- . .....
L'UNIVERSITE PIERRE ET l"1ARIE CURIE
-
PARIS
6
-
SpéciaJité
BIOLOGIE
ET
PHYSIOLOGIE
VEGETALES
mention
Mécanismes
du
Développement
et
Productivit6
peH
t·;'J.(1ièIIJoiselle
DOGBO DENElON
Ocïette
L'activité
chlorophylle
synthétase
des
chJ_oro~laslcs et
des
chromoplastes
de
fr-uit..
de
Poivron
(Cap.s.1s~~_':__:J__n_!:~..~_~ L.
cv
Yolo
\\,i L' n der)
f a c t e U l: s
.l 0 C il l. i s a t ion
;
s i te
d 8
b 1- 0 s y n l h è s e
cl (~
l ' r" " :' y Ej ,-
soutenue
le
14
novembre
1983
devant
la
Corr!J:lif;sion
composée
èe
1,1
,-,
1:
•
1·1/\\Z LI Jl.K
Président
· .
t1 ..
3.
CA~1r.Rl\\
· . .
EXélmin2.teurs
iL
R.
t-'.ONEGER
1
11-
R.
REI·n'
·
J
A maman
h~ lo~n ~~ ~i phoch~.
AVANT
PROPOS
Le
travail qui
fait
l'objet
de
ce
mémoire
a
été
réalisé
dans
le
Laboratoire
de
Régulations
Métaboliques
et Différenciation
des
Plastes
de
l'Université
Paris
VI,
dirigé par
Monsieur
le
Professeu~
MONEGER.
Je
lui
exprime ma profonde
reconnaissance pour son
accueil,
pour
les
conseils
dont
i l
m'a
fait bénéficier et pour
les
moyens
matériels qu'il a
mis
à
ma disposition.
Monsieur
le Professeur MAZLIAK,
Directeur du Laboratoire
de Physiologie Cellulaire
de
l'Université Paris
VI, a
accepté
d'exa-
miner ce
travail,
d'en
être
le
rapporteur
et de
présider
le
Jury
ëe
cette Thèse.
Je
tiens
à
lui
exprimer toute
ma
reconnaissance.
Monsieur REMY
a
bien
voulu accepter
de
lire et
juger ce
mémoire
malgr6
le
délai
excessivement bref
imposé par des
contrai~~es
adoinistratives
survenues
en
fin
de
parcours.
Qu'il
veuille bien
trouver ici
l'expression
de
ma
reconnaissance.
Monsieur CAMARA,
Chargé
de
Recherches
au CNRS, a
dirigé
ce
travail.
I l m'a
initiée
aux diverses
techniques.
Ses
conseils,
ses
encouragements
et sa disponibilité ont
conduit à
la
réalisaticn
de
ce mémoire.
Il
a
également
accepté
de
faire
partie
de
mon
Jury
de Thèse.
Je
le prie de
trouver, dans
ces
mets
ordinaires,
le
t-élr:o~
gnage de
ma très
profonde
reconnaissance.
J'adresse
mes
vifs·
remerciements
à
Madame
AGNES
pour
son
dévouement et ses
nombreux services,
à
Monsieur
d'HARLINGUE
et à
Madame
BARDAT pour
leur
collaboration.
Je n'oublie
pas
les
autres
membres
du Laboratoire
dont
les
noms
ne
figurent
pas
dans
ce
méreoire
et qui
m'ont
exprimé
leurs
amitiés.
A chacun
j'exprime ma profonde
gratitude.
La dactylographie
de
ce
mémoire
a
été
effectuée
par
Madame
NARGEÜT.
Je
la
remercie
très
vivement pour son dévouement,
son
courage
et sa
sympathie.
Je
remercie
aussi
Monsieur VILLAT pour sa
contribution
très
appréciée à
l ' i l l u s t r a t i o n
de
ce mémoire.
SOMi'1A IRE
1
1NTRO~UCT10N --------------------------------------------------
2
HISTORIQUE - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
2
1-
Biosynthèse
du
noyau
tétrapyrrolique
- - - - - - - - - - - - - - - - - -
AI Synthèse de l'acide o-aminolévulinique -------------
2
BI Condensation en porphobilinogène -------------------
5
cl
6
Biosynthèse
des
chlorophyllides
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
DI Localisation cellulaire des réactions --------------
6
8
11- Biosynthèse
de
l'alcool
terpénique
- - - - - - - - - - - - - - - - - - -
8
AI Hétérogénéité de la fraction alcoolique ------------
BI Voies de formation des alcools terpéniques estéri-
9
fiant
les
chlorophyllides
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
A1UC-4i\\li
,-
\\\\.
@ -
/,_<ç;- ~ l', \\
111- Assemblage
des
deux parties
:
la /fteëfction a'e:stérifi-
1
(
\\
-
J
ca tion . - ~- ---- ---- --- -- -- - -- -- -l~ -~n' -- -- --::
AI ActlVltes de la chloropnvlle.se _""l
;t
_
~ ,-
\\~ \\
/ ·1
1 1
BI La ç h 10 r 0 ph Y 11e s y n L-h e tas e - - - - -~'7
- ' -- - - - 7 - -.;} - - - - - - - .- - -
,r<s,
- -
~,'è
0
':.Qf1ementS\\J.Çl0
MATERIEL ET METHODES
1-
Préparation
du
matériel
végétal
(Blé,
Epinard,
Poivron
14
AI Blé
.
14
1-
Culture
du Blé
14
2- Traitement du Blé
à
25°C et à
34°C
14
BI Epinard et Poivron
14
11-
Préparation
et
caractéristiques
des
fractions
subcellu-
laires
14
AI Plastes intacts
14
chromoplastes
14
1-
Les
2-
Les
chloroplastes--- - -. ---------------------------~~
3-
Les
, -
l
:>
e t l 0 p a s tE: s ~- - - - - -. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
1 S
.c
.
l
-do
l
19
B
ous-Lractlons
p
astl
la es
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
cl Critères de pureté ----------------------------------20
1- NADH-cytochrome
C-réductase
insensible
à
20
l'antimycine
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
2- Succinate
cytochrome
C-réductase---------------
20
3-
Activité
galactosyltransférase - - - - - - - - - - - - - - -
20
4-
Dosage
des
chlorophylles
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
21
5-
Dosage
des
protéines
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
21
2 l
III-
Analyse
des
~léotides ~yridiniques ----------------
AI
23
Extraction
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
23
1-
Les
formes
réduites
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
23
2-
Les
fornes
oxydées
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
BI
23
Dosage
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
IV-
Préparation
des
substrats
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
24
AI Extraction et purification d~s chlorophyllides~--- 24
BI Extraction et purification des protochlorophyllides 26
cl Pré'paralion des chlorophylles marquées ---------.--.
26
DI Préparation et pyrophosphorylètion des alcools
terpéniques
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
28
V-
Incubation
avec
les
précurseurs
marqués
et
analyse
des
produits
formés
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
~8
AI Composition du milieu d'incubation --------------- 28
BI Mesure de la radioactivité incorporée dans les
chlorophylles
et
alcools
diterpéniques
(géranylgtra-
niol
et
d é r i v é s ) · - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - · - - -
29
cl Analyse des chlorophyllides marquées libérées sous
l'action
de
la
chlorophyllase
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30
DI Mesure de la radioactivité incorporée dans les
30
carotènps
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
El Technique de comptage et calcul de la radioactivit~30
RESULTATS
ET
DISCUSSION
I-
Degré
de
pureté
des
suspensions
utilisées
- - - - - - - - - - - - - 3 2
AI
suspe~sio~s de
chloroplastes
- - - - - - - - - - - - - - - - - - 3 2
BI Les suspensions de chromoplastes
32
cl Les fractions pl astidiales -
32
1-
La
fraction
membranaire
32
2-
La
fraction
s t r 0 Hl Ù. t i que
11- Mise
en
évidence
de
l ' a c t i v i t f
chlorophylle
synthétas2
dans
les
chloro~lastes et chromoplastes
de
Poivron
(Capsicum annuum L.)
et
nature
de
l'alcool
diterpéni-
que
estérifiant
les
chlorophyllides
- - - - - - - - - - - - - - - - -
36
AI Résultats --------------------------------------
36
1-
Radioactivité
incorporée
dans
les
chlorophylles
36
2-
Radioactivité
incorporée
dans
les
alcools
di terpéniques
libres
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
37
BI Discussion-----------------------------
37
III-
Spécificité
de
la
chlorophylle
synthétase
vis-à-vis
de
différents
substrats
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
43
AI Spécificité vis-à-vis du noyau tétrapyrrolique---
~3
BI Spécificité vis-à-vis de l'alcool terpénique----
44
IV
-
Conclusion partielle
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
46
V-
Influence
de
différents
facteurs
sur
l'activit~ de
la
chlorophylle
synthétase
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
47
AI Effets de la variation du pH du milieu d'incubation 47
1-
R é s u l t a t s - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
47
a)
Effets
sur
l ' e s t é r i f i c a t i o n
des
chlorophylli-
des - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
47
b)
Effets
sur
l'incorporation
de
l'isopentényl-
pyrophosphate
dans
les
alcools
diterpéniques
libres - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
'18
2-
~iscussion ------------------------------------
49
BI Effets du pyrophosphate sur la synthèse des chloro-
phylles
et
des
alcools
di terpéniques
libres
par
les
suspensions
de
chloroplastes
et
chromoplastes
à
partir
de Œ- 14 c] isoper:ténylpyrophosphate -------
sa
1-
Résultats - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
50
2-
Discussion
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
51
_
. .
2+
2+
cl Role des lons dlvalents (Mg
,Mm
)
et
de
l'EDTh
sur
la
synthèse
des
chlorophylles
et
alcools
diterpéniquEs
librr~ par
les
suspensions
de
plés-
tes
à
partir
de 0-
9 isopenténylpyrophosphate -- --
52
1-
Résultats - - - - - - -
52
2-
Discussion --.- - - -
53
DI In fI u en ces des nu clé 0 t ide s
( N1>. DPH,
A'r P )
sur
l ' a c t i v i t é
chlorophylle
synthétase
- - - - - - - - - - - - - - - -
55
1-
Effets
du
NADPH
sur
la synthèse
des
chlorophyl-
les
et
des
alcools
diterpéniques
libres
par
les
suspensions
plastidiales
- - - - - - - - - - - - - - - - - -
55
a)
Ré sul t a t s - - -
55
b)
Discussion
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - . - - 56
2-
Effets
de
l'ATP
sur
la synthèse
des
chlorophyl-
les
et
des
alcool
diterpéniques
libres
par
los
suspensions
plastidiales
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ---
62
a)
Résultats
- - - - - - - - - - - --------------------
62
b)
Discussion --- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ---
62
El Conclusion partielle -----------------------------
66
VI-
Localisation
intraplastidiale
de
l ' a c t i v i t é
chlorophyl-
le
synthétase
et
connection
avec
les
enzymes
impliqu~es
dans
la biosynthèse
des
caroténoides
- - - - - - - - - - - - - - - - - -
67
AI Activité chlorophylles synthétase dans diverses
fractions
plastidiales
(membranes
et
stroma
Effets
du Triton
X-IOO
et
du NaOH
0,1
N sur
la
synthèse
des
chlorophylles
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
68
1 -
Rés u l t a t s
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - --
6 e.
a)
Activité
chlorophylle
synthétase
àans
le
stroma
dans
les
membranes
et dans
les
deux
sous-fractions
combinées
de
chloroplastes
e t
de
ch rom 0 pla ste s
de
P 0 i v r 0 n - - -
- - - - - ---
68
b)
Les
effets
du Triton
x-100
sur
l'incorpora-
tion
dC[1- 14 ëi
isopenténylpyrophosph2'te
dans
les
chlorcph~11es par les chloro~lastes et
chromoplastes
de
Poivron
- - - - - - - - - - - - - - - - - - -
69
c)
Les
effets.du
traitement
des
membranes
pa~
le
NaOH
(0,1
N)
sur
l'incorporation
de [J--'[}
géranylgéranylpyrophosphate
dans
les
chloro-
59
ph Y11 e s
- - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - --
72
2 -
Dis cu s s ion
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - -- --
BI Connection entre l'estérification des chlorophylli~
des
et
la biosynthêse
des
caroténoides
- - - - - - - - - - -
76
1-
Résultats
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
76
2-
Discussion
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
77
cl Con c lus ion par t i e 11 e - - -- - -- - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - -
80
VII- Site(s)
de biosynthèse
de
la chlorophylle
synthétase
81
AI Mise en évidence et caractéristiques de la chloro-
phylle synthétase dans
les
étioplastes
de
Blé
(Triticum sativum L.
var.
Florence Aurore)
- - - - - - -
82
1-
Résultats
82
al
Effets
de
la variation
du pH
du milieu d'in-
cubation
sur
l'activité
chlorophylle
synthé-
tase
dans
les
étioplastes
de
Blé
- - - - - - - - - - -
82
bl
Effets
du pyrophosphate
sur
la synthèse
des
chlorophylles
par
les
suspensions
d'~tioplas
tes
de
Blé à
partir de
l'isopenténylpyrophos-
ph~te ---------------------------------------
2+
2+
c)
Rôle
des
ions
di va len ts
(Mg
,
Ï"1n
)
sur
l'activité
chlor~phylle synthétase et
l'incor-
poration de
l'isopenténylpyrophosphate
dans
les
alcools
diterpéniques
par
les
suspensions
d ' é t i 0 pla ste s
de 131 é
- - - - - - - - - - - -- - - -- - - - - - - - - -
83
2- Discussion--------------------------------------
84
13/
Activité
chlorophylle synthétase
dans
les
plastes
de
13 lé
cul t i v é
à
2 5 0 C e t à
3 4 0 C -- - - - - - - - - - -- - - - - - - -
8 5
1- Effets
sur
le
verdissement
du Blé
--------------
85
2-
Effets
sur l'activité
chlorophylle
synthétasc
-
a)
Ré sul ta t s
- - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - -- - - - -- - -
85
b)
Discussion - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
8~
DISCUSSION GENERALE ET CONCLUSION - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
SS
BI B L l OG RAP HIE
- - - -- - - - - -- - -- - -- -- - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- -- - - - - - - -
9 -:
ABREVIATIONS
ADP
adénosine
diphosphate
ATP
adénosine
triphosphate
BT
bleu de
thiazolyl
DHAP
dihydroxyacétone
phosphate
dpm/mg
désintégration
par
minute
par
milligramme
de
protéine~
DTT
dithiothreitol
EDTA
éthylène
diamine
tétracétate
FAD
flavine
adénine
dinucléotide
IPP
isope~ténylpyrophosphate
KF
fluorure
de
potassium
KH
P0
potassium
dihydrogéno-phospahte
2
4
MES
acide
2 [N-Morpholin~
étha~esulfonique
MOPS
acide
morpholinopropanesulfonique
NAD
nicotinamide
adenine
dinucléotide
oxydé
NADPH
nicotinamide
adenine
dinucléotide
phosphate
réduit
nm
nanomètre
1
mM
rimole
nanomole
P-CMB
para-chloromercuribenzoate
PES
éthosulfate
de
phénazinc
3
PGA
3
phosphoglycérate
pmole
picomole
PPi
pyrophosphate
inorganique
'1' ris .- HC l
Tris
(hydroxyméthyl)
aminométhane
ajusté
à
l'acide
chlorhydrique
UDP
Galactose
uridine
diphospho-galactose
U-v
ultraviolet
1
INTRODUCTION
La
chlorophylle,
principal pigment
collecteur
de
l'énergie
lumineuse
utilisée
par
les
organismes
photosynthétiques
(plantes
~vertes et certains microorganismes), ne constitue pas â l'état
isolé
une surface
photoréceptrice
optimèle,
l'agrégation
de
ses
molécules
entre
elles
ne
favorisant
pas
leur
accessibilité
aux
photons.
En
outre,
la
conversion
de
l'énergie
captée
nécessite
la
présence
de
molécules
oxydoréductrices,
judicieusement positionn~es
dans
l'environnement
immédiat
des
molécules
de
chlorophylles
impliquées
dans
les
centres
réactionnels
des
photosystêrnes.
Pour
tenter
de
comprendre
ce
phénomène,
on
s ' e s t
souvent
adressé
à
des
modèles
physico-chimiques.
A ce
niveau,
certaines
conditions
structurales
se
révèlent nécessaires.
Elles
peuvent
étre
réalisées
par
exemple
si
on
dissout
la
chlorophylle
dans
une
matrice
lipidique.
Hais
cette
mise
en
solution pose
un
certain
nombre
de problèmes
ainsi,' la
chlorophylle
n'0:st pas
solubilisée?
par
l'alcool
stéarique
(alcool
en
C
saturé),
mais
elle
l ' e s t
dans
18
l'alcool
oléique
(dérivé
en
C
insaturc"
en
9)
(GAINES
et
2'll.,
18
1964).
Ce phénomène
serait
lié
au
fait
que
le
phytol
(alcool
diter-
pénique qui
constitue
la
chaine
latérale
de
la
chlorophylle)
possè~~
trois
substitutions
méthyles
qui
interagissent
avec
les
doubles
liaisons
oe
la ;llatrice
lipidique
dans
laquelle
la
chlorophylle
eSt
dissoute
(ROSENBERG,
1967).
Les
caractéristiques
structurales
qui
conditionnent
les
possibilités
fonctionnelles
de
~a
chlorophylle
se
trouvent
réalisées
chez
les
végétaux par
le
fait
que
le
squelette
té t r a p y r r 0 l i que
pol air e
( c 11 10 r 0 p h Y l l i Cl (;)
0 li
y:. lus
? ~ é c j ,,, c? ];1C r; t
l ëJ
fonction
acide
du
gyoupement propioniqlle
du
noyau pyr)-ole
IV,
une
fois
synthétisée,
est
estérifiée par
le
phytol qui
s' iEsère
dans
la matrice membranaire plastidiale.
Or,
on
sait que
ceLte
dernière
est principalement
composée
de
galactolipides
pr~sentant des
acides
gras
en
C
avec
une
três
forte
insaturation.
Ainsi
chez
les
végétaux
18
étiolés
verdissant
â
la
lumi~re
(qui
acquiêrent
progressivement
une
aptitude
photosynthétique)
on
peut
établir
une
corrélation
positive
entre
la
synthèse
des
galactolipides
et
l'augmentation
de
la
teneur
en
chlorophylles.
2
L'estérification par
~e phytol du squelette t6trapyrro~ique
polaire
(chlorophyllide),
se
révèle
donc
capitale pour
l'ancrage
et
le positionnement
des
molécules
de
chlorophylles
dans
la
matrice
-~membranaire plastidiale,
qui
conditionnent
les
capacités
fonction-
nelles
de
l'appareil photosynthétique.
En
conséquence,
c'est
sur
cette
étape
anabolique
d'estérification,
qui
est
catalisée
par une
enzyme
dénommée selon
les
auteurs
chlorophyllase
ou
chlorophylle
synthétase,
et qui
n'a été
étudiée
jusqu'ici que
de
façon
frag~e~
taire,
que
nous
avons
concentré
notre
attention.
Nous
avons
choisi pour cette
étude
des
modèles
biologiques
susceptibles
d'offrir
la possibilité
d'étudier différents
stades
du métabolisme des
chlorophylles
(étioplastes
qui
recèlent
les
précurseurs
des
chlorophylles
chloroplastes
oü elles
sont
activement synthétisées
chromoplastes qui
contiennent
les
produ~~s
de dégradation des
chlorophylles).
Ap~ès un
rappel
concernant
la structure
de
la
chlorophyll~
1
suivi
d'un historique,
nous
présentons
les
matériels
et
techniques
que
nous
avons
utilisés
et
les
résultats
qu'ils
nouS
ont permis
d'obtenir sur divers
points
~dentité de
l'enzyme
d'estérifica~ic~
localisation
de
l'activité
et site
de biosynthèse
<
et propriétés,
~---- ---~-
de
l J enzyme)
HISTORIQUE
La
réaction
d'estérification
qui
constitue
l'étape
terminale
de
la biosynthèse
des
chlorophylles
(a
et
b
chez
les
végétau~ supérieurs)
et
dont
les
caractéristiques
réactionnelles
et
enzymatiques
font
l'objet
de
ce
mémoire,
fait
intervenir
comme
substrats
une
Œolécule
â
noyau
tétrapyrrolique,
appelée
chloro-
phyllide
et
un
alcool
terpénique.
La présentation
des
données
bibliographiques
concernant
les
mécanismes
de
cette
réaction
nécessite
un
exposé
préa~~ble des
principales
informations
actuelle-
ment
disponibles
â
propos
de
ses
substrats
et
des
conditions
de
leur
formation
(Fig.
1).
1-
BIOSYNTHESE
DU
NOYAU
TETRAPYRROLIQUE
Les
travaux
réalis~s chez
les
mutants
sur
la
synth~se
de
chlorophylle
bloquée
à
différents
stades
ont permis
d'isoler
de
nombreux
intermédiaires
et
de
proposer
un
schéma
global
de
biosynthèse du
squelette
tétrapyrrolique
des
chlorophylles,
même
dans
les
cas
oa
on
n'a
pas
pu
réaliser
une
étude
enzymatique
(KIR:":,
1978).
AI Synthèse de l'acide é-aœinolévulinique
La première
étape
de
la
synthèse
du
noyau
tétrapyrrolique
est
constituée
par
la
formation
de
l'acide
6-aminolévuliniqu€,
dont
l'origine
demeure
controversée
chez
les
végétaux.
Chez
les
animaux
et
les
bactéries,
sa
synthèse
â
partir de
glycine
et
de
succinyl-CoA
est
catalysée
par
la
6-aminolévulinate
synthétase.
4
CHLOROPHYLLE h
-CHO
~'---------'
~ o
C
o~
1
l Cft3
ri~oprènc(C5)
]
CHLonOPHYL\\[ (1
FigtUte.
1
- - - -
St~uctu~e. mol~cula~~e. de. la chlo~ophyll2 a.
La chlo~ophylle.
b en di66~~e. ~eule.m2nt pa~ la
~ub~t~tut~on d' Url ~ad~cal C/10 QU C!-{ 3 JLe.pé~~ bufL .ta n.{gu:l.e.
pa~ de~ pa~e.nth~~e.b.
Cette
enzyme
a
été
purifiée
par
GI~SON et al.
(1958)
chez
les
bactéries.
Chez
les
végétaux,
son
activité
a
été
décelée
dans
des
cultures
de
soja
(WIDER DE
XIFRA et
a~.,
1971)
ou
l'épiderme
de
Pomme
de
terre
(RAMASWAMY
~t NAIR,
1973).
Le
y-dioxoval~rate pourrait
~également être un précurseur de l'acide 8-aminolévulinique
(GASSMAN
et al.,
1968).
Récemment,
DZELZKALNS
et
al.
(1982)
ont
montré
que,
chez
l'Euglène,
l'acide
O-aminolévulinique
e~t synthétisé à
partir
de glycine
et
de
succinyl-CoA,
en
présence
de
phospl:dte
de pyric1o:-;al.
En
l'absence
de
ce
dernier,
l'enzyme
est
irréversiblement
inactivée.
Selon BEJI"LE
et CASTELFRJl.NCO
(1973),
l'acide
O-ëtminolévu-
linique
serait synthétisé
à
partir
de
glutaœate'OH-HAMA
et
SENGE~
(1975)
chez
Scenedesrnus
ainsi
que
HENDRY
et
STOBART
(1977)
chez
l'Orge,
montrent que
le
glutaoate
est
utilisé
pour
la
synthèse
Q2
l ' a cid e
6 - ami no l é vu lin i que
uni q l, e men t
à
l a I u ,1; i (; r e.
1-1 E L I. E R e t
GAS S tH\\ N
(l 9 8 2 )
mon t r e n t
q li e,
c 11 e z
l ' 0 r 9 e,
l ' ct c: ide
<5 - a fi i n 0 l é v u l i Il i que
peut être synthétisé
à
partir
de
succinyl-CoA
ct
de
glycine,
mais
aussi
à
partir de
glutamate.
Au
total,
la
nature
de~
précurseurs
possible
de
l'acide
o -aminolévulinique ne semble pas définitivclnent établie, mais, le
suc c i Il Y1- C0 A e t
l a g I Yc i ne,
a i n s i
que
l e
g .l u l:. a Dl é1 t ~
a p p 3. rai s s e Il t
les
candidats
les
plus
plausibles
à
cette
fonction.
BI Condensation en
porphobi linc'gène
La
conàensat.ion
de
deux molécules
d'acide
8-aminolév\\J.1inic:"C.c
conduit
au porphobilinogène,
monopyrrole qui
est
à
l'origine
du
premier
tétrapyrrole
naturel
l'uroporphyrinosrène
III
(Fig.
2).
L'enzyme qui
catalyse
la
synthèse
du porphobilinogéne
à
partir
0~
l'acide
6-arninol~vulinique, la
6-aminolévuljnate
déshydratase
a
été
détectée
dans
les
extraits
de
chlorelles
par
GRANICK
(1954)
et
dan s I e s p I a ste s
pur i fié s
de
E li 9 le n a_ g r a cil i s p a r
Ci\\ REL L C~ L I~ AtH!
(1964).
Elle
est ~galement présente
dans
les
tissus
de
cals
de
soja
( T l Gl ER e t
al.,
1 9 6 8 )
e t
d êl n s I e s
cul tu r e s
cl e
t i 5 sus
de
J( 2. l êl n ch Ci e
C'. r e !1 a t ë:.
( ST 0 BART
e t
THO t1 AS,
1 9 6 8).
D1, VIE S e t
al.
(1 9 6 6)
In 0 n t r e n t
(~U e
dan s
les
ce Il u les
à e
E ~ 9 l ~ n~ 9 r a cil i s
a yan t
pou s s é
à
l 'ob s cu r i t é f
la teneur
de
l'enzyme
augmente
lors~ue celles-ci
sont
exposées
fi
la
lumiére
et qu'elles
forment
des
chloroplastes.
Ces
résult2ts
ont été
6
confirmés
par
EBBON
et TAIT
en
1969.
cl Biosynthêse des chlorophyllides
L'uroporphyrinogène
III
est
formé
par
action
coopérative
de
deux
enzymes
l'uroporphyrinogêne
1
synthétase
ou
porphobili-
nogène
déaminase
et
l'uroporphyrinogène
III
Co-synthétase
ou
uroporphyrinogène
isomérase
(BIRD
et
al.,
1965).
Ces
deux
enzymc:s
avaient déjâ
été
mises
en
évidence
par
BOGORhD
(1958
a,
b)
à
partir
de
germinations
de
Blé
et,
plus
récemment,
par
LLAMBIAS
et
BATLLE
(1971)
dans
des
cals
de
soja.
Les
réactions
enzymatiques
qui
condui-
sent à
la formation
de
la protoporphyrine
IX
(Fig.
i~)
a partir ~e
l'uroporphyrinogène
I l l ,
dans
les
plantes,sont
peu
connues.
Quant
~
l'enzyme
responsable
de
la
fixation
du
magnésium sur
la
protopor-
phyrine
IX
(Fig. lb) ,
la
ferrochélatasc,
elle
a
été
mise
en
évicle~:ce
dans
les
chloroplastes
d'Epinard
(GRIFFITHS
et
a l . ,
- - - -
1 9 6 8)
dans
les
chloroplastes
et
les
étioplastes
de
Haricot
et
d'Avoine
( KA TES
etH ARS Ill'. L L ,
1 9 7 5).
S 0 il s I ' a ct i on
<i ' un e
mé t i1 Y l t r ans f f ras e ,
le
c y cIe
1 1 I d e
l a
Mg - pro top 0 r p h Y r i ;-,c~
( Fig.
1 b)
est !T, é t fi Y l é
en
présence
de
S-adénosyl méthionine.
L'activité
de
cette
enzyme
permet
ainsi
la synthêse
de
la Mg-protoporphyrine
monométhyl
e s t e r
(Fig.
lb), _précurseur
immédiat de
la protochlarophyl1ide
(Fig.
2
).
L'activité
de
cette
enzyme
a
été
décelée
dans
les
chloroplastes
de
feuilles
de
l-jais
(KIRK
et
i'YLIOTIS,
1972)
et
d'Eu01~_~...9ra.ci.Lis_
( 0 AVIE S
~.!-----.9~,
1 9 6 6).
P l li S
rée e fi men t ,
G RI FFI l' HS
(1 9 7 5,
1 9 7 8,
1 93 0 )
signale
la
réduction
de
la protochlorophyllide
en
chlorophyllide
dans
les
étioplastcs
de
Maïs
et
d'Orge.
DI Localisation cellulaire des réactions
En
ce qui
concerne
la
localisation
cellulaire,
CARELL et
KAHN
(19E~
ont
montl"!~' que les produits dérivant de
l'acide
6-aminolévuliniçLle
ne
traversent pas
librement
les
Dembranes
dans
les
organites.
Ces
produits
resteraient
dans
leu~ compartiment
de
synthèse.
Cepend~nt
l'acide 6-aminolévulinique
déshydratase
serait
synthétis~
du
cytoplasme
(SCHNEIDEF,
1971
BEISENHERZ
et SCHNEIDER,
1974)
Dans
ces
conditions,
la
Ô -aminolévulinate
déshydratase
doit
traverser
l'enveloppe
plastidiale.
7
BIOSYNTHESE DE LA D-fLOROPHYLLE
"'~..-.._---""""'-~ .........
_~------
COOH
1
HOOC
Cli2
JH2!H2
B'OC"/()
H
Acide
Aminolevulinique
Porphobi 1 inogenc
Proloporphyrine
IX
CloIOIC'phyll ide
H2
1
H2C
1
HOOC
PI Dt Deh 1O' oph Y I\\i de
Bio~yn~h~~e de la ~hlo~ophylle a a pa~tih de i'a~ide
6-aminol~uulinique.
8
L'ensemble
de
ces
réactions,
dont
certaines
étapes
ont été
partiellement étudiées,
et à
propos
desquelles
seules
les
enzymes
chlorophyllase et
protochloropLyllide
oxydoréductase
ont été
__ purifiées,
permettent
d'aboutir
aux chlorophyllides
a
et b,
substrats
directs
de
la
réaction
d'estérification par
l'alcool
diterpénique.
11-
BIOSYNTHESE DE L'ALCOOL DITERPENIQUE
AI Hétéro~éité de la fraction alcoolicue
Les
premiers
travaux de
FISCHER
(1928)
et
de
FISCHER et
LOWENBERG
(1929)
avaient permis
de
montrer que
l'alcool
estérifiant
les
chlorophylles
in
vivo
é t a i t
le phytol
(C
)
Cependant,
RAPO?OR~
20
et HAt·1LOI'J
(1961)
montrent que
la
chlorophylle
G60
chez
C.tlC2..roD~um
est estérifiée par
un
alcool
terpénique
en
C
,
le
farn6s01.
Dan5
15
le
cas
de Rhodospirillum,
la bactériochlorophyllc
est
essentiellE:'!.:'="~"c
estérifiée pa~ le
géranylgéraniol
(KATZ
et
ë:.l.,
1973).
Chez
les
végétaux
supérieurs,
ELLSWORTH et NOWAK
(1974)
signalent chez
les
graines
de
Cur~ubi_t~ une hétérogénéité
de
la
fraction
alcoolique
estériiiQnt
les
protochlorophyllides.
Selon
a u t e urs,
l e: s
p r ü toc h l 0 r 0 p h Y l l i à e s e t n O!1
les
c 11 l 0 r 0 p Ï1 y I l i è. e s
s e r èl i c< ~
estérifiées
par des
alcools
en
C
,
et
par
du
géranylgér2niol
et
15
des
jérivés
plus
ou moins
saturés
de
ce
dernier.
Cette
h6térogénfit~
est à
nouveau
signalée
pour
les
protochlo~ophyllides des
~tioplastes
isolés
de Phaseolus
vulgaris,
de
Cucumus
sativus,
d'Helianthus
a~nus
e t
de
z e a
ma ys
( S II l 0
e t
S 11. SA,
1 9 83).
Ces
au te urs
sig na le n t
l ct
p r f se" --
ce
de quatre
dérivés
terpéniques
en
C
estérifiant
les
protochloro-
20
phyllides
le
géranylgéraniol,
le
dihydrogéranylgéraniol,
le
tétra-
hydrogéranylgéraniol
et
le phytol.
Ils
montrent que
la
teneur
en phytol
baisse
au
cours
de
la germination des
graines
de
Phaseolus
vulgaris
â
l'obscurité,
tandis
que
la teneur
en
t_étrahydrogéranylgéraniol
augmente.
Er~
revanche,
LILJENBERG
(1974)
montre que,
chez
l'Orge
cultivée
à
l'obscurité,
les
protochlorophyllides
ne
sont
est~rifiées que
par
le
géranylgéraniol.
9
I l
faut
signaler que
les
travaux
mentionnés
ci-dessus
font
état d'une
estérification
au stade
des
protocillorophyllides.
Or;
ces
dernières
sont
très
difficiles
à
séparer des
chlorophyllides
dëJ.ns
les
systèmes
utilisés
pour
l'analyse.
Par
ailleurs,
la
prot0chloro-
phyllide
est
très
rapidement
(quelques
secondes
d'éclairement)
photo-
réductible
en
chlorophyllide.
C'est
ainsi
que
senOCH
(1973)
montre,
chez
des
germinations
de
Phaseolus
vulqaris
cultivées
cl
l'obscurité
que
les
chlorophyllides
sont essentiellement
esté~ifiées par
le
phytol.
Pendant les
premières
heures
d'éclairement,
des
formes
ill~~r-
médiaires
de
chlorophyllides
estérifiées
par
le
géranylgéraniül,
le
dihydrogéranylgéraniol
ou
le
tétrahydrogéranylgérarliol
apparajsse~
Un
résultat
analogue
est obtenu
après
traitement
de
germin~tions
de
Blé
par
des
herbicides
(RUDIGER et
al.. ,
1976)
ou
au
cours
du
verdissement
de
germinations
d'Avoine
en
ana~robiose ( s e H 0 e li
€
t
", l .
1980) .
Ces
études
montrent
une
hétérogénéité
de
la
fraction
alcoolique
estérifiant
donc
les
protochlorophyl1ides
ou
les
chlcrc-
phyllides.
Or,
on sait
que
les
chlorophylles
présentes
dans
les
chloroplastes
actifs
sont
essentiellem2nt
estérifiées
par
le
phyts~.
B/
Voies
de
formation
des
alcools
terpéniques
estérifia~t les
chlorophyllides.
Le
schéma de biosynthèse
des
alcools
terpéniq~~s pcu~ant
estérifier
le
noyau
tétrapyrrolique
est bien
connu.
IJ.
est
2;1
grande
partie
commun
avec
celui
de
la
chaîne
de
biosyntÎlèsc
des
caroténoldes.
L'étape
essentielle,
en
dehors
de
la
formation
de
l'acétyl-CoJl.,
est
la phosphorylation
du
mévalonate
CIl
név<J.Jon2te
pyrophosphate par
les
actions
de
la mévalonate
kinase
et
de
la
phosphomévalonate
kinase.
Par
décarboxylation,
le
mévalonate
pyrophosphate donne
l'is~penténylpyrophosphate. A partir dE cette
unité
isoprénique,
on
obtient successivement,
par
action
de
la
prényltransférase,
une
série
de
réactions
de
condensation qui
donnent
le
géranylpyrophosphate
(C
)
le
farnésylpyrophos~)llate (C
)
10
1S
et
le
géranylgéranylpyrophosphate
(C
).
Selon
le
schéma
ci-desso~s
20
( Fig.
2),
l a
réd u c t ion
du 9 é ra n y l 9 é ra n y l P Yr 0 p ho S plie. t e
con d \\ü t a u
phytol.
10
111-
ASSEMBLAGE DES
DEUX PARTIES
LA
REACTION
D'ESTERIFICATION
AI Activités de la chlorophyllase
La
derniêre
étape
de
la biosynthèse
des
chlorophylles
est
l'estérification
du
noyau
tétrapyrrolique
par
un
alcool
diterpénique.
La
chlorophyllase
a
pendant
10ngteiiOps
été
considérée
comme- impliquée dans
cette
réaction.
Cette
enzyme
est
répanèue
chez
les
végétaux
(CASTELFRANCO et BEALE,
1983).
Elle
catalyse
l'hydrolyse
des
chlorophylles
en
chlorophyllides
e~
phytol
(KLEIN
et VI5ENIAC,
1961).
Son
activité
en
l'absence
d'acétone
est
stimulée
par
le
Tri ton
X-100
Ulc
FEETERS
et
a l . ,
1971
;
l'lc
FEETEP9~$j)
Son
e,~
, ,,\\~.
action
est
favorisée
par
de
fortes
concentratio;~i
.• aCéjr~é. dans le
(...
0
s...
mil i e u
réa c t ion n e l
( HO L DEN,
1 9 6 1 ).
\\"1 ILL S '1' AT TER.;e
~W k L ( 9~l\\1)
~ L
VJ ~
~~
sig na le n t
que
cet t e e n z y ni e
peu t
ca t a lys e r I a
r ~ ' \\ion
. ~ l:~te .
SHIt-lIZU et TM1AKI
(1963)
mon t ren t
que
] ' acti vi tê"'5'~h~J.q~~e de
/)e,.,., ~_D\\\\e'7
la
chlorophyllase
dans
des
ext:ce.its
acétonigues
Qe~pet:t être'
inversée
en
augmentant
la
concentration
en
phytol
dans
le
milieu
d'incubation.
Ce
dernier
point
n'est
p'as
confirmé
par
!JOLDEN
(1963)
qui
montre
que
les
chlorophylles
aussi
bien que
les
phéophytincs
peuve~t
servir de
substrats.
L'auteur
nontre
cependant
que
les
préparations
cOntenant
la
chlorophyllase
peuvent
catalyser
la
réaction
de
transestérification.
WELLBURN
(1970)
montre
que
ni
le
phylylpyro-
phosphate,
ni
le
géranylgéranylpyrophosphate
n'est~rifient les
chlorophyllides
dans
des
préparations
renfermant
la
chlorophyllase.
Cette
enzyme,
selon
lui,
estérifie
les
méthylchlorophyllides
p~r
le phytol,
et
non
les
chlorophyllides,ce
qui
confirme
les
rèsultQts
de
CHIBA et
al.
(1967)
MOLL
et
STEGWEE
(1978)
signalent que
la
réaction
~'~ydrolyse ne
suit
pas
une
loi
cinétique
Michaelienne.
I l s
coristatent de
plus
que,
lorsque
la
chlorophyllide
a
ou
la
méthyl-
chlorophyllide
a
i~corporées
dans
des
liposomes
sont
incubées,
en présence
d'un
extrait â
activité
chlorophyllase,
avec
du
phytol
et
du méthanol,
la
chlorophylle
a
et
la
méthylchlorophylle
a
sont
synthétisées.
Par
électrophorèse
en
pr~sel!ce ., -
Ut:::
dodécyl
de
sodium
(SDS),
la
chlorophyllase
donne
une
bande ~onstituée
1 1
par un polypeptide
dont
le
poids
moléculaire
est
évalué
â
30.000.
ELLSWORTH
(1972)
~ontre, après
filtration
sur
gel
d'une
\\préparation
renfermant
la
chlorophyllase,
que
l'enzyme
responsable
de
la
transestérification
a
un
poids
moléculaire
nettement
inférieur
â
celui
de
l'enzyme
responsable
de
l'action
hydrolyt.ique
ou
de
l'enzyme
impliquée
dans
la
réaction
d'est";rification.
Plu,;
réCep.r:lcn"
TERPSTRA
(1981),
en
travaillant
sur Phaeodactylum
tric_ol~~~.t=-uln,
signa!e que
la
chlorophyllase
est
une
glycoprot6ine.
BI La chlorophylle synthétase
A côté
de
ces
travaux,
RUDIGER ct
al.
(1977)
montrent
pour
la première
"
.
-,-OlS,
en
utilisant
un
systême
acellulairc
préparé
à
partir
de
gerr.Jinations
èe
maïs,
une
C!".t01:ifici.ltion
des
chlorop::yl-
lides
endogènes
par
le
géranylgérélny~_pyrophosphate. Ils
d~J~:ontreTIt
que
l'enzyme
active
dans
ce
système
est
présente
ilins
léS
étioplastcs
soumis
â
un
faible
éclairemen~ et
incub6s
en
présence
de
géranyl-
géranylpyrophosphate
(RUDIGER ~t
a~.
19t30).
Ils
ùénomrne:n"c
cC'ti.:e
enzyme
la
chlorophylle
synthétase.
Au
total,
les
résultats
exposés
ci-dessus
montrent
que
plu sie urs
en z y Iii es
son t.
sus cep t i b les
d' i n te ,1' ven i r
cl cl n s
l il
1: é a c t i (1 TI
d'estérification.
Au
terme
de
l'an01yse
bibliogrilphique,
nous
cons~atons que plusieurs
problénles
se
posent
à
propos
des
ré~ction5
qui
con du i s e fi t
à
l ' e s t. é ri fic a t ion
de :3
c)) l 'J r 0 p 11 YI l ide ~~ .
En premier
lieu,
selon
certai~s auteurs,
l'estérification
des
chlorophyllides
serait
catalysée par
la
chlorophyllasc,
qui
selon
l ' é t a t
physiologique
et
les
conditions
d~ milieu
réactjonncl.
serait
capable,
soit
d'hydrolyser
les
chlorophylles
en
chlorcphllJicc~
et phytol
(c'est
le
cas
du
déverdissement
qui
se
preduit
~u
cours
de
la maturation
chez
les
fruits),
soit
de
catAlyser
l ' e s t é r i f i c a t i o n
des
chlorophyllides
par
le
phytol
(c'est
la
situation
rencontrfe
au
cours
du
verdissement
so~l'action de
Id
lumière
des
v~gétaux
étiolés).
Pour
d'autres
auteurs,
en
revanche,
cette
étape
serait
catalysée par
une
autre
enzyme,
lé'.
chlorophylle
s.ynthétasc,
ir~pliç'--'ée
uniquement
dans
la
réaction
d'estérification.
I I
En
second
lieu,
l'alcool
diterpénique
(phytol)
estérifiant
les
chlorophyllides
dérive
de
l'isopenténylpyrophosphate(mo16cule
en Cs très polaire)
qui,
par une
série de
consensations
donnant
des
interm~diaires de plus en plus apolaires
(géranYlpyrophosphate,
farnésylpyrophosphate),
aboutit
au
géranylgéranylpryophosphate
(molécu12
en
C
).
Dans
le
p:aste,
cette
dernière
est
commune
â
la
20
voie
de biosynthèse
des
chlorophylles,
des
terpènes
sensu
tricto
(caroténoides,
kaurène
. . )
et
des
autres
prényllipides
(plasto-
quinoncs,
tocophérols
.).
A partir
du
géranylgéranylpyrophosphate
trois
réductions
supplémentaires
sont
nécessaires
pour
aboutir
au
phytol.
Quels
sont
~es
facteurs
qui
régulent
la
disponibilité
en
géranylgéranylpyrophosphate
et
sa
réduction
en phytol
?
Quels
sont
les
rapports
topologiques
entre
les
différentes
enzYIi1es
\\.ctilisant
le
géranylgéranylpyrophosphate
au
sein
du plaste
?
La
réaction
d'estérification
est-elle
spécifique
du
géranyJ-
géranylpyrophosphate
ou
des
chloro?hyllides
?
Autant
de
ques~ions
pour
lesquelles
nous
disposons
de
peu d'éléments
d'informations.
En fin,
les
t r a v Cl. u x
réa lis é s
sur
l ' a cid e
<5 _. il r.J i ft olé v u 1 i n i Cl u 8
dé~ydratase et
l'étude
de
cert3ins
mutants
ont permis
de
suggérer
des hypothèses
relatives
aux
sites
de
biosynthèse
de
cert~ines
'enzymes
in tervenan t
dan s
l a
forma Li on
de s
ch 10 rophy Il i de s.
En
revanche,
au moment
00
nous
avons
entrepris
ce
travail,
on
ne
disposait
d'aucun
renseigneIi"lent
sur
les
sites
cellulai_~es dp-
uiosyn-
thèse
de
l'enzyme
impliquée
dans
l'estérificat_ion
des
chlo:':"ophyllià'~s
Nous
avons
donc
abo:-:-dé
l'étude
des
l:rois
points
év0C!.tlés
ci-dessus
nature
de
l'enzyme
e~
cause
nature
de
ses
substrats
terpéniques
et
régulation
de
leur disponibilité
sites
de
biosynt1:.ès.:.:
de
la
pro-:::éine enzymatique.
Pour
condaire
notre
cxpérim8i1tai.:.ion,
nouS
avons
utilisé
des
plastes
isolés
de
Blé
et
de
Poivron
(étio-
plastes,
chlorcplastes,
chromoplastes),
dont
les
divers
stades
àe
différenciation
reflêtent
diff6rcntes
manifestations
du métabclisme
des
chlorophylles.
Ainsi,
dans
les
conditions
naturelles,
da.ns
les
étioplastes
de Blé,
les
chlorophylles
ne
sont
pas
présentes.
I l
s'y
accumule
des
protochlorophyllides
rapidement photoréductibles
en
chlorophyllides.
Dans
les
chloroplastes
de
Poivron,
les
chlorophylles
sont
synthétisées.
Dans
les
chromçplastes
de
Poivron,
elles
ne
le
1 3
dont pas,
bien que
le
g~ranylg~ranyipyrophosphatey soit activem2n~
produit.
Cette méthodologie
présente
l'avantage
de
donner
des
renseignements,
non
seulement
sur
les
activités
dans
chaque
type
de plaste,
mais
aussi
à
la
faveur
de
l'interconvertibilit~ entre
types
morphogén~tiques de
ces
organites,
su~ l'évolution des
activités
au
cours
des
processus
physiologiques
telles
que
les
transformations étioplastes-chloroplastes
et
chlo~oplastes-ch.como
plastes.
Dans
un
premier
temps
nous
avons
étudié
globaler.lent
la
formation
des
chlorophylles
a
et h,
sans
distinguer
ses
deux
fcrœes
pigmentaires.
Dans
ces
conditions,
afin
de
simplifier
la rna~iêre
d'exposer
nous
parlerons
de
la
chlorophylle
pour
désigner
globalecsnt
les
chlorophylles
a
et b,
et
nous
ne
préciserons
la
forme
qu'en
c~s
de
nécessité
pour
la
compréhension
du
texte. Les
r~sult~ts que
nous
avons
obtenus
sont présentés
cio-après
dans
l'ordre
suivant
Mise
en évidence
de
l ' a c t i v i t é
chlorophylle
synth~tasc dans
les
chloroplastes
et
chromopl~stes de
fruits
de
Poivron
et
spécificit~
vis-à-vis
de
différents
substr~ts
influence
de
différents
f6cteL~S
sur
l ' a c t i v i t é
chlorophylle
synthétase
localisatioll
de
l'actjvi~~
chlorophylle
synthétase
au
sein
du plaste
site (s)
de
hiosynt;~0s",
de
la chlorophylle
synthétase.
14
MATERIEL ET METHODES
1-
PREPARATION DU
MATERIEL VEGETAL
(BLE,
EPINARD,
POIVRON)
AI Blé
1-
Culture
du
Blé
Les
graines
de
Blé
(Triticulil
séiti":.t~m 1..,
var.
Florence
aurore)
après
hydratation
de
quelques
heures
dans
l'eau
distill~e,
sont mises
à
germer
dans
des
bacs
de
culture
contenallt
de
12
vermiculite
imbibée
d'eau.
La
germination
des
graines
et
le
ddvclop-
pement
des
plantules
s'effectuent à
l'obscurité
à
25°C.
2-
Traitement
du
Blé
à
2SoC et
à
34°C
L'obtention
des
plantules
se
déroule
selon
le
protoco]~
expérimental
décrit
ci-dessus.
La
germination
et
le
développeœcnt
des
jeunes
plantes
s'effectuent
â
l'obscurité
soit
à
25 u C,
sbiL
à
34°C.
Après
14
jours,
une
partie
ôe
chùque
lot
est prélevée
I)(JUL-
l'extraction
des
éticplastes.
L'autre
partie,
éclairée
pendant
-2
1 8
heu r e s
( 3 ,1
H. m
)
â
2 5 ° CEt
à
3 '1 C Ces t u t i 1 i sée
PC) u r l ' e;.; t .!: 2_ C -
tion
des
chloroplastes.
BI Epinard et Poivron
L'Epinard
a
été
procuré
sur
le
marché.
1. e s
Po i v r 0 n s
( Cap s i c u m a 11 n u ~ 1..,
var.
Y0 10 Vi 0 Tl der)
ver t s
ou orangés
ont été
obtenus
sur
le
marché
de
Rungis
11-
PREPARATION
ET
CARACTERISTI?UES
DES
FRACTIONS
SUBCELLULIIIRES
AI Plastes illtacts
1-
Les
chromoplastes
(Fig.
3a)
Les
chromoplastes
sont
extraits
à
p a r t i r
de
péricarpe
orangé
de
Poivron
(Capsicum
annuum
L.
var.
Yolo
Wonder)
selon
la
méthode
de
CAMARA
et
al.
(1982
~. Le fruit débarrassé de ses pépins
est
pesé
et
découpé
en
petits
dés.
Le
matériel
obtenu est
introduit
dans
le
milieu d'eX~Taction ~
~aison de
1
ml
p8r
gramme
de
matière
15
Broyage
("mixer"
2x3
sec.
1 ml
milieu/g MF
! milieu: mercaptoéthanol 1 mM ; EDTA 1 mM
saccharose 0,4
M ;
Tris-HCl pH 8)
Filtration
l (4 épaisseurs de toile Dlutex 50 ~m)
centrlifug:::::ifuge~seSorvall RC 2B
rotor
SS
34
1-
150 X
g,
5 min,
culot éliminé
2
-
2000
X
g,
10 min
culot
surnageant éli~i~é
(centrifugeuse
EeckndIJ
L3-50
,
rotor
sw27
60.000
x 9
,
60
min
2ml __----,~
91111
0.45 l\\ti
0.8 li iVi
9m!
1.45 rvi
~i9UlLe. 3a
Méthode de plLépcuwLtovl de,~ C.l1fLOtilOp.tcu,;t().,s il'l:tac..U,
de.
6fLuit
de POiVlLOll (T O de :tfLavait : 0-4°C ; MF : ma:ti~1Le. 6fLa~c.he)
16
fraîche.
Le
milieu d'extraction
contient
saccharose
0,4
11
EDTA
1 mM
8-mercaptoethanol 1
mM
Tris-HCl
50 mM et son
pH
final
est
8.
Après
15
minutes
au
froid,
le
matériel
est broyé
2
fois
pendant
3
secondes
au mixer à
grande
vitesse
(22.000
Rpm)
et
l'homogénat
'-e'st
filtré
sur 4
épaisseurs
de
toile
Blulex
(50 wm).
Les
débris
cellulaires
sont
éliminés
aprês
5
minutes
de
centrifugation
à
150 x
g
(centrifugeuse
Sorvall
RC
2B,
rotor
SS
34).
Le
surnageant
recueilli
est soumis
à
une
autre
centrifugation
à
2000
x
9 pendant
10 minutes.
Ce
dernier
culot
riche
en
chromoplastes
est
lav6
par
le
milieu
d'cxtraction
sans
EDTA et
remis
en
suspension.
Les
chromoplastes
intacts
sont prélevés
à
l'interface 0,84
M -
1,45
M après
une
centrifugation de
60
minutes
à
60.000
x
0
sur gradient
discontinu
de
saccharose
o , 4 5 M;
0, 8 4
t-1
1,45
M (centrifugeuse
Beckrndn
L3-50,
rotor SV!
27).
2-
Lcs
chloroplastes
(Fig.
3b)
Les
chloroplastes
sont
extraits
à
partir du péricarpe
vert
de Poivron
(C~E.sicum è.nnuum L.
var.
Yole'" 1·7onder).
La
:l1é'<~hode uti] i~:(('
e s l
une
m0 di fic a t ion
de
cel les
déc r j. tes
,} a r T U QUE T , II 9 7 2);
N j\\lZl~ Ti\\.lJ l
et B l\\ RB ER, (1977).
La pré par a t ion
du
mat é }~ ~ e l e s t
ide nt i qu e
2.
ce Il e
des
chromoplastes.
La première
centrifugation est
)~édlisée à
150
x
C]
penëar.t
2 minutes
(centrifugeuse
SORVALL Re
2B
l:otor
:;S31)
Les u )~ r'. ù g (', a n t
obtenu est
recentrifugé
à
220u x
g
pendant
JO
secondes.
Le
culot
rincé
avec
le
milieu d'extraction
sans
EDTA est
repris
avec
un
faible
volume de
ce
même
milieu.
Apr6s
homogénéisation
i l
est
déposé
sur
un
gradieJlt
discont~inu de
saccharose
0,75
[Ji,
~~
_. ,
1,5
M.
La purification
est
réalisée
au bout
de
15
min~tcs de
centri-
f li g a t ion
à
1 000
x
9
( c e n t r i f 11 g eus e
SOR V7, YJ L Re
2 13
rotor
ES
34)
et
les
chloroplastes
intacts
sont
récupérés
~
l'interface
1 , 5
/-1.
3-
Les
étioplastes
(Fig.
3c)
Les
étioplastes
ont été
obtenus
â
partir
de
jeunes
plantes
de Blé
(Triticum
sativum
var.
F l 0 r e n c e
ë: u r 0 r e )
d e
1 <J
j 0 u :c s
cl e
9 e }~;Ji i. -
nation.
Les
graines
de
Blé
hydratées
pendant
unc
heure,
sont mises
1 7
( ,\\ mi x c r " 2 >: 3
sec.
1
lU l
In i l i e u / 9
t--l F
111 i l i e u
mercaptoéthanel
1
mM
EDTA
1
mM
saccharose
0,4
M ;
'1' r i s - Il C l
P 11
8)
FIL1'Hl\\TIOIl
( 4
6paisseurs
de
t o i l e
Blutex
50~~
1
V
CENTRIFOGl',TION
( Centrifugeuse
Sorvall
Re
2B
HotOl:
SS
34
).
, ....'
1-
150
x
g
,2
min
culot
~limin6
2-
2.200J x ~
,30
sec
..
~
-:.------
Culot
Surnageant
éliminé
Centrifugeuse
Servall
RC
213
Hotor
lIb
4
1 .000
>-:
g
l S r n i n ) .
îürnl
10 [nI
0,7:5 [Vi
10 ri:!
r~ ; r. l' " n
, 1)
~~_",-_~_L
,
W!_:tho de. de. plLépaJwLi.o 11 d e.JJ
c- IL.t 0 lL 0 p.t a.':, .t éJS -i nt: 0_ c- J:J':J
G..?-
POivHJj!
(e dC'_ tlLava-i..f ; Q-4°C ; nF ; ma:t-i.èlLc.. nlL(,:ic..hc).
lél
Broyage
("mixer"
4
x
3
sec.
6
ml
milieu/g MF
milieu:
Mercaptoéthanol
1 mM
EDTA
1
mM
saccharose 0,4
M;
Tris-HCl pH
8
'CI
Filt::ation
l (4 épaisseurs de toile Blutex 50 ~m)
,
Çentrifugation
l (Centrifugeuse Sor••ll RC 2. rotor 55.'4)
1-
150 x
g,
5 min,
culot
éliminé
2 -
3020 X
g,
10 min
<1-
culot
surn~gea~t
éJimi~é
(centrifugeuse
Sorvall
RC
2B
;
rotor
Hb
34
2200
x
g
,
10 min.
10rril_ _~
10011
0.75 M
10rnf
1 iJl
étiop!astes
intacts
10ml
1.75 M
F-igu./Le 3(:
M~thode de p/L~pa~at~on de~ ~~~opla~te~ ~ntact~ de
6eu.~.f..e.e~ de B.e.~ (T D de. ;t.Jwv o...z.r:. ; Q-4 D C ,MF
/llrd.d'.he'
Ùha.zcl1c-)
19
à
germer à
l'obscurité
dans
des
bacs
de
culture
remplis
de
vermiculite
Les
feuilles
découpées
et pesées
sont
immédiatement
trempées
dans
,
le
milieu d'extraction
placé
dàns
la paillasse
froide
â
raison
de
6 ml par gramme de
matière
fraîche.
Le
milieu d'extraction
est
identique
à
celui
des
chloroplastes.
Au bout
de
30 minutes,
le
'~atériel est broyé
4
x
3
secondes
au
mixer à
grande
vitesse
(22000 Rpm).
L'homogénat est
f i l t r é
sur
4
épaisseurs
dE
toile
Blutex-
(50 wm)
Le
f i l t r a t
est
centrifugé
â
150 x
g
(centrifugeuse
Sorvall
RC
2B
rotr
SS
34)
pendant
5 minutes.
Le
f i l t r a t
est
c~ntrifu96 &
150 x g pendant 5 minutes
(centrifugeuse
Sorvall
RC
28
rotor
SS
3~)
Le
surnageant
est
recentritugé
â
3020 x
9 p~nd3nt 10 min~tes
(Centrifugeuse
Sorvall
RC
2B
rotor
S5.34.
Le
culot obtenu
est
rep~is
avec
le
milieu d'extraction
sans
EDTA.
Cette
suspension
est purifiée
sur un
gradient discontinu
de
saccharose
(0,75
M
1 1'1
1,75
M)
après
une
centrifugation
â
2200
x
g
(centrifugeuse
Sorvall
RC
2B;
rotor Hb 34)
pendant
10 minutes.
Les
étioplastes
intacts
sont
prélevés
â
l'interface
1 M -
1,75
M.
BI Sous-fractions plastidiales
Fractions
membranaires
(enveloppes
prothylakoïdes,
thylakoïdes,
lamelles
achlorophylliennes)
La
séparation
des
fractions
membranaires
du
stroma
s'opêrc
sur. les
plastes
intacts
obtenus
aprês
passage
sur
gradient.
A la
suspension
de
plastes,
est
ajouté
un
volume
égal
de
tampon
Tris-IICl
50 mM pH
7,6
et l'ensembJ.e
est
centrifugé
pendant
10 minutes
à
4 . 000 x
g,
(c c n t r i f u g eus e
Sor va 11
Fe
2 B ,
rot 0 r
S S
J 4).
Cet t c
0 P é r "- i:. ion
a
pour but d'éliminer
le
saccharose.
L'éclatement
des
plastes
se
fait
par
choc osmotique.
Le
culot obtenu
de
cette
pr~c6dente centri-
fugation
est
repris
avec
du Tris-HCl
pH
7,6
additionné
de
DTT
10 mt·j,
Après homogénéisation,
on
laisse
reposer
la suspension
au
froid
pendant 10 minutes.
L'homogénat
contenant
ainsi
lp.s
plastes
éclat.és
est centrifugé pendant
2 heures
à
100.000 x
g
(Beckman
L3-·50
l:otor
type
42-1).
0:1 obtient
un
culot
constituant
la
fraction
me;.lbraJ~airc
pl~stidiale dont la composition varie selon les cas
(enveloppes
et prothylakoides
pour
les
étioplastes,
enveloppes
et
thylakoides
pour les
chloroplastes; enveloppes
et.
lamelles
achlorophylliennes
pour
les
chromoplas~esJ. Cette fraction est lavée avec du Tris-HCl
50 mM pH
7,6
additionné
du
DTT
10 mM
avant
utilisation.
Le
surnageant
intolore
constitue
la
fraction
stromatique.
20
C/ Critêre~ de pureté
La pureté
des
organites
et
des
fractions
isolées
est
déterminée
en évaluant
les
activités
ci-dessous
1-
NADH-Cytochrome
C-réductase
insensible
â
l'antimycine
L'étude
de
cette
activité
dans
nos
préparations
permet
d'évaluer
le
degré
de
contamination par
les
misrosomes.
Cette
activité
est
déterminée
en
suivant
au
spectrophotom0tre
la
r6ductic::
du cytochrome
C.
fait
à
550 nm
(méthode
de
HACKETT
et
a l . ,
1960).
le
cytochrome
C 0,24
mM,
le
3,5
mM,
le NADH
se
déroule
pendant
15
minutes
10
~l d'Une solution
d'antimycine
de
ID.
réductiC':~
du cytochrome
C.
2-
Succinate
cytochrome C--réduc:-!ase
Cette
activité permet
d'évaluer
le
d~gr6 de contamination
de
la suspension plastidiale
par
les
mitochondries.
Le
milieu
réactionnel
est identique
à
celui
de
la NADH-cytochrome
C-r6ductasc:
mais
dans
ce
cas;
on
remplace
le NADH
par
le
succinate
(20 mM)
et
on
omet
l'antimycine.
3-
Activité
galactosyl
transférase
(Fig.
Il
C'est
un
marqueur
positif de
l'enveloppe
plastidiale
(DOllCE,
1974)
et probablelnent
des
t_hyld:oiclcs
(CILl.l>.NDEns
et
al.
1982) .
Le
milieu d'incubation
utilisé
contient
Sorbitol
0,13
M,
r
14-
Tri s - fI C l
5 0
mM p H 8, 5
M9 C l 2 0, 2 II 11,
U DP -tY - g
Gal u. c t 0 s e
( êl. C t i -/ i t S
spécifique
340 llCi/
~mole, activité dans
le
milieu
d'incubCltion
0,096
Ci),
une
fraction
aliquote
de
suspension
de
plastes.
Le
vol~~e
final
du milieu d'incubaticn
est
de
1 ml.
La
réaction
est
arrêtée
par 2 ml
de
chloroforme/méthanol
(2v/1v) .
21
Les
lipides
sont
extraits
selon
la
technique
de
BL1GH
et DYER
(1959).
L'extrait
lipidique
est
chroQatographié
sur pJaque
de
silica gel
G d2veloppée par
acétone/benzène/eau: (91v/30v/8v)
selon
,-la mét.hode
de
POHL et
al.
(1970)..
Les
lipide~ sont détectés après
pul vér is a tion
d' une
sol u tion
de
prinuline
(\\'IRIGHT,
1971)
e t e Xélli1en
en
lumiêre
ultraviolette.
L'identification
des
différents
lipides
a
été
précédemment
décrite
par
CAMA RA
et
MONtGER
(1977).
Les
résulca~~
obtenus
sont présentés
â
la
figure
4.
4-
Dosage
des
chlorophylles
Les
chlorophylles
a
et
b
sont.
dosées
spectrophotoméi.:riC}uec.ent
par
la
rr.éthode
de
t-1ACK1NNEY
(1941).
La
teneur en
chlo~'ophylles tot2.1e,;
est é val Il é e
selon
la
f 0 y lil U J. e
de
13 n. Ul N S t·1ll
(1 <) 6 3) .
--
chIo r 0 p h Y Ile
a
(mg/l)
12,7.D663
-
2,G9.D645
chlorophylle
b
(mg / 1)
22,9.
D615
-
1,G8.D663
-
chlorophylles
totales
(mg /1)
1000 x
D. 652
36
5-
Dosage
des
protéine~
Certains
plastes
(chromoplastes
et
éventuellem2~t chlo~o~
plastes)
sont
délipidés
par
un
méli'lrlfJc
Acétone/éthanol
(2v/lv)
cl
rai son
de
4
ml
de
mé la n 9 e
pou r
JIll
des us p e !1 s ion.
A I:J r è s u n e
nui t.
au
congélateur,
l'ensemble
est
centrifugé
à
2000
x g
pendant
10
minutes.
Le
culot
o~tenu est
repris
dans
du
NaOU
0,1
N
Une
fraction
de
cette
solution
est
utilisée
pour
le
dosage
des
protéines
( L 0 vi H. y
et
a l . ,
1 9 5 1. ) •
111-
ANALYSE
DES NUCLEOTIDES
PYR1DIN!QUE~ (VERMEERSCH,
1976)
L'extraction
des
nucléotides
a
été
réalisée
directement
sur
l a s us pen s ion
de
pla ste s
(1-1 AT S UI-J II H. A e t
1,11 YACHI,
1 S 80). 500 )J l
d'une
suspension
de
plastes
prélevés
sont plaCÉS
dans
un
broyeur
de potter et
entreposé
dans
la paillasse
froide
en prévision
de
l ' ext:raction.
Les
opérations
concernant
l'extraction
diffèren~ selon
o~e
l'o~ veut extraire
les
foY~es oxydées
ou
les
form~s rédui.tes.
22
---,-------.------r---
M
'Of
~-
>~
0-
o
W
l!J
40_
n:
o
0..
Ci:
o
o
z
LU
30
r-
>
l-
u
q
o
o
<!
r:c
20
CiM~~ique dliMcDhpoha~ion de galacto6~ daMh lel galac~o
lipide6
(moMogalacto6yldiglyce~ideJ digatactohljid;gtucc~;de J
6:téhOlf].tyc.C'.hideJ
paIL .te,!:'
ChflO;ilOpla,~:tC'..6
;-6olé~ cie. Fo.éVJLon.
@ monoRalac~ohyldiglyc~h;de)
v 6te.h-:3tg.tyco6ide •
23
AI Extraction
1 -
Les
for ru e s
réd u i tes
( NAD H,
NAD p.r: )
Le
broyeur
de
potter et son
pilon
sont plongés
dans
l'azote
liqu~de. 1 ml de NaOH 0,2 N est ajouté au contenu du potter et se
trouve
instantanément
congelé.
Le
pilon
est
mis
en
place
et
la base
du potter
est plongée
dans
un
bain
d'eau bouillante
d'un
volume
suffisant pour que
l'ébullition
ne
cesse
pas.
30
secondes
suffisent
au dégel
qui
permet
l'homog~néisation. Le broyage ne doit pas durer
plus
d'une
minute
et
demie.
Une
saumure
de
glace
(-21°C)
est
utilisée
pour
assur2r
pendant
une
minute
le
refroidissement brusque
du broyat
qui
est
constamment agité
pendant
l'opération.
Le
tube
de
broyage
est
transféré
de
la
saumure
dans
la glace.Le
pilon
est
rincé
par
ml
du
milieu
de
broyage
afin
de
récupérer
tout
le
milieu
d'extraction.
Le
pH
est ensuite
ajusté
entre
8 et 9
par
le
!lCl
lN
et
l'électrode
du pH
m~tre est
rincée
avec
du
tampon
bicine.
2-
Les
formes
oxydées
(NAD,
NADP)
On
utilise
le
Hcl
0,2
N com~e
milieu
d'extraction
et
le
pH
est
ajusté
entre
6,5
et
7
au
moyen
d'une
solution
de' soude
lN.
Pour
le
reste
des
étapes
de
l'extraction,
le
protocole
est
~dentique
â
celui
des
formes
réduites.
I l
faut
noter
que
la
durée
de
l'ensemhle
deR
opérations
d'extraction
ne
doit
pas
excéder
10 min
pour que
les
formes
réduites
soient bien
conservées.
Les
extraits
sont
centrifuqés
directement
dans
les
tubes
de broyage pendant
3ü
minutes,
ajustés
d
5 ml
avec
le
tampon
bicine.
Les
extraits
sont
dosés
immédiatement ou
un
jour après
la
congélation.
BI Dosag~_
( VER r,m ERS CH
e t
a l . ,
1 9 7 7
LECHEVALLIEH et
al.,.
1977
1
t·10 N E GER
e t
a l . ,
1 9 7 7 ) .
Le
dosage
des
différentes
formes
de
nucléotides
pyridj,niques
est
eff~ctu~ par oxydo-réduction enzymatique cyclique.
Chuque
(; 0 e fl Z y rI! e
S Li bit
éi. l t. E :c li éi t i ""v 2 Iâ e il t
ü. n G r é duc: t. i G ~
P 2:;::-
uns y s t è IT! e
~ n ~~ y ID. é!. -
24
:
1
1
tique
spécifique
(ce
qui
permet
le
dosage
séparé
des
formes
phospho-
rylées
et non phosphorylées)
et
une
oxydation
spontanée
par
le
PESo
Ce
dernier est réoxydé
par
le
BT,
dont
la
forme
réduite
(formazan)
présente
un
maximum d'absorption
à
570 nm,
ce
qui
permet
l'étude
cinétique
de
la
réaction
au
spectrophotométre.
IV-
PREPARATION
DES
SUBSTRATS
AI Extraction et purification des chlorophyllides
(a+b)
(FiS.
::)
Les
chlorophyllides
(a+b)
sont
extraites
à
partir
de
feuilles
d'Epinard selon
la
méthode
de
HOLDEN
(1961).
Les
feuilles
débarrassées
de
leurs
nerv~res sont
lavées
plusieurs
fois
à
l'ecu
distill~e et découpées
en
fines
lamelles.
Le
matériel
obtenu
(20 g. MF)
est broyé dans
200
ml
(i' acétone
à
50~.
Le
broyat
est
conservé
à
l'obscurité,
à
la
température
ambiante
pendant
18 heures
au
moi~s
avant d'ètre
f i l t r é .
Le
f i l t r a t
est
~xtrait à
l'éther
de
pétrole,
ce q~i permet
d'éliminer
les
chlorophylles
qui
n'ont pas
été
hyd~:olyséc~,. La pl1a::.:e
hydroacétonique
contenant
les
chlorophyllidcs
(a+b)
est
extraitê
c.;.
l'éther
éthylique.
Cette
phase
éthérée
est
lavée
plusieurs
fois
à
l'eau distillée
avant
d'être
mise
â
sec.
La purification
des
chlorophyllides
se
fait
sur
couche
mince
de
plaque
de
Cellulose.
Les
plaques
sont d2veloppées
dans
\\ln
syst.è!ne
constitué~ pa.;: !·;ét.Li.inol/
dichlororuéthane/eau
100vl
18vl
20v
(SCHNEIDER,
1968).
Le
spectre
des
chlorophyllides
(a+b)
en
solution
dans
l'éther
éthylique
est
présenté à
la
figure
5
Il
présent8
les
caractéristiques
suivantes:
(À
,1a):,
éther
éthyliy'ue
tJ. 50
n ru,
6 4 /.
n );, )
La
te n e u r e n
ch 10 r op h Y Il i d cS est
dé ter ni i née
sel CJ Il
les
équa.tions
uti U.s é e s p a r
CO!'ll-\\R et
Z sCj-J}.;;r LE, Cl 9'12) 0'
chlorophyll(ide)
a
(mg 11)
9.93
D.G60
-
0,78
D.642,5
chlorophyll (ide)
b
(mg 1 1)
1 7 , G D.bi}2,5
-
2,8
D.660
chlorophyll(ides)
totales
(mg 11)
7 , 12
D.660 +
16,8
D.642,5.
Les
chlorophyllides
purifiées
SO:lt
conservées
dans
l'ethe:::
éthylique à
-
20°C
jusqu'à
utilisation.
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _.
-1
25
1
450
G42
'--'_J_U_'.-Ll_1_LJ_..J_-l_L..L'--'-..L--l.-
1 J-.Ll...J -LLJ ...J_..J-LLJ,--,I~I-l--A.-l.J..J ....
370
/:·70
700 nnI
Spe.c.):"U'.. de. .ta c.ft.toll.Opily.tL<'de..
(a+bj
e.x.tJz.o..Lte. de..
6e.lù.. /:.t.t!../.J
d' Epino..Jz.d,
e..n ~o.tution
dan6 .t'~the..Jz. ~thylique..
26
BI Extraction et purification des protochloyophyllides (Fig. 6)
Elles
sont
extraites
à
partir de
feuilles
étiolées
de
Blé.
Après
9
jours
de
germination
à
l'obscurité,
les
feuilles
coupées
e t
t rai té e s p a r
une
sol Li t ion
cl' a cid e
0- a I!1 i no l é vu l i, ri i que
Il
lJ1 (,j
son t
conservées
à
l'obscurité
pendant
24
heures,
ce qui
a
pour but
d'induire
une
accumulation
de
protochlorophyllides.
Les
feuil'les
sont:.
dans
l'acétone
b r 0 y é esTav e c u n e
pin c é e
d e s ab 1 e
e t
duc a r bon a t e
de
D1ù 9 nés i u In •
Le
broyat est
filtré
et
le
résidu cst
rincé
avec
de
l'Éther
étllylique
Le
f i l t r a t
extrait â
l ' é t h e r éthylique
est
plusieurs
fois
lav6
d
l'eau distillée pour
éliminer
l'acétone.
La
suite
des
opérations
se
déroule
selon
la.
méthode
décrite
par GRIFFITHS
(1978).
l\\près
séchél<J~
sur NaCl,
à
l ' e x t r a i t éthéré
est
ajouté
un
volume
égal
d'éther de
pétrole.
A l'ensemble
transféré
dans
uneampoule à
décanter
est
ajouté
l e
1 1 10
des 0 TI
vol 'J me,
d' un
!TI é l ëHI 9 e
Dl é th a n 0 lia 111 Dl 0 nia q li e
0, 0 l
f·j
(4v/1v).
Il
se
forme
une
biphase.
La
phase
i:Jférieure
contenant
les
protochlorophyllides
est
récupérée.
Cette
dcrniè~~ opération
est
répétée
deux
à
trois
fois.
Cett~
bypophase
extraite
de
ncuveau d
l'éther éthylique
est
lavée
et
séchée
comme
précédemment.
L'extrait
mis
à
sec
est
conservé
dans
l'0ther
éthyliq'Je
jusqu'à
utilisation.
Le
spectre
des
protochlorophyllides
(a+b)' en
solution
da~s
l'éther éthylique
(Fig.
6)
présente
les
caractéristiques'
déc r i t c s p a r
BOl-lB ART
e t
il 1. (1 9 8 1 ) .
( ),
ma x
;
é the r
é th Y l i que
431,622)
La
teneu~ en protochlorophyllides est estimée selon
la
formule
de
KLEIN
et SCIIIFF
( 1 97 2).
protochlorophylls(ides)
(mg/l)
= 28,6818 D.62G -
5,2091
0.663.
cl Préparation des chloroohylles marquées
Les
feuilles
étiolées
de
blé
de
7
jours
de
germination
sent
,
-
,
d
[ 1 t1 "1
" J :
•
l -
"
.
excis~es
et
traltees
par
une
solutlon
e
~aCloe
u-amlno
evu~Jn}quE
(46 rnCilmt101e,
25
~Ci). Après
12 heures
à
l'obscurité,
le
mat.ériel
L. 1
431
6?2
1
1
1
1
1
1
1
\\
1
\\
1
\\
K-.~.~//\\
1
_
1
1
1
""----:
_L-l_'_Ll_J_L.J_I---LL_I_LLLI-.LJ_L_LJ_J,__L..I__LL_L.J_L.J.
L
ï00 flTI
400
500
GOO
Figu};e {;
Srec~he de la rhotochlo~orhy!lide [a+bl
eit~ai~e de
6e.u.-i.lte6 de Blé é.,ti 0 f!.-é,
en ,~o.tuI,LoJ'7. dCULh f'é.:thC',fL é>thyLi-quC-.
est rd!';
.2
C:;claire~.
Au bout
de
8
heures,
les
feuilles
so'nt broyées
:1
successivement
dans
l'ac6tone,
puis
dans
l'acétone
à
90%~
Les
1
chlorophylles
extraites
à
l ' é t h e r
éthylique
sont
séchées
et
reprises
par de
l'éther
de
pétrole.
Après
passage
sur
colonne
de
cellulose,
elles
sont
chromatographiées
sur plaque
de
Silica-Gel
G ajustée à
pH
7 et
développée
dans
le ,système
éther
de
pétrole
(40 0 -60 0 C)1
.J,.cétone
60v/40\\7.
Les
chlorophylles
sont
conservées
dans
de
l ' é t h e r
de pétrole
à
-
20°C
jusqu'à
utilisation.
DI Préparation et pyrophosphorylation des alcools terpéniques
Les
alcools
terpéniques
pyrophosphorylés
ont
été
prépar6s
dans
notre
laboratoire
selon
la
méthocle
décrite
par
CAl·1ARA
(198 étb, C' J.
V-
INCUBATION
AVEC
LES
PRECURSEURS
MARQUES
ET
ANALYSE
DES
PRODUITS
AI CU;~}Jositic!n
du
milieu
d'incubation
Le
milieu de
base
u t i l i s é
pour
l ' e s t é r i f i c a t i o n
2~
la
chlc-
rophyllicle
contier.t
un
volume
final
de
2 ml
11gCl
15
mI1,
t1nC1
5
,:~~.~.
2
2
DTT
10
mrf;,
FK
5 mi-i,
NADPH
0,05
mt-l,
saccharose
0,4
l·i,
Tris-HCl
50
!:;~.~
e
(pH
7,6),
un
alcool
marqué,
une
suspension
de
plastes
dont
la
te:l0Ur
en
protéines
est
déterminée
selon
la
méthode
de
LOHRY
et
al.
(1951).
La
réaction
se
déroule
à
25°C.
Dùns
~.e
cas
des
chrcGo-
plastes,
nous
ajoutons
au
milieu d'incubùtion
d0crit
ci-dessus,
20
~S
de
chlorophyllides
(a+b)
extraites
de
feuilles
d'Epinard
scIon
la
ru é th a cl e
do
HO L DE !'J
(1 9 6 1),
pur i fié e s
selon
S CH N E ID;': R
(1 9 6 8)
e t
ému l s i 0,.
nées
dans
2,5
mg
de
Tween
80.
La
réaction
est
arrêtée
par
cle
l'acétate
d'éthyle.
L'inclibat
ott épuisé
pÙ.r de
l'acétone
anhydre.
La
solution
pigmenta.ire
est
ensuite
transfér6e
clans
de
l ' é t h e r
éthylique
dép~roxydé. Aprês
plusieurs
lavages
â
l'eau d i s t i l l é e ,
l ' e x t r a i t
est
séché
sur
NaCl
et
concentré
à
sec.
A
partir
de
ce
mêMe
milieu
de
base,
nous
avons
également
essayé
de
mesu~er l'ùctivité
de
la
chlorophyllase.
Pour
ce
fai:!:'e,
-3
selon
les
tubes
d'incubation,
nous
y
avons
ajouté
p- Cl-lB
10
l·j,
*' La nature de l'aléool est précisée dans la partie résu';"tat.s
29
ac&tone
25%,
Tween
80
500 ~g,
Triton
X-loO 0,2%,
chlorophylles
(15.642
dpm).
La
réaction
est
arr~tée par 3 ml de chloroforme/méthanol
(~v/lv). Au contenu de
chaque
tube,
on
ajoute
5 ml
de
mélange
chlo'~cfornle/lii<2thanol (2v/1v)
et
1 ml
d'eau
distillée.
Après
homo-
g6néisation
ct
centrifugation à
2.000
g
pendant
5
minutes,
on
récup0re
l'hypophase
contenant
les
pigments
et
on
le
concentre.
Dans
certains
cas
expérimentaux où
nous
avons
utilisé
l'IFP,
nous
nous
sommes
également
intéressés
à
d'autres
voies
de
biosynthèse
utilisant
ce précurseur
commun.
A_insi
pour
l'étude
des
cdyotènes,
on
ajoute
le
FAD
au
milieu d'incubation.
La
sépara-
tio~ d2 chaque produit de synthêse est réalisée selon une méthode
appi:opric~e.
BI Mesure de la radioactivité incorporée dans les chlorophy].lc~
.
-
ct
les
alcools
di terpéniques
(géranylgeraniol
et
dérivés)
Une
fraction
de
l ' e x t r a i t
est
déposée
sur plaque
de
Silica
Gel G.
Le
développement
se
fait
dans
le
mélange
éther de
pétrole
(40-GO°C)/
Acétone
60v/40v.
Les
chlorophylles
(a;b),
Rf
0,65
0,70 et
les
alcools
diterpéniques
sont
récupérés
séparément.
Les
chlorophylles
sont
repurifiées
par
chromatographie
~ur plaque
de
Silica-GeJ
G développée
dans
le
chlorofonne
(\\'IELLBURN,
1976).
L'é 3. li t ion s e
f ait
a v e c
l C
!TI é l an g e
1-1 é th an 0 l. / [, c é ton e
(4 \\" / 1 v)
( DUGG1;1'J
et
REJ3EIZ,
1982).
Les
alcools
diterpéniques
sont purifiés
sur
plaque
de
Silica-Gel G développée
dans
l'éth8r de
pétrole (Cl'.!·lARA et
a~.
1 C) G::> (_~) •
CC' s
a l co cl S
son t
dé t e ct é s e n
UV a. p r ès
.D LI l v é ris a t ion
d' une
soll,tior:
de
Hhodamine
6G.
Une
étude
plu:~
déta.J lIée
de
la
nat.ure
de
l'alcool
estérifiant
les
chlorophyllides
a
ét~
réalisée
apr~s sapo-
nific,c::t.ion
èes
c:xtraits
(Ci1,!:lt,RI\\
et
a l . ,
1982!J)
et.
ch~omatographie
de
l'insaponifiable
sur
plaque
de
Silica-Gel G imprégnée
de
paraffine
(5~.·)
développée
dans
le
mélange
méthanol/eau
70v/30v
(STAHL
et
JOfŒ,
1965).
Une
autre
cl,romatogra.phie
sur
plaque
de
Silica-Gel G
p~lvérisée
d'une
solution
de
AgN0
(10%)
da~s de
l'acétonitrile,
3
développée
dans
Je
m61ange
Ether
de
pétrole/éther éthylique
50v/50v
a
ét6
effectuée.
Dans
ces
deux
derniers
cas,
les
taches
sont
détectées
par autoradiographie
sur
film
"Kodire>: Kodak".
_, I.J
C/ Analyse
de
la
chlorophyllide
mar~uée, libérée sous l'action
de
la
chlorophyllase
La méthode
utilisée
est
la
méthode
modifiée
de TANAKA et
~l.
\\1982~ Une quantité connue de pigments extraits après incubation
est prélevée
et
déposée
sur plaque
de
cellulose
développée
de.ns
le
système
Ether
de
pétrole
(40 0 -60°C)/Acétone
80v/20v.
Les
chlorophyllides,
Rf
0-0,4
ainsi
séparées
des
chlorophylles
et
des
carotènes
sont 01uées
à
l'acétone.
D/ Mesure
de
la
radioactivité
incorporée
dans
les
carotènes
Les
carotènes
ont été
purifiés
par
chromatographies
successives
sur plùques
selon
la méthode
de
C~MARA et
al.
(1982b)
La première
chromatographie
est
effectuée
sur plaque
de
Silice.-Gel
G
développée
dans
un
système
de
solvants,
constitué
par
~ther de
pétrole
(40-60 0 c) /acétone
60v/40v.
Elle
permet
de
séparer
lES
carotènes
des
autycs
pigments
plastidiaux.
La bande
de
carotèr,e
récupérée
sur
le
front
est
éluée
à
l'acétone
puis
concentrée
pour
une
deuxième
chromatographie.
Celle·-ci
est
réalisée
de
nouveac: .SU2--
plaque
de
Silica-Gcl
G développée
dans
l'éther
de
pétrole
(40-60 0 C)
seul.
Celle-ci
a
pour but
d'éliminer
les
alcools
entraînés
lors
de
la première
chromatographie.
Après
révélation
â
l~ Rhodamine SS
( 0 , 05 %) e t e y. a men à
l ' UV,
0 n
ré cu p ère
t 0 11 t e l a
Z 0 n e
dé l i Hl i t é e
~) a r
le
squalêne
(Rf 0,6)
au-dessus
de
2cm
du dép6t.
La
chromatographie
de
MgO/kieselgur
(lw/lw)
devéloppée
jans
éther
de pétrole/benzène
90v/10v permet
une
séparation
très
n~t~e
des
différents
types
de
carotènes
(phytoène,
phytofluènE_cis,
phytofluène_trans,
a
carotène,
S carotène,
zétaca.rotène)
s' ils
peuvent être
détectés.
E/ Technique
de
comptage
et
calcul
de
la
radioactivit6
La
radioactivité
est
déterminée
par
comptage
en
s c i n t i l l a -
tion
liquide.
Une
fraction
aliquote
de
l ' e x t r a i t purifié
est
introduit dans
un
flacon
de
comptage,
mi?e
à
sec,
puis
additicnné2
de
10 ml
de
mélange
scintillant
constitué
de
2,5
diphényloxazole
(ppo
3g)
et
1,4
di
2-(4-méthyl-S-ph6nyloxazolyl)-benzêne
3 1
(àirnéthyl-popo~'" i
0,5
g)
par
l i t r e
de
toluène
(BRAMLEY
et
a l . ,
1974).
La
correction
d'extinction
("quenching")
est
effectuée
par
la
m(,thodc
de
l'étalon
("standard")
externe
en
u t i l i s a n t
des
échantil-
lons
ès
référence
[3 Hl
hexadécane,
[14 c ]
hexadécane.
32
RESULTATS ET DISCUSSION
1-
DEGR~ DE PURETE
DES
SUSPENSIONS
UTILISEES
T
._' '.
.........,
su,,;n('n~;jons
l..'
de
chloroplastes
Les
activités
succinate
cytochrome Cr6ductase
caractéris-
tique
des
rr.itoc:llcY1dries
( 0 , S n mol e
de
c y toc h rom e
C
réd u i t / m11 / !:, 9
de p ]~ r) t é i ne)
e t
lU:, D H
c y toc 11 rom e
C
r 6 duc tas e
in sen s i b 1 e
à
l ' a 11 t i my c i ne
caracl~ristiquc des
microsomes
(0,4
nmole
de
cytochrome
C
réduit/rn/
mg
de
p:cotéine)
mesurées
dans
les
suspensions
de
chloroplastes
intacts
sont
n~çligeables. La
chromatographie
sur plaque
(CAMARA
et
l·jÜ;~r~GE~-::,
197"1)
de
l ' e x t r a i t
lipidique
montre
q u ' i l
ne
contient
pas
(:(."~ phos~}!J,~tiôyléthanolù.i;;ine. L'enser.,ble
de
ces
données
peerElEt_
d'e~clure une
cOI,tamination
par
les
membranes
e~traplastidiales.
Da;1s
le
cas
des
c11romoplastes
l ' activit(~ succinate
c:,'to-
chrome
C r~~uctase
est
n~glige~~le, de
méme
que
celle
6e
la
NAD~
cyt.ochror'0
C
réductase
insensible
à
l'antimycine
(3
nr:101es
de
cytochron!<:~ C réôlJi.t./min/mg de protéine).
Lac 0 li1? Cl s i t i 0 II
li. P i d i Ci u e
des
ch rom 0 pla. s t. es
( T .) b 1 e a li
1)
ln o!: t r r
la pr~sence de
phosphatidyléthanolamine
dans
les
chromoplastes.
Ce
lipide
est
typique
des
syslèmes
membranaires
extraplastidiaux
( !'i A Z L l Ï\\ K,
1 9 "7 7).
Dan s
nos
co j} dit ion s
exp é 1'- i ni en t ü 18 s,
l ' 0 mis s ion
du
l;j,'Isnésium
diH!:::;
le
milieu
cl' isolement
permet
de
réduire
son
contenu.
En
cffe~ en élimi!lilnl le magnésium du milieu d'extraction,
on
Yéêuit
ncta.blernent
sa
teneur
(Télbleaü.
de
mfme
que
l'aggluti-
nation
des
chromoplnstes
par
d 8 5
membranes
extraplastidiales
( CA r·i II f( A
~ t
a l . ,
1 9 8 3) •
1-
La
fr~ction membra~ajre
• Dans
le
cas
des
chloropJ.astees,
l ' a c t i v i t é
UDP-galactosyl-
t r an s f (-:' ras e
r'"araurou"
\\,..-J.1
_
_
'-_
......
posi ti. f
de
l'enveloppe
plastidiale
(DOUCE,
33
TABLEAU
l
Composition
en
lipides
des
chromoplastes
de
Poivron
isolés
dans
un
milieu
d'extraction
avec
ou
sans
magnésium
(10
mM) .
Teneur
exprimée
cn
~g/mg protéine.
- 1
Teneur
en
lipide
g.mg
protéine
Catégories
moléculaires
Chromoplastes
Chromoplastes
préparés
avec
du
préparés
sans
au
des
li_pides
HgC1
t-1g C 1
2
2
Mono9alactosyl~i91ycéride
85
103
Cigalactosyldiglycéride
76
102
Sulfoquinovosyldiglycéride
1 7
16
Phosphatidylcholine
'13
26
Phosphatidyléthonolamine
25
5
Phosphatidylinositol
9
5
Phosphatidylserine
1
o
Pbosphatidylglycérol
13
6
11. c i ct e
ph
o
0 ,3 P Il a i~ i d j. CI u e
6
TOTAL
275
263
34
1974)
et
des
thylakoïdes
(GILLANDERS
et.
a l . ,
1982D dans
les
membranes
pli:lstidiales
(enveloppes
+ thylakoïdes),
après
inc~bation avec de
r;;
14-
l ' UDP - ,y -
cj gal a c t 0 S ces tes t i TIl ~ e par mes ure deI a rad i 0 a c t i vit é
incorporée
d~ns le œonogalactosyldiglycéride
(17400
dpm/mg
protéine/
heure)
et
dans
le
digalactosyldiglycéride
(1425
dpm/mg
protéine/
heure)
Dans
le
cas
des
chronoplastes,
l ' a c t i v i t é
UDP-galactosyl-
tlansférase
est
présente
dans
les
membranes
p l a s t i d i i l l e s .
On
note
une
faible
activit~ dans
la
fraction
sté:colglycoside
(Fig.
4).
1 l;
Quand
les
chromoplùstEs
sont
incubés
ilvec
l ' UDP- [u-
9 galactose,
l~ radioactivité
se
répartie
principalement
entre
le
monogalactosyl-
diglycéride
et
le
digalactosyldiglycéride.
L ' a c t i v i t é
de
la
galacto-
syltransférél~.e est
linéùire
ju~.~c~i}'è 20
minutes
dans
nos
conditions
expérimentales.
Nous
enregistrO:1S
O,~ p~ole/min/mg protéine pour le
monogalactosyldiglycéride
et
0,04
pmole/min/mg
protéine
pour
le
digalactosyldig}yc6ride.
La
faib~e radioactivité
observée
dans
le
stérolglycériûe
(a, 01
pmole/lilir:/J'ii]
protéin,,~) PQurrait êt.re due à
l ' a c t i v i t é
ri'une
épimérase
D'autres
auteu~s ont
suggéré
une
illc.orporation
directe
de
galact~()se dans
le
s t é r o l
(LIEDVOGEL
e t
KLEI 11 l G ,
1 9 7 9).
L il.
q U é.. n t i té
cl e
r ~ d i 0 é~ C t i vit é
r e t r 0 U v é e
dan s
l a
fraction
SLé.::-olylycoside
après
jncorporéttion
de
UDP- IT!l4 c]
galc3.ctose
est
[~ible par
rapport
3
celle
observée
dans
les
chromoplastcs
de
N c: y. c i _. S li S
( LIE DV0 GEL
e t
KLEI 1'-1 l G,
1 9 "7 7
1979)
e t
de
TroPileolum
( LIE DV0 GEL
(~~ al.,
1 9 7 8).
L'O r j_ <;1 j ne
d e s té roI 9 1 Y cos ide
dan 5
les
c!n-ornoplastes
n'a
pc3.S
été
encoro
précisée.
2-
La
fr2cticn
stromêltiquc
(Fi_g.
7)
Dans
les
deux
types
d2
plastes,
la
fraction
stromatique
est
dépourvue
de
pigments
mell1b_cG.naires
(carot_énoïdes,
chlorophylles)
Le
spectre
c1.o.ns
l ' u l t r a v i o l o t
et~
le
visible
(Fig. 7)
permet
de
noter
la
présence
d'Un
pic
à
278
nm
correspondant:
probablement
à
des
prot~ines ou des
acides
nucléiques.
L'ensemble
des
données
présentées
ci-dessus
montre
que
les
chloroplastes
et
les
chroliloplastes
isolés
p:césentent
des
conditions
3S
---l-----·--..-----r-.------r--------.-------.---.---~
1
1
Î
\\
/
\\/
\\\\
1
1
1
- - - - - ' - - -
1
!!1l_ __~ _ _._.
_
_.'_ -._._.__ _..
..l.--_.
. _ _ ._._.
•. ..!._.
......l. _ .__
4·5:J
n rll
Sp0'.C.t110'.
ci: ab,j(lJLp.t-i..on de. fa
6J~(~c.;tiMl .!:>.t!LOlrIO>t-i..qU.e.
C?vt
!:J 0 .tu,t-i..o Il
dan!:J
;CJt..!../.,
) 0
lil::\\
1'1/-1
7, (,:
VTT
10 IJlM
36
que
nOlls
envisageons.
II
-
MISE
EN
EVIDENCE
DE
L'ACTIVITE
CHLOROPHYLLE SYNTHETASE
DANS
LES
CHLOROPLASTES
ET
CHROMOPLASTES
INTACTS
DE POIVRON
i~,~1::.::":.-:i~..!~l,_,i~~_'~um) ET IH'-TURE DE L'ALCOOL DI'!'ERPENIQUE ESTSRIFIM1T
LA
CHLOROFHYbLIDE
1-./ r;Gsultat:~;
-
.
.
d
r
l. 4 ] .
-
Apres
IncorporatIon
eL1 -
~ Isopen~enylpyrophosphate
par
les
susp~nsions plastidiales on obtient,
après
analyse,
deux
l-
Une
in corpora ti.on
de
la
radioactivité
dans
les
chlorophylles.
2-
Une
incorporation
de
léi
radioactivité
dans
les
alcools
diterpéni-·
q11e s
lib res .
Les
f i 0 li j~ e s
( 8 a , b )
montJ:ent
que
les
chloroplùstos
et.
les
ch r 0 r.J 0 1.) l ü ste s i : , 0 lés
de
P 0 i v r 0 n
.i. n cor pOL' e n t
l ' i s 0 pen té n y l p Y r 0 ph 0 s F h "'. L (-
dans
les
chlorophylles.
Dans
les
chlGropJ.astes,
cette
inc0rporation
se
fait
d'une
manière
progressive
et
continue
en
présence
de
Dans
les
chromoplast0s,
l'in~orporation lente
au
d~but de
la
réaction,
atteint
très
tôt
SOll
optimum
après
2 heures
d'incubation
(Fig. 8b), Plu-Celil
de
cette
durée,
on
obsE;rve
un
palier.
I l
faut
noter que
dans
le
CélS
des
chro:r.oplastes,
la
syn'chèse
des
chlorophyl-
les
exise
la présence
de
chlorophyllides
exogènes.
Apr~s 10 minutes d'incubation, alors qu'on~~ que 3,66 pmoles
de
radioactivitd
incorpor6e
par
~g de
protéines
pour
les
chromo-
plastes,
on
enJ:egistre
5,4
pmo12s
pour
les
chloroplastes.
Après
2 heures
d'incubation,
la
synthèse
des
chlorophylles
par
la
suspensiol
de
chromoplastes
devient
stationnaire
aprês
un
maximum.
Dans
J.es
chlorcplastes,
on
observe
encore
une
synthèse qui
persiste,
m~me
a u - deI il
d (~
4 h e L1 r c sel' .i.. n c u b êt t ion .
37
Apràs
saponification
des
moléc~les de chlorophylles marquées,
l'alcool
libéré présente,
sur plaque
de
silice
imprégnée
de
paraffine
(5%)
et
développée
dans
le
mélange
méthanol/eau
70v/30v
(STMiL
et .]ORK,
1965)
les
èaractéristiques
(Ef
0,02)
d'un
alcool
cl i t ~ r 1-' <2 n i c.~ u e.
l, p r è, s
ch r 0 !i! a t 0 g r 2 p il i e
S D r
pla que
d e s i l i ce
i In pré 9 née
de
ligN0
(DOG13G
.~al., 1982),
cette
fraction
alcoolique
se
résoud
3
en
3
bandes,
Rf
0,16
(qui présent.e
les
mêmes
caractéristiques
que
le
g~ranylgéraniol)
Rf
0,27
(Ciui
pournlit
être
le
dihydrogé-
ranylgéraniol)
et
Rf
;
0,80
(qui
préser.te
les
mêmes
caractéristiqties
que
le
phytol.
La
répartitibn
de
la
radioactivité
incorporée
dans
la
fraction
alcoolique
(géranylgéraniol 94,6%,
dihydroq0ranylgéraniol
5,1%
et phyt.ol
(0,3%)
montre
que
dans
ncs
conditions
expérimentales,
la r~duction progressive
jusqu'au stade
du
phytol qui
constitue
la
cha J. rI e
lat é r él l e
cl c
l o.
ch 1 0 r 0 p 11 Y 11 e
n'e s t
que
f ai b 1 e E1 e n t.
réa lis é e .
libr~s
(Fig.
Ba,b).
L'analyse
de
la
fraction
alcoolique
libre
obtenue
aprês
incorporation
montre
qu'il
Existe
également
une
voie
de
biosynthêse
de
ces
molécules
t.erpéniques
telles
que
le
géranylgéraniol
et
le
phytol
dans
les
suspensions
plastidiales
(Fig.Barb).
L'observatio~
des
figul-es
(Ba,L)
montre
que
l a
synthèse
de
ces
mol~cu1.es alcooJ.i-
que s
é lev é e
él u
d r~ but de
1.' in c Ll bat. ion 1
d j nd n u. e
pro 9 r e s s ive men'=-
a 1 (; J:" S
que
celle
des
chlorophylles
croît.
Ce
phénorr.ène
laisse
suggérer
l'utilisation
simultanée
du
r.1êm8
précurseur duns
les
deux
voies
de
;
b i 0 S y n t]1 .'~ se.
B/
Dj. s eus s ion
Cette expérience
met
en
évidence
l'existence
de
deux
phénomênes
concommitants
1.
La. pré sen cee t.
1.; a c t i vi. té
d' 11 n e
e n z y mec a.!? ab l e
Cl e
c a t a lys e r
l'estérification
de
la
chlorophyllide
en
présence
d'un
substrat
de
nature
alcoolique.
2.
La synthèse
d'alcools
ditcrpéniques.
38
120
1SQ
300 min
------\\
8
1
3001_
~5ol
2001-
0
:::1: 1
J }
r () _~_I.---,
;
oI./·.~~:~
~::~=:::-:=!i-.
~,
.""""
.,, .
1__
20
GO
r~iUlhf!. ~
Inco~ro~ation d';~opent~l1u!ry~opho6phate dan6 la chlo~ophyile
(C(~b) e..t t'!..6 aLcooE-6 d.{.:éeJtpé.n.<.qLU!.-6
(9~'~Lo.ny,f9ŒJLO.Sliot,
dihydJ1o-
gfnanu.tgé.~aniot, phUtoll pa~ te~ pla~t~~ ;~olf6 de 6Jtuit de
PQ .i. t; !L Ù Il .
e
;-6opent~nulpYJtophohphate incOhrOh~
dal16
t~ chioJtophytl~
/:>,
i'!'opellté.!lyt,I:lYJLopf1o-6)JfIa:t2. .{.I1CQ/Lpo/l.é dcu'!.-6
le.,!J
cu~coot-6
dLtr?-h.péVl,Lqu~6 .
39
L ' e): i ste n c'c~
de
cet te
'e n z y III e
a
él:. é
mis e
en
é vi den c e t 0 u t
récemment
par
RUDIGER
et
ses
collaborateurs
en
1980
dan;
les
membranes
d'étioplastes
d'AVoine.
Cette
équipe
l ' a
dénommée
'n ch 1 0 r 0 p h Y 11 e
s y n t. h é tas e "
( s p é c i fi que
d e I ' est é r i fic a t ion
d e I a
chlorophyllide)
pour
la
distinguer
de
la
chlorophyllase,
qui
selon
certains
auteurs
catalyse~ait l'estérification en plus de
s 0 fi
a c t ion
h y d roI Y t i q 1.1 e
( ~'I 0 L F F
e t
P RIe E,
1 9 5 7
SHIMIZU
e t
TAMAKI,
1963
SUDYIIJA,
1963
BOGER,
1965
CHIBA ~t
cd.,
1967
\\'lELLBURN,
1970
EL L S \\'!O .R'l' Il,
1 9 7 1
1972
BOGORAD,
1976
1-10LL
et
STEG\\'/EE,
1978)
!~ 0 us
è. von s t e sté
.l' a c t i \\' i té
d e I a
ch 10 r 0 p h Y I l as e
dan s
nos
préparations
en
suivant
l ' a p p a r i t i o n
de
la
chlorophyllide
dans
1<:.:
milieu
c'incubation
à.
part.ir
de
la
chlorophylle
marquée,
~ Ci"ù r fi i e.
J) a 11 s I e s
con è i t i 0 ~I S
no r ln ê.l es,
c' e s t -- à - di r e
ce I l e s /'q u i
se
r a P l' roc h e J~ t
ri e
nos
con à i t ion s
exp é r i men t ale s
( T ab l eau
2),
l e p 0 u r _.
centage
de
chlorophylles
hydrolysées
varie
de
1%
à
1,28%.
Cependant
l ' a c t i v i t é
ùe
cette
er,7.'!lfJe
peut
être
mise
en
évide:1ce
dans
nos
Jlr<~pilrations ~i
0:1
r':~alise les
conàitions
de
son
activi.té
(présence
ô (>
(~é ter 9 e n t
0 u
d e s 0 1 van t.
0 y 9 an i. que
e. g.
a c é ~~ 0 ne.
DL:.;, s
ces
c <J. S 1
(Tubleau
2),
le
pourcentage
d'hydrolyse
a t t e i n t
8,6%
pour
l'acétone
et
29,22 96
pour
lé
TLitoll
x-l00.
Le
plus
c;ranà
pourcentage
d'hyd:colysE
c'. \\' co c I e
Tri ton
X- 1 00
c: s t
0 b te n u a v e c
l a s us P 2 n s i 0 ri
de
ch J. 0 r 0 p ].. a ste s. .
!..jCJLL
ct
STEGj':EE
(1978)
ont
obtenu
une
hydrolyse
importante
de
la
ch l 0 r 0 p 11 Y :LI e
e n
pré sen c r,
de
chIo r 0 ph Y I l as e
pur i fié e
e t
è. e
Tri l: 0 n
X- 1 0-::
Les
rés u l t a t S
0 b t ï~ nus
a v e c I e
p'- C j.j B
(1, 07 % 9 1 h Y d roI Ysc) ,
iJlhibiteur
de
la
chlcrophyllase
(TERPSTRA,
1977)
ne
sont.:
pas
très
diff6rents
du
pourcelltagc
d'hydrolyse
enregistré
dans
les
conditions
. n 0 r 1Jl Co les
(1,::2 S %).
Cee i
t:. é 111 0 i 9 n e
que
dan s n e s e o n dit: ion s
exp é r i In e n t a -
lit
l e s , l ' a c t i v i t é
de
la
chlorophyllase
est
négligeable.
... u
Activité
de
la
chlorophyllasa
dans
l
~
es
suspensions
de
chloroplastes
et
de
chromoplastes.
% de
chlorophylle
hydrolysée
conditions
-3
+ p-Cf1D
-3
la
M
+p- C~1B
10
n 'rTriton -l-Zlcétoné
normales
+ DTT
10 mi1
D'TT
0, 2~;
25Z;
2h
2h
2h
2h
/.h
chloroplastes
1,08
0,79
1 ,07
29,22
5,07
chromoplastes
l ,28
0,75
o
O,'!:?
8,G
t.emps
d'incubation:
"lh
La
composition
da
mil.ieu
d'incubation
est
idcritjquG
~
cùlul
du
mil i e u
de
h li S e
( con dit ion s
no r ;n a. les),
1:1<1 i s o n
r c f:1 ::>1 ace
.1 a
c!-' J. <.) ~: 0 _
phyllide
par
de
la
chlorophylle
marquée
(15.6~2 dpm ~Jn5 cn~quc
tube) .Suiv2nî:
les
tubes,
on
<::joute
les
produits
mentionnés
ci'-dc!'isus.
La synthèse
d8s
chlorophylles
jar
les
chl.oroplastes
est
plus
lentG
et
le
nomhre
de
molécules
pigmentaires
synthétisées
reste
faible.
Dans
les
chromopl.astes
au
cnntraire,
après
10 minutes
d'inc~bation, la synthêsc
des
chlorophylles
s'accélère
et
atteint
une
phase
stationnaire
représentée
par
un
plateau
après
/.
heures
d'incubation.
Le
nombre
de
molécules
pigmentaires
s~nth6tis6es
pendant
la
méme
période
a
t r i p l é .
La
faible
activité
de
l'enzyme
ohservée
dans
les
chloroplas-
tes
pourrait
s'interpréter par
une
r6~rcinhibition exerc~e par
les
chlorophylles
prée~istantcs. Quant
â
1.2
phase
stationnaire
obs~rvée
~ans la synthêse
des
chlorophylles
par
la
suspension
de
chromop12stes
e 11 e
n e
peU t
s' exp l i que r
que
p a .l:"
un
é fi u i s e )jj E: n t
d ~~ s
ch 101: 0 P h Y 1. l ide s
ex09êne~
fournies
au
milieu
r~actionnel. En
étudiant
la
synthêse
deschlorophylles
par
les
chromoplastcs
de
fleurs
de
Narcisse,
KREUZ
et
KLEINIG
(1981),
ont
montré
que
la quantité
de
pigments
synthétisés
est
fonction
de
la
concentr<::tion
en .chlorophyllide
exogène
du
milieu
d'incubation.
41
1
; 1
Après
saponIfication
des
molécules
de
chlorophylles
marquées
(Fig. 9a ,b)
l'analyse
des
alcools
libérés
selon
la
méthode
déjà
décrite
(DOGBO
et
a l . ,
1982)
montre
q u ' i l s
sont
de
nature
différente.
Le
géranylséraniol
représente
94,6%
de
la
radio-
activité
totale
incorporée
dans
les
chlorophylles,
le
dihydrogéranyl-
géraniol,
5,1%
et
le
phytol
0,3%
(Fig.17il.,b).
La
quantité
élev8e
du
géranylgéraniol
dans
cette
iractioll
alcoolique
est
une
preuve
de
la prédominance
de
la
chlorophylle
0stérifiée
par
le
géranyl-
géraniol
(chlorophyll(:-géranylgéraniol)
dans
le
milieu.
Ccci
est
en
accord
avec
les
résultats
de
SCHOCH
ct
al.
(1977)
et
RUDIGER
et
al.
(1980)
qui
pensent que
le
prelnirc'T
produit
formé
est
la
chlorophylle_géranylgéraniol
et
que
ce
dernier
subit
une
réduction
jusqu'à
la
chlorophylle-pilytol.
LILJEI~13ERG (1974)
üffi:>:l11c
C}è\\C'.
ûiJ.ns
les
fpuilles
de
l'OrCjc
ayant poussé
à
l'obscurité,
la
pyotochlorophyllidc
est
estérifiée
par
l e
9 é r a n y l 9 é r a. n i 0 l .
l 1 r e TI] éi n~ u e
é CJ 2 1. e 1'1 e n t
gue
cl a ;l S
l a
b a e t é rio --
chlorophylle,
l'e_leool
d'estérificat.io:-I
est.
le
géril~-Iylgéraniol.
Ces
mêmes
résulta':.s
ont
été
confirmés
par
\\·'ELLBunN
(J 976),
SCilOCl
( 1978»
BEN Z et
é\\ l .
( 1 980),
qui
0 ri 1:
t r a v èl i I l é
sur
l e ~;
: eu i J. l c ~
verdissantes.
De
plus
l'utilisal~ion d'herbicides
(J~UDIGER ~!_~~
(1976),
montre
que
la
première
r~t.ape (le
la
phyLylaticn
est
la
formation
de
la
chlorophylle-géranylgéraniol.
Lu
chlrirophylle-phytol
qui
con s t i tue
l ' é t a p e
fi TI ale
est
a t. te i n te
ç r â. c: e
à
une
,. éd u c t i 0 TI
successive
du
premier
p:r.-oduit .
La
détection
de
ces
pig~ents intermédiaires
(RliDIGER Gt
a l . ,
(1976),
SCHOCH
(1978),
au
cours
C-cl.
verclissE:lTIent
et
la.
consiàéYi'.tion
que
le
géranylgéraniol
et
ses
dérivés
constituent
les
préc~rseurs
du phytol
(COSTES,
1966
SOLL
et
SCHULTZ,
1981
SOLI.
et
a l . ,
1983)
laissent penser que
l ' e s t é r i f i c a t i o n
ne
5 2
fe~ait pas
pa.r
une
phytylation
directe.
La
prépondérance
de
la
chlorcphylle_géranylgéraniol
observée
dans
nos
expériences
pourrait
donc
être
inter~rétéé comme
un
blocage
dans
la
réduction
de
cet
alcool
par
!1Jô..,qlJC:
ou
insuffisance
C1'..l
NADPH.
Ce
point
sera
abordé
en
d~tail ultérieureElent.
(page
55)
42
-fi
8 x:O -
Cpln
A
chloroplastes
1
1
1
o _
~_ f\\~: j
'--
---'--
l_.--1_---l
J---.J_ _--l _ _----'
o
N
\\1
U-Z
Ch G
C
-11
8):10 . -
B
cprn
,'Of
r...:
o
J.4
-
'...-
chromojJ!astcs
1 J
o -
.-/'--~~--.
\\I\\/\\,~~ -J
1~__ ---l
L -
J_ _ L
l
------I-_-.J__ ._ _
o
l'J
V
l::- Z Che;
C
Ré.pa.'L-t-i.-t.{.oll de..tCt JiCéd.J.'.oac.t-<uLUi
!,Ct!L
rtc:..ouÎ!.
de S/t/:::C( C;(j
(qJ/z.. è,s
-<.11 c. u Jtpo }w Li. 0Il de. D-i: ç] -<---6 GP c.i/J. <:: VIl!.t.p YJe Ci ,;:l 0-6 Phe.t C!. , PG.:L t (j
MC-6pe.n-6;.oH6
de. c.htoJiopta-6tc!_:'
e.t C.iJ JUJliIOp.f..((-6:te.,j
dl?
6JwLt dc.
T'o.{.VJW/'I.
Ch.f.OJiOp.e.Ct'S.U~.-:.l c.OI1f.:C/îCtYi.-t C.h.tOJiOphlj.f..f.-i.de.,s cndoo()it2..!)
dl,'!. 0 JJl 0 p.e. a.l :t e.-6
+ c. h .f. 0 JLQ ph 1j1. .f.ùL Œ. -6
e. X 0 9 è :1('_ -6 •
~
. J '
° ; (1ft-<.g-<.ne.: !J: J'1.2. (1 XCtJl.U,.éJ':.C'"
l i ;
v -i- (: t. Ct HUl t ft -i- li e. ,
L + Z : .t u.U .1~ J1 e + Z é a Y.. Cf.. 11 :t h-i- J1 (' ,
Ch:
c. ft t (1 /1 0 P il YJ!. .t c!-,~
( c ~. !J )
G : a.f.coof.-6 ditefLrtn;qu~-6 l-i-!JfLQ.-6,
C; ca/z..o:t~J1e-6 ,
-,
F .. : ,6/wnt dct -6ofucw-t.
1-60p(J.n.té.vtljJ:.plj/Lopflû-6pha-te.
(5:5 tnCUmMoJ::e.6;
0,31
\\1C-i.)
43
111-
SPECIFICITE
DE
LA
CHLOROPHYLLE
SYNTHETASE
VIS-A-VIS
DE
DIFFERENT~
SUBSTRATS
AI Spécificité vis-à-vis du noyau tétrapyrrolique
Les
résultats
que
nous
avons
présentés
ci-dessus
montrent
que
la
chlorophylle
synthétase
catalyse
l'estérification
de
la
chlorophyllide
par
le
géranylgéraniol pour
donner
la
chlorophylle.
Nous
avons
cherché
à
déterminer
dans
les
mémes
con6itions,
si
la
chlorophylle
SYllthétase
é t a i t
capable
de
catalyser
cette
même
réaction
avec
de
la
protochlorophyllide
exogène,
précurseur directe
de
la
chlorophyllide,
par
r~duction. Les
résultats
obtenus
montrent
que
l'enzyme
est
très
peu
active
vis-à-vis
de
ce substrat
(Tableau
])
pour
le
même
temps
d'incubation
ct
avec
la suspension
de
chro~oplaste~
on
a
une
synthèse
de
chlorophylles
plus
félible
(S
?;;!nl(~s/i1lg de
prot~ines à
l'ob~jcurité,
4,7
pmoles/rng
Qe pro'~éines à
J.a
lumière)
de, protoc_hloroDhyll_i:de---.-9.~~~.
~
,
_.
en pre sen C ê 7 Cl. e
c n 10 r 0 pn yTI l Cl. '"
(3 2 7 , 1.. 0
Il 1r'.O les / mg
cc:
pro t e J. n es)
0 n
" c:
peut exc.lure
une
inacessibilité
du
site
cata'lytigue
dans
les
conditions
de
not.re
expériellc2 ..iD._ vit..f..Q car ELLSV:Cj~TH et nOVAl.:::
(1974)
ont signalé
la p.'::"ésence
de
prot.ochlorophylle
(c'cst-à-o.irc
de
protochlcrophyllide estérifiée)
d3.!1s
les
semences
de
courgette.
TA13LEl'.U
3
.
'[1
i 4 71 .
-
l
li
h
'
1
l n c Co r p 0 rat l 0 n
Cl. e
_ -
CJ l S 0 pen te n y
p y r 0 p . cs p a t e
(, a Tl s e s
chlorophylles
et
les
alcools
diterpéniques
par
les
suspensi0~s
de
chromoplastes
de
Poivron
ell
présence
de
protoc~iorophyllide.
radioactivité
exprimée
cn
pr.101es/L'CJ
de
pTotéines
fractions
analysées
obscurité
lumière
- - - - - _ . _ - - - - - - - -
chlorophylles
5
il , 7
alcools
diterpéniques
55, 5
47,::?
L'incubation
s ' e s t déroulée
soit
à
l'obscurité
soit à.
la
lumière. (Protochlorophy.ilide
20 .Wg/ml.
Isopenté!~ylpyrophcsphat'2
5 3
ru c i / In 11 0 l e
0, 31
JI Ci) .
.-
44
BjSpécificité
vis-à-vis
de
l'alcool
terpénique
Dans
les
expériences
que
nous
avons
décrites,
la
chloro-
phyllide
était essentiellement
estérifiée
par
le
géranylgéraniol
qui
est
un
alcool
terpénique
à
20
atomes
de
carbone.
Nous
avons
cherché
â
savoir
si
un
alcool
terpénique
de
chaine
plus
courte,
le
farnésol
(C
)
pouvait
estéri::ier
la chlorophyllide.
Les
résl.ll.tats
1S
obtenus
sur
l'incorporùtion
de [l_3 H
J farnesylpyrophosphate et de
Q_3 tTI
gél-anylgél-aDylpyrophosphate
par
les
suspensions
de
chloroplil~;Lc:-;
et de
chromoplastes
sont
présentés
à
la
figure
10
Les
chloropl~stes
aussi
bien que
les
chromoplastes
isolés
de
fruit
de
Poivron
sont
capables
d'estérifier
la
chlorophyllide
par
le
farnesol
et
le
géranylgérQniol.
La
réactivi~é de
ces
substrats
allyliques
à
concen-
tration
équi\\1alent~: augr.Jente
avec
la
longueur
de
la
chaîne
c<:trbonÇ;c
(c 1 5 ( C 2 0)'
Des
cl 0 n n (> e s
sim i lai r e s
a v aie n t
été
0 b t e nue s p a r
RU 0 l C 1:: I~
et
al.
(1 980)
dan s I e s
1:1 e mb ra n es
d' a v 0 in e.
Dù n s
les
co E dit ion s
naturelles,
l'estérific~tion avec
le
farnesol
pour
la
formation
d0~
d,lorophylles
avait
été
signùlée
chez
les
bilctéries
(CAPLE ·~L~.,
1978
STE::::~EP. ~J:.-_al.. ,
1981).
ELLSIWRTH
et.
NOVAK
(1974)
ont
également
rapporté
que
l'ùlcool
d'estérification
des
téguments
internes
des
graines
de
courgette
étai~
le
farnesol.
Du point de
vue
ce
l'évolution,
l'estérification
préférentielle
avec
le
substrilt
en
C
(géranylgéraniol)
reflête
probablement
20
un
meilleur
accrochaqe
dans
les
Ele;;Jbra.Des
de
chloroF~ylle-gércnyl
géraniol que
de
chlorophylle-f~rnésol.
-
Lorsque
les
plastes
(chloroplastes
et
chromoplastes)
isolés
de
Poivron
sont
incubés
Ci]
?r~se!1;::E: de
qua:ltité
8quivalente
cI", :;é:.-aTi:''-l.-··
géranylpyrophosphate
et
de
phytylpyrophosphate
(deux
alcools
en
C 2ü
diff6rant par
le
degré
de
saturation),
on
constatè que
seul
le
géranylgéranylpyrophosphate
est
incorporé
dans
les
deux
types
de
plastes
(Tableau
4).
Ce
résulta'c
De
confirme
pas
ceux
obtellUS
par
SOL L .5: t
al.
(1 9 8 3)
qui
:n 0 n l~ r e 11 t
q l, 12
1 e
ph Y t Y l P Y :L 0 P ho s ph a t e e sté ri f: i e
directement
la chlorophyllicle
mais
sont
en
faveur
de
ceilX de
RUDIGEE
et al.
(1976)
qui
avajent
suggéré
que
la premiêre
étape
de
la
phyty-
lation
est
la
formation
de
chlorophyll~-géranylgéraniol.
--
...
45
F-<gU-'L(/,
10
Evo-tu.Lto~l 11'. -ta twdioae-tiv;';::é ,'L(J,tat.,i·J~ obte.nue, ((;)!L0J~
-<11 e-o fLp 0 fULt:io IL
d c- [J - ID 9 é fL(/.ll Y.tg é !L(U'l YtP!f Jé 0 ph 0 ,') Fi 11O.-t e. e..t n-·· 3 in
t\\ ((fi !1 C,.0 yt P!f JL 0 P h0 !.J jJ h (!.;( (2 da n·~ -f e,~ r.: h-t C' ,'1 (. PhIJ .t.f c.IJ ((l + b) p (/. f( )~ (>~ !.lf
C~
(l, ,\\ /
dl?_ PO-<\\JJLOil.
(Le.,')
\\'(LfeuJL_6
JL2.pJLê,~c.-l'l.tCHt te POUfLe-()Il.tag~ de. Cil~O;ic:pi:!,'/j2>
cb~~~i6iŒe.6/te!J chlo~orhyl-tide!.J to~ate!J (/.jou~~e.IJ.
:.s
cIL flO 1.110 p.t a ,,'< C'. .0{ YI cu b ~ ,_\\ Cl V e. c [J - 3~~D
9 é fLa flUt 9 é. !? a 1'1 y t j] l( Je cp h 0 IJ J'; Il 02 ~~
(4011Iilote.IJ).
G
•
<
(
dUL{!I)jop.tC1.IJ:t:~.o incubé/" avc-c: [1- 3iIl Ù(UlnéIJljtpljJwpho.0p!JeJc.
(4 Ù n m0 .t e. ,') ) .
(
0
46
TABLEAU
4
Incorporation
de
D_3~ géranylgéranylpyrophosphat.e et de
[p_14 c]
phytylpyrophosphate
à
quantité
équivalente
dans
les
chloro-
phylles
par
les
chloroplastes
et
les
chromoplastes
de
Poivron.
Radioactivité
exprimée
en
dpm/mg
de
protéinus
++
Plastes
GGI-'P '"
PPP
ChloropliJstes
5/.894
74,56
Chromoplastes
1~.G95
136.
+
++
géranylgéranylpyrophosphate
phytylpyrophosphate
( 2 0
In C i / ;il 1,1 0 l e
0 , 8 5
~ Ci)
( 0 , 0 ";
rn C i / El t1 0 le)
IV-
CONCLUSION
PARTIELLE
Les
rés u l t. a t s
pré sen tés
d a li S
ce
cha pit rem 0 n t: r e n t
q LI e _l ü
chloropJlylle
synthétase
qui
catalyse
l'estérifjcation
de
la
chlCJro"
phylJide
par
un
alcool
terpénique
est
présente
dans
les
chloroplaste=
et
chromoplastes
isolés
de
fruit
de
Poivron.
Contrairement a
C~ qU2
certai~s auteurs
pensent,
cette
enzyme
est bien
difrérente
de
la
c J1 10 r 0 p h Y11 a se.
Les
es sai s
d \\'
S y n th è s e
cl. e
ch 10 :1. 0 p h Y 11 e :3
à
par t i r
(J'~
chlorophyllia"es
et
de
prot"-c')cl;lorophyllic1es
mont.rent
que
lé).
ChJ01__ Op\\;~'
lide
constitue
le
meilleur
s~bstrat. De
mérne
les
tests
réalis6s
avec plusieurs
alcools
terpéniques,
en
particulier
le
farnésol
(C 1
~
r
1
~ :J
le
géranylgérn.niol
(C
avec
'1
doubles
liaisons)
et
le
phyt.ylpyro-
20
phosphate
(C
saturé)
indiquent que
le
substrat préférentiel
est
20
le
géranylgérù.niol,
à'où
une
8stérificÙctiofl
importante
à
pc.!:'tir
c:'e
cet
alcool.
La
réduction
oe cet alcool jusqu'au stade phytol est
faiblement:.
réalisée
dans
nos
conditions
cxpérimen-;:ales,
c'est-à-cJi.:c~
en présence
de
faible
quantité
de
NADPH.
47
v- INFLUENCE DE DIFFERENTS FACTE~RS SUR L'ACTIVITE DE LA CHLOROPHYLLE
SYNTHETASE
Après
la mise
en
évidence
de
l ' a c t i v i t é
de
la
chlorophylle
synthétase
dans
les
suspensions
de
plastes
(chloroplastes
et
chromoplastes),
nous
avons
essayé
d'étudier
les
facteurs
qui
pourraient moduler
son
fonctionnement.
Ainsi
nous
avons
porté
notre
attention
sur
L'effet d'une
variation
du
pH
du
milieu
d'incubation.
L'importance
des
ions
divalents
et
du
ppi
-
L'e f f e t
des
n '.1 clé 0 t i des
( NAD PH
et AT P )
AI Effets de la variation du pH du milieu d'incubation
1-
Résultats
a)
Effets
sur
l ' estérificati.o;l
c~es _c:}110roFhY_lliGe~
(T ab le au
5 a)
L ' in CCL" po r é1 t ion
cl e
l. 1 i S 0 pen t l~ :1 y 11' Y:c '2?:1 0 s P 1-, <J te
dé'. n s
l ~ :.;
chlorophylles
par
les
suspensions
de
chloroplastes
(Tableau
Sa)
subit
une
varië\\tion
en
for.ction
du pH.
Féjulc
dans
les
pH
ëlcit1es
(pI'16),
elle
croit
réguli8r2ment
lorsqc:' on
tend
vers
les
pI-!
légèn:.fi22Ilt
bas i que s.
Lem ël y i Pl U 17\\ d 1 i il cor po:>: a t ion
e ~ t
0 b S c :c \\' é
il
.p fi
7, G.
(Hl - CI c Li
de
cep H,
l a s y n th ès e
di !TI j nue
t r ès
r 0. pi é3 e Il: e nt.
Avec
les
chromoplastes
(Tableau
Sa)
on
observe
une
inccr-
porution ;lus
importante
dans
les
pH
acides.
Le
max{mu~ d'incorpora-
tion
est il pH
6.
DallS
les
pH basiques,
la synthècse
des
chlo~ophylles
dans
ces
suspensions
chromoplastiqucs
ciScrait
brusquel7lcnt.
'lé!
TABLEAU
5a
l
.
d
(11· 14- J .
- l
ncorporatlon
e ~-
C
lsopenteny
pyrophosphate
dans
les
chlorophylles
sous
différents
pH+
Hadioactivité
exprimée
en
pmoles/mg
de
protéines
pH
Plastes
6
6,5
7
7 , 5
7,6
8
8, 5
._~-
Chloroplastes
499
828
845
114S
1255
388
1 ,;
Chromoplastes
2019
1156
1585
337
101
134
1 1
+ Les différents pH ont été obtenus de la f2çon s'1i.vantc
l'HG
et
6,5
tampon
1·1ES 1
pH
-1
tampon
MOPS,
pH
7,5
7,6
8
(3, 5
t_2.IEpOn
Tris-HCl
b)
E f f e t S
S IJ r
l ' i n cor p 0 rat i 0 :1
cl e l ' i S 0 pen té n y l F Y r 0 ph 0 S p] 1 a t. e
-----~--
----~--_._--
La
synthèse
des
alcools
diterpéniques
(Tableau
Sb)
est ?]us
importante
à
pH
7,5
ùvec
les
suspensions
de
chloroplastes.
Elle
reste
faible
dans
les
pH
acides
et
décroît
dans
les
pE basiques.
Dd,IS
les
chromopla~;tes! le
maxill1um d'incorpol:a.tion
~"t
enrcg:i_~.;t_J"é il
pi!
7.
Au-delà
de
cc
pH,
elle
décroît.
I l
faut
noter
qu'en
dehors
des
différences
observées
dans
la
synth~se des
chlorophylles
et
des
alcools
p~r
les
chloroplastes
et
les
chromoplastes,
i l
existe
un
par a I l é lis me
cl c,!1 s I ' .:.. n cor po rat ion
d e I 1 i s 0 pen t. é ;-I Y l P Yr 0 p ho s ph a t e
d a ,1 S
-ces
deux
c~tégories de
cOŒposés
pour
chaque
type
de
plaste.
49
TABLEAU
Sb
[J_14cj
Incorporation
de
isopenténylpyrophosphate
dans
les
alcools
di terpéniques
libres
(Géranylgéraniolet
dérivés)
sous
différents
pH+
Radioactivité
exprimée
en
pmoles/mg
de
protéines
pH
Plastes
Chloroplastes
17, 89
17,46
20,36
41,59
1 1 , 2 2
3 , 1 2
0,";
Chromoplastes
50,62
59,79
66,68
43,28
6,23
5
1
+
Les
différents
pH
ont
été
obtenus
de
la
façon
suivante
pH
6
et
6,5
tampon
MES,
pH
7
tampon
!10PS,
pli
7 , 5
7 , 6
8
8,5
tampon
Tris-HCl
2-
Discussi.on
Lep B est
un
par a ln è t r e
i mpo J: t 2. nt,
i n t: e r ven an t
d ê~ n s
l a
ré guI a t ion
cl e
l ' a c t i vit é
des
e n Z :Z' In es.
Or
c e p j{
dép 2 il d
111 i .- Hi ê El C
d'autres
facteu~s comme
la
lumière
ou
la
concentration
en
certaines
mol écu les
chi 111 i que s.
l'lE R D2\\ N e t
al.
(1 9 -, 5),
e n
é tu dia n t
1 e r ô l e
du
pB sur
la
régulation
de
la
fixation
du
carbone
par
le
chloroplaste,
ont
constnté
que
le
pH
du
stroma
subit
une
variation
au
cours
de
l'éclairement.
TREBST
(1974)
avait
déjà
montré
que
le
stroma
des
chloroplastes
s ' a c i d i f i e
lorsque
les
tissus
sont placés
à
l'obscurité,
alors
qu'à
la
lumière,
i l
prend
des
valeurs
basiques.
Une
étude plus
fine
menée
par
HELDT
et
ses
collaborateurs
(1973)
sur
le
chloroplaste
a
permis
de
préciser que
l'éclairement
cause
une
alcalinisation
du
stroma et:
une
acidification
dans
l'espace
thylakoidal.
Cette
différence
observée
résulte
du mouvement
de
protons.
Cette
observat:ion
a
été
confjrmée
par CHOW et
al.
(1976)
+
Ces
auteurs
ont montré
que
la
lumière
induit
une
entrée
de
H
et Cl
da:is
le
chloroplaste
alo~s rTll ' pl10
facilite
1ël
sortie
des
ions
-.L~
' - " - - -
50
2+
+
Mg
et
K .
Les
résultats
ci-dessus
et
ceux obtenus
par
GREBANIER
et
al.
(1979)
sur
la
synthèse
desprotéines
chez
le
/vIais
au
cours
du
verdissement pourraient
expliquer
en
partie
le
comportement
- des
chloroplastes
et
des
chromoplastes
dans
la
synthèse
des
cillorophylles
et
des
alcools
diterpéniques.
Cette
équipe
a
pu mettre
en évidence
l'existence
de
trois
catégories
de
protéines
lors
de
la
transformation
des
étioplastes
en
chloroplastes
les
protéines
présentes
dans
les
étiopl.astes
et
qui
disparaissent
pendant
la
photomorphogénèse
plastidiale.
-
celles
présentes
dans
les
chloroplastes
et
absentes
dans
les
étioplastes.
celles
présentes
dans
les
étioplastes
et
dans
les
chloroplastes.
Des
études
similaires
réêilisées
par
IKEUCEI
et
~;UE.l>.KJI.MI
(1982)
sur
les
étioplastes
de
Courge
durant
la
période
du
verdissc-
ment
du matériel
végétal
ont.
abouti
<'Ill}:
mêL1CS
! .. C::~oultats.
La
différence
observée
dans
le
fonctionnement
de
la
chlorophylle
synthétase
dans
les
suspensions
plastidiales
utilisées
serait due
à
sa
régulation
au
sein
de
c)laque
type
de
pla.ste
physio-
10giqueI!lent.
c1istinct.
Faut-il
voir
en
cc
phénomène
une
différence
de
co ru p 0 s i t ion
pro t é i que
e fi t r e
C;1 lOT 0 pla s ~'. c s
e 'c
c li rom 0 pla ste s
?
l l
convient de
noter
dans
cc
cas
la
difficulté
il
déterminer
le
plI
optimum d'une
enzyme
quand
on
est
en
présence
de
protéines
hétéro-
gènes.
BI Effets dn pyrophosphate SUL la synthè~.;e de.s chlorophylles et
des
alcools
diterpéniques
libres
par
les
suspensions
de
chloroplastes
et
chromoplastes
â
partir
de
l'lsop0nténylpyrophosphate.
1-
Résultats
(Tableau
G)
L'inc6rporation
de
l'isopenténylpyrophosphate
(Tableau
6)
dans
les
chlorophylles
et
dans
les
alcools
diterpéniques
est
plus
importante
en
absence
de
pyrophosphate.
La
présence
de
celui-ci
dans
le milieu
d'incubation
réduit .fortement
la synthèse
de
ces
molécules.
51
Avec
la suspension
de
chloroplastes,
on
n'obtient que
44,5%
d'incorporation
de
l'isopentenylpyrophosphate
dans
les
chlorophylles.
Cette
incorporation
est
três
réduite
dans
les
chromoplastes
aû
on
n'enregistre
que
17,8%
dans
les
chlorophylJes
et
3,3%
dans
les
alcools.
TABLEAU
6
-
14 ~
Effet du pyrophosphate
sur
l'incorporation
deU-
~
isopenténylpyrophosphate
dans
les
chlorophylles
et
danco
les
dJcools
diterp6niques.
Rad i 0 a c t i vit é
exp r i mé e
en
pm 0 les / l~\\ 9
de
pro t ( i ne,,;
Plastes
l':coéiuits
analysés
- FPi
+ ppi
Ch l
1255
55.9
Chloroplastes
C
14, 22
20
Ch l
1585
283
Chrollloplastes
C
67
2 , Î.
20
ChI
chlorophylles
(a+b)
C
alcools
diterpéniques
20
isopcnténylpyrophosphate(53
mCi/rnMole
c5 , :3 11J Ci)
2-
Discussion
Ces
r6sultats
sont
en
accord
avec
ceux
obtenus
récemoent
au cours
de
la synthêse
du phytoêne
in
vitro.
En
incubant
la
iroc-
t ion
s t rom a t i q li e
de
ch r 0 1:10 pla ste s
de
Po i v r 0 11
e 11 pré s ~!1 ce deI' i s 0 pen _
ténylpyrophosphate,
LAFERHIERE
(1983)
n'a obtenu
après
additio;;
de
1 mM
de pyrophosphate
,que
3,7<;;
d'incorporation
de
l'isopenté-
nylpyrophosphate
dans
le
phytoène.
Dans
ce
dernier
cas
en
effet,
le pyrophosphate
inhibe
considérablement
la
condensation
de
l'unité
:>2
isoprénique
(isopenténylpyrophospahte).
Dans
le
cas
qui
nouS
intéresse,
cet effet
se
traduit
par
un~ inhibition de
la
synthèse
de
l'alcool
diterpénigue
(géranalygéraniol)
qui
estérifie
la
chlorophyllide
et
non
sur
la
réaction
d'estérification proprement
dite.
Nous
préciserons
ce
point
dans
Je
chapitre
consacré
à
la
localisation
intraplastidiale
de
l'activit6
chlorophylle
synthétase
(page
67
).
Ce
résultat
est
à
rapprocher
de
ceux obtenus
par
HOLLOWAY
et
POPJAK
(19G7)
lors
de
la
biosynthêse
du
farnesylpyrophosphate.
Ces
auteurs
ont montré
que
le
pyrophosphate
pouvait
se
fixer
sur
les
sites
récepteurs
de
la
farnesyl
pyroI)hosphatc
synthétase.
Après
l'étude
des
effets
de
la
variation
du pH
et
de
la
présence du pyrophosphate
dans
le
milieu d'incubation,
nous nous
sommes
intéressés
au
role
que
pouvaient
jouer
les
ions
divalents
et
les
li U clé () t ide s
( J'J 1; D P H
e t
JI. T P )
sur
l ' a c t i vit é
cri l 0 r 0 ph Y I l e
s y n t h ~ tas e .
synthèse des
chlorophylles
et
des
alcools
diterpéniques
libres
par
- - - - - - - - - - - - ~ - ~
les
suspensions
de
plastes
à
partir
de
l'isopenténylpyrophosphate.
1 -
H.é s li. l tilt s
(T ab le au
7)
L'observation
du Tableau
7
des
résultats
montre
une
variation
dans
la
synth0se
des
chlorophylles
ct
des
alcools
diterpéniques
.
.
2+
2+
en
fonction
de
la
concentration
en
ions
dlvalents
(hg
et
Mn
)
du
2+
2+
milieu d'incubation.
L'addition
d'jans
Mg
et
Mn
stimule
l'incor-
poration
de
l'isopenténylpyrophosphate
dans
les
chlorophylles
et
al cool s
cl i ter p <5 n i que s
lib r es.
L'O Jf1 i s s ion
de
ces
ion s e t
l a pré sen ce
de
l'EDTA
(agent
chélateur
des
ions
divalents,
pouvant
complexer
les
ions
endog6n2s)
réduisent
considérablement
la
synth6se
de
ces
molécules.
TI\\BLEAU
7
Effets
des
ions
sur
l'incorporation
de[i_14 c]isopentenyl-
pyrophosphate
dans
les
chlorophylles
et
les
alcools
diterpéniques
par
les
suspensions
de
plastes.
Radioactivité
expiroée
en prnoles/my
de
protéines
++
++
-
t·1g
Plastes
Fractions
+ Mg++ 15 III t·j
++
- t1n
+ Mn
5
rn!1
analysées
+ EDTA
Ch l
1255
0,98
Chloroplastes
C
14,22
0, 10
20
Ch l
101
2,6
Chromoplastes
C
5
0, 1
20
ChI
chlorophylles
(a+b)
C
alcools
diterpéniques
20
isopenténylpyrophosphate
(53
rnCi/mMole
0,31
~jCi)
2-
Discussion
L'examen
de
nos
résulta1~s er
de
ceu/. obi~eilus récenr;]cnt:.
dans
notre
laboratoire
sur la synthêse
du phytoêne
nous
permettent
d'envisager
trois
raIes
-
Les
ions
divalents
interviendraient
directement
sur
la
synth~se
de
Géranylgé~anypyrophosphateen
fragilisant
la
lioison
du
pyrophosphate
et
de
la
chaîne
carbonée
(CORI,
1983).
:::"c
sch6mc:<
réactionnel
de
l ' IPP
(Fig.
11)
conduisant
au géranylgéranylpyro-
phosphate
montre
une
série
de
condensations
de
molécules
terpéni-
ques
avec départ
de pyrophosphate
~a
rupture
de
la
liaison
chaîne
carbonée-PPi
favoriserait.
la
condensation,
donc
la
D:\\fAPl'
y
IPP
. FrP .
CCP?
'hou
_ K - ../le.
Il
_
R<:- a c. Li. {} Yt.o
cl c. c. 0 rI cl C.)l ,~ ({ .{-~ 0 l'l de. .t 1 ~.o 0 p (' nU. J: !J t.)J I.J .'l (; PfH! .0 P !w.t C'. CI:
9 é!7. a Ill) .e. 9 é JL ({ J11j .t p Y'~L 0 Pil 0 .0 ph. ct.t e..
V/,1;\\ PP:
d~ III é:t hIj.t a.f.f Ij t p IJ J1. (1 ph 0.6 P fwt C'.
FPP:
6a /1. J1 i!.o y.t)J Ijf1. 0 PfI o.) Ph({.t e.
GPP :
g~~({J1y.t)Ju!7.0rhObphate.
GGPP:
[] é.'<. a I1lj.t 9 (i Ji CfJ) UC. P1J·'1. 0 ph 0 ~) P fw;t e.
IPP
: ~.oo)Je.n.té.nlje.plpu.''PflO,~pha.tC'.
55
synthèse
de
l'alcool
diterpénique,
on
occurence
le
géranylgérûniol.
-
Ces
ions
pourraient
intervenir
également
dans
l'arrangement
des
molécules
c'est-à-dire
orienteraient
les
molécules
les
unes
par
rapport
aux
autres
de
manière
à
faciliter
la
réaction.
Dans
ce
cas,
i l s
se
lieraient probablement
au
groupe
polaire
du pyrophosphate.
Le
dernier
r61e
joué
dans
cette
action
par
les
ions
serait
la
formation
du
complexe
IPP-ions.
Pour étudier
la
synthèse
du
far"nesylpyrophosphate,
LASKOVICS
et
POULTER
(1981)
ont
utilisé
++
++
comme
précurseurs,
des
complexes
Ng
- IPP
et
E-l-ig
-
GPP
++
(Enzyme
-
Mg
-
Ger~nyl PP).
Les
résultats
de
leurs
expériences
leur ont permis
de
montrer que
le
substrat
le
plus
métabolisé
est
cel u i
qui
s e t r 0 uv e
sou s
for me
de
co mpIe xe
s u b s t. rat
ph 0 ,; P 11 0 ~~ y 1 é - i 0 Tl ~-
L'ensemhle
de
ces
résultats
permet
de
conclure
que
le
r ô 1 e
j 0 u é
par
1 e s
ion s
dan s
1 a
s y Il th ès e
des
chIo r 0 p h Y Il e s
~ emai1 i f e 5 -
terait
surtout
oU
niveau de
la
synthèse
èe
l'alcool
diterpénique
qui
estérifie
la
chlorophyllide.
DI Influence des nucléotides "J~~D~~_!,.T~_2_SUY l_-'-~~t.ivité c;11orc-
phylle
synthétûse.
1-
Effets
d"J
NADPH
sur
la
synt.hèse
des
chlorophylles
("1-.
c;es"
Nous
avons
vu
jusqu'â
présent,
qu'en
présence
de
faibles
qua n t i tés
de
1'1 AD P H
( 0 , 0 5
m1"1 )
dan s I e
ru i lie u
réa ct i'0 n n el,
1 Q
chlorophyllide
é t a i t
essentiellemcllt estérifiée
par
le
;~ranylgér~-
niol.
Nous
avons
donc
testé
le
rôle
du NADPH
sur
la
r6duction
progressive
en phytol
du
géranylgéranicl
qui
estérifie
10
cl1l.oro-
phyllide.
a)
R.ésultats
(Tableau Ba
Fig.12)
Dans
une
expérience
préliminaire
nouS
avons
incuhé
le
géranylgéranylpyrophosphate
avec
une
suspension
de
chromoplastes
pou r vue
en
chIo r 0 p h Y Il ide,
e n
pré sen ce
0 u
li 0 n
Cl. e
N1\\ D10 1-1.
Les
rés u 1 t 0) t s
obtenus
montrent que
le
NADPrl
n'aqit
p~s
sur
la
Yé0ction
d'est.~rifi-
56
cation proprement
dite
(Tableau 8a).
EQ
revanche,
lorsque
les
suspensions
de
chloroplastes
et de
chromoplastes
sont
incubées
en
présence
de 1J_14<J isopentényl-
pyrophosphate
et
de
quantités
croissantes
de
NADPj-1
on
Ilote
élU
j
niveau de
la
répartition
de
la
rQdioactivité
dans
l'alcool
diterpé-
nique qui
estérifie
la
chlorophyllide/deux
faits
1-
Aux
faibles
concentrations
en
NADPH
(0,05
mlvl ) .
Darrs
les
chloroplastes
on
observe
quatre
types
d'alcools
diterpérriques
estérifiant
la chlorophyllide
dont
le
degré
d'insaturaticn
diminue
dan s
l ' 0 rd r e: 9 é ra n y l 9 é r an i 0 l ,
di h Yd r 0 9 é r ël n y l 9 é yan i 0 l ,
té t :::- 2. h Yè r 0 .-
9 é r a n y l 9 é r il ni 0 l ,
P 11 Y t 0 l
( Fig.
1 2 a )
Autrelf.ent.
dit
la
réduction
de
l'alcool
àiterpénique
estérifiant
la
chlorophyl.l.iàe
se
f d i t
selon
trois
étapes
(Fig.
1 3 )
Dans
les
chrornoplastes,
on
note
la
présence
du
géranylgéraniol,
de
dihydrogéranyJg~raniol c j -
de
té trahy àrogé rany l gé ran io 1.
Le
phytol
n'es t
pas
dé ce lé
(Fi g.
1 2l:l) .
La
chlorophyllide
est
donc
principalement estérifiée
par
le
gérany"lgéraniol.
2-
l,ux
concent.rations
élevées
en
NADPH
(2
1111-1).
Dans
les
chloroplas·ccs ..
on
observe que
les
formes
intermédiaires
(dihydrogéranylg~raniol
e t
t é t rad i h Y g é r il n y l 9 é r il n i 0 1)
c t
l e p h Y 'c. 0 l ,
con s écu t_ ifs
~
l 2.
réduction
~u géranylgéraniol,
s'~ccumulcnt dans
les
chlorophylles
(Fig. 12c)
I l
Y a
une
diminution
de
la quantité
du
gé~anylgéraniol
au profit
de
ses
dérivés
hydrogénés.
Dans
les
chroiEoplvstes
(Fig. 12d)
,
les
formes
intcrl,Iédiai~es
deviennent
nettement
importantes
et
on
nate
l'app~ritioll du
phytol.
Le dihydrogéranylQôraniol,
premier
produit
hydrogéné,
reste
cependant prépondérant
par
rapport
aux
autres
dérivés.
b)
Discussion
(Tableau 8b)
Aux
faihles
concentrations
en
N~DPH,
le
géranylgéraniol
qui
estérifie
la
chlorophyllide
est
réduit
jusqu'au stade
phytol
dans
les
suspensions
de
chloroplastes.
Dans
les
chromoplastes,
cette
réduction
est partiellemellt
réalisée
et
on
De
décèle
que
les
dérivés
intermédiaires
(djhyctTog~ranylgéranylt tétrahydrogéranyl-
:J 1
-"
r!l~lO
cp:n
ch~ C::Opl;1 s w", i J /\\ D I)H 0.0 Sln rVI
o
.... .1-- '_ _1--
- - 1 - _ L L
--'
o
'G
dG
tG P
li - - - '
0):10 -
cpm
Cl
1
o _
~","om"p'">1C"'rMDPIi0.05ni'~;
~./'\\
.
__,
1--
-.1
1.
_
o
G
dG
tG
G -t~
10 ï
cprn
o
o
G
dG
tG
P
~..z.g(l-JU', 12
E66et~ du NADPH ~u~ la ~~ra~t..z.t..z.on de fa ~dd..z.oact;u;t~
..z.ncO~p(;JL~C. dal1,~ .te.,~ o..lcool)., t'.J1 C20 c.~tii~i-6..z.c(li.t la dl~O~ophyf.LLd2
[a + 6) o.fM è',~ .ln c. () ft, P0 ,1. at..z. CJVL d e. [1 - l 'i ç] ..z. ,!J 0 Pe Il t fi. Il If ZP If ,'La PfI 06 ,u ,'l([ t e
pa~ le~ ~la~te~ de 6~u..z.t de Poiv!(ol1.
_O:o~..z.gine ; G:g~hal1ylg~~an;ol ; dG:d..z.hyd!(og~!(anljlg~han;o!
t~thahljd~ogŒ~aI1Ulge~an..z.ol ; p:phytol.
l~opeVlté,llylpy~ophol.phat(J- (53 InCi/mtAole ; 0, 31 ~C..z.)
-_..
58
géraniol).
Ces
conditions
semblent
montrer
une
plus
grande
disponibilité
en
NADPH
endogène
dans
les
chloroplastes.
En
effet,
+
après
dosage
de
ces
nucléotides,
on
a
un
rapport
NADPH/NADP
qui
passe
de
3,16
dans
les
chloroplastes
à
0,06
dans
les
chromoplastes.
+
Ce
rapport
NhDPH/NADP
pourrait
donc
moduler
la
réduction
du
qérônyl-
géraniol
estérifiant
la
chlorophyllide
en
phytol.
Par
2illeurs,
ce
rapport
évolue
dans
le
même
sens
si
l'on
considère
les
tissus
entiers
du
fruit
au
cours
de
la
matur2tion
(Tableau
Bb).
La
prépondérance
de
la
chlorophylle-géranylgéraniol
et
l'absence
de
phytol
dans
la
fraction
alcoolique
obtenue
à
partir
de
susp~nsions
de
chrornoplastes
seraient
directement
liées,
dans
le
cas
de
nos
expériences,
à
la
diminution
du pouvoir
réducteur
au
cours
de
la
maturation.
Des
travaux
de
LENDZIAN
et
BASSHAM
(1975)
sur
les
+
chloroplélstes
d'Epinard,
i l
en
résulte
que
Cr2
rapport
NADPH/NADP
pouvait
régler
l ' a c t i v i t é
du
cycle
des
pentoses
phosphates,
source
principale
de
NADPH
notamment
dans
le
cas
des
chromoplas~es qui
ont perdu
toute
activité
photosynthétique.
Selon
leu~ ~tudes
l ' a c t i v i t é
du
cycle
des
pentoses
phosphates
décroît
de
50~
si
ce
rapport
passe
de
0
à
0,25.
Pour
des
valeurs
supérieures
à
0,25,
on peut
observer
une
inhibition
totale
de
cettG
activité.
Lès
+
résultat.s
Obt.f:'llU';
(Tableau ~rh)
sur
l ' é vol Ut: ion
d'.]
r il;:-> po r t
lJ AD P Il / Uil j) :r
au
cours
de
la
rna.turation
du
frui"l
de
Poivron
sug'Jf:rent
l~n
fOllctionnement
actif
de
ce
cycle
dans
les
fruits
orangé~.
Une
confirmation
vient
d'c~
t t r e
fournie
tout
réce~ment
par
Z l E (; LE R e t
Cl 1.
(1 C) 8 3).
Ces
au t c Ln s
s G
son t
p él r t. i cul i (, r e Dl C n t
intéressés
aux
variations
de
l ' a c t i v i t é
de
certàines
enzymes
caractéris"liqucs,
des
chloroplastes
et
des
chromoplastes
du
péric2rpe
de
fruit
de
POiV:::OIl.
LéS
résul"lat~.; oe
let:.rs
é·tudes
mon"lycnt
que i
l ' a c t i v i t é
de
certaines
enzymes
et
en
particulier
celle
de
lél
glucose-6-phosphiJ.t.e
déshydrogénase
reste
ideni.:ique
dans
les
deux
types
de
plastes
et
qu'elle
est
stimulée
au
cours
de
la
transition
chloroplastes-chrcr:loplast2s
(jusqu'à
110%).
Ces
auteurs
soulignent.
par ailleurs
que
l ' a c t i v i t é
de
cette
enzyme
régulée
par
la
lumière
dans
les
chloroplastes,
ne
l ' e s t
plus
dans
les
chromopla~tes.
59
TABLEAU
Ba
Incorporation
du géranylgéranylpyrophosphate
dans
les
chlorophylles
par
les
suspensions
de
chromoplastes.
Radioactivité
exprimée
en
dpm/mg
de
protéines
Plastes
piÇlments
+ NADPH 0,05
ml'1
-
NJ\\DPE
Chromoplastes
chlorophylles
37272
313 G 3
géranylg~ranylpyrophosphate
(20 mci/rnMole
0,85
1-lCi)
'l'AB LEidJ
8 b
Evolution
des
chlorophylles
et
du
pouvoir
réducteur
( r·; A D f' tl /
+
NADP
)
au
cours
de
la
maturation
du
fruit
de
poivron.
stadc::s
matur:~té
couleur
vert
ver t
b YU 1:-, 5. t r e
lJ ru 1;: d. t J: (>
:) :;:- a r: '] (;
0 r a n (] (,
composants
jours
o
2
6
{3
10
- - - - - - - _ . - - - -
chlorophylles
totales
1157
857
670
216
~g/g de mati~re sêche
Chla/Chlb
3 , 0 1 2 9 1
2,88
2 , /. 3
+
NADPS/NADP
0,37
0,36
o ~ 18
0, 16
0, 13
ChIa
chlorophylle
a;
Chlb
chlorophylle
b
60
Dans
ces
conditions)on
peut
penser que
dans
les
chromoplaste~
le
NADPH
qui
se
forme
cst
rapidement
u t i l i s é
probablement
dans
la
voie
de
biosynthèse
des
tocophérols
(dont
la
chaine
lat6rale
est
le
phytol qui
dérive
précisément
du
géranylgéraniol
par
réduction)
qui
s 1 a c c u fi U1 e Il t i n te n s é me n t
10 r s
d e I a
dis par i t i 0 Il
cl ê S
ch 10 r 0 p Jl Y I l (' :3
dans
les
chrolf:oplnstes
(Cl\\!'-lARA ct
a~.,
1982e).
Les
expériences
effectuées
par
cette
équipe
sur
ce
même
matériel
montrent
que
la
teneur
de
ces
composés
est
multipliée
par
quatre
dans
les
chromo-
plastes.
Aux
concentrations
élevées
en
NADPD,
on
observe
une
modifi-
cation
dans
la
répartition
de
la
radioactivité
de
la
fraction
alcoolique
estérifiant
la
chlorophyllide.
Dans
les
chloroplastes,
les
formes
intermédiaires
du
géranylgéraniol
(dihydrogéranylgéraniol
et
tétrahydrogeranylgeraniol)
et
le
phytol
augmentent
en
qU~11tit6.
On
observe
une
proportion
de
plus
en
plus
importante
de
chlorophyl-
1 ide
est 6. r i fié e
par
l e p h Y toI.
Dil n s I e s
ch rom Cl pla~; tes,
l.::t
cIL 3 5: n 2
de
réduction
du
géranylgeraniol
aboutit à
la
formation
du
produit
final,
ce qui
conduit
à
une
apparition
du
phytol
dans
la
chaine
alcoolique
des
chlorophylles.
L'ensemble
de
ces
résult_Clts
poUr)-<i2!~_
expliquer
ceux
de
KREUZ
et
KLENIG
(1981)
qui
n'ont
pas
obtcTlu
d ' h Y d r 0 9 .! n a t ion
du
9 é r Cl n y 1 9 é r a Tl i (} l
a v e c
les
c 11 r 0 lJlCJ P l ù. 5 teS
(2 ("
1) <; r c: i éO S C
D'une
façon
g~nérale, les
expériencc~ discuL0cs
ci-dessus
metteTlt
en
évidence
deux
fù.its
d'unc
part
une
plu~
grande
disponibilité
du
Nl\\DPH
dans
les
chloroplastes
~ue dans
les
chromoplastes.
d'autre
part
l ' e f f e t
p a r t i t i f
du
NADPH
exogène
ajouté
â
nos
pr~pa-
rations
dans
la
réduction
de
la
chaine
latérale
dG
l ' a l c o o l
diterpéniquE:
e s t é r i f i a n t
la
chlorophyllidc
(Fig.
13).
Ce
rôle
du NADPH
dans
la
modification
de
la
nature
de
la
chaine
latérale
alcoolique
des
chlcrophylles
avait
déjà
été
const<lté
par
divers
chercheurs
(HELLBURN,
197(';
RÜDIGEi{
et
a l .
1977
SCHOCH,1978
BENZ
et
al.
1980) .
61
CIHO 1l0PliYLLI DE
H
/.c
0
/
0'
'OCH~
Ch!idc _ G ër~I>1Y 1Cér31llot
NADPH!
Chl,de, - d :hyd. QG e r anylge l ""iol
NAQPH!
Il,;~ri./
Cll'l....~
.......... H
<:H;>
Ç-H~
C=O
1
o '-./"'j/'-".III/
[~-_._-------,
CI~LO;~OnIYlL E.J
- ~ ~ ~ ~ ~ - - - - - - _
.. -
F-i-gU.fle.
13
RédlLc.:Uon
de_ ta c.1l.toJ(ophyt.t-i-dc-gé}ictVl.y.fgé/1CU1,i-Ot e_i'J
C.htoflophyt-f-i-de.-phytol en r!lé~e.nc.e de NAVPH (endog~ne. ou excg~J1e)
62
2/ Effets de l'ATP sur la synthèse des chlorophylles et des'
alcools
diterp6niques
libres
par
les
suspensions
plastidiaJ.os
La
réaction
catalysée par
la
chlorophylle
synthétase
ne
peut
s'effectuer qu'en
présence
d'un
alcool pyrophosphorylé.
Nous
avons
essayé
a
déterminer
l'origine
de
l'ATP
nécessaire
à
la
réaction
de
phosphorylation
Ce
phénomêne
rev~t d'ailleurs,
une
importance
capit.ale
si
l'on
considère
les
chrollloplastes
qui
ont perdu
toute
activité
de
photophosphorylation.
Nous
avons
donc
incubé
les
suspensions
de
plastes
,-1 iJ ~
( chIo r 0 pla ste s
et
ch r 0 In 0 pla ste s )
avec
le
ph Y t 0 l_u _ SJ en présence
ou nO:1
d'ATP
et
de
deux
int.ermédiaires
(DH1\\P
et
PGA)
de
1<3
séqucpce
glycolytique présentée
,=i
la Figure
14.
Les
résultats
obtenus
sont
présentés
dans
les
tableaux
(9a et b)
indiqués
ci-dessous.
a -
Résultats
(Tableau
9a,b)
Les
résultats
obtenus
(Tableaux
9a et b) Jlont.rent qu'ell
r:-:-
l 4 ~
présncce
de ~-
~ phytol
seul,
on
a
'.1 ne
est é ri fic L: t ion
d c
J ,-
chlorophyllide
a
et
de
la
chlorophyllide
h,
ce qui
traduit
une
activité
phytol
kinase
dans
les
prfparations.
En présence
d'ATP:
la
radioactivité
incorporée
augmente.
Il
en
est
de
m~me
avec
le
DHAP ct
le
3
PGA,
intermédiaires
du
cycle
de
la
glycol~se. On
remarque
toutefois
une
synthèse
plus
importante
dans
les
suspensions
de
chloroplastes.
b -
ûiscussion
(Fig.
14)
Ces
résultats
laissent
penser qu'une
séquence
glycolytiGu~
fonctionne
~ans
les
deux
types
de
plastes
et
assure
ainsi
la
prod 1Jction
d'ATP
(Fig.
14)
Dans
les
fruits
verts
en
général,
les
réactions
de
photophosphorylation
(générat~ices d'ATP)
sont
faibles
et
déclinent
avec
la
ma'curation.
On
peut
donc
penser que
le
fonctionnement
d'une
séquence
glycolytique
dans
les
plante~ en
a c cor d
a ve c I e s
rés u l t a t S
0 b te nus
par S U1 COX _~_~al.
(1 9 7 7)
e t
SIMCOX
et
DENNIS
(1978)
dans
le
cas
des
proplastes
de
Ricin,
IREL1\\ND
8t
a l .
(1979)
l}U
cour~
c.e
l'ét\\;.de
étiopl~st8s
0.)
,
Dihydroxyacetone
....
Glyceraldehyde
3 phosphate
phosphate
+
NAD
+
Pi
DHAP
f~NADH + H+
1,3
Diphosphoglycerate
/,
ADP
'------;b
A cr P
3-Phosphoglycerate
l'111
2-PhosphGglycerdte
Pho~j)hoenolpyruvate
ADP
~ ...
..'--.':1'
!~Irp
EnGlpy:::-uvate
U.9ufte.
14
TABLEAU
9a
Incorporation
de
QJ_14 9 phytol dans les chlorophylles par ,les suspensions de
chloroplastes
après
1
heure
et
deux heures
d'incubation.
-'--1
Rad i 0 a c t i vit é
exp r i née
e fi
cl P Ir. / mg
de
p r 0 té i n e s
i
~1'"
1
1
If
1<1-
1
r;-;
14::;"]
· - l
!
:
tJ-
g pytc,l
1
~-
çj pLytol
10 -
y phytol
1
1
1
1
+ DEA?
i ' " 3 ? GA
l'
~
1
IU_ 14 a phytol
1
_ rr"Cl
+ .tl.D?
1
-;-
ADP
1
<.D
LW
1
+ t"•• -
1
1
-
+ N AD
l'
+ ADP
1
Pigments
P
P
1
+ KH 2 04
1
+ KE 2 04
1
r-
r----------
lE
2
H
1H
2E
lH
28
1
lE
2E
I
--G-';';-, '"
chlorophylle
- - - - - - - - & - ,-+-12 2 O. 5 1
1 8 6 5 , 4
3 3 6 , 9 9
1 0 4 l , <2
4 7 3 , 3 7
\\
4 5 4 , 1 2
1
-, 06 5
J
chlo'rophylle
b
43,26
-1- 89,8
I
1
12<,5'1
233'-;]-'-:-
43
:'
87,91
.J)'
17S-,-s;l--2-7-S-'-3-B
: ,
! ; .
i ;
l
i
i
1
i
1--
1
chlorophylle:;
Il
263,77
Il
955,12
JI
1;.61,53
P 7 475
1
51637
i 541 2?
1240,8211413
91[
(a
+ b)
i
-"
1
'
i
' -
' , '
_ _ _ _ _ _ _ _.........L'
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1
1
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l
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1
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1
...:: .... 1.""2 2 ..\\.:
4
'
~\\ .. ..
,
..J:'
\\.,'1 I.'\\.
•
~
•• 1'!
P1:ytol
0, 07
mCi/~;:>iole
TABLEP.ü
9b
Incor?oration de
Œ_14~ phytol dans les chlorophylles par les suspensions de chromoplas~es
après
1 heure
et
2 heures
d'incubation.
1
1
RadioaT vi ::".rimée eo d?W('~.::;r::::::s
~.14g phytol~
té
1
1
14
Qï-
~ phytül
1
+ DEAP
+
3 PGA
1
[ü-
~ phytol
.
+
.n.DP
1
+ AD?
Pigments
+
N.:'.D
1
+ ATP
+ KE
PO
LI)
+ KH?PO 1"
2
4
1
\\.0
~
~
1
1
j
1
1
J
_ _ . l ,
---1-
.
"-----j
lB
2B
1
1 )"'
') L'
•
1.;'
? '-'
l
1 r~
? "
1
1
- .1
~ ri
1
1 T.
-
n
1 "
~ li
1
'
57--1
'1
Il ,.,
III
3?
78
1
6"
3 Q
1
r
1
! --"-7_.
1
chlorophylle
a
1 8
83
1
17,48.
~
'
1
0
1
- ,
,
~, v
:
b
! . )
----".
;-------1
i---------f--~--
1
1
~
l
'
CUOrO?hYll~
10,92 ~
_
+"' 1
1 1 , 14
l 8 , :2 1
1
"' 1
8 =-'
., 8
2 5
5~'
1
1 1" -j
2 7
.,?
9
1"
l
" - , "
1
. ' ,
!
-"
, 0 •
"
• -,
1
~_.
r -
- - -
\\ l
.
l 1
1
1
C J1
0 r 0 p r, y - •. ':0 ~.
i
2 C'
'
':: ,r
'"j
~
30,04
(.,+'~\\
0,·1
'1
i
l) 0
, •. c
:;.;,6.3110. 1 ,63
i 228,51
1
34 ,32
112,l'i
\\
c..;.
......
)
l
' 1
1
!
, _ . . J . _ _
1
1
~~DP,
F.. TP 1
~!1AP,
Kg?PO.~1
I~AD,
J PGP,
5
[;::·1
Phytol
0,07
mCi7mM31e
66
chloroplastes
de
feuilles
de
~icin, et stitt et REES (1979)
(chloro-
plastes
de
pois)
qui
ont
mis
en
évidence
la présence
de
certaines
enzYJ:l(~S du
cycle
glycolytique,
permettént
in
vitro,
la
synthèse
cJ C c>
!~~ ~: :: ,:" C li 1 c s
Cl' li T P
née e '0 sai r e s
à
l a
ph 0 s ph 0 r y l a t ion
des
a l cool s .
Nos
résultats
sont en
accord
avec
ceux
de
WATTS
et
KEKWICK
(1914).
Ces
auteurs
ont
essayé
d'incorporer
le
phytol
marqué
ainsi
que
~'c: ,~
è é ri v é s
ph 0 s ph 0 r y lés
( P y r 0 p ho S ph a t é
et
mon 0 p ho s ph a t lS )
dans
In~
chlorophylles
à
partir
des
suspensions
de
feuilles
de
Harj.c"ot.
I l s
ont
obtenu
une
incorporation
plus
importante
pour
le
phytolpyrophosphate
et
mcnophosphate
que
le
phytol
seul.
En
utilisant
le
géranylgéraniol,
le
geranylgeraniolphosphate
et
le
9,~ranylgéranylpyrophosphate,RÜDIGEE et aJ_.
(1980)
ont
égaler.'ent_
obtenu
une
estérification
décroissante
avec
le
géranylgéranylpyro-
pho.,-,]~L:ète, le
gl"'rùnylgf.ranylmonophosphate
et
le
géranyJ_géorc;niol
cn
présence
de
rne8branes
d'étioplastes
d'avoine.
La prése:lce
d'l\\TP
dans
le
rüilieu
d'incubation
aUCJ1:;E:ilte
l'incorporation
du
géranylgéranylmonophospilate
et
du
géranylgéraniol
cl 2. n ::;
les
ch 10 r 0 p il l' 11 es.
Ces
ob s e r v ël t i o;~ s
O:l t
con d li i t
ces
'" ut e tl. ~- S
à
lJC'lIser que
l'alcool
est
d'abord phosphorylé
avant
d'êt-re
ir:corporé.
La
r~actioil d'estérification pourrait être
consjdérée
cor(JlTIe
nn
ensemble
comportant
entre
autre
une
sÉ,qnence
d' activit(s
Kina~;e et
une
rée.ction
de
transfert
(HUDIGER et
al. ,
1980).
El Conclusion part..ielle
L'ensemble
de
ces
résultats
obt_enus
par ]]]odificat.i.olls
dG
différents
facteurs
révèle
la nécessité
de
collaboration
entre
l a c h 10 r 0 p h Y 11 e
s y n the tas E:
CI li i
c a t a lys e
l tes t ê ri. fic a t ion
pro pre fT; e 11 'c
dite
et
les
enzYDes
catalysant
la
synth~se de
la
chaine
latérale.
Plusieurs
facteurs
interviennent à
ce
niveau
le
pH
intervient
directement
sur
la
réaction
d'estérification
catalysée par
la
chlorophylle
sy~thétase. Le
pH
favorable
se
sitUE
dans
lez
zones
7,5-7,6 pour
les
suspensions
de
chloroplastes
et
à
pH
G pour
ll="s
suspensions
de
ChrOl;]Oplastes.
67
-
Le
pyrophosphate
intervient
dans
la synthêse
des
chlorophylles
par son
action
sur
la
synthê~e de
la
chaine
latérale
de
nature
alcoolique.
I l
inhibe
la"synthèse
du
géranylgéraniol
qui
estérifie
l 2.
c: J'j 1 0 j: 0 Il li Y l l i. de.
2+
2+
-
Les
ions
divalents
(io]';'
et
lJIn
)
agissent
comme
le
pyrophosphélte
SUf
la
synthèse
de
l'alcool
diterpénique
de
la
chaîne
latérale
en
favorisant
sa
synthèse.
J" e !':
n 1.1 clé 0 t. j cl E' S
( NAD PlIe t
1\\ T P )
i n ter vie n n (> n t
iJ
c1 eux
ni\\" eau x .
L'addition
d'ATP
ou
d'une
molécule
de
la
séquence
glycolytique
riche,
en
énergie
(DHAP;
PGA)
stimule
l'incorporation
du phytol
d0ns
les
chlorophylles.
Ce
qui
montre
la présence
d'Une
kinase
end (1 9 è n e
dan s
ces
de u x
·t y p e s
de
pla ste s e t
l e
f 0 n c U. 0 11 n e mer;. t
cl ' une
s é Cl U Cè n c E.'
9 l Y col Y t i que
qui
i n
v i v 0
pou rra i t~
è S sur e r I a
disponibilité
En
ATP.
Le
NADPU
modifie
uniquement
la
nature
de
l o.
C]l a ) n e
al::: 0 0 l i que
e n
f il \\' ;:) ris (~ n'c
l a s y n th Co s ~
cl u
~'11 Y t 0 1 à
partir du
géranylgéraniol
selon
3
étapes.
VI -
LOC1\\LI S l,,], ION
l NT Rl,P Ll,~;'l' l D lALE
DE
L'ACT l V.1 'l'E
CIl LO;~OP jj y LI., E
S "il'1'.'.'!' j>
__
- - - ~ - - - _ . _ - - - - - - - _ ..-~-
DES
CAROYENOIDES
La
modification
dt:
E:ilieu
d'incubation
c1~, bdse
par
cQQit.ê.cr:
2+
2+
ou
or:,i s si 0 Il
c18
certains
é l di rJ (2 Il t S
( j 0 Il s
[·1 9
t!; 11
NAD F H,
AT P
et
dériv~s)
a
r~vélé
une
modulation
de
l ' a c t i v i t é
de
Id
chlorophylle
synth6tase.
Cette
variation
d'activit~ s'est surtout manifestée
au
niveau
de
la synthèse
du
substrat
alcoolique
(çéranyJ.geraniol)
qui
COll S t i t \\l e I a
cha î n e
1 a t é raI e
d e I a
chIo r 0 ph YIle.
Cep li é n 0 TI] è l, E:
l 2:l j c' s c
suggérer
une
coopération
de
certaines
enzymes
plastidiales
dans
la
synth6se
des
chlorophylles.
Par
ailleurs,
le
géranylgéranylpyrophosphate
constitue
un
intermédiaire
clé
ddns
lé< biosynt;lèse
des
caroténoïdcs
puisque
sa
dirnérisation
donne
le
phyto~lle qui
est
le
premier
caroténofde
formé
dans
la
chaîne
de
hiosynth&sc
chez
les
végétaux
sup6rieurs.
68
l 1
Tl::> u s a
s e n:.b 1 é
r:. é c ès sai r e
de
co mpl é ter
c e t r a V a i l
e n d é ter min an t
les
sites
èes
principales
réactions
impliquées
dans
la
synthèse
des
chlorophylles
(site
de -synthèse
de
l'alcool
diterpénique
gér~nyJgéranylpyrophosphate, site
de
réaction
d'estérification
propY~ment dite)
en
rapport
avec
les
sites
d'activité
des
enzymes
interv0nant
dans
la
biosynthèse
des
caroténoides.
Pour
ce
faire,
nous
avons
u t i l i s é
la
technique
mise
au
point
par
MAKENDER
et
LEECE
(1970)
qui
permet
de
préparer
les
sous-fractions
plastidiales
en
faisant
éclater
les
plastes
par
choc
osmotique.
Nous
avons
ainsi
préparé
deux
sous-fractions
Une
fraction
rnembranaire
(enveloppes
et
thylakoides
pour
les
chloroplastes,
enveloppes
et
lélmelles
achlorophylliennes
pour
les
ch rorr:oplas tes)
Une
fraction
soluble
le
stroma.
L'activité
de
chacune
de
ces
fractions
(séparées
ou
COlilbinée~,) a
é té
tes tée.
1\\/ Activjtl~ chlorophylle synthétJ1Se dans
diverses
i:racti0ns
plastidiales
(membranes
s t
stroma).
Effets
du
Triton
X-laa et
du Na 0 Il
0, 1]~
s 11 r I a
s y n t: h ès e
des
chIo r 0 p h Y 11 cs.
1-
Résultats
a)
Activité
chlorophylle
synthétasc
Gens
le
stroma,
dans
les
ncmbranes
et
dans
les
deux
sou~'-frù.ctions corrJ:Jinées
èi.e
chloro-
plastes
et
de
chromoplastes
de
Poivron.
Afin
de
localiser
le
site
d'estérification
de
la
chlorop~yl:~
de
d,EIS
les
plilf3tes
de
Poiv;:ol1,
les
fractions
membranaires
de
chloroplastes
(enveloppe
+
thylakoïdcs)
et
de
chYo~:Joplastes
(enveloppes
+
lù.melles
achlorophylliennes)
ont
été
séparées
du
strorno.
ct
incubées
séparément
avecQ _14êJ isopenti:[nylpyro9hosph?t-.e
en présence
de
chlorophyllides
(a+b).
Les
r~sultats obtenus
aussi
bien
avec
les
chloropl~stes
qu'avec
les
chromoplastes
montrent
que
ni
la
fraction
membranaire
ni
la
fraction
stromatique
si
cette
dernière
est
dépourvue
d'activit6
,
galdc:Losyl
~
Co..L
19822),
r.:.e
sont
c2p2bJ.es
t
69
de
catalyser
l ' e s t 6 r i f i c a t i o n
de
la
chlorophyllide
â
p a r t i r
de
1 ' i s () pen t iS ~: y 1 P Y r 0 p h 0 S ph a t e
(Fig.
15).
Mais
lorsqu'on
recombine
ces
det::·:
fro.ctions
(membranes
+ stroma),
on
oDserve
une
incorporat.i.orl
de
l'isopenténylpyrophosphate
dans
les
chlorophylles
qui
~volue
en
fonction
du
t'2mps
d'incubation
(Fig.15).
bl
Les
effets
du
Triton
X-l00
sur
l'incorporation
de
les
chlorophylles
par
les
chlo~oplastes et
les
chromoplastes
de
Poivron.
(Fig.16).
Lorsqu'on
incube
les
suspensions
plastidiales
avec
l'isopcn~(nylpyrophosphate en
présence
de
Triton
X-l00,
la
synthèse
des
chlorophylles
est
fortement
influencée
par
la
concentration
de
ce
d2t~rgent dans
le
milieu
d'incubation.
Importante
en
présence
de
faj.!)le
quantité
de
Triton
X-l00,
la
synthèse
des
chlorophylles
d~croIt rapidement
pour
prendre
une
valeur
nulle
lorsqu'on
intrcdui~
plus
de
G l"Y
de
'."riton
dans
le
tube
d'incubation
(Fig-.1G).
C /
Le:';
l ' f f "'. t s
d u t y Ct i te mer,·t
des
me mb r 2. n es
pla s 1.:. i C. i ale s
p <1 ~
l e
r:- '1-
tJ Ct 0 Il
( 0, 1
J'1)
sur
l 1 j ne" 1:' p 0 rat ion
de L1 - -!il 9 é ra n y l 9 é :c a n i 0 J:o Y J: C l:'J ho 5 P 11 2. ~ '"
d J r; s
lE:':;
C)1 J rH 0 Fh Y I l c ,,;
( Ta b l e èJ. ù
1 0) .
L~~
résultats
d~jâ obtenus
d8ns
les
deux
types
de
plas~es
après
ection
du Triton
x-loo
ou
apr~s incubation
avec
les
dif[é~~nt~~
fractions
plastidiales,
montrent
que
la
chlorophylle
synth6t~s2
est
II n e
e n 7: y :Tj e
( pro U::: i ne)
me TIl b r a Jl air e.
Selon
l a c las s i. fic a t ion
cl e
SIl'! GER
co t
Il l C ü L S Ci N
(1 9 7 2 ) ,
0 n
dis t i 11 CJ U e
d eux
c a t é g 0 rie s
d e
protéines
mCl~:'\\)}:ô,11aires
les
protéines
intégrales
(fermem211t
li~es
.i
1 a
Q e Pl b r 2. ne)
e t.
les
pro t é i n c:: s
p é r i p h 6 r i Cl. u e s
( f a i b 1 e r.J e n t
l j. é E S
â
12,
membrême),
Ce:':
cSE,rniprcs
sont
facilement
libé,rées
de
la
1':<~l!lb~anE:
par
un
trail-er:Jcnt
il
lé,
;:;oude
0,1
IT
(STECK
et
YU,
lS73l.
Lor::qu'c:
no\\.::,
appliquons
un
tel
traitement
aux
membranes
de
chloroplastes
et
de
ch:,:: Cl [j C pl Li. s t c s
Ù r.o
Po i v r 0 n,
ne u s
co 11 S t a ton s,
cl ans
1 e s
de u x . cas,
c: :.:: e
L' .:J.C t i vi té
ch loropLy Ile
s'ln th.2 tas c:
es t
t.rés
af fectée
70
1
chloroplastes
1
.___-0
-1
o~
l
@/Q/
l
1/
I~i_
~.1
f1
rJ
r~_l
.__l .---.L.-__l
o
30
GO
120
1 GO
o
30
60
120
180
Tl: hi P S
( l~'l;'-' ."
TEMPS
(r-nin)
. ' l
, " )
U.fj ((iLeI.
15
_._----
1
.
et
r 1 1 4 cl,
J . -
n
,
1
...J
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i'lCOfLpu.':at.LOi'!
.C'. i
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.<..,!)open-LC'.11Y·'...P!!/iOPiIO<'l}J la.te.
(.~a.IU, c('6
c.iJ.t (}.!L [1 )J fi. U[ [ e..s
p a,'i. J!.J!.<'l
-6 (1 LU· - ~:e ~t c.):.{ U !l·S
pz 0.-6 Li.. cU. al: c.,s : ILCLdJ.. °a c.!.../.. v--'~ .tC:
J..l,r.(:it)JO'Ll!2..
d(1I16
.f!C..0
c.hfoJ~Op!i0LtC'.-6
(a+b)
iJCL!r. f~('.-!:
li1 C'./ilb h (UH!. l,
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.S-tJ'OIil(t de
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c.t de. c.I1JLoiJ1op.ta<'l.tC'.<'l dC'. Po/~\\)hOfl.
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• 1"
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) ] •
'L (' j' ; 0 '1
l'
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() c' t
'""
,.J"
1A _
li;j c'.-L
«,1.
'L"-/~ J L
, - -
l.
'J lVL
~
"-,~ CC./L
V I , .. ,,-
,
·Lé-\\.. ·.,_,C v 1::.
lé C-
O rD'<-I.~Cpc.'lte.j~ytpY;i(l,'Jho ..:,p!L{lJ(' c!alî.'J .te,:, C.h.tOhopf1ut.tr,s ia+oJ
p ah f c..!'
)Jf((/~ )~ C.':' ri (J. Po i \\)!; C' il --
(!~ C,:'
v cd C', u. 11,.\\
JL e piL 0.6 C-11.-t e. i1,t .t e
pOUhC<!.i1.:tO.!]l'.
éic /(C.[i,LO(l('"tj~\\)Lt,:i.
ilièù/L)JOiL2C'
pah
f!..c.-6
p.tC(/S:tC,6 .tJLa,{:té..~
[ '
,-
. f
\\1
1r' (Î /
ri .
~.. J -
•
-
l
, ?
(
ri
-1-
t'J{(/t
''--~~
1 .'L·(.,:'O Il
/'.-
l/ ../
/Lct .. _~LO:)~CÂ __ '--\\.1,{~.{:C_
.lCilC.O/LpOJr..ee.
fJ({"L
J .c./J
p~a.ll.{..t2..S
110 J1VW,{,t é'J •
Ihopc.:i {é·l'i.y.tpY!(Op!-tOh pllCL.fc,
(53 I/îC--<'./til,'·[Oe.e. "
0
31
C·,
,
)":
~-)
IL.
'l'AI3LEAU
1o
Incorporation
de U_3~ géranylgéranylpyrophosphate dans les
chlorophylles
par
les
membranes/traitées
ou non par
le
NaORO,lN;
do
chloroplastes
et
de
chromoplastes
de
Poivron.
Radioactivité
exprimée
en
dpm/mg
de
protéines
Téœoin
Traitées
(NaOH 0,1
N)
Chl0Lopl3.stes
24.054
2.341
35.666
2.222
Los
ncmbranes
iso16es
selon
la
méthode
décrite
(matériel
et
!:nSt.i1oàes)
ont
été
traitées
par
la
soude
0,1
N.
JI.près
15
minutes
au
Lcoid,
l'en,;emble
est
centrifugé
à
lODOOO.1\\g
pencîant
30 minutes.
Le
cu.lot
iT.i~;
en
suspension
es'c
utilisé
pour
les
incubations.
G~Lilllylgéranylpyrophosphate (20 mCi/mMole,
0,85
~Ci)
Ce}.' é sul t a t
nous
permet
de
conclure
que
la
chlorophylle
s y 11 1.. h ,c' -t ;,: s e
di) n s I e s
de u x
t y P e s
de
pla ste s e s t
une
en z ':! TIl e
p é r i p 1: É; r i q lÀ 'êc •
Air:,d,
on
pent.
imaginer
in
vivo
le
fonctioflI!cmE:nt
de' la
chloroph~'llt2
S)'rlt}1~t~5e de
id
mani0re
suivante
les
réactions
d~
condensatio~
dD
c}",în.on
tc::rpénique
(isopenténylpyrophosphate)
catalysées
par
10 pT~nyltransf~rase stromatique
fourniss8nt
le
géranylgéranylpyro-
pli () ~; 1" '1 " t co
c; u i
él U
con tac t
d e I 3.
C fl ] 0 r 0 ph Y Ile
s y n t h ~ 'c: ct S E'
l 0 c al i sée
S \\J ::::-
.c éi f ace s L r 0 Ti! a tic: u 2
est é ri f.i e
lac;l 10 r 0 p 11 Y 11 ide
end 0 9 è !1 e
localisée
dans la
fraction
m2mbranairc.
Dans
ces
conditions
o~
peut
8xclu~e
une
participation
de
l'enveloppe
plastidiale
dans
les
~eux
tYr('~S èe plast.es.
Cet
argument
est.
renforcé
pëlr
le
rait
que
l'e;,"elC'::.-
pep l ,]
°
5 .~ i c1 i ct l c n e
r c n fer Hl e
pas
de
ch 10 r 0 p h Y Il e s
( DO UCEe t.
,J
YJI. r. D ,
1979).
Cepell'~~cult avant
de
conclure
sur
ce point,
i l
convic:ndrait
d'incuber
l'enveloppe
isolée
en
présence
de
chlorophyllide
et de
géranylgéranylpyrophosphate.
2-
D.i.scussion
L'al)serlC~ de
l'~ctivité chloyophyll.2
synthit~se dans
'13
cha C u li e
cl e
ces
SOli S - f ra c t ion s
pla s t i dia les
( me rob ra n e
et
s t rom a )
prise
inctividuellemcnt et
sa
restauration
dans
les
mêmes
fractions
associées
nous
ont
conduits
à
préciser
les
rapports
entre
la
fraction
]scmbrë'.nZ1:Lre
et
la
fraction
stromatique
en
analysant
les
métabolites
àérivés
GC
l'isopenténylpyrophosphate.
La
fraction
membranaire
de
chlcJc:;)lastes
ou
de
chromoplastes
de
Poivron
ne
métabolise
pratiquement pas
l'isopenténylpyrophosphate.
Alors
que,
dans
les
mCmcs
conditions,
le
stroma
de
chloroplastes
et
des
chromoplastcs
synthétise
activement
le
géranylgéranylpyrophosphate,
alcool
qui
estérifié
la
chlorophyllide.
Le
résultat
de
ces
analyses
nOlIS
p e r Iil e t
de
con c l ure
que
1 è
pré 11 Y 1 t r ans f é ras e
e s 1~
une
e n z y ln e
sol u b 1 e
associée
au
stroma
de
chloroplastes
et
de
chromop1astes,
puisqu~
la
solubilisation
de
cette
enzyme
a
été
réalisée
dans
des
conditions
qui
excluent
la
lib0~ation de protéines
périphériques
(force
ionj~ue
élevée,
agent
chélat'?ur
des
ions,
e t c . ) .
Ceci
n'exclut
pas
que
in
v i v.Q ,
} ' (; 11 :-: y [;; ~
t r (] 'J cJ i l 1 e
à
], ëi
P ;2 r i p J'! l~ rie
des
In e mb r il n lé! s
p], êl. 5 t i cl i 2 1 e s
contenélr:t
des
ch1or()p~iyl1ideé~ endogènes.
D'un
autre
côté,
l ' e s t é r i -
Li-cation
cles
ch l 0 ]~ 0 P il Y11 ide se:; t
catalysée
par
une
enzYQe
1 . -
_.1.ep
aux
membranes,
conformi;;,ent
aux
résultats
de
RUDIGER
et
al.
(1977).
Cette
interprétation
est
renforcée
par
le
f a i t
que
lorsque
les
incubations
sont
réalisées
avec
l'isopenténylpyrophosphate,
en
augmentont
le
r2.p~'ort protéine,; stroJ:Jé1i:iqëlcs/protéines l!1emJ./rê,no.i.res
(par
additi_on
de
prot2incs
stro!nütiquéèS) 1 i l
en
rés'llte
ur,c
st~mul·?tic~
de
l'estérifi.ca:-.ion
de
la
chloyophylJide
(Fig.
17)
U e
1) lus 1
q 11 2. n (;
les
struct.ures
mer;,branaij~es sont.
oésorgc.nisées
par
le
'.triton
X-10fJ
(par
ausmentation
de
la
concentration
en
Triton
-dans
le
milieu
d'incubation).
le
taux
d'estérification
est
t~ês
fortement
réduit
(Fig.
16)
.Par
ailleurs,
lorsque
le
stroma plastidial
est
incubé
-
3
r-' 3 --1
êlvec
U - H] CJérany lpycophosphatc' ou
.J -
IL
farnesy lpyrophosphate
5.1.1_J?J~'-~5:!!.._c:~__c~~_PYJr;)!-)]l-,,),ogl.!:.5"lt_.ç _
AJui
peut
sc
fixer
sur
les
sites
ullyliques
de
la
prenyl~ransférase
e t
de
l ' i. s 0 pen t 6 il Y l P Y r 0 p h 0 s p!l ù t e
( E 0 LLO ii!, Y e t
POP J AK ,
1 S 6 1),
0 n
observe
une
solvolysc
des
substrats
(Fig.
18)
Dans
le
cas
du
9 ë.r. any lpy ropl. oS.]Jh a Le
- - - - - - -.. Cl Il
();) t.1. e n t
1 e
9 é r a n i 0 l e t
d 0. n s
l co
cas
d u
f i1 r n és y 1 P Y r 0 ph 03 ph a t ":
on
obtient
le
farnesol.
Ceci
résulte
d'une
activité
aberrante
de
la prényltransférase
(la
coupure
hétérolytique
ent:::-e
le
C'
de
l'ë.cool
1
et
le
PPi
donne
un
carbocation
qui
réagit
avec
l'eau)
en
accord
avec
les
résultats
de
POULTER
et
RILLING
(1976)
sur
la
74
___l
_
o
!50
100
2.00
250
PRc,·~-r_~·I''''r:: r 'L(1)
.
( L
; .... t....
\\1
...1
F.i-g Cl/le.
) 7
E~6rth de la vaftiation d~ la qua~tit~ de rhot~;n(~
LU, C-' !i1o..t'<- CI Li <2,\\
(ill
i!l.Z..ti c u.
J~ é. a c. :t.<- 0 I! n cC' ,!, U/L t l ,( 1'1 C. 0 /cp 0 Ji. cct'<-. (i li Ci. c.
[J_l-;c\\ .<.hU;)(liittllljf.PYhOpiI0'))Jl1çLe. dC(I?,~ lc.-6 chtoJcorhytL('.~1
(aro)
•
JJCUL
f c.,!' Jli C')i' l, /((1/1 (>s Pt ~l6.U d'<- a-f C.6 ri (' P() Jo' vfLO Vl •
CfL/iO!i10pt.Ci.6fcs,
500 p 9 rf C'.
°
)).'L
t é. ùu'. -6 Iii ('.. 1)1 bJi (( V! aiJt c>s
,
.
c. h..f.e /tO p Zo. -6.t (L·6
111 e.IilU
1
:100 1. 'J ci c. p Ji 0 t Ci,<- i l('...6
il cU-, CU.. h c..s
" [1 li cl P J,O l "1) , !.. f l )
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Dl,j 517'0 Jo
)',rn"'J]cl
-o'/o;r;p Jp 01/})'::J:!)U.lOlf)'Y- oU:~Jr)1Icl op 6:[( 5[ '0 ~qnJw: iJ LlO
')-'()~t:)(fcl
-,~ jl;Ô;),dicl7f!iwii1rcl Op o,?fjJ''){\\J0Y- YJ7f :{LfDnbrjd:wy 9'()JLfo':l(~d;ctJ 'iG'1 1;!lOd -
"J 0 y-? U 7trJ 9 [U~-CJ : c] ! J 1)! 11 ülf~ f] Œ! t - IJ ; iJ
"UO:~üqI7JHr,P Î)ê)':T?'li/
u7J
yl1DP
'n? n P0l,':('LI: ''l'~)jfi',' 1) LJ cl y-!) l/ cio 11fi ri Y'7f 00 J ;)1) y-() P ~ J:(\\ Y-iJ'O () 7P 1)1: / )'u 7; CryJ
:; -;: :j :JJ,:r V
)'0 l
yll iJ P
il?! J('~ cl 1] J ~ 11 Ç) '-I-? (1 7'):J iJ 1) ':P J)7( (;;0 'ù fil):r 1.f()J'r WH! Û J :,n: 7))'
. o;'ù '/ ~ 7:(: -al;
,{Vii 0'1 rJ Il
YZi 7
"'J 1] b :lf7J lh( 0 Il! d j/J// cl yO Il ô01;JICI 'a p J:ù
Ù :;::J [jd \\,.;) Il cl
-o'J, cI 'J n\\---glfl(1J9
~If-r]
j'o
dj',n/dyo!JdOl(fidJfnIÎJ1{~6 [Hç-ll op O'JUr)y-0':d
il ù
If 1) 'l,' in' 0 cl
() P Ç'-,)}' ?'7)7fcl 01110 1I1p 0 P +0
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17
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(,
Z
r - - - , - --'------- ~
1 - -
------
~:~~or~
B
0 - - -
- - - - - / /
~ ~
0
1
Ç.
-iOV~
1
r~
J ~
SL
76
prényltransférase
èe
foie
de
Porc.
L'ensemble
de
ces
données
indique
que
la
frctction
stromatique
du plas~e est essentiellement
engagée
dans
les
réactions
de
transfert de
groupement prényl,
~lors
que
les
étapes
finales
sont
spécialement
dirigées
par
les
membra~es
plastidiales.
BI Connection entre l'est~rific~tion des chlorophyllidcs et la
biosynthèse
des
caroténoides.
1-
1 t1 ~
Pour
étuàier
ce
phénomène,
nous
avons
fourni
de LJ. -
eJ
isopenténylpyrophosphate
â
des
suspensions
de
cllloroplastGs
pour~uc5
de
chlorophyllide
endogène
et
de
chromopJ.astes
cn
présence
de
chlorophyllide
exogène.
1-
Ré sulta ts
Les
résultats
obtenus
montrent q u ' i l
y
a
incorporation
de
l'isopenténylpyrophosphat.e
dans
les
chlorophylles
et
le
9 é ra n 2' J. 9 é ra n i 0 l
l j b r co s
a ve c
). a
sus pen s ion
de
ch l 0 r 0 pla ste s
( Fig. ~ ::Jé.:
Dans
les
suspensions
de
chrolnoplastes,
en
présence
de
chlorophyi~iC~
exogène,
on
observe une
synth0se
importante
des
chlorophylles.
On
décèle
égéllernent
la
pré~3-(~nce (lu
géraJlylgéralliol
libre
t:Oll~ C:c·-.;:;C:
ôa,1s
les
chloroplastes
(Fig. 19b)
Mais
la
synth0se
des
caroténcid0~
en
présence
de
chlorophyll:i,dcs
est
ext:rêr.;emenL
Yéë.uite.
Le.'
rappc~t,
c 11 l 0 r 0 p h Y 11 e s / c il r 0 1:. é n 0 r ù e 5
<=1 5 , 8 3 ) ( '-:: cl b 1 e êI li
l l ) W 0 n tee
q u (~
1. a
~ y n ''':' ;, ,'~ s ~
des
cilloyophylles
(es~érif:i.c0tion des chlorophyll·idcs)
e s t
f2VC::"i.sc~c,
dans
les
suspensions
de
chromoplastes
en
présence
de
ch]crophyl:i~e~
exog6nes.
Lorsqu'on
u t i l i s e
la
protochlorophyllide,
ce
rapport
;ossc,
""
(.J,03.
E n
2 b s e Ji C e
cl e
c 11 l 0 J: cp h Y Il i d e~ e x 0 9 è n c: s,
l ' i n cor f' 0 TaU. 0 1·:
c1 e
l'isopenténylpyrophosphate
par
les
suspcllsions
ae chromopl".stes
e ~; t e s s e Il t. i. e Il e me fi t
0 b s e r v é e
dan s I e s
car 0 t è n « !3
( Fig . 2 Ca)
pl1yt~ofluène_cis
ph Y t 0 f l u (~ n e - t ra 11 s
0. - car 0 t è n e ; ç
+
i3 c a L' 0 t è, :1 e .
77
'1"
1
6
o
~''''
r-
o
,--.... 4
....
1.,'-
E
Q..
chloroplastes
o 2
' - "
o
J~l
__J_~---L_._l.-...........L-------1.
---
a
1\\1
V
l),Z
Ch G
c
l
Li,S u.fL c.
19
.
IIH'..oJtpoJwLi..ol1 dc.[1_14 g -i.-60pe.i'L-tél'lY:'PU fLO pi,06p!Ja,f:C' cc':) t.:
C.!lJ:.OJéOp!lU.ttl!.'S
I?:t
dan.6
f!.r,s
cŒf1c:tène.-6
peuL .te-6
rta~,.(e.,S de. Pc I)/Le
( ch 1'.0 hO pla-6;t (7.-6
i
c. h/lO ;;~ 0 pia-6:t C'..-6 + chio ,'L 0 P f1 lf U .,(:d i?.-6 C. x 0 9 è He.,~
o
OJLJ..gJ..ne.;
:J;
ni:'ouw:thi..l'l.e.
j
vi..ofaxal1:tlùnc;
L + L ;
J:.U:té.'<.fU?, + zéax.cw:thJ..l1e.
j
Ch
c.htO!LOp(l!j.t.LC~
({~< ~
G
Œic.oot-6
dJ..:te.npéni..quC'..-6
lJ..bhC.-6
;
c.
:
c.a~o:ttHc.-6 ;
F
6hon-t du ~otVŒI'l.~.
0,31
j.:C,L)
78
TABLEAU
1,1
.
d
r.- 14:1.
-
Incorporatlon
e
J
~-
9 lsopentenylpyrophosphate dans les
chlorophylles
et
dans
les
caroténoIdes
par
les
suspensions
de
chromoplastes
de
Poivron
en
présence
de
chlorophyllides
exogênes.
Radioactivit~ exprimée
en
dpm
Ch l 0 r 0 p h~' l l éè S
Plastes
Chlorophylles
Caroténoïdes
carotenoïde?,
Chromoplastes
43.000
1200
35,83
Isopenténylpyrophosphate
( 5 3
Ir. C i / m1'\\ Cl l e
0,31
pCi)
2-
Discussion
Dans
les
plastes
pouvns
de
chlorophyllides
(chlorcphylJi6es
endogènes
dans
les
chlorop12stes,
chlol·OphylJ5.des
exogènes
dans
les
suspensj.ons
de
chrornop1.ast~cs) on
observe
un
dra.lnage
préférentiel
è e l ' i s 0 p e JI té n y l P Y r 0 p ho S ph a t e
ver s I ' est. é 1: i 1: j cac. ion
des
ch l c j~ () ph J' l -
lides.
La protochlorophyllide
ne
joue
p~s
ce
raIe.
Cette
donnée
peu t e x p l j q ù e r,
co m!ll e l ' 0 n t
mon t r é e e r t él..l. n S
;1 ut. c li r s,
qu' D. V e c
1,,-, s
chloroplast~cs
in
vitro on
n'oLtjent
Fas
la
synthèse
des
carotGrloïëes
- - - - - /
si
on
utilise
l'isopent~nylpyrophosph2te o~ des
substrats
allyliqu~s
de
longueur
de
chaine
allant
jusqu'à
C
.
20
Dans
le
cas
des
chromoplastes,
la
synth~se préférentielle
cl. e
C él rot é n 0 ï des
0 b s e r v é e
en
él b 5 e n c e
è E
ch l 0 r 0 p h Y l J. i è e s
( Fig. 2 ') i:d
peut
être
restaurée
eD
présence
de
Triton
X-100
(Tableau ~~
ces
condit.ions
(présence
de
chlorophyllides
ct
de
Tri.toll
X-I00
èa~:3
les
suspensions
de
chromoplastes),
l ' e s t é r i f i c a t i o n
de
la
chlorophyl-
lide
diminue
d'une
part,
et
d'autre
part;
la
synthèse
des
carot6nci-
des
est stimulée.Une
analyse
détaillée
des
caroténoïdes
montre
que
seul
le phytoêne
est
marqué
lorsque
la
concentration
du Triton
X--100
augment8
(Fig. 20b)
(CA!U1RA
et
a l . ,
19823).
1..,' effet
solubilisant
du Triton
X-I00
sur
les
strl:ctures
me~bra!1aircs (HELEI':ll\\S,
1975)
explique
les
effets
constatés
ci-dessus.
Ceci
confirme
deux
faits
..Jr--------------~--~-..."
81~10'~
A
'j
cprn
i ~
..
II1
()
/
't ~~ 'r\\
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G
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r'
1
-_..._--....-----_.._~-~~~~.~-~~~~._~-~._~~.~<
IInattf6<!-. de.!>
c.o..JLo:tèJlc:.!l p[ul.i6·Lé./~ aphè/) .~J1c.[;JLpo~'l{~.t1oJ1 dC'. [i_!!i cJ
1hOreJ1té.~ljf pynoph06phate pah te~ c.hhDwopla~te6 en ab~ence de
C.htofLophyll1de6
exog~J1e6.
Il
en ab~enc.c: de TJL1ton X-700
B :
CIL
ptLé..HllC.C:
de.
TJL1toYl
X- 700
C. hJl.O 1110 p.ta.) .t;' cr UJ'_-O
(Ill g)
0=
7 0
p IL tj~t [; 2. ne:;
2
ph fj -t: a 6.t U. èl1 e. - c.1 ~5
;
3 r fu} .:t 0 6.t u. è. 11. e. - :t JL CJL ~~
4 a-c.ahotène ; ç +6 c.alLo:tène ; olLig;'ne.
160 pe.ll:té.nylp0'ho pho,s pI1CL.te.
( S 3 lI,C--éj m;'.{o.t.e. ;
0 , 3 i\\lC;')
80
-
l'estérification
de
chlorophyllides
est
catalysée par
une
enzyme
membranaire.
la désaturation
du phytoène,
précurseur de
caroténoïdes
colorés
est
inhibée.
Ce
qui
confirme que
les
désaturases
sont des
enzyces
membranaires
alors
que
la phytoêne
synthétase
dans
le
cas
des
ch~omoplastes de
Poivron
est
une
enzyme
soluble.
cl Conclusion partielle
La
synthèse des
chlorophylles
par
les
chloroplastes
~és~ltR
d' une
coopérat~ion entre
les
enzymes
stromatiques
et
membranaires.
La destruction
des
membranes
plastidiales
(thylakoidesl
qui
cüns~i
tuent
une
structure
d'accueil
des
chlorophylles
réduit
fortement
leur synthèse.
La
chlorophylle
synthétase,
enzyme
d'estérific~ticn
est
une
prot~ine rnembranaire
périphérique.
TABLEI,U
12
.....
1.1..,
Incorporation
de
~-- -g isopentenylpyrophosphate
da~5
:€S
ch 10 r op h Y I l e s
( a + b )
et dan s
les
car 0 té n 0 ï ë. e s
p ë:. :>':
les
ch r 0 n~ 0 pl 2. S ': 2 ~;
de Poivron
après
addition de
la
chlorophyllide
exogêne
en
prCse:I=~
de Triton
X-100.
- - - - , - - - - -
Radioactivité
exprimée
en
dpm
Triton
X-100
(mg.
- 1
mg
protéines)
Pigments
o
5
10
50
jOO
2 (le;
Chlorophylles
43.000
30.000
13.500
6.000
2.50:::;
. '- - ,
Carot.énoides
1.200
4.900
17.300
31 .000
32.20C'
32.::=
ChloroJ2hylles
35 , 83
7,75
0,78
0, 19
0,03
o , .~ "~
Caroténoïdes
Isopenténylpyrophosphate
(53
mCi/mMole
0,31
flCi)
81
VII
-
SITE(S)
DE BIOSYNTHESE
DE
LA CHLOROPHYLLE
SYNTHETASE
L'utilisation
de
mutants
végétaux
a
permis
de préciser
certaines
séquences
réactionnelles.
Cette
technique
a
souvent été
associée
à
l ' u t i l i s a t i o n
d'inhibiteurs
de
traduction
(cycloheximide,
chloramphénicol,
lincomycine).
Ces
études
ont permis
de
préciser
certaines
étapes
intervenant
dans
la biosynthèse
du
noyau
t6trapyr-
rolique
des
chlorophylles
(KIRK,
1978).
L'utilisation
de
ces
inhi-
biteurs
de
traduction
se heurte
souvent à
des
problèmes
de
phyto-
toxicité
(SAKILIBA,
1983).
On
cannait depuis
les
travaux
de
BRAWERMAN
et CHARGAFF
(1960),
UZZO et LYMAN
(1969)
sur
les
Euglènes,
que
les
températures
élevées
perturbent profond0ment
le
développement
de
l'appareil
photosynthétique.
Plus
récemment
FEIERABEND et SCHRADER-REICHHARDT
(1976)
ont montré
que
ce
phénomène
é t a i t
lié
à
une
déficience
en
ribosomes
plastidiaux
(70S)
comparable
â
ceux
de
certains
mutants
( Bé5 RN E R _~~-=.'
1 9 7 3).
Dan s
C'e s
con dit ion s,
les
v é 9 é tau x
ai n s i
traité~ sont incapables de synth~tiser des polypeptides c~dés pir Je
gén6me
plastidial.
Cette
caractéristique
a
été
mise
â
profit,
récemment
dans
le
LaboratoiJe
(Cl'.MARA,
1981'.ai
SAKILIBA,
1983)
pour
déterminer
le
site
de
synthêse
de
la
phytoène
synthétase
chez
les
végétaux
supérieurs.
Nous
avons
donc
u~ilisé ce
modèle pour
d~te~miner 10
site
de
synthèse
de
la
ch1orophylle
synthétasc.
Ainsi
des
germina-
J
tions
de
Blé
étiolé
ont
été
placées
à
25°C
et
34°C
(Voir
chapitre
matériel
et
méthode).
Cette
derni~re température
dans
le
cas
du
Blé
inhibe
la
formation
de
ribosoii1es
plastidia.ux
(Cl\\r-;t-.l~l\\.,
1984<:\\)
De
ces
germinations
de
Blé
traitées
à
25°C
et à
34 D C sont
extraits
des
plastes
utilisés
dans
l'expérience.
Nous
avons
d'abord mis
en
évidence
et
défini
les
caractéristiques
de
la
chlorophylle
synthé-
tase
dans
les
plastes
de
Blé
étiolé
avant
de
décrire
les
résultats
obtenus
aux
différent,es
températures.
82
AI Mise en évidence et caractéristiques de la chlorophylle
synthétase
dans
les
~tioplastes de Blé
(Triticum
sativum L.
var.
Florence
aurore).
1-
Résultats
a)
Effets
de
la
variation
du pH
du milieu
d'incubation
sur
- - - - -
.
l'activité
chlorophylle
synthétase
des
étioplastes
de
Blé
(Tableau
13)
La
variation
du
pH
du
milieu d'incubatio~ modifie
l'incGr-
poration
de
l'isopenténylpyrophosphate
dans
les
chlorophylles
et
dans
les
alcools
diterpéniques
(Tableau
13).
La synthêse
des
chloro-
phylles
et des
alcools
diterp6niques
faible
dans
les
pH
acides,
passe par
un maximum à
pH
7,6
et
décroit
dans
les
pH b~siques.
TJ.\\.BLElIl1
13
Incorporation
de II 14:::1 .
-
l
-
h
h
"
1
-
S::J l S 0 P E: n te n y
p y r 0 p
0 s p a t e
Q ans
_ e s
chlorophylles
et
dans
les
alcools
dit2rpéniques
par
les
suspensions
d'étio~lastcs de
Blé
sous
1 .
IO +
Clvers
Pl
- - - - - - - - - - - -
Radioactivité
.~xprimée en pmolcs/rng de protéines
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
pH
Fractions
6
6,5
7
7 , 5
7,6
8
8, 5
analysées
Chlorophylles
0 , 11
1 ,68
4 , 1 7
4,50
5, 37
0," 5
0,22
- - - - - - - - -
Alcools
0,27
0,36
0,36
0,40
0,45
0,18
0,09
diterpéniques
Les
pH ont été
obtenus
de
la
façon
suivante
pH
6 et
6,5
tampon
MES
pH
7
tampon
MOPS
;pH
7,5
7,6
8
8,5
tampon
Tris-
Hcl
Isopentênylpyrophosphate
(53
rnci/mMole
0,31
f-lCi)
. . . . "'!!!'i'(
83
b-
Effets
du pyrophosphate
sur
la
synthèse
des
chlorophylles
par
les
suspensions
d'étioplaste
de
Blé
à
partir de
l'isopentényl-
pyrophosphate
(Tableau
14)
L ' in c 61: po rat ion
d e I ' i s 0 pen té n y l p Y r 0 p ho s ph a t e
da!l s I e s
chlorophylles
et
dans
les
alcools
diterpéniques
est
fortement
réduite
en
présence
de
pyrophosphate
(Tableau
14).
On
n'observe
que
29%
de
chlorophylles
synthétisées
et
31%
d'alcools
diterpéni~ile5.
Incorporation
de
IT_14~ isopenténylpyrophosphate dans
les
chlorophylles
et dans
les
alcools
diterpéniques
par
les
suspensions
d'étioplaste~ de
Blé
en présence
de
pyrophosphate.
- - - - - - - - - - - - - -
Radioactivité
exprimée
en
dpm/mg
de
protéj~es
fractions
analysées
-
PPi
+ PPi
,25
l:~i",
chlorophylles
5,37
1 , 5 7
alcools
diterpénigues
0,45
-~---------- - - - - - - - - - - -
Isopenténylpyrophosphate
(53
mei/mNole
'Ü,31
flei)
2+
2+
c-
RaIe
des
ions
divalents
(Mg
1
Mn
)
sur
l ' a c t i v i t é
chlorophylle
synthétase
ct
l'incorporation
de
l'isoperlténylpyro~~os-
pilate
dans
les
alcools
c3.it"erpénjques
par
les
susper:.sions
d'étio-
plastes
de
Blé
(T21Jleau
15).
2+
2+
Les
ions
Mg
et Mn
favorisent
l'incorporation
de
l'isopenténylpyrophosphat:e
dans
les
chloroplas"tes
et dans
les
alcools
diterpéniques
(Tableau
15).
La présence
de
l'EDTA
(agent
chélateur
de
ces
ions)
réduit à
la
fois
la synthèse
des
chloraphyll~~
84
du
g~~anylgeraniol et de ses dérivés hydrogénés.
'l',ABLEAU
15
2+
2+
Effets
des
c0tions
Mg
et
Mn
sur
la
synthèse
des
chlor~phylles et 6es
alcools
diterpéniques
par
les
suspensions
d'ét.ioi-,l.astes
Je
Blé
à
partir
cielJ.-14~isopenténYlPyroPhosphate.
Radioactivité
exprimée
en
dpm/mg
de
protéines
2+
2+
frù.ctions
+ 11g
15
mIl
-
Mg
2+
2+
analysées
+ I1n
5
ml1
-
Mn
+ EDTA
(1
ru r·j )
--~----'---------
ch 1 0 J~ 0 P h Y Il e s
5,37
2,25
alcoclJ s
diU;)~p0niques
0,45
0, 16
------ - - - - - - - -
s,31
WCi)
2-
Discussion
Les
résultats
obtenus
ci-dessus
rév~lent deux
faits
1.
Lü
synthèse
de
chlorophylles
par
les
susper'.sions
d'étioplastes
de
Elé
à
partir
de
l'isopenténylpyrophosphate.
I l
faut
noter
cependant que
cette
synthêse
est
moins
importan~e (5,37 pmoles/
mg
de
protéines)
par
rapport
à
celle
obtenue
dans
les
mêmes
conditions
avec
les
suspensions
des
chloroplastes
(165
pmoles/
mg
protéines)
et
de
chroJiwplastes
(327
pruoles/mg
de
protéines)
de
Poivron.
Nos
résultats
et
ceux obtenus
par
VEZITSKII
et
WALTER
(1981)
aui
après
i n f i l t r a t i o n
de
chlorophyllide
à
des
feuilles
étiolées
de
Secale
cereale
L.
montrent
une
formation
de
chloro-
P il yI], es,
p e r ru et te. n t_
cl 1 a f f i r mer
CI u c
l a c h 10 r c ph Y I l e
synth.2tase
est également présente
dans
les
éticplastes
de
Blé
dépourvus
de
chlorophylle
tout
comme
dans
les
chromoplaste§
de
Poivron.
85
1.
Par ailleurs,
la modulation
de
i ' a c t i v i t é
de
cette
enzyme
dans
les
étioplastes
est
comparable
â
celle
obtenue
dans
les
chloro-
plastes
et
dans
les
chromoplastes
de
fruit
de
Poivrün.
Ainsi
Le
pyrophosphate
réduit
la synthèse
des
chlorophylles
par
inhibition de
la synthèse
de
l'alcool
estérifiant
la
chloro-
phyllide.
.
2+
2+
-
Les
10ns
Mg
et Mn
favorisent
la
synthèse
des
chlorophyllc~
par stimulation
de
la synthèse
de
la
chaîne
latérale.
-
Les
effets
du pH sur
l ' a c t i v i t é
chlorophylle
synthétase
SOi~t
identiques
â
ceux obtenus
avec
les
chloroplastes.
L'optimun
de
synthèse des
chlorophylles
se
situe à
pH
7,6.
La mise
en
évidence
de
l ' a c t i v i t é
chlorophylle
synthétase
dans
les
étioplastes
de
Blé
et
la
facilité
de
culture
contrôlée
que
présente
ce
matériel
végétal,
nous
ont
conduits
a utiliser ce
système
biologique
pour
les
études
sur
la détermination
des
sites
de
biosynthèse
de
la
chlorophylle
synthétase.
BI l,c ti vi té ch l orophy ~ les yn th é taS e (3 ù_n_s__l_e s p l ast_e~s__d~(>_B_]_.ç_s
cultivé à
25°C et il
34°C
1-
Effets
su:,:-
le
verdisseEJent (3u
81é
AP r è s
1 4
j 0 urs,
les
pla nt li les
!JI ai nt en \\1 e s
il
le li r
t. e TT' p é :c ê. t cL 'c;
de
germiantion
(25°C
et
34°C)
sont
écL.lirée~; pe;,dant 18 heures.
Les
jeunes plantes
ayant
germé
â
25°C ont
verdi
tandis
qu'on
0bser~e
une
inhibition
du
verdissement
chez
le:::;
p}.u.ntcs
eXl'0s,se,,:
b
~~·4°c.
2 -
E f f e t~ s
s u ..c
l ' a c t i vit é
ch l c :( 0 ph Y l l e s )_:rd~h é t..?- é, c:..
La
synthèse
des
chlorophylles
par
les
suspensioDs
d'étio-
plastes
de
Blé
trait~ à
25°c et à
34°C à
partir du
géranylgér2~yl
pyrophosphate
est
très
différente
(Tableau
16).
L'incorporation
de
géranylgéraniol
dans
les
chlorophylles
par
les
étioplastes
des
plantules
ayant poussé
â
34°C est plus
importante
que
celle
obten~c
avec
les
étioplastes
de plantules
maintenues
à
25°C.
En
présence
d'e
chlorophyllide
exogène,
cette
synthèse
est
mui tip1.iée
pi:'..":
5
da~,:'O
86
le
cas
des
plantes
développées
à
34°c.
Elle
est
généralement
stimulée
si
la
suspension
d'étioplastes
subit un
flash
(2
min
d'éclairement)
avant incubation à
la
lumiêre
a~biante. Aprês éclairement des
jeunes
plantes,
la synthèse
des
cHlorophylles
par
les
suspensions
de
plastes provenant
de
ces
deux
lots
est
relativement
identique
en
présence de
chlorophyllide
exogène.
Dans
les
incubats
dépourvus
e)jogènes
de
chlorophyllides,
l-a--synthèse
de
chlorophylles
double
dans
les
plastes
du
lot
traité
à
34°C.
Dans
tous
les
cas
la
synthèse
des
chlo-
rophylles
est plus
importante
à
34°C qu'à
25°C.
TABLEAU
16
3
Incorporation
de[1-
ï,TI géranylgéranylpyrophosphate
dans
les.
chlorophylles par
les
suspensions
de plastes
de
Blé
cultivé
à
25°C et à
34°C.
Radioactivité
exprimée
en
dpm/mg
de
protéines
!-i,itéri el
Blé
cultivé
olé- cultivé
végétal
~ ~ ~ - - - - - c - - - - - .
Blé
étiolé
+ chlide
6. 77:'.;.
36.023
5,22
*' chIlde
41.648
59.766
1 ,43
Blé
,~c lai ré
+ chlide
31.223
32.105
1 ,03
(18 h
de
-
chlide
24.636
54.093
2,19
lurüèro)
- _ . _ - - - - - - - - _ . _ - -
chIlde
= chlorophyllide
;;;.
.
-
l
.
-
suspenslon
ec
alree
pendant
2
minutes,
pUis
incL:bacion
à
la
lumière
ambiante.
Gér~nylgéranylpyrophosphate
(20
mCi/mMole
0,85
~Ci)
==
87
b)
Discussion
L'estérification
obtenue
en
absence
de
chlorophyllide
exo-
gène
dans
le
milieu d'incubation
complète
les
résultats
de
DUGGAN
et
REBEIZ
(1982)
qui
montrent
qu'il
y
a
un
pool
endogène
de
chloro-
phyllide
dans
les
étioplastes
et
dans
les
chloroplastes.
La
stimu-
lation
de
la synthèse
des
chlorophylles
observée
avec
les
étioplastes
ayant
reçu
2 minutes
de
lumière
dans
le
milieu
dépourvu de
chloro-
phyllide
exogène
sugqère
la
synthèse
et
la présence
de
protochloro-
phyllide ?hotoconvertible
en
chlorophyllide
â
25°C et â
34°c.
Cette
dernière
est
estérifiée par
le géranylgéranylpyrophosphate
FEIERi".BEND
(1977),
dans
18
cas
de
Secale
cereale
L.
dont
la déficie;:clè
en
ribosomes
plastidiaux
est
induite
â
32°C,
note
la présence
de
chlorophyllide.
GRIFFITFiS
et
BEER
(1982)
montrent
que
la protochlo-
rophyllide
est photoconvertible,
ce
qui
expliquerait
la
stimulation
de
l'èstérification
obtenue.
Dans
nos
conditions
expériemntales,
la
déficience
en
r i b 0 som c::: s p I as t i dia u x
a v ait
dé j à
été
fi 0 n t. r é
( C M·U'. RA,
1 9 G3
coml~1C
l ' a t t e s t e
en
autre
l ' a c t i v i t é
Ribulose
1,5-hisphosphate
carboxyluse.
-
f· .
.
'\\.~ 1 4 ab·
b
t
l
. t
t .
1\\}J r es.:. l ): a. t l 0 n
Q e
~ -
~
J. car
0 n a
e
par
e s
e x t r a l
s e n z y fi . l q L!. e s
pr6parés
â
partir de
feuilles
de
Blé
développé
â
25°C
et à
34°C,
l'auteur obtient
respectivement une
activité
ribulose
1,5-bisphosphat0
carboxylas2
de
68
nDoles/mg
de
protéines/min
(pour
les
plantes
â
2 5 Q C)
e t
9
Dl;] 0 les / m9
de
pro t é in e s / mi. n
( pou r
les
pla fi t. e ~.
à
3 4 ° C).
DCl n s
ces
cunditions,
on
sait
q~e
la petite
sous-unité
est
sYllthétisée
par
le
cytClplasme,
sur
les
ribosomes
80S,
et
12
granGle
sous-unité,
dans
le plaste,
sur
les
ribosomes
70S.
La
coopérQt~on du
cytopl~sme et
du
plél.ste
dans
le. synthèse
de
cette
protéine
enzymatique,
expliqup
sa
faible
activité
dans
les
plantes
déficientes
eri
ribosomes
plasti-
c3iaux
(plantes
à
34"C.)
L ' e 11 S e mb le
c1 e
ces
con 5 i dé r 2. t ion s
n (j Il S
P e r me 'c
d'a f fi r ru c: r
que
la
chlorophylle
synthétase
est synthétisée
dans
le
cytoplasme
sur
les
ribosoJr.cs
80S.
rd.nsi
dans
l ' é t a t
actuel
de
nos
connaissances
sur
la
synthêse
des
enzymes
impliquées
dans
la biogénèse
des
tcrpé-
!loides,
on
note
une
très
grande
dépendance
du
plaste
par
rapport
au gén6me
nucléaire.
Ce
fait
a
été
démontré
dans
le
cas
de
la
protochlorophylle
oxydor~ductase (GRIPPITHS
et
BEER
1982
P,ATSCP.ll.UE?
_"!'5'
88
et al.,
1982),
dans
le
cas
de
la phytoène
synthétase
(CAMARA,
19840.
SAKILIBA,
1983)
et présent~ment pour
la
chlorophylle
synthétase
dans
ce présent travail.
Pour
comprendre
ce
phénomène,
on peut
faire
appel
au
modêle
de
la synthèse
de
la pe~ite sous-unité
de
la
ribulose
1, 5-bisphosphatc
carboxylase.
Dans
le
cas
de
la
chlorophylle
synthétase,
l'enzyme
serait synthétis~e dans
le
cytoplasme
sous
forme
d'un
polypeptide
pré cu r seL, r.
Ce
è. e r nie r
e n t r e r il i t
d 2. n s
l e p l il ste
0 Ù
s f,
J:'. <1 nif est e
s 0 :1
activité par un
mécanisme
post-traductionnel
(Fig. 21) .
89
DISCUSSION GENERALE ET CONCLUSION
La
réaction
d'estérification,
qui
constitue
la
dernière
étape
de
la biosynthèse
des
chlorophylles,
a
longtemps
été
considérée
comme
catalysée par
la
chlorophyllase,
enzyme
qui,
selon
certaines
données
bibliographiques,
serait également
responsable,
par
son
action
hydrolytique,
de
la
dégradation
de
ces
mêmes
molécules
pigmen-
taires.
L'activité
de
cette
enzyme
se
manifeste
en
présence
de
Triton
x-100 ou d'acétone,
qui
constituent
des
facteurs
nécessaires
(MüLL
et
STEG\\";EE,
1978).
Or,
nos
travaux
ont
été
effectués
en
l'absence
de
tout
détergent
ou solvant
organique.
Par
ailleurs,
dans
nos
conditions
réactionnelles,
le
taux
de
dégradation
des
chlorophylles
est
très
faible
et
i l
n'est pratiquement
pas
affecté
par
l'addition
de
p-CMB
(inhibiteur de
la
chlorophyllase).
Ces
données
nous
permet-
tent
donc
de
considérer que
l'enzyme
d'estérification
active
dans
noS
conditions
réactionnelles
n'est pas
la
chJorophyllase,
enzyme
de
dégradation
des
chlorophylles,
mais
une
autre
enzyme
la
chlor-o-
phylle
synthétase.
Les
recherches
menées
sur
la
localisaLion
de
l ' a c t i v i t é
chlorophylle
synthétase
au
sein
du plaste
ont
montré
que
l a
synthÈ::28
des
chlorophylles
exige
l ' i n t é g r i t é
de
cet
organite.
En
f~it;
une
étroite
coopération
s ' é t a b l i t
entre
le
stroma'et
la
fraction
membr~-
naire
(prothylakoides
dans
les
étioplastes,
thylakoides
dans
les.
ctlloroplast.es,
lamelles
a.chlo:cophyllicJHlAs
dans
les
ch:-:omoplù.stes).
Le
rôle
du
stroma,
entité
COinnune
à
ces,plastes
morphocénc.5--
tiquement
différents,
es'c
cê:,oit:al.
Les
différentes
è'capc~.; de
la.
voie
de
biosynthèse
qui
aboutit
â
la
formation
d'un
alcool
en C
,
estéri-
20
fiant
le
noyau
tétrapyrrolique,
sont
catalysées
par
des
cnzymes
l 0 cal i sée s
à. ans
l e s t rom il.
U n
ph é n 0 ln è n e
s i rr. i l il ire
a v a i t
été
mon 'c r é
dans
la
biosynthèse
de
certaines
étapes
dli
noyau
tétrapyrroJique
de
la
chlorophylle
(S!JjITH
et
REBEIZ,
1979),
des
caroténoides
(Cl'l.j·L:"l.Rl'.
1982c
;
KREUZ
et
a l . ,
19(2),
ct
des
acides
gras,
où
les
premi~res étapes
de
condensation
se
déroulent
dans
le
stroma
(OHLROGE
et
a l . ,
1979).
90
Les
étapes
finales
s'effectuent
au
niveau
des
membranes
qui
constituent
une
structure
d'accueil.
A ce
propos,
i~_ faut noter
la
grande
affinité
de
la
chlorophylle
synthétase
pour
les
alcools
à
longue 'chaîne
(C
),
par
rapport
à
ceux
qui
cOLlportent
moins
de
20
vingt
atomes
de
carbone.
Ce
f a i t
pourrait
jouer
en
faveur
de
l'intégration
et
de
la stabilité
des
chlorophylles
dans
les
structures
membranaires
lipophiles.
Cet
argument
est
renforcé
par
le
f a i t
qu'en
présence
de
Triton
X-loO
(détergent
qui
solubilise
les
membranes),
la
synthêse
des
chlorophylles
est
fortement
inhibée.
Par
ailleurs,
ces
structures
membranaires,
dans
le
cas
des
chromoplastes
que
nous
avons
u t i l i s é s ,
stil;1l11ent
considérélble!:;cnt
la biosynthèse
de
l'alcool
terpénique
réalisée
par
la
fraction
s t rom a t i que
( CAM ARA
e t
a ~.,
1 9 8 2 c).
Cet
e f f e t e s t é gal c men t
c] ci j1] 0 ~1 t. ré
lorsque
la
fraction
stromatique
est
incubée
en
présence
de
détergents
neutres .~
des
concentrations
supérieures
à
la
concentration
micellai-
re
critiq~e
(LAPERRIERE,
1983)
ou
de
J.iposomes
de
galactolipides
(LAPERRIERE
et
CAMARA
.1984).
i
L'el1s~,,::ble de
ces
considérutions
permel
(Je
compr€'nd}:e
qu'cu
cours
de
l'interconversion
entre
différents
type~ morphogénétiques
de plastes,
les
premiêres
ébauches
de
membranes
se
1!1anifest.ent
au
niveau
du stroma.
Les
plastes
retenus
comme
matériel
pour
cette
étude
représentent
trois
stades
physiologiques
(étioplastes,
chloroplastes,
chromoplastes)
présentùnt
tous
une
activité
chlorophylle
synthétase.
br,
les
études
réalis~es sur
ces
trois
types
de
plastes
ont
montré
des
différences
entre
eux
dans
l'ultrastructure
et
dans
la
composition
b i 0 chi mi que.
l K EUe H I e t
l·lU RA KA1,11
(1. SI 8 2 )
0 il t
ra p po r t é
rée e ln m(' n t
que,
lors
de
la
transformation
des
étioplastes
en
chloroplastes
chez
l'Orge
et
le
l·laïs,
i l
S2
produit
une
synt11èse
de
protéines
nouvelles,
alors
que
d'autres
disparaissent.
Ces
auteurs
ajoutent
cependant
que
certaines
prot~iries présentes
dans
les
étioplastes
peuvent
persister dans
les
chloro~lastes. Des
études
parallêles,
conduites
par CAMARA et
BRANGEON
(1981)
sur
la
composition
lipidique
des
nle~lbraI1CS lors
de
l~
tr~nsition des
chloroplastes
ei1
chromoplastes
91
chez
le
Poivron,
ont révélé
que
la désorganisation
des
granums
est
accompagnée
de
la disparition
de
certaines
espèces
lipidiques.
SCHNEIDER et
al.
(1977)
avaient
déjà
noté
une
augmentation
de
la
perméabilité
membranaire
du plaste
au
cours
de
la
transformation
du chloroplaste
en
chroliloplaste.
La
chlorophylle
synthétasc
présente
dans
ces
plastes
morphologiquement
et physiologiquement différents
serait
donc
une
protéine
"constitutive"
de
ces
organites.
L'utilisation
de
plastes
(étioplo.stes
et
chloroplastes)
de
plantules
de
Blé
traités
à
34°C
(température qui
inhibe
la
formation
de
ribosomes
plastidiaux
chez
cetLe
espèce
végétale)
pour
la synthèse
des
chlorophylles
montre que
la
chlorophylle
synthétase
est
synthétisée
au niveau
du
cytoplasme.
Les
mêmes
conclusions
avaient
déjà
été
énoncées
par
SAKILIDA
(19B3)
à
la
suite
de
travaux
utilisant
des
plastes
de
Pois
traité
par
des
inhibiteurs
de
synthèse prot6ique
(cycloheximide
et
chloramphénicol qui
inhibent
respectivement
l ' a c t i v i t é
des
ribosomes
cytoplasmiques
(~t
celle
des
ribosoEE:s
plastidiaux) aVClnt
le
verdissement.
Ces
données
peJ~mettcnt de
conclure
que
la
protéine
e:n%ynù-
t i que
( 0 u
plu s
pré c i s ES 1'1 e nt
s 011
pré cu 1- s e ur)
e s 1:
s y n th ES t :i. s 6 e
è. ans
l c
cytol'lasl!le
et,
par
conséquent,
qu'elle
pénè·tre
ensuit.e
dans
J8
plaste.
La
chlorophylle
synthétéise,
comme
c'est d'ailleurs
Je
Cé'.S
pour
la phytoêne
synth6tasc,
est
donc
une
enzyme
codée
exclusivcD2Dt
par
le
gl:!lÔme
nucléaire,
Tilélis
dont
l'oct.ivjté
se
manifeste
à
l ' i n t é -
rieur
du plaste.
Le
f~it q~e le
site
de
biosynthêse
de
l'enzyme
soit le
cytoplasme,
c ' e s t à
dire
un
territoire
cellulaire
autre
que
le'
plaste
(direct(~ment concerné par
les
modifications
morph0<Jénétj.q;lC:~.
consic16rées)
peut_
expliquer
la
présente
et
l ' a c t i v i t é
de
cet
enzyme
danS
les
diverses"formes
de
plastès
étudiées.
La présence
de
protéines
structurales,
telles
que
la
chlorophylle
synt;,étase,
communes
à
divers
types
de
plastes,
et.:
le
contrôle
par
le
cytoplasme
de
proce~sus métaboliques
intervenant
dans
la morphogén~se du plaste,
permet
de
comprendre
la
possibilité
d'interconversions
plastidiales
(transformation
et
réversibilité)
P'im
77T7
m
Fig. 22)
Il
est
tentant
à
ce
propos
de
noter
que,
dans
les
feuilles
sénesc~ntes (perte de
chlorphylles,
désorganisation
du
pla&ce),
d'Orge,
les
plastes
présentent
un
vieillissement
plus
tardif
si
on
les
isole
du
cytoplasme
(CHOE
et.
THII·1AN,
1975)
L'ensemble
des
processus
impliqués
dans
la
synthêse
des
chlorophylles
depuis
l'isopent6nylpyrophosphate
est
résum6
à
la
figure
21.
En
dehors
du
schéma
habituel
d'évolution
des
plastes
( é t i 0 P l il S t. e -> chIo r 0 pla ste --)- ch rom () pla ste
0 u
chIo r 0 p l ù ~; t e s é n s s c ~ nt)
qui
refl~te des
stades
ou états
de
développement.
des
organes
(feuille~
fruits),
i l
exist.e
un
processus
inverse
(réversion)
comparable
au
phénomène
de
"dédifférenciation".
Les
expéricncc;s
réalisées
sur
divers
matériels
ont
montré
q u ' i l
y
a
?ossibilit.é
de
réversion
de
chromoplastes
en
chloroplastes
GRONEGRESS
(1(371)
a
constaté
une
t r ans for;;] a t ion
de
c 11 r 0 Dl 0 P l il ste s
duc 0 rte x
par elle 11 Y lTi c: 1... eux
de
car 0 t. :~ p
après
éclairement
cet t e
t r ans for Di a 1... ion
s ' il C C 0 i,j P d 9 l! e
d e l ' a p p a 1- i .C
tion
de
systèmes
laIT,el1a1re5
cont.enar.t
de
la
chloyopllyl.le
e'c
de
li}
1
v
;'
disparit.ion
de
criste.ux
de
carotÈ:nes.
DEVIDE
c·t
LJUBESIC
(1972)
0,,;:
obtenu
les
raêmes
résultats
pour
les
cJ!romoplastes
de
tissus
sou:.>-
épidermiques
de
Citrouille.
En
1967,
TH011S0N
et.
ses
collabore.te"rs
avaient déjà
observé
ce
phénomêne
sur
les
oranges
de
Valence
après
traitement
par
le
gibbérellate
de
potassium,
et,plus
r~cemm8Dt,
GRONEGRESS
(1974)
l ' a
décrit
après
un
travail
sur
la
sputhe
de
Zan te d (' ~;; ch i a
e 11 i 0 t t i a n a
e t
su.':"
les
s é p Cl les
d C'
~) u ~~~E-_l.'::..~ e ~~_.
Les
études
microsccpisues
effect.uées
au
cours
de
la
t.rans-
formation
chromoplaste
-chloroplaste
montrent que
la
réversion
s u i t
une
voie
de
développement
analogue
à
celle
de
la
conversion
de
proplastes
en
chloroplastes.
I l y
a
apparition,
dans
le
stroma,
de
formationi:vésiculaires
partant
de
la membrane
interne.
Certaino~
de
ces
structures
sont
associées
élUX
granums
en
i:oj~mation, en
illên:e
temps
que
réapparaissent
les
chlorophyl18s
et
l'acti.vité
photosynt!1é·-
tique.
Ce
mécanisme
de
réversion
peut
ftre
mis
en
rapport
avec
la
possibilit{
de
synthèse
active
des
chlorophylles
au
détriment
de
la
synthése
des
caroténes,
manifestée,
en
présence
de
chlorophyllides
ex 0 9 è Il es,
p cl L
les
cl j L 0 m°pla 5 tes
d €:
Po i -v r 0::' •
Il
1:
1
1
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<!
ISOPENTEl-Ul-PP
GEfl"NYL-PP
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_ . J ••_ . ' .
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nlOPL ASTr:
CHLORO!"L 1.51"
CHnOI,~OpLIl ST E
SITE Oc
S"-IH HE SE
DES
rNZYr:;[S
..' CAROTEI-iOIUEPl
"CHLOROPIWLLFS
'v=~
PLf,STon LJI~;OI;~S
v
..
LTOCOPHFI,OLS
(
""-
PHYlOEtJe.:-l
7 /
s \\'IHHETl'.~
r [iHlf)i\\OPIlYLlE sn~THET/l.~
.~---~._-----
1
! ENVELOfJPE DU PL,r"STE
-----=---
'~'Œcun$CU")
1.:noc",1
SV," HE","' ( SOUs-
w
~
li)
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CIiI.Of~(l"f·iYlLE SYiHHETASE
Ri')vscmes
[~O S _ _
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PP [C U Fi S f: U f( )
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o
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[\\!OV!-\\U
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2 1
--~_._--
Sehiill1tl hl'.6Uma"t ff!.6
p/ré-l1omfI1e.6
,t-Vl,tCJL\\)CnaI1Z
daVl.6 la biogtl1~.6e de.6 te![p~Vlo~de.6 plahtidiaux
1.
94
1
Fi.. 9 [OU?
2 1
S~h~ma ~~~umant le~ ph~nom~ne~ i..nte~uenant dan~ la bi..og~n~6e
de~ te~p~noZde~ pla~ti..di..aux
-
le bt~oma e~t le ~i..~ge d~ la ~onden~ati..on de~ peti..te~ uni..t~~
i..~ 0 pfLéni..Q u. e,5 JU,5 Q[[ 'au 9 li ~aITY 19 I!Jwn ylp !J'fL 0 p h 0 ~ Pfwt e. Ce,5 !(~ a ~;C:~o lU,
de ~onden~ati..on 60nt ~ataly~~e~ paJL la pfLéJ1ylt~an~6~~a~e. Le
g~fLanyl9é~anylpU~orhohphatee~t ofLi..enté ve~~ la bi..o6ynth~6r de6
~a~o.:téJ1o,{.de~, c1e.,5 ~h.tOJlOphy.tlc.6,
dc.,j
pJ'a,_~.:tOQLLÙlOJl(>5 OLL dC>j to~o
ph~~oL5, dont le,5 de~lli..è~c~ é.tapc..6 60nt ~ataly~~e.~ pa~ de.~ enzljHlz.j
memb/wnai..~e~ : éti..op.ta~tr.,5 (phothy-c'cdwi.de,5) , ~hloJLop.e.a,5te/j Uhy.ti.:"-
fwZde~), ~h~ot!?oJ?la~te6 U'.ame.tle~ adl.[o~oph!J.tli..eVlJle-6).
Au niveau du hi..te de 6YJ1th~6e de~ enzYHle~, le~ donJ1ée-6
obteiwe~ dO.IH .te ~a,5 dC.6 ~((.J1.0t(illOXc!C.),
mont/1.ent Que. la
phytoè'llc-
6Yl1tl1t5.-ta,5e,
C-!"lZUJilC.
catalY6(Lnt CCi.. ')!JJ2.thiZ,jc
d1.1. phy,toè.ne
(pJi..em-ic./L
~a~oténoXde dan~ .ta dw.:i.nc.. de b,é.o6!Jn-th~~c. c.hez .te,5 t1égê.taux) (J_~.:t
~!fnthét,ü~e au ni..t)Ca[l dc/., .'L-<.b0601:1C{ 80 S (SAKILIEA, 1983 ; CM!ARA,
19E4al
601.1.6
6o~IIie d'un p/iê~u''1.-6c.(I!l. Ce de''1.IT.i..e/L t~a\\)eh6e l'ell~J;e.tor:'i'_'c.
du.. p.ta,5.t e p a~ un 1:'7 é UUl.C61êl(!.. P 06 .:t .. ..t:JUI.. ri 1.1 c.t.{~ 0 lHl ef . Le.) Jd! ,) u['j af../5
Ob.:tC'.I'W-6
daf16
.te p,'1.é.6eJ'1-t tJLCL v ai..t ,
lJlontJ,e..nt ({u'i..l
C',I'/
e,5:t"de m~lllc. PC:tL.'i
la ~h.toJi..ophy.tfe 6ynth~ta6e.
95
l
CHJ.Ol<QPLAS1'E
FONCTIONNEL
1
__
._.
. __
..
~_
_~-
.~~-
/.'
-- /
/ /
•
/.~
"~~
r:~::iQPLAST<\\(
CH Lü no p·--.C-A-S-T-'c--J-----1\\
L
.
__
SENESCENT
F-<. 9 (LA C.- ? 2
T~an~6o~mation mohpho9tn~tique en~~e di66~~en~b typeb
de. pla.!>tc..
- - - 7
:tJzClJH 60 !lliwLLO n
_ _ _-?
~ é. IJ C' !L -6 ,L 0 11
96
Pour mieux cerner
les problêmes ,posés
par
les
mécanismes
de biosynthèse des
chlorophylles par
les
plastes,
i l
serait
utile
d'orienter
les
travaux
vers
l'étude
de
la biosynthèse
du noyau
tétrapyrrolique,
afin
de
dégager
un
schéma d'ensemble
de
la
formation
de
ces
molé~ules pigmentaires indispensables à
la
vie
des
plantes
photosynthétiques.
97
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a
high
temperature
induced
deficiency
of
plastids
ribosomes
Plant~
154,
459-464.
'••'..f'1
BEALE
S.I.
r:;
1 4 '-1
e t C 1\\ STE L F RII N C 0
P. A.,
1 9 7 3
- 0 -
~ i n cor po rat ion
f rom
r
exogeneous
compounds
into
aminolevulinic
acid
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isol~te6
e 11 l 0 r 0 pla s t s
c f
~~5i~~~'
1',)::,-c:~~__Bioyh_~~:_~_i0r>~1Y~"
lOS,
~ -6.
CILS TE L F lUIi'1 CO
P. A.
e t
BE PΠES. 1 .,
1 9 8 3
.-
ChIo r 0 p h Y Il
b i 0 S y n the sis
recent
advances
and
éi:t'eas
of
current
interest.
Ann.
Eev.'Plant
---.----_._,-----_._-_._-
Physiol.',
34,
241-278.
CHIBA
Y.,
A1GA 1.,
1DEMORI
M.,
SATOH
Y.,
MATSUSHITA
K.
et
SASA T .•
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