-~-----~1
THESE
pras.ne'.
l
L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG
pour obtenir le qrade de
DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG
par
Yvonne Libona OIYIZOU
S y n t h è s e
d ' u n e
s o n d e
p h o t o s e n s i b l e .
t r a n s m e m b r a n a i r e
e t
p h o s p h o l l p i d i q u e .
E t u d e s
p h y s i c o c h i m i q u e s
e t
p h o t o c h i m i q u e s
d a n s
l e s
v é s i c u l e s .
Soutenue le 25 Septembre 1987 de devant la commission d'examen:
MM.
G. OURISSON
Pr~sident
D. GERARD
F. SCHNEIDER
Examinateurs
Y. NAKATANI

---

Professeur Guy Ourisson
"On va essayer de faire quelque chose", m'avez
vous
dit
lorsque
je
me
suis
pr~sentée
à
vous, il y a quatre ans. C'était enfin l'espoir
pour moi, après avoir frappé en vain à toutes les portes
pour
trouver
un
'laboratoire
d'accueil.
Peu
de temps après, vous acceptiez définitivement
de me prendre dans votre équipe. Je ne me doutais pas à ce
moment-là,
que
je
rentrais
non seulement dans une grande équipe scientifique, mais aussi
dans une école humaine.
En effet, ces années ont été très riches tant pour le
contenu
de
ma
formation
en
chimie
organique
que
pour
la
richesse
en relations
humaines.
Cher Professeur, veuillez
trouver
ici
toute
ma
reconnaissance
pour
l'accueil
dans
votre
laboratoire, pour le suivi de ma formation et
de
mon
travail,
pour
les
précieuses
discussions
et
les
conseils,
également
pour
l'aide
financière
qui m'a ôté
un grand souci. Pour tout
cela un simple mot : Merci.
Docteur Yoichi Nakatani
C'est une grande joie pour moi de
pouvoir
vous
remercier.
Avec
vos
qualités
scientifiques
et
humaines,
vous avez guidé mon travail le
jour le jour. Merci également pour le soutien moral dans
les
moments
les
plus
difficiles
pendant
lesquels
vous
avez même mis la main à la pâte.
C'était une chance pour moi de pouvoir travailler avec
vous
car
tout
en
étant suivi dans le travail, on garde une certaine liberté.
Docteur Geneviève Wolff
Je
ne
saurais
oublier
mes
débuts
à la paillasse lorsque vous
avez du m'apprendre les principes élémentaires
du
travail
de
paillasse.
Je
vous
remercie
pour toute la patience et la sympathie que vous avez eu
à mon égard. Durant tout le long de
mon
travail
de
thèse,
vou~
m'avez
apporté
une
aide
précieuse
jusqu'à
la
réalisation
technique
de
ce
mémoire. Merci.

---

Mon travail doit beaucoup à Arielle Genevois qui durant son ann~e
de DEA a
travaill~
avec
moi.
Elle
a
su,
avec
beaucoup
de
courage,
participer
aux
essais
difficiles
de
synthèses
de
L~cithines.
Je lui
t~moigne
ma
profonde
reconnaissance
et
lui
souhaite
une
bonne
continuation à Gif-sur-Yvette.
Mes
remerciements
vont
à mon voisin de paillasse, Tarik Lazrak,
qui m'a initi~ aux techniques de pr~paration des v~sicules.
Je
remercie
Messieurs
Professeur
D.
G~rard
et
Docteur
F.
Schneider pour avoir accepté
de juger mon travail.
Mes
remerciements
vont
~galement au Gouvernement Burkinab~ pour
la bourse qui m'a ~t~ accord~e.
Que soient ici remerci~s
les
divers
responsables
des
services
de
l'Institut
de Chimie de Strasbourg grâce auxquels ce travail a pu être
men~ à bien. Je remercie Madame E. Krempp et Messieurs J. D.
Sauer
et
P.
Wehrung
pour
les
spectres
de RMN, Messieurs R. Hueber et G. Teller pour
les Spectres de Masse, et Madame
M.
François
pour
la
microanalyse
des
~chantillons.
Je
suis
heureuse
de pouvoir adresser mes remerciements à Madame
Scheer pour la gentillesse avec laquelle elle
a
r~alis~
les
mesures
de
DSC,
Madame
M.
Mi~h~ pour les observations au microscope ~lectronique et
Monsieur A. Walksman qui m'a permis
d'utiliser
le
spectromètre
u.v.
de
son laboratoire.
A
vous,
mes
camarades
du
Laboratoire G.O., auprès de qui j'ai
pass~ des
moments
agr~ables~
avec
le
sérieux
du
travail
de
chacun,
l'ambiance
est
tout
aussi
agr~able. Merci pour votre aide, vos conseils
et votre pr~sence.
Merci à Madame M. Geffroy, pour la frappe de
cette
thèse,
et
à
Mademoiselle V. Ulrich, pour les retouches.
Enfin,
merci
à tous les amis qui m'ont aid~e dans la r~alisation
technique de cette thèse.

---

SOM MAI R E
INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE l
SONDES PHOTOSENSIBLES TRANSMEMBRANAIRES
1. UTILISATION DES SONDES PHOTOSENSIBLES DANS L'ETUDE
DE MEMBRANES LIPIDIQUES •••.••.••••.•••••••••••••••••••••••••••••• 5
1.1
Travaux de Khorana
6
1.2
Travaux de Breslow
7
1.3
Choix de notre sonde
8
2. EXEMPLES D'AMPHIPHILES A DEUX TETES POLAIRES ••••••••••••••••••••• 9
2.1
Produi ta naturels
9
2.2
Produits synth'tiques
lO
2.2.1 Exemples de Kunitake
lO
2.2.2 Exemples de Ringsdorf
lO
2.2.3 Exemples de Fuhrhop
11
3. CONCEPTION DE LA SONDE PHOTOSENSIBLE
TRANSMEMBRANAIRE •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 11
3.1
Choix des têtes polaires ••••.••..••••••.••.••••.•..••••••. 1l
3.2
Choix de la chatne lipidique en sn-l •••••••.•••.•••.•.•••. 12
3.3
Configuration en C-2 du glyc~rol••.••.•••••.••••..•.•..••• 13
3.4
Choix du groupement photosensible ••••••••••••••••••....•.• 13
3.5
Importance de la liaison entre le groupe
photosensible et la chatne lipidique qui le porte •••..•... 15
REFERENCES

---

CHAPITRE
II
SYNTHESE DE PHOSPHOLIPIDES PHOTOSENSIBLES
INTRODUCTION • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 24
1. SYNTHESE DES ACIDES GRAS PHOTOSENSIBLES ••••..•••.••.•.••••....•• 25
1.1
Synthèse des esters ph~noliques••••..•....•.••.•.••••.•.•• 25
1.1.1 Synthèse à partir de l'acide azélaïque ••••••..•.••.•.•.••. 25
1.1.2 Synthèse à partir du monoester méthylique de l'acide
..
az é lalque
27
1.2
Synthèse d'acide gras à liaison ~ther.•••••••..•••••••.••. 29
1.2.1 Synthèse du monoacide
29
1.2.2 Synthèse du diacide
31
1.2.3 Caractérisation spectrale •..•••••.•••.•.•.•.•..••••••..•. 33
2.
ACYLATION DE DERIVE DE GLYCEROPHOSPHATIDYLCHOLINE .•.•..••.•.• 34
2.1
Donn~es bibliographiques •••••••..•••..••.•...••••.••.••... 34
2.1.1 Activation de l'acide
34
2.1.2 Protection de la tête polaire ••.•••••.••••••••••..•••••... 35
2.1.3 Activation des hydroxyles du glycérol •..•••••••.•.••••...• 37
2.1.4 Réaction de couplage
3?
2.2
Pr~paration du complexe de cadmium de la
lysol4.ci thine
37
2.3
Essais initiaux d'activation des acides .•••.••••.••••••••• 38
2.4
Couplage par un imidazolide ••••••.•.•••.••••••••••••••••.• 39
2.4.1 Synthèse de lécithine mixte avec le monoacide ••••••..••... 39
2.4.2 Synthèse de lécithine mixte transmembranaire ..••.•.••.•..• 39
a) Préparation du bis-imidazolide .•....••..•••.•••.••..••• 40
b) Couplage bis-imidazolide + lysolécithine •.•••••..•...• 41
- activation de l'alcool par DMSO- •••.•••••.••••••••... 4l
- activation de l'alcool par DMAP ••••.•••••.••••••••••• 41

---

2.5
Autre voie possible de couplage: par l'acyl-thiazolidine .. 43
2.5.1 Couplage: glyc~rophosphatidylcholine+ 2 monoacides •..•... 43
a) Pr~paration de l'acyl-thiazolidine du monoacide ••.•..•. 43
b) Acylation du complexe:
(GPC)(CdCl2) • . . . . . • • . . . . . . • . . . . . 43
2.5.2 Essai d'application à la synthèse de la l~cithine
transmembranaire
44
3. PURIFICATION DES LECITHINES •....•...•••.•..•.•.•.••••.•.....•••. 46
4. CARACTERISATIONS SPECTRALES . . • . . . . . . . • . . . . • • • . . . • . . • • . • . • . . . . . . . 47
4.1
Spectrom~trie de masse
47
4.2
R~sonance magn~tique nucl'aire du proton •••.•••.•••.••..•. 50
CONCLUSION • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • . • • • 50
PARTIE EXPERIMENTALE
52
RE~ERENCES..••••.•..•..•••.•..•••.•.•.•••••••••••••.••••.•.•.•.... . 72

---

CHAPITRE III
PHYSICOCHIMIE ET PHOTOCHIMIE DES
PHOSPHOLIPIDES PHOTOSENSIBLES
INTRODUCTION • • • • • • . • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • . • • • • • • • • • • • . • • • • • • • 79
1. TECHNIQUES DE PREPARATION ET DE CARACTERISATION
DES BICOUCHES LIPIDIQUES ••••••••••••••••••••••••••••••••••••.••• 81
1.1
Pr4§paration
81
1.1.1 V~sicu1es mu1ti1ame11aires •••••••••••••••••••••••••••••••• 81
1.1.2 V~sicu1es uni1ame11aires ••••••••••••••••••••.••••••.•••••• 81
1.2
Purification
84
1.2.1 La filtration sur po1ycarbonate ••••••••••••••••.•••••••••• 84
1.2.2 La filtration sur gel
84
1.3
Caract4§risation
85
1.3.1 La microscopie ~lectronique••••••••••••••••••••••••••••••• 85
1.3.2 La microca1orim~trie diff~rentie11e••••••••••••••••••••••• 86
a) Transition de phase d'une bicouche 1ipidique ••••••••••• 86
b) Principe de la microca1orim~trie diff~rentie11e•••••••• 86
c) Facteurs de variation des paramètres de la
transition de phase . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
1.3.3 Etude des spectres U.V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . 89
2. PHOSPHOLIPIDE MIXTE DE LONGUEUR D'UNE MONOCOUCHE : RESULTATS •••• 91
3. PHOSPHOLIPIDE TRANSMEMBRANAIRE •••••••••••••••••••••••••••••••••• 93
3.1
Etude physicochimique: pub1ication •••••••••••••••••••••••• 93
3.2
Etude photochimique
106
3.2.1 Conditions exp~rimenta1es•.•••••••••••••••••••••••••••••• 106
3.2.2 R~sultats•••...•••...•.•••.••••••.••••••.••••••.•••••. ... 10a
3.2.3 Conclusion
10a
CONCLUSION GENERALE ••••••••••••••••••••• 110
REFERENCES •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 112

---

l
N T"R 0 DUC T ION
G E N E R A L E
-_._-----~--------------------~--------~-
;:." ..
';.'>'
".
;-~,.
:-
,..
-"
,1
\\,

---

-1-
I.e
IOOdèle
des
membranes
naturelles admis actuellanent est celui de
s~ et NICOLSON (1) : dans
une
bicouche
phospholipide
dl environ
.
0
50 A d 1 ~paisseur, baignent les ccJ11?os~s principaux suivants
• les sWols
· les glycolipides
· les pro~ines.
Figure 1
M:xièle des membranes naturelles.
M:>saïque fluide selon Singer et Nicolson.
Ce
IOOdèle
de
roosaïque
fluide,
repr~sent~ sur la figure l, reste
cependant
hyPOth~tique lorsque
l'on
Si int&esse
à
la
structure
microsoopique
de
la
bicouche
et il est important d' ~tudier Par les
méthodes les
plus
directes
possibles
la
topologie
des
roollkules
incorpor~s dans ces membranes biologiques •.

---

-2-
Beaucoup
de
prcblànes
particuliers
n'ont
pas
trouv~ de r~e
dMinitive jusqu'à ce jour. Nous ne citerons que quelques ex~les :
1.
L' ~tude
des
interactions
entre
les
phospholipides
et
les
prot&es intrinsèques des membranes
pennet
d '~tudi.er
la
structure
et
la
fomation
d 'tme
membrane
détennin~.
Pour
beauooup
de
p~ines actives, l'arrangement tep:>logique de la partie hyàrq>hobe
reste enex>re un vaste danaine à explorer (2,3).
2.
Certaines
membranes
<:x:Ilp)rtent des phospholipides à très longues
chaînes
(C24-<:30)'
par
canparaison
avec
les
chaînes
grasses
de
phospholipides
classiques
(C14-<:20)
(4)
;
beaucoup
d'autres
membranes
lipidiques
sont asynétri~, c'est-à-dire que les lipides
tels
que
les
sulfatides,
les
œrE9:>rbsides
et
sphing~lines,
possèdent
des
chaînes
grasses difflkant d'au IOOins 6 à 10 atanes de
carbones
(5) •
Diff&entes
~tudes irxtiquent
que
ces
IOOlkules
particulières
jouent
tm rôle structural de stabilisation de membrane
(6-8). Diff&entes vari~~s de structures d' interdigitation,
dans
le
cas
de
phospholipides a~iques, ont ~~ pr~ (figure. 2 : A);
~ement,dans le cas de rœlange de phospholipides de
longueurs
diff&entes,
il
y
a
tme
r~tion asynétrique dans la bicouche
lipidique (figure. 2 : B ).
3. Le cholest&ol est camu pour être le
renforçateur
tmiversel
des
membranes
d'eucaryotes
( 9 ) •
Chez
les
procaryotes,
on
trouve des
substituts du cholest&ol tels
les
hc:çanoïdes
ou
les
carot~oïdes
(10) •
Dans
les
membranes
d' ar~ct&ies (classe
particulière
de
microorganismes), on trouve
des
lipides
carplexes
ex>rrespomant
à
des
bis-(diphytanyl
di~ther)
(11)
(figure
3).
La
tq;>ologie
transmembranaire
de
ces
lipides
rigidifie
la
membrane.
Ces
microrganismes
sont
resistants
à
des
ex>ndi.tions
drastiques
de
tatpkature (110°C), de salini~ du milieu
de
culture
ou
d' acidi~
(plU) •
ces
IOOl~es sant ~ s jouer le rôle de stabilisateur
de membranes par
une
tq;>ologie
transmembranaire
dans
la
bicouche
lipidique.

---

o
-3-
o
CH -O-~-R
Il
1
1
R-C-O·C·H
0
1
Il
CH.-O-P-O- X
1
OH
R =
+
X = CH2CH2N (CH3 ) 3 (choline)
CH2CH2ï!lli3 (éthanolamine)
+ phospholipide
court
Ct--)-
------10
c~)---~o
C!--l- -------,0
o
0
A
B
Figure 2
,~~.,>
\\
/-->~:)
, '
\\
'
\\
"-
HO
bactériohopanetétrol
ctolestérol
Il
p~ j
H
,.....,-"......---....---...--------'-""--"'./'..--"'./"'--""". / ' .
/ " :
t:'.....H"'V"'-"'"'V"'-"'''''''''''-''''''''.--...................................--.....A.-'''"''-_.A......
36"
glycérol-dialkyl-glycérol tétraether
bactériorubérine
Figure 3
Structure de quatre lipides nenbranaires.

---

-4-
Un
certain
nanbre
de
néthodes
physiques
permettent
d'explorer
l'int&ieur
de
bicouches
lipidiques
et
d '~tudier les interactions
entre les diff&ents constituants d'une membrane cœme
dans
les
cas
ci~s ci-dessus.
ces techniques sont fondœs sur des mesures de :
· RPE (r~ce paramagn~tique ~lectronique)
(12)
• M:D (microcalor:i.Iœtrie diff&entielle (4,5,8,14)
• Infrarouge (8,13,16)
• Raman (7,16)
• Rayons X, (17).
On
devrait
~anent POlNOir utiliser d'autres techniques
; par
exanple, en RMN les
effets
d'anisotropie
provoqœs
par
un
groupe
aranatique ou un groupe chiral.
Une
autre
awroche
possible
de
ces
~tudes consiste en
l'identification
de
la
tq:x>logie
interne
d'un
constituant
membranaire,
par
la
fonnation
par
photochimie
d'une
liaison
covalente
avec
une
lTOlécule-sonde
(18,19). C'est dans ce cadre que
se situe ce travail , canstitu~ de deux parties :
1. La synthèse de sondes photosensibles de type phospholipidique
dont l'une est transmsnbranaire. cette synthèse sera d~ite au
chapitre II.
2. L' ~tude physicochi.mique et photochimique des phospholipides cons-
tituera le chapitre III.
Avant de dtkrire ce travail, nous
pr~senterons dans
le
chapitre
l
les
diff&ents
travaux
portant
sur
l'utilisation
de
sondes
photosensibles
POUr
l' ~tude
d'interactions
entre
constituants
membranaires.
Les
r~sultats peu satisfaisants de ces travaux et
d'autres consida-ations sont
à
l'origine
de
la
conception
de
la
sonde transnanbranaire que nous avons ~tudiœ.
Le
bien
fond~ de ce travail a encore ~~ prouv~ par la parution très
r&:ente d'une publication pr~liminaire rapportant un travail
dont
le
but est similaire au nôtre (20).

---

CHA PIT R E l
SON.O E S
P HOT 0 S E·N S l BLE S
T R ANS M E M B R A N AIR E S

---

-5-
1. UTILISATION DES SONDES PHOroSENSIBLES DANS L' EIUDE
DE MEMBRANES LIPIDIQUES
Il
existe
un
nanbre
impressionnant
de nolécules photosensibles
qui
ont
~t~ utilisœs cœme
sondes
de
milieu
hydrophobe
de
menbranes.
Nous
reportons
sur
la figure 4 quelques exenples de ces
nolécules (21-29). C",
.'
c",-~-c'"
9'"
r'"
o1
-a·p-o
1
o1
CH,- CH- C...
1
1
') !
~'
o,
CII.e-..
.,li
(21)
(22,23)
(24)
o
~II
N,-O--C-NMCM,CM,S-S- glycopeptide
(25)
(26)
(27)
o
1 R, • -(CHI".CH,; R,' -(CH,I,,-O-~.Ç.CF,
H,
V-VIII
R,' -ICH,',.CH,
V R,' -ICH,i,o-O-©
N,
H
V, R, • -(CHII,-C-C-C-CCH,),CH,
H è
VII
Ra' -(CHII.·C=e-CH,-CH-(CH,I.CH,
H H
H,
VII'
R,. -(CH,l,-CH-tCHzl.CH,
N,
(28)
(29)
Figure 4 : Exenples de sondes photosensibles (r~f&ences)

---

-6-
ces IOOlécules doivent être elles~s amphiphiles ou hydrophobes,
de
façon
à
pouvoir
s' instker partiellement ou carplètement dans le
carpartiment hydr~hobe de la bicouche.
Dans
le
cas
de
petites
IOOl~es
(22,23),
la
distribution
pr~tkentielle du r~ctif sera à l'inttkieur de la bicouche.
Dans
le
cas de IOOl~es amphiphiles (ex : 21), la tête polaire sera
retenue à l'exttkieur
de
la
bicouche
et
le
groupe
photosensible
port~ par la partie li~hile s' instkera en profondeur dans la
bicouche lipidique.
De ces exanples, nous
retenons
deux
types
de
travaux
ceux
de
Khorana et ceux de Breslow.
1.1 Travaux de Khorana
Khorana,
depuis
1977,
s'est
inttkes~ notanment
aux
menbranes
naturelles. Ses travaux ont port~ sur les ~tudes d'interactions :
. phospholipide-phospholipide (30),
. phospholipide-st&ol (31),
phospholipide-prot~ine (ex
la glycophorine-A ou le cyto-
chrare-bS) (32,33 ) .
Les
phospholipides
utilis~s dans
ces
~tudes sont
porteurs
de
groupements
diazirine
ou
nitrène
en
position w de la chaîne acyle
elle-même en position 2 du glyctkol. Nous schénatisons
ces
IOOl~es
cœme ceci :
o tête pJlaire
./VV\\ chaîne lipidique
* groupe photosensible
L'utilisation
de
ces
sondes
n'a pas donn~ les r~sultats escœq:>t~s.
En effet, l'analyse des prot~ines obtenues
après
irradiation
IOOntre
que
les
positions
d'attaque
du
groupe photosensible sur le groupe
r~teur sont très diverses (30,32).

---

-7-
1. 2 Travaux de Breslow
Après avoir utilisé des r~ctions photochimiques
pour
fonctiona-
liser
les
stérols
(34 ) ,
BreslcM
s'est
intéressé
à
la
synthèse
d'anphiphiles
à
têtes
polaires
-eoo- ou iN(Me) 3 et porteurs de
groupes photosensibles (benzophénone)
(28).
Ces
roc>lécules
lui
ont
penni.s
d'étudier
le
désordre
dans
des
vésicules
ou
dans
des
bicouches
multilamellaires
fonnées
de
didcrlécylphosphate.
Nous
•
représentons ces amphiphiles par les schémas suivants :
Après
préparation
de vésicules, irradiation et dégradation chimique,
les prcrluits
sont
analysés
en
SM
pour
détenniner
les
sites
de
r~ction sur la chaîne.
les
résultats
obtenus
sont
représentés
sur
la
figure
5
ils
indiquent
une
nette
différence entre des vésicules multilamellaires
(plus ordonnées)
et. les
vésicules
unilamellaires.
Néanrooins mâne
dans
ce
cas,
nous
observons
que
la
distribution
des positions
d'attaque est large.
30
20
........... '0. ..
10
... "0- .. - -<l.. ......'1:(
Fiqure 5
Exemple de distribution 'jes [X)sitions fooctionalisées
( 0) vésicules nultilaxœllaires
( 0) vésicules unilamellaires

---

-8-
1.3 Choix de notre sœde
Dans
ces
deux exerp1es, la chaine qui porte le groupement photcr
sensible est très flexible; ceci doit conduire à des
positions
d' at-
taque peu spécifiques (Figure 6) d'où les r~sultats peu concluants.
,
h
Figure 6
L'utilisation
d'une
sorxie
portant
\\.ID
groupe photosensible sur une
chaîne
transnembrariaire,
de
façon
à
maintenir
le
groupement
rat:POrteur
au
voisinage
du centre de la bicouche, pouvait canpenser
cet effet de d~rdre. Une
telle
mo1ku1e
devrait
être
de
nature
phospholipidique,
de
façon
à aworter
le
moins
de
perturbation
possible à le membrane (figure. 7).
A
B
Figure 7
c
ceci
est
r~sab1e avec un grOl.lpE'ltelt rapporteur photosensible (cas
dkrit dans ce ménoire), ou des radicaux
libres
stables.
Une
telle
sorxie
peut
être
s~trique A ou di~trique !! avec des têtes
polaires
identiques
ou
diff&entes
f,
pour
explorer
diff&entes
profondeurs de la bicouche.
Delimo et coll. viennent
de
publier
la
synthèse
d' \\.ID
rocdè1e
de
1OO1kul.e
transnanbranaire
de
type
phospho1ipidique
(20).
Dans ce
travail tout à fait cc:up1énentaire du nôtre,
la
mo1ku1e
syn~tisœ
possède des têtes polaires phosphatidy1étbano1amine.
HN+
0-
~ o 0- +NH
l"...o-r=o
3
(° 0
00-, o=P-a...) 3
~~s6S~c1"-6
1 ....
~

---

-9-
Une question fondamentale se
pose
éviderment
des
amphiphiles
à
deux
têtes
polaires
peuvent-ils
s' incoIp:>rer
dans
une
bicouche
lipidique ? U!S observations suivantes nous ont apporté
des
éléments
de réponses positifs.
2. EXEMPLES D' AMPHIPHILES A DElJX Tm:'ES POIAIRES
Des
amphiphiles
porteurs
de
deux
têtes polaires aux extramtés
d'une chaîne grasse existent dans des
membranes
biologiques
ou
ont
été synthétisés pour des raisons diverses.
2.1 Produita naturels
U!S
études
sur
les
œroténoïdes
a, w -dihydroxylés développées
dans notre laboratoire ont IOOntré que ces IOOlécules
s' incoIp:>rent
de
façon
transmembranaire
dans une bicouche lipidique, et que leur taux
d'incoIp:>ration est optimum quand leur longueur est
proche
de
celle
de la bicouche (35) (figure 8).
dIH,HJ
1
1 1_'
..::.d.:.;:(O::..:,O:..:..J
_
1 1
'H
1 1
H,O
Dêcaprênozêaxanthine
~-O~ ~O-CH
' ~ ~ 1 2
~
o.
C.H-O l l O - C H
0
1
\\1
l')
ICHj,NI~-O-P-o-CH2 1
d(CeO,CeO)
1
CH-O-P-O-(CI-ÜNlcH'
1
1_
.. ------.--...::..-.-....:...------J.I
2
1
. 7'2
3'3
oe
00
Bicouche de DPPC
Figure 8
Struture de la décaprenozéaxanthine et de la bicouche de
DPPC(avec 2 coudes gtg par chaîne)
Par
ailleurs,
De
Rosa
et
coll.
ont
isolé des manbranes d' arché-
bactéries des lipides transmernbranaires oamplexes (11) (figure 3).
U!S différents études de
leurs
propriétés
therrootropiques
IOOntrent
qu'ils
sont
miscibles ~vec du DPPC dans une bicouche lipidique, avec
une topologie transmembranaire (36,37).

---

-10-
2. 2 Produits syntMtiques
2.2.1 Exemples de Kunitake (38,39)
Pour étudier la relation entre la structure
d'un
amPhiphile
à
deux
têtes
polaires
et
la
IOOrphologie
de l'agrégation qu 1 il fonne lors
d'une dispersion dans l'eau, Kunitake a été le premier
à
synthétiser
et
à
utiliser
des
amphiphiles
à
têtes
polaires
anmonium
quaternaires. Ces IOOlécules fonnent des liposanes
lorsque
la
chaîne
entre
les
deux
têtes
polaires
possède
une
longueur
appropriée.
Celles
qui
possèdent
des
segments
rigides
au milieu de la chaîne
transmenbranaire carme ~ sont capables
de
s' asse:nbler
en
bicouches
lamellaires
et
l' addition
de
cholestérol
pennet
de
préparer des
vésicules.
CH:3
-
CHJ
C~~~CH=NO~
-JI'==./
_
0-1CH2+:-00~
la
-
N:C~~:CHJ
~I
Br CH)
1
CHJ
er-
2.2.2 Exemples de Ringsdorf (40)
Ringsdorf
a
synthétisé
une
variété
d' amphiphiles
synétriques
polymérisables, carme :
(CO,[CH,l,-C=C-C=C-[CHll,O'C
HO,CC HIS-i::
1
CO,[CH,),-C=C-C=C-[CHI),O,C
SOH,COIH
3
x
-CH:C0
iCO,[CHll,-C=C-C=C-[CH,l,OICl
2H
-[CH:l,CO,H
-[CH:l,SOl~a
x-s
CO,H
~
HO,e
s-x
-[CH:J:NH2
L'analyse
en
microscopie
électronique
(cryodécapage)
de liposanes
mixtes
fonœs
de
I:MPC
et
de
bisamphiphiles
l
ou
4
avec
un
pourcentage
IOOlaire
1/1
IOOntre
des
surfaces
haoogènes,
sans les
structures ondulées observées dans le
cas
de
séparation
de
phase.
Ces
liposanes
sont plus rigides que les membranes de lipides nonnaux
[lo1PC ou DPPC (d'après les analyses de fluorescence).

---

-11-
2.2.3 Exemples de Fuhrhop (41,42)
les
molécules
à deux
têtes
polaires
sont ~~s bolanq;>hiphiles
(bola : nan de missile
sud-arcériçain).
En
dispersion
aqueuse,
les
l'OOlécules
~ fonnent
des
rronocouches
lipidiques
:
MIM (monolayer
lipid membranes).
2
a
R' = R = SOi Na"
2
b
R' = R = S-CH2-COO' Na"
2
0
0
C
Rl. = R = S-CH2-CH20H
R'-(~
~)-R'
2
d
R'
R
= S-CHOH- CH 20H
e
RI
2
R
= S-CH2-CH2 - NHjCI'
R'
R2 :
S-CH-COO' Na-
0
0
1
CH2-COO' No-
S
De tous ces exE!li>les, nous retenons que des amphiphiles à
deux
têtes
polaires
peuvent
fonner des liposanes ou des v~icu1es, à l' ~tat pur
ou en xœI.ange avec un autre lipide.
I l nous faut bien entendu le ~ifier dans
tout
cas
nouveau,
carme
dans
celui
de
la
sorXl.e
photosensible
transmanbranaire
dont nous
allons dkrire les principales cara~stiques.
3. a:u::EPTION DE rA SONDE PHO'roSENSIBLE TRANSMEMBRANAIR
ra conception de notre molécule n~ssitait certains choix. En
effet,
la
sorXl.e
à
syntMtiser doit être la plus proche possible de
lipides
naturels
et
possé::ier
un
groupement
photosensible
suffisanment rœctif.
3.1 Choix des têtes polaires
les
phospholipides
de
loin
les
plus
répandus
et
les
plus
abondants entrant dans la canpositien des membranes
biologiques
sont
les
1,2-diacyl-phosphatidylcholine
ou
phosphatidylétbanolamine.
Durant les
préparations
de
bicouches
lipidiques
ou
les
analyses
physicochimiques,
un
facteur
i.rrp:>rtant est celui de la t~ature.
L' ~tat
le
plus
inMressant
de
la
bicouche
est
1 '~tat
"cristal
liquide" dans lequel les chaînes
hydrocarbon~s sont
flexibles.
Ce
pl'élanène
sera
plus
d~taill~ au chapitre III. Signalons seulanent
ici qu'au dessus d'une certaine
tarphature
dite
'Iln,
une
bicouche
lipidique passe de 1 '~tat gel à 1 '~tat "cristal liquide".

---

-12-
les
phosphatidyléthanolamines
posséJent des 'lln assez élevées, ce qui
ne
facilite
pas
leurs
études
physicochimiques.
Dans
notre
liù:x:>ratoire,
des
variétés
de
phospholipides ont été étudiées; ils
possèdent
tous
des
têtes
polaires
phosphatidylcholine
(PC)
exeq>les
I1-1PC
(chaîne
lipidique
en
C14),
DPPC
(C16 ). Nous avons
choisi de synthétiser une sonde posséJant deux têtes polaires
PC,
de
façon
à
canparer ses propriétés physicochilniques à celles du I1-1PC ou
du DPPC.
3.2 Choix de la chaîne lipidique en sn-l
La température de transition de phase d'une bicouche de
I1-1PC
est
de
24°C.
cette
tEqlérature est facilement accessible expérimentalement.
Par contre, le DPPC a un 'lln de 43°C, ce
qui
cœ;>lique
les
mesures.
Une
chaîne
myristoyle
en Cl4 canne celle du IX-1PC a donc été choisie
ccmne acyle du résidu glycérol de la sonde, en position sn-l.
3.3 Configuration en C-2 du glycérol
le carbone
secondaire
du
glycérol
des
phospholipides
est
un
carbone
asymétrique,
la
nanenclature
adoptée
pour
décrire
ces
roolécules est assez SPéciale et nécessite une présentation.
3.3.1 Nomenclature (43,44)
La
majorité
des
études
de
glycérophospholipides
utilisent
deux
nanenclatures
principales
pour
désigner l'asymétrie du carbone 2 du
glycérol. les produits naturels sont des énantianères R.
• La numérotation de SUndaralingam
Dans une projection de Fischer, le carbone porteur de la tête
polaire est le carbone 1; il se place en haut de la chaîne
verticale. L'hydroxyle en 2 du glycérol se situe ainsi à droite
(série D).
• La convention sn (stereospecifically numbered)
Dans ce cas, la carbone 1 est celui qui se situe en haut de la
projection de Fischer avec l' hydroxyle en 2 du glycérol tourné vers
la gauche ( série L).
On note souvent des appellations ex, 13 ou 'Y pour
désigner
la
position
de la tête polaire sur le glycérol: ®

---

-13-
Pour
rester
dans
le
danaine
des prcduits naturels, les lkithines
que nous voulons synthétiser garderont la configuration R.
La
figure
9 montre
les
différentes
représentations
et
appellations de tels
énantianères.
Exemple I:MPC =
(el
• 2-R,3-dimyristoylglycéro-
l-phosphatidylcholine(c)
.2,3-dimyristoyl-JJ-glycéro-
l-phosphatidylcholine(b)
.1,2-dimyristoyl-sn-çlycéro-
3-phosphatidylcholine(a)
R
• dimyristoyl-L-a.-
®= tête polaire
glycércphosphatidylcholine (a)
Figure 9 : Stéréochimie de l'atane de
carbone C(2) de glycércphospholipides
3.4 Oloix du groupement photosensible
Le groupe rapporteur doit être photosensible, mais aussi
être
un
chranophore
pennettant
de
vérifier l'incorporation de la sonde dans
une bicouche lipidique. Trois principaux
groupes,
inertes
chimique-
ment
et
sensibles
à
la
lumière U. V, ont été utilisés pour étudier
les micelles ou les bicouches lipidiques
· les azides ~C-N3 (21,29)
• les diazirines ;C::~
(25,27,29)
• Les carbonyles;C=O (28).
ces fonctions sont utilisées généralement
sous
fonne
conjugée
avec
un
noyau
aranatique
pour
les rendre plus réactifs (langueur dl onde
plus élevée).
LI irradiation
des
azides
À
=
300
nm)
prcduit
des
nitrènes
capables
de
créer
des insertions dans les liaisons C-H ou o-H ; des
additions sur les liaisons C=C peuvent avoir lieu
mais
les
prcduits
sont peu stables.

---

-14-
les
nitrènes
intenné:üaires
possèdent
une grande longMt~ et sont
peu réactifs
(19,24).
De
plus
ils
peuvent
~anent fonner des
produits de réarrangement dans le cas d'alkyl-nitrènes .
RCH2N
- - - - - - )
RCH=NH
les
diazirines
produisent
des
carbènes
par
excitation
à
des
longueurs d' orxies supérieurs à 340 nm, ce
qui
est
int&essant
pour
~tudier
les
systànes
biologiques
sans
causer
de
dcmna.ge
photochimique aux prot~es ou
aux
acides
nucl~iques (exanples de
Khorana) .
le
d~savantage
des
diazirines
est
qu'elles
peuvent
s'autoisanériser
en
d&iv~s diazo.
Ces
derniers
canposés
sont
g~&alement de puissants
~lectrophiles capables de produire des
réactions secondaires (19).
Cependant
les
carbènes
sont
plus
réactifs
que
les
nitrènes
et
dorment des produits d'insertion dans les liaisons C-H ou C=C
et
ces
produits sont stables (19,45).
~ _,(IR
N
h LJ
RzC(11 -
RzC
N
~Rc/'CI'
,
z ,
C
, ,
Depuis
une
vingtaine
d ' ann~s,
les
œtones
aranatigues
sont
utilis~s carme sorne
(46).
Ces
mol~es,
à
l '~tat
excit~,
attaquent
prM&entiellanent
les
hydrogènes
tertiaires;
les
abstractions
d' hydrogène
de
xœthylènes
peuvent
être
cependant
d:>tenues
aussi
avec
de
bons
rerxlanents
(47) .
le tœcani.sme de la
photochimie
de
œtones
est
dorm~
ici
sur
l' exanple
de
la
benzoph~one (figure 10,11).
* O~-o _h_V__
---T2 (rr , lf )
RH
O C?"D
c
_ . - -
l
- - - - - - " -
So
radical cétyl
Figure 10: diagramne d'état
Figure Il: mécanisme de
photorMuction

---

-15-
le
spectre
~lectronique d'absorption de la benzophalone présente
deux bandes correspoOOant aux transitions suivantes :
(n J n: *) de longueur d'onde ~levée (vers 340 nm);
(lt 1 Jt *) de faible longueur d'onde (vers 250 rm).
Quand on irradie la
benzophénone
à
une
longueur
d'onde
d'environ
340
nm,
la
roolécule
est
excitée d'abord à l'état singulet (ln, 1'(*)
cet état singulet subit
rapidement
( t < 10-10
s)
une
conversion
interne
en
un
état
triplet
(3n , ft *) plus· stable que le premier
Ct. ~ 10-5 s) (figure 10).
A l' ~tat triplet l'atane d'oxygène devient déficient en
électrons
et
œagit
en
captant
un
hydrogène
de
son ennvironnement.Il se fonne
deux radicaux qui s'apparient.
les avantages de ces œtones aranatiques sont les suivants :
· elles sont stables chimiquement et inertes en photochimie vis-à-
vis de l'eau, ce qui ~vite des pertes par hydrolyse ou par dégra-
dation (48);
· la longueur d'onde d'irradiation (300 nm) est facilement accessible;
· les produits issus de l' irradition sont stables chimiquement POur
pennettre leur extraction et caractérisation sans artefacts.
Pour ces diverses raisons, nous avons choisi
dans
un
premier
tarps
un
groupe
photosensible benzophalone, d'autant que la synthèse de la
sœde corresporrlante est plus sirrple. Ce groupe
sera
porté
par
une
chaîne
transmanbranaire
liant
les
carbones C-2 du glyc&ol par des
liaisons ester.
3.5 Irrp>rtance de la liaison entre le groupe photosensible et la
chaîne lipidique qui le porte
Ccmne dans les cas d~jà cités, où
l'utilisation
de
sondes
dans
les
études
d'interactions est suivie de dégradation et d'analyse des
produits, la liaison
entre
le
groupe
photosensible
et
la
chaîne
lipidique
qui
le
porte
joue un rôle irrportant, canne d~rit sur le
schlma qui suit.
La fonction X doit résister aux étapes de
préparation
de
vésicules,
de
photochimie
et d'extraction. A ce niveau l'analyse des produits ~
par les techniques
usuelles (
SM,
RMN
)
est
plus
facile
si
une
dégradation en rool~e de taille plus faible 12 est possible.
La
nature
de
la fonction X choisie sera définie dans le chapitre II
décrivant les synthèses de phospholipides photosensibles.

---

-16-
+
~
0
Me)N
,
0
O·
N+Me
l..-o-r:O (~O ~
~ rJ~ o:P-a...) 3
&.r
1I~ f)'X
a ----0
~
A
0
Sonde photosensible t~ansmembranaire
incorporation dans
une bicouche lipidique
Vésicules
1)
hv
2)
extraction
o
Me)co-r:o(O~o' ~
X~ rJ~' O'~~J'Me,
&.ra
W'"
li
a -'-0
1....
~ 1
B
R œ
tdégradation chimique
HaY ~.'0 ·(Y.~ yJOH
C
~
~ dégradation chimique
.
lI'WX
1"
1
....
~
R œ
D
Schéma des différentes étapes de l'étude photochimique

---

-17-
COlOllSION
Les IOOI~es-sondes que
nous
nous
prqlOSOl1s
de
syn~
tiser
pour
~tudier leurs
carp:>rtanents
physicochimiques et photo-
chimiques doivent répon3re aux caraet&istiques suivantes :
• les têtes polaires sont des groupes phosphor~s
(en
fait,
ici
des
phosphatidylcholines);
•
la
configuration
en
C-2
de
leur
r~sidu glyœrol est celle des
phospholipides naturels;
• les lkithines sont mixtes : la
chaîne
lipidique
RI
en
position
sn-l
du
glycérol
est
1.m
acyle
(en
fait
ici 1.m myristoyle); la
chaîne R2
en
position
511-2
carp:>rte
un
groupement
photosensible
(aœtcph~one
ou
benzcp~ne)• Dans le· cas d'un phospholipide
classique A : RI et R2 doivent être de longueur
L voisine;
dans
le
cas d'un phospholipide transmembranaire B: 2 L (RI) = L (R2)
2L
a
Il
•
le
chou
de
la
liaison
X devra
pennettre
de
silnplifier
la
caraet&isation des produits de la photochimie ;
enfin,
si
possible,
la
méthode
syn~tique utili~ devrait
pennettre
de
préparer
des
phospholipides
tr~ranaires
disynétriques,
portant
le
groupe
photosensible
à
diverses
profondeurs, et des têtes polaires diff&entes de part et d'autre.

---

-18-
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Thermotropic properties of bipo1ar 1ipids of Su1fo1obus
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Formation of stable mono layer membranes and re1ated structures
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---

CHA PIT R E l l
--------------------
s ~ N THE S E "0 E P H 0 S p' H 0 L l PlO E S
P H O'T 0 SEN S l BLE S

---

-24-
Introductiœ
La voie classique de
pr4>aration
des
phospholipides
est
celle
de
l' hénisynthèse •
Diverses
lkithines
ont
~t~ obtenues Par acylation
de glyc&q>hosphatidylcholine(GPC) A, ou de la
L- a -lysolkithine(LL)
,!!, (prcrluits carmerciaux) •
·rOH
r~C-R
ACOOH
CHOIt
~C-R
1
~
+
1
0
+
~o-P~CH,H(~)5
CH,~~CH,H(~~
,
A
/,..
0-
type 1
R'COOH
•
Schéna. l : Stra~ie d' hlmisynthèse des lkithines.
cœme il a ~ irxii.qu~ en canclusiœ du chapitre pr~ent, les
IOOlkules que nous avons entrepris de syn~tiser sœt
du
type
II:
mixte.
Il
nous
fallait
syn~tiser, tout d'abord, les acides gras
RCCX>H
photosensibles,
qui
seront
utili~s pour
acyler
la
L-u-
lysanyristoylglyŒrcphosphatidylcholine
(IM:2PC) ,
canne
dkrit
dans
le schéna II.
•
•
Sonde luosmembuoaire
F
schlma
II
StratéJie d' hlmisynthèse des lkithines photosensibles.

---

-25-
1. SYNI'HE'SE DES ACIDES GRAS PHO'roSENSIBLES
Dans le cas des acides gras f et Q (schéna II),
la
fonction
de
liaison
X
entre les noyaux aranatiques et les chaînes lipidiques
doit être
facilanent
hydrolysable.
Notre
attention
s'est
d'abord
portée
sur
une
liaison
ester
X = -ccx:>-. La photolyse suivie de la
saponification du produit conduirait, carme
nous
l'avons
montré
au
paragraphe
3.5
du
chapitre
l
,à un ~s~ de type G ou li (schéna
III
)
.Ies
~sés Q et g,
seront
relativement
faciles
à
caractériser .
1.1 Synthèse des esters phéloliques
Pour
ootenir
le
monœ.cide
f avec X = -CCX:>-, deux voies de
synthèse ont été envisagées (schénas IV et IV' ) .
1.1.1 Synthèse à partir de l'acide azélaïque (schéna IV)
Il s'agit du monocouplage d'un
diacide
avec
la
p-hydroxy-
acétophénone
(1).
L'acide
azélaïque
1
est
transfo~ en clùorure
d'acide 2 par traitanent au chlorure d' oxalyle (2):
en
présence
de
p-hydroxyacétophélone
3
et
de
pyridine
, l e clùorure 2 cooouit au
-
-
nélange de mono- et de diesters- i et ~.'
dont
la
purification
est
rerx1ue difficile pour les raisons suivantes :
· les Rf des produits l, i, 1, sont trop proches
pour qu'une
chranatographie
sur
colonne. de silice
soit
efficace:
· une séparation en parties neutres
1 et acide i + l a échoué:
les produits sont hydrolysés par
les bases utilisées, K2C03
et NaHC03. On récupère donc les produits de départ 1. et l :
· la précipitation de l'acide carboxylique i sous fonne de sel
d'amoonium
quaternaire dorme
des produits
d' hydrolyse en
présence de triéthylamine ou benzylamine.
Par
contre
le
diester
5
a
pu
être
isolé par cristallisation du
nélange réactiormel en
milieu
neutre.
Mais
ce
produit
n'est
pas
utilisable pour notre synthèse.

---

-26-
1) photolyse
OH
E
•
-
OO-o-i-CH,
2) saponification
G
OH
1) photolyse
F
•
-
HOO~OOH
2)saponlflcatton
R
H
-
Schlma III
•
CH3C0-o-0H
pyrldlnelTHf
CH3C0-o-0ZC(CHZhCOZH
+
4
Schlma IV

---

-27-
1.1.2 Synthèse à partir du monoester rréthylique de l'acide
az~laïque( sch~ IV')
Une
autre
voie
d'obtention de l'acide i serait la coupure
~lective d'un ester mixte.
Me02C(CH2hC02H
6
7
pyrldlne/THF
H02C(CH2)C020COCH3
~---------------
.Me02(CH2hC02-0-COCH3
8
4
e3 511 ou f1e3 51Brl
·Hal
Sch~ IV'
J + 4 + 6
- - -
Le IOOnoester rréthylique de 1 'acide az~laïque 6
(ccmnercial)
est
transfonœ
en
chlorure d'acide 7, puis trai~ Par la p-hydroxy-
acét(l)hSlone 1. On isole ainsi le diester mixte ~ d'après
le
sch~
synth~tique
IV.
L' ~tape
suivante
consiste
à
hydrolyser
l'ester
xœthylique dans des
conditions
non-basiques;
(nous
avons
démontr~
dans
le
paragraphe
prtkédent l' hydrolyse facile de la liaison ester
aranatique Par un milieu basique) . Une hydrolyse
très
douce
d'esters
xœthyliques
peut
être
obtenue
Par
traitement
à
l'iodure
de
tri.lréthylsilyle (Me3SiI) (3,4). Le mécanisne est d~rit ccmne suit
0
0 -
Si"J
0
11
11
/
•
.
1"1
l -
C -
0 -
l' • MeJSil --~.... l -
cr'.
"l -
C -
0 -
S,MeJ •
t; 0' (,B
!HP
oIl
l - C - O H
Les auteurs ont IOOntr~ une
~lectivit~ de
la
réaction;
cela
nous
pennettait
d'espérer
hydrolyser l'ester xœthylique sans dcmnage pour
l'ester aranatique.

---

-28-
Nous
avons
r~isé
deux
essais,
l'un
en
utilisant
directement
l' ic:rlure
de
'!MS
dans le milieu réactiormel, et l'autre
en introduisant un mélange Me3SiBr
+ NaI
qui
prcx1uit
in
situ
le
Me3SiI
de
manière
progressive.
Dans
aucun
des cas il n' y a eu de
sélectivité. les deux liaisons esters Sont hydroly~s avec
la
même
facilité.
cette
hydrolyse
anarchique
pourrait
être due à HI, lui
mÊme libéré par
une
~entuelle action de l' humidité
(malgré
les
précautions prises ) sur Me3SiI.
cette
voie
nous r~èle que la liaison ester aranatique est également
très sensible à un milieu acide.
Nous faisons ranarquer que, d'après
la
théorie
de
Hanmett
(5-7),
l'hydrolyse
basique
d'un
ester aranatique est facilitée par
la
présence
d'un
substituant
électrœ.ttracteur
en
para,
par
résonance
ou
par
effet inductif. En particulier, avec un substituant
acétyle, nous avons les équilibres suivants :
~ -00
-OH
?:;JJR\\t~)
R- C~
~ 2-CH~ =
R-~:-~--ôC-CH~
OH
1~o
OH
- - - - °OC-CH~
Plus le substituant est électrœ.ttracteur,
plus
la
vitesse
d' hydrolyse
croît
en
milieu
basique.
L' hydrolyse
acide peut être
égalanent aidée par les groupements
électrc:rlormeurs,
même
si
cette
influence
est
faible
et
peu régulière. le canposé l est en fait un
vinylogue d'anhydride, ce qui explique sa facilité d'hydrolyse
o
0
Il
Il
l
R~~-R
Devant cette situation, il était nécessaire
de
modifier
la
structure
des
acides
f et Q destinés à estérifier l'hydroxyle libre
de la
lysolécithine
(schéna
I) .
Nous
avons
décidé
d'assurer
la
liaison X non plus par un ester, mais par un groupe éther X = ~ .

---

-29-
1.2 Synthèse diacide gras à liaism ~ther
1.2.1. Synthèse du roonœcide
Une
m~thcrle
classique
de
pr~paration des
~thers, la
r~ction de Williamson (8,9)
entre
un
alcoolate
et
un
halog~ure
d'alkyle, semble bien adapt~ à notre cbjectif
ROH
__base
....... RO- _--=.R,;..';.;;X:...-_.... ROR'
Le
couplage
de
l'anion aœtcphénoxyle 9 avec le ll-brcm:>UIXlkanœte
de zœthyle Il (acide cœmercial : 10)
pennet
d 'cbtenir
l'ester
12,
dont la saponification fournit l'acide 13.
Le rendanent global par rawort à l est de 68 % (schéna V).
Le
choix
du
branoacide de départ siest port~ sur une chaîne en C-ll
de façon à cbtenir après couplage
avec
la
p-hydroxyaœtcpMnone l,
un
acide
gras
13
dont
la
longueur
soit
proche
de
celle .du
myristoyle en position
1
de
la
lysolkithine
à
acyler,
tout
en
restant
facilanent
accessible.
Les deux chaînes hydroca.rbonœs sont
repr~sent~ ci-dessous.
L
repr~sente
la
longueur
des
chaînes
lipidiques.
f'lr0
o
y0
OH
o
o
OH
<----------------------------------->
L

---

-30-
Br(CHz)1.COzH
10
3
-
l
J
~eOH
NaH /
DMF
96%
HBr gazeux /
CH3COVo- Nd
Br(CHz)1.COzCR]
9
12
86%
KOH /
EtOH aqueux
13
Schéma V
Synthèse du monoacide

---

-31-
1.2.2 Synthèse du diacide
I.e
principe
de
la
synthèse est le mâne que ci-dessus mais
présente une difficulté suppllmentaire
puisqu'il
faut
réaliser
une
di-éthérification
de
la
p, p '-dihydroxyacétophénone 14. Pratiquement
le traitement direct de 14 par 2 éq.
de
NaH
suivies
de
2
éq.
de
l' halogénure
15
ne
pennet pas d'obtenir directement le diéther avec
un 'rendement acceptable: par contre, le IOOnoéther 16 a
été
isolé
et
caractérisé.
Pour
améliorer
le
rendement
en diéther 17, nous avons dO.
modifier
les conditions expérimentales en intervenant à plusieurs niveaux:
1. Ranplacement du branure d'alcoyle Il par l'iodure 15 plus
réactif. cette substitution est réalisée en
traitant
le
branoester Il par NaI dans l'acétone à reflux.
2. Utilisation des sels
d' amooniums quaternaires des anions
phénoxyles (10, Il): ceux-ci sont
plus solubles
dans
les
solvants
organiques
canne le DMF : on augmente ainsi la
vitesse d' alcoylation.
3. Mise
en oeuvre de la réaction en deux étapes successives
sans isolement intennédiaire :
a) fonnation
d'un
IOOnoanion
par traitement de la
4,4 '-
dihydroxybenzophénone 14 avec
un équivalent de
NaH:
la substitution in situ en sel d' anrooniun Dl et
le traitement par l ' équivalent d'iodure
15 produisent
le monoéther 16.
b) Répétition de la séquence ci-dessus, ce qui conduit au
diéther-diester 17.
la saponification du diester en
diacide
18
s'effectue
suivant
les
voies
classiques:
nous
avons
amélioré la solubilisation du diacide
par addition de THF à la
potasse
éthanolique.
Dans
les
conditions
décrites
sur
le
schéna
synthétique
VI,
nous
avons pu obtenir le
diacide, mais non sans difficultés: ces
difficultés
étaient
dues
à
l' insolubilité
des
produits,
tant
pour
les réactions que pour les
cristallisations de 17 et de 18 en particulier.
I.e
rendement
glci::lal
-
-
est de 66 % par rapport à 14 •

---

-32-
a
L4
l 1éq. NaH
cat,lN(nBu)4' DMf
- +
[
" 0 NcnBUIJ
:"-.1
a
Hill acttoae
BrCCH2)18C02CH3
l 1éq.l(CHz)I,COzCH3 .........--------
92°/0
11
i l
[~O(CH2)"C02Me]
~ 1
1éq. NaH
Cil t .IH(nBu)4' 0 M F
+ -
(nBu)4 N o~
~O(CHz)10 coz Me
~
a
Me02 C(CHz),o O~O(CHZ),o CCz Me
....
1
1 /.
:"-.
11
a
KOH / EtOH aqueux
920'°1
0û0Jr0
HOz C(CH2),0
(CH)
co H
1 ....
.".
2 10
Z
"'"
~I
II 0
Schéma VI
Synthèse du diacide

---

-33-
ra poursuite du travail nécessite des quantités irrportantes
des acides 13 et 18. Une préparation des esters
12
et
17
sur
une
échelle
plus
grarrle
(10
fois
plus
de
prcx1uit)
a été effetuée à
11 I.e.S.N. à Gif-sur-Yvette, avec quelques modifications mineures.
1.2.3 caractérisation spectrale
Sur la base des données de RMN, de SM, dl IR, et
de
la
microanalyse,
nous
avons
pu
confinner
la structure et la pureté des acides 13 et
18.
En IR, on note la présence des
bandes
dl absorption
C=O
des
acides
(1700
ale1) ,
ou
aranatiques (1680 pour le monoacide 13 et 1640 pour
le diacide 18).
la RMN a été réalisée pour le monoacide
13
dans
a::x:;13'
tandis
que
celle
du
diacide
a été réalisée dans la pyridine.Dans les deux cas,
on vérifie la présence vers 7 ppn de signaux qui sont dus
au
système
aranatique A2B2.
o
Il
-c
0 -
les
déplacements
chimiques
des
signaux
attribués
aux
hydrogènes
acides
<XX:>H
varient
suivant les cas et disparaissent par traitanent
du produit au méthanol deutérié.
la spectraœtrie de masse fournit les bons pics moléculaires
- 13 : masse moléculaire observée
320
- 18 : masse moléculaire observée
582

---

2. ACYLATION DFS DERIVES DE GLYCEROPIDSPHATIDYICHOLINE
Introducticn
Disposant
d'acide
gras
photosensibles,
1 ' ~tape
suivante
d'estérification
de
la
lysol~ithine est la plus inp::lrtante. De
nanbreuses méthcdes ont ~t~ utili~ pour acyler la L-cl..-glyœro-
phosphatidylcholine
~ ou les lysol~ithines!!.
Leur
~volution
r~t aux soucis de :
- rWiser des réactions de plus en plus rapides,
- réaliser des corxli.tions expérimentales douces afin d '~viter la
fonnation de prcduits sec:x:>rXiai.res,
- utiliser le lOOinS possible d'agent d' acylation K.
De façon ~érale les synthèses cœp:>rtent quatre ~tapes essentielles
GlyœropbolpbltldylcboliDe
A
ou IYlolécilbiDe !
éta,. 2)
protectloe
éta,. 1)
ull.atloe
(R'QH)(CdCl )
l
l... A' B'
etl,. 3)
RCOX
IctivatioD
K
eta,. 4) coadeDlatioe
SChéma VII
Strat~ie d'estérification de la glyœrq:>hosphatidyl-
choline et de la lysol~ithine
2.1 ~ bibliographiques
2.1.1 Activation de l'acide
Il
s'agit
de la fonnation d'un intennédiaire portant un bon
nucl~fuge X:
RCCX>H -----~. RCOX
J
K

---

-35-
Diffa-ents da-iv~ diacides ont ~t~ utili~s
a) Les chlorures diacides X = Cl, obtenus en traitant 11 acide par du
. (COCl)2 (2) ou du SOC12. Le da-iv~,sensible à llhumidit~, est uti-
lis~ après évaporation du solvarit r~ctionnel, sans autre
purification
RCOOH
• Ra:Cl
b) les anhydrides
X::::(XX)R, obtenus par
la zœthode
classique
(12,13)) : traitanent de 11 acide par le N, N1-dicyclohexyl-
carbodiimide (DCC). ces da-iv~s, relativanent stables, peuvent
être isol~s par filtration et cristallisation dans llaœtone.
2 RCOOH
.,
R-c-O-C-R
H ~
c) les imidazolides X = imidazole : la dissolution de 11 acide et du
N,N-carbonyldiimidazole (CDI) dans \\ID solvant aprotique fonne
SPQntananent 11 acylimidazole avec un dé3aganent de CC>2 (14,15).
ce da-iv~ diacide est
plus r~ctif que 11 anhydride, sensible à
11 humidit~ et doit être utili~ sans isolanent.
RCOOH
2.1.2 Protection de la tête polaire
Les pranières synthèses
de
l~ithines ont ~t~ effectuœs
sans protection des têtes polaires (21,22,26-28). Le proœd~ avait
11 inconv~ient
de
conduire
à
la
fonnation de produits secondaires
difficiles à séParer pour la suite. Eh Particulier,
la
tête
polaire
phosphatidylcholine
subit
des
r~ctions secondaires et un certain
nanbre de produits ont ~~ caracta-i~s (20,23,45,46) :
- Migration de phosphate et fonnation de 1,3-diacyl GPC.
- Fonnation de 2,3-çlyœrophosphate cyclique: propri~t~
courante chez les esters de
phosphates
posséJant un hydroxyle
adjacent au groupement phosphoryle, en pr~sence de base (31).
- Fonnation diacide phosphatidique due à la perte de la choline.
- Dénéthylation de la choline en pr~sence de pyridine.
Une protection
adé::luate
du
groupanent
phosphatidylcholine
pennet
dl arOOliorer
le
rendanent en l~ithine. ra zœthode couranment
utilisœ consiste à fonner un CXJ1'Plexe ionique
avec
le
chlorure
de
cadmium (32,33).

---

-36-
Agent Acylar.1:
K
Catalyseur
~onditions ~péra~~ires
l''endemer.t
t
RéféI"ence
Alcool
(nombre d'équivale~ts) par OH
(GPC'x (CdC1
/ OOC / 3e ;;n
51
16-17 q
2)y
(a)
RCOCl
(5)
Pyridine
œC1 3
CHC1
/ OOC /
3
1 h
50 - 60
18
20°C / 3 h
(GPC) x (CdC1
/ 20°C / 72h
90
19-20
2)y
CRCO) 20
(3)
œC1 3
RCOO NEt~
(3)
GPC
(RCO)2 0
<l)
sans solvant / 98°C / ~8 h
81
RCOONa
(2)
GPC
(RCO)20
(2)
sans solvant / 6: oC / 2 jours
21
RCOONa
<l)
LL
(RCO)20
(la)
sans solvant / 5JoC / 2~ h
21
RCOCNa
(~)
LL
RCOOS02(C6H~)CP.3
(3)
œ C1
/ 25°C / 2 h
~8
22
2
2
(GPC)/CdC1Z)Y
(RCO)20 (l.,Z - 1,5)
r:t1AP : éq / OH
œC1
/ 25°C / 3:-~C h
75 - 30
23-2~
3
(GPC'x (CdC1 2)y
(RCO)Z
(2)
~-pyrrolid1nOpyri-DMSO-Benzene / ~'J-~2°C / 2-5 h
80
25
dine
1 éq / ŒI
LL
<RCO) 20
(5)
~-,?yro1idincPYTidine œC1
/ 35°C / :,5 - 3,5 h
9~ - ~3
26
3
léq/Œ1
-
im (1)
DM50
2,5 êq /08
solvant/50·C/ 3 jours
14
27
LL
RCO
sans
-
(2)
DM50
2,5 êq /OH
DM50 /
17·C / 4-5 mn
68
28 C)
GPC
RCO im
RCO lm
-
IGPCl
2,5 êq /OH
DM50 J 20·C / 15 mn
72
29 c;J
x (CdC1 2 )y
(2)
DM50
-
(GPCl
l
êq / OH
DM50 / 17·C / la mn
61
30 CI
x (CdC1 2 )y
RCO im (2)
DM50
--
-
- -
Notes
al Suivant les cas, le complexe (GPCl
(CdC1 ,
utilisé est sous la forme
(GPCl
(CdC1 ' ou
x
2 y
2
(GPCl 2 (CdC1 2' 3 •
bl L'utilisation de dérivés chlorés comme aqent acylant peut produire des produits secondaires
soit des Acyles chlorodésoxyglycérophosphatidylcholine isolés par Aneja.
cl Cette réaction marche bien avec des acides gras insaturés. Dans le cas de chaines saturées peu
solubles, le rendement est amélioré par l'utilisation d'un solvant mixte DMSO-THF.
Il ne se produit par de racémisation de l'alcool tertiaire du résidu glycérol sous l'effet de
l'amion dimsyl sodium qui est une base encombrée.
Tableau l
exemples de différentes méthodes de couplage

---

-37-
2.1.3 Activation des hydroxyles du glycérol
Les
alcoolates
de
glyœrq,hosphatidylcholines,
fonnes
nucl~hiles des hydroxyles,
sont
obtenus· soit par. action de bases
azotées
pyridine,
4-pyrrolidino-pyridine,
4-
di.Jtéthylami.n~yridine:~ (16,17 ,23-26}), soit par une base plus
forte cœme l'anion dimsylscxliun:J:1vfSO- (28-30).
2.1.4 Maction de couplage
Ccmpte
tenu
des
~lénents ci-dessus ci~s,
le
tableau 1
relate des exarples de
synthèses
de
l~ithines avec des rcéthodes
variées.
2.2 Pr~tian du CCIIplexe de cadmian de la.lysolkithine
ra L- ct- lysanyristoylglycérc:phosphatidylcholine est
cœmercialisée
par
SIG1A sous sa fozme libre. Nous avons pr~par~ son
CCIIplexe de cadmium par la rcéthode classique de
Baer
(25,32-34).
Le
rerrlanent
en
ccmplexe
stkh~ 24 h à 50°C est de 92 % (schéna VIII).
ra microanalyse, le dosage de phosphore et le spectre IR dénotent la
pr~sence
de
solvant
de
cristallisation(H20
ou
alcool)
mais
le
prcxiuit semble pur.
CH202C(CH2 )12CH3
1
CdCI 2
CHOH
1
0
EtOH 1 CHCI 3 1 H 0
2
\\1
+
CH20-P-OCH2CH N(CH
2
3 )3
•
0-
Schéna VIII

---

-38-
2.3 Essais initiaux d'activation des acides
Les premiers essais d'activation de
l'acide
13
sous
fonne
de chlorure d'acide ou d'anhydride ont ~~ n~atifs.
Dans
le
premier cas le traitement de l'acide Par (CXX:l )2 produit une
rœ.ction
se<:::orrlai.re
sur
l' aœtc:p~e,
qui
est
une
œtone
~olisable (schéna
IX) •
Le
chlorure
vinylique
20
a ~t~ isol~ et
caract~is~ sous fonne d'ester ~thylique.
,
ICOCl)z
CI
CH 3CO -0O(CHz),oCOzH
CHz .. t'00(CHz).oCOCI
CHzCl z
i l
2Sl
SChéna IX
Dans le seconi cas, concernant
la
préparation
d 'anh~ide,
l'acide
13
a
~t~ trai~ Par le OCC dans du CHC13. Cette r~ction s'arrête à
un stade inteJ:ITéüaire.
la
N-acyl-ur~ isol~ 21 provient de
la
o-acyl-ur~ qui ne poursuit pas l'~tape suivante pour la fonnation
d'anhydride (12, 35) ~ le zœcarusrne est prc:po~ sur le schéna x.
R
R'"C -OH
(OCC)
NHD
Isolt IICIUI'
o=c/
'~-O
0" C-R
ACOOtt
21
°
NND
R~ë-o °
-ë R
o=c/
'NND
.....
SChéna X
Ces xœthodes d'activation
d'acides
ont
donc
~t~ exclues pour le
diacide.

---

-39-
2.4 Couplage par l'imidazolide
2.4.1 Synthèse de l~ithine mixte avec le monœ.cide
-----------------_.. -------
,
Le
traitement
de
l'acide
13
par
le
CDI fournit l'acyl-
imidazole 22, utili~ pour est&ifier la lysol~ithine sous
sa
fonne
de
CC1Tplexe
de
cadmium
19.
ra l~ithine d~sirée L1 a ~~ obtenue
-
-
avec un rendement de 59 % par rapport à la
lysol~ithine 19
(schéna
XI) •
CH3 CO -o
~ O(CH2),oC02H
Il
1,25 tCl. CO.
CHC13 /2 "120'C
CDI = N,N-Carbonyldiimidazole
22
591
0,34 tq. (Ll), ( CdCI, )3
19
60'C 124"
L1
Schéna XI
2.4.2 Synthèse de la l~ithine mixte tra.nsnembranaire
La
strat~e
de
couplage
entre
le
diacide
18
et
la
lysol~ithine 19 est la mêne que celle dkrite ci-dessus.
Les
~tapes
sant
repr~sentées
dans
le
schéna
XII.
Deux
difficult~s
se
pr~sentent:
• celle de l' insolubilit~ du diacide dans l' ~tape a);
• celle de la diest&"ification dans l' ~tape b).

---

-40-
a) Préparation du bis-imidazolide : ~tape a)
ra pyridine, seul solvant de solubilisation du diacide à
froid,
pennet
la
pr~ation du bis-imidazolide mais, s'est r~~~
inCXllpatible aveC la lysol~ithine qui
pr~ipite lors du couplage.
Des
conditions
exp&imentales
convenables
ont
pu être trouv~s en
tenant canpte de plusieurs facteurs:
- I.e diacide doit être d~assé de tout solvant de cristalli-
sation par mporation d'une solution de 0ie13 dans le toluène,
suivie d'un séchage sous vide à 50°C.
- ra rœction doit être men~ à chaud pour solubiliser le diacide
et cela dans un solvant eatpltible avec le 0iCl3 ,
solvant de
dispersion de la
lysol~ithine. Durant nos expériences, l'acyl-
imidazole s' est r~~l~ être sensible à une ~lmtiOn de t~
rature. Par con~ent, la tarpérature de la rœction n'a pas
exœd~ 45°C et le tarps de rœction a ~~ rMuit au mi.ni.Irn:m
possible, soit 3h.
- I.e <DI doit être utilisé en l~er excès. Dans la lit*ature, il
est dkrit que le <DI fonne des carbonates avec les alcools
(36 ). Dans notre cas, l'utilisation d'un trq> gram excès de <DI
pourrait d~sactiver notre lysol~ithine.
o
o
..
N~
Il
;::::::: N
R-O-H
+
~N-C-N~
-----..
R-O-C-O-R
- Nous avons utilis~ un catalyseur dans notre rœction, la ~
(37-39).
L'ensanble de ces observations nous
a
men~ aux conditions
:a)
du
schéma XII:
2 éq. ~.
2,4 éq. <DI
THF/43°C/3h
La fonnation de l' imidazolide 23 est v&ifi~ pàr sa facili~ de
transfonnation en diester xœthylique 17 par traitement au MeOH;

---

~C(CHz),OO~O(CHz),OC02 H
1 ...
.... 1
...
:-....
o
Im-O CICH2l,o 0 t \\ P 0 I C H 2 " O CO-lm
, ...
1
"
:0..
°
MeOti
Me~C(CHZ),OO~O(CH:zll0CCZ Me
1 ...
1
...
:-....
b)
o
17
L2
Schéma XII
Synthèse de la lécithine transmembranaire

---

-42-
b) Couplage bis-imidazolide + lysol/kithine ~tape b)
Au
cours
des
praniers
essais
d' acylation,
nous
avons
isol~ et
caract&is~ des prcxiuits de rnonocouplage 24 et 25.
R = H 24
R = H
25
L'origine
de
ces prcxiuits, en particulier 25, r~side dans le solvant
de cristallisation emnagasin~ dans les
mailles
du
canplexe
amorphe
de
CdC12
avec la lysol/kithine, carme il a ~t~ indiqu~ au paragraphe
2-2. Le séchage avant utilisation du
canplexe
de
la
lysollkithine,
par
évaporation
d'une
suspension
dans
aIC13-toluène
sous
vide,
aboutit à une
diminution
i.np:>rtante
de
la
quantit~
des
prcxiuits
secondaires 24 et 25 .
- Activation de l'alcool par l'anion dimsylscxiium.
L'utilisation de l'anion :cMSO- pour catalyser l' esterification
ne donne qu'un rendement de 6 % en l/kithine L2. Le rendement
faible s'explique sans doute par l'insolubilit~ du bis-imida-
zolide 23 dans le œso à froid.
- Activation par la ~.
Ce catalyseur très efficace des rœ.ctions de transfert d'acyle
(16-18) a ~~ utili~. L'activation de l'hydroxyle par la ~
conduit a un bon rendement mais nfkessite un tarps de rœ.ction
plus long. Pour améliorer la dispersion du canplexe de lysol~
cithine dans le aIC13, nous avons d'abord soumis le mélange
r~ctionnel aux ultrasons pendant 3 heures.
Le
roode
cçératoire adcpt~ pour le couplage dans l' ~tape b) du schéna
XII est :b)= 4 ~.WTHF/aIC13
ultrasons/20°C/3h
agitation/43°C/24h
Le rendement ootenu est de 29 % en lécithine
transmembranaire
L2
et
d'environ Il % en prcxiuits de monocouplage
24 + 25

---

-43-
2.5 autre voie possible de couplage: par l'acyl-thiazolidine
Parallèlement
à
la
voie
de
synthèse
de
ltkithine
par
l'acyl-
imidazole que nous avons
dtkrite
ci-dessus,
nous
avons
cherché
à
utiliser une nouvelle voie, par un da-iv~ acyl-2-
thiazolidine-2-thione.
S
~ J-.s
R-C- N0
M
Dans
la
litta-ature,
les
acyl-3-thiazolidine-2-thiones
ont
~t~
utilisœs pour acyler les sucres ou les
amines
(39-42).
Nous
avons
exploi~
cette
méthode
pour
essayer
de
préparer
autrement
nos
ltki.thines. Deux ~tapes-cl:és
(a
et
b)
constituent
cette
voie
de
synthèse d'ester.
S
o
~
~
a)
)l-s
b)
Il
R-C -OH
..
R-C -N0
•
R -C -OR'
J
M
2.5.1 Couplage glyœrcçhosphatidylcho1ine + 2 monoacides
a) Préparation de l'acyl-thiazolidine du monoacide:
Panni
les
diffa-entes
voies
possibles de préparation (39,41), nous
avons utilisé la méthode la plus silnp1e et la plus
douce
•Il
s'agit
de
l'action
de
la
mercapto-thiazoline-2-thione
sur
l'acide
en
présence
de
rxx: cœme agent de corx1ensation et .de I:t-1AP canne
catalyseur (schÉ!rla XIII).
la N-acyl-thiazolidine 26 a été obtenue avec un rendement de 72 %.
b) Acylation du c:x::q;>lexe : (GPC) (CdC12)
Pour
réaliser
les
essais
de
cette
nouvelle
méthode ,nous
avons
utilisé
la
GPC carmercialisœ par SIGtA, sous sa fonne c:x::q;>lexœ 27;
l'activation des
hydroxyles
a
été
réalisœ
par
l'anion
DMSQ-.Le
couplage représenté dans le schéma XIII donne un Rdt de
50 % en lécithine L3.
L'inta-êt
de
ces
nouveaux
réactifs
d' acylation
de
glycércçhosphatidylcholines est la
préparation
avec
un
bon
rende-
IœI'lt,
selon
une
méthode
simple
et
peu cofiteuse, d' intenté:li.aires
réactionnels stables.

---

-44-
CH~C0-o0(CH2)'OC02H
(6PC)(CdClz)
27
Il
N
C~SH (2 éq.)
S
72 %
DCC (1,5 éq.) /DMAP (0,3 éq. )
OMSO- Na+/DMSO
CH2C12/THF/20°C/24 h
5
/'5
N0
26
(4
éq .. )
(l
éq.)
50%
o
o-oi
if
LJ
SchSna XIII
2.5.2 Essai d' awlication à la synthèse de la lécithine
transmanbranaire
Forts des r~sultats obtenus
précé:1emnent
pour
la
prépara-
tion
de
l'acyl-thiazolidine
26
et
la synthèse de la lécithine L3,
-
-
nous avons envisag~ la synthèse de la lécithine L2 par cette voie.
a) Préparation de l' acyl-3-thiazolidine-2-thione du diacide
Pour les
manipulations
du
diacide
18
,
se
pose
constanment
le
prd:>lè:ne
de
l' insolubilit~ ; deux solutions ont ~t~ recherch~s pour
r~soudre ce proolè:ne :
- effectuer la rœction à tanpérature ambiante dans la pyridine,
seul solvant de solubilisation du diacide à froid' ;
- effectuer la rœction à chaud dans le THF, ccmne dans le cas de
la préparation du bis-imidazolide (schéna. XII).

---

-45-
~s corxlitions c:ph-atoires suivantes: a),
b)
d~ites dans
le
schlma
XIV
ont
été
utilisées.
Dans
11 une
cxmne dans 11 autre
l~analyse spectroscq>ique (RMN) rrontre la présence de deux isanères
la
N-acyl-thiazolidine
et
la S-acyl-thiazolidine. ~ triplet ô =
3,25 PIE attribué aux protons C!!2C-N diminue au
profit
dl un
tr~plet
fortement
blindé
ô =
2,41
HE
correspondant aux protons S-C!!2C=O.
wrs
de
la
pr~ation, la N-acyl-thiazolidine
M
siest
donc
isarérisée
en
un
thioester
plus
stable
N.
~
raisons de cette
isarérisation varient.
Dans les. corxlitions
a),
le
milieu
est
entièrement
basique
:
la
pyridine utilisée ccmne solvant peut catalyser cette isarérisation.
5
s
o
)-5
R-~-N0
o
Il
J
+
-/J-.
-"
S
R-~V
•
.!!.
Dans
les
ccnti.tions b) ,
11 isanérisation
irr~ersible a lieu sous
11 effet de la tarpérature ; il Si agit dl un réarrangement thenni.que.
Nous pouvons rawrocher ce phénanène du type de
réarrangement
décrit
pour les alkyl-benzothiazoles (43,44).
R
1
0:>-8
LI isanère
!!,
inerte
dans
les
corxlitions
de
transestérification
(MeO-/MeOH), ne pennettait pas
11 utilisation
du
mélange
dl isanères
pour
la
synthèse de la lécithine transmembranaire. Cette voie a donc
o
été abandonnée.
0
~
l "il
.... ,
H~"'~~OH
..
N
C
N
}-SH
C
S
}-SH
S
DCC
DCC
Pyr141ne120·C124 "
THF/4Q·CI24 "
s
s--\\
l..;N- 0
SChéna XIV
Pour
les
besoins
physicochi.mi.ques
la
lécithine
L2
é~ pr~ée
uniquement
par
la
méthode
par
11 acyl-imidazole.

---

-46-
3. PURIFICATION DES LOCITHINES
les
lécithines
il,
1.2,
L3
obtenues
ont
été
purifiées
suivant la procédure suivante:
- les phospholipides, sous
forme
de
CClTplexe
avec
le
chlorure
de
cadmium
après
couplage,
sont débarrassés des ions Cd2+ et CI- grâoe
à des résines échangeuses d'ions
IRe - 50 (RarH)
et
A-21
(JANSSEN)
faiblanent acide
faiblanent basique
La première du zœlange de oes résines débarrasse égalanent
le
milieu
de la II-fAP.
-
les
lécithines désirées sont séparées des produits de monocouplage
et de la lysolécithine
par
chranatographie
sur
colonne
de
silioe
avec
des
éluants
couramnent utilisés pour la séparation de phospho-
lipides = zœlange CHel3 : MeOH : H20 de prqx:>rtions variables.
- La chranatographie sur gel Séphadex de
LH-20
en
milieu
organique
avec du
CHeI3:MeOH(I:I),
pennet
de
parachever
la
purification
des
phospholipides
1.2
et
L3
et
de débarrasser le produit de la silioe
entrainée
par
la
chranatographie
précédente.
le
stockage
de
phospholipides
contaminés
avec
de
la
silioe
les
décarp)se
progressivanent en lysophospholipides.
La pureté des produits est vérifiée par
CCM,
la
révélation
étant faite à l 'lN et à l'acide IOOlybdique(47). L'éluant Perfonnant
CHel3
:
MeOH
:
H20 (95
35
6) mis au point par UMMERS
pour
séparer
les
1,2-diacyl-sn-glycéro-3-phosphatidylcholine
de
leurs
isanères
1,3-diacylés
a
été
appliqué
à nos lécithines (29) • Aucune
traoe de produit secondaire (isanère l, 3-diacylé)
n'est
décelable
en
CCM. ceci est égalanent confinné par les spectres de RMN.

---

4. CARAcrERISATIONS SPECI'RALES
4.1. Spect:rarét.rie de masse
L'analyse
en· Spectraœtrie
de
masse
de phospholipides présente un
grand intérêt; mais des difficultés dues à leur faible
volatilité
et
à
leur
faible
stabilité
thennique
existent.
Pour
sunnonter
ces
problèmes,différentes Il'éthodes sont prcposées
• désorption de ~ : FD.MS (48,49)
• ionisation chimique :CI.MS (gaz réactif
NH3 ) (50-53)
spectrat'étrie de masse Par lmission d'ions seoondaires
SI.MS (54)
• banbardement Par atanes rapides : FAB.MS (53 )
~ct électronique : El.MS (55,56) •
Dans
le
cas
de
lécithines (1,2-diacylglycérophosphatidylcholines),
les modes d'ionisation cités
pennettent
d'observer
des
"quasi"ions
rooléculaires
et
des
fragments
caractéristiques de lécithines. Nous
résuroons dans le schéna XIV,
les
principales
possibilités
de
pics
(mie) observés.
Ranargues :
1)
Quel
que
soit
le
mode
d'ionisation, l'ion
protoné
(M+H) + est
observé; les fragments mie 184 et MH-183 sont souvent observés.
2)
Les
lécithines
présentent
en
SM
des
pics
dont
les
masses
supérieures à M+1 sont dues à un transfert de choline
d'une
roolécule
à l'autre (ion de canbinaison) (53,58): mie M+184,M+104,M+86,M+58.
3)
Dans
le
cas
de CI (NH3), on observe le pic de substitution MH-42
da à l'échange entre N(CH3) de la tête polaire et NH3 gaz réactif.
4) La masse M+23 est due à la présence
d'ions
Il'étalliques
Na.+
même
dans les échantillons les plus purifiés(49,53).
Pour
notre
part,
nous avons utili~ les techniques disponibles pour
l'analyse des lécithines Ll, U, L3, soit CI (NH3), El, et FAB.

---

-48-
o
+.
•
+ -
-H20
rM+00-; - OCH,CHz~Ol,l,]
[M • HO CH2CH2N(CH3)~
..
lM' 86)
·.
1+-
+.
+-
[ M' CH2=N(CH2)2
[M' Na]
[M -H+CH ]
3
l
0-
(M' 104)
(M • 58)
~ (M' 23)
~ (M'., 4)
(M' 184)
o
1
II
+_
o
CH -0
o
l?
-C-CH CH R J+.
Il
12
0
2 2
CH2 -0 -C -CH2~R] [
~
1\\
+ •
942 - 0 - C - CH2CH2R
~-O-C-~~R
1
~
~ -H
CH - 0 -
~ - CH
CH - 0
2CH2R'
-c -C~CH2R'
4
1
~
CH - 0 -~ -CH CH R'
2
2
1
0
~ -~ -C~CH2R'
- 0
1
CH2 -0
1
0
+.
-~ -OCH
CH2 -0
2CH2N(CH3h
1
~
•
bH
(MH -
148)
~ -0 -~ -OCH2CH2] [ H]
2 -OJ-t
CH
~OCH2CH2~CH3)3
•
(t'ti-I5)
OH (t1i- 59)
• H
M
o
o
CH -0 -~ -CH CH R
.
2
2
2
Il
CH -0
ft
-C-CH CH R ] +.
12
2
2
r -q
2 -0
-CH2CH2R
1
+·
-2H
[
•
]
CH -OH
•
(MH -R'CH2CH=C=0 - 2)
CH - 0 -~ -CH
CH - 0 -
2CH2R'
""
-N(CH3)3
~ -CH2CH2R'
1
]+.
0
1
R
• ~3
1
R
.
CH2 - 0 -
~ - OCH2CH2N(CH3)3
1
•
CH
CH2 - 0 -
2 -0 -P -OCH CH NH
P-OCH2CH2N(CH3)3
OH
1
2
2.3
•
OH
(t'ti - R'CH2CH=C=0)
•
(l'ti - 42)
l :(~).
o
Il
CH -0 -g-CH CH R]+.
1 2
2 2
12-0 -C -CH2CH2R
+ •
'2H
CH -Q
CH
rMH'- R'CH
.,
2CH2C02H + 2 ~
R
~+.
t
HO-
OCH2CH2~CH3)3
1
+~ C-
CH2CH2R'
1
P.
+.
[
:"
CH2 -6
( 184)
CH2 -0 -~ -OCH2CH2~CH3)3]
(t'ti - '83)
OH
•
1t'ti - R'CH2CH2C02H )
schéma XIV

---

Tableau 2 : Principaux ions mie de spectres de masses
des
l~ithines
LI, 1.2, L3 et du ct-1PC.
,Principaux pics: mie (intensité relative),
Composé
Technique
~+CH2SN(CH3)1 (M+23)+ (14+14)+ "'+1 )+
Autres
[MH-IS)
MH-42)
(!'Π... S9)
~IH-148)
(MH-183 )
118.)
t,
IC(NH 3)
827(9)
782(3 )
770(47)
756(8) 728(11 ) 711(57) 622(2)
587(100)
IE(70eV)
770(2)
587(40)
494(100)
F1IB(glycérol)
792(1 ,8)
770(10)
184(100)
L
IC(NH 3)
862(12)
~48(4) 820(4)
678(100)
3
F1IB(glycérol)
862(1 '4)
184(100).
L
FA8(glycérol)
1482(0,8
184(100)
2
04 PC
IC(NH )
735(3 )
690(1 )
678(18)
636( 44)
530(9)
495(100)
3
ra spectranétrie de masse des trois produits présente les ions
protonés (M+H)+. Dans le
cas
de
la
l~ithine transmanbranaire on
observe
(M+2H)+.
cela
vérifie
bien que la protonation se fait sur
la tête polaire au niveau des phosphates.
D'après nos résultats, l' le (NH3) donne de meilleurs
résultats
quand
cette
technique
est réalisable (masse IOOl~laire faible); on obtient
des pics caractéristiques de phosphatidylcholines. Par contre
la
FAB
nous
a
pennis
d'obtenir
le
"quasi"ion
IOOl~aire(M+2H)+ de la
bis-l~ithine 1.2

---

-50-
4. 2 ~sanance magœtique nucléaire du proton
Les spectres de RMN_1H des
trois
phospholipides
photosensibles
LI,
1.2 ,
L3
sont en accord avec les structures proposées., Nous retrouvons
les
vaieurs
des
d~placanents chimiques des protons des chaînes
grasses photosensibles. D'autre part,
les
valeurs
des
d~placanents
chimiques
relatives
aux
têtes
polaires
correspondent
à
celles
pr~lablanent indiquées dans la litt~ature(45,57,58).
la RMN_lH de phospholipides pennet essentiellanent de
distinguer
les
d~iv~s 1,2-diacyl~s Q des
1,3-diacylphospholipides
R. En effet,
l'allure des signaux dus
aux
protons
-CX:XX:!!2CH2
des
deux
chaînes
acyles
renseigne
sur la nature de l'isanère de position. Dans le cas
de d&iv~ 1,3-diacylglyœrophosphatidylcholine R,
la
mol~le est
symétrique
et
les
protons (a , b) sont équivàlents; sur le spectre,
on observe un triplet.
9laI
0 (al
CH20CCH2CH2R
CH OëCH CH R
0
2
2
2
1
Il (bl
1
0
+
CHOCCH2CH2R'
CH 0-P-OCH CH N(CH
2
2
3 )3
...
~ \\
0
lb)
0-
1
(CH3~N CH2C~~-o CH2
ÀCH CH C~CH2
2
2
0-
Dans le cas d' isanères 1,2-diacyl~s, les protons (a) et
(b)
ne
sont
pas
équivalents,
car
leurs
environnenents
magn~tiques
sont
diff~ents;
les
signaux
repr~sentent deux
triplets
(400 MHz) qui
donnent l'apparence
d'un
quadruplet
(200
MHz).
Sur
les
spectres
(Fig:
l,
2,
3 )
des
lécithines
LI,
1.2 ,
L3
nous
observons
des
"quadruplets"
à
2,2-2,3
ppn. cela montre que lors des synthèses,
une migration du groupement phosphoryle
ne
se
produit
pas
sur
le
glyœrol.
CON::LU8rON
Nous
avons
synth~tis~ trois
phospholipides
portant
un groupanent
photosensible; ceci
a
pu
être
r~lis~ en
sunnontant
de
grandes
difficult~s
pratiques:
solubilit~
très
faible
et
r~ctivit~
insuffisante de certains intennédiaires.
L'un de ces canpos~s possède une
chaîne
assez
longue
pour
pouvoir
être
transmembranaire, ce
qui
pennettra
d ' ~tudier
la topologie des
constituants des bioouches phospholipidiques.

---

-51-
•• 1
Il
1
99
Il
,1
'1
\\ ,.
J
\\
400 MHz
COCIb ",
Li
m
8
7
5
4
3
o
il'
gg'
ck'
400 MHz
~-
J\\
L2
l
1
b
8
7
5
4
3
2
o
L3
m
ck'
9
8
7
8
5
4
3
Figure l,
2,
3
Spectres RMN des trois lécithines synthétisées

---

PAR T l E
EXP E R l MEN T ALE
-.-. -- - ---- ... - -- --- -- - -- - - - - --- - -- -- - - -- ---

---

-52-
PARTIE EXPERIMEMTALE
A.INDICATIONS GENERALES
1. Mesures physiques
La r~sonance magn~tique nucl~aire (RMN)
Les spectres du proton (RMN-lH) ont ~t~ r~alis~s en solution
dans
le
chloroforme
deut~ri~
(sauf dans le cas d1indication diff~rente). Les
spectres à 80 MHz ont ~t~ enregistr~s sur un
appareil
BRUKER
WP
80
CV,
les
spectres
à
200 MHz sur un appareil BRUKER WP 200 SY et les
spectres à 400 MHz sur un appareil BRUKER
AM
400.
Les
d~placements
chimiques
( 5 )
sont
exprim~s
en
ppm
par rapport à une r~f~rence
interne: TMS (S =O)ou CHC13 (6 =7,27).
Les
constantes
de
couplage
(J)
sont
exprim~s
en
Hertz (Hz). La r~solution digitale est de Q,3
Hz.
Les
abr~viations
suivantes
d~signent
les
multiplicit~s
du
couplage
s (singulet), d (doublet), t
(triplet), q (quadruplet) et
m
(multiplet).
Les
spectres
du
Carbone
13
(RMN-13C)
ont
~t~
enregistr~s
sur
l'appareil BRUKER avec des produits en solution dans
du CDC13. La r~solution digitale est d'environ 1,5 Hz.
La spectrom~trie de masse (SM)
Les analyses ont ~t~ r~alis~es sur le spectromètre
de
masse
THOMSON
CSF,
THN
208
en introduction directe. La tension d'acc~l~ration est
de 70 eV. Les spectres FAB sont obtenus sur un spectromètre
de
masse
ZAB
HF
(VG
Analytical, Manchester ), les matrices utilis~es sont le
glyc~rol et le thioglyc~rol.
La spectrom~trie infrarouge (IR)
Les
spectres
IR
ont
~t~
enregistr~s
sur
un
spectrophotomètre
PYE-UNICAM-SP3-300
S
(Philips).
Les
produits sont en solution dans
du CHC13 ou en pastille dans du KBr.
Les
valeurs
d1absorption
sont
exprim~es en cm-l.
La spectrom~trie ultra-violet (UV)
Le
spectromètre
UVIKON
810
(Kontron), ~quip~ d'un LS PRINTER 48 et
d'un UVIKON recorder 21, a permis
de
tracer
les
spectres
UV.
les
longueurs d'ondes sont exprim~es en nm.

---

-53-
La microanalyse (MA)
Les
analyses
ont
~t~
effectu~es
par le service de microanalyse de
l'Institut de Chimie de Strasbourg.
Les points de fusions
( F)
Ils
ont
~t~
d~termin~s
sur
un
microscope
à
platine
chauffante
REICHERT et n'ont pas ~t~ corrig~s.
2. Technigues chromatographigues
La chromatographie sur couche mince (CCM)
Les ~chantillons ont ~t~ analys~s sur des plaques KIESELGEL 60
F
254
de
MERCK,
de 0,25 mm d'~paisseur.
Les r~v~lations sont faites soit à
l'UV, soit à l'iode, soit au m~lange H2S04
EtOH-vanilline,
ou
au
r~actif
molybdique.
La
valeur
Rf
est la distance travers~e par le
produit divis~e par la distance totale parcourue par le solvant.
La chromatographie d'~lution sur colonne (CC)
---------------------------------------------
Les chromatographies
sur
colonne
ont
~t~
effectu~es
sur
gel
de
silice
KIESELGEL
de
granulom~trie
40-63
}oC- m.
Sauf
indications
,
contraires, le poids de silice utilis~ a
~t~
de
30
a
50
fois
le
poids du produit à chromatographier.
La chromatographie d'~change d'ions
La
r~sine
~changeuse de cations utilis~e est l'Amberlite IRC-50 ROTH
et
la
r~sine
~changeuse d'anions
l'Amberlite
A-2l
JANSSEN.
Les
produits sont pass~s (dissous dans l'~luant CHC13/MeOH/H20
4/5/1))
sur une colonne de m~lange à volume ~gal de ces deux r~sines.
La perm~ation sur gel
La
purification
par
perm~ation
sur
gel
a
~t~
effectu~e sur une
colonne Sephadex LH-20 de PHARMACIA Fine Chemicals,
l'~luant
utilis~
est du
CHC13/MeOH ( 1:1).

---

-54-
~éactifs utilisés
Abréviations
formUle développée
Masse
Source
Qualité
'+.
ou semi-développée
Moléculaire
Acide azélaique
-
HOOC(01 7)7COOH
188,23
ALDRICH
98
Acide ll-bromoundécanoique
-
Br(CH2)10COOH
186?30
JANSSEN
99
8romure d'hydrogène
-
HAr
80,91
FLUl<A AG
99,8
Chlorure de cadmium
-
CdCl 2
183,31
PROlABO
98
Chlorure d'oxalyle
-
(COCl) 2 .
126,96
ALDRICH
99
N, N' - Dicyclohéxylcarbodiimide
DCC
CfiHI1N=C=N-C6Hll
206,33
AlliRICH-CHIMIE
99
4,4'-Dihydroxybenzophénone
-
( (p) HO-C 6 H4) 2CO
214,22
ALDRICH-CHEMIE
97
1,l'-Diimidazolcarbonyle
DIC
C3H3N2--CO-e3H3N2
162,15
AlliRICH-CHIMIE -97
'I-Diméthylaminopyridine
DMAP
(4)-(CH3)2N-C5H5N
122,17
fWKA AG
98
Diméthyl sulfox ide
DMSO
CH SOCH
78,13
FUJKA p[',
99,9
3
J
i Iydroxyde de potassium
-
KOH
56,11
PROlABO
86
~-Hydroxyacétophénone
-
(p)HO-e H -COCH
I1 4
3
136,15
EGA-CHEMIE
98
Hydrure de sodium
-
NaH
24,00
FWKA AG
Dispersion ds l'huile minérale 5[,%
Iodure de sodium
-
NaI
149,89
PROlABO
99,5
Iodure de tétrabuty larnnonium
IN (nBu)4
(CH3CH2CH2CH2)4NI
369,38
RO'Il-I
.... 99
L- a -lysomyristoylphosphcd:i-
dylcholine
l.MPC
C22H4607NP
467,60
SIGMA
98
2-Mercaptothiazoline
-
(2)-IIS-C H NS
119,21
3 5
JANSSEN
98
Méthanol
MeOH
CH 0H
32,04
PROlABO
99,8
3
Pyridine
Pyr.
C H N
79,10
PROlABO
99,7
5 5
Sodium
-
Na
22 ,99
PROlABO
98,7 (en mqrceaux ds huile de vase
Complexe de cadmium de la
lir.e
L- a -glycérophosphatidylcholine
(GPC) (CdCl )
2
C8H2006NPCdC12
440,54
SIGMA
98
Tableau de caractéristiques des différents réactifs utilisés

---

-55-
B.SYNTHESE
ll-bromound~canoate de m~thyle II
MeOH
C•.JI,.p~r • 279,07
On dissout 15,4 g (82,3 moles) d'acide
ll-bromound~canoïque 10
dans
75
ml
de
MeOH refroidi à O°C. La solution est satur~e d'HBr gazeux.
Après 24 h à 4°C, le mélange
réactionnel
est
versé
dans
de
l'eau
glacée,
et
est
extrait
à
l'éther.
La
phase
organique est lavée
jusqu'à neutralité, séchée sur
Na2S04
et
évaporée
à
sec.
L'huile
obtenue
est
chromatographiée sur colonne de silice. L'élution par un
mélange CH2C12 : hexane (1:1) donne 15,5 g de bromoester Il.
Rdt = 96 %
CCM : Rf = 0,5 (hexane : CH2C12 - 1:1)
RMN-1H (80 MHz)
CDC13
$(ppm) 3,69 (s, 3H
COOC~3)
3,45
(t,
J = 8Hz,
2H C~2Br)
2,34
(t,
J =
7,5 Hz,
2H C~2CO)
1,85 et 1,34 (m, l6H (C~2)8)
IR
(CHC13)
cm- l
3010, 2940, 2865
(V CH2)
; 1730 (VC=0(OCH3))
1460 ; 1440 ; 1230-1200 ; 1175.
ll-iodound~canoate
lhl
de m~thyle 15
BrCCHz).,COzCH,
-----I~..
{(CHz).,COzCH,
.dto••
i l
i l
C.zHzpzl =326,07
On chauffe à reflux pendant 5 h une suspension de 17,3 g
(0,06
mole)
de
ll-bromoundécanoate
de
méthyle
Il
sec et de 30 g (0,2 mole) de
NaI anhydre
dans
200
ml
d'acétone.
Après
filtration
du
mélange
réactionnel
et
évaporation du solvant, l'huile obtenue est reprise à
l'éther; les sels NaI+NaBr sont extraits à
l'eau
la
phase
orga-
nique
est
lavée
avec
une
solution de thiosulfate de sodium à 5 %,
séchée sur MgS04. Après évaporation du solvant on
obtient
une
huile
épaisse qui est utilisée sans autre purification par la suite.
Poids = 18,1 g de 15; Rdt : 90 -
93 % •
CCM : Rf = 0,5 (hexane:CH2C12 - 1:1)
RMN-lH (80MHz) CDC13 J"ppm :
3,7 (s ,3H,COOC~3)
3,22 (t, J = 8Hz, 2H ,C~2I)
2,34 (t, J 7,5 Hz, 2H,C~2CO)1,85
1,34 (m, l6H,(C~2)8)

---

-56-
1l-(4-acéty1phénoxy)-undécanoate de rœthy1e 12
BrCCHII ••COICH,
~
1.1
CH3C0-o0CCH21IoC02CH3
u
C20H:so04 ::33 ",21
A
une
solution de 1,3 g( 9,3 rnmo1es) de p-hydroxyacétophénone 3 dans
10 ml de DMF, on ajoute sous courant d'argon 410 mg
(9,3
rnmo1es)
de
NaH
(suspension
à
50
%
dans
l'huile
minérale).
Après
15
mn
d'agitation, on ajoute 2,8 g (10,2
rnmo1es)
de
bromure
Il
et
2,8g
(18,6
rnmo1es)
de
NaI
anhydre.
Le
mélange est agité énergiquement
pendant une nuit à température ambiante
sous
argon
puis
neutralisé
avec
HC1
IN
et
extrait à l'éther.La chromatographie ,sur colonne de
silice (é1uant : hexane:acétate d'éthyle -
70: 30) suivie d'une
cristallisation dans un
mé1ange:éther-hexane)
donne
2g
de
produit
12; F : 75°-76°5C : Rdt 80%.
CCM : Rf = 0,5 (hexane:acétate d'éthyle -
70:30)
RMN-1H (200 MHz) CDC13bPpm:
7,96-7,91 (Syst.A2B2, J=8,9Hz, 2H , H arom. ortho/CO)
6,95-6,90
(Syst.A2B2, J=8,8Hz, 2H , H arom. méta./CO)
4,02
(t, J=6,5Hz,
2H, C~20)
3,67 (s, 3H, C~30)
2,56 (s, 3H, C~3CO Ar.)
2,31
(t, J=7,5Hz,
2H, C~2COO)
1,81 (m, 2H, C~2CH20)
1,62 (m, 2H, C~2CH2CO)
1,51-1,31 (m, 12H, C~2)6)
o
RMN-13C (50MHz)
: CDC13bppm:
197(2"), 163,1(6"); 130,5(3"); 51,2(1'); 34,0; 114,1; 77,5
et
76,9
et
76,3
(solvant);
68,2(11);
29,3;
29,2;
29,1;
26,10(1"); 25,88; 24,86.
SM
70 ev, lE,
90°C, mie 334(50,M+)
; 319(17,M+-CH3)
303(8,M+-OCH3)
; 261(16)
; 167(11)
; 149(13)
;
137(65, 0.Ar.COCH~+2H) ; 136(43,+HOArCOCH3)
121(100,.OAr-C=OH )
IR
(CHC13)
cm- 1 3020(VC=C arom.)
; 3000, 2940 ,
2860
(VCH2)
; 1730 (v c=o (OCH3))
; 1670 (II CO arom. )
1600 , 1580 , 1500 (J,I C=C arom.)
; 1360 ; 1300
1260 ; 1170
1020 (J,I c-o arom.)
; 960 ; 830 .
uv
( 7\\.. max, ~ )
-EtOH (274 nm, 17.400)
(221,5 nm, 12.000)
-CHC13(274 nm ; 17.500)
MA : calculé %
C
71,81
H
9,04
trouvé
%
C : 71,89 ; H : 9,24.

---

-57-
lOB
acide 11-(4-acéty1phénoxy)-undécanoïque 13
CH;sC0-o0CCH2)10C02CH;s
IIOB
aqutUi
11.
CH;sC0-o0CC,H2)IOC02H
i l
c1,NzaO. = 320,20
On
chauffe
2g
d'ester
12
(6
moles) dissous dans 10 ml de potasse
éthano1ique 0,7N (5 % H20) à réf1ux pendant 1 h, puis
on
évapore
le
solvant;
le
résidu
est
repris
dans
l'eau et acidifié par HC1 IN.
L'extraction
au
chloroforme
suivie
d'une
cristallisation
dans
acétone
EtOH
donne
des cristaux incolores 1,6 g de 13 ; F
et 98-100°C (polymorphisme)
: Rdt 86 %
CCM : Rf = 0,5 (acétate d'éthyle)
RMN-1H (200 MHz) CDC13 ~ppm :
7,96-7,91(Syst.A2B2,J= 9Hz, 2H, H arom.ortho/C=O)
6,95-6,90(Syst.A2B2,J=8,9Hz, 2H, H arom. méta C=O)
4,02 (t, J = 6;5Hz, 2H, C~20)
2,57 (s, 3H, C~30)
2,36 (t, J=7,4Hz , 2H, C~2C02H)
1,81 (m, 2H, C~2CH20)
H
1,64 (m, 2H, CH2CH2C=O)
1,31 (m, 12H,
(CH2)6)
o
RMN-13C (50 MHz) CDC13 Gppm :
196,63 (2')
; 178,83 (19')
163,11 (6')
; 130,48 (3')
;
130,16 ; 114,13 ; 71,55 -
76,91-76,28 (solvant)
; 68,22
(11)
; 33,75(2)
; 29,34 ; 29,20 ; 29,08 ; 29,02
(CH2)
;
28,95 ; 26,12 (l')
; 25,87 - 24,61 (3 et 4)
SM
lE
70 eV, 100°C, mie 320 (27, M+)
; 305 (8, M+-CH3)
;
137 (50, OArCOOCH3+2H+); 136 (50, OArCOOCH3+H+);
121 (100)
IR
(CHC13)
cm- 1 3030 (JI =C-H arom.)
; 2940 - 2860 (J) CH2)
;
1715 (v CO acide)
; 1680 (II c=o arom.)
;
1600 - 1510 (V C=C arom.)
; 1580C Ar-O-)
;
1360 (II C-O-C)
; 1305 ; 1260 ; 1170 ; 960 ;
840 (0 = C-H hors du plan)
;
UV
( i\\.. max, E-)
CHC13:
( 272 nm, 17.400)
MA
calculé %
C
71,12 ; H
8,81
trouvé
%
C
71,23 ; H
8,86.

---

-58-
I.- -1=myristol-2-lysoglycérophosphatidylcholine
(canplexe de cadmium) 19
CdC1 2
HOH 1 CHCI;s 1 ~o
(Cn H..607NP)2(CdC1 Z)3 = 1484,50
On dissout
500
mg
(1,07
mmoles)
de
L- ~ -myristoyl-
lysophosphatidylcholine
(MLPC)
dans 30 ml d
'un m~lange EtOH : CHC13
(2:1)
. La solution est maintenue à O°c et
soumise
à
une
agitation
~nergique.
On
ajoute goutte à goutte une solution de CdC12
(900 mg :
4,9 mmoles) dans 1 ml H20 et 40 ml EtOH.
Un
pr~cipit~
apparaît.
La
solution
est
maintenue
au repos à O°C pendant 1 h puis le pr~cipit~
est filtr~, lav~ avec de l'EtOH froid puis avec de
l'~ther
et
s~ch~
24 h à 50°C. On obtient 730 mg de produit pulv~rulent 19.
Rdt : 92 %
IR :
(pastille KBr)
cm- l
; 3460 (OH solvant de cristallisation
H2 0 ou alcool). 2940 ,
2860
(v CH2)
; 1730 (v C=O)
; 1470
1
( il CH2aester)
; 1210
(&1 P02 asym.)
; 1090
(V P02 sym.)
; 1060
(}/(P)-O-C)
; 980
(JC-C-N+)
;
1170
(i/C-O-C).
MA
calcul~ %
.
35,56 . C;
6,25
H;
.
1,89
N •
trouv~ %
C
35,72
H
6,43
N
1,89 .

---

-59-
l-myristoyl-2-[11-(4-ac~tylph~noxy)-und~canoy~-sn-glyc~ro-3­
phosphatidylcholine LI
CDI 1 CltCI,
. .
CH C0D-0(CH
CO-NC! (lll, c CtICl, l,.
CH,CO-{)-O(CHlI,OCOlH
l
l l 10
U
Z2
II
C~IH120'0NP = 769.19
Cette
r~action
doit
être
effectu~e dans des conditions strictement
anhydres et à l'abri de l'air. Le m~lange des solutions
est
effectu~
par transfert au moyen d'une canule en utilisant une rampe à argon.
Une
solution
de
130
mg
(0,4
mmole)
de
l'acide 13 et 85 mg (0,5
mmole) de carbonyldiimidazole (CDI)
secs
dans
2
ml
de
CHC13
est
agit~
2
h
à
temp~rature
ambiante
sous
argon. Cette solution est
transf~r~e dans une suspension de 100 mg(0,135 mmole) de
complexe
de
cadmium
de
la
lysol~cithine 19.
L'ensemble
est
agit~ sous argon
pendant 24 h à 60°C. Le solvant est ~vapor~
et
repris
dans
100
ml
d'un
m~lange
CHC13:MeOH:H20
(4:5:1)
puis filtr~. La liqueur est
ensuite pass~e sur r~sines
~changeuses
d'ions
IRC-50
et
A-2l
(10
ml).
Les
solvants
sont ~vapor~s.Par chromatographie sur une colonne
de
silice,
l'acide
gras
restant
est
~lu~
par
un
m~lange
CHC13:MeOH:AcOH
(97:3:1),
puis
la
l~cithine
LI
est
~lu~e
avec
CHC13:MeOH:AcOH (60:40:2). On obtient 61 mg de
produit
amorphe.
Rdt~
59 % par rapport à (CdC12)3 (LL)2.
CCM : Rf 0,30 (CHC13 : MeOH : H20 - 65
25
4)
RMN-lH (200MHz) CDC13
§
ppm :
7,94-7,92 (Syst A2B2, 2H, H arom. ortho/C=O)
6,93-6,91 (Syst.A2B2, 2H, H arom. m~ta/C=O)
5,21 (m, lH, C~ du glyc~rol)
4,4 (m, 2H C~20C=0 du glyc~rol)
4,14 (m, 2H, C~2P04 de la choline)
4,0-3,97 (m, 4H, C~20, C~2P04 du glyc~rol)
3,83 (m, 2H, C~2N de la choline)
3,38 (s, 9H,
(C~3)3N)
2,56 (m, 4H, C~2C02)
1,8 (m, 2H, C~2CH20)
1,57-1,22 (m, 36H, Autres CH2)
0,87 (t, 3H, CH3 myristoyle)

---

-60-
IR
(CHC13)
cm- l
;
3300
(OH, solvant de cristallisation)
2930-2860
(V CH2)
; 1735
(II COOH3)
; 1670
(\\l'CO arom.)
1600
(v'
C=C arom.)
';
l570(v~rom.para.substitué)
; 1450-1430
(v CH2 ester)
; 1360 ; 1250 (V P'02- asym)
; 1170 (II C-O-C)
1090 (v' P02- sym)
1050 ( Il (P)-O-C)
; 1020
: 970
(V C-C-N+)
830
(V (C)-O-p-O)
; 640.
SM
70 eV,
lC (NH3)
,140°C ,mie: 862
(0,8)
827
(19, M+CH2=N(CH3)2);
782
(3,M+14);
770
(47,MH+);
756 (8);
728
(ll,MH -N(CH3)3 +NH3);
711 (57,M-choline-H20-(CH2)2);
669
(3,2)
; 654
(2,2);
636
(3,4)
; 622
(2,2
M -P03CH2CH2N(CH3)3 +H +NH4);
605
(18, M -P03CH2CH2N(CH3)3 +2H);
604
(2,4)
;
587
(100, MH -P04CH2CH2N(CH3)3); 575
(2,8)
; 571
(1,6);
568
(2)
; 543
(2)
; 528
(16)
495
(4)
;
487
(1,2);
471
(9,5)
; 450
(0,7)
; 436
(0,8)
7 0 eV ,
lE, 150 ° C, mie: 906
(1 , 8 );
814
(12);
770
(2)
; 758
(3)
679 ou 680(4); 645 ou 646
(5);
604
(7,3)
; 587
(40)
; 543
(4)
494
(100)
; 481 (6)
;
451
(15)
;
336
(15)
;
319
(4)
303
(5 , R2C=0)
FAB (glycérol),
mie: 792 (1,8 , M+Na+); 770,4 (10, MH+)
542,2 (2)
; 500
(1,5)
; 468
(1,7)
;
450
(3,4)
359
(6)
343
(2)
; 184
(100, HOP03-CH2CH2N+(CH3)3).
UV
(~max, f,
CHC13
(272 nm,
10.200)
MA
calculé %
C
63,91
; H
9,43
trouvé
%
C
59,63
; H
9,68.

---

-61-
11-(4-acéty1phénoxy)-undécanoY1thiazo1idine-2'-thione 26
N
C)-SH
S
CHlC0-o0ICH2),OC02H
~
DCC 1 Dt1AP 1
CHC\\3 - THf
LJ
On dissout 600 mg (1,87 mmo1es) d'acide 11 , 490 mg (2,37
mmo1es)
de
dIcyc1ohéxy1carbodiimide
(DCC),
410
mg
(3,6
mmo1es)
de
2-mercapto-2-thiazo1ine
(MT),
et
60
mg
(0,48
mmo1e)
de
diméthy1aminopyridine (DMAP) secs dans un mélange
de
CH2C12
(8
ml)
et
THF
(4m1).
La
solution
est
agitée 24 h à température ambiante
sous argon, filtrée pour éliminer
l'urée
formée.
Après
évaporation
des
solvants,
le
mélange réactionnel est chromatographié sur silice
(é1uant = hexane:acétate d'éthyle
1:1),
l'acy1
thiazo1idine
est
ensuite
cristallisée
dans
du
CH2C12-hexane.
On
obtient 440 mg de
cristaux jaunes 26, F = 80,5° - 81°C
Rdt : 72 %
CCM : Rf = 0,28 (hexane:acétate d'éthy1e- 70:30)
RMN-1H (200MHz) CDC13
Ô ppm
7,96-7,91 (Syst.A2B2, J=9Hz, 2H, H arom.ortho/CO)
6,95-6,90 (Syst.A2B2, J=9Hz, 2H, H arom.méta/CO)
4,58
(t,
J=7,5Hz, 2H, C~2S)
4,02
(t, J=6,5Hz, 2H, C~20)
3,29-3,25 (m, 4H, C~2N et
C~2C=0)
2,56 (s, 3H, C~3C=O)
1,81 (m, C~2CH20)
1,69 (m, C~2CH2C=O)
1,31 (m,
(CH2)6)
RMN-13C (50MHz)
CDC13
0 ppm :
201,39 (f=S)
; 196,52 (CH3 f=O)
; 174,82 (N-f=O)
163,08 (O-f arom.)
; 130,46 (Ar-f=O)
;
130,20 ; 114,13 ; 77,54 ; 76,91 ; 76,28 ; 68,23
55,95 (fH2N)
; 38,30 ; 29,33 ; 29,23 ; 29,20 ;29,03
28,96;
28,16 (fH2S)
; 26,13 ; 25,88 ; 24,66
SM :IC(CH4)' 80°C, m/e:421(100, M+); 406(1, M-CH3); 393(2); 388(6);
379(30, M-CH3C=O); 362(2); 360(1,5); 331(2; M- S); 317(4,);
303(35,M- thiazo1idine-2-thione); 284(5); 275(5); 273(4).
IR
CHC13
cm- 1 : 3000,2940,2860( YCH2)
; 1600, 1500
( v C=C arom.) ; 1690 (II NC=O); 1580 ; 1670 ( li CO arom)
1360( IIC-O-C)
; 1280(
v C=S) ; 1260 ; 1150 ;
1170 ; 1055 ( v C-N)
UV
( À. max, f,..)
CHC13:
(275 nm, 17.000)
MA
calculé %
C
62,65; H
7,41; N : 3,32.
trouvé
%
C
62,79; H
7,55; N
3,39.

---

-62-
L~-1,2-di-[11-(4-acétylphénoxy)-undécanoYiJ-phophatidylcholine
L3
CH3COOOCCH2)10CO
2.§.
o
0{)1
if
LJ
- Préparation de dimsylsodium dans DMSO
On
dissout
145mg(6,3
mmoles)
de Na lavé dans l'hexane dans 5 ml de
DMSO sec (par agitation
pendant
2
h
à
température
ambiante
sous
argon).
Le
titre
de
la
solution
obtenue
(dosage
par
HCl lN en
présence de phénolphtaléine) est: l N . la valeur théorique
étant
de
1,3N =) Rdt : 77 %.
Réaction de couplage
On
dissout
42 mg (0,095 mmole) de L- J. -
glyœrophosphatidyl-
choline, complexe de cadmium: (GPC) (CdC12) 27 et 160
mg
(0,38
~mole)
d'acyl-thiazolidine
26
dans
4,5
ml de DMSO par chauffage pendant 2
mn à 35°C. A cette solution maintenue à
20°C,
on
ajoute,
goutte
à
goutte
sous
agitation,
380 ~l d'une solution de DMSO-/DMSO lN (0,38
mmole). Après
30
mn,
le
mélange
réactionnel
est
neutralisé
par
addition
d'environ
6
ml
d'acide
acétique
O,lN
et
dilué dans de
l'eau. L'extraction au CHC13 : MeOH (2:1),
suivie
du
lavage
de
la
phase
organique
au
MeOH:H20
(l:l),donne un résidu après évaporation
des solvants. Le DMSO est éliminé par séchage sous
vide.
Le
produit
est
dissous
dans
un
mélange
CHC13:MeOH:H20
4:5:1, échangé sur
resines d'Amberlite IRC-50 et A-21 et le filtrat
est
évaporé.
Après
chromatographie
sur
silice
(éluant
CHC13:MeOH:H20
4:5:1)
et
perméation sur
Séphadex
LH-20
(éluant
CHC13
MeOH
1:1),
on
obtient 41 mg de produit amorphe L3.
Rdt : 50 %
CCM
Rf = 0,25 (CHC13
MeOH
H20 - 65:25:4)

---

-62-
L~-1,2-di-[11-(4-ac~tylph~noxy)-und~canoYiJ-phophatidYlcholine
L3
, ~r-J'~3
CH3COOOCCH2)IOCO
'.
1
'-0
CdCI2
26.
21
o
0-01
if
LJ
- Pr~paration de dimsylsodium dans DMSO
On
dissout
l45mg(6,3
rnmoles)
de Na lav~ dans l'hexane dans 5 ml de
DMSO sec (par agitation
pendant
2
h
à
temp~rature
ambiante
sous
argon).
Le
titre
de
la
solution
obtenue
(dosage
par
HCl IN en
pr~sence de ph~nolphtal~ine) est: 1 N . la valeur th~orique
~tant
de
1,3N => Rdt : 77 %.
R~action de couplage
On
dissout
42 mg (0,095 rnmole) de L- d. -
glycérophosphatidyl-
choline, complexe de cadmium: (GPC)(CdC12) 27 et 160
mg
(0,38
~mole)
d'acyl-thiazolidine
26
dans
4,5
ml de DMSO par chauffage pendant 2
mn à 35°C. A cette solution maintenue à
20°C,
on
ajoute,
goutte
à
goutte
sous
agitation,
380 ~l d'une solution de DMSO-/DMSO IN (0,38
rnmole). Après
30
mn,
le
m~lange
r~actionnel est
neutralis~
par
addition
d'environ
6
ml
d'acide
ac~tique
O,lN
et
dilu~ dans de
l'eau. L'extraction au CHC13 : MeOH (2:1),
suivie
du
lavage
de
la
phase
organique
au
MeOH:H20 (l:l),donne un r~sidu après ~vaporation
des solvants. Le DMSO est ~limin~ par s~chage sous
vide.
Le
produit
est
dissous
dans
un
m~lange
CHC13:MeOH:H20
4:5:1, ~chang~ sur
resines d'Amberlite IRC-50 et A-2l et le filtrat
est
~vapor~.
Après
chromatographie
sur
silice
(~luant
CHC13:MeOH:H20
4:5:1)
et
perm~ation sur
S~phadex
LH-20
(~luant
CHC13
MeOH
1:1),
on
obtient 41 mg de produit amorphe L3.
Rdt : 50 %
CCM
Rf = 0,25 (CHC13
MeOH
H20 - 65:25:4)

---

-63-
RMN-lH (200MHz) CDCl3
b ppm
7,94-7,89
(Syst.A2B2, J=8,9Hz,
4H, H arom.ortho/C=O)
6,93-6;89 (Syst.A2B2, J=8,9Hz 1
4H, H arom.m~ta/C=O)
5,22
(m, lH, C~ du glyc~rol)
4,36-4,l4(m, 4H, C~20C=0 du glyc~rol, C~20P03 de la choline)
4,00 (t, J=6,5Hz,
4H, C~20-Ar; m, 6H, C~2P04 du glyc~rol)
3,83 (m, 2H, C~2N)
3,38 (s,9H, N(C~3)3)
2,55 (s, 6H, C~3C=0)
2,28
(m,
4H, C~2C=0)
2,00 (m, H20,
4H, 2 moles d'eau/l~cithine)
1,79 (m, 4H, C~2CH20)
l,57
(m,
4H, C~2CH2CO)
1,28 (m, autres (C~2))
IR :(CHC13)
cm- l
; 3500
(H20)
; 2920-2850
(lCH2)
1730 ( Il C=O)
; 1670 ( vCO arom.)
; 1600-1500
(vC=C arom.)
; 1580( Ar-O-)
; 1460-1420
( V CH2 ester)
; 1360 ; 1300 ; 1255 (II P02-asym)
1215;
1170
(VC-O-C)
;
1090 (VP02-sym).
SM
:IC (NH3), 70 eV, 140°C, mie: 918
(4)
;
862 (12, MH+);
848
(4, MH+-CH3); 820
(4, MH+-N(CH3)3+NH3 ou M-CH3C=0
802
(37)
; 696
(35, MH-P03 choline + 2H); 678 (100
;
MH-OP03CH2CH2N(CH3)3).542
(7)
; 527(14)
; 470
(26)
;
/
406
(64)
;392 (9)
:FAB(glyc~rol),
mie: 862,3 (14
MH+)
; 744,3
(2,4);
1
614,2 (1)
; 560,2 (4)
; 542 (3)
; 406
(3)
; 461,1-369- 277
et 185
(Matrice du glyc~rol); 184 (100, HOP04CH2CH2N(CH3)3)

---

-64-
4, 4'-carbonyl-di-ll-phénoxyuOOécanoate de méthyle 17
~;.."OH NaH)N(nBu)~
1
1
Me02 C(CH2ho 0'OrP0(CH2)'O C~ Me
; '
:-...
.....
1
1;,
:-...
° 14
° ~1. C;nHS..07 = 610,39
On
ajoute
par
petites
portions
0,81 9 (16,8 mmoles) de NaH à 50 %
dans l'huile minérale, sous léger courant
d'argon,à
100
ml
de
DMF
anhydre. Après 15 mn, on ajoute en agitant 3, 21 9 (15 mmoles) de
4,4'-dihydroxybenzophénone
14
et
0,55
9
(1,87 mmoles) d'iodure de
tétrabutylammonium secs. Après 15 mn supplémentaires
on
ajoute
5,48
9
(16,8
mmoles)
de
ll-iodo-undécanoate
de
méthyle.
L'agitation
énergique à température ambiante est .maintenue pendant
2
h
puis
on
procède
dans
les
mêmes conditions à une nouvelle addition de 0,81 9
de NaH, de
0,55
9
d'iodure
de
tétrabutylammonium
et
de
5,48
9
d'iodo-undécanoate
de
méthyle. Après une nuit,le mélange réactionnel
initialement jaune (coloration due
à
la
4,4'-dihydroxybenzophénone)
devient
incolore.
De l'eau glacée est additionnée,et la solution est
neutralisée par HCl IN. Le
précipité
formé
est
filtré
et
lavé
à
l'eau;
une
cristallisàtion
dans
THF
fournit 6,6 9 de cristaux F
108,5°-109°C : Rdt : 72 %.
CCM : Rf = 0,60 (hexane:acétate d'éthyle - 70:30)
RMN-IH (200MHz) CDC13
$
ppm :
7,80-7,76 (Syst A2B2, J=8,8Hz,
4H, H arom.ortho/CO)
6,96-6,92 (Syst A2B2' J=8,9Hz,
4H, H arom.méta/CO)
4,03 (t, J=6,5Hz,
4H, C~20 )
3,67 (s,6H, C~30)
2,31 (t,
J=7,5Hz, 4H, C~2C=O)
1,82 (m, 4H, C~2CH20)
1,62 (m, 4H, C~2CH2C=O)
1,31 (m, 24H,
(C~2)6)
RMN-13C (50MHz)
; CDC13
~ ppm
194,30 (19)
; 174,14 (2)
; 162,36 (13)
; 132,07 (16)
130,56 (15 ou 14)
; 113,85 ; 77,54-76,90 et 76,27
(solvant)
68,16 (12)
; 51,27
(1)
; 34,01 (3)
; 29,34 ; 29,22-29,05
(CH2)
; 25,89-24,85 (4* 5*)

---

-65-
SM
70 eV,
lE, 150°C, m/e:610 (100, M+); 592 (0,8)
; 579 (17
M-OCH3); 537 (15)
; 425 (7)
; 412 (14)
; 396 (4)
; 393 (6)
IR
CHC13
cm- 1 : 3020 (V =CH arom.)
; 2940 (V CH2)
1730
(V C=0{OCH3)); 1640
{VC=O
(Ar)); 1600, 1500 (II C=C)
1440 (V CH2crester); 1300 ; 1280 ; 1250 ; 1165 ; 1100 ; 925
850
u. V:
( À-max, e.)
CHC13 = (301 nm, 26.000)
A
calculé: % C
72,73
H
8,92
trouvé
%
C
72,70 ; H
9,07
Données
physiques
du
produit
16
(majoritairement
formé
lors
du
traitement direct
de 14 par 2 éq.de NaH 'et 2 éq. de 15)
0
HlC02C(CH2)I00'CYû0H
1"
CCM:
Rf: 0,26 (hexane:acétate d'éthyle - 70:30)
~~
RMN-1H (200MHz) b ppm:
pyridine-d6
COC13
8,02
7,76 (m, 4H, H arom. ortho/C=O)
7,20
6,95 {m, 4H, H arom. méta/C=O
5,08
6,01 (s, 1H échangeable 020, ~O-Ar)
4,03
4,03 (t, J=6,5Hz, 2H, C~20)
3,65
3,67 (s, 3H, C~30C=0)
2,34
2,32 (t, J=7,5 Hz, 2H, C~2C=0)
1,78
1,82 (m, 2H, C~2CH20)
1,64
1,3 {m, 14H,
(C~2)7)
SM
lE, 70 eV, m/e
412 (66, M+)
; 381 (10, M+-OCH3)
; 339 (11)
227 (11)
214 (100)
; 185 (9)
; 121 (90)
IR
(KBr)
cm- 1 . 3220
( V HO phénol)
.
, 2930-2850 ( JlCH2)
1735 {)I C=O (O CH3) ) ; 1620 ( JI C=O arom.)
;
1600-1500
,
.
( li C=C arom. ) . 1575( ary1 para éthéré)
;
1500 , 1430 ; 1300
,
.
1270 . 1250 ; 1180 , 1140 ; 1000-800
MA
Calculé %
C : 72,77
H
7,82
Trouvé
%
C
72,66
H
7,75

---

-66-
acide 4,4'-carbonyl-di-ll-phénoxyundécanoique 18
On chauffe à reflux pendant 5 h 2,14 g
(3,5
mmo1es)
d'ester
17
en
solution
dans
50
ml de potasse éthano1ique (5 % H20) 0,3 N et 50 ml
de THF. Le solvant est
évaporé
et
le
résidu
dissous
dans
l'eau.
L'acide
est
précipité
par
acidification à pH=l avec HC1 IN, filtré
et lavé à l'eau. La cristallisation dans le THF donne
1,88
g
de
18
sous forme de cristaux incolores; F
155°C. Rdt : 92 %.
CCM : Rf = 0,19 (CH2C12
: EtOH - 95 : 5)
RMN-1H (200MHz)
. (pyridine deutériée) b ppm
8,06-8,01 (m, 4H, H arom. ortho/C=O)
7,18-7,14 (m, 4H, H arom. méta/C=O)
5,9 (large, C02~ , H20)
4,00 (t, J=6,5Hz, 4H, C~20)
2,54 (t, J=7,4Hz, 4H, C~2C=O)
1,85 (m, 8H, C~2CH2C=O, C~2CH20)
1,38-1,22 (m, 24H,
(CH2)6)
SM
lE (70 eV),
140°C, mie :582 (28, M+)
; 564 (28, M-H20)
538 (26, M-C02)
; 523
(10, M-CH2COOH)
; 411 (3)
398 (4)
; 393 (10)
; 352 (4)
; 311 (8)
; 305 (6)
214 (100)
IR
(KBr)
cm- 1 ; 3060 (OH acide)
; 2940-2860 (1/ CH2)
1710 (IIC=Oacide); 1630 (LlC=Oarom.); 1605-1505
( 1/ C=C arom.)
; 1460 ; 1430 ; 1420 ; 1310 ; 1250;
1170 ; 1010
930; 855
750;
MA
calculé %
C
72,12
H
8,65
trouvé
%
C
71,96
H
8,83

---

2,2 '-(4, 4 '-carbonyl-ll-phénoxyundécanoyl)-bis (ljmYristoyl-
sn-glycéro-3-phosphatidylcholine 1.2
ole
Im-O C(CH 2),o °'CyJ0(CH2)10 CO-lm
•
1 ....
1
; '
~
DMAP
THF
° 23
-----~
Pr~liminaire :
Il
est
indispensable
que
les
solvants
et
les
r~actifs
soient
parfaitement secs. Le CHC13 utilis~
est priv~ d'EtOH
par
extraction
à
l'eau,
s~chage
sur
CaC12
une
nuit et distillation sur CaH2. La
mise en oeuvre de
cette
r~action
n~cessite
l'utilisation
de
deux
bicols.
Chacun
des
r~actifs
est
trait~
sans
transvasement
interm~diaire. Les s~chages et ouvertures sous
argon
se
font
à
la
rampe
à
vide.
Le
s~chage
est
effectu~ par dissolution dans THF à
chaud
(pour
le
diacide)
ou
par
sonication
à
40°C
(pour
la
lysol~cithine).
Le
solvant
est
~vapor~
sous
vide
en pr~sence de
toluène. Cette op~ration est r~p~t~e 3 fois et
le
s~chage
parachev~
à 50°C sous vide pendant 24 heures.
a) Formation de l'imidazolide
A
150
mg
(0,258
mmole)
de
diacide
18
s~ch~
comme
décrit
ci-dessus,
on
ajoute
100
mg
(0,62
mmole)
de carbonyldiimidazole
(CDI)
et 100 mg (0,82 mmole) de dim~thylaminopyridine(DMAP), puis
7
ml
de
THF.
On
agite
sous
argon
à
43°C pendant 3 h. La solution
devient limpide et donne la solution 1
V~rification de la formation de l'imidazolide: 23
On agite 1,4 ml de la solution 1 avec l ml
MeOH
sec
pendant
30
mn
à
temp~rature
ambiante. On v~rifie par CCM la disparition du
diacide et l'apparition quantitative du diester m~thylique.
Im·O C(CH2),o 0'CyJ0(CH2hOCO-lm
MeOH
1 .....
1
..
'"
~
o
23

---

-68-
b) R~action de couplage
On part de 600 mg (0,8 mmole) de complexe: (LL)2
(CdC12)3
~,
séchés
comme
d~crit
ci-dessus,et
dispersés dans 20 ml CHC13 par sonication
à 40 oC. Dans cette suspension,on transfère 5,6 ml
(0,2 mmole)
de
,la
solution
1
au
moyen d'une seringue. Le mélange hétérogène est agité
3 h à température ambiante par
sonication
puis
24
h
à
43°C
sous
agitation
magnétique.
L'imidazolide
résiduel
est
hydrolysé
par
addition de
quelques
gouttes
d'AcOH
aqueux
O,lN.
Après
addition
d'eau
le
produit
est extrait 3 fois au CHC13:MeOH (2:1) et la phase
organique est lavée
3
fois
avec
MeOH:H20
(1:1),
le
solvant
est
évaporé
le
résidu
est
dissous
dans
200
ml
de CHC13:MeOH:H20
(4:5:1) et passé sur résines échangeuses d'ions
IRC-50
et
A-2l
(20
ml).
Après
évaporation
des solvants, la séparation des produits est
effectuée par chromatographie sur silice.
Le
reste
de
diacide
est
élué
au
CHC13:MeOH:H20
(65:25:4)
ce
qui donne la Fraction l
; les
produits de monocouplage 24 et 25 élués au
CHC13:MeOH:H20
50:45:1
constituent
la
fraction II = 24 mg : Rdt : Il %. La lysolécithine et
le produit de dicouplage sont élués
avec
CHC13:MeOH:H20-40:50:l0
on
obtient
la
fraction
III.
La
fraction III subit plusieurs passages
succéssifs sur une colonne de LH-20
(longueur
=
27
cm,
diamètre
=
1,5
cm,
éluant
CHC13:MeOH
l:l)jusqu'à obtention de la lécithine
pure L2 89 mg ; Rdt : 29 %
CCM : Rf = 0,07
(CHC13
: MeOH : H20 -
65
: 25
4 )
RMN-lH (200 MHz)
CDC13 + MeOD
S ppm :
7,7
(d, J=8,8Hz,
4H, H arom.ortho/C=O)
6,9
(d, J=8,8Hz,
4H, H arom. méta/CO)
5 , 2 (m,
2 H, Hb)
4,4-4,2(m,
8H, Ha Hd)
4 , 00
(m,
8 H, Hc Hk')
3,68
(m,
4H, he)
3,2
(s, l8H, Hf)
2,87
(s,
solvant)
2 , 29
(m, 8 H, Hg Hg,)
1,75 (m,
4H, Hj')
l,56 -1,22(m, autres CH2)
0,85
(t, 6H, Hj)
SM
FAB(glycérol),
mie: 1482
(0,8
, MH2+)
; 1299 ;
1059
(0,6)
; 997
;
935
(1,8); 848 ; 530 ; 490
468
(40)
184
(100, HP04CH2CH2N(CH3)3).

---

-69-
UV
(X max ,E: ) : CHC13 (300 nm, 24.000)
MA
calculé % C: 64,02 %
H: 9,39
%
N: 1,89 %
trouvé
%
C: 62,38 %
H: 9,70 %
N: 1,83 %
~o
.
Données physiques de ~ :
....e,N·
9-
~
'-...~~:o (00
l '"
.... 1
0
~~'"
'"
~crH
CCM : Rf = 0,24
(CHC13:MeOH:H20 -
65-25-4)
RMH-'H (200 mHz)
CDC13 + MeOD ô ppm :
7,73-7,69 (d,
4H, H arom. ortho/C=O)
6,92-6,88
(d,
4H, H arom. ortho/C=O)
5 , 2 (m, 1 H, Hb)
4 , 4- 4 , 2 (m, 4H, Ha Hd)
4 (m, 6HHcHk')
3 , 5 (m, 2H, He)
3,33 et 3,17 (solvant)
3, 09 (s, 9H, Hf)
2, 24
(m,
6H, Hg Hg')
1,8 (m, 4H, Hj')
1,55-1,26 (m, autres CH2)
0,82 (t, 3H, C~3 myristoy1e)
.
o-~
0
Données physiques de 25 : Me'C~D:':o00
~
....
1
.Jl.-.~ .......... ~
"
0
CJ~~~~"""'"\\).-!
'"
~
Me
cr
CCM: Rf 0,30
(CHC13:MeOH:H20-65:25:4)
RMN-IH (200MHz)
; CDC13
<f ppm
7,79-7,72
(d, 4H, H arom. ortho/C=O)
6,96-6,92 (d,
4H, H arom. méta/C=O)
5 , 3 (m, 1 H, Hb)
4,37
(m,
4H, Ha Hd)
4,02-3,9
(t,
4H, C~20.Ar
m,
2H, Hc)
3, 87
(m,
2H, He)
3,55 (s,
3H, C~30C=O)
3,38
(s,
9H, Hf)
2,31 (m, 6H, Hg Hg')
1,81 (m, 4H, Hj')
1,25 (m,
50H, autres
(CH2))
0,87
(t, 3H, C~3 myristoyle)
SM
FAB 1046,5 (2, MH+)
: 848,4
(1)
682,3
468,2 (1,5)
381 (3)
319 (l,5)
: 184
(l00, HP04CH2CH2N(CH3}3)

---

-70-
Préparation en demi-grand à Gif sur Yvette
Des réception des produits leurs puretés ont
été
vérifiées
par
les
données physiques : F ,RMN.
-Préparation du Il-bromoundécanoate de méthyle Il :
Un
tricol
de
l
l
est
muni
d'une
arrivée
d'HBr, d'un agitateur
mécanique, d'un thermomètre et d'un réfrigérant surmonté
d'un
flacon
barboteur
et
d'une garde à CaC12. On charge dans le tricol 500 ml de
méthanol anhydre et 100 g (0,54 mole) de l'acide
Il-bromoundécanoïque
10.
Tout
en
maintenant
la
température
vers
10°C, l'acide bromhydrique est mis à barboter. Au
total
430
g
(5,3
moles)
d'HBr
est ajouté en 5 h pour obtenir la saturation. Le ballon
est fermé hermétiquement et conservé 48 h en chambre froide.
Il
y
a
précipitation
d'une
huile.
Le mélange réactionnel est ensuite-versé
dans l l d'eau glacée et extrait avec 3 x 800
ml
d'éther.
La
phase
organique
est
lavée
à
l'eau (3 x 200 ml)
jusqu'à pH neutre, séchée
sur Na2S04 et le solvant
est
évaporé
à
sec.
La
purification
par
chromatographie
sur
silice (2kg):éluant = CH2C12
Hexane -
50:50 (5
1) donne une huile jaune pâle :104 g i Rdt : 97 %.
-Préparation de 12
l ballon
de
500
ml
est
équipé
d'un
agitateur
mécanique,
d'un
thermomètre,
d'une
ampoule
à
brome,
d'une arrivée d'argon et d'un
réfrigérant
surmonté
par
une
garde
de
CaC12.Dans
ce
ballon,on
dissout
15g
(0,110
mole)
de p-hydroxyacétophénone l
dans 115 ml de
DMF, sous argon et sous agitation. La
solution
obtenue
est
limpide
et
de
couleur
violette. Puis par petites portions, en maintenant la
température entre 15-20°C,on ajoute 4,73 g (0,109 mole) de
NaH
50
%
en
15
mn.
On
lai se
réagir
20
mn,
et
32,3
g
(0, 116 mole) de
bromoester Il et 32,3 g (0,215 mole) de NaI anhydre sont
ajoutés.
Le
mélange
hétérogène
est
agité
énergiquement
à température ambiante
une nuit
puis environ l
l d'eau froide
est
ajouté
et
le
pH
est
ramené
à
la
neutralité
par
addition
de
quelques gouttes HCl IN.
Après extraction à l'éther(6 x 500 ml) et
évaporation
du
solvant,on
obtient
un
produit solide (42 g) qui est recristallisé dans MeOH(2 x
300 ml)ion obtient
33 g de cristaux incolores. F = 76°C.
Rdt
90%.

---

-71-
-Pr~paration du ll-iodound~canoate de m~thyle 15
Dans
un
tricol
de
2
1
muni
d'un
agitateur
m~canique
et
d'un
r~frig~rant
surmont~
d'une garde à chlorure de calcium, on introduit
70 g (0,25 mole) de bromound~ca~oate de m~thyle Il ,800
ml
d'ac~tone
et
122
g
(0,8
mole) de NaI anhydre.Après 5 h de r~flux, le m~lange
r~actionnel est laiss~ reposer 1 nuit
à
temp~rature
ambiante,
puis
filtr~
et
le
solvant
est
~vapor~.
Le r~sidu obtenu est repris à
l'~ther (300 ml), lav~ à l'eau(2x 250 ml), -au
thiosulfate
de
sodium
5
%(lx
300
ml)
et
ensuite
à
l'eau(lx 300 ml). Après s~chage sur
MgS04, la phase organique est ~vapor~e et le
produit
est
s~ch~
par
~vaporat~on au
toluène
(50
ml).
On
obtient
79,5
g
d'une huile
orang~e : Rdt : 98 %.
-Pr~paration de 17
1 ballon de 1 1 est ~quip~ d'un
agitateur
m~canique,
d'une
arriv~e
d'argon,
d'un
thermomètre,
d'une
ampoule
à
brome
et
d'un
r~frig~rant. Sur 470 ml de DMF, on ajoute par petites portions
3,8
g
(0,07
mole)
de
NaH
50
%.
Après
15
mn d'agitation à temp~rature
ambiante 15 g (0,07 mole)
de
4,4'-dihydroxybenzoph~none 14
et
2,6
(0,007mole)
de
(nBu)4NI
sont rajout~s. On laisse r~agir 15 mn et on
rajoute 25,6 g
(0,078
mole)
de
ll-iodound~canoate de
m~thyle
15
goutte
à
goutte,
sous
agitation
pendant
2
h 30 mn à temp~rature
ambiante.Au milieu r~actionnel on ajoute :
· 3,8
g de NaH en 10 mn
· 2,6
g de (nBu)4 NI en 10 mn
· 25,6 g d'iodoester 15 en 10 mn
Après une nuit d'agitation, on ajoute 400 ml d'eau
glac~e
et
le
pH
est
ramen~
à
7
avec
HCl
IN.
La
filtration et le lavage à l'eau
suivis de deux recristallisations dans 500 ml de THF donnent 40
g
de
cristaux incolores. F : 109°C . Rdt : 94 %

---

-72-
REFERENCES
1. V. BOHMER, F.SCHNEIDER, K. FUKUYAMA et S. FUJII
Monatsh. Chem., 116, 1419-1432
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Cyclic esters of aliphatic diacids with pyrocatechol and
hydroquinone.
2. R.ADAMS et L.H. ULICH
J. Am. Chem. Soc., !l, 599-611 (1920).
The use of oxalyl chloride and bromide for producing acid
chlorides and acid bromides
or acid anhydrides III.
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Aldrichimica Acta, l i ' 267-274 (1981)
Bromotrimethylsilane and iodotrimethylsilane versatile reagents
for organic synthesis.
4. G.A. OLAH et S.C. NARANG
Tetrahedron, ~ , 2225-2277 (1982)
Iodotrimethylsilane - A versatile synthetic reagent.
5. G.M. BENNETT et F.M. REYNOLDS,
J. Chem. Soc., 1935, 131-141
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an alcohol with hydrobromic acid.
6. E. TOMMILA et C.N. HINSHELWOOD
J. Chem. Soc.,1938, 1801-1810
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of substituent influences in ester hydrolysis.
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8. A.C. GRIFFIN et S.J. HAVENS
J. Polym. Sei. Polym. Phys. Ed., ~, 951-969 (1981)
Mesogenic polymers.III. Thermal properties and synthesis of three
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---

CHA PIT R E l l l
----------------------
f, P H Y SIC 0 CHI MIE E T P HOT 0 CHI MIE
DES
r
P:H 0 S P H 0 L l P IDE S
P H O'T 0 SEN S l BLE S

---

-79-
INTRODUCI'ION
cœme cela a été indiqué dans le chapitre I,
les
études
physicochimiques
des
vésicules. unilamellaires canposées de phospho-
lipides tels DMPC, DPPC, DPhPC et la lécithine du
jaune
d'oeuf
avec
différents
additifs
(stérols,
carot~oïdes et leurs précurseurs),
ont été dévelq:pées dans
notre
laboratoire,
ces
dernières
armées.
Des
techniques
de préparation, de purification et de caractérisation
de ces vésicules, IOOdèles siIrplifiés
des
membranes
naturelles,
ont
été mises au point par P. BISS:E:RF1' et A. MIIDN (l, 2) .
Un
but
iIrportant
de
ces
études
était
d'étudier
la topologie de
carot~oïdes 0(., w -dihydoxylés dans
les
bicouches
lipidiques.
LI utilisation
de
teclmiques
différentes, en particulier l'étude des
spectres W-visibles et
des
dichroïsmes
linéaire
et
circulaire
a
permis
de
prouver
l'insertion
d'une
telle
molécule
de
manière
transmembranaire, perpendiculaire à la surface de la bicouche.
Avant d'utiliser les lécithines
photosensibles
synthétisées
canne
sondes
pour
explorer l'intérieur des bicouches lipidiques, il
était primordial de vérifier également la topologie de
ces
molécules
une
fois
incorporées
dans une bicouche lipidique et de retrouver la
prq;>riété d'organisation spontanée lors d'une diSPersion
dans
l'eau.
L'étude
physicochimique
des
sondes,
en
particulier
la
sonde
transmanbranaire,
a
constitué
finalement
l'essentiel
du
travail
avant
qu'un
élargissement
des
études sur un systàne ten1ai.re DMPC,
sonde, additif (stérol ou carot~oïde) ait pu débuter.
Nous avons utilisé des techniques
déjà
mises
au
point
au
laboratoire
pour
préparer
les
vésicules
et
les caractériser. Les
techniques seront décrites dans ce chapitre.
Les résultats obtenus avec la
sonde
photochimique
de
même
longueur
qu'une
rnonocouche
Ll
seront
présentés rapidement du fait
qu'il s'agit d'une
sonde
classique
ccmne
celles
qui
avaient
été
synthétisées
par
Khorana
(Chap.
I.,
paragraphe 1.1), mais avec un
groupe photosensible différent.
o
i f

---

-80-
La sonde photosensible L2, par son originalité
méritait
une
étude
approfondie.
Il
était
nécessaire de chercher à répondre à un
certain nanbre de questions :
1. La sonde fonne-t-elle des vésicules qu'elle soit pure ou en
mélange avec du DMPC ?
2. L'incorPOration de cette sonde dans une vésicule est-elle quan-
titative ou existe-t-il un taux d'incorPOration maximum ?
3. Y a-t-il miscibilité totale entre le DMPC et la sonde?
4. Quelle est la perturbation apportée par la sonde à une vésicule
de DMPC ?
L2
Panni
les
différentes
techniques
pennettant
d'étudier
l'interaction
entre
deux phospholipides différents dans une bicouche
lipidique, nous avons choisi deux
approches
différentes
et
canplé-
mentaires :
- la spectroscopie d'absorption visible était réalisable sur les
susPensions de vésicules du fait que nos sondes possèdent un
chrarophore sur une de leurs chaînes acyles.
- La microcalorimétrie différentielle pennettait de vérifier si
les sondes fonnent des bicouches lipidiques et dans le cas de
mélanges avec du DMPC, elle donnait une information sur la nature
des phases du mélange des deux lipides et notanment pennettait de
préciser s'il Y a miscibilité ou pas.
Cette
technique
a
été
larganent
utilisée
dans le cas de
phospholipides à chaînes mixtes.
L'accès
limité
au
microscope
électronique
nous
a
juste
pennis de vérifier la formation de vésicules avec la
sonde
transman-
branaire
en
mélange
avec du DMPC. Tous ces résultats seront présen-
tés sous la fonne d'une publication, telle qu'elle sera soumise.
Nous
aborderons
égalanent
l'analyse
des
produits
de
photochimie
de
la
sonde
transrnanbranaire,
ce
qui
n'est
qu'un
résultat préliminaire.

---

-81-
1. TEX:HNI~ DE PREPARATION El' DE CARACI'ERISA'roN
DES BICOUCHES LIPIDIQUES
1.1
Pr~ation
1.1.1 Vésicules multilamellaires ou liposomes
Les structures appelées
MIN
(multilamellar
vesicles)
fonnent
un
empilement
concentrique
de bicouches lipidiques (association "en
oignons" ). Nous les avons utilisées essentiellement pour
les
mesures
de transitio~ de phases (TIn, âH) et les essais de photochimie.
Figure l
: représentation de liposanes
Les MIN sont préparées de la manière suivante (3)
- addition d'eau sur un fin film de lipide,
- hydratation de ce film par incubation à une température
supérieure d'environ 100e à la température de transition
de phase du lipide utilisé,
- dispersion par agitation à l'aide d'un agitateur à tour-
billon.
Les
liposomes
obtenus
sont utilisés tels quels pour les différentes
études.
1.1.2 Vésicules unilamellaires
Trois méthodes
principales
existent
pour
la
préparation
de
vésicules :
- la méthode de sonication (4) fournit des petites vésicules
appelées SUV (small unilamellar vesicles), de taille cc::rrprise
o
entre 200 et 500 A ;

---

-82-
- la méthode d'injection à l' ~ther (5) pennet d'obtenir des
grosses v~sicules, de taille canprise entre 600 et 1200 Â
appel~s IlN (large unilamellar vesicles);
- la méthode de phase inver~e fournit de plus grandes
v~sicules : RE.V (reverse ether vesicles) (6 ) ; les diamètres
o
sant de l'ordre
de 1500 à 2000 A.
Figure 2 : repr~sentation d' une v~sicule unilamellaire
Gén&alanent, suivant la taille d~sir~ de v~sicules, l'une
ou
l'autre
de
ces
méthodes
est
utilisée.
Pour
notre
Part, nous ne
décrivons que la technique de sonication que nous avons
choisie
pour
préparer
nos
v~sicules. Les autres m~thodes de préparation ne
peuvent être appliqu~s à nos sondes en raison
de
leur
insolubilit~
dans
les
solvants
organiques
tels
que l' ~ther, l' ~thanol, l' ~ther
isopropylique.
ra préparation par sonication consiste à
obtenir
tout
d'abord
un
film
sec
de lipide au fond d'un ballon rond. L'hydratation de ce
film par addition
d'un
tampon
fonne
des
liposanes.
Soumises
aux
ultrasons
à
l'aide
d'une sonde de titane, ces structures se cassent
et fonnent des StN. Le tampon de pH8 utilis~ est
le
Tris,HCl
10
mM
additionn~
de
NaN3 5mM, de EDTA.Na2 l mM. Un paramètre important est
la
t~ature de
la
solution
au
cours
de
la
sonication.
Les
ultrasons produisent une ~lMtion de
température
de
la
solution,
qui
est
dans
notre cas supérieure à 40°C, ce qui est suffisant pour
que les
systèmes
que
nous
avons
pr~~s soient dans
la
phase
"cristal liquide" cœme nous le verrons ult&ieuranent.
Nous
avons
utili~
le
sonicateur
Branson
SONIFIER
cell
disruptor roo muni d'une micrcrsonde en alliage de
titane.
Le
temps
de
sonication
a
~t~ g~&alanent de 90 mn, en s&ies pulsées. Le
dispositif expérimental est schénati~ sur la figure 3.

---

-83-
SONDE en alliage de Titane
,
,
\\"\\i...
~.." .~~ ,
•
J •
....,. .
. .1.'.
~l
~_OiJt------BALLON de 10 ml
BALLON d'Argon
~~-~~LIPIDES + TAMPON
10 mg
/
10 ml
,
. •,
-
4nm
Figure 3
Préparation de vésicules par sonication

---

-84-
1.2 Purification
Les techniques de purification ont ~t~ appliqu~s uniquement
aux
préparations de v~sicules.
1.2.1 La filtration sur polycarbonate
Les
filtres
de
polycarbonate
sont
constitu~s de manbranes de
polycarbonate,
avec
des
pores
de
diamètres
précis.
Ces
pores
cylindriques
de
taille bien dMinie sont obtenus par banbardement de
la rnanbrape avec des ions lourds. Les tailles disponibles
varient
de
0.01 pm à 12.0 pm.
Nous
avons
utili~ les
fil tres
de
porosit~
0,8,
0,4
et 0,2 pm
successivement. Les échantillons sont filtr~s deux
fois
sur
chaque'
filtre.
Papadjopoulous
a
IOOIltr~ que,
lors
de la filtration d'une
solution de v~sicules au
travers
de
ces
rnanbranes
poreuses,
les
v~sicules peuvent
se
casser
et
prendre
la
taille
des pores des
filtres. Des filtrations successives sur des filtres
de
diamètre
de
plus
en
plus
petit
pennettent
d' hanogénéiser
une
population
de
v~sicules (7).
Pour
nos
SUSPensions
de
v~sicules issues d'une
sonication,
la
filtration sur polycarbonate
pennet
en
plus
d'~liminer le titane
introduit par la sonde d' ultrasons.
1.2.2 La filtration sur gel
Plusieurs
types
de
gels existent sur le marché. La filtration d'une
solution au travers de
ces
gels
pennet
de
s~parer les molécules
suivant
leur
taille
ou
leur
poids
moléculaire. L'utilisation des
gels dans le cas de suspensions de v~sicules pennet
de
séparer
les
v~sicules
unilamellaires
des
v~sicules multilamellaires et des
microagr~ats. En outre,
certains
gels
cœme
le
Séphacryl
81000
pennettent
d'obtenir
des
fractions de v~sicules hanogènes en taille
(8). Nous avons rœlis~ nos filtrations sur le 8~pharose 4
B-CL
(2);
ce
gel
pennet
de
séparer
des
v~sicules dans
la
garnne de rayon
corresporrlant à celle de nos pr~parations.

---

Il est nécessaire de ccmnencer par concentrer la
solution.
Ceci
est
rœJ.isé
à
l'aide
d'une
cellule d'ultrafiltration avec une manbrane
PM 10 (AMICON) qui ne
laisse
pas
passer
les
particules
de
poids
moléculaires
supérieurs
à
10.000
MW.
La.
solution,
généralement
concentrée de 10
ml
à
2
ml,
donne
une
concentration
finale
de
l'ordre
de
5
mg/ml ; elle est d4x>sée sur une colonne de gel 4B~.
.les caractéristiques de la filtration sont les suivantes:
température
4°C,
volume d'exclusion
30 ml,
vitesse
: 40 ml/h,
fractions de
4 ml.
Une présaturation de la colonne avec une fraction de la
suspension
à
filtrer
est
néCessaire
pour
éviter
une trq> grarrle absorption des
vésicules sur le gel lors de la filtration.
Ces étapes de purification sont
nécessaires
avant
l'étude
par
les
SPeCtres
lN
ou
la
microscopie
électronique.
La.
stabilité
des
solutions gardées à température ambiante est d'une sanaine environ.
1.3 caractérisation
1.3.1 La. microscopie électronique
cette technique pennet
• de vérifier la nature d'une suspension aqueuse (vésicules
rm.ùtilamellaires ou unilamellaires)
· de mesurer la taille des particules
• de visualiser l' haoogénéité des vésicules dans le cas de SW.
Nous avons
utilisé
la
technique
sinple
et
rapide
de
coloration
négative
avec
le
molybdate
d' amnonium
ccmne
colorant.
.les
échantillons ont été analysés par Mlle Miehé au Centre
de
Neurochimie
de
Stras1:x>urg.
.le
noie
cçératoire
adopté
sera
décrit
dans
la
publication qui suit.

---

-85-
Il est nécessaire de ccmnencer par concentrer la
solution.
Ceci
est
réalisé
à
l'aide
d'une
cellule d' ultrafiltration avec une manbrane
FM 10 (AMIOON) qui ne
laisse
pas
passer
les
particules
de
poids
moléculaires
supérieurs
à
10.000
MW.
ra solution, généralement
concentrée de 10
ml
à
2
ml,
donne
une
concentration
finale
de
l'ordre
de
5
m;/ml ; elle est déposée sur une colonne de gel 4B-eL.
les caractéristiques de la filtration sont les suivantes :
température
4°C,
volume d'exclusion: 30 ml,
vitesse
40 ml/h,
fractions de
4 ml.
Une présaturation de la colonne avec une fraction de la
suspension
à
filtrer
est
nécessaire
pour
éviter
une trq;> grande absorption des
vésicules sur le gel lors de la filtration.
Ces étapes de purification sont
nécessaires
avant
l'étude
par
les
spectres
lN
ou
la
microscopie
électronique.
ra stabilité des
solutions gardées à température ambiante est d'une sanaine environ.
1.3 caractérisation
1.3.1 ra microscq:>ie électronique
cette technique pennet
· de vérifier la nature d'une suspension aqueuse (vésicules
multilarnellaires ou unilamellaires)
· de mesurer la taille des particules
· de visualiser l'haoogénéité des vésicules dans le cas de StN.
Nous avons
utilisé
la
technique
siJrple
et
rapide
de
coloration
négative
avec
le
molytXlate
d'anmonium
cœme
colorant.
les
échantillons ont été analysés par Mlle Miehé au centre
de
Neurochimie
de
Strasbourg.
le
roode
q;>ératoire
adopté
sera
décrit
dans
la
publication qui suit.

---

-86-
1.3.2 La microcalorimétrie différentielle
a) Transition de phase d'une bicouche lipidique
Les bicouches phospholipidiques peuvent exister sous deux formes
différentes :
. A basse température, les molécules sont dans une phase
dite "gel" où les chaînes hydrocarbonées sont parallèles
et toutes trans : le systàne est fig~ (figure 4 A).
. Aux températures ~levées, les chaînes hydrocarbonées
sont mobiles et le systàne est fluide : c'est la phase dite
"cristal liquide" (figure 4 !!).
Le passage d'une phase A à une phase B se prcx:1uit à une tan-
-
-
pérature critique 'nn, ~valente à une fusion. ce phénanène
est endothennique. Les valeurs de la chaleur absorbée par mole
de lipide 4H en KJ/mol., et de la température de transition de
phase 'nn sont caractéristiques d'un phospholipide donn~.
TRANSITION
PRETRANSITION
PRINCIPALE
1717m7mnm7;717d;
'N1//I7I7//I'''/J
rUPtiPt/taVPtlPPPPP -+ !!1I///7IJ1]////;VI/I 1j~/11
h
-+
1/{/{/I/I/I/VtI"
l'fil/II
"gel"
"cristal liquide"
A
B
Figure 4
Transition de phase d'une bicouche lipidique
b) Principe de la microcalorimétrie différentielle (9)
La microcalorimétrie différentielle M:D est une technique de
haute sensibilit~ pennettant l'analyse directe de la t~
rature de transition de phase 'nn et la mesure du  H d'une
bicouche lipidique donnée.
Les mesures sont généralement r~isées sur des susPensions
de MLV dont la pr~ation a ~t~ dOCr'ite auparavant. Elles
consistent à chauffer simultanénent, à la mêne vitesse, un
~tillon de suspension de MLV et une rMérence d'eau.

---

-87-
Durant l' échauffanent progressif, les tarpératures augmentent
linéairanent. Au niveau de 'lln, la suspension de vésicules ab-
sorbe de la chaleur pour la fusion des chaînes hydrocarbonées
l'appareil doit fournir plus de chaleur à l'échantillon pour .
maintenir l'équilibre de tanpérature avec la référence. Pour ce
phénanène endothermique, l'appareil enregistre l'excès de cha-
leur spécifique en fonction de la t~ature : graphiquanent
on obtient \\.ID pic étroit et s~trique dont le milieu est 'lln:
la surface représente l'enthalpie de transition ~H.
LU
Tm
::l
2
Ile
~
(j
~
en
S
LU
...
Endothennique
«
::
(J
~
en
r
~
)(
LU
TEMPERATURE
Figure 5 : Variation de l'excès de chaleur spécifique
en fonction de la t~ature d'une suspension de
bicouches lipidiques
Note : Dans certains cas on obsexve, à
une
tarpératue
inférieure
à
'lln,
une
prétransition
Tp.
L'analyse
en
microscopie
électronique
après
cryodécapage
a montré l' apparition d'une structure ondulée des
vésicules au niveau
de
Tp.
Ce
pic
n'est
décelable
que
sur
des
appareils très perfectionnés.
c) Facteurs de variations des paramètres de la transition de phase
Plusieurs facteurs pelNent influencer 'lln et ~H d'une bicouche
lipidique:
* La fonne de la bicouche
La taille de la vésicule influence les paramètres 'lln et ~H:
en effet, dans le cas de petites vésicules, le rayon de courbure
est très faible, les chaînes hydrocarbonées sont plus proches et
sont dans une confonnation "tout trans". 'lln et AH se trOlNent
diminués. Mais cette variation est faible (11). En général, les
mesures de KD sont réalisées sur les MIN; dans ce cas la bicouche
est sous fonne "quasi-plane".

---

-88-
* ra nature du phospholipide utili&§
dans les exarples de la littérature, il est cormu que 'lln et â H
augmentent avec la longueur de la chaîne hydrocarbonée (12).
Phospholipide
nanbre de carbone de
'lln (OC)
âH
KJimal.
la chaîne hydrocarbonée
14
23,6
27,6
DPPC
16
41,3
38,1
DSPC
18
58
44,7
Tableau 1 : Exarples de 'lln et de
H
de quelques phospholipides en diSPersion dans l'eau
· L'introduction d' insaturations cis ou de ramifications sur la
chaîne hydrocarbonée diminue la tarpérature de transition de
phase (13,14).
• La diphytanoylphosphatidylcholine et les lipides archébactériens
transrnanbranaires ne présentent pas de transition de phase (15).
· les phosphatidyléthanolamines ont des 'lln plus élevées que leurs
haooloques à têtes polaires phosphatidylcholine.
* Incorporation dans les bicouches d'additifs rigides
L'incorporation d'un additif (stérols, caroténoïdes ou protéines
dans une bicouche de phospholipides, diminue la tarpérature de
transition de phase du phospholipide utilisé lorsqu'il y a une
borme solubilité de l' additif dans la bicouche, et diminue le
caractère abrupt de la transition (danaine de transition).
le mélange lécithine-cholestérol a été larganent étudié et a
révélé l'effet renforçateur du cholestérol dans une manbrane.
le cholestérol élargit la transition de phase et diminue l'en-
thalpie âH quand il est soluble dans un phospholipide. Quand il
est insoluble, la courbe de Iv(!) reste :inchangée, avec un pic
aigu (16).
* MtUange de phospholipides (13)
wrsque l'on mélange deux phospholipides de nature différente
dans une bicouche lipidique, deux cas se présentent :
a) Il Y a miscibilité totale de ces deux lipides et on observe
sur les SPectres de Iv(!) un pic dont la tanpérature de transition
de phase se situe entre celles des deux lipides purs.
Cela est observé pour des lipides de structures assez proches.

---

-89-
b) Il Y a "séparation de phasesl1 car les deux lipides ne sont pas
très miscibles. On observe alors deux transitions de phases cor-
pondant chacune à un des lipides. Ces valeurs de 'Th! sont plus ou
moins mcx:lifi~s suivant le degré d' imiscibilité des deux
lipides •
. Dans le cas d'un mélange mixte de phospholipide long, et de
phospholipide court ayant la mâne tête polaire, il y a
séparation de phases quand la différence du nanbre de carbo-
ne des chaînes grasses dépasse 4 unités (17). Cela revient
égalanent au cas des deux phospholipides ayant des TIn très
différents; il se produit alors une séparation de phase.
Nous pouvons citer un exanple de Khorana (18): le mélange
équimolaire de DPPC avec PC l donne deux transitions de phase
sépar~s qui montrent la coexistence de deux phases :
G.
b.
PC l
10
20
30
40
:l0
r.m".,.'",. (Oc1
Figure 6
Exanple de séparation de phases dans une bicouche mixte.
Dispertions aqueuses de PC l (a), DPPC (b), PC I/DPPC
(1/1
: mo l . /mo l .)
(c)

---

-90-
1.3.3 Etude des spectres UV
L'utilisation de
propriétés
spectrales
de
molécules
pour
étudier
leur
incorporation
dans une bicouche lipidique est bien connue. ÇaIIne
nous venons
de
le
voir,
la
transition
de
phase
d'une
bicouche
lipidique affecte peu la structure "macroscopique" de la bicouche.
Le passage des chaînes hydrocarbonées d'un ordre à un désordre
crée les changanents suivants (13) :
- diminution de l'~sseur de la bicouche,
- augmentation de l'aire par molécule et du volume total,
- diminution de la microviscosité,
- augmentation de la penœabilité à l'eau et aux ions.
Le
changement
de
fluidité
des
chaînes
lipidiques
influe
nécessairanent sur tous
les
phénanènes
sensibles
à
la
nature
du
milieu,
par
exanple
sur
l'absorption
UV
ou
visible,
sur
les
dichroïsmes, sur la
RMN,
etc.
Ce
changanent
peut,
ou
non,
être
décelable
par
les
méthodes disponibles et dans les cas positifs, on
observe
un
changement
sigmoïde,
caractéristique
de
phénanènes
coopératifs,
dont
le
point d'inflexion se situe au niveau de 'nn. De
tels changanents ont été observés
dans
les
spectres
UV-visible
de
caroténoïdes
incorporés
dans
une
bicouche phospholipidique (2), et
dans le spectre
de
OC
d'un
phospholilide
porteur
du
chranc::çhore
azobenzène
incorporé
dans
une bicouche de lécithine de jaune d'oeuf
(19).
Pour notre part, après incorporation de la
sonde
dans
une
bicouche
lipidique
de
DMPC,
nous
avons
enregistré
le
spectre
UV
de
la
SUSPension
de
vésicules à différentes tarpératures. La transition de
phase peut être dénontrée par la
variation
brutale
de
la
longueur
d'onde
d'absorption
maximale
du
chranc::çhore
de
la
benzophénone,
d'une
valeur
corresp0rx3ant
à
l'état
aggrégé,
vers
une
valeur
correspondant à l'état IOOIlanérique et
équivalent
au ).. max
dans
un
solvant
peu
polaire.
L'appareillage
utilisé
sera
décrit
dans la
publication.

---

-91-
2. PHOSPHOLIPIDE MIX'IE DE IDNGUE1JR D'UNE MONOCŒJCHE
RESULTATS
La lécithine Ll
est
un
phospholipide
"classiqueIl
possédant
en
position w de
la
chaîne acyle, elle mâne en position 2 du glyœrol,
un groupement p-alcoxyacét~hénone.
o
-er
Ll
les
suspensions
de
vésicules,
préparées
par
la
méthode
de
sonication,
ont
été caractérisées par microscopie électronique après
coloration négative au
zoolybdate
d' amoonium.
les
clichés
zoontrent"
que
l'on
a
des SUV pratiquanent hanogènes en taille, de rayon moyen
500 .± 50 A (figure. 7). La M:D de
cette
suspension
de
vésicules
fait
apparaître
un
pic étroit à 33°C correspondant à une transition
de phase gel-cristal liquide classique (figure. 8).
Tm
•
• • tî O·o
.. ..
;..A
o 6
JO
•
J'
•
•
(}
Figure 7
Microscope électronique
Figure 8: Thennogramne en M:D
(coloration négative)
Suspensions de vésicules de Ll

---

-92-
ces résultats nous montrent
que
l' intrcxluction
d'un
noyau
phényle
n'empêche
pas
la
fonnation
de
vésicules. La bicouche lipidique est
plus stable thenniquanent qu'une bicouche de DMPC
mais
moins
stable
qu'une
bicouche
de
DPPC ('lln I:l-1PC < 'lln U < 'lln DPPC); cela satisfait
notre choix de départ d'un
groupanent
photosensible
porté
par. un
noyau
phényle
pour
le
rigidifier
et
atténuer
sa
mobilité
transversale.
L' activation
photochimique
de
cette
molécule
n'a
pas
pu
être
réalisée
avec
l'appareillage
dont nous disposions. La longueur d'
onde d'absorption maxilnale du groupe aœtcçhénone est en effet
À =274 nm et la lampe de mercure utilisée irradie à
À =300nm.

---

-93-
3.
PHOSPHOLIPIDE TRANSMEMBRAIRE
3.1 Etude physicoch.im:ique
Dans ce paragraphe, nous présentons
les
résultats
obtenus
avec
la
lécithine L2 sous la fonne d'une publication.
Article provisoire à soumettre à : Biochimica Biophysica Acta
(partie physicochiroique)
Physioochanica.l Properties of a Synthetic Transmembrane
Phosphatidylcholine
: A l-biel Photoactivatable Manbrane-Spanning Lipid
A phospholipid
3,
carrying (i) a transrnerobrane chain with a
-
photoreactive
group
(benzophenone)
in
the
central
part,
(ii)
two
myristoyl
d'lains
and
(iii)
two
polar head-groups (phosphatidylcholine)
has been synthetized.
The organization of IDixtures of this
d., W -dipolar
phospholipid
and
dimyristoylphosphatidylcholine
(DMPC)
was
studied
in
bilayer
systans.
The
fonner, a minù.c of an archaebacterial lipid, has a
molecular length approxilnately equivalent to
the
thickness
of
the
DMPC
bilayer.
The
fonnation of vesicles fran mixtures of lipid 3 and DMPC was
-
achieved.
The
topology
of
3
in
the
mixed
vesicles
was
studied
by
-
ultraviolet
absorption
of
the
benzophenone
chranophore
in 3, which is
-
sensitive to solvent effect.
The chranophore of molecule
3
is
situated,
-
above
'Dn
in a typical lipidic environrnent and the molecule is oriented in
a transrnembrane manner in the mixed vesicles.
Thus, canpound 3
is
really
-
a
rnanbrane-sPanning
molecule.
The thennal prOPerties of canpound 3 were
-
studied
in
multilamellar
disPersions
by
differential
scanning
calorimetry.
The
dispersions of the pure substance undergo a sharp phase
transition at 51°C with an enthalpy change of aOkJ/mol.
In mixtures
of
3
-
with
DMPC,
one obtains mixed phases at temperatures higher than the phase
transition.
The miscibility of canpound 3 with DMPC in the
gel
state
is
very low.
-

---

-94-
INl'RODUCI'ION
Cholesterol
reinforces
each
half
of
the
bilayers
in
eucaryotic menbranes (Fig. l, Type A); it is hCMever
usually' not
present
in
prokaryotes,
where
i ts
mechaniœl
rôle
is
played
by
surrogate
polyterPene derivatives, which we have postulated to
fonn
a
phylogenetic
series
(1) •
Tlùs
canprises,
in
a fonn very similar to cholesterol, the
Pentacyclic triterPenes of the hopane family
(2,3) .
We
have
postulated,
and
confinned
the
menbrane
reinforœment
by
d.,lA> -dipolar carotenoids
(Type B), which are localized, as expected, across
the
membrane
(4 )
and
stabilize
bath
halves
of
the
bilayer
at
the same time (5). '!he third
(Type C)
of
membrane
organization
is
the
assembly
of
ri., w -dipolar
manbrane-spanning
!OOlecules,
such
as
di-bisphytanyltetraethers (two C40
chains; for example, structure 1
in
Fig. 2) ,
which
have
been
found
in
archaebacterial
lipids
(6).
-
Tlùs assembly has been extensively studied by
the groups of King et al. (7), of De Rosa et al. ( 8 )
(thenrotropic
studies)
and
of
Luzzati
et al. (9) (phase diagrams of lipid-water systans). One of
the !oost striking results obtained with
these
lipids
is
the
very
high
fluidity of the "IOOIlolayer", canbined with its high intrinsic stability.
(}:::::::::::
Phospholipids
(}:::::: : :::::::::D Membrane-spanning
Lipids(Archaebacteria)
()::::::::: ::::::::=::{J
•
Cholesterol or Hopanoids
Il
••- - - - . . .
d , w-Dipolar Carotenoids
A
B
c
D
Fig. 1 : Different Types of M:!nbrane Lipids Organization
A
recent
structural
investigation of archaebacterial lipids
has disclosed another type of lipid, 2 (Fig. 2); assembly of
the
!OOlecule
2 gives type D in Fig. 1 (10)*.
-
-
* In archaebacteria, in particular in Halobacterium, exist of course
aIse diphytanylglycerylethers (two C20
chains,
half
length
of
bilayer)
(lI) .
We
have
recently
discussed
sare of the properties of diphytanyl-
glycerylphosphatidylcholine with d-,w -dipolar carotenoids (12).

---

-95-
Fig. 2 : Structures of dialkylglyœryltetraether
1
and
trialkylglyceryl-
tetraether 2, the backbones of archebacterial lipids.
r-blecule
2
has
a unique structure : (i) a manbrane-spanning
chain (the bisphytanyl -
group), (ii)
two
phytanyl
chains
and
(iii)
two
polar' head-groups
(glycerol
derivatives).
The synthesis of this tyPe of
canpounds or
analogues
has
been
recently
achieved
by
the
groups
of
Kunitake
et
al.
(13) ,
of
Ringsdorf
et
al.
(14) ,
and
of Schreiber,
Richards et al. (15). However, physicochanical properties of
the
.assanbly
(Type D) have not yet been described.
we descri.be now our preliminary observations about
sane
biophysical properties of such an organization, that of a synthetic el, (,1)-
dipolar
phospholipid
3,
which
carries the structural elanents described
above and also a
-
photoreactive
functional
group
on
transrnanbrane
chain
(Fig. 3) (16).
Fig. 3 : Structure of synthetic transrnanbrane phospholipid 3
The
choiœ
of canpound 3 was justified by our plan to use it
as a photochemical probe of the
-
topology of the
interior
of
phospholipid
bilayer.
Therefore,
it was at first required to study its properties in a
bilayer system with I:MPC.
MATERIALS AND Mf:l'fDDS
Materials.
I:MPC
(Sigma,
USA)
was
used
as
purchased.
This
chanical
migrated
as
a
single
spot
on
F254
silica
gel plates (0.25 rem thick,
Merck) with ch1orofonn/methanol/water (65:25:4, v/v/v) as solvent.

---

-96-
Preparation of vesic1es.
The sonication method was use:1 to
prepare
sma11
uni1ame11ar
vesic1es
(SW)
(17 ). Appropriate aliquots of stock solutions
of DMPC (chlorofonn)
and
canpound
3
(chlorofonn/methanol/water,
4: 5 : l,
-
.
v/v/v)
were
rnixe:1
and
the solvents were evaporate:1 to dryness in vacuo.
Ta this film of mixe:1 lipids (approximately la
mg)
was
adde:1
la
ml
of
buffer
(la
mM
Tris-Hel,
1 mM EDTANa2, 5 mM NaN3, "Ultrapure water" fran
Millipore). This suspension was sonicate:1
under
Ar
for
90
min
with
a
Branson
Sonifier
B-30
(po.ver
setting
5).
The
vesicle preparation was
filtere:1 through polycarbonate filters
(Nucleopore,
Pleasanton
0.8,
0.4
and
0.2 pm).
The
resulting
suspension
was
concentrate:1 to 2 ml in an
ultrafiltration
cell
(Amicon
stirre:1
cell) •
Gel
filtration
of
the
suspension
at
4°C
on
a
Sepharose
4BCL
oolurnn
(Phannacia
France),
previously saturate:1 with a fraction of the same
solution,
gave
vesicule
fractions.
Beth
of
these
purification
procedures
eliminate
external
aggregates. The concentrations of.DMPC
and
canpound
3
in
the
vesicles
-
were
measure:1
respectively
by
phosphorus
detennination
(18)
and
by
ultraviolet
spectroscopy,
after
destruction
of
the
vesicles
and
extraction with chlorofonn/methanol (1: 1 , v/v).
Ultraviolet
Speetros~.
Spectra were recorde:1 on an Uvikon 820 Kontron
spectrophotaneter. The sample was thennostate:1 to ± 0.1Oc and kept
for
30
min
at
the
desire:1 temperature for equilibration. A series of spectra at
several tanperatures were taken in heating runs.
Differential 5canninq calorimetry (DSC)
Measurements
(with
Dr.
B.
Lotz
and
Mrs.
M.
SCheer, Institut Charles Sadron, Strasbourg).
Multilamellar
dispersions were prepa.re:1 by adding deionize:1 water (100 ,ul)
to
the
dry
film
of
lipids
(approximately
la
mg)
in
a
tube.
The susPension was
incubate:1 at GO°C in a bath for la min and then shaken on a
vortex
mixer.
50
pl
of
this
dispersion
was
seale:1
into
a
thin
aluminum pan. The
reference pan containe:1 50",ul
of
deionize:1
water.
The
rneasurement
was
Perf0nned
on
a
Perkin-Elmer
DSC-2B apparatus. The tanperature progranm-
ation rate (heating and cooling) was 5 degC/min and the sensitivity
was
2
ml/s.
Just
before
the
measurarent, the apparatus was calibrate:1 with Ga
(Ill' = 30.9°C,AH = 5.5!) kJ/g.rool). Each sample was scanne:1 at
least
twice
to
check
the
reversibility
around
the phase transition. The transition
temperature
('!hl)
was
taken
as
the
peak
of
the
recording.

---

-97-
Electron
microSC9?Y
(neqative
staining)
(by
Mrs.
M.
Miehé, Centre de
Neurochimie, Strasbourg).
Tc a copper grid cœted with
a
Fonnvar
carbon
film,
was
applied
am blotted dry a drop of a solution (0.1 mg/ru) of
bacitracin (Sigma, USA). Vesicles at a concentration of 4
x
10-4
M
we.re
then
awlied
to
the
grid
for
l min am drawn off with filter paper. A
drop of 2% amoonitm molybdate was imnediately added for l
min,
drawn
off
with filter paper, and allowed to dry.
RESULTS AND DISCUSSIONS
Mixed vesicles fran œPC am membrane-spanninq phospholipid 3
With
manbrane
spanning-phospholipid
3
in
admixture
with
a.1PC, we can reconstitute a membrane model, closer
-
to
the
natural
systan
of
archaebacteria
than
that
prePared
fran ~ alone. CcInp:>und 3 spans
.
-
the bilayer am stabilizes the membranes.
Attenpts to prePare vesicles fran the dipolar
lipid
3
alone
gave
a
turbid
liquid
am microprecipitates
(apparently
-
multilamellar
structures,
but
nct
precisely
identified
except
by
DSC, as described
below). However, when CCII'pOund 3
was
cosonicated
with
DMPC
(see
below
-
molar
%
ratio)
vesicles
are
fonned
(mixture of different sizes). This
suggests that DMPC molecules are predaninantly located in the
outer
layer
of
the
vesicles, creating a suitable curvature for fonnation of vesicles:
in other words, that I:MPC plays the rôle
of
space-filling
molecules
for
the vesicles (Fig. 4).
()::::
I:MPC
l-Bnbrane-spanning
0== :::::0
phospholipid 3
-
Fig.
4
Hypothetical
spacer
rôle
of
IMPe
in mixed IMPe- 3 vesicles

---

-98-
Kunitake et al. have already mentioned that the sarne
rôle
is
played
by
cholesterol incorporated in vesicles of a "symtletrical" dipolar
anmonium amphiphile with a single chain~(l9). We
just
mention
that
this
curva:ture
effect
for vesicle fOII\\lation ha.s been optained without "spacer"
in a single molecule, by the
presence
of
"asynTnetrical"
0-, w -dipolar
groups
this
is
the
case
of the di-bisphytanyltetraethers 5 found in
-
Sulfolobus solfataricus (20) and of a synthetic
tA, vJ -dipolar
amphiphile
6 with two head-groups different in size (Fig. 5) (21).
-
(CH3)3~-(CHZ)IO-o-oCH"N-oo-(CHZ)IO-~(CH3h
B~
4
B~
=
"r:~~:l"CHO~
~
6
W O H
=
OH OH OH
Fig.
5
:
Examples of "symnetrical ft or ftasymnetrical" structures
of natural or synthetic membrane-spanni.nq molecules
The extent (average value per vesicle) of
"incorporation"
of
the
dipolar
phospholipid
3
in the mixed vesicles with CMPC was measured
-
by the methoos described in
the
preceding
chapter
and
expressed
as
s
(mole
% ratio)
or
r (equivalence % ratio) respectively according to the
relation s = 100 x CMBpc/(CJ:1.1PC + CMspc) or
r
=
100
x
2CMsPC/(CJ:1.1PC
+
2CMspc) * ,
where
CMBpc
and
CLMPC
are
the
molar
concentration
of
rnembrane-spanning phosphatidylcholine 3 and J:1.1PC, respectively (Table 1).
-
*In this fonnula,
it
was
taken
into
account
that
one
dipolar
lipid
functionally
corresponds
to
two
I:MPC
molecules.
r
presents therefore
approximately the volume % ratio occupied by the molecule 3
in
the
mixed
-
vesicles with rt-1PC.

---

-99-
Table 1 : Incorporation ratio of rnanbrane-spanning phospholipid 3
in
I:'MPC
vesicles prepared by sonication.
s = 100 x
-
~PC/(CDMPC
+ ~PC) and r = 100 x 2CMsPC/(CJ:l.1PC + 2CMspc),
where
CMspc
and
CDMPC
are
the
rnolar
concentrations
of
I1l€!1'lbrane-spanning
phosphatidylcholine 3 and DMPC, respectively.
-
Concentration of 3 ini-
Incorporation of 3 in the rnixed
...
tially added to
-
DMPC
vesicles with DMPC
s
r
2
2
4
5
4
8
la
9
17
20
20
33
50
32
49
At the
lower
concentrations
of
carpound
.1 (s 4 20) , the
rrolecules
initially
rnixed
were
almost
canpletely
incorporated
in the
vesicles. However, when the molar % ratio of 3 increases
up
to
s
= 50,
-
total
incorporation
is
not
achieved.
Sepharose
gel
filtration of the
crude vesicle preparation (s = 50 before cosonication) gave two fractions:
the faster eluted fraction has a higher concentration of 3
(s
= 38)
and
the
second
fraction has a lower concentration of 3 (s
-
= 20). Knowing that
-
the gel filtration can separate particules according to
their
sizes,
the
results
rnentioned
above
rnight
be
explained
by a difference in size of
vesicles of the two fractions : vesicles
containing
more
3
should
have
-
larger
radius,
which is intuitively probable, as they would require fewer
space-filling DMPC.
Attanpts
to
purify
the
rnixed
vesicles
containing
phospholipid
3
in
a
higher
concentration were unsuccessful, because of
-
the fonnation of rnicrcprecipitates.

---

-100-
T<?pology of inserted nenbrane-spanning phospholipid 3 in the
-
mixed vesicles with J:»nlC
We have chosen the length of the
transmembrane
chain
to
he
approximately
equal
to
the
bilayer
thickness of dimyristoyl chains, as
indicated by a space-filling canpact IOOdel (Fig. 6).
Fig.
6
:
Spaoe-fi1ling
cx:upact
JOOdel
of
the
membrane-spanning
phospholipid 3
-
In addition, both head-groups of 3 are phosphatidylcho1ines,
like
in
IJ.1PC.
Therefore, we first
-
specu1ated and then confinned that the
1OO1ecule 3 is oriented in
a
transmembrane
marmer
in
I!-1PC
vesic1es
as
-
sha-m in Fig. 4.
The
variation
of À. max
for
five
vesic1e
suspensions was
measured as a function of temperature (Fig. 7).
1. .
o
50
T·C
Fig. 7 : Variation of the absorption maximum with temperature
for
severa1
proportions
of
incorporated 1.
Vesicles
were
prepared
fran I!-1PC and
nanbrane-spanning phosphatidy1choline 3 at the fo11CMing proportions
==
04 1001 %, •
20 1001 %, and ho 32 1001 %.

---

Each sample, sul::mi.tted to heating fran IDoe to 55°e,
gave
a
sigmoidal
curve
starting
fran
about 7\\. max
=
267
nm
(at
lower
teroperatures)
to "!'- max
=
284
nm
(at
higher
teroperatures).
We
have
observed that 3 shows "A max at 300 nm in rnethanol,
whereas
upon
addition
of
water
-
the
value
goes
down
to
276
nm
(fonnation
of
agregates).
Furthennore,
a
diester
7 ,
having
the
same
chranophore
as
the
zœmbrane-spanning m:>iety in
-3,has Àmax at 288 nm in n-decanol solution
and
at
276
nm
in
the
-
aggregated
state
in the same solvent, at lower
tanperatures.
M80zC(CHz),o O~O(CHZ),O coz Me
,
...
l "-
~I
° 7
These facts imply that, in the vesicle suspensions,
(i) above the phase-transition ('lln) of the mixed Iipids, canpound 3
is in the m:>naneric state and diffuses freely and laterally
-
in the
vesicIes, because the lipid chains in the medium are in a liquid
state,and
(ii) below 'lln, canpound 3 has a tendency to aggregate (phase separation).
-
This phenanenon is reversible and is analogous with that
observed
in
IMPC-
t:J.. , uJ
-dipolar
carotenoid
vesicles
(4) .
These
observations
show
that
canpound
3
is situated in the Iipidic phase and
oriented in a transrnanbrane manner
-
in
the
vesicles.
Fig.
7
also
shows
that
'lln
(rneasured
at
the
mid-point
of
the
sigmoidal
curve)
shifts
gradually
to
higher
tanperatures, as the concentration of the canpound 3
increases.
-
These
observations
on
the
whole
can
be
interpreted
as
showing
a
good
miscibility
of
the
two
Iipids
in
our
experimental
conditions, above 'lln.
!,hases of rm.ùtilamellar
dispersions
of
œPC
and
the
rnembrane-spanning
phospholipid 3 (preliminary st\\Xly)
-
Fig.
8
shows
a
series
of thennograms (heating curves) for
mixtures
of
hydrated
DMPC
and
rnembrane-spanning
phospholipid
3,
containing
these
canponents
in
different m:>lar fraction ratios
-
(XMspc :
m:>le fraction of 3 in œPC-l dispersions).

---

-102-
A sharp thennal transition at 51°C (ÂH = 80 kJ/rool) was
observed for multilamellar dispersions of the pure canpound 3; and that
of DMPC was found, as already known, at 24°C (Â H = 20
-
kJ/rool) (lit. 'Dn =
23.9°C, 6.H = 22 kJ/rool) (22).
-3
t
•
Xtv\\SPC
u
=0.40
~
oc
XMSPC
UJ
::r
=0.20
~
o
Cl
z
w
17
27
57
Fig. 8 : ose scans of pure DMPC, pure membrane-spanning phosphatidyl-
choline 3 (solid curves, around 'Dn), and their mixtures: ~pC = 0.20
(crosses curves) , ~pC = 0.40 (dashed curves). ~pC : roole fraction of
3 in œ1PC-3 dispersions. Heating scans; scan rate 5 degCjmin.
The thennograms of mixtures depicted in Fig. 8 (~pc = 0.20
ana 0.40) reveal two phase transitions, one, sharp, occurring in the same
tarperature range as that of œ1PC, the other, a broad one, between the
'Dn' s of the two lipids. 'Ibis indicates that the fonner is enriched in
DMPC and the other is canposed of different danains of the rnixed lipids.
No occurrence of a phase transition can be detected at 51°C ('Dn of
canpound 3). When the proportion of 3 to DMPC increases, i t can be
observed -
that the tanperature, at
-
which the broad peak occurs, gets
progressively higher (39°C for Xf.1sPe"'0.20, 44°C for Xf.1sPe"'0.40) and the
relative proportion of transition enthalpy in this broad peak increases.
A similar behaviour has already been observed for the systans of
DLPC (dilauroylphosphatidylcholine) - DSPC (distearoylphosphatidylcholine)
and of œ1PC - DPPE(dipalmitoylphosphatidylethanolamine), where there is a
marked difference in roolecular lenghs or polar head-groups of mixed
lipids (22-24).

---

-103-
The
phase
diagranrne
dedueed
for the DMPC-3 system fran the
=
calorimetrie results is shawn in Fig.
9.
The
extent
of
the
horizontal
portion of the lower solidus ctllVe has yet to be detennined.
DMPC - 3
•
L
50
, .
•---.-
3D/,
L+~_.
..
..
----~.
~---
s
10
o
0.2
0.4
0.6
0:1
1.0
XMS PC
Fig. 9 : Phase diagranrne constructed fran calorimetrie transition ctllVes
(Fig. 8) for aqueous dispersions of LMFC + l
The
slopes
of
the
phase
diagranme
for mixtures of DMPC-J
suggest that the system is far fran ideal mixing. These data
also
suggest
a good miseibility of LMFC and the lipid l at the higher temperatures (T>
'lln) and a bad miseibility at gel phases.
It has already been knawn that sone
do ,w -dipolar
transrnem-
brane
molecules,
such
as
di-bisphytanyltetraethers 1 of arehaebacteria,
-
the synthetie analogue 6, or a synthetie single ehain
anmonium
amphiphile
-
4,
fonn
monanolecular
layers
in
the
hydrated
state.
In spite of the
-struetural differenees between our canpound 3 and these eanpounds,
-
canpound
3
also
forros
multilamellar
diSPersions,
as expected fran its
-
dimension
and
molecular
shape.
Furthennore,
canpound
3
SPans
the
-
manbrane in mixed lipids with DMPC.
These
informations
obtained
by
phase
analyses
were taken
into aeeount for a preliminary experiment of photochemistry
in
a
bilayer
system of DMPC-3 (16).
-

---

-104-
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---

-106-
3.2 Etude photochimi.que
Grâce
au
groupe
benzc:phénone
inclus
dans
la
sonde,
une
r~ction
photochimique
peut
être
éffectuée
sur
des
sUSPensions
de
v~sicules de bicouches lipidiques qui ont incorpor~ la mol~e sonde.
Le principe de notre méthode photochimique
a
~t~ eJCPOs~ au
chapitre
l
paragraphes
3-4
et 3-5). Je rappelle siIrplanent ici que nous
d~irons dans ce chapitre
les
essais
pr~liminaires encourageants que
nous
avons
effectu~s sur des
SUSPenSions
de v~sicules de J:l.1PC avec la
mol~le sonde 1.2.
3.2.1 Corxtitions Expérimentales
Nous avons éffectu~ les premiers essais
sur
des
SUSPenSions
. de
v~sicules unilaméllaires.
Dans
ce
cas, l'extraction et les analyses
des produits de r~ction ~taient rendues difficiles
par
la
pr~sence des
sels utilis~s dans le tampon de pr~paration de v~sicules_
L' exanple
pr~sent~ ici est celui rffilis~ sur une suspension
de v~sicules multilaméllaires, soit une suspension de 30 mg (J:l.1PC
+
sonde
30% molaire) dans 40 ml de H20.
Le
montage
utili~ pour
la
photochimie
est
un
montage
classique
(Fig. 8 ) •
La
lampe
à
vapeur
de
mercure
moyenne
pression
(Phillips
HP.K
l25W)
a
un spectre d'émission qui s'~talonne de 200 à 600
!In;
le
r~ipient est en
Pyrex,
qui
est
transparent
aux
longueurs
d'ondes > 300 nm, donc bien adaptée au
;\\. max de la benzc:phénone.
Pour
obtenir
les meilleurs r~sultats, il est souhaitable que
la température de la SUSPension de v~sicules T soit supérieure à
celle
de
transition de phase de la bicouche 'Ihl, soit dans le cas pr~sent T > 35°C.
Pour
le
premiers
essais
nous avons plong~ l'ensanble du montage dans un
bain d'eau à 40°C.
Après 5h d'irradiation, on observe
la
disparition
de
la
bande
d'absorption
de
la
benzc:phénone en U.V. L'eau est évaporée sous pression
réJuite, le r~sidu sec est soumis à une transest~ification : (5 ml MeOH +
1 ml MeONa 0, SN - agitation à tanpérature ambiante
l2h) _ Après
neutrali-
sation par HCl, le produit est extrait par CHe13-
canpte
tenu
des
faibles quantit~s de produit brut dont nous
disposons (8 mg) et des difficult~s de purification
de
ce
type
de
pro-
duit,
nous
avons
sounis directement le nélange r~ctionnel aux analyses.

---

-107-
réfrigération
bain d'eau
-+-&--+-.,~--t-+---l~lampe de Hg
o
'V
suspension de vésicules
(MLV)
dans l'eau
agitateur magnétique
plaque chauffante
Dispositif expérimental de l'irradiation photochimique

---

-108-
3.2.2 ~tats
les spectres de masse ont ét~ ~fectœs en ionisatioo chimique
(NB3)
avec
chauffage
progressif
de
la
source
de
façon
à
tUiminer
les prcrluits
volatils. Dans ces conditions, on ooserve un pic
mie
852
(M)
aCCCll'Çagn~
de
mie
835
(M+H-18) ccnpatible avec la pr~sence de l'hydroxyle tertiaire
et d'un pic mie 611 (A) qui constitue le pic majeur du spectre.
le spectre de
RMNlH
(200
Hz)
du
brut
de
r~ction est naturellement
CCII'I?lexe
et
difficile
à
interpr~.
CeperXiant,
si
on
le <XIrpU"e au
spectre de la sonde pure, on ooserve un d~laœment net des
pics
dans
la
r~on des protons aranatiques. le d~laœment chimique des H aranatiques
en position ortho du C=O
ô = 7,7 se d~lace à
ô =
6,7
dans
le
prcx3.uit
de
r~ction. ce phélanène est en accord avec la transfonnation du groupe
carlxmyle en un groupe IOOins ~lectroattracteur
(hydroxyle).
3.2.3 Conclusion
ces r~sultats prcUiminai.res n'apportent pas de conclusion d~initive au
prà:>lène
que
nous
nous
sannes
p~ de r~soudre. ceperxiant on doit
remarquer qu'ils sont C'CJtPitibles avec notre attente.
Il faut remarquer en particulier que dans le cas dkrit
ci-dessus,
on
ne
peut
pas
savoir
si
le
groupe
myristoyle
qui
a
œagi avec le groupe
benz~Mnone provient du phospholipide tMPC ou du deuxième groupe acyle
de la sonde elle-même.
Dans
l' ~
suivante
du
travail,
il
faudra utiliser un phospholipide
autre que le tMPC par exerple le DPPC, ce
qui
pe.II'Rettra
de
lever
cette
ambi9Ui~.

---

-109-
une autre question reste {X)~ : quelle est la {X)sitien exacte
d'attaque de
la
sonde
sur
le
phospholipide
cible
dans
tme
bicouche
lipidique ?
La
poursuite
du travail sera Mfectu~ avec des ëq;:pareillages de
photochimie ou d'analyse SM plus ~labor~s.

---

CON C LUS ION
G E N E R ALE
------~--~---------------------------
J

---

-110-
De ce travail de thèse,
il
ressort
la
synthèse
de phospholipides photosensibles.
L'une
de
ces
molklIles est transmembranaire et a ~~ conçue
afin de l'utiliser pour des ~tudes de bicouches lipidiques.
Nous avons entrepris l' ~tude physicochimique d'un
tel
lipide
transmembranaire;
à
l'~tat
pur
ou en mcUange avec du Dr1PC, il fonne des
bicouches
lipidiques
pr~sentant les mânes
caraet&istiques
que
les
bicouches classiques.
Ce
travail
~tait la ndse au point dl un premier specilnen; des
awlications diverses peuvent d~er de ce premier IOOdèle de molklIle
1.
1 '~tude
photochimique,
d~jà
aroorœe,
reste
à
poursuivre.
LI incorporation
de
la
sonde
dans
des
membranes
plus
naturelles (ex. fonœes de la l~ithine de
jaune
d'oeuf
ou
de
lipides
arch&aet&iens)
pennettra
d 1 ~lucider
les
interactions
entre
ces
diff&-ents constituants membranaires.
2. LI utilisation de groupements rapporteurs
autres
que
la benzq:>h~one est envisageable.
a)
Un
groupement
fluorescent,
ex la 1,6-diph~yl-l,3,5-hexatrièneplaœ
sur
la
chaîne
transmembranaire
sera
utilisable
dans
les
~tudes
de
fluidit~ membranaire.
1,6-Diph~yl-l,3,5-hexatriène
b)
La
ndse
en place d lun groupement paramagœtique, le long de la chaîne
transmanbranaire
est
en
cours
au
laboratoire,
les
molklIles
seront
destin~s aux ~udes de fluidit~ de membranes naturelles.

---

-111-
les
à>jecti.fs
IX>rtent
sur
la
synthèse de phospholipides carp:>rtant des
têtes IX>laires phosphotidylcholine (PC) ou phosphatidyllethanolamine (FE)
- en C-l du r~sidu glyœrol,
une
chaîne
dIacide
gras
essentiel (AGE),
-
en
C-2,
une
chaîne
IX>rtant
un groupe à nitroxyle
(az~thoxyle) en IX>sition 5 ou 12 (20).
les molkules à syn~tiser sont donc
l. et ~ par exE!'l"{>le.
Après
incorporation
de
ces somes dans ces membranes biologiques par des
transf&ases, des ~tudes de
corr~ation entre l'activi~ de certaines
protlfu1es et la fluidit~ de la membrane seront ~œs (21).
'\\..
0
-~""'"
•
-C0~-~
0
,
. /
' - 0 - P-O
0
_
O·
1
0-
o
o
'\\..
0
0)
0
+,/
o~
o
..
-/N-
-~~
•
r 0
-
' - 0 - p- 0
'"
./
o-P-o-"-
o
,
o
1
0-
0-
R = CH)
(pc)
R = H
(FE)

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l-9(1987}
Les acides gras essentiels ont -ils une fonction structuro-
modulatrice membranaire sp~cifique ?

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RESUME
Nous
avoos
syn~sé des phospholipides photosensibles à têtes '
polaires
phosphatiàylcholine.
les
lkithines
ont
~tS
obtenues
par
condensation
de
d4ri~ acyl-imidazole ou acyl-thi.a;zolidine avec le
OCIlplexe deœdmium d~ lysolkithines ou de glyŒrophosphatidylcholines.
L'une de ces IOOlku1es possède un
groupement
benzophénonique
au
milieu d'une cbainé lipidique transmembranaire.
L' ~ physioochim:i.que de ces IOOlku1es IIaltre qu' ell~ fo:z::ment
des ~:icules à
1 '~t pur ou en uélange avec
la
IM?C.
De
telles
bioouches
presentent
des
transitions de phase, anal~ par les mesures
de microoal.oriJIétrie diffmentielle ou de spectre U.V.
L'irradiation, phot:ochi.mi.que
de
la
lki.thine
transmembranai.re
i.noorpoœe ~ une bioouche lipidique, IIaltre la fozmation dl une liaison
covalente entre la ben2:ophfSnœe et
une
chaine
myristoyle;
ces
premiers
zésultats ouvrent
la - voie
à
son
utilisation oœme sœde photosensible
,pezmettant l'exploration de l'intérieur de bioouches lipidiques.
, Sondes
photosensibles,
synthèse
de
lki.thines,
phospholipides
transmembranair,
wsicules,
spectre
ultra-violet,
microcalorimetrie
diff4rentielle, phot:ochi.mi.e.

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