement. Les boucles du
froid sont-elles
le
résultat d'un changement de
la
confor-
mation des boucles granulaires,
ou représentent-elles plutôt
l'expression nouvelle d'informations spécifiques, qui ne sont
pas sollicitées à température normale? L'analyse de l'évolu-
tion
des
modifications
chromosomiques,
au
cours
de
l'hypothermie (voir paragraphe II.2),
fournira un élément de
réponse essentiel à cette question.
Quoi qu'il en soit,
l'hyperdéveloppement des boucles du
froid participe probablement à
un processus d'adaptation de
l'ovocyte à des conditions de milieu particulières. En effet,
ces
boucles
se
maintiennent
sur
leurs
si tes
d' appari tion
aussi longtemps que l'ovocyte survit en hypothermie. De plus,
elles
régressent
très
rapidement
lors
du
retour
à
la
température normale
: une heure après que l'ovocyte ait été

57
incubé à
20°C,
les boucles du froid ne sont plus visibles ;
au bout de deux à quatre heures
à
20°C,
la morphologie des
chromosomes en écouvillon est parfaitement restaurée et les
boucles
granulaires
sont
à
nouveau
observées
à
leur
emplacement habituel.

58
II.
MODIFICATIONS DE L'ORGANISATION DES MATRICES RNP DES
BOUCLES LATERALES
1. Matrices des boucles latérales observées à
température normale : analyse ultrastructurale
1.1. Identification des différents types de boucles
latérales en microscopie électronique
1.1.1. Microscopie électronique à transmission
Pour
cette
étude,
nous
avons
utilisé
un
procédé
de
préparation
des
chromosomes
en
écouvillon,
qui
permet
l'observation d'un
même
bivalent~ à
la
fois
en microscopie
optique
et
en
microscopie
électronique
à
transmission
sur
coupes
ultrafines
(Gounon
et
Karsenti,
1981
Spring
et
Franke, 1981 i cf. "Matériel et Méthodes").
Les différentes régions d'un même chromosome sont ainsi
repérées en microscopie optique à
constraste de phase,
puis
en
microscopie
électronique
à
faible
grandissement,
avant
d'être détaillées à des grandissements très élevés. La figure
11 présente le bivalent XI de l'ovocyte de Pleurodeles waltl,
observé en contraste de phase, puis en microscopie électroni-
que à
transmission:
on reconnaît
sur ces deux images l'axe
chromosomique
matérialisé
par
les
chromomères,
des
boucles
normales, des boucles globulaires et des boucles granulaires.
Ce
bivalent
est
également
caractérisé
par
la
présence
en
position médiane d'une structure particulière appelée sphère
(Lacroix, 1968). La comparaison de ces deux images montre que
la morphologie des chromosomes est parfaitement préservée au

59
cours de la préparation pour la microscopie électronique. Les
dimensions des chromomères, la taille des différentes boucles
latérales,
l'épaisseur et les caractéristiques individuelles
de
leur
matrice,
n'ont
pas
été
altérées
au
cours
des
multiples étapes de fixation et d'inclusion des chromosomes.
Les
seules
divergences
enregistrées
entre
les
deux
types
d'image sont très localisées et reflètent des distorsions du
plan
de
coupe.
Les
matrices
RNP
des
différents
types
de
boucles latérales,
sélectionnées en microscopie optique, ont
été
analysées
de
façon
systématique
en
microscopie
électronique sur coupes ultrafines.
1.1.2. Microscopie électronique à balayage
Les
chromosomes
en
écouvillon
ont
été
préparés
pour
l'examen
en
microscopie
électronique
à
balayage
selon
une
méthode
mise
au point par
Daskal
et al.
(1976,
1978)
pour
l'observation des nucléoles et des chromosomes métaphasiques.
Cette méthode a été adaptée et appliquée aux chromosomes en
écouvillon
par
Angelier
et al.
(1984,
cf.
"Matériel
et
Méthodes")
;
les conditions de fixation,
de déshydratation,
et d'ombrage des étalements chromosomiques, ont été définies
de manière à en préserver les structures.
La
figure
12
montre
le
même
bivalent,
observé
en
microscopie
optique
(fig.
12a) ,
puis
en
microscopie
électronique
à
balayage
(fig.
12b),
à
des
grossissements
rigoureusement identiques
:
i l s'agit du bivalent VII,
dont
chacun des
chromosomes homologues
porte,
outre des
boucles
normales bien développées, un remarquable faisceau de boucles
globulaires. En comparant ces deux images, on peut constater

60
que les moindres détails de la structure chromosomique sont
fidèlement reproduits en microscopie électronique à balayage.
Les
différents
types
de
boucles
latérales,
ainsi
identifiés,
sont ensuite analysés à des
grandissements plus
élevés.
L'étude
en
microscopie
électronique
a
balayage
corrobore les résultats obtenus en microscopie électronique à
transmission sur
coupes
fines.
De plus,
l'examen de
photo-
graphies prises en stéréo apporte de précieuses informations
sur l'organisation dans l'espace tridimensionnel des matrices
RNP de boucle latérale.
1.2. Matrice des boucles normales et géantes
En microscopie
électronique
à
transmission,
et
sur
un
plan de
coupe particulièrement favorable incluant
la quasi-
totalité de
la boucle
(figure 13b),
la matrice des boucles
normales
et
géantes
présente
deux
caractéristiques
principales :
- La première de ces caractéristiques est une asymétrie
accentuée
(fig.
13b)
déjà
remarquée
en
microscopie
optique
(fig.
13a).
Cette
aSYmétrie
est
liée
à
l'existence d'un ou de plusieurs gradients d'épaisseur,
matérialisant
les
unités
de
transcription.
Dans
la
matrice
de
la
boucle
géante
présentée
dans
la
figure
13b,
on
distingue
ainsi
au
moins
deux
unités
de
transcription de polarités inverses.
-
L'autre caractéristique de cette matrice observée en
microscopie
électronique
à
balayage,
est
sa
texture
particulaire
(fig.
13b).
Cette structure est confirmée
lorsqu'une portion de la matrice normale est détaillée à

61
fort grandissement (fig. 13c). La matrice apparaît alors
constituée de particules arrondies, d'un diamètre ·remar-
quablement uniforme.
Cette apparente uniformité dans la taille des particules
de
la matrice
est
vérifiée par
une mesure
systématique de
leur diamètre,
sur des coupes sériées de boucles normales et
géantes
issues
tantôt
d'un
même
étalement
chromosomique,
tantôt de plusieurs étalements.
Il ressort de cette analyse
que les particules observées dans la matrice de type normal
ont
un
diamètre
constant
de
30
nm,
diamètre
qui
demeure
invariable le long d'une même boucle, mais aussi d'une boucle
à l'autre.
De plus,
lorsque la coupe est tangentielle à la matrice
de la boucle, ces particures apparaissent alignées comme les
perles d'un collier,
le
long de
fibrilles
déployées
radia-
lement par rapport à
l'axe de DNP de la boucle
(fig.
13c).
Une
telle
organisation
de
la
matrice
RNP
a
également
été
décrite
en
microscopie
électronique,
chez
diverses
espèces
d'Amphibiens
(Gall,
1956
Malcolm et
Sommerville,
1974
Mott et Callan, 1975 ; Spring et Franke, 1981). Les aggrégats
linéaires de particules observés
in si tu ont été isolés et
caractérisés
(Sommerville,
1973
Malcolm
et
Sommerville,
1974, 1977). Ces aggrégats, ou fibrilles, correspondent à des
molécules
d' ARN
en
cours
d'élongation,
périodiquement
associées à
des protéines acides pour former des particules
RNP ;
la continuité entre les particules d'une même fibrille
RNP est donc assurée par l'ARN.
En microscopie
électronique
à
balayage
(fig.
14),
on
retrouve la structure particulaire de la matrice normale. Les

62
particules RNP de taille régulière,
étroitement accolées les
unes aux autres,
emballent l'axe de la boucle sur toute sa
longueur (fig.
14a). Par endroits, on remarque cependant des
interruptions
dans
la
gaine
particulaire,
correspondant
probablement à des intervalles entre unités de transcription
adjacentes

Dans la partie la plus épaisse de
la matrice,
les
particules
RNP
tendent
parfois
à
se
rassembler
en
aggrégats de type granulaire.
Le
diamètre
moyen
des
particules
RNP,
mesuré
sur
un
détail de la matrice normale (fig.
14b, cl, est de 50 nm, ce
qui est en apparente contradiction avec le diamètre de 30 nm
décrit
en
microscopie
électronique
à
transmission
cette
différence de taille est attribuée à l'épaisseur de la couche
métallique déposée sur les chromosomes avant l'observation en
microscopie
électronique
à
balayage
(cf. "Matériel
et
Méthodes").
En
effet,
au
cours
de
l'étape
d'ombrage,
une
couche
d'or
de
la
nm
d'épaisseur
est
évaporée
sur
les
étalements chromosomiques.
Les particules de 50 nm observées
en microscopie électronique à balayage sont donc, sans aucun
doute, identiques à celles de 30 nm trouvées en microscopie
électronique à transmission.
Sur des stéréographies d'une portion de matrice normale,
prises
à
des
grossissements
importants
(fig.
14b,
c),
on
reconnaît
l'alignement
des
particules RNP
en fibrilles,
et
l'on
peut
visualiser
la
disposition de
ces
fibrilles
dans
l'espace
tridimensionnel
les
fibrilles
RNP
s'enroulent
autour
de
l'axe
virtuel
de
la
boucle,
en
un
mouvement
régulier.
Ce mouvement confère aux particules RNP,
qui
leur
sont associées, un agencement hélicoïdal par rapport à l'axe
de la boucle (fig. 14b, cl.

63
1.3. Matrice des boucles granulaires
Sur
une
coupe
observée
à
faible
grandissement
(fig.
15b),
les
granules
de
la
matrice
granulaire
apparaissent
comme
des
aggrégats de
matériel dense
aux électrons
et de
texture particulaire. Dans la partie proximale de la boucle,
les
granules
adoptent
une
disposition
en
zig-zag,
déjà
remarquée
en
microscopie
optique
(fig.
15a).
Ces
granules
peuvent
fusionner
entre
eux
dans
certaines
portions
de
matrice.
Sur un détail de
la matrice granulaire
(fig.
15c),
la
structure particulaire
des
granules
est
très
nette.
Chaque
graml1e
a,
en effet,
l'aspect
d' un
amas~ de
particules
RNP
semblables à celles que l'on trouve dans la matrice normale.
Ces
particules
se distinguent
parfaitement
à
la périphérie
des granules,
ce qui nous a permis d'en mesurer le diamètre
avec
précision
comme
dans
la
matrice
normale,
les
particules
RNP
de
la
matrice
granulaire
ont
un
diamètre
régulier de 30 nrn.
De
plus,
des
fibrilles
RNP
présentant
un
alignement
caractéristique de
particules de
30
nrn,
se déploient
à
la
périphérie de certains granules,
oü elles établissent entre
elles de nombreux contacts (fig. l5c).
Ces
images
suggèrent
que
les
granules
correspondent à
une compaction des fibrilles RNP,
c'est-à-dire des produits
de la transcription.

64
L'examen de la matrice granulaire en microscopie électronique
à balayage corrobore les informations obtenues en microscopie
optique, comme en microscopie électronique à transmission.
La
boucle
granulaire
est
toujours
fortement
aSYmétrique
(fig.
16a).
Dans
les parties de
la boucle
qui
s'insèrent
dans
le
chromomère,
la
matrice
est
généralement de
type
"normal".
Elle s'épaissit ensui te
progressivement,
en
même
temps
qu'apparaissent
des
granules
de
diamètre
croissant.
Les
plus
gros
de
ces
granules
peuvent
atteindre
3
~
de
diamètre,
s'assimilant ainsi à de petits globules.
Chaque
granule
est
un
aggrégat
sphéroïdal
de
particules RNP de 50 nm, équivalentes aux particules de
~O
nm
décrites
en
microscopie-
électronique
à
transmission.
- L'examen en stéréo d'une portion de matrice granulaire
( f igs
16b,
c)
révèle
une
disposition
hélicoïdale
des
granules,
chaque
granule occupant un plan décalé
dans
l'espace
par
rapport
aux
granules
adjacents.
Cet
agencement
rappelle
l'agencement en zig-zag observé en
microscopie
optique
et
en
microscopie
électronique
à
transmission
(fig.
15),
le
zig-zag étant la projection
sur un plan de l'hélice visualisée en trois dimensions.
De
plus,
la
disposition
hélicoïdale
des
granules
s'accompagne d'une légère torsion de l'axe de la boucle,
(fig. 16b, c).

65
1.4. Matrice des boucles globulaires
La figure 17b représente une boucle globulaire, observée
sur
coupe
ultra-fine.
Un
plan
de
coupe
exceptionnellement
favorable
permet
de
suivre
le
tracé
de
la
boucle,
et
de
visualiser
l'alignement
des
globules.
A
plus
fort
grandissement
( fig.
17 c ),
chaque globule apparaît
comme un
gros
aggrégat
de
matériel
très
dense
aux
électrons,
comportant trois zones :
-
un
coeur
généralement
bien circonscrit,
extrêmement
compact ;
- entourant ce coeur,
une zone moins dense,
de texture
particulaire ;
la
t~oisième
zone,
périphérique,
se
compose
de
fibrilles RNP qui se déploient tout autour du globule ;
on retrouve dans ces fibrilles l'agencement linéaire des
particules RNP de 30 nm de diamètre
les fibrilles RNP
issues
d'un
même
globule,
ainsi
que
de
globules
adj acents,
établissent
entre
elles
de
nombreuses
interactions (fig. 17c).
Chaque
globule
résulterait
donc
d'une
compaction très
importante
de
fibrilles
RNP,
compaction
plus
intensive
au
centre
du
globule,

la
texture
particulaire
est
diffi-
cilement visualisée.
En
microscopie
électronique
à
balayage,
les
boucles
globulaires se présentent généralement sous la forme de gros
buissons de globules, étroitement accolés les uns aux autres
(fig.
18a).
Chaque
globule
est
un
aggrégat
compact
de
particules
RNP
de
50
nm
(fig.
18b,
c)
correspondant
aux

66
particules de
30 run
trouvées en microscopie électronique
à
transmission dans la matrice globulaire. A la périphérie des
globules,
on
distingue
l'alignement
des
particules
en
fibrilles RNP
:
par les nombreux contacts qui s'établissent
entre
elles,
les
fibrilles
issues
de
globules
adjacents
tissent
un
réseau
qui
occupe
l'espace
inter-globules
(fig. 18a).
Les figures 18b et 18c présentent une portion de boucle
globulaire photographiée en stéréo:
l'axe de la boucle peut
être
suivi
sur
une
longueur
appréciable,
ce qui
est assez
rare dans ce type de boucle. On remarque, dans la matrice, un
manchon particulaire quasi-continu, résultat de la fusion de
plusieurs
globules.
Les
globules
adoptent
une
disposition
hélicoïdale,
rappelant
celle~ des
granules,
et
l'axe
de
la
boucle accuse une torsion très accentuée.
1.5. Matrice des boucles "à matrice dense"
Comme
son
nom
l'indique,
la
boucle
"à matrice
dense"
révèle un aspect très compact en microscopie électronique à
transmission. La figure 19b montre une paire de boucles, dont
la matrice
est réduite
à
une masse particulaire,
vacuolée,
aux
contours
irréguliers.
Sur
un
détail
de
cette
matrice
(fig. 19c)
on distingue
nettement
des
particules
RNP
de
30 run de diamètre, identiques à celles qui composent tous les
autres types de matrice. Cependant, l'agencement en fibrilles
de
ces
particules
n'est
pas
reconnaissable.
Nous
pensons
néarunoins, qu'un tel agencement existe au sein de la matrice
dense,
mais
que
l'extrême
compaction
des
produits
de
la
transcription empêche sa visualisation.

67
Observée
en
microscopie
électronique
à
balayage
(fig. 20), la matrice dense enveloppe l'axe de la boucle dans
une gaine particulaire continue : cette gaine est constituée
de particules RNP de 50 nm, étroitement accolées les unes aux
autres
(fig.
20b, cl.
L'examen en stéréo révèle une torsion
accusée de l'axe de la boucle (fig. 20b, cl.
1.6. Discussion : Modèle d'organisation structurale des
différents types de matrice RNP.
Notre
étude
ultrastructurale
et
comparative
des
différents
types
de
boucles
latérales
démontre
l'existence
d'une
structure
primaire
commune
à
toutes
les matrices de
boucles
latérales,
quelle
qu.e
soit
leur
morphologie
une
particule RNP de 30 nm de diamètre. En effet, dans tous les
types
morphologiques
de
matrice,
les
transcrits
naissants
sont organisés
en fibrilles
RNP,
les molécules d' ARN étant
régulièrement
complexées
en particules RNP de
30
nm.
Cette
observation est conforme à toutes celles réalisées auparavant
dans
l'ovocyte
d' amphibien
(Malcolm et
Sommerville,
1974
Mott et Callan,
1975
Angelier
et Lacroix,
1975
Scheer
et al.,
1976) ,
mais
ces
différents
auteurs
s'étaient
principalement attachés à l'ultrastructure des seules boucles
normales.
Il
ressort
de
notre
étude
ultrastructurale
que
les
variations morphologiques observées au niveau des boucies du
pleurodèle
sont
liées
à
une
compaction
plus
ou
moins
importante des
fibrilles RNP au sein de leur matrice
:
les
fibrilles
RNP,
distinctes
dans
la
matrice
de
type
normal,

68
sont rassemblées en aggrégats de densité croissante dans la
matrice granulaire, puis dans la matrice globulaire, et enfin
dans la matrice dense.
Plusieurs
types
d'interactions
moléculaires
interviennent
dans
la
constitution
des
matrices
RNP
des
boucles
latérales.
La
formation
des
particules
de
30
nm,
visibles au sein de chaque fibrille RNP, est assurée par des
interactions
de
type
ARN-protéines,
mais
aussi
par
des
interactions
de
type
protéines-protéines
(Malcolm
et
Sommerville,
1974)
la
nature
de
ces
interactions
sera
discutée
plus
loin
(voir
chapitre IV).
D'après
nos
observations
en
microscopie
électronique,
des
interactions
protéiques
surviendraient
également
entre
fibrilles
RNP
adjacentes, et joueraient un rôle essentiel dans le maintien
des
aggrégats
qui
constituent
les
matrices
des
boucles-
repères. En effet, les fibrilles RNP émergeant de granules ou
de globules contigüs, tissent entre elles un réseau connectif
très important. De même,
la fusion des éléments figurés dans
la
matrice
des
boucles-repères,
fusion
maximale
dans
la
matrice
dense,
s'expliquerait
par
une
extension
de
ces
interactions protéiques à des portions de boucle de plus en
plus grandes.
Cette observation est corroborée, indirectement, par les
images de boucles latérales observées après étalement par la
technique de Miller et Beatty (1969), qui détruit la plupart
des liaisons protéiques : les transcrits primaires sont alors
visualisés,
sous forme de fibrilles regroupées en unités de
transcription,
mais
la
structure
cara~téristique de
la
matrice
RNP
est
détruite
;
les
boucles-repères
ne
se

69
distinguent
alors
plus
des
boucles
normales
(Angelier
et
Lacroix, 1975 ; Angelier, 1978).
Par
contre,
lorsque
la
déprotéinisation
est
plus
ménagée,
la
morphologie
de
chaque
type
de
matrice
est
suffisanunent
maintenue
pour
être
identifiée
sans
ambiguité
(Angelier et Lavaud, 1982 ; Penrad-Mobayed et al., 1986).
L'analyse
en microscopie
électronique
à
balayage
fait
apparaître
un
enroulement
de
l'axe
de
la
boucle,
qui
"rectiligne"
dans
la boucle
normale,
décrit
une spirale de
plus en plus prononcée dans la boucle granulaire,
la boucle
globulaire,
et
enfin dans
la boucle
à matrice dense

la
torsion de
l'axe est maximale.
Ce mouvement de
l'axe de
la
boucle est paJ;:allèle à
l'épaississement de
la mat_rice
RNP,
donc
à
l'augmentation
de
la
taille
des
aggrégats
de
transcrits.
Si l'on considère que ces aggrégats résultent de
l'établissement
d'interactions
protéiques
réunissant
des
fibrilles RNP de plus en plus distantes, on conçoit aisément
que
l'axe
des
boucles-repères
soit
soumis
à
une
telle
torsion.
Pour résumer l'ensemble de nos observations,
nous avons
établi un modèle schématique qui représente l'organisation de
la matrice RNP des boucles latérales,
depuis
le type normal
jusqu'au type "à matrice dense"
; ce modèle montre également
la relation existant entre les matrices RNP et les unités de
transcription visualisées sur les étalements de type "Miller"
(f igure
21
voir
légende détaillée).
Notre modèle
suggère
l'existence d'une évolution dynamique de la morphologie des
boucles-repères. Plusieurs observations sont en faveur d'une
telle évolution :

70
(1) Les boucles-repères peuvent être absentes des sites
chromosomiques
qui
les
portent,
dans
les
très
jeunes
ovocytes, ou à certaines périodes du cycle saisonnier :
des boucles normales sont alors observées en leur lieu
et place.
(2)
La
matrice
des
boucles
granulaires
présente
une
graduation dans la taille de ces éléments figurés,
qui
est à la base de la polarité très marquée décrite dans
ces
boucles.
Sur
une
même
boucle,
la
matrice
adopte
fréquerrunent
une
structure
"normale",
puis
typiquement
granulaire
dans
la
partie
la
plus
épaisse
de
la
boucle,
les
granules
peuvent
atteindre
la
taille
de
globules,
et
même
fusionner
entre
eux.
Une
boucle
granulaire
peut~
donc
montrer
également
le"S
caractéristiques
d'une
boucle
normale
et
celles
d'une
boucle globulaire.
(3) Dans le même ordre d'idée, on peut remarquer que le
diamètre des plus petits globules de la matrice globu-
laire est voisin de celui des granules (1 ~).
(4) Les boucles à matrice dense sont, à elles seules, un
argument
important.
D'une
part,
le
matrice
de
ces
boucles subit différents états de compaction visualisés
sans équivoque: elle passe d'une structure granulaire à
une
structure
globulaire,
et
enfin,
à
la
structure
"dense".
D'autre part,
ces boucles perdent
leur valeur
de
repères
dans
de
nombreux
ovocytes,
et
ne
se
distinguent alors en rien des boucles normales qui les
encadrent (Lacroix, 1968).

71
Quels
sont
les
facteurs
qui
déterminent
l' aggrégation
spécifique des transcrits dans les boucles-repères ? Quelle
est la signification biologique d'une telle aggrégation ?
Ces deux questions
essentielles
seront discutées plus
loin, en tenant compte notanunent des informations nouvelles
apportées
par
l'analyse
des
modif ications
induites
par
le
froid dans
l'organisation des différents
types de matrices
RNP.
2. Matrice des boucles latérales traitées par le froid
2.1. Evolution de la structure des boucles
latérales avec la durée de l'hypothermie
microscopiê optique
Trois pleurodèles femelles ont été placés dans une eau à
aoc, et des ovocytes ont été prélevés à des intervalles de
temps s'échelonnant entre 24 heures et a semaines. L'analyse
des nombreuses préparàtions chromosomiques réalisées à partir
de ces ovocytes a permis d'établir la chronologie des modifi-
cations qui affectent le caryotype durant l' hypothermie, et
de comprendre le processus d' hyperdéveloppement des boucles
du froid.
On distingue trois étapes principales dans l'évolution
morphologique des chromosomes en écouvillon traités par le
froid :
(a) Entre 24 heures et 4 jours d'hypothermie (fig. 22a),

72
aucune réduction n'est encore perçue dans la taille des
chromosomes.
Les
boucles
normales
sont
encore
nombreuses, et bien développées. Les boucles globulaires
ont
un
aspect
très
massif,
les
globules
étant
étroitement accolés à l'axe chromosomique: ces globules
ont déj à
perdu leur
forme
arrondie,
et présentent des
contours grossièrement polygonaux.
L'information
la
plus
importante,
à
ce
stade
de
l'hypothermie,
concerne
l'évolution
des
boucles
granulaires.
La figure
22a montre le bivalent XI,
fixé
après 24 heures de traitement par le froid : ce bivalent
est l'un de ceux qui portent des boucles granulaires à
20°C, et des boucles du froid hyperdéveloppées dans les
condi tions
optimales
d' hypo'éhermie
(plus
de
8
j ours
à
8 ° C
voir
paragraphe
I. 2 . 3 . ).
On remarque sur
chaque
chromosome, une paire de boucles (flêches épaisses) dont
la
matrice
adopte
simultanément
deux
configurations
dans
sa
partie
la
plus
épaisse,
cette
matrice
est de
structure
typiquement granulaire
ensui te,
la matrice
enchâsse l'axe de la boucle dans un manchon uniforme, où
l'on
distingue
par
endroits
de
petits
granules
résiduels.
La
taille
de
ces
boucles
est
encore
très
voisine de celle des boucles granulaires.
(b)
Entre
5 et
7
jours
d' hypothermie
( fig.
2 2b),
les
boucles normales sont nettement moins nombreuses et pré-
sentent une grande hétérogénéité de taille : des boucles
normales
bien
développées
encadrent
des
portions
de
chromosomes
portant
des
boucles
minuscules,
voire
absentes
(fig.
22b).
L'axe
chromosomique commence à se

73
condenser,
conune
en
témoignent
l'épaississement
et
la
coalescence
intensive
des
chromomères.
Hormis
la
vacuolisation
de
certains
globules,
aucun
changement
nouveau
ne
survient
dans
l'aspect
des
boucles
globulaires.
Par
contre,
à
l'emplacement
des
boucles
granulaires
s'observent désormais
des
boucles
géantes,
entièrement
recouvertes
par
un
épais
manchon
ribonucléoprotéique : on reconnaît, dans ce manchon, de
nombreux granules résiduels, distribués tout le long de
la boucle (fig. 22b).
Il
semblerait bien que
ces boucles géantes,
conune
les
boucles à matrice mixtes décrites à un jour d'hypother-
mie, représentent les stades intermédiaires d'une évolu-
tion
structurale
des
boucles
granulairés
vers
les
boucles du froid.
Il n'y aurait donc pas disparition des
boucles granulaires puis apparition aux mêmes sites des
boucles du
froid,
mais
évolution progressive d'un type
de boucle à l'autre.
(c) A partir de 8 jours d'hypothermie (fig.
23), la con-
traction
de
l'axe
chromosomique
est
maximale
et
la
réduction du nombre et de la taille des boucles normales
est très marquée. c'est généralement à ce stade que l'on
remarque
le
déploiement des boucles globulaires,
et la
fusion des éléments de leur matrice ; les globules pré-
sentent
des
contours
crénelés.
Des
boucles
du
froid,
aisément
reconnaissables
à
leur
longueur
et
à
leur
matrice en spirale,
s'observent désormais sur les sites
qui en sont porteurs (fig. 23). Sur la plupart des biva-
lents, le développement des boucles du froid atteint son

74
point
maximal
entre
8
et
10
jours
d'hypothermie.
Cependant,
celles du bivalent VII sont susceptibles de
s'allonger
encore
entre
10
jours
et
3
semaines
de
traitement par le froid:
l'amplitude de ces boucles est
alors telle que des cassures se produisent fréquemment à
proximité d'une de leurs insertions dans le chromomère.
Ainsi, sur le bivalent VII présenté dans la figure 23c,
on distingue plusieurs boucles du froid dont l'une des
extrémi tés est détachée dans
le nucléoplasme
on peut
apprécier,
sous
cette
forme,
l'exceptionnelle
longueur
de ces boucles. Rappelons que la morphologie des boucles
à matrice dense,
lorsqu'elles
sont présentes,
ne
subit
aucune
modification
visible
à
l'échelle
de
la
microscopie optlque.
Au-delà de deux mois d'hypothermie,
les chromosomes en
écouvillon ont un aspect caractéristique de l'arrêt définitif
de
toute
activité
transcriptionnelle
l'axe
chromosomique
est
condensé
à
l'extrême
et
totalement
dépourvu
de
boucle
latérale.
De plus,
la plupart des ovocytes présentent alors
une
altération
de
leur
forme
et
de
leur
pigmentation,
qui
traduit une importante altération métabolique.
En conclusion,
un effet optimal sur la morphologie des
chromosomes en écouvillon de l'ovocyte est obtenu lorsque la
femelle est maintenue en hypothermie durant 8 à 15 jours.

75
2.2. Analyse ultrastructurale
Les chromosomes en écouvillon, isolés après a à 15 jours
d'hypothermie
à
aoc,
ont
été
fixés
et
préparés
pour
l'observation en microscopie électronique à transmission sur
coupes fines,
ou en microscopie électronique à balayage
(cf.
"Matériel et Méthodes").
Dans
les deux cas,
les
différents
types
de
boucles
latérales
sont
repérés
à
faible
grandissement
(figures
24a, b)
avant
d'être
analysés
à
des
grandissements plus élevés.
2.2.1. Matrice des boucles du froid
Les
boucles

froid,
examinées
en
microscopie
électronique à transmission sur coupes fines,
présentent une
matrice RNP dense,
de
texture
particulaire
(fig.
25a).
Sur
des plans de coupe très favorables,
les sinuosités de l'axe
de
ces
boucles
sont
visualisées
sous
forme
de
"boucles
secondaires" entièrement recouvertes par la matrice RNP (fig.
25a).
Lorsque
l'on
détaille
cette
matrice
à
fort
grandissement
(fig.
25b),
on y distingue des particules RNP
étroitement aggrégées les unes aux autres : cette observation
n'a en elle-même rien de
surprenant
;
en effet,
comme nous
l'avons précédemment montré,
les particules RNP représentent
la
structure
de
base
de
toutes
les
matrices
de
boucles
latérales.
Cependant,
une
mesure
systématique
de
leur
diamètre révèle que ces particules RNP ne mesurent plus que
15 nm, alors que dans les conditions normales de température,
elles présentent un diamètre uniforme de 30 nm.

76
En microscopie électronique à balayage, la spiralisation
de
l'axe des boucles du froid,
déjà décrite en microscopie
optique,
devient évidente.
La figure
26a montre un faisceau
de boucles du froid appartenant au bivalent VII. La longueur
exceptionnelle de ces boucles a entraîné, comme très souvent,
une
cassure
au
niveau
de
leur
insertion
fine
dans
le
chromomère. Sur cette image, on remarque que la spiralisation
de l'axe de la boucle croît en amplitude depuis
l'extrémité
la plus étroite jusqu'à l'extrémité la plus épaisse,
où une
configuration
en
"boucles
secondaires"
est
reconnue.
Une
telle image est conforme à la description de ces boucles en
microscopie
optique,
et
témoigne,
une
fois
de
plus,
de
l'excellente
préservation
des
structures
lors
de
la
préparation des chromosomes pour la microscopie électronique
à balayage.
Sur
un
fort
grandissement
d'une
portion
de
boucle
du
froid observée en microscopie électronique à
balayage
(fig.
26b),
on
retrouve
l' aggrégation des
particules
RNP dans
la
matrice
ces particules ont un diamètre moyen
de
35 nm
;
compte-tenu de la couche d'or d'une épaisseur de la nm étalée
sur les préparations,
le diamètre réél de ces particules est
de
15
run.
Dans
les
mêmes
conditions
de
préparation,
les
particules RNP des matrices de boucles latérales non traitées
par le froid ont un diamètre de 50 nm.
La
taille des particules
RNP qui
composent
la matrice
des boucles du froid est donc très inférieure à la normale.

1
77
1
2.2.2. Matrice des boucles globulaires
1
En microscopie
électronique à
transmission
sur
coupes
fines,
les boucles globulaires révèlent une morphologie très
1
inhabituelle. Chaque globule apparaît comme un gros aggrégat
1
dense de particules RNP, entièrement couronné par des aggré-
gats secondaires,
également denses aux électrons
(fig.
27a).
1
Les globules présentent des contours réguliers, mais sont de
diamètres
hétérogènes.
Les
aggrégats
secondaires
qui
les
1
entourent peuvent fusionner en structures plus importantes
:
1
ils
sont
très
certainement
à
l'origine
des
contours
irré-
guliers,
souvent
crénelés,
présentés
par
les
globules
en
1
microscopie optique.
Un réseau de particules RNP,
organisées
en fibrilles,
r~lie entre eux les globules adjacents.~
Une autre information importante ressort de l'examen en
microscopie électronique à transmission des boucles globulai-
res traitées par le froid.
En effet, une mesure systématique
de la taille des particules RNP qui constituent les globules,
quel que
soit l'aspect de ces derniers,
révèle un diamètre
uniforme de
15 nm
:
ce
diamètre est
identique à
celui des
particules trouvées dans les boucles du froid, mais de moitié
inférieur
à
celui
des
particules
RNP
observées
dans
la
matrice globulaire avant l'hypothermie (fig. 29b, b').
L'examen en microscopie électronique à balayage confirme
l'ensemble de ces résultats. En effet, les globules apparais-
sent comme de gros amas sphériques,
dont la surface externe
est
entièrement
recouverte
par
de
petits
aggrégats
de
particules
RNP
(fig.
27b).
Ces particules
ont
un
diamètre
moyen de 35 nm, qui correspond à un diamètre réél de 15 nm.

78
La réduction de taille des particules RNP, déjà observée
dans
les
boucles
du
froid
hyperdéveloppées,
affecte
donc
aussi la matrice des boucles globulaires, dont la morphologie
est
altérée
par
le
froid.
Nous
avons
également
recherché
cette
réduction
dans
les
matrices
RNP dont
la morphologie
n'est pas modifiée au cours de l'hypothermie: la matrice de
type normal et la matrice dense.
2.2.3. Matrice des boucles normales et à
matrice dense
Sur une partie de chromosome en écouvillon observée sur
coupe
ultra-fine
(fig.
28a),
les
boucles
normales
apparaissent
courtes
e~
clairsemées
le
long
de
l'axe
chromosomique.
Les
chromomères,
fortement
épaissis,
coalescent sur de grandes portions de cet axe très condensé.
A fort
grandissement
(fig.
29a,
a'),
on distingue
dans
la
matrice des boucles normales des particules RNP de 15 nm de
diamètre.
Toutefois,
la
matrice
de
ces
boucles
est
moins
épaisse que dans les conditions normales, et l'alignement des
particules
en
fibrilles
RNP
y
est
difficilement
reconnaissable (comparer les figures 29a et 29a').
En microscopie
électronique à
balayage
(fig.
28b),
on
peut apprécier
la
réduction
importante du
nombre et de
la
longueur des boucles normales:
l'axe de DNP, très condensé,
est
clairement
visualisé
entre
les
boucles,
largement
espacées
les
unes
des
autres.
Les
particules
RNP
apparaissent, là aussi, plus petites qu'à la normale: 35
nm
de diamètre au lieu de 50 nm,
après étalement de la couche
d'or sur les préparations.

79
Dans la matrice dense,. les particules RNP ont également
un diamètre uniforme de 15 nrn (fig. 29c). Cependant, pas plus
que
la
microscopie
optique,
la
microscopie
électronique
à
transmission
n'a
révélé
d'autre
modification
dans
la
structure de cette matrice.
La réduction du diamètre des particules RNP affecte donc
indifféremment
tous
les
types
de
matrice
RNP,
après
traitement par le froid.
De plus,
cette réduction
est
observée
dans
toutes
les
boucles
latérales
dès
le
1er
jour
d'hypothermie,
qu'il
s'agisse
-
des
boucles
normales,
encore bien développées
(fig.
30a)
;
- des boucles granulaires, dont la structure originelle
est encore reconnaissable (fig.
30b)
;
- des boucles globulaires, dont la morphologie n'est pas
encore altérée (fig.
30c)
;
- ou des boucles à matrice dense (fig.
30d).
2.3. Discussion: Modifications structurales induites
par le froid dans les différents types de matrice
RNP
L'organisation des
matrices
RNP
des
boucles
latérales
subit deux types de modifications au cours du traitement par
le froid. Le premier affecte la structure élémentaire commune
à toutes les matrices,
la particule RNP ;
le second affecte
la morphologie des matrices granulaires et globulaires.

80
2.3.1. Réduction du diamètre des particules RNP
En microscopie électronique,
les
particules RNP ont un
diamètre
uniforme
de
15 nm
après
traitement
par
le
froid,
alors qu'à température normale,
ce diamètre était de 30 nm.
Ce premier type de modification s'opère de manière homogène,
la réduction de
taille
des
particules
RNP
s'observant dans
toutes
les
matrices,
quelle
que
soit
leur
morphologie.
De
plus,
cette
réduction
survient
dès
les
premières
heures
d' hypothermie,
et
représente
donc
un
changement
structural
précoce.
Le deuxième type de modification affecte la morphologie
des matrices RNP, mais de manière hétérogène : tandis que les
matrices
normales
et
denses
conservent
leur
morphologie
initiale respective,
les matrices granulaires et globulaires
subissent
d'importants
changements
structuraux,
visualisés
aussi
bien
en
microscopie
optique
qu'en
microscopie
électronique.
2.3.2. Evolution de la boucle granulaire vers
la boucle du froid
L'analyse
en
microscopie
optique
des
modifications
présentées par la boucle granulaire,
après des temps d'hypo-
thermie croissants (figs.
22 et 23) suggère fortement que les
boucles du
froid
résultent d'une
transformation progressive
des
boucles
granulaires,
en
réponse
à
une
hypothermie
prolongée. Cette évolution expliquerait l'absence des boucles
granulaires
du
caryotype
après
8
jours
d' hypothermie
(cf.
paragraphe
1.2.3.),
et
la
coïncidence
entre
les
sites
des

al
boucles granulaires à
20°C,
et ceux des boucles du froid à
aoc.
Nos
observations
nous
ont
permis
d'établir
un
modèle
d'évolution de la boucle granulaire vers la boucle du froid.
Ce modèle,
schématisé sur
la figure
31,
tient compte de
la
structure
de
la
boucle
granulaire
typique

20°C),
des
configurations intermédiaires adoptées par cette boucles dès
les premiers jours d'hypothermie, et des caractéristiques de
la boucle du froid pleinement développée.
L'augmentation
de
taille
spectaculaire,
qui
survient
lors de l'évolution de la boucle granulaire vers la boucle du
froid,
s'interprète aisèment si l'on admet que dans la boucle
granulair..e,
la
longueur
réelle
de
l'axe
de,_ DNP
est
bien
supérieure à sa longueur apparente
cet axe serait, par con-
séquent,
hautement
compacté
dans
les
granules
(fig.
31a).
Logiquement,
et
conune
nous
l'avons
représenté
dans
notre
modèle,
la
longueur
de
DNP
contenue
dans
chaque
granule
serait proportionnelle au diamètre de ce dernier.
L'hypothermie induirait une désorganisation graduelle de
la
matrice
granulaire,
dont
les
éléments
figurés
ou
granules -
se désagrègeraient progressivement (fig.
31b, cl.
Ceci expliquerait la présence de granules résiduels dans la
matrice des boucles intermédiaires, visualisées notamment à 1
jour
et
5
jours
d'hypothermie.
Les
plus
petits
granules,
localisés dans la partie la plus fine de la matrice, seraient
les premiers à disparaître (fig. 31b, cl.
La conséquence première de cette désorganisation de la
matrice granulaire serait une relaxation de l'axe de DNP, en-
traînant l'extension progressive de la boucle.
Cette relaxa-
tion débuterait
dans
l'insertion
fine
de
la boucle,
et se

82
propagerait peu à peu à toute sa longueur, parallèlement à la
désorganisation des granules (fig. 31b, cl. De ce fait, l'axe
s'étirerait
plus
rapidement
dans
la
région
étroite
de
la
boucle,
alors
que
dans
sa
partie
la
plus
épaisse,
i l
conserverait une configuration en boucles secondaires. Entre
les
deux
extrémités
de
la
boucle,
l'axe
présenterait
des
degrés de
relâchement
variables,
et décrirait des
spirales
plus ou moins
serrées
(fig.
31d).
Cette interprétation est
étayée par l'observation, après 8 jours de traitement par le
froid,
de
boucles
du
froid

l'étirement
de
l'axe
est
maximal,
mais
aussi
de
boucles

l'axe
est
presque
entièrement reployé en boucles secondaires.
Dans
le dernier
cas, l'amplitude des boucles du froid est moins importante.
Dans -les
premiers
jours
d'exposition
au- froid
(1 à
7
jours à aOC) correspondant au début de la transformation des
boucles
granulaires,
la
matrice
RNP
constitue
un
manchon
dense
qui
masque
entièrement
les
contours
de
l'axe
de
la
boucle
(fig.
31b,
c).
Au
contraire,
dans
les
boucles
du
froid pleinement développées
(après 8 jours à 8°C
; fig.
31
dl,
la matrice RNP épouse étroitement les contours de l'axe
de DNP,
qui
sont
alors parfaitement
visualisés.
Ces
images
s'expliqueraient
par
la
désorganisation
des
aggrégats
de
transcrits qui constituent les granules, et par la relaxation
des fibrilles RNP initialement compactées dans ces granules.
Les
diverses
interactions
protéiques
intervenant
dans
la
compact ion
des
fibrilles
RNP
à
20°C
seraient
donc
rompues
lors
du
traitement
par
le
froid.
Ce
modèle,
qui
s'appuie
principalement sur
l'observation des modifications
induites
par le froid dans la configuration des boucles granulaires,

83
corrobore cependant notre modèle précédent,
établi pour les
boucles granulaires à 20°C (voir fig.
21)
:
(1) Compte-tenu de la densité des produits de la trans-
cription dans la matrice des boucles granulaires à 20°C, une
compact ion
importante
de
l'ADN
de
ces
boucles
était
déj à
suggérée.
La
décondensation
spectaculaire
de
l'axe
des
boucles
granulaires
à
8°C confirme
l'existence d'une
telle
compaction, et indique que l'ADN des boucles granulaires peut
être extraordinairement long.
(2)
D'autre
part,
notre
modèle
initial
(fig.
21)
suggèrait l'existence, à 20°C, d'une évolution dynamique d'un
type de boucle "normal" vers les différents types de boucles-
repères, et en particulier vers la boucle de type granulaire.
L'analyse
des
modif ications
induites
par
le
froid
dans
la
matrice granulaire est en
faveur d'une
telle évolution.
En
effet, après examen des images de boucles du froid obtenues
en microscopie optique, comme en microscopie électronique, on
conçoit aisément qu'à son degré de décompaction maximal,
la
matrice des boucles granulaires puisse adopter une configura-
tion semblable à celle de la matrice "normale"
une
telle
configuration est d'ailleurs visualisée dans les portions de
boucles
du
froid

l'étirement
de
l'axe
d'ADN
est
très
important (voir fig.
Sa).
2.3.3. Evolution des boucles globulaires
L'analyse
de
l'évolution
morphologique
des
boucles
globulaires
au
cours
du
traitement
par
le
froid,
en
microscopie optique comme en microscopie électronique, montre
que
l'altération
de
la
structure
des
globules
est
un

84
processus lent et progressif. En effet, c'est seulement après
8
jours
d'hypothermie
que
les
globules,
plus
nombreux,
exhibent
des
contours
crénelés,
liés
à
la
présence
d'aggrégats
RNP
secondaires
à
la
périphérie
de
chaque
globule.
Ces
images
suggèrent
que,
tout
comme
la
matrice
granulaire,
la matrice globulaire subit une décompaction au
cours du traitement
par
le
froid.
Cette
décompaction,
qui
reste
très
ménagée,
conduirait
à
la
formation
de
globules
plus petits et plus nombreux qu'à 20°C, eux-mêmes fragmentés
en
aggrégats
RNP
secondaires.
L'analyse
des
modifications
morphologiques
induites par
le
froid dans
la structure des
boucles globulaires,
corrobore donc
une
fois
de plus
notre
modèle
de
l'organisation
des
boucles-repères
à
20°C
(fig.
21).
En
effet,
selon
ce
mOdèle,
les
boucles
globulaires
résulteraient d'une aggrégation croissante de fibrilles RNP,
l'un des stades intermédiaires de cette aggrégation étant la
constitution
d'amas
de
type
granulaire
(voir
paragraphe
II.1.6.).
Or,
à
8°C,
les
aggrégats
RNP
secondaires
qui
résultent
de
la
désorganisation ménagée
des
globules
sont
très semblables,
par
leur
structure et
leur dimension,
aux
granules de
la matrice granulaire.
De plus,
la présence de
fibrilles RNP déployées à partir de ces aggrégats secondaires
est fréquemment observée.
Le
froid
affecte
donc
de
manière
différente
la
morphologie
des
boucles-repères,
induisant
ainsi
une
décompaction
préférentielle
des
boucles
granulaires
et
une
décompaction ménagée des boucles globulaires,
tandis que la
morphologie des boucles à matrice dense n'est pas modifiée.
Ces observations suggèrent l'existence de variations dans les

1
85
l
mécanismes
d'aggrégation
des
transcrits
au
sein
des
différents types de matrices RNP.
1
A quel(s)
niveau(x) ces mécanismes sont-ils altérés par
[
l' hypothermie
?
Que
ref lète
la
réduction .de
diamètre
des
particules RNP
et quel
rôle
joue-t-elle dans
la désorgani-
t
sation partielle ou totale des matrices RNP, et dans l'hyper-
l
développement des boucles du froid ?
Nous
avons
tenté
de
répondre
à
ces
questions
en
analysant les modifications induites par le froid au niveau
des
propriétés
physiques
et stucturales des
particules RNP
nucléaires hétérogènes (RNPnh), isolées à partir des ovocytes
en hypothermie.

86
III. ANALYSE DES PARTICULES RNPnh DERIVEES DES MATRICES DE
BOUCLES LATERALES
La réduction de diamètre des particules RNPnh, observées
dans
les
matrices
de
toutes
les
boucles
latérales
à
8°C,
pourrait refléter
une
altération
importante
induite
par
le
froid dans l'assemblage de ces particules.
Une telle altéra-
tion devrait retentir sur
la masse des particules RNP mono-
mériques,
donc
(1)
sur
leur
vitesse
de
sédimentation
en
gradient de sucrose et/ou
(2) sur leur densité relative dans
le chlorure de Césium (CsCl).
Dans
chacune
des
expériences
décrites
ci-après,
les
caractéristiques
des
particules
RNP
nucléaires
isolées
à
partir .Q' ovocytes
contrôles,
et
d' ovocytes~ traités
par
le
froid,
sont définies et comparées.
1. Isolement et purification des particules RNP
nucléaires hétérogènes
Dans
la
plupart
des
systèmes
cellulaires,
l'isolement
des RNPnh nécessite l'utilisation de procédés drastiques tels
que
la
sonication,
ou
l'action
prolongée
de
ribonucléases
endogènes
(revue
par
Knowler,
1983).
Ces
procédés
peuvent
être sources d'erreurs dans l'interprétation des analyses qui
s'en suivent.
Dans l'ovocyte d'amphibien,
les problèmes liés à l'iso-
lement des particules RNPnh sont,
en grande partie,
circon-
venus: Sommerville (1973) a décrit une méthode rapide et peu
agressive, qui permet la purification des particules RNPnh à
partir d'homogénats d'ovaires
(voir "Matériel et Méthodes").

87
Les
particules
RNP
ainsi
obtenues
sont
d'origine
chromosomique
et
représentent
les
produits
de
la
transcription,
nouvellement
synthétisés,
libérés
dans
le
nucléoplasme à partir des matrices RNP des boucles latérales
(Sommerville, 1973).
Deux
fragments
d'ovaires
issus,
l'un
d'une
femelle
maintenue à
20°C,
l'autre d'une femelle soumise à une hypo-
thermie
de
la
jours
à
8°C,
ont
été
incubés
24
heures
en
présence
d'uridine
tritiée,
puis
homogénéisés.
Après
centrifugation différentielle de ces homogénats,
les culots
correspondant
à
la
fraction
RNP
sont
resuspendus
dans
un
tampon
approprié,
puis
purifiés
sur
un
premier
gradient
linéaire
de
sucrose
25-55%
(Kloetzel
et al.,
1982
voir
"Matériel et Méthedes").
20 à 25 fractions sont collee-tées ;
un échantillon de chacune de ces fractions est prélevé pour
une
détermination
de
la
radioactivi té
incorporée
dans
les
ARN,
et
pour
une
estimation
de
la
densité
optique
(voir
"Matériel et Méthodes").
La
figure
32
présente
un
profil
typique
de
gradient
ainsi obtenu : ce profil est identique pour les complexes RNP
issus
des
ovocytes
contrôles,
comme
pour
ceux
issus
des
ovocytes traités par le froid. Deux pics de radioactivité et
de densité optique sont observés :
(a)
Le pic le plus lourd
(fractions 3 à 5)
correspond
aux
RNPnh
qui
sédimentent
très
rapidement,
à
une
vitesse
supérieure
à
1
000
S.
En
effet,
les
particules
RNPnh
de
l'ovocyte
d'amphibien
sont
isolées
sous
forme
de
larges
complexes (Sommerville, 1973 ; Malcolm et Sommerville, 1974)
et non
sous forme
de particules
individuelles
30 S,
comme

88
r
dans
la plupart des autres cellules
(revue par Samarina et
Krichevskaya, 1981).
La nature
du matériel
qui
compose
ce premier pic est
vérifiée
en
microscopie
électronique.
Les
fractions
correspondantes
(fractions
3
à
5)
sont
rassemblées
et
un
petit
échantillon
est
préparée
pour
l'observation
en
microscopie
électronique
(Malcolm
et
Sommerville,
1974
Kloetzel et al., 1982 ; voir "Matériel et Méthodes"). Sur les
micrographies ainsi réalisées, les complexes RNP apparaissent
comme
de
larges
aggrégats
au
sein
desquels
on
distingue
nettement
les
particules
RNP
monomériques
(fig.
33a,
b).
Alors
que
dans
les
préparations
provenant
d'ovocytes-
contrôles,
les
particules
ont
un
diamètre
de
30 nm
( fig.
33a), dans les préparatiGns issues d'ovocytes traités par le
froid
(f ig.
33b),
les particules ne mesurent que 15 nm.
Le
matériel isolé du gradient de sucrose correspond donc bien à
une fraction RNP pure.
(b)
Un second pic sédimente à 80 S dans le gradient de
sucrose
(fig.
32
fraction
17).
Ce
pic
correspond
à
des
ribosomes contaminants
(Sommerville,
1973
; Kloetzel et al.,
1981). Cette fraction ribosomique a été retenue pour servir
de marqueur
de sédimentation dans
les
gradients
ultérieurs
(voir "Matériel et Méthodes").
2. Sédimentation des particules RNPnh monomériques en
gradient de suc rose
Les aggrégats RNPnh purifiés par le premier gradient de
sucrose ont été précipités par centrifugation, et resuspendus

89
dans
un
tampon
contenant
1
~g/ml
de
ribonucléase.
Ce
traitement a pour but de convertir les larges aggrégats RNP
en
monoparticules
individuelles
(Malco~
et
Sommerville,
1977) .
Après
une
incubation de
30 minutes
à
DoC,
les
échan-
tillons
sont
fixés
au
formaldéhyde
puis
déposés
sur
un
gradient
linéaire
de
suc rose
5-60%
(voir
"Matériel
et
Méthodes").
Après centrifugation le gradient est fractionné
et
la
radioactivité
incorporée
dans
les
ARN,
ainsi
que
la
densi té
optique,
sont
mesurées
dans
chacune
des
fractions
collectées. Les ribosomes 80 S sont centrifugés en parallèle
dans un gradient de sucrose identique.
Les
profils
des
gradients
obtenus
pour
les
monoparticules RNP issues d'ovocytes-contôles
(fig.
34a)
ou
d'ovocytes
traités
par
le
froid
(fig.
34b)
diffèrent
de
manière significative.
Dans le premier cas (ovocytes-contrôles)
la majorité de
l'ARN résistant à la RNase sédimente à
30 S (fig.
34a)
ce
coefficient de
sédimentation caractérise
les monoparticules
RNPnh d'une grande variété de cellules eucaryotes (revue par
Samarina et Krichevskaya,
1981)
et en particulier celles de
l'ovocyte
d'amphibien
(Malcolm
et
Sommerville,
1977).
Il
était donc
attendu pour
les particules
RNP originaires des
ovocytes-contrôles.
Par
contre,
les
monoparticules
RNP
isolées
a
partir
d'ovocytes
traités
par
le
froid révèlent
un coefficient de
sédimentation
d'environ
15
S
(fig.
34b),
soit
nettement
inférieur à celui des particules "normales".
Un pic mineur de
radioactivité est
fréquemment observé
dans les toutes premières fractions des gradients de suc rose

1
90
l
(fig.
34a,
b)
ce
pic
correspond
très
certainement
à une
partie des aggrégats RNP natifs qui n'a pas été convertie en
t
monomères par l'action ménagée de la RNase.
r
Ces résultats indiqueraient une réduction significative
de
la
masse
des
monoparticules
RNPnh
au
cours
de
l ' hypo-
1
thermie,
corroborant
ainsi
la
réduction
de
leur
diamètre
constatée
en
microscopie
électronique
dans
la
matrice
des
boucles latérales.
Cependant,
on
ne
peut
exclure
la
possibilité
que
les
particules
de
faible
vitesse
de
sédimentation
obtenues
résultent d'une dégradation excessive des aggrégats
RNP par
la
RNase,
et
ne
représentent
donc
pas
les
structures
originales. L'intégrité de ces particules a donc été vérifiée
parïUne analyse de leur densité dans le ehlorure de césium.
3. Analyse de la densité relative des monoparticules
RNPnh dans le chlorure de Césium
La densité relative de molécules ou de complexes molé-
culaires donnés dans le chlorure de césium (CsCl) reflète la
proportion respective
de
leurs
composants.
Dans
le cas des
complexes RNP,
le taux de protéine peut être calculé d'après
la formule empirique de Spirin (1969 ) :
(l,8S-P)
pourcentage de protéine =
0,006
p est la valeur de la densité dans le chlorure de Césium,
exprimée en g/cm3 .
Les monoparticules RNPnh issues des ovocytes-contrôles,
ou des ovocytes traités par le froid,
sont précipitées par
centrifugation,
resuspendues
dans
un
tampon
approprié
et

91
déposées
sur
un
gradient
linéaire
de
CsCl
24-60%.
Pour
chacune
des
fractions
collectées,
la
densité
relative,
la
radioactivité incorporée dans les ARN, et la densité optique
sont déterminées (voir "Matériel et Méthodes").
Les
profils
typiques
des
gradients
ainsi
obtenus
sont
présentés
sur
la
figure
35.
On
constate
que
les
monoparticules RNP isolées à température normale
(fig.
35a),
comme
celles
isolées
après
traitement
par
le
froid
(fig.
35b),
ont une
densité
relative identique de
1,38 g/cm 3 .
De
plus,
dans
une
expérience-témoin,
la
même
densité
a
été
trouvée
pour
les
aggrégats
RNP
non
traités
par
la
RNase,
avant comme après hypothermie. Ces résultats prouvent que les
complexes RNP n'ont pas été altérés par la RNase, et que la
faible vitesse de sédimentation (15 S au lieu de ~O S) de ces
particules
après
le
froid
traduit
bien
une
modification
authentique de leurs propriétés. De plus, ils indiquent qu'en
dépit d'une réduction importante de la masse des particules
RNP,
la proportion respective de l'ARN et des protéines qui
les
composent
est
strictement
conservée
au
cours
de
l'hypothermie.
En effet,
la densité relative
de 1,38
g/cm3
dans le CsCl, obtenue pour les particules RNP soumises ou non
à l' hypothermie,
traduit un
taux de
protéine d'environ
80%
(Spirin, 1969), l'ARN constiutant les 20% restant.
4. Discussion: Modification de l'assemblage des
particules RNPnh de l'ovocyte en hypothermie
La vitesse de sédimentation des aggrégats RNPnh dans le
sucrose est proportionnelle à la masse de leurs constituants,
ARN et protéines, et par conséquent, au nombre de particules

92
qui composent ces aggrégats.
Samarina et al.
(1968)
ont,
en
effet,
montré
qu'il existait
une
relation directe entre
le
nombre de monomères dans les aggrégats RNP et leur vitesse de
sédimentation.
Compte-tenu de l'importance des aggrégats RNP
nucléaires de l'ovocyte de pleurodèle (fig. 33a, b), i l n'est
pas
surprenant
que
leur
vitesse
de
sédimentation
dans
le
sucrose
soit
grossièrement
identique
quelle
que
soi t
l'origine de ces aggrégats
(fig. 32). Par contre, on pouvait
s'attendre à ce que la réduction du diamètre des particules
RNP,
observée à
SOC dans
la matrice des boucles
latérales,
retentisse sur la vitesse de sédimentation des monomères qui
composent ces aggrégats.
Une
réduction
de
la
masse
globale
des
monoparticules
RNPnh,
traitées par·le froid,
a
effectivement été démontrée
par
l'analyse
de
leur
sédimentation dans
le
sucrose
ces
particules révèlent un coefficient de sédimentation de 15 S,
alors
que
les monoparticules
isolées
à
température
normale
sédimentent à 30 S (fig. 34a, b).
Cependant,
la densité
relative des monoparticules dans
le chlorure de césium est rigoureusement identique, avant et
après
hypothermie
(fig. 35a, b)
cette
densité
de
1,38 g/cm3 ,
qui
indique un
rapport protéine :
ARN de
4 : 1
(80 % de
protéine
pour
20 % d'ARN;
Spirin,
1969),
est
caractéristique des RNPnh des cellules eucaryotes. En effet,
la densité des complexes RNPnh, quelle que soit leur origine
cellulaire, varie étroitement entre 1,35 et 1,4 g/cm3
(revue
par Samarina et Krichevskaya,
1981)
;
ainsi,
dans
l'ovocyte
de l'amphibien Triturus cristatus,
les particules RNPnh ont
une
densité
relative
de
1,39 g/cm3
dans
le
CsCl
(Kloetzel
et al., 1981).

93
Nos
résultats
démontrent
donc,
d'une
part,
que
les
particules
15 S obtenues
après
l ' hypothermie
sont bien des
particules RNPnh authentiques,
et d'autre part,
qu'en dépit
d'une
réduction
importante
de
leur
masse
globale,
la
contribution
respective
de
l'ARN
et
des
protéines
à
la
constitution de ces particules est strictement conservée
la
masse
d' ARN
et
la
masse
de
protéines
subissent
donc
une
réduction proportionnelle au sein de la particule RNP traitée
par le froid.
Des
données
essentielles
sur
l'organisation
des
particules RNPnh dérivent de ce type d'analyse.
Samarina
et al.
{1968}
ont
montré
qu'il
existait
un
rapport
de
1/3
entre
la
vitesse
de
sédimentation
d'un
complexe RNPnh,
mono- ou poIyparticulaire,
et la vitesse de
sédimentation de l'ARN purifié à partir de ce même complexe
ainsi, l'ARN contenu dans une monoparticule 30 S sédimente à
environ 10 S.
Le
poids
moléculaire
{M}
d'un
ARN
donné
peut
être
calculé d'après sa vitesse de sédimentation {S}, en utilisant
l'équation de Spirin (1963)
:
M = 1550 . S2,1
L'ARN de la particule 30 S a
donc un poids moléculaire
de
200.000
correspondant
à
une
longueur
de
1.000 nucléotides; compte-tenu du rapport protéine: ARN qui
est
de
4 : 1
dans
la
particule
RNPnh,
la
masse
protéique
estimée est de 800.000, ce qui porte à 1.10 6 la masse totale
de la particule RNP 30 S {Samarina et al., 1968}.
Le
même
raisonnement,
appliqué
aux
particules
RNPnh
modifiées
par
l'action
du
froid,
fournit
les
données
suivantes

94
(1) Dans la monoparticule 15 S, l'ARN aurait une vitesse
de
sédimentation
de
5 S,
contre
10 S
dans
la
particule
"normale" 30 S ;
(2) selon
l'équation
de
Spirin
(1963),
cet
ARN
5 S
aurait un
poids moléculaire
d'environ
45.000,
équivalant
à
une longueur de 225 nucléotides ;
(3)
les
protéines
auraient
un
poids
moléculaire
de
180.000,
soit quatre fois
le poids moléculaire de l'ARN,
ce
qui porterait à 225.000 la masse totale de la particule 15 S.
Ces
données
sont
rassemblées
dans
le
tableau
récapitulatif ci-dessous :
Particule RNPnh
Particule RNPnh
30 S (à 20°C)
15 S (à 8°C)
ARN
PM : 200.000
PM : 45.000
(- 1.000 nucléotides)
(- 225 nucléotides)
Protéines
PM : 800.000
PM : 180.000
Particule
PM
PM
225.000
entière
-------------------------------------------------------------
En
conclusion,
cette
étude
démontre· que
la
particule
RNPnh
de
l'ovocyte
de
pleurodèle
soumis
à
l'hypothermie
renferme une quantité d' ARN et de protéines plus de quatre

95
fois
inférieure
à
la
normale.
Le
froid
induit
donc
une
modification importante de l'assemblage des particules RNPnh
de
l'ovocyte.
Cette
modification
est
précoce,
homogène,
reproductible, et parfaitement réversible lors du retour à la
température normale.

96
IV. DISCUSSION DE LA PREMIERE PARTIE: NIVEAUX D'ORGANISATION
DES MATRICES RNP DES BOUCLES LATERALES
Dans la plupart des systèmes cellulaires,
aucune compa-
raison directe ne peut être effectuée entre la structure des
particules
RNP
isolées
par
fractionnement
cellulaire,
et
l'organisation
in si tu
de
ces
mêmes
particules.
L'ovocyte
d'amphibien est
à
cet égard un
système privilégié,
puisque
l'organisation des
complexes RNPnh peut être visualisée sur
le site même de leur formation,
c'est-à-dire dans la matrice
RNP
des
boucles
latérales
des
chromosomes
en
écouvillon
(Callan & Lloyd,
1960 ;
Gall & Callan,
1962 ;
Izawa et al.,
1963).
Dans
~es
chromosomes
en
écouvillon

pleurodèle,
l'analyse de la structure des divers types morphologiques de
boucles latérales, et des modifications induites par le froid
dans
cette
structure,
fait
ressortir
trois
niveaux
dans
l'organisation des matrices RNP :
(1) organisation
primaire,
dans
la
particule
RNP
de
diamètre uniforme;
(2) organisation secondaire dans la fibrille RNP;
(3)
enfin,
organisation
tertiaire
en
matrice
RNP
de
morphologie caractéristique.
1. La particule RNPnh
Notre
étude
ultrastructurale
comparative
démontre
l'existence
d'une
structure
primaire
commune
à
toutes
les
matrices
de
boucles
latérales,
quelle
que
soit
leur
morphologie
une
particule
RNP
de
diamètre
uniforme.
Ce

97
diamètre de
30 nm à
température normale,
est réduit à
15 nm
dès
le
1er
jour
de
traitement
par
le
froid.
L'analyse
des
particules
RNPnh,
isolées
biochimiquement,
conf irme
que
la
diminution
de
taille
de
ces
particules
est
liée
à
une
réduction de leur masse globale.
Quel est le facteur qui détermine l'uniformité de taille
des
particules
RNP
?
Quelle
est
la
signification
de
la
réduction
induite
par
le
froid
dans
la
masse
de
ces
particules?
Ces deux questions doivent être considérées en fonction
des
deux
composantes
de
la
particule
RNP,
l' ARNnh
et
les
ribonucléoprotéines,
et
de
leurs
caractéristiques
respectives.
1.1. L'ARNnh
Le
terme
"ARN
nucléaires
hétérogènes"
(ARNnh)
désigne
l'ensemble
des
transcrits
primaires
copiés
par
l'ARN-
polymérase
II,
à
l'exception
d'une
classe
particulière
d'ARN:
les
petits
ARN
nucléaires
ou
"small
nuclear
RNA"
(snRNA).
Seule
une
petite
fraction
de
ces
ARNnh
subira
le
processus
de
la
maturation
pour
donner
naissance
aux
ARN
messagers (ARNm ; Darnell, 1982).
La
longueur
du
segment
d' ARN
compr is
dans
une
mono-
particule
30
S,
semblable
à celle que
l'on
trouve
dans
le
noyau de
l'ovocyte du pleurodèle à
température normale,
est
d'environ 1 000 nucléotides (800 ± 200 nucléotides; Samarina
et al.,
1968
Martin
et al.,
1974
Le
Stourgeon
et al.,
1981;
Steitz
et
Kamen,
1981).
Dans
la
particule
RNP
15
S
isolée de
l'ovocyte
de
pleurodèle
traité
par
le
froid,
la

98
longueur
de
l' ARN
peut
être
estimée
à
environ
225
nucléotides.
Plusieurs observations tendent à réduire l'importance du
rôle
joué
par
l' ARN
dans
le
maintien
de
l'intégrité
des
particules RNP.
Premièrement,
une grande partie de cet ARN
est relativement exposé et sensible à l'action de la RNase
;
lorsque
l' ARN
est
digéré
par
cette
enzyme,
les
protéines
particulaires
demeurent
fortement
aggrégées
les
unes
aux
autres
dans
une
solution
de
faible
concentration
saline
(Martin et al.,
1978).
Deuxièmement,
le
segment d' ARN peut
être réduit à une longueur de 50 à 100 nucléotides, sans que
l'intégrité
de
la
monoparticule
RNP
en
soit
affectée
(Kinniburgh et Martin, 1976).
Ces
observations
Indiquent
que
si
l'ARN
est
une
composante
essentielle
de
la
monoparticule
RNPnh,
les
caractéristiques
structurales
de
cette
particule
sont
essentiellement liées à la composante protéique.
1.2. Les ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes
Les
protéines
représentent
environ
80%
de
la
masse
totale de la particule RNPnh, qu'il s'agisse de la particule
30 S isolée à
température normale,
ou de la particule 15 S
obtenue après traitement de l'ovocyte par le froid.
Dans
l'ovocyte
d'amphibien,
l'analyse
des
protéines
associées
aux
transcr i ts
primaires
dans
des
conditions
de
température
normales,
a
révélé
l'existence
d'un
groupe
restreint de polypeptides de
50 à 68 KDa,
fortement liés
à

99
Deux
modèles
principaux
ont
été
proposés
quant
a
la
stucture des particules RNPnh 30 S.
Dans le premier modèle,
l ' ARN
est
enroulé
à
la
sur face
d'un
noyau
protéique
globulaire
préformé
et
stable,
dénonuné
"informofère"
par
Samarina et al.,
(1968).
Dans
le
second modèle,
l'ARN est
associé aux protéines en une fibrille RNP continue,
qui est
ensui te
périodiquement
condensée
en
structures
compactes
cette
conformation
serait
stabilisée
par
diverses
interactions protéiques (Stévenin et Jacob, 1974).
Le
premier
modèle
est
généralement
le
plus
favorisé,
notanunent
en
ce
qui
concerne
la
structure
des
RNPnh
de
l'ovocyte
d'amphibien
(Malcolm
et
Sonunerville,
1974
Sommerville,
1981).
En
effet,
le
concept
d'une
particule
protéique préformée et de masse ~onstante, associée aux ARN
en cours d'élongation, expliquerait la régularité du diamètre
des
particules
RNP
trouvées
dans
la
matrice
de
toutes
les
boucles latérales des chromosomes en écouvillon.
Quelle
est
l'origine
de
la
perte
de
masse,
et
de
la
réduction
de
diamètre
conséquente,
constatées
dans
les
particules
RNPnh de
l'ovocyte
de
pleurodèle
traité
par
le
froid ?
Nous envisagerons deux hypothèses
(1)
Le
froid
pourrait
induire
une
redistribution
des
ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes de l'ovocyte. Une
telle
redistribution
a
été
décrite
dans
les
cellules
HeLa
soumises à un choc hyperthermique
: deux ribonucléoprotéines
de 35 et 37 KDa ne sont plus détectées dans les RNPnh après
le choc, mais se retrouvent associées à la matrice nucléaire
(Lutz et al.,
1988).
Il
a
été
également
démontré
que dans

100
l'ovocyte de
l' amphibien Triturus,
les RNPnh
et
la matrice
nucléaire
avaient
plusieurs
polypeptides
communs
(Kloetzel
et al.,
1982.).
In
vitro,
ces
protéines
sont
capables
de
former
des
complexes
particulaires
en présence d' ARN,
mais
aussi de polYmériser en structures fibrillaires semblables à
celles qui constituent le réseau nucléosquelettique (Kloetzel
et al.,
1982).
Il
n'est
donc
pas
exclu
qu'au
cours
de
l' hypothermie,
certaines
ribonucléoprotéines
hétérogènes
soient préférentiellement associées à la matrice nucléaire au
détriment des particules RNP.
( 2)
La
seconde
hypothèse,
que
nous
retiendrons
comme
étant la plus favorable,
relie la formation de particules RNP
rédûîtes à l'absence, ou à la présence en-faible quantité, de
certaines
protéines
spécifiques
dans
le
noyau de
l'ovocyte
traité
par
le
froid.
En
effet,
comme
nous
l'expliciterons
dans
la
seconde
partie
de
ce
mémoire,
l'un
des
effets
précoces de
l'hypothermie est
la suppression de
la plupart
des
protéines
nucléaires de
l'ovocyte,
suppression observée
dès
24
heures
à
8 0 C.
De
plus,
bien
qu'un
prof i l
protéique
proche
de
la
normale
soit
progressivement
restauré
après
plusieurs
jours
d 'hypothermie,
de
nombreuses
protéines
ne
sont
pas
resti tuées.
Selon
le
modèle
d'une
particule
protéique préformée,
associée aux
ARNnh
immédiatement après
la
transcription
(Samarina
et al.,
1968
Malcolm
et
Sommerville,
1974),
i l
est
évident
qu'un
manque
de
ribonucléoprotéines, ou une concentration anormalement faible
de ces protéines dans
le noyau de
l'ovocyte,
conduiraient à
la constitution de particules régulières mais de masse et de
diamètre
réduits.
La
réduction
proportionnelle de
la masse

101
protéique
et
de
la
quantité
d'ARN
comprises
dans
chaque
monoparticule
RNP
au
cours
de
l' hypothermie,
suggère
fortement
que
la
composante
protéique
de
ces
particules
détermine la longueur du segment d'ARN qui leur est associé;
ceci se conçoit aisément si
l'on considère que
la perte de
protéines
implique
une
réductlon
du
nombre
des
si tes
d'attachement de
l' ARN à
la
périphérie de
la monoparticule
RNP.
Cette interprétation est tout à fait compatible avec ce
que
l'on
sait
sur
le
métabolisme
des
protéines
RNP
de
l'ovocyte
d'amphibien.
En
effet,
bien
que
ces
protéines
soient
dans
leur
ensemble
très
stables
(Gall
et
Callan,
1962),
tous
les
polypeptides
considérés
individuellement,
n'on~ pas la même durée de vie (Sommervîlle et Hill, 1973).
De plus,
une fraction importante des RNPnh est constituée de
protéines synthétisées de novo
(Sommerville et Hill,
1973).
On peut également remarquer que dans nombre d'expériences de
reconstitution in vitro de particules RNP,
la concentration
des
protéines
mises
en
présence
des
ARN
est
déterminante
quant à la génération de complexes RNP (Thomas et al., 1981 ,
1983 ; Kloetzel et al., 1982 ; Swanson et Dreyfuss, 1988).
L'utilisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre les
r ibonucléoprotéines
nucléaires
de
l'ovocyte
de
pleurodèle,
pourrait permettre de détecter les variations induites par le
froid dans la composition des particules RNPnh.
2. La fibrille RNP
Notre étude en microscopie électronique montre que dans
tous les types de matrice RNP, avant comme après l'exposition

102
au
froid,
les
transcrits
primaires
sont
organisés
en
fibrilles
RNP,
chaque molécule d' ARN
en
cours
d'élongation
étant régulièrement complexée en particules RNP de diamètre
constant.
L'assemblage des
particules RNPnh
a
lieu
alors que
la
molécule
d' ARN
est
encore
attachée
à
l'axe
de
DNP.
Cette
certitude
découle
de
nombreuses
études
ultrastructurales
réalisées dans l'ovocyte d'amphibien (Malcolm et Sommerville,
1974
Mott et Callan,
1975
Angelier
et Lacroix,
1975
Scheer
et al.,
1976),
et
est
corroborée
par
notre
propre
analyse
de
l'ultrastructure
des
boucles
latérales
dans
l'ovocyte de pleurodèle.Dans les cellules de mammifères, des
études immunocytochimiques ont également montré que les ribo-
nucléoprotéInes
maj eures
étaient
associées ~ aux
ARNnh
immédiatement
après
la
transcription
(Martin
et
Okamura,
1981; Economides et Pederson, 1983).
Deux
questions
principales
se
posent
quant
à
la
structure des transcrits primaires de l'ovocyte d'amphibien,
et des cellules eucaryotes en général :
(1)
Quelle
est
la
signification
de
l'assemblage
des
particules RNP au niveau de la molécule d'ARNnh ?
(2)
La
localisation des
particules
RNP
le
long de
la
molécule
d'ARN
en
cours
d'élongation
est-elle
sequence-
dépendante ?
2.1. Rôle des particules RNPnh
Deux fonctions extrêmes, mais non incompatibles, peuvent
être attribuées aux particules RNPnh.

103
La
première
fonction,
essentiellement
structurale,
serait la compaction des ARNnh néosynthétisés. En effet, dans
la plupart des cellules,
le taux de compaction de l'ARN dans
la
fibrille
RNP
varie
de
6
à
10
(revue
par
Sommerville,
1981). Cette compaction aurait pour but de protéger
les ARN
d'une
éventuelle
dégradation
par
des
endonucléases,
d'empêcher
la formation
intensive de structures
secondaires
au sein de la molécule d'ARN, de faciliter le déplacement de
l'ARN en cours d'élongation,
et sa libération de l'axe d'ADN
(revue par Dreyfuss, 1986).
Les
particules
RNP
pourraient également
jouer
un
rôle
actif
dans
les
évènements
post-transcriptionnels
qui
conduisent
à
la
producfion
d'ARNm.
En
effet,
les
étapes <-
précoces de la maturation des ARN sont réalisées au sein même
de la fibrille RNPnh.
Dans
l'ovocyte d'amphibien un clivage
intensif
a
lieu
au
niveau
des
ARN
naissants
des
discontinuités dans le gradient de longueur des fibrilles RNP
d'une
même
unité
de
transcription
ont
été
observées
en
microscopie
électronique,
après
étalement
de
la
chromatine
selon la technique de Miller et Beatty (1969 ; Laird et al.,
1976
Scheer
et al.,
1979) .
De
plus,
des
boucles
secondaires, semblables à celles qui se forment au moment de
l'excision
des
séquences
introniques
dans
les
ARN
pré-
messagers, ont été décrites dans les fibrilles RNP
(Angelier
et Lacroix,
1975
Angelier,
1978
Sommerville et Scheer,
1981 ;Sommerville, 1981).
Choi et al.
(1986) ont montré qu'un anticorps monoclonal
spécifique
d'une
ribonucléoprotéine
majeure,
inhibait
l'épissage in vitro des ARN pré-messagers de cellules HeLa;

104
la protéine considérée est impliquée dans la formation d'un
complexe d' épissage
(ou "spliceosome"),
contenant également
des petits ARN nucléaires, et indispensable à la progression
de la réaction d'épissage (Brody et Abelson, 1985 ; Grabowski
et al., 1985).
Ces résultats suggèrent donc un rôle actif et essentiel
des complexes RNPnh dans le processus de maturation des ARN
pré-messagers.
Si
l'assemblage
des
particules
RNPnh
de
l'ovocyte de pleurodèle est sans aucun doute perturbé par le
froid,
nos
résultats
ne
nous
permettent
pas
d'évaluer
d'éventuelles
modifications
dans
les
diverses
fonctions
attribuées à ces particules.
2.2. Localisation séquence-spécifi~ue des
particules RNP
Les études ultrastructurales, en particulier celles qui
ont été réalisées dans l'ovocyte d'amphibien,
favorisent la
notion d'un assemblage non-spécifique des particules RNP le
long de la molécule d'ARNnh
(Malcolm et Sommerville,
1974
Mott et Callan,
1975
Angelier
et
Lacroix,
1975
;
Scheer
et al.,
1976).
Notre
propre
analyse
ultrastructurale
va
également
dans
ce
sens,
puisque
des
fibrilles
RNP
polyparticulaires
sont
observées
dans
toutes
les
boucles
latérales et en tous points de la matrice RNP.
Dans
le
même
sens,
diverses
expériences
de
reconstitution in vitro dans
lesquelles des protéines RNPnh
forment
des
particules
en
présence
d' ARN,
mais
aussi
en
présence
d'ADN
viral
ou
d'homopolymères
nucléotidiques,
suggèrent fortement que ces protéines RNPnh ont une affinité

105
non-spécifique
pour
tous
les
acides
nucléiques
simple-brin
(Pullman et Martin, 1983 i Thomas et al., 1983 i Wilk et al.,
1983).
La
constitution des particules RNP
serait
donc une
propriété intrinsèque des protéines RNP,
indépendante de la
structure ou des séquences de l'ARN.
Cependant,
des
résultats expérimentaux de plus en plus
nombreux
indiquent,
qu'au
moins
dans
certains
cas,
l'assemblage
des
particules
RNP
peut
être
structure-
ou
séquence-spécifique.
Ainsi, dans l'ovocyte de l'amphibien Triturus cristatus
Kloetzel
et al.
(1982)
ont
montré
que
deux
polypeptides
purifiés à partir des RNPnh forment des particules semblables
aux particules RNPnh en présence d'ARNnh, mais pas au contact
d'ARNm,
ni d'ADN ribosomique
:
l' ARNnh contiendrait'- donc un
signal spécifique d'assemblage des particules RNP.
De
même,
l'analyse
en
microscopie
électronique
des
transcrits d'embryon de Drosophile, étalés selon la technique
de
Miller
et
Beatty
(1969)
a
montré
que
ces
transcrits
adoptaient tantôt une structure fibrillaire lisse, tantôt une
structure
particulaire
le
choix
entre
ces
deux
configurations
serait
déterminé
par
la
séquence
d'ARNnh
(Beyer et al.,
1980).
Ultérieurement,
ces mêmes
auteurs ont
également
montré
que
les
particules
RNP
observées
sur
ces
transcrits étaient spécifiquement localisées sur les sites de
clivage de l'ARN (Beyer et al.,
1981
i
Osheim et al.,
1985).
Toutefois,
les
conditions
de
préparation
très
stringentes
utilisées
dans
ces
expériences
détruisent
probablement
la
majorité des structures RNP natives. Les auteurs interprètent
néanmoins leurs observations par une stabilité préférentielle
des particules RNP situées à proximité immédiate des introns.

106
Ils
attribuent
à
ces
particules
un
rôle
actif
dans
la
juxtaposition des
séquences codantes
ou exons,
qui
survient
après l'excision des introns.
Dans
le
même sens,
Swanson et
Dreyfuss
(1988a,
1988b)
ont décrit une affinité préférentielle de plusieurs protéines
RNPnh de cellules HeLa pour des sites incluant l'extrémité 3'
des introns dans les ARN pré-messagers.
De
même,
diverses
études
biochimiques
ont
décrit
une
sensibilité différentielle des particules RNP à l'action des
ribonucléases
(Steiz et Kamen, 1981 ; Stévenin et al.,
1982).
Dans
les
transcrits
de
polyome,
alors
que
introns
et
exons
sont
uniformément
complexés
en
particules
RNP,
les
introns
sont plus sensibles aux nucléases
(Steiz et Kamen,
1981). Des
résultats identiques 6nt été obtenus dans les ARN spécifiquës
de la ~-globine (Patton et Chae, 1985), suggérant une fois de
plus
une
distribution
non-uniforme
des
protéines
RNP
en
relation avec l'épissage des ARN.
D'une
part,
ces
données
concernent
la
structure
d' ARN
bien particuliers
d'autre
part,
les
techniques
utilisées
dans les expériences citées plus haut sont,
pour la plupart,
très dénaturantes.
De ce fait,
i l n'est pas démontré que les
situations décrites dans ces travaux s'appliquent à
la vaste
majorité des ARNnh.
En ce
qui
concerne
la
structure
des
fibrilles
RNP
de
l'ovocyte de pleurodèle, notre étude nous permet de conclure
sur deux points :
( 1)
l'assemblage
des
particules
RNP
le
long
des
molécules
d' ARN
en
cours
d'élongation
est
apparemment
non-
spécifique ;

1
107
1
(2)
les
modifications
induites
par
le
froid
dans
la
structure
des
particules
RNP
s'opèrent
sans
discrimination
r
apparente,
ce
qui
suggère
une
faible
variabilité
de
la
l
stabilité de ces particules.
r
3. La matrice RNP des boucles latérales
~
Le
dernier
degré
d'organisation
des
produits
de
la
transcription, dans l'ovocyte d'amphibien, est la matrice RNP
des boucles latérales.
Notre étude ultrastructurale démontre
que
les
variations
morphologiques
observées
à
température
normale au niveau des boucles du pleurodèle,
sont liées à une
compaction plus ou moins importante des fibrilles RNP dans la
matrice.
Ces
fibrilles
RNP, ·-distinctes
dans
la
matrice
de
type
normal,
sont
rassemblées
en
aggrégats
de
densité
croissante dans
la matrice granulaire,
puis dans
la matrice
globulaire et
enfin dans
la matrice
dense.
A l ' inverse,
le
froid
induit
une
désaggrégation
spectaculaire des
fibrilles
RNP dans
la matrice des boucles
granulaires
qui évoluent en
boucles
du
froid,
et
une
désorganisation
ménagée
de
la
matrice globulaire.
La matrice dense
n'est
pas affectée par
ce type de modification.
Comprendre
à
quel
niveau
le
froid
perturbe
l'organisation des matrices RNP des boucles-repères pourrait
permettre de mieux appréhender
les
mécanismes
d' aggrégation
des transcrits dans ces matrices, à température normale.
(1)
Comment
s'opère
la
désorganisation
des
boucles
granulaires
et
l ' hyperdéveloppement
des
boucles
du
froid
à
aoc ?

10a
L'altération de
l'assemblage des
particules RNP
à
aoc
peut être envisagée comme l'une des causes de cette désorga-
nisation.
En effet,
comme
nous
l'avons déjà
explicité
(cf.
paragraphe
II.1.6.),
les
interactions
protéiques
jouent
un
rôle
primordial
dans
la
constitution
et
le
maintien
des
aggrégats de transcrits dans les matrices RNP,
à température
normale. La perte de protéines qui survient au froid dans les
particules
RNP,
et
par
conséquent
dans
les
fibrilles
RNP,
pourrait s'accompagner de la rupture, ou du non-établissement
de certaines interactions spécifiques,
conduisant ainsi à la
désaggrégation
de
ces
fibrilles
RNP,
à
la
décompaction de
l'ADN des boucles granulaires, et à
l'hyperdéveloppement des
boucles du froid.
(2)
Pourquoi
les
matrices
RNP
des
autres
types
de
boucles-repères
ne
subissent-elles
pas
une
désorganisation
comparable à celle de la matrice granulaire ?
Les
matrices
globulaires
et
denses
sont-elles
aussi
affectées par la réduction des particules RNP à aoc, mais la
matrice globulaire présente une désaggrégation très ménagée,
et la matrice dense n'en révèle aucune, même après plusieurs
semaines
d'hypothermie.
Ces
observations
suggèrent
donc
l'existence d'un facteur
stabilisant dans ces deux types de
matrices, facteur qui serait absent de la matrice granulaire.
Ce facteur peut être recherché au niveau de
la composition
protéique des différents types de matrices RNP.
La
variabilité
des
protéines
associées
aux
boucles
latérales
des
chromosomes
en
écouvillon
d' arnphibien
a
été
démontrée par des études immunologiques, faisant appel à des
anticorps monoclonaux,
ou à
des anticorps polyclonaux mono-

109
spécifiques.
Lacroix
et al.
(1985)
ont
décrit
plusieurs
anticorps monoclonaux dirigés contre les protéines nucléaires
de
l'ovocyte
de
Pleurodeles
waltl,
et
reconnaissant
des
antigènes
associés
aux
ARN
naissants
dans
les
matrices
de
boucles latérales. L'un de ces anticorps (A 33) marque toutes
les boucles normales du caryotype,
mais ne reconnaît ni
les
boucles globulaires,
ni les boucles à matrice dense
(boucles
de
types
B et
D,
définies
par
Lacroix,
1968).
Un
autre
anticorps
(A
1)
marque
seulement
une
trentaine
de
boucles
normales,
réparties
sur
les
12
bivalents
du
caryotype.
Certaines de ces boucles ne sont que partiellement marquées,
au
niveau
d'un
segment
correspondant
à
une
unité
de
transcription (Lacroix et al., 1985).
A~l'aide d'anticorps polyclonaux monospécifiques, Moreau
et al.
(1986,
1987)
ont
étudié
l'association
de
plusieurs
protéines
avec
les
structures
nucléaires
de
l'ovocyte
de
pleurodèle, et ont montré :
- que la nucléoplasmine,
l'une des protéines nucléaires
majeures de l'ovocyte, était associée aux particules RNP dans
les boucles latérales des chromosomes en écouvillon et dans
le nucléoplasme ;
- qu'une protéine de 185 KDa,
analogue de N1/N2 chez le
xénope
(Dabauvalle
et Franke,
1982)
était associée
aux
RNP
nucléoplasmiques, mais aussi aux boucles granulaires ;
qu'une
autre
protéine,
HMG1,
était
associée
aux
boucles latérales en activité de transcription, mais quittait
le noyau après arrêt de la transcription i
- et enfin,
qu'une protéine acide de 82 KDa s'associait
transitoirement aux boucles latérales
à des moments physio-
logiques précis (Moreau et al., 1986 ; Moreau, 1987).

110
Ces
études,
ainsi
que
de
nombreuses
autres
études
similaires menées chez d'autres espèces d'amphibiens
(Scott
et Sommerville,
1974
Sommerville et al.,
1978
Kloetzel
et al., 1980 ; Roth et Gall, 1987) montrent que si la plupart
des
protéines
sont communes
à
toutes
les matrices
RNP des
boucles
latérales
certaines
protéines
peuvent
être
spécifiques
d'un
type
morphologique,
ou
d'un
état
physiologique précis.
La
nature
variable
des
protéines
associées
aux
ARN
naissants
dans
les
matrices
RNP
des
différents
types
de
boucles
latérales
doit
être
retenue
comme
un
facteur
important pouvant expliquer,
d'une part,
l'aggrégation plus
ou moins poussée des
transcrits dans ces boucles à
20°C, et
d'autre pArt, leur désaggrégation différentielre à 8°C.

111
DEUXIEME PARTIE
MODIFICATIONS INDUITES
PAR LE FROID DANS LES SYNTHESES DE L'OVOCYTE

r
112
[
I. SYNTHESES D'ARN DANS LES CHROMOSOMES EN ECOUVILLON
r
1. Analyse autoradiographique des synthèses d'ARN dans
les boucles latérales des chromosomes en écouvillon
Les
ovocytes
prélevés,
tantôt
chez
des
femelles
maintenues
à
20°C
(ovocytes-contrôles),
tantôt
chez
des
femelles
maintenues
à
8°C,
ont
été
incubés
en
présence
d'uridine tritiée,
à
20°C pour les ovocytes-contrôles,
et à
8°C
pour
les
autres.
Afin
de
pallier
à
un
éventuel
ralentissement de la pénétration des précurseurs radioactifs
dans
l'ovocyte
au
cours
de
l'hypothermie,
nous
avons
également
réalisé
des
micro-injections
d'uridine
tritiée
directement dans
la vésicule germinative
(cf.
"Matériel et
Méthodes"). Dans les deux cas,
incubation ou microinjection,
des
résultats
identiques
ont
été
obtenus
et
seront
donc
présentés indifféremment.
1.1. Synthèses d'ARN dans les chromosomes en
écouvillon d'ovocytes-contrôles
Après
6
heures
d'incubation
en
présence
d'uridine
tri tiée,
les
boucles
latérales
de
type
normal
sont
uniformément marquées
(fig.
36a,
a').
De même,
les boucles-
repères de type granulaire (fig. 36a, a'), et à matrice dense
(fig.
36b, b') présentent déjà un marquage significatif. Par
contre,
l'incorporation
du
précurseur
radioactif
dans
les
boucles
globulaires
est
à
ce
stade
très
faible
(fig.
36a,
a' ) .

113
Après
24
heures
d'incubation,
les
boucles
normales,
granulaires,
et
à
matrice
dense,
sont
fortement
et
uniformément marquées
(fig.
37a,
a'
c,
c').
Les
boucles
globulaires
présentent
désormais
un
marquage
significatif
mais partiel
dans
les portions de boucle où l'alignement
des globules est bien visualisé, on distingue à
la fois des
globules
présentant
une
forte
concentration
de
grains
d'argent,
et des globules qui en sont dépourvus
(fig.
37b,
b' ) .
Après
48 heures,
on observe un marquage uniforme,
très
intense,
de
tous
les
types de boucles
latérales,
y
compris
les boucles globulaires
(fig.
38).
Le marquage des produits
RNP,
libérés dans le suc nucléaire,
augmente également avec
lardurée de l'incubation (fig. 36, 37 ~ 38).
1.2. Synthèses d'ARN dans les chromosomes en
écouvillon d'ovocytes en hypothermie
Dans un premier temps, nous avons analysé les synthèses
d'ARN dans
les
ovocytes
issus d'une
femelle
soumise
à
une
hypothermie de 24 heures. Comme nous l'avons déjà décrit, les
principales
modifications
structurales
des
chromosomes
en
écouvillon concernent,
à
ce
stade,
les
boucles granulaires
qui entament leur évol~tion en boucles du froid.
Nous avons ensuite étudié les synthèses d'ARN dans les
ovocytes prélevés chez une femelle soumise à une hypothermie
de
8
jours
à
ce
stade,
les modifications ffiorphologiques
subies par
les chromosomes en écouvillon sont à
leur
point
maximal
et
les
boucles
du
froid
sont
parfaitement
développées.

114
1.2.1. Ovocytes issus d'une femelle maintenue
à 8°C durant 24 heures
Après
6
heures
d'incubation
en
présence
d'uridine
tritiée,
aucun marquage n'est détecté au niveau des boucles
latérales des chromosomes en écouvillon,
qu'il
s'agisse des
boucles
normales
encore
bien
développées,
des
boucles
globulaires,
ou
des
boucles
granulaires
dont
la
transformation est amorcée (fig. 39a, al).
Aucune augmentation significative n'est observée dans le
marquage
des
boucles
latérales,
quelle
que
soit
leur
morphologie, ni après 24 heures d'incubation (fig.
39b, b'),
ni même après 48 heures (fig.
39c, Cl). De mêm~,
le matériel
RNP libéré dans
le suc
nucléaire
à
partir des
matrices
de
boucles
latérales,
présente
une
incorporation
de
radioactivité très faible (fig. 39).
L'activité
transcriptionnelle
est
donc
très
fortement
ralentie
au cours
des
premiers
jours
du traitement par
le
froid,
et
ce,
dans
toutes
les
boucles
latérales
des
chromosomes en écouvillon.
1.2.2. Ovocytes issus d'une femelle maintenue
à 8°C pendant 8 jours
Six
heures
après
l'apport
d'uridine
tritiée,
aucun
marquage
n'apparaît
sur
les
boucles
latérales
normales,
globulaires, ou sur les boucles du froid (fig. 40a, a').
Après
24
heures
d'incubation,
les
boucles
normales
présentent
un
marquage
significatif,
mais
considérablement

115
plus
faible
qu'à
température
normale
(fig.
40b,
b').
Les
boucles du froid sont tantôt vierges de tout marquage
(fig.
40b, b'),
tantôt faiblement mais uniformément marquées
(fig.
40c,
c').
Enfin,
les
boucles
globulaires
ne
sont
pas
significativement marquées (fig.
40c, Cl).
Après
48
heures
d'incubation,
le
marquage
augmente
légèrement dans les boucles normales et les boucles du froid,
mais pas dans les boucles globulaires (fig.
41).
L'incorporation
du
précurseur
radioactif
dans
les
RNP
nucléoplasmiques
croît
avec
le
marquage
des
boucles
latérales.
On remarquera que
les
nucléoles sont
fortement marqués
après
48
heures
d'incubation en présence dl uridine
tritiée
(fig.
41). -Ce marquage
intense est d'ailleurs observé pour
des temps d'incubation inférieurs, 6 heures et 24 heures.
Après une hypothermie prolongée,
l'activité synthétique
des
chromosomes
en
écouvillon
atteint
donc
un
niveau
significatif,
contrairement à ce qui était observé dans les
premiers jours de traitement par le froid. Cependant,
le taux
de
transcription
reste
bien
inférieur
à
ce
qu'il
était
à
température normale.
2. Expériences d'inhibition des synthèses d'ARN dans les
boucles latérales des chromosomes en écouvillon
Effets de l'Actinomycine D et de l'a-amanitine
L'actinomycine
D
et
l'a-amanitine
sont
deux
drogues
connues pour leur capacité à inhiber les synthèses d'ARN. Ces

116
deux
inhibiteurs
de
la
transcription
agissent
selon
deux
mécanismes différents.
L'actinomycine D n'a pas
d' affini té pour les molécules
d'ARN-polymérase, mais forme un complexe stable avec l'ADN
:
la
formation
de
ce
complexe
nécessite
le
maintien
de
la
configuration
hélicoïdale
de
l'ADN,
et
la
présence
de
guanine,
cette
base
étant
spécifiquement
reconnue
par
l'actinomycine D (Reich et Goldberg,
1964).
En se
fixant
à
l'ADN,
l'actinomycine
D empêche,
dans
un
premier
temps,
la
progression
normale
des
molécules
d' ARN-polymérase,
et
provoque la libération prématurée des fibrilles RNP en cours
d'élongation
(Snow
et
Callan,
1969
Sonunerville,
1973
Scheer,
1978).
Dans
un
deuxième
temps,
elle
bloque
l'initiation de
la transcription en empêchant
l'attachement
de nouvelles molécules d'ARN-polYmérase à l'axe de d'ADN.
L' a-amani tine se
fixe
directement
aux molécules d' ARN-
polymérase
toutefois,
elle
n'inhibe
pas
la
liaison
de
l'enzyme à
l'axe de
l'ADN,
pas
plus qu'elle ne provoque
la
dissociation
des
complexes
de
trancription
préalablement
formés.
L'a-amanitine
bloque
l'initiation
de
la
transcription,
et
l'élongation
des
molécules
d'ARN,
en
empêchant l'établissement de ponts phosphodiesters entre les
ribonucléotides (Cochet-Meilhac et Chambon, 1974).
Bien qu'ils
agissent
selon
des
mécanismes
différents,
ces
deux
inhibiteurs
provoquent
la
rétraction
des
boucles
latérales des chromosomes en écouvillon.
La vitesse de cette
rétraction
reflète
le
taux
des
synthèses
d' ARN
au
sein de
chaque
type
de
boucle.
L'intérêt
de
l'utilisation
en
parallèle
de
ces
deux
inhibiteurs
pour
étudier
la

117
transcription
réside
donc
dans
le
fait
que
leurs
modes
d'action sont différents.
2.1. Effets des inhibiteurs sur les chromosomes en
écouvillon d'ovocytes-contrôles
L'actinomycine D (50 ~g/ml) et l'a-amanitine (100 ~g/ml)
ont
été
introduites
par
microlnjections
dans
la
vésicule
germinative d'ovocytes issus d'une femelle maintenue à 20°C.
Les ovocytes ont ensuite été incubés
à
20°C dans un milieu
approprié
(cf.
"Matériel
et
Méthodes").
Après
des
temps
d'incubation
croissants,
les
chromosomes
en
écouvillon
ont
été isolés et fixés, avant d'être observés en MO.
Une
modification
speé't.aculaire
de
la
morphologie
des
chromosomes
en
écouvillon
survient
très
rapidement
lorsque
l'on fait agir les inhibiteurs à température normale
(20°C).
En effet,
5 minutes après
l'injection d'a-amanitine dans
le
noyau
de
l'ovocyte,
et
15
minutes
après
l' inj ection
d'actinomycine
D,
la
majorité
des
boucles
latérales
a
complètement régressé. Seules demeurent sur les bivalents qui
en sont porteurs,
les boucles globulaires
(f ig.
42a)
les
autres types de boucles latérales, normales, granulaires ou à
matrice
dense,
ne
sont
déjà
plus
observées.
L'axe
chromosomique est fortement condensé (fig. 42a).
Dix minutes
après
l'injection
d'
a-amanitine
dans
le
noyau,
et
30
minutes
après
l'injection
d' actinomycine
D,
l'axe
chromosomique
épaissi
et
condensé
à
l'extrême,
est
complètement dépourvu de boucles latérales (fig. 42b, cl. Les
boucles globulaires
sont désormais
absentes du caryotype.
A
l'exception des
bivalents
IV et XI,
identifiés grâçe à
une

1
118
1
structure particulière appelée sphère,
les chromosomes ne se
1
distinguent plus les uns des autres (fig. 42b, cl.
En conclusion,
si à
20°C toutes
les boucles
latérales
r
sont extrêmement sensibles à l'action des
inhibiteurs de la
,
transcr iption,
les
boucles
globulaires
sont
cependant
les
dernières à se rétracter.
1
2.2. Effets des inhibiteurs sur les chromosomes en
écouvillon d'ovocytes en hypothermie prolongée
L'actinomycine D (50 ~g/ml) et l'a-amanitine (100 ~g/ml)
ont
été
injectées
dans
le
noyau
d'ovocytes
issus
d'une
femelle maintenue a jours à aoc.
Après des
temps croissants
d'incubation à aoc, les chromosomes en écouvillon sont isolés
et préparés pour l'observation en MO.
Six
heures
après
l' inj ection
des
drogues,
aucune
modification
n'affecte
la
morphologie
des
chromosomes
en
écouvillon. Les boucles normales, les boucles du froid et les
boucles globulaires sont encore bien développées (fig.
43a).
Vingt-quatre
heures
après
l'injection
des
inhibiteurs
(fig.
43b),
on observe une rétraction importante des boucles
normales, qui sont à peine visibles sur l'axe chromosomique.
Les boucles du froid, qui se distinguent encore parfaitement,
ont
nettement
perdu
de
leur
amplitude.
Par
contre,
les
boucles
globulaires
ne
présentent
aucune
modification
et
restent bien développées.
Après quarante-huit heures d'incubation en présence des
inhibiteurs
(fig.
43c),
les boucles
normales
ont quasiment
disparu.
Les
boucles
du
froid
typiques
ne
sont
plus
observées,
soit qu'elles
se soient complètement rétractées,

119
ou qu'elles
aient
suffisamment régressé pour
être masquées
par
les
boucles
globulaires
adj acentes.
Ces
dernières
restent, en effet, bien développées, et ne semblent pas avoir
été affectées par les inhibiteurs (comparer les figures
43a,
b et cl. Les boucles globulaires se maintiennent ainsi aussi
longtemps
que
l'ovocyte
survit
aux
effets
toxiques
des
drogues,
en
moyenne
3
à
4
jours
après
la
première
microinjection.
L'administration
d'une
seconde
dose
d'inhibiteur,
24 heures après la première,
n'accélère pas la
rétraction de ces boucles globulaires.
La
sensibilité
des
boucles
latérales
à
l'action
des
inhibiteurs
des
synthèses
d' ARN est donc
fortement
réduite
dans les ovocytes en hypothermie, qu'il s'agisse des boucles
normales, des boucles du froid, ou surtout des boücles globu-
laires.
3. Discussion: Ralentissement général de la
transcription dans les chromosomes en écouvillon à SOC
A température normale (20°C),
les boucles latérales des
chromosomes
en
écouvillon
révèlent
deux
modes
de
transcription:
(a)
Les
boucles
normales,
granulaires
et
à
matrice
dense,
présentent
un taux de
transcription comparable.
Les
matrices
RNP
de
ces
boucles
sont,
en effet,
rapidement
et
uniformément
marquées
par
l'uridine
tritiée.
De
plus,
ces
trois types de boucles
latérales régressent très rapidement
en présence des inhibiteurs des synthèses d'ARN.
L'uniformité
de
marquage
de
la
matrice
des
boucles
latérales
indique
que
la
vitesse
de
la
transcription
est

120
identique sur
toute la
longueur de la boucle concernée
: ce
mode
de
transcription
a
été
décrit
dans
la
majorité
des
boucles latérales des chromosomes en écouvillon d'amphibiens
(Gall et Callan,
1962
; Izawa et al., 1963
; Snow et Callan,
1969 ; Hartley et Callan, 1978).
(b)
Les
boucles
globulaires
révèlent
un
mode
de
transcription
plus
complexe
que
celui
des
autres
types
de
boucles. Ces boucles apparaissent faiblement et partiellement
marquées après 24 heures d'incubation en milieu tritié, alors
que
les
autres
boucles
latérales
sont
déjà
fortement
et
uniformément marquées. Les boucles globulaires sont également
toujours
les
dernières
à
se
rétracter
en
présence
des
inhibiteurs
de
la
transcription,
qu'il
s'agisse
de
l'actinomycine"D ou de l'a-amanitine.
De
plus,
par
une
étude
détaillée
de
la
transcription
dans
les
boucles globulaires,
faisant
appel
à
des
analyses
autoradiographiques
en
microscopie
optique
comme
en
microscopie
électronique,
à
des
techniques
d'étalement
moléculaire,
et à des expériences d'inhibition des synthèses
d'ARN, nous avons montré en collaboration avec Penrad-Mobayed
et al.
(1986)
qu'une
même
boucle
globulaire
présentait
toujours
plusieurs unités de transcription repliées sur elles-même, au
sein des globules ;
-
qu'il
existait
des
variations
asynchrones
entre
les
uni tés
de
transcription
d f une
même
boucle
globulaire.
Les
uni tés
de
transcription
présenteraient
alternativement
des
phases d'activité et des phases d'arrêt des synthèses d'ARN.
Dans ce dernier cas,
la libération des transcrits ne serait
pas
immédiate.
Ainsi,
seules
les
unités
de
trancription en

121
phase d'activité seraient marquées par l'uridine tritiée, et
sensibles
à
l'action
des
inhibiteurs
de
la
transcription.
Ceci expliquerait à la fois
le marquage partiel des boucles
globulaires
en
autoradiographie,
et
leur
rétraction
plus
lente en présence de l'actinomycine D et de l'a-amanitine.
Ce mode
particulier de
transcription dans
les
boucles
globulaires, ainsi que le mode de transcription observé dans
les
autres
types
de
boucles
latérales
normales,
granulaires,
et
à
matrice
dense,
sont
schématisés
dans
la
figure 44.
A
8°C,
si
nous
ne
notons
aucune
modification
des
modalités de
la transcription dans
les différents types de
boucles latérales, nous obserVons cependant un ralentissement
général des synthèses d'ARN.
En effet, dans les ovocytes isolés après un court séjour
de la femelle à 8°e
(24 heures),
le taux de synthèse d'ARN
dans
les
chromosomes
est extraoridnairement
faible
aucun
marquage n'est observé dans les boucles latérales, quelle que
soit leur morphologie, après 48 heures d'incubation en milieu
tritié.
Par
contre,
dans
les
ovocytes
isolés
après
8
jours
d' hypothermie,
la
transcription
atteint
un
niveau
significatif. Dans ces ovocytes tout comme dans les ovocytes-
contrôles, le taux des synthèses d'ARN varie selon le type de
boucle considéré.
(a)
Les
boucles
normales
ne
sont
significativement
marquées
par
l'uridine
tritiée
qu'après
24
heures
d'incubation,
au
lieu
de
6
heures
à
température
normale
(20°C).
De
plus,
la
régression
complète
de
ces
boucles

122
survient 24 heures après l'injection d'actinomycine D ou d'a-
amanitine
dans
le
noyau
de
l'ovocyte
à
8°C
à
20°C,
les
boucles
normales
disparaissaient
en
quelques
minutes.
La
transcription y
est
donc
fortement
ralentie,
ce
qui
était
prévisible,
compte-tenu
de
l'importante
rétraction
de
ces
boucles au cours du traitement par le froid.
(b)
Les
boucles
du
froid
présentent
également
une
activité
transcriptionnelle
très
réduite
48
heures
après
l'administration
d'uridine
tritiée,
ces
boucles
sont
uniformément
mais
faiblement
marquées,
et
leur
régression
nt est
observée
qu'après
48
heures
d'incubation
en présence
des
inhibiteurs
de
la
transcription.
Le
développement
spectaculaire
des
boucles
granulaires
en
boucles
du
froid
n'est
donc
pas
associé
à
une
amplification
des
synthèses
d' ARN, comme on pouvait le supposer.
(c)
Enfin,
aucun
marquage
signif icatif
n'est
détecté
dans les boucles globulaires après 48 heures d'incubation en
milieu
tritié.
De
plus,
ces
boucles
semblent
totalement
insensibles
à
l'action
prolongée
des
inhibiteurs
de
la
transcription.
L'ensemble
de
ces
résultats
suggère
que
la
transcription y est fortement ralentie,
voire arrêtée à 8°C,
ce qui n'est pas surprenant
compte-tenu du mode particulier
de transcription
que présentaient
déjà ces
boucles à
20°C.
Nous avions en effet émis l'hypothèse selon laquelle dans les
boucles globulaires à
20°C,
les fibrilles RNP des unités de
transcription
en
arrêt
de
synthèse
n'étaient
pas
immédiatement
libérées
(Penrad-Mobayed
et al.,
1986
voir
fig.
44),
ce qui
expliquerait le maintien de
ces boucles
à
8°C en l'absence quasi-totale de toute transcription.

123
En
raison de
leur faible
fréquence
d'apparition,
nous
n'avons
pu
obtenir
de
données
suffisantes
quant
à
la
transcription dans les boucles à matrice dense à 8°C. D'après
les
rares
observations
que
nous
avons
pu
réaliser,
il
semblerait cependant que les synthèses d'ARN y soient égale-
ment très ralenties.
Quel
est
le
facteur
responsable
du
ralentissement
de
l'activité transcriptionnelle des chromosomes en écouvillon à
8°C ?
Selon
Hartley
et
Callan
(1978),
le
froid
ralentirait
l'ensemble
des
activités
enzymatiques
dans
l'ovocyte
d'amphibien et par conséquent, celle de l'ARN-polymérase II,
enzyme ~responsable de
la
transcription
dans
les
boucles
latérales
des
chromosomes
en
écouvillon
(Schultz
et al.,
1981).
Si
le
froid inhibe bien l' activi té de
l' ARN-polymérase
II,
comme
le
confirme
l'ensemble
de
nos
résultats,
il
semblerait que l'activité de l'ARN-polymérase 1,
responsable
de
la
transcription
nucléolaire
(Reeder
et
Roeder,
1972
Schultz et al.,
1981)
ne soit pas
affectée.
En effet,
nous
avons pu constater que
les
nucléoles
étaient
rapidement et
fortement marqués par l'uridine tritiée à 8°C.
Ces observations suggèrent donc
un effet
spécifique du
froid sur l'activité de l'ARN-polymérase II. Nous reviendrons
plus loin sur ce point très important.

124
II. MODIFICATIONS DES SYNTHE5ES PROTEIQUES DE L'OVOCYTE EN
HYPOTHERMIE
Nous avons analysé les protéines néosynthétisées par les
ovocytes issus de femelles placées à aoc pendant 24 heures, 5
jours, ou plus de a jours. En effet, ces périodes de stress
coincident
avec
les
étapes-clés
des
modif ications
chromosomiques, et en particulier avec les étapes de l'hyper-
développement
des
boucles du
froid
(paragraphe
II.2.,
1ère
partie) .
Les
ovocytes
de
stade VI
sont
isolés
et soigneusement
défollicularisés,
avant
d'être mis
en
incubation durant
20
heures à aoc, en présence de Méthionine-S 35 (cf. "Matériel et
Méthodes" )
l"'-élimination des cellules folliculairës assure
le marquage
et
l'analyse des seules
protéines endogènes de
l'ovocyte.
Les
protéines
totales,
cytoplasmiques,
ou
nucléaires
des
ovocytes
traités
par
le
froid
ont
été
analysées
par
électrophorèse bidimensionnelle,
et
comparées
avec celles des ovocytes-contrôles.
1. Analyse des protéines totales de l'ovocyte en hypo-
thermie
Pour cette analyse, les protéines du surnageant 10.000 g
d'ovocytes-contrôles
(fig.
45a),
et d'ovocytes
isolés après
24
heures
d' hypothermie
(fig.
45b),
ont
été
séparées
par
électrophorèse
bidimensionnelle
à
aoc.
La
comparaison
des
profils
protéiques
ainsi
obtenus
met
en
évidence
une
réduction des synthèses de l'ovocyte à
aoc. Cette réduction
affecte
particulièrement
les
polypeptides
de
haut
poids

125
moléculaire
(supérieur
à
90 KDa
;
fig.
45b).
Cependant,
de
nombreux
polypeptides
sont
synthétisés
en
quantités
équivalentes à 20°C et à Soc.
Outre la baisse quantitative de l'ensemble des synthèses
protéiques, la modification qualitative la plus significative
est observée à Soc au niveau de deux polypeptides de 46 KDa,
et de points
isoélectriques respectifs 5,0 et 5,2.
Ces deux
protéines très voisines présentent les mêmes caractéristiques
de
migration
en
électrophorèse
bidimensionnelle
que
l'actine
la
protéine
la
plus
acide
(46
KDa,
pi
5.0)
correspondant
à
l' actine 13, et la
plus basique
(46
KDa,
pi
5,2)
correspondant à
l ' actine ~
(Ballantine
et al.,
1979
;
Vandekerckhove et al., 1981). De plus, l'identité de ces deux
protéines
a
ét:"é
confirmée
par
immunolocalisation ~à
l'aide
d'un anticorps monoclonal anti-actine (Miles, fig.
46).
Dans les ovocytes-contrôles, bien que ces deux protéines
soient
synthétisées
en
quanti té
importante,
on observe
une
nette prépondérance de
l' actibe 13 sur l' actine ~ (fig.
45a).
Par
contre,
à
8°C,
les
deux
isoformes
de
l'actine
sont
synthétisés en quantités équivalentes (fig.
45b).
Un
prof i l
protéique
similaire
est
observé
après
des
temps d'hypothermie
plus
longs,
5
jours ou 15
jours
à
Soc.
Nous
avons
cependant.
noté
une
légère
restauration
des
synthèses dans les ovocytes isolés après 5 jours à SoC.
L'analyse des
protéines néosynthétisées
présentes
dans
le cytoplasme ou dans le noyau des ovocytes en hypothermie a
permis de préciser la nature des modifications induites par
le froid dans chacun de ces deux compartiments cellulaires.

1
126
1
2. Analyse des protéines cytoplasmiques et nucléaires
r
des ovocytes isolés après 24 heures d'hypothermie
1
Après
incubation
en
présence
de
Méthionine-S 35 ,
les
ovocytes
défollicularisés
sont
énucléés
manuellement
les
r
protéines des
surnageants
cytoplasmiques
100. 000
g,
et
les
protéines nucléaires totales sont alors séparées par électro-
t
phorèse bidimensionnelle (cf. "Matériel et Méthodes").
2.1. Protéines cytoplasmiques
Plusieurs
modif ications
sont
observées
au
niveau
des
protéines cytoplasmiques de l'ovocyte isolé après 24 heures à
BoC
(fig. 47c)
:
(1) On remarque en premier lieu une baisse significative
de
l'ensemble
des
synthèses
protéiques.
De
nombreuses
protéines,
très
abondantes dans
le cytoplasme des ovocytes-
contrôles
(fig.
47a)
sont
absentes
après
24
heures
d'hypothermie, ou quantitativement réduites
le premier cas
est illustré par deux protéines majeures de 47 KDa et 54 KDa,
le second cas,
par
une
protéine
de
96
KDa
(fig.
47b).
Ces
trois
protéines
sont
citées
à
titre
d'exemples,
mais
la
baisse des synthèses affecte de nombreuses autres protéines,
notamment dans les hauts et les bas poids moléculaires.
Par
contre,
de
nombreuses
taches
radioactives,
correspondant
à
des
protéines
dont
les
poids
moléculaires
varient
entre
46
et
96
KDa,
présentent
une
intensité
comparable dans
le
cytoplasme
des
ovocytes-contrôles
(fig.
47a), et dans celui des ovocytes en hypothermie (fig.
47c)
:

127
ceci
suggère
que
la
synthèse
de
ce
lot
de
protéines
est
maintenue à 8°C.
(2)
La
seconde
modification
importante
concerne
une
protéine de 185 KDa,
analogue des protéines nucléaires N1/N2
de l'ovocyte de xénope (Dabauvalle et Franke, 1982 ; Moreau,
1987) .
Alors que cette protéine n'est que faiblement détectée
dans
le
cytoplasme
des
ovocytes-contrôles
(fig.
47a),
elle
est observée en quanti té
importante dans
le cytoplasme
des
ovocytes isolés après 24 heures à 8°C (fig. 47c).
(3)
Enfin,
on
observe
une
modification
au
niveau
de
l'actine
cytoplasmique.
Dans
le
cytoplasme
des
ovocytes-
contrôles,
11 actine
13
est
prédominante
par
rapport
à
llactine ~
(fig.
47a et
48a):- Par contre,
à
8°C,
ces
deux
protéines sont synthétisées en quantités identiques (fig.
47c
et
48c).
De
plus,
la
comparaison
des
taches
radioactives
correspondant à
ces deux protéines à
20°C et
à
8°C suggère
une baisse de la synthèse de l'actine 13 à 8°C.
2.2. Protéines nucléaires
Trois modifications principales affectent
les protéines
nucléaires de
l'ovocyte isolé après
24 heures d' hypothermie
(fig. 47d).
(1)
On observe tout d'abord une perte dramatique de
la
grande
majorité
des
protéines
nucléaires
néosynthétisées.
Cette
perte
est
indépendante
du
poids
moléculaire
des
protéines. Ainsi, parmi les protéines très abondantes dans le
noyau des
ovocytes-contrôles
(fig.
47b),
mais
absentes
du
noyau
après
24
heures
d'hypothermie,
figurent
les

128
polypeptides
de
185
et
96
KDa
déjà
cités,
ainsi
que
deux
polypeptides de 33 et 34 KDa (fig. 47d).
(2)
Seul un lot restreint de protéines néosynthétisées
est maintenu dans le noyau après 24 heures à 8°C (fig.
47d).
Ce lot comprend :
-
la
nucléoplasmine
(3 2
KDa;
pi
5,3
à
6,1),
protéine
majoritaire dans le noyau de l'ovocyte d'amphibien (Earnshaw
et al.,
1980
;Krohne et Franke,
1980
Mills et al.,
1980
;
Moreau et al., 1986),
-
les
protéines
P43
(pi
5,3),
P53
(pi
5,6),
P68
(pi
5,9), P72 (pi 5,2), P74 (pi 5,1) et P82 (pi 5,5),
- et les deux isoformes ~ et ~ de l' actine.
A l'exception de P43 et P53 qui deviennent majoritaires
dans le noyau de l'ovocyte après 24 heures d'hypothermie, les
autres
protéines
sont
présentes
en
quantités
plus
faibles
qu'à 20°C.
La protéine P74
(pi 5,1) présente une grande similitude
avec
hsp70,
protéine
majoritaire
synthétisée
par
l'ovocyte
d'amphibien (Bienz et Gurdon,
1982 ;
Boucher, 1982 ; Browder
et al.,
1987),
ainsi que par une grande variété de cellules
en réponse à un choc hyperthermique
(revues par Schlesinger
et al., 1982 ; Pelham, 1985 ; Lindquist et Craig, 1988).
Cette
similitude
s'observe
tout
d'abord
au niveau
des
caractéristiques
de
migration
en
électrophorèse
bi-
dimensionnelle. En effet, le terme hsp70 regroupe une famille
de protéines dont les poids moléculaires s'échelonnent entre
67 et 78 KDa
(revues par Nover et al.,
1984
;
Lindquist et
Craig,
1988).
De
plus,
dans
l'ovocyte
isolé
de
pleurodèle

129
soumis
à
un
choc
hyperthermique,
hsp70
est
résolue
en
électrophorèse sous forme de plusieurs sous-unités de points
isoélectriques
variés
(Boucher,
1982).
En
examinant
les
profils électrophorétiques présentés par cet auteur, et ceux
que nous
avons obtenus à
partir d'ovocytes
cultivés à
35°C
pendant 3 heures, no~s avons pu constater que la protéine du
froid P74 présentait les caractéristiques d'une sous-unité de
hsp70 chez le pleurodèle.
Cette
similitude
s'observe
également
au
niveau
des
propriétés antigéniques de P74 et hsp70. En effet, nous avons
réalisé
des
immunolocalisations
sur
des
transferts
de
protéines nucléaires totales d'ovocytes de pleurodèle traité
par
le
froid,
en
utilisant
un
anticorps
monoclonal
anti-
hsp70 : cet anticorps, dénommé G-10C9, aimablement f~urni par
Mme D. Mattei de l'Institut Pasteur,
reconnaît une séquence
de 16 acides aminés, présentant une forte homologie avec les
protéines hsp70 de cellules de souris
(87,5%) et de cellules
humaines (81,2%)
Mattei et al.,
1989). Parmi les protéines
nucléaires
de
l'ovocyte de
pleurodèle
traité
par
le
froid,
seule P74 est spécifiquement reconnue par cet anticorps (fig.
49).
Cette protéine du foid
présente donc
sans aucun doute
une forte homologie avec hsp70.
(3) Enfin, la dernière modification notable est observée
au niveau de l'actine nucléaire. Dans
le noyau des ovocytes-
contrôles,
les
deux isoformes de
l' actine
sont en quanti té
très importante, avec èependant une prédominance évidente de
l'actine
13 par rapport à
l' actine ~
(fig.
47b et
48b).
A
l'inverse, à 8°C, l'actine ~
devient prédominante par rapport
à
l' actine
13,
et
ce
malgré
une
baisse
quantitative

130
remarquable
des
deux
isoformes
dans
le
noyau
de
l'ovocyte
(fig. 47d et 48d).
3. Analyse des protéines cytoplasmiques et nucléaires
des ovocytes isolés après 5 jours d'hypothermie
3.1. Protéines cytoplasmiques
Après
5
jours
d'hypothermie,
on
observe
une
légère
restauration
des
protéines
cytoplasmiques
néosynthétisées
(fig.
47e).
Ainsi,
deux
protéines
de
47
et
54
KDa
qui
n'étaient
plus
détectées
apres
24
heures
à
8°C,
sont