THESE
DE DOCTORAT D'ÉTAT ÈS SCIENCES NATURELLES
prll.enU.
A L'UNIVERSITE PIERRE ET
-
PARIS VI
-
par
DOGBO DENEZON Odette
..
POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR I!s SCIENCES
ENZYMES DE BIOSYNTHESE DES TERPENOIDES PLASTIDIAUX :
ORGANISATION MOLECULAIRE ET R.EBHU:R0'tT MA\\.GAC~:
CoNSE\\l AFR\\CA\\~I\\r.~~l s\\.W~~m:UR'
___________ ...p.QU.R l'ENSE1GN';;~~GAQO\\JGOU
c. A. ~\\. b~ Jt})~~. ~'?-~~" ... ·s
Arrivee. . '
to Q.4.7...
0
,
OU~ n ! .'
, Enregistre s _~ <_', _...,..
SOUTENUE LE 17 Juillet 1989 DEVA
t1RY'~COMPOSE DE:
M. P. BENVENISTE
M. G. BOMPEIX
M. B. CAMARA
M. J-P. CARDE
M. R. MONÉGER

AVANT PROPOS
Ce
travail a
été
réalisé
dans le
Laboratoire
de
Biochimie
du Développement
Végétal de l'Université
PARIS
VI,
dirigé
par
Monsieur le
Professeur
MONEGER. Je
lui
exprime
ma profonde reconnaissance pour
les conseils dont
il
m'a fait
profiter, pour les
moyens matériels qu'il
a
mis
à ma disposition
et surtout pour l'accueil
qu'il m'a
réservé
dans
son Laboratoire.
J'ai été
très sensible
à
l'attention
qu'il
a toujours
porté non
seulement à
mon
travail mais aussi à ma situation d'étudiante en France.
Monsieur
Professeur
BENVENISTE,
Directeup
du
Laboratoire
Biochimie
Végétale
de
l'Université
de
Strasbourg
a accepté d'analyser ce travail et d'en être le
rapporteur.
Je le prie de bien vouloir agréer l'expression
de ma profonde gratitude.
Monsieur CARDE,
Directeur de
Recherches au CNRS
et
Directeur
du
Laboratoire
de
Physiologie
Cellulaire
Végétale
de l'Université Bordeaux l,
a accepté d'examiner
ce
travail
et d'en
être le
rapporteur. Je
tiens à
lui
exprimer toute ma gratitude.
Monsieur
le
Professeur
BOMPEIX,
Directeur
du
Laboratoire
de Pathologie
Végétale de l'Université
PARIS
VI,
a
bien voulu
examiner
ce travail.
Je
tiens à
lui
exprimer ma profonde gratitude.

Monsieur CAMARA,
Professeur à l'Université Bordeaux 1,
a
dirigé ce
travail. Il
m'a initiée
aux diverses
tech-
niques.
Avec
lui,
j'ai
appris
la
rigueur et
la
per-
sévérance.
Ses
conseils,
ses
encouragements
et
sa
disponibilité
ont conduit à la réalisation
de ce mémoire.
Il
a
également accepté
de faire
partie de
mon jury
de
thèse.
Je
le prie
de
trouver ici
le
témoignage de
ma
profonde reconnaissance.
J'adresse
mes
sincères
remerciements
à
Monsieur
..
d'HARLINGUE
pour
sa collaboration
et
ses nombreux
ser-
vices,
à Madame
QUENNEMET et à Mademoiselle
FRANCKE pour
leur amitié.

SOMMAIRE
INTRODUCTION GENERALE
1
Rremière p{/rJie : EIURIJ des 60~ympS
/nler~enal1l uans ra v/osyn l hlJSe dU
phylo ne.

H 18 TO R1QUE
_ 7
AI BIOSYNTHESE DE L'INTERMEDIAIRE EN C2 D

--------------
1 -
Converalon de l'ae'tate en m'valonate

1.1-
Convlralon dl l'aeètatl en HMG-CoA

'
---------
..
1.2-
Converalon de

_________10
2 -
3 -
Blolynth6.e du o'ranyl
phate
12
Il IIOSYNTHE SE DU PHYTOE NE
13
,
CHAPITRE 1
- "Blo.ynth'.e du phyto6ne par le. plante.
aup'rleure.
:
ml.e
en 'vldence de l'actlvl''
phyto'ne ayntha.e, .lte de blo.ynth'.e de
l.
l'enzyme
et r'ouiatlon
:.
ARTICLES:
1-
Blo.ynthe.l. of phytoene ln pla.tld .troma 110-
lated
from
hlgher planta
1.
2 -
Regulation of phytoene .yntheala ln plaatld
atroma I.olated from hlgher plantt
1.

COMMENTAIRE DES ARTICLES 1 & 2
11
CHAPITRE 2
-
Etude de l'effet d'un analogue de l'IPP
(amlnoph6n6thylpyropho.phate) .ur la
aynth'ae du phyto'ne
28
ARTICLE
-
ln vitro
Inhibition
of phytoene .ynthe.l.
by phenethyl pyrophoaphate derlvatlvea
28
CO MME N TA 1RED EL' AR'"I C LE 3
2 9
..
CHAPITRE 3 -
Etude des enzymes Intervenant dans la
a y n th' s e
dei' 1n te r m ,. dia 1r e e n C2 0
3 3
ARTICLE:
-
Purification of Isopentenyl pyrophosphate
homerase and geranylgeranyl pyrophosphate
.ynthase from Capslcum chromoplasts by
afflnlty chromatography
33
C OMM ENTAIRE DE L'ARTICLE 4
34
CHAPITRE 4
-
Purification et proprl6Us de la
phytoêne .ynthase
39

ARTICLE:
-, leolatlon and çharaçhrlzatlon ·of a blfunç-
tlonal .nzym. eatalyzlng th • • ynth .... of
phytoene
a.
COMMENTAIRE DE L'ARTICLE 1
40
CON CL US ION PARTI E LLE
42
Oellxièmp. psrl/p
-
ACliy.ilé mél/li(Joine
ildenOS.,Yllr§nsrerssf .;Im~seden e,I!LdPnCp
de /r07S rormes e
e uue
es q ((l{S de
quelques Iscleurs sur son scl/Y/le
44
..
HIS TOR 1QUE
41
RES U L T A TS
ET DIS C us S 10 N
51
Il MISE EN EVIDENCE DE L'ACTIVITE MAT ET ETUDE DE
QUELQUES FACTEURS (Mg2+, AT P ,t pH) SUR L' ACTIVITE
DE
L'ENZYME
52
----------------------------------------
AI
R •• ultat.
~2
BI DI.eu •• lo"
53
III CARACTERISTIQUES DES ISOENZYMES ET ETUDE DE
QUE L QUE S FAC TE URS
5 3
AI
La çon.tante
cinétique et le pold. moI6culalr,_ 54
1 -
R6.ultatt
54
2 -
DI.çu •• lon
54
------------------------------------

BI Influence
de
dlff'ren" facteure
eur l'actlvlU
dee
dlfférentee formee de la méthionine
ad' no eyllr a ne f6 ra e e
55
1 -
S ta bill 16 the r ml que
5 5
a)
Réeultate
66
b) Dlecueelon
55
2 -
Effete du bicarbonate de eodlum et du DMSO
eur lee
actlvltée MAT
68
a)
R' e u l1ate
58
b) Dlecueelon

68
3 -
Influence dee produite du métabolleme de la.
SAM (ACC, MTA), de l'Inhibiteur de la eynthllee
de
l'éthylène (acide amlnooxyacétlque) et de
certaine
r'gulateure de croleeance (ASA, AIA,
GAs)
eur la eynthèee de la SAM
68
a)
R'eultate
59
b)
Dlecueelon
80
.. -
Effete
de
la cycloleuclne, du trlpolyphoephate,
du p - CMB et du traitement dee MAT par l'hydro-
xyphénylglyoxal eur la eynthèee de la SAM
82
a)
R6eultate
82
b) Dlecueelon
66

5 -
Exlatence de trola formea de la MAT chez lea
e.pèce.
et matériel. autre. que le fruit de poi-
vron:
feuillea
de
poivron,
feulllea de tomate
et cellule.
l.oUe.
de fruit de polvron
87
Ré. u 1t a ta
8 8
CI Conclu.lon
88
1111 ETAPES DE PURIFICATION DE LA MAT
_ 89
IVI
EVOLUTION DE L'ACTIVITE MAT AU COURS DE LA
..
MATURATION DU FRUIT VERT DE POIVRON
71
AI R6.ultat.
71
1
-
Stade de maturité
71
2
-
Nature
de l'Inhibition
72
3
-
Nature
de l'Inhibiteur
76
..
-
Effets de d'naturant. proUlquea aur l'ex-
trait
Inhibiteur de
fruit
orangé
78
BI DI.cu •• lon
82
CON C LU S ION PA RTl E LLE
_ 83
CONCL VS/ON GFNFRAL~
86
B/BL/OGRAPHIE-.___ __
__ __
89

ABREVIATIONS
ABA
Acide abscissique
Ado
Adénosine
Adomet
Adénosylméthionine
ADP
Adénosine di phosphate
AIA
Acide indole -3- acétique
ATP
Adénosine triphosphate
cpm
coup par minute
DMAPP
Diméthylallylpyrophosphate
DMSO
Diméthylsulfoxyde
..
dpm
désintégration par minute
DTT
Dithiothréitol
EDTA
Ethyléne diamine tétraacétique
FPP
Farnésylpyrophosphate
GA3
Acide gibbérellique
GGPP
Géranylgéranylpyrophosphate
IPP
Isopenténylpyrophosphate
MAT
Méthionine adénosyltransférase
Met
Méthionine
119/g.MF
microgramme par gramme de matière fraîche
NADP
Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate
oxydé
NADPH
Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate
réduit
NaH2P04
Dihydrogéno-phosphate de sodium
nm
nanomètre
nmole
nanomole
p-CMB
Para-chloromercuribenzoate
PEG
Polyéthylène glycol
SAM
S-adénosylméthionine

1
,
..
INTHOOUCnON GENERALE
1

2
Les caroténoIdes
jouent
un rôle
important dans
le
développement des
plantes et
la
croissance de
certains
microorganismes
(champignons
et
bactéries).
Leur
biosynthèse (Fig.a) constitue
une étape importante
de la
mise en place
des structures photosynthétiques
présentes
dans
le
matériel
vert.
Non
seulement
ces
pigments
participent,
aux
côtés
des
chlorophylles,
à
la
photosynthèse par
leur
capacité
d'absorber
la
lumière
visible (GOODWIN,
1980), mais ils jouent également un rôle
de
protection
des
tissus
contre
la
photooxydation·
(BRITTON,
1976; GRUMBACH, 1979).
~
Dans le
fruit du
poivron (Capsicum
annuum L.),
au
cours de
la
maturation,
les chloroplastes
évoluent
en
chromoplastes. OUtre les transformations morphologiques et
infrastructurales qui accompagnent
cette différenciation,
on note
particulièrement l'accumulation de
caroténoïdes,
concomitante de la régression, puis de
la disparition des
chlorophylles. Cette évolution traduit des transformations
biochimiques et fonctionnelles
de ces organités
(CAMARA,
1980;
CAMARA
et
al.,
1980;
CAMARA,
1981;
CAMARA
et
MONEGER,
1982).
En
dehors des
caroténoïdes,
molécules
terpéniques
stricto sensu, on observe également dans ces chromoplastes
une
augmentation
de
la
synthèse
de
plastoquinones,
composés
qui tiennent
une
place
importante
parmi
les
transporteurs d'électrons photosynthétiques, ainsi que de

tocophérols.
La
molécule
de
ces
prénylquinones
comme
celle
des
chlorophylles,
comporte,
outre
une
chaIne
latérale isoprénique,
un
noyau
porteur
de
groupements
méthyle dont certains· (Fig. a) sont fournis principalement
par la
S-adénosylméthionine (SAM)
(ELLSWORTH et
PIERRE,
1976; CAMARA
et
al.
1982c;
GAUDILLIERE et
al.,
1984;
CAMARA, 1985b; CAMARA
et d'HARLINGUE, 1985
; d'HARLINGUE
et CAMARA, 1985). La
production de ce donneur
de méthyle
est catalysée par la méthionine adénosyltransférase (MAT).
L'accumulation de caroténoïdes et
de prénylquin~nes
est
précédée
et
accompagnée par
la
mise
en place
des
protéines enzymatiques
fonctionnelles impliquées dans leur
biogérièse.
Or,
les travaux
concernant
ces composés
ont
porté,
pour la plupart, sur leur mise en
évidence ou leur
caractérisation. Les
recherches concernant les enzymes qui
interviennent dans leur synthèse sont très limitées.
Dans
les
matériels
capables
d'accumuler
des
caroténoïdes,
la synthèse du phytoène
constitue une étape
importante
de la formation de ces
constituants. En effet,
ce
pigment
constitue
le premier
carotène en
C40
et
le
précurseur
de
tous
les
autres
caroténoïdes.
Sa
bio-
synthèse,
catalysée
par
la
phytoène
synthase,
fait
également
intervenir l'isopenténylpyrophosphate
isomérase
(IPP isomérase)
et la géranylgéranylpyrophosphate synthase
(GGPP synthase),
responsables
de
la
synthèse
d'un

4
intermédiaire ~n
C20, substrat de
la phytoène
synthase.
C'est donc sur l'étude
des enzymes de cette
séquence que
nous avons, dans un premier temps,
concentré nos efforts.
Nous
nous
sommes
ensuite
intéressés
à
la
méthionine
adénosyltransférase (MAT).
Dans
ces
recherches,
nous
avons
utilisé
essentiellement le
modèle
développé
au Laboratoire
par
CAMARA
(1981) et
constitué
par
la
transformation
des
chloroplastes en chromoplastes
au cours de
la maturation
du fruit
de
poivron.
Nous
avons également
fait
appel
ponctuellement,
pour
certains
travaux,
à
d'autres
matériels comme
des
chloroplastes (épinard, pois),
des
étioplastes (blé, maïs, orge) et des amyloplastes (pois).
L'exposé des travaux
développés sur les
deux thèmes
évoqués ci-de~sus . (étude des
enzymes impliquées dans
la
biosynthèse du
phytoène
et
dans celle
de
la SAM)
est
précédée d'un
historique
présentant
chaque
thème.
Les
résultats obtenus
ont fait
l'objet de
six articles
qui
sont insérés dans le mémoire.

SAM

.-T-,,-,I
bopenlényJ-
.PYl'ophosphale
!

~H'
SAM
1

PlaIl"'lulno...·9
CH,
H
9
géranyl -
pyrophosphate
!
farnésyl-
pyrophospllate
.---------------------------------------.- ~
SQlIaJène
!
Méthionine
géranylgéranyl-
- - .
<;aroténoïdt's
pyrophosphate
~ phytoène
A T P
phytol
pp; • Pi
li)
l \\
·
titaminl"KI
- +
tocophéro/s
chlorophy lIf's
solanésyl - If'
..---...-----.-[CN ]- ------- s À M

J

plas loquinone5
pyrophosphate
••+
solanésyl - '0
pyrophosphale
------------------------------------------ ~
ubiquÎIlone .. 10
Figure a : Schéma de biosynthèse des tf'rp~noïdes au sein de la ct"lIult"
réactions intrapJastidiaJes
........... réactions extrapJastidiaJes
réactions conduisant à la synthèse de la SAM

6
PREMIERE PAR TIE
..
Etude des enzymes intervenant dans. la
biosynthèse du phytoène.

7
HISTORIQUE
Les études
sur la
biosynthèse des caroténoïdes
ont
été largement
stimulées
par
les
travaux de
PORTER
et
LINCOLN (1950)
portant sur la
conversion du phytoène
en
1ycopène et en ~-carotène.
Les recherches menées d'une part sur
la structure du
phytoène, du phytof1uène et du
zéta-carotène (ANDERSON et
..
PORTER, 1962; PORTER et ANDERSON,
1962)
et, d'autre part,
sur
les
voies
de
formation
des
caroténoïdes
avec
utilisation
des
traceurs
(PORTER
et
ANDERSON,
1962;
ANDERSON et
PORTER,
1962), ont
permis
de proposer
une
séquence
réactionnelle
pour
la
biosynthèse
de
ces
po1yénes.
Les
études
destinées
à
établir,
d'une
manière
rigoureuse et complète,
les étapes de cette chpîne de bio-
synthèse des
caroténoïdes, ont
été conduites selon
deux
types de méthodologies
faisant appel soit à
des traceurs
radioactifs, soit à certains mutants ou
à des inhibiteurs
spécifiques.
De ces travaux,
il se dégage que deux parties peuvent
être
distinguées
dans
la
chaîne
de
biosynthèse
des
caroténoïdes :
"

8
- la biosynthèse d'un intermédiaire en C20
- la biosynthèse du phytoène, dont
le remaniement et
la désaturation séquentielle conduisent à
tous les autres
caroténoïdes.
AI BIOSYNTHESE DE L'INTERMEDIAIRE C20 (Fig. b et cl
1- Conversion de l'acétate en méva10nate (Fig. bl
L'acétate est
considéré comme
un produit de
départ
dans
la
biosynthèse
des
caroténoïdes.
Les
travaux
~
effectués
dans
ce
sens
et
utilisant
des
substrats
radioactifs
ont montré
que ces
derniers sont
conver~is
soit
en acéty1-CoA, soit en composés intermédiaires entre
l'acéty1-CoA et les carotènes.
1.1- Conversion de l'acétate en 3-hydroxy-3
méthylglutary1-CoA (HMG-CoA).
La conversion
de
l'acétate ou
de l'acétyl-CoA
en
HMG-CoA
a
été
surtout
étudiée
dans
la levure
et
le
Rhodopseudomonas
sphéroïdes (CARR,
1962). Mais la plupart
des
informations
sur la
conversion
de l'acétyl-CoA
en
HMG-CoA
ont été
fournies par
les travaux effectués
sur
les
préparations
obtenues
à
partir
du
foie de
pigeon
(BRODIE
et PORTER,
1960). Selon ces travaux,
l'HMG-CoA se
formerait selon deux voies.

9
Dans 'la
première,
il
y
a d'abord
condensation de
deux
molécules
d'acétyl-CoA
avec
formation de
l'acétoacétyl-
CoA.
Cette étape
est catalysée par une
thiolase (STEWART
et
RUDNEY,
1966). Une deuxième condensation avec une autre
molécule
d'acétyl-CoA conduit
à l'HMG-CoA
par action
de
l'HMG-CoA
synthase. La deuxième voie découverte par BRODIE
et
ses
collaborateurs
(1962,
1963)
utilise
comme
intermédiaires l'acétyl-CoA et le malonyl-CoA.
1.2- Conversion de l'HMG-CoA en mévalonate
La
conversion de l'HMG-CoA en mévalonate décrite dans
la
levure (DURR et RUDNEY,
1960), a été réalisée
in vitro
au
moyen d'un système enzymatique obtenu à
partir du foie
de
pigeon. L'étude
détaillée de
cette conversion
montre
que
la
formation
du
mévalonate
nécessite
une
transformation
stéréospécifique
dans
laquelle le
groupe
carboxyle
de l'HMG-CoA
est réduit en alcool
primaire. La
réaction
est catalysée par l'HMG-CoA réductase
et le seul
cofacteur
requis est
le NADPH.
Cette enzyme' a été
très
étudiée
ces
dernières
années
à
partir
de
matériels
biologiques
très divers. Elle a été mise
en évidence dans
certaines
fractions
subcellulaires
comme
les
mitochondries,
les plastes
ou les microsomes
(BROOKER et
RUSSELL,
1975a,
1975b,
1979;
RUSSELL et
HARVEY,
1979;
CIGHETTI
et
al.,
1981
CAMARA et
al.,
1983). Elle
a
également
été
purifiée
chez
les
animaux
et
le
gène
correspondant a été cloné (CHIN et al.,
1982a, 1982b).

10
Sa
purification a été
décrite chez les végétaux
(BACH et
al.,
1986).
2- Formation de l'isopenténylpyrophosphate (Fig.b)
,
Les
travaux
effectués
sur
la
biosynthèse
de
l'isopenténylpyrophosphate
montrent
que
le
mévalonate
radioactif
(2_ 14 C mévalonate)
est
incorporé
dans
de
nombreux
carotènes par
les cellules intactes et
par des
homogénats
de
tissus de
plantes
ou de
microorganismes;
(ANDERSON
et al.,
1960; KREZMISKI
:1.-960 ;
STEELE et GURIN,
1960; SUZUE;
La synthèse de
l'IPP débute
du
mévalonate en mévalonate
de
la
mévalonate
kinase
et
de
la
phosphomévalonate
kinase.
L'activité de la mévalonate kinase a
été mise en
évidence
dans
des
préparations
de
latex
d'hévéa
brasiliensis
(ARCHER et al.
1963;
WILLIAMSON et KEKWICK,
1965 ),
de
pois
(POLLARD
et
al.,
1966)
,et
de
pin
(VALENZUELA et al.,
1966).
La phosphomévalonate kinase a été
purifiée à partir
du
foie de rat (BAZAES et al.,
1980). Les activités de la
mélavonate
kinase et
de la phosphomévalonate
kinase ont
été
mises en
évidence dans les chromoplastes
de poivron
(CAMARA et BRANGEON,
198Ia).

11
c ..nlCOI • CIIfOSCOI
lCETYL_ COl
~
COUI
CIsCOC "tC lSeOI
acETUCETYl_Col
~'.,cosco.
coUI
cK,,_c (aKICK;OS COA
LIYDllaU, LIETHYl
1
C~CQaH
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~C/
.(HLOUYE
Il
0
t::..c"'O~
~C ~C".I.O
1S 0 PEIlTEIlYL
'UOPHOS PHATE
®®
Figure b
biosynthèse de l'isopenténylpyrophosphate à partir de l'acétyJ-CoA

12
Par
décarboxylation,
le
mévalonate pyrophosphate
donne
l'IPP
sous
l'action
de
la
mévalonate-5-pyrophosphate
décarboxylase.
Cette
enzyme
a
été purifiée
surtout
à
partir
de
foie
(BAZAES
et
al. ,
1980;
SHAMA
et
RAMASARMA,1980;
ALVEAR et al.,
1982;
JABALQUINTO et al.,
1983).
Une purification partielle a été réalisée à partir
du latex d'hévéa (SKILLETER et KEKWICK,
1971).
3- Biosynthèse du géranylqéranylpyrophosphate (Fig.C)
La
biosynthèse
du
GGPP,
précurseur
immédiat
du
..
phytoène, commence par l'isomérisation de
l'IPP et DMAPP.
Cette réaction est catalysée par l'IPP
isomérase. Mise en
évidence par
AGRANOFF et
ses collaborateurs (1960)
dans
les extraits de Rhodospirillum rubrum et
la levure, cette
enzyme a été étudiée à partir d'extraits de foie de pigeon
(HOLLOWAYet
POPJAK, 1967;
KOYAMA
et al.,
1973) et
de
fruit de courge (OGURA et al.,
1971).
Des essais
de purification de
cette enzyme ont
été
entrepris sur des extraits de fruit de tomate (SPURGEON et
al.,
1984).
La suite de la synthèse est constituée
par une série
de
réactions
de
condensation
qui
conduisent
succes-
sivement au
GPP, au
FPP et au
GGPP. Ces réactions
sont
catalysées par les prényltransférases.

13
Leur activité
a
été mise
en
évidence
dans les
divers
matériels
comme
le pois
(POLLARD
et
al.,
1966),
les
plantules de pin (VALENZUELA et al.,
1966), les plastes de
carotte (NANDI et PORTER,
1964), de
poivron (DOGBO,
1983;
DOGBO et al.,
1984; CAMARA,
1985a),
de tomate (QUENNEMET,
1984). Les prényltransférases
animales qui conduisent
au
FPP ont été purifiées
à partir de foie
(REED et RILLING,
1975;
BARNARD
et
POPJAK,
1981),
et
de
levure
(saccharomyces cerevisiae)
(EBERHARDT et RILLING,
1975) .
..
BI Biosynthèse du phytoène (Fig. c)
Le
phytoène
est
le
premier
carotène formé
et
le
précurseur de
tous les
autres caroténoïdes. Sa
synthèse
s'effectue soit
par
condensation
de deux
molécules
de
GGPP, soit à
partir du préphytoène (CAMARA,
1984; CAMARA
et al.,
1985). Sa
synthèse peut être également
obtenue à
partir du
mévalonate (GRAEBE,
1968;
CAMARA,
1980) ou
de
l'isopenténylpyrophosphate (CAMARA et al.,
1980; CAMARA et
,
-
al.,
1982a; LÜTKE - BRINKHAUS et al.,
1982).
Un
important
travail retraçant
cette
voie de
bio-
synthèse
qui
conduit
de
l'acétate
à
l'ensemble
des
caroténoïdes a été effectué sur le poivron (CAMARA,
1981).
L'ensemble
des
données
présentées ci-dessus
montre
que
les études
(mise
en
évidence,
caractérisation
et
régulation des enzymes) entreprises dans le domaine de la

14
biosynthèse
des
pigments
et
en
particulier
celles
réalisées sur les caroténoïdes
restent fragmentaires. Ces
différents points ont été abordés dans le chapitre 1.

15
GPP
~IPP

~"t-a~
.FPP
~IPP
..

.GGPP
C
PREPHYTOENE
40
PYROPHOSPHATE
PHYTOE NE
C40
Figure c
Biosynthèse du phytoène à partir de J'isopentényJpyrophosphate. La réaction 1 est
catalysée par l'isopentényJpyrophosphate isomérase; les réactions 2, 3 et 4 sont
catalysées par la GGPP synthase; les réactions 5 et 6 sont catalysées par la
phytoène synthase.
DM,I\\PP : diméthylalJylpyrophosphate
FPP
: farnésylpyrophosphate
GPP
: géranylpyrophosphate
GGPP
: géranylgéranylpyrophosphate
IPP
: isopenténylpyrophosphate

16
CHAPITRE 1
BIOSYNTHESE DU PHYTOENE PAR LES PLANTES SUPERIEURES
MISE EN EVIDENCE DE L'ACTIVITE PHYTOENE SYNTHASE,
SITE DE BIOSYNTHESE DE L'ENZYME ET REGULATION.
1 - Biosynthesis of phytoene in plastid stroma
iso1ated from higher plants.
Plant Science
(1987),
49,
89-101
2 - Regulation of phytoene synthesis in p1astid
stroma iso1ated from higher plants. Plant
science (1987),
49,
103-109

Plant Science, 49 (1987) 89-101
art icle 1
89
Elsevier SCientific Publishers Ireland Ud.
METABOLISM OF PLASTID TERPENOIDS. I. BIOSYNTHESIS OF PHYTOENE IN PLASTID
STROMA ISOLATED FROM HIGHER PLANTS
ODE'ITE DOOBO·, FRANCOISE BARDA~ ANDRE LAFERRIERE·, JOELLE QUENNEME-r-,
JUDY BRANOEONb and BILAL CAMARA·'-
·Laboratoire de Biochimie du Développement Végétal, E«uipe de l'UA CNRS 1180, Université Pierre et Marie
Curie (ParÎI VI), 4 Place JUBBïeu 76252 ParÎI C4dex 05
Laboratoire de Structure et Métabolisme des Plantes
Bat. 490, 91406 Orsay (France)
(Received AUKUBt 27th, 1986)
(Revision received November 29th, 1986)
(Accepted December 8th, 1986)
Usine prephytoene pyrophosphate and iBopentenyl pyrophosphate as substrates, the synthesis of phytoene
was demonstrated for the first time in chloroplasts, etioplasts and amyloplasts. The stromal fraction was the
sole site of phytoene synthesis. These data were complemented by the fact that the enzymatic activity in each
plastid stroma was proeressively lœt after immunoprecipitation with an antiserum directed against Capsicum
chromoplast phytoene synthetase enzyme complex.
Key words: plastids; stroma; terpenoids; carotenes; phytoene biosynthesis
Introduction
derived from chromoplasts to pt!rform this
synthesis has not been demonstrated. Indeed.
The stroma is a permanent entity of
under
conditions
used
for
chromoplast
plastids
and houses the basic machinery
phytoene
synthesis,
we
were
ur;table
to
involved in carbon dioxide fixation: In the
demonstrate significant syn~esis of phyto-
chromoplast types which actively synthesize
ene by Capsicum chloroplasts (B. Camara
carotenoids
[ 1-3] ,
phytoene,
the
first
et al., unpublished results). Thus. a com-
c.,o carotenoid, is synthesized from iso-
plete pattern of phytoene synthesis in vitro
pentenyl pyrophosphate by a soluble stromal
in plastids at different stages' of differenti-
complex (phytoene synthetase) through a
ation remains to be established.
series
of
reactions
involving:
isopentenyl
In this study, we show through the use
pyrophosphate
isomerase,
geranylgeranyl
of prephytoene pyrophosphate [7] or iso-
pyrophosphate
synthetase,
geranylgeranyl
pentenyl pyrophosphate and suitable mani-
pyrophosphate-geranylgeranyl transferase and
pulations of the incubation conditions. that
phytoene synthase [4,5]. Though phytoene
phytoene is synthesized by a stromal soluble
synthetase associated with spinach chloroplast
complex devoid of any plastid membranes,
envelopes has been demonstrated [6], the
in amyloplasts, - etioplasts, chloroplasts and
capacity for plastid stroma other than those
chromoplasts isolated from different plant
materials. A second approach to this demon-
-To whom correspondence shol.'.ld he sent.
stration involves the use of antibodies pre-
Abbreviations:
AMO,
2' -isopropyl-4' -(trimethylam-
pared
from
phytoene synthetase enzyme
monium chloride)-5' -methylphenyl piperidine-1-<:ar·
boxylate; DTT, dithiothreitol; HPLC, hiih perform-
components purified from Capsicum chromo-
ance liquid chromatography; IPP, isopentenyl pyro-
plasts, to precipitate the phytoene synthetase
phosphate.
enzyme complex.
0618-9452/87/$03.50
© 1987 Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd.
Printed and Published in Ireland

90
Materials and methods
pared
and visualized for electron micro-
scopy as described previously [19].
Plant
materials. . Normal
mature green,
Radioactive su bstrates. [1-14C]Isopentenyl
orange and a yellow mutant of Capsicum
pyrophosphate (48 mCi/mmol) was purchased
annuum fruits (var. Yolo Wonder) were used.
from Amersham. [1-3H]Geranygeranyl pyro- '
Pisum sativum (var. Petit Provencal) seed-
phosphate (20 mCi/mmol) was prepare<! as
linga were grown at 25°C with an ll·h day
described
previously
[20,21].
[3H]Pre·
length for 9 days. SpinacÛJ olerocea L. was
phytoene pyrophosphate was prepare<! as
obtained from
a local market. Hordeum
described below.
vulgare
(INRA
var.
Béatrice),
Triticum
Triethylphosphonoacetate (10 g) was added
aestivum (var. Florence Aurore), Zea mays
10 a freshly prepared solution of ethanolic
(INRA 508 from La Française de Maïs) were
sodium ethoxide (1 g sodium metal and
germinated at 25°C in the dark for 9 days.
20 ml ethanol); trons.famesylacetone (6 g),
Plastids and plastid 8ub(ractions isolation.
prepared and purified as described previously
Chromoplasts from orange and yellow C.
[22], was added slowly over a period of
annuum
fruits
were isolated as reported
30 min. The contents were stirred overnight
previously
[8] . Chloroplasts were isolated
under nitrogen. The organic layer wu ex·
from C. annuum fruits, P. sativum, and S.
tracted with ether, the extract was concen-
oleracea. A first pellet obtained as described
trated by evaporation and purified by column
[9,10], was purified on a sucrose step gradi-
chromatography on silica gel eluted by a
ent [10] or a pereoll gradient lU]. With
gradient of benzene/petroleum ether (60-
either method,
the results obtained after
40°C) (0-100%). The resulting trans-geranyl·
incubation with radioactive precursors were
geranoate (1.8 g) in 20 ml of ether was
similar. Etioplasts were isolated and purified
slowly
treated
with
lithium
aluminium
from Z. mays, H. vulgare, T. aestivum, accord-
hydride (600 mg) at O°C. --rhe mixture was
ing 10 the procedure described by Leech and
extracted with ether and washed with water.
Leese [12]. Amyloplasts were isolated and
The
trans-geranylgeraniol was isolated
by
purified from etiolated epicotyls of P. sativum
column chromatography eluted with ben-
by the method of Gaynor and Galston [13].
zene/ethylacetate (80: 20). The infrared spec-
Plastid stroma preparations were isolated by
trum showed peaks at: 3320, '.1635, 1450,
osmotic shock [4]. Plastid envelope mem-
1005, 970 cm -1 comparable 10 those reported
branes were prepared by the freeze-thaw
in the literature [23]. Trans-geranylgeraniol
method
[14] . Prolamellar bodies + pro-
(500 mg) was treated with a 6-fold excess of
thylakoids were prepared according to the
activated manganese dioxide [24,25] to yield
method
of Sandelius and Selstam [15].
trans-geranylgeranial (450 mg). The latter
Before
each
incubation,
the
membrane
was converted to trans-geranylgeranial hy-
fractions were repelleted by centrifugation at
drazone
[26,27],
After evaporation,
and'
100 000 X g for 1 h. The working tem·
treatment with an excess of activated man-
perature was 4°C.
ganese dioxide, the trans-diazo-geranylgeranial
The biochemical purity of the different
was obtained. The infrared spectrum showed
plastids
was assayed by determining the
peaks at: 2965, 2925, 2850, 2065, 1645,
activity of the following enzymes involved
1385 cm -1. The diazo compound was dis-
in carbohydrate metabolism: sucrose synthase
solved in ether' and added under nitrogen
EC 2.4.1.13 [16], starch synthase EC 2.4.1.21
ta a chilled solution containing zinc iodide
[17],
ADP-glucose
pyrophosphorylase
(400 mg) and trans-geranylgeraniol (400 mg)
EC 2.7.7.27 [18] and UDP-glucose pyrophos-
in ether. The end of the reaction was moni·
phorylase EC 2.7.7.9 [18]. As an additional
tared by the disappearance of the orange
test, some of the isolated plastids were pre-
ta red diazo derivative. Mter evaporation,

91
prephytoene alcohol was separated by chro-
system (/JBondapak Cu) using Methanol!
matography on silica gel plate developed
cychohexane/bexane (80: 10: 10, v/v) as the
with carbon tetrachloride/ether (85: 15, v/v)
solvent.
and on Florisil column eluted with petroleum
Immunoprecipitation
of phytoene syn-
ether
(40---60°C)/ether
(97: 3,
v/v)
[27].
thetase actlvity. To mixture (200 /Jg) of
The resulting pure alcohol (50 mg) showed
separately
purified
phytoene 'synthetase
M = mIe 542 and the infrared spectrum
enzyme components (isopentenyl pyrophos-
showed peaks at 3360, 2970, 2926, 2850,
phate isomerase, geranylgeranyl pyrophos-
1655, 1450, 1380, 1376, 1116, 1045, 835
phate synthetase, geranylgeranyl pyrophos-
cm-l •
phate-geranylgeranyl transferase and phyto-
The prephytoene alcohol was treated with
eue
synthase)
purified
from
Capsicum
a 6-fold excess of active manganese dioxide
chromoplasts [30 and manuscript in prepare
in petroleum ether at O°C under nitrogen.
ation] was added an equal volume of com-
After filtration, the aldehyde was dissolved
plete
Freund 's
adjuvant.
After
vigorous
in ether and reduced with lithium aluminium
mixing,
the
emulsion
was
injected
into
[lH]hydride (180 mCi/mmol) obtained from
2 rabbits. This process was repeated 3 weeks
NEN. The reaction waa stopped by the addi-
later without addition of adjuvant, then
tion of saturated aqueous solution of ammo-
weakly for 2 weeks after which blood was
nium chloride. The ether extract was chro-
withdrawn by cardiac puncture. The isolation
matographed on a DEAE-8ephadex LH 20
and quantification of the immunoglobulins
(formate column)
prepared according
to
G were done according to the procedures
Peterson and Sober [28J and eluted with
previously described [31,32 J.
chloroform.
Prephytoene
pyrophosphate
Radioactivity
incorporation
was
deter-
(25% yield) was prepared using the pro-
mined by liquid scintillation counting. Protein
cedure previously described for prenyl pyro-
content was determined accofOing to the
phosphates [21]. The specific radioactivity
procedure of Bradford [33].
of prephytoene (12 Ci/mol) was based on
phosphate determination [29].
Results and discussion
Assays and analy.i. of product.. Unless
specified otherwise, the incubation medium
Ultrastructural and biochemical characteristic~
contained in a final volume of 1 ml: 2 mM
of isolated plastids
MgCl"
1 mM MnCl
The work was primarily carried out with
2 •
5 mM dithiothreitol
(DTT). 1 mM ATP, 0.2 M sorbitol, 50 mM
Capsicum
fruit
plastids (chloroplasts and
Tris-HCl (pH 7.6), 400 /Jg of Tween-80,
chromoplasts), as a preliminary to generalize
[1· l4C]isopentenyl
pyrophosphate,
[1-3H]-
the results to other types of plastids. These
geranylgeranyl
pyrophosphate or [lH]pre-
plastids were isol,.ted according to the de-
phytoene
pyrophosphate
and
a
definite
scribed procedure are shown in Fig. 1. In
amount of proteins as indicated in the result
both the chloroplast (Fig. lA) and chromo-
section. The reactions were carried out at
pIast (Fig. lB) preparations, one can note
25°C for various times, (chromoplast prepar-
that the photographic fields are devoid of
ations from orange C. annuum were used,
contamination by other cellular organelles
unless otherwise stated in the text). The
or membrane debris. An estimated 90% of
reactions were terminated and the products
the chloroplasts are intact (Fig. lA) as shown
analyzed as described before [21], without
by the well-developed granal-intergranal net-
acid
hydrolysis.
Altematively,
the
lipid
work. the dense stroma and the double
extract containing prenoIs and hydrocarbons
membranes
of
the
chloroplast
envelope
was analyzed by high performance liquid
(Fig. 2A). The preparation in Fig. lB con·
chromatography (HPLC) on a reverse phase
sists entirely of intact chromoplasts; the

92
a.:
.....
°·4
..' ~ "'
'j..
Fig. 1.
Preparations of isolated intact chloroplasts from green fruits (A) and intact chromoplasts from mature
(orange) fruits (B) of C. annuum. Bar represents 1 l'm.

93
A
\\
."
'.
~.~
~'.:;'~
_.
,~.
.Sp
. .
- ,-",",~.
,.
,
.--
:,~."...
.
.
~.
_ .
.
. . .
...~ l'
B·'
i
..
li .S.u
~~...:.....'""lIII!--..'....ï
_ i
l'lg. 2.
Detail of an isolated chloroplast (A) showing double envelope membranes (arrows), developed granal·
intergranal network and dense stroma and an isolated intact chromoplast (B) whoSe internai membrane system
consists of a reticulum (R) and extended lamellae (L); the nUmerous invai1inations of the inner envelope mem·
brane (arrows) are characteristic of these chromoplasts.

94
Table I.
Distribution of marker enzymes in the different plastid preparations. Activity distribution (%) was
calculated as follows: (activity in intact plastids'activity in the total soluble homoienate) X100.
Plastids
Activity distribution %
Sucrose
Starch
ADP-Glucose
UDP-Glucose
synthase
synthase
pyrophos-
pyrophos-
phorylase
pborylaae
C. annuum
chloropwts
0.5
33
30
0.2
chromoplasts
0.7
25
24
0.3
P.•atillum
chloroplasts
0.2
32
38
0.1
amyloplasta
0.5
15
16
0.6
Z. may.
etloplasts
0.6
18
20
0.4
H.llulgore
etioplasts
0.3
20
17
0.5
T. ae.tillum
etioplasta
0.7
15
16
0.4
detailed
ultrastructure
of a chromoplast
network penetrating into the stroma (arrows,
(Fig. 2B) is comparable to that observed
inset Fig. 2B), increasing considerably the
in situ [19]. The internai membrane struc-
surface
contact
between the
membranes
tures consist of a reticulum-like network
and the surrounding stroma.
(arrow) apparently contiguous with a more
From a biochemical point of view, starch
extended lamellar system as weil as inter-
synthase and ADP-glucose pyrophosphorylase
spersed lipid globules and proteolipid fibrilli.
which are plastid enzymes [34] have the same
The inner envelope ~mbrane shows numer-
distribution (Table 1). On the other band
ous invaginations which form a perforated
cytoplasmic contaminations
are
negligible
Table Il.
Carotene synthesis from prephytoene pyrophosphate by isolated plastids. Purified plastids were
rapidly diarupted by osmotic ahock and incubatedas described under Materia1s and methods. Each assay contain-
ed 2 mi of proteins and 2 IoICi of prephytoene pyrophosphate. Incubation wu for 90 min. ')he totallipid devoid
of prephytoene alcohol was used for analysis.
Plastids
Incorporation
Product distribution (%)
(nmol)
Phytoene
PhytoOuene
roCarotene
aoCarotene
/loCaroœne
C. annuum
chloroplasts
0.75
75
6
16
2
2
oranie chromoplasts
0.86
41
34
23
0.6
1.4
yellow chromoplasts
0.82
46
20.6
31
1.1
1.3
P. IGtillum
chloroplasts
0.29
68
14
17
0.3
0.7
amyloplasts
0.40
73
9
17
0.2
0.8
Z. may.
etioplasts
0.49
68
6
25
0.1
0.9
H.llulgare
etioplasts
0.63
62
7.5
29
0.5
1
T. autivum
etioplasts
0.56
66
7
26
0.3
0.7

95
in the different plastid preparations (Table
(Fig. 3). In the presence of the different
1) as shown by the very low activity of
membrane systems, we noted only a partiaI
sucrose
synthase,
and
UDP-glucose pyro-
cleavage of the pyrophosphate group, without
phosphorylase.
a concomitant· synthesis of phytoene. This
phenomenon was particularly evident for
Conversion of prephytoene pyrophosphate
the envelope membranes (Fig. 3). On the
into carotenoids
other hand, when the system was recon-
Ruptured isolated plastids (chromoplasts,
stituted, Le. when the stroma was reassoci-
chloropluts, etiopluts and amyloplasta) in-
corporated prephytoene pyroph08phate into
carotenes at a significant level (Table II).
chromoplasts
Phytoene
appears
as
the
major product
84
N
followed by phytofluene, t- Q- and {j-caro-
o
tenes. To examine the possibility of artifact
'; 56
....
formation, control experimenta were run in
o
parallel
with
boiled
plutid preparations
~28
or in the buffered medium aIone. No labelled
o
carotene was detected in the latter cases.
wOj.e=------'L.-_---.Jl~_---"----'----"'-
The reaction required the presence of
ti
chloroplasts
B e __ e_e
divaIent cations (MgC12 and MnCI
~36
2) as shown
a:
by the 95% inhibition noted after addition of
/
_ _ 0 - 0
~ e
818
o
6 mM EDTA. However, at higher concen-
~
.:::::::-- 0
,
trations of divaIent cations (10 mM), a 36%
o
inhibition was noted. The addition of chloro-
phyllides (a + b) to the incubation medium
did not depress the radioactivity incorporated
into carotenes. Thus, compared to the situ-
ation previously observed with isopentenyl
pyrophosphate
(IPP)
[20], when chloro-
w
phyllide esterification is by-passed, carotene
Z
amyloplasts
0
e - - -
synthesis occurs in isolated chlorophyllous
~"'36
plastids. Therefore the inability of higher
.----
plant plastids other than chromoplasts to
l
w
e-----
incorporate C. to C
Œ18
20 prenyl pyrophosphates
. /
into carotenoids is not due to the absence
Ol<::..._---.Jl~_----"'- _ _~---"------..Io.....J
or
inactivation
of
phytoene
synthetase
o
10
20
30
40
60
or other enzymes involved in the pathway
Time (mini
to /3-carotene.
Fig. 3.
Phytoene synthesis from prephytoene pyro-
phosphate
by
different
plastid
subfractions.
Subplastidial site of conversion of prephyto-
(A) Cop,icum chromoplast stroma (rom oranie (e)
and yeUow (0) (ruits and total chromoplut mem-
ene pyrophosphate into phytoene
branes from oranee fruits (... ) were uled. (B) Cap-
In order to locaIize this enzymatic activity,
,icum
chloroplut stroma
(e).
Pilum chloroplast
isolated plastid subfractions (stroma, pro·
stroma (0) and envelope membranes (... ) were used.
thylakoids + prolamellar bodies, thylakoids,
(C) Etioplast stroma from Hordeum (e). Triticum
a-chlorophyll lamellae, chloroplast envelope
(o),
Zeo (e) and total etioplast membranes (rom
Hordeum
(... ) were used.
(D) Pilum
amyloplast
membranes, inner and outer envelope mem·
stroma (e) and total membranes (... ) were used.
branes) were prepared and tested for activity.
Each aasay contai ni ne 1 pCi o( prephytoene pyro-
Only the stroma was capable of converting
phosphate and 1 mi of proteins except for envelope
prephytoene pyrophosphate into phytoene
membranes (400 Pi).

96
ated with the membrane fraction, the syn-
Conversion
of isopentenyl pyrophosphate
thesized
phytoene
was
desaturated
and
to phytoene
cyclized
(Table
III),
in
good agreement
The experiments described above under-
with the integral nature of the desaturases
line the pivotai role played by plastid stroma
and cyclases involved in carotene biosyn.
for the synthesis of phytoene from pre-
thesis. ft is worth noting that the extent
phytoene pyrophosphate. However, up to
of conversion is probably lowered by the
now, it was impossible to demonstrate phyto-
presence
of
phosphatases
or
unspecific
ene synthesis from isopentenyl pyrophos-
prenyl
pyrophosphate
hydrolases
in
the
phate, using plastids other than chromoplasts.
membrane fraction. Using isopentenyl pyro-
To do titis, purified chloroplasts (trom C.
phosphate, it has been shown that phytoene
annuum, P. sativum , S. oleraceae), etioplasts
synthetase is a soluble enzyme localized
(from
T.
aestivum, H. vulgare, Z. maYB)
in chromoplast stroma [4,5]. Here we demon-
and amyloplasts (trom etiolated epicotyls
strate that this is also valid for other types of
of P. sativum) were subjected to a gentle
plastid stroma incubated with prephytoene
osmotic shock followed by a centrifugation
pyrophosphate. The presence of phytoene
at 100 000 X g for 1 h. At completion, the
synthetase in chloroplast envelope membranes
supematant (stroma) was immediately used
[6]
would require the involvement of an
and incubated in the presence of the standard
additional
mechanism
for
the
transport
medium
described
under
Materials
and
of carotenoids
to
the
thylakoids
where
methods.
At the end of the incubation
they are organized in the different photo-
period, carrier amounts of phytoene, geranyl-
systems.
On
the
other
hand,
stroma!
linalool, geranylgeraniol were added before
phytoene synthetase' working at the peri-
the
extraction with chloroform/methanol.
phery of thylakoid membranes could easily
The lipid extract was subjected ta high
discharge at the destined site phytoene for
performance liquid chroma~phy as shown
further reactions.
in Fig. 4. The position of the standards,
Table III.
Carotene synthesis in reconstituted plastid system (stroma + membranes). In each case 1 mg of
stroma! proteins and 1, mg of membrane proteins were used. The incubation was as in Table II.
Fractions
Incorporation
Product distribution ('Il)
(nmol)
Phytoene
Unsaturated carotenesa
C. annuum
chloroplast stroma
0.85
100
0
chloroplast stroma + thylakoids
0.42
81
19
chloroplast stroma + envelopeb
0.35
100
0
chromopIast stroma
0.92
100
0
chromoplast stroma + membranesc
1.01
60
40
P. satillum
chloroplast stroma
0.35
100
0
ch1oroplast stroma + thylakoids
0.28
77
23
Chloroplast stroma + envelopeb
0.22
100
0
H. lIulgare
etioplast stroma
0.61
100
0
etioplast stroma + membranesd
0.52
70
30
a These inc1ude: phytoOuene. t-carotene. a-carotene. Il-carotene.
b Inner and outer membranes were used.
C A-chlorophylllamella were used.
d Prothylakoids and prolamellar bodies were used.

97
clearly shown since unconjugated carbon-
homologous terpene series, but runs like a
to-carbon double bonds absorb in this zone
chromanol on thin layer chromatography
[35], allowed the detection of radioactivity
on silica gel G developed with benzene/
in
the
fractions
containing
phytoene,
ethyl acetate (90: 10, v/v) (Rf: O.SO quite
geranylinalool + geranylgeraniol (not sepa-
different hom that of prephytoene alcohol
rated in this system) and an unidentified
in the same system Rf: 0.5S) and after HPLC
prenyl compound (X, mainly detected. in
using methanol/tetrahydrofuran (90: 10, v/v).
incubations using chromoplast stroma). The
Furthermore, when eluted and used as a
distribution of radioactivity was not changed
substrate for phytoene synthesis, it remained
changed after saponification of the lipid
untransformed. Its formation was not înhi-
extract.
bited by 2' -isopropyl-4' -(trlmethylammonium
Further analysis of the prenyl derivative
chloride)-5'-methylphenyl piperidine-1-carbo-
X showed that it does not belong to the
xylate (AMO) a known inhibitor of geranyl-
geranyl pyrophosphate cyclization to kaurene.
Detailed
examination
of
the
fraction
B
coincident with phytoene was further carried
ln
...
out by chromatography on silica gel plates
N
developed with petroleum ether, after addi-
D
ci
o
tion of unlabelled squalene and kaurene. This
step confirmed that the label was exclusively
A
present in phytoene. The recovered phytoene
H
was subjected to reverse phase chromato-
graphy using the system of Suzue. et al.
[36].
Here
again,
the
radioactivity
was
detected only in phytoene." Therefore, a
c
possible contamination by dehydrosqualene
F
G
which has a polarity close ta that of phytoene
E
can be ruled out. As an additional test, the
purified phytoene was chromatographed on
o
AgNO) impregnated silica gel plates using
the solvent system (petroleum ether/ethyI
o
acetate/di-isopropyl ether (2: 1: l, v/v). The
radioactivity present in phytoene migrated
Fig. 4.
HPLC of the lipid extract obtained after
as the cis isomer previously characterized
incubation
of
Capsicum
chromoplast stroma in
[37].
the presence of IPP. After incubation (3 h), un-
labelled standards (A, farnesol; B, geranylgeraniol +
The time course of the reaction is, shown
geranyllinaJool; C, phytol; D, cr -tocopherol; E, phyllo-
in Table IV. The extent of' incorporation
quinone; F, solanesol; G, cis + trans-phytofluenes;
of isopentenyl pyrophosphate into phytoene
H, cis + tral18-phytoenes) were added to the lipid
is
higher
in
non-photosynthetic
plastids.
extract. The latter was filtered through a Sep Pak,
In the case of chloroplasts, incubation wi th
silica cartridge (Waters) eluted with diethyl ether.
At completion, traces of prenyl phosphates or pyra-
high stromal protein content (above 4 mg/ml)
phosphates remained adsorbed
while Cree prenois
inhibited the synthesis of phytoene. The
and hydrocarbons were eluted. This fraction wu
exact reason for this effect is under investi-
concentrated to dryness and used for HPLC. The
gation. The composition of the reaction
operating conditions were: Cil IlBondapak column,
mixture was adopted after several atte~pts
methanol/cyclohexane/hexane
(80 :10: 10, v/v)
as
mobile phase, flow rate (1 ml/min), detection at
ta manipulate the reaction conditions. The
A,u nm' The different fractions were monitored for
ratio between MgC1 2 and MnCI2 , the presence
radioactivity by Iiquid scintillation counting.
of ATP, DTT, and Tween-SO were necessary

98
Table IV.
Phytoene synthesis from isopentenyl pyrophosphate by different plastid stromas. Purified plastids
were processed as described in Table II, except that 0.18 IlCi of isopentenyl pyrophosphate and 2.5 mg of pro-
teins were used for incubation.
Piast id stroma
Product incorporation (nrnol)'
Incubation time (min)
30
60
120
180
C. annuum
chloroplasts
0.10
0.21
0.47
0.62
orange chromoplasts
0.29
0.97
2.08
2.63
yellow chromoplasts
0.31
0.88
1.90
2.30
P. satiuum
chloroplasts
0.03
0.07
0.17
0.21
amyloplasts
0.08
0.18
0.55
0.75
Z. may.
etioplasts
0.16
0.32
0.72
0.97
H. uulgare
etioplasts
0.30
0.47
0.87
1.13
for optimal synthesis of phytoene, especially
in chloroplasts. For chloroplasts, etioplasts
and
amyloplasts
a
pre-treatment
of
the
stromal proteins with 5 mM EDTA before
incubation in the presence of 8 mM MgCl 2 ,
4 mM MnC1
and the other cofactors given in
2
the Materials and methods section, resulted
in a 25% stimulation of phytoene synthesis.
Additional support for the presence of
phytoene synthetase in the stromal fraction
of plastids at different stages of differenti-
ation was shown after immunoprecipitation
of the phytoene synthetase activity present
in amyloplasts, etioplasts and chloroplasts.
Antibodies raised against phytoene synthetase
from Capsicum chromoplasts reacted posi-
Fig. 5.
Ouchterlony double immunodiffusion ana-
Iysis of phytoene synthetal;e. The gel
plate .... as
tively
with the preparation derived from
prepared with
1% aiarose in phosphate buffered
Capsicum chloroplast stroma as shown by
saline (0.02 M phosphate buffer pH 7 + 0.9% NaCI)
the Ouchterlony immunodiffusion plate (Fig.
containing 0.5%
Triton
X-IOO and
0.02% Na.,",.
5). On the other hand, when Triton X·I00
In the centre weIl 20 III of rabbit antiserum a~inst
phytoene synthetase enzyme complex were plac-ed.
solubilized
membranes
from
Capsicum
In wells 1 and 2, Capsicum chromoplast and chlo:o-
chromoplasts or chloroplasts were put in the
pIast stroma enriched in phytoene synthetase actinty
outer well, no precipitin bands were formed.
by
polyethylene
glycol
6000
precipitation
Uld
As shown in Fig. 6, the antibodies progress-
catalyzing the incorporation of 0.05 pmol/s of IPP
ively precipitated the phytoene synthetase
were plac:ed respectively. In well 3 and 4, 100 l'~ of
Capsicum chromoplast and chloroplast total mem-
activity
from
amyloplast,
etioplast
and
branes solubilized with 0.5%
'D'iton X-IOO,
ere
chloroplast stroma. ln each case, the capacity
placed
respectively.
The
precipitin
reaction
as
of the stroma 10 synthesize geranylgeraniol
carried out for 48 h in a closed vesse!.

99
chromopIast stroma of C. annuum is shown
100
._---.----/~-----.
in Fig. 7. No enzymic activity was detected
Control
in the region of antibody excess. The equiv.
i

t~
alence points were identical. This indicates
that there is a constant immunoprecipitable
enzyme per unit of activity in the stroma1
preparation.
Therefore,
the
difference
in
actîvity reflects difference in enzyme content,
not
in
catalytic
properties,
presence
of
.
activaton
and
inhibiton.
Therefore
the
difference in activity between chloroplast
and chromoplast stroma is due to the syn·
o ~;;;~2:====:===~
100
200
thesis of antigenically identical or nearly
Antiserum lIdded (JIll
identical molecules during the düferentiation
Ft.. 6. Immunoprecipitation of plastid stroma
process.
phytoene synthetese. Stromal proteina (4 mg) from
It is weil known that during plant develop-
Cop.icum
chromoplasts (e) and chloroplasts (.),
ment, the physica1 state (soluble or membrane
Pisum
chloroplasts
(0)
and
Hordeum
etioplasta
(0) were incubated with the indlcated amountli of
bound) of an enzyme can be subject to
antiserum
againat
phytoene
synthetase
enzyme
change [38]. The data presented here show
complex at ao°c for 1 h in 50 mM TRis-HCl pH 7.6.
for the first time that, in spite of the ultra-
The total volume wa. adjuated to 1 ml with the
structural and biochemical changes which
same buffer. The mixture was left at 4°C overnight.
occur during plastid düferentiation, phyto-
After addition of 10 mg of protein A-Seph&r08e,
ene synthetase remains a soluble stroma!
the precipitate was collected alter centrifugation
(Eppendorf microfuge) and the supernatant fluids
enzyme.
were used for phytoene .ynthetase assays as described
The metabolic compartmentltion of early
under Materials and methoda. 0.5 ,.Ci of IPP wa.
reactions
of carotenoid
synthesis in the
uaed.
stroma is very similar to that described
for the intraplastidia! site of protoporphyrin
pyrophosphate
and
phytoene
were
both
synthesis,
which
has been
demonstrated
affected. In addition, the quantitative pre-
by reconstitution experiments (re-association
cipitin reactions with the chloroplast and
of plastid membranes and stroma! fraction)
1
,
.-.-.
.-

.-
1:
.
.-
/
"iii
1
..
100
. /
o
~Q.
0 01
. /
:eE
..-1: o.s
al CI
,"
/
50l
I:~

>
..
CI "a
01.-
1
.>
.~
"- U
"Cl
1: ...
<
<Cl.
O
Ol(""l...._
.....---l_-O::::""--~------:'""=------::::'":""
o
0.1
0.2
0.3
O.•
Stromal enzyme added (activity in pmol/. 1
Fig. 7.
Quantitative precipitin reaction of phytoene synthetase from Cop.icum chromoplast and chloroplast
stroma. To 150,.1 of antiserum agalll8t phytoene synth('tase enzyme complex were added chromoplast (e) end
chloroplast (c) stroma equivalent to the amounts of enzyme indicated. Precipitation procedures were as described
in Fig. 6. 'The resulting supernatant was used for assays.

100
[39] and for the synthesis of kaurene by
9 H.Y. Nakatani and J. Barber, Biochim. Biophys.
plastid stroma [40].
Acta, 461 (1977) 510.
Finally, from the results presented above,
10 O. Doebo, B. Camara and R. Moneger, C.R.
Acad. Sci. (Paria) Ser.III, 295 (1982) 477.
the following generalizations can he drawn.
11 R. Hau, H.P. Siebertz,K. Wraee and E. Heinz,
Firstly. the synthesis of phytoene, the first
Planta, 148 (1980) 238.
.
C40 carotenoid. is not specific to chromo-
12 R.M. Leech and B.M. Leeae, Isolation of etio-
pIast
stroma.
Under suitable
conditions:
plasts from maize, ln: M. Edelman, R.B. HalUck
balance between MgCI, and MnCI"
pres-
and N.H. Chua (Eda.), Methoda in Chloroplut
Molecular
BioloiY, Elsevier
Biomedical Press,
ence of ATP and Tween-SO,· phytoene is
Amsterdam, 1982, p. 221.
synthesized
in
amyloplast,
etioplast
and
13 J.J. Gaynor and A.W. Galston, Plant Cell Physiol..
chloroplast stroma. Secondly. for this syn-
24 (1983) 411.
thesis. the presence of plastid membranes
14 K. Cline, J. Andrews, B. Mersey, E.H. Newcomb
(envelope, thylakoids or a-chlorophyll lam-
and K. Keeptra, Proc. Nat!. Acad. Sci. U.S.A.,
ellae) is not primarily required.
78 (1981) 3595.
15 A.S. Sandeliua and E. Selstam, Plant Phyaiol.,
76 (1984) 1041.
16 P.S. Chourey, Mol. Gen. Genet., 184 (1981)
Acknowledgements
372.
17 J.S. Hawker, J.L. Ozbun and J. Preiss. Phyto·
chemistry,l1 (1982) 1287.
18 L. Shen and J. Preiss, Biochem. Biophys. Res.
We wish te thank Dr. M. Dieng for his
Commun., 17 (1964) 424.
help and characterization of prephytoene
19 B. Camara and J. Braneeon, Planta, 151 (1981)
alcohol and Professor Dr. G.B. Brubacher,
359.
Ors. H.R. Fricker and Y. Fujita for kind
20 O. Doebo, F. Bardat and B. Camara, Physiol.
Vee., 22 (1984) 75.
'
gifts of authentic chemicals. We thank the
21 B. Camara, Methods Enzymol., 11 0 (1985) 244.
P.J. Foundation for a grant te O. Oogbo.
22 O. Isler, R. Rueff, L.H. Cho~ard-dit.Jean and
A. Winterstein, Helv. Chim. Acta, 41 (1958) 786.
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303.


Plant Science, 49 (1987) 103-109
article 2
103
Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd.
METABOLISM OF PLASTID TERPENOIDS. Il. REGULATION OF PHYTOENE SYNTHESIS
IN PLASTID STROMA ISOLATED FROM HIGHER PLANTS
ODET!'E DOGBO and BILAL CAMARA·
Laboratoire de Biochimie du D~ueloppement V~,~tal, Equipe de "UA CNRS 1180, UniuersiM Pierre et Marie
Curie (Paril VI), 4 P14ce JUB8ieu 75252 Paril Cédex 06 (Frunce)
"(Received August 27th, 1986)
(Revision received November 29th, 1986)
(Accepted December 8th, 1986)
In plastid stroma the synthesis oC phytoene" was regulated by several Cactora, (i) MgCl: or MnCl l alone and the
combination oC both oriented selectively the incorporation oC isopentenyl pyrophosphate (IPP) between phyto-
ene and other isoprenoids including geranylgeraniol, geranyllinalool, and solanesol (ii) neutral detergents (Tween-
80, Triton X-100), polyethyleneglycol and diga1actosyldiglyceride liposomes stimulated the incorporation oC IPP
into phytoene (iii) ATP or diCCerent glycolytic intermediates enhanced the synthesis oC phytoene Crom IPP.
Key word.: plastids; stroma; terpenoids; carotenes; phytoene biosynthesis; regulation
Introduction
showing that phytoene synthesis in plastid
stroma is regulated at three levels: (1) bY the
In higher plants, the plastid compartment
presence of detergent and relabed molecules
is the site of synthesis of specifie prenyllipids.
(2) by the balance between Mn2 + and Mg2+
These include homogeneous isoprenoid com-
in the stroma (3) by the availability of ATP.
pounds (carotenoids, kaurene) and mixed iso-
The latter observation 100 us to study the
prenoid compounds in which the isoprenoid
linkage between the synthesis of phytoene
side chain alkylates a non-isoprenoid nucleus
and stromal glycolysis as a possible source of
(chlorophylls,
plastoquinones,
toeopherols,
ATP.
"
phylloquinone). The main building unit for
aU these molecules is geranylgeranyl pyro-
Materials and methods
phosphate which is exclusively synthesized
by plastid stroma [1-4]. For carotenoid, the
Plant materwls. Normal mature green and
dimerization of geranylgeranyl pyrophosphate
orange Capsicum annuum fruits (var. Yolo
into phytoene is also catalyzed by plastid
Wonder) were used. Pisum sativum (var. Petit
stroma [1,2,4].
Provençal) seedlings were grown at 25°C with
We have now extended these investiga-
a 11-h day length for 9 days. Spinacia
tions to different factors regulating speci-
oleracea L. was obtained from local market.
fically the synthesis -of phytoene in isolated
Hordeum
vulgare
(INRA
var.
Béatrice),
plastid stroma. Here, we present evidence
Triticum aestivum (var. Florence Aurore), Zea
mays (INRA 508 from La Française de Maïs)
·To whom correspondence should he sent.
were germinated at 25°C in the dark for
Abbreviations: CTAB, cetyltrimethylammonium bro-
9 days.
mide; DGDG, digalactosyldiglyceride; DT!', dithio-
Plastids and plastid subfractions isolation.
threitol; HPLC, high perCormance liquid ch ro mato-
graphy; IPP,
isopentenyl
pyrophosphate; MG DG,
The methods describOO previously [4] were
monogalactosyldiglyceride.
adopted.
0618-9452/87/$03.50
© 1987 Elsevier ScientiCic Publishers Ireland Ltd.
Printed and Published in Ireland

104
Assays and analysis of products. Unless
specified otherwise, the incubation medium
contained in a final volume of 1 ml: 2 mM
=3.8
o
MgCI
E
2 ,
1 mM MnCI2, 5 mM dithiothreitol
c
(DTT), 1 mM ATP (for some experiments
ATP was replaced by glycolytic intermediates
as specified in the text) , 0.2 M sorbitol,
50 mM Tris-HCI (pH 7.6), 400 Ilg of Tween-
./Ooolate
80, [1-14C]isopentenyl pyrophosphate (48
--------~
___ *
M_G_DG~_
mCi/mmol) and a definite amount of proteins
\\
*
as indicated in the result section. The reac-
tions were carried out at 25°C for various
times. The reactions were terminated and the
product analyzed as described before [5].
Fil. 1.
Effect of detergents, polyetbyleneglycol
Altematively, the total lipid extract con-
6000 and galactolipids on tbe incorporation of IPP
taining prenois and hydrocarbons was analyz-
into phytoene by Cap.icum chromo piast stroma.
ed by high performance liquid chromato-
DGDG and MGDG were 80nicated in 50 mM Tris-
graphy (HPLC) on a reverse phase system
HCI buffer (pH 7.6) before addition to the medium;
(IlBondapak CIS) using methanol/cyclohex-
0.3 "Ci of IPP wu uaed.
ane/hexane (80: 10: 10, v/v) as the solvent
[4]. In some experiments, the lipid extract
hand, CTAB completely inhibited the incor-
dissolved in petroleum ether was adsorbed to
poration of isopentenyl pyrophosphate (see
a SePak (silica cartridge, Waters) successively
also Ref. 9). When different concentrations of
eluted with 10 ml of petroleum ether and
polyethylene glycol (PEG) were added to the
10 ml of acetone to separate respectively the
incubation mixture in the lbsence of any
hydrocarbon and the prenol fractions.
detergents, phytoene synthesïs was also stimu-
Radioactivity
incorporation
was
deter-
lated (Fig. 1). In addition, one can note that
mined by liquid scintillation counting. Protein
the major plastid lipids (galactolipids) exert a
content was determined according ta the pro-
stimulatory effect in the case of DGDG and
cedure of Bradford [6]. Monogalactosyldigly-
an inhibitory effect in the case of MGDG.
ceride (MGDG) and digalactosyldiglyceride
Though the chromopIast stroma was more
(DGDG) were prepared from spinach leaves
active, very similar results were obtained for
according to a previously described procedure
chloroplast, etioplast and amyloplast stroma.
[7].
The mechanism of stimulation is unknown.
This phenomenon has been observed after
Results and, discussion
addition of liposomes [1] or membrane frac-
tions into the incubation medium [2]. In
Stimulation of phytoene synthetase by de ter-
spinach plastids where the synthesis of phyto-
gents and polyethyleneglycol and galacto-
ene was not demonstrated, it has been shown
lipids
that the incorporation of isopentenyl pyro-
Neutral detergents (Tween-80 and Triton
phosphate into the total lipid fraction was
X-100) stimulated phytoenesynthesis (Fig. 1).
stimulated after recombination of stromal and
A similar effect was noted in the case of
membrane fractiôns [10]. In the case of
tomatoes prenyltransferase [8]. This pheno-
detergents, the stimulation could be due to
menon was less pronounced in the case of
the formation of membrane-like structures
Triton X-100 at concentrations far above the
which stabilize the enzyme complex, in addi-
critical micellar concentration. For cholate,
tion to providing a better diffusion of sub-
no significant effect was noted. On the other
strates and products [11]. It has been shown

105
Table I.
Effects of MgCla and MnCl a on isopentenyl pyrophosphate incorporation into phytoene and prenois
by Cap.ieum chromoplast stroma. Stromal protein (2.5 mg) and 0.18 #lCi of isopentenyl pyrophosphate were
used. Incubation wu for 3 h.
Treatments (mM)
Incorporation
Product distribution (%)
(nmol)
MgCla
MnCl a
EDTA
Phytoene
Prenois
0
0
0
0.45
0
100
0
0
10
0
0
0
2
0
0
1.65
8
92
4
0
0
1.62
10
90
0
2
0
0.98
70
30
0
4
0
1.10
73
27
2
4
0
0.96
66
34
2
8
0
0.72
65
35
4
2
0
0.86
62
38
8
2
0
0.91
65
35
2
2
0
1.59
10
90
4
4
0
1.70
17
83
that polyethyleneglycol induces aggregation
with labelled IPP in the absence of exogenous
of enzymes [12,13]. Such a mechanism could
addition of divalent cations, the radioactivity
enhance the cohesion of the individual en-
incorporated was strongly reduced (Table 1)
zymes (isopentenyl pyrophosphate isomerase,
and only the prenol fraction was labelled.
geranylgeranyl
pyrophosphate
synthetase,
Detailed analysis of the latter fraction by
prephytoene pyrophosphate synthetase and
HPLC [4], showed that the lattel was exclu-
phytoene synthase) involved in phytoene syn·
sively localized in the C20 prenol fraction.
thesis and could favour a better channeling of
When a similar incubation was carried out in
substrate·s.
the presence of 10 mM EDTA, any radio-
The stimulation effects above mentioned
activity was detected in the totallipid extract
may he taken as an eVidence that in vivo, the
(Table 1). Therefore one may conclude that
soluble phytoene synthetase partitions be-
the endogenous stromal pool of Mg2 + and
tween the membrane fraction and the stromal
Mn2 + were able to sustain only the synthesis
phase, according to certain physiological con-
of geranygeranyl pyrophosphate since
no
ditions such as membrane synthesis during
phytoene was detected. The same result was
pl8.stid differentiation or in case of hydro.
exactly obtained for the other types of plastid
phobie effect induced by ion concentration
stroma. By exploiting this situation we com-
(see also Refs. 14 and 15 for similarity). This
pared the effectiveness of the two cations to
allows phytoene to he discharged into the
regulate the synthesis of phytoene. As shown
internal plastid membranes where further
in Table l, Mg2 + gave an enhanced incorpora-
reactions occur [1,2]. This mechanism may
tion of IPP into the lipid fraction compared
explain the formation of carotenoids organ-
to Mn2+. However, under these conditions,
ized in prothylakoids, thylakoids, a-chloro-
the extent of incorporation of IPP into phyto-
phyll
membranes
and
lycopene
crystal
ene was only 10% compared to the 65-70%
bordered membranes [16] inside the stroma.
incorporation observed in the presence of
Mn2 + (Table 1). Though the extent of incor·
Regulation of phytoene synthesis by metal
poration was generally lower as shown pre-
ions
viously [4], the same trend was noted in the
When chromopIast stroma was incubated
different plastid stroma used.

106
spot unresolved
in
the high perfonnance
liquid analysis, since it eluted like geranyl-
geraniol, was detected (Fig. 2). In this system,
the polarity of this compound was not modi-
fied after saponification, excluding the forma-
tion of prenylesters which might occur [18].
On paraffin-impregnated sillca gel plate de-
veloped with methanol/water (70: 30, v/v),
this compound behaved like geranylgeraniol.
When chromatographed on sillca gel plate
developed with different solvent systems, it
was identical to geranyllinalool. Geranyllina-
1001 has been normally detected after acid
hydrolysis [19] which induces rearrangement.
In the present study no acid treatment was
attempted.
Furthermore
this
prenol
was
detected in all the incubations carried out
with the different plastid stroma used in this
study. The nature of its fonnation is far more
complex than a simple dephosphorylation by
phosphatases, since the latter operate in the
Fig. 2.
Radioautogram of the total Iipid extract
sequence:
prenyl
pyrophosphate-prenyl
after
IPP
incorporation.
Cap.icum
chromoplasts
monophosphate-prenol
without
rearrange-
stroma was
incubated
in the presence or in the
ment [20]. It has been shown that farnesyl
absence of MgCI. and MnCI•. The lipid extract was
pyrophosphate synthetase cata:lyzes the solvo-
spotted before or after saponification on silica gel
lysis of its product in the presence of less than
plate developed with benzene/ethyl acetate (90 :10,
v/v). Unsaponified extract obtained aCter incubation
nanomolar concentration of inorganic pyro-
in the presence (1) and in the absence (2) of divalent
phosphate [21]. This effect was also noted
cations; saponified extract obtained aCter incubation
for a partially purified prenyltransferase from
in the presence (3) and in the absence (4) of divalent
Pisum in the absence of pyrophosphate [22].
cations. The following abbreviations refer to: (P)
A similar mechanism may explain the fonna-
phytoene, (X) unidentified prenol, (G L) geranyllina·
1001. (GG) geranylgeraniol and (0) origin including
tion of geranyllinalool detected in our study.
phosphorylated derivatives.
To our knowledge, geranyllinalool has been
identified
as a plant constituent only in
jasmin flowers [23]. For the different plastid
In order to get sorne insight into the pro-
stroma used, the formation of geranyllinalool
cesses involved. the total lipid was further
was specifically promoted by the nature of
analyzed. As an alternative to HPLC analysis,
the metal ion since its formation was induced
the total lipid extract derived from an incuba-
by MgC12 (Fig. 3). On the other hand the
tion in the presence and in the absence of
formation of the prenol derivative (X) peculiar
added metal ions was spotted on a sillca gel
to chromoplast stroma was strictly dependent
plate developed with benzene/ethyl acetate
upon the presence of MnC1
(Fig. 3). From
2
(90: 10, v/v) [17] since this system allows
these in vitro data, one
may conclude that
the separation of primary and tertiary alco-
the balance between Mg2 + /Mn2 + may regu1ate
hols. Surprisingly, beside phytoene, geranyl-
efficiently the synthesis of phytoene.
geraniol and the unidentified prenyl derivative
Another specific effect promoted by MgCl:
(X,
mainly
detected
in
incubations with
in Capsicum chromoplast stroma is illustrated
chromoplast stroma), an additional radioactive
in Fig. 3. One can note that in an incubation

107
carried out with MgCl
as the sole divalent
2
1
2
3
4
5
., ,.
cation
extemally added
to
the medium
P
~
r
r,
solanesol, the prenyl side chain of plasto:
quinone-9
was synthesized (Fig. 3). This
result was also verified after high perfonnance
:,,;
X
~
liquid chromatography using the conditions
~
~,
~-~
previously described [4]. Further manipula-
tions of the ratio MgCI2/MnCI induced the
2
accumulation of severa! minor prenoIs having
GL
........ ,:.:MilI.
~. .~.
chain length between C20 to C45 as determined
S
r
by the logarithmic plot of the retention time
versus the number of carbon atoms (results
~.
GO
..
not shown). Therefore the elongation of the
prenol chain in Capsicum chromo pIast stroma

is under the influence of MgCl2 , a mechanism
similar
to
that
found
in Bacteria
1[24].
Whether geranylgeranyl pyrophosphate and
solanesyl pyrophosphate are synthesized by
the same prenyltransferase is not established.
However, it has been shown that purified

famesyl
pyrophosphate
synthetase
from
Fig. 3.
Radioautogram showing the changes pro-
avian liver synthesizes geranylgeranyl pyro-
moted by the MgCl,/MnCI, ratios on the incorpora-
phosphate
under certain
conditions [25] .
tion of IPP by Capsicum chromoplast stroma. The
millimolar
concentrations
used
for
the different
Regulation of phytoene synthesis by ATP
MgCl,/MnCl, ratios were: 2/0 (1), 4/0 (2), 0/2 (3),
produced (rom stromal glycol'ysis
0/4 (4) and 4/4 (5). The unsaponified Iipid extract
was chromatographed and the abbreviations were as
Previous data using a Lycopersicum phyto-
described in Fig. 2 except that 8OIanesoi (S) was
ene synthetase [26] and AphGnocapsa mem-
detected.
branes [27] demonstrated that the addition
Table' n.
Effect of ATP on isopentenyl pyrophosphate incorporation into phytoene and prenoIs by Capsicum
chromoplast stroma. The concentration of ATP in the standard medium was changed as shown. Stromal protein
(2.5 mg) and 0.18 "Ci of i80pentenyl pyrophosphate were UBed. Incubation was for 3 h.
Treatments (mM)
Incorporation
Product dÎ5tribution (%)
(omol)
ATP
Phytoene
Prenois
20
10
0
1.13
57
43
1
1.27
70
30
2
1.38
77
23
3
0.04
0
100
4
0.03
0
100
2
1
0
1.80
62
38
1
2.63
78
22
2
0.24
61
39
3
0.25
23
77
4
0.03
0
100
0.2
0.1
0
2.60
9
91
1
1.69
0
100
2
1.29
0
100

108
Table III.
Effect of glycolytic intermediates on the incorporation of isopentenyl pyrophosphate into phytoene
and prenois by Cap.icum chromoplast stroma. The incubation medium was as described under Materials and
methods except that 10 mM MgCI
were used while ATP was replaced by the different glycolytic
2 , 5 mM MnCI 2
intermediates indicated below. For fructose 1,6-bisphosphate and glyceraldehyde-3-phosphate the incubation
medium contained in addition 4 mM NADP<. ADP, K HPO. and only 4 mM ADP in the case of 1,3-diphospho-
2
glycerate. Radioactivity incorporated with ADP alone in the absence of glycolytic intermediates was comparable ta
that of the standard medium without ATP.
Treatmenu (mM)
Incorporation
Product distribution (%)
(nmol)
Phytoene
PrenoIs
Standard medium without ATP
1.70
53
47
Fructose l,6-bisphosphate
2
1.63
48
52
4
1.78
56
44
6
2.18
61
39
Glyceraldehyde'3'phosphate
2
1.70
43
57
4
1.80
52
48
6
2.11
63
37
1,3,-Diphosphoglycerate
2
2.07
64
36
4
2.20
68
32
6
2.32
70
30
of ATP to the incubation medium stimulated
[20]. This phenomenon could not he demon-
the synthesis of phytoene from isopentenyl
strated in this work. This stimulation by ATP
pyrophosphate.
In
addition. it has been
led to the idea that in vivo. endogenous ATP
shown that ATP stimulated the prenyl trans-
fonnation may he acting dire~t1y on phytoene
ferase activity from Pisum [22] and Gossy-
synthetase. Therefore we evaluated the pro-
pium [28]. We investigated to what extent
duction of ATP by stromaI glycolysis in
phytoene synthetase from Capsicum chro-
relation to phytoene syntbesis. After addition
moplast stroma was controlled by ATP. The
of fructose 1.6~iphosphate. glyceraldehyde
relationship hetween ATP concentration and
3-phosphate
or
1.3~iphosphoglycerate as
phytoene synthesis is shown in Table II. One
specified, a marked synthesis of phytoene
can note that the stimÙ1atory effect of ATP
occurred (Table III).
is strongly dependent on the concentration
Finally. it should he stressed that this in
of MgCh -and MnCl
vitro study is only a model of what is going
2 , suggesting the participa-
tion of ATP~ivalent cation complexes. A
on in vivo inside plastid stroma. Nevertheless,
marked stimulation of phytoene synthesis was
from a physiological point of view, these data
observed at 1 mM ATP. However. the concen-
show that the plastid stroma is a c1uster of
tration of ATP is very critical. since at higher
enzymes functioning in close cooperation.
concentrations (more than 2 mM), the synthe-
sis of phytoene was severely inhibited (Table
Acknowledgement
II). Very similar results were obtained for
amyloplast and etioplast and to a lesser extent
We thank the P.J. Foundation for a grant to
for chloroplast stroma. Though the mecha-
O. Dogbo.
nism of ATP stimulation is unknown. the
possibility that ATP may act as an al10steric
References
effector has been proposed [26]. It has also
been shown that ATP could inhibit the
1 K. Kreuz, P. Beyer and H. Kleinig, Planta, 154
dephosphorylation of prenyl pyrophosphates
(1982) 66.

109
2 B. Camara, F. Bardat and R. Moneger, Eur. J.
18 F.
Lutke-Brinkhaus. G. Weiss and H. Kleinig.
Biochem., 127 (1982) 255.
Planta, 163 (1985) 68.
3 O. Dogbo, F. Bardat and B. Camara, Physiol.
19 D.V. Shah, D.H. Feldbruegge, A.R. Houser and
Veg., 22 (1984) 75.
J.W.
Porter,
Arch.
Biochem.
Biophys.,
127
4 O. Dogbo, F. Bardat, A. Laferriere, J. Quennemet.
(1968) 124.
J. Brangeon and B. Camara, Plant Sei., 49 (1987)
20 L.M. Perez, G. Taucher and O. Cori, Phytochem-
89.
istry, 19 (1980) 183.
5 B. Camera, Methods Enzymol., 110 (1985) 244.
21 E. Demole and E. Lederer, Bull. Soc. Chim.,
6 M.M. Bradford, Anal. Biochem., 226 (1976) 551.
(1958) 1128.
7 B. Camera and R. Moneler, Physiol. Vel., 15
22 B.E. Allen and D.V. Banthorpe, Phytochemistry.
(1977) 711.
20 (1981) 36.
8 S.L. Spurgeon, N. Sathyamoortby and J.W. Porter,
23 A.
Saito
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H.C.
Rillinl,
Arch. Biochem.
Arch.
Biochem.
Biophys.,
230
(1984) 446.
Biophys., 208 (1981) 508.
9 P.M. Bramley and R.F. Taylor, Biochim. Biophys.
24 R Fuji, H. Salami, T. Koyama, K. Ogura, S. Seto,
Acta, 838 (1985) 156.
T. Baba and C.M. Allen, Biochem. Biophys. Res.
10 M.A. Block, J. Joyard and R. Douce, Biochim.
Commun., 96 (1980) 1648.
Biophys. Acta, 631 (1980) 210.
25 B.C. Reed and RC. Rilling, Biochemistry, 14
11 B. Camara and R. Moneger, Physiol. Veg., 20
(1975)60.
(1982) 757.
26 B. Maudinas, M.L. Bucholtz, C. Papastephanou.
12 G.D. Reinhart, J. Biol. Chem., 265 (1980) 10576.
S.S.
Katiyar,
A.V.
Briedis and J.W.
Porter.
13 R. Medina, J.J. Aragon and A. Sols, FEBS Lett.,
Biochem. Biophys. Res. Commun., 66 (1975)
180(1985)77.
430.
14 D. Ben-Bassat and L.E. Anderson, Piant Physiol.,
27 I.E. Clarke, G. Sandman, P. Bramley and P.
68 (1981) 279.
Boger, FEBS Lett., 140 (1982) 203.
16 P.H. McNeil and D.A. Walker, Arch. Biochem.
28 S.R. Adam. and P.F. Heinstein, Phytochemistry,
Biophys., 208 (1981) 184.
12 (1973) 2167.
16 S.W. Rosso, J. U1trastruct. Res., 25 (1968) 307.
17 M.O.
Oster and
C.A.
West,
Arch. Biochem.
Biophys., 127 (1968) 112.

17
COMMENTAIRE DES ARTICLES 1 & 2
Les travaux déjà
effectués sur le fruit
de poivron
ont montré qu'au cours de sa maturation,
il se produit une
accumulation de caroténoides (CAMARA,
1980; CAMARA,
1981;
CAMARA et B~GEON,
1981b; CAMARA et MONEGER,
1982) dont
le premier formé
est le phytoène
(CAMARA et
al.,
1982a;
LAFERRIERE,
1983). Par ailleurs,
les mêmes travaux et ceux
d'autres auteurs travaillant sur
des matériels différents
(MAUDINAS et al.,
1977; PORTER et SPURGEON,
1979; KREUZ et
al.,
1982) ont montré
que la synthèse de
ces pigments se
déroule exclusivement à l'intérieur du
plaste. Partan~ de
ces données, nous avons recherché dans différents types de
plastes
l'activité
phytoène
synthase,
antérieurement
appelée phytoène synthétase.
Nous avons également
étudié
quelques facteurs régulant la synthèse du phytoène.
AI Mise en évidence de l'activité phytoène synthase
dans des plastes à différents états de différen-
ciation et site de biosynthèse du phytoène.
Lorsque nous incubons, en
présence de pyrophosphate
de préphytoène,
la
fraction
stromatique
de
différents
types
de
plastes
(çhromoplastes,
chloroplastes,
étioplastes
et
amyloplastes)
de
diverses
espèces
végétales, nous observons
l'incorporation de ce
substrat
dans le
phytoène.
Cette
incorporation est
sensiblement
identique pour tous les types de stroma utilisés,
à l'ex-

18
ception
du stroma
de
chromoplastes' pour
lequel
l'ac-
cumulation de phytoène
est beaucoup plus
importante (Fig
3, article 1).
Lorsque nous incubons les
plastes entiers
ou lorsque nous procédons à la réassociation des fractions
subcellulaires correspondantes (stroma + thylakordes, pour
les chloroplastes; stroma +
lamelles achlorophylliennes,
pour les
chromoplastes et
stroma + prothylakordes,
pour
les étioplastes), nous observons dans tous les
cas que la
synthèse
du
phytoène
est
suivie
de
celle
d'autres
carotènes
comme le
phytofluène,
le
E-carotène,
l '
a-
carotène et le a-carotène (Tableaux II et III, article 1).
~
Par contre,
l'incubation de la
fraction membranaire seule
en présence
de pyrophosphate
de préphytoène n'aboutit
à
aucune synthèse de phytoène (Fig.3, article 1).
Ces résultats confirment que:
La synthèse des carotènes s'effectue au sein du
plaste.
- Le phytoène est exclusivement synthétisé par des
enzymes stromatiques solubles.
- La désaturation et la cyclisation du phytoène font
intervenir des enzymes membranaires.
Ils sont également
en accord avec ceux
obtenus par
différents
auteurs
travaillant sur
les chromoplastes
de
poivron
(CAMARA et al.,
1982b) ou de pétales
de narcisse
(KREUZ et al., 1982). Ces chercheurs, en utilisant l'iso-

20
1 -
Influence de différents
ions (composition
et
concentration ioniques) du milieu d'incubation
sur la synthèse du phytoène par le stroma de
chromoplastes.
Lorsque nous incubons
du stroma en
présence d'IPP,
nous
observons que la synthèse du phytoène est étroitement
contrôlée
par la
balance Mg 2 +/Mn 2 +. Les résultats résumés
dans le tableau 1 de l'article 2, montrent que:
En l'absence d'ions et en présence d'EDTA (a~ent
chélateur des ions divalents),
il n'y a aucune
synthèse, ni de phytoène, ni de prénylpyro-
phosphates.
- En présence du Mn 2 + seul,
l'incorporation de l'IPP
dans le phytoène est plus importante (70 à 73%)
qu'en présence du Mg 2 + seul
(8 à 10%).
- Lorsque les deux ions sont présents,
la synthèse
du phytoène est contrôlée par le rapport
Mg 2 +/Mn 2 +.
La synthèse la plus faible est obtenue
quand ce rapport est égal à 1.
L'analyse de ces résultats suggère
tout d'abord que
le
stroma utilisé
contient les
ions divalents
endogènes
lui
permettant
de
réaliser la
synthèse
de phytoène
en
l'absence
de tout
apport exogène.
Les études menées
par
CHOW et ses collaborateurs (1976) sur des chloroplastes

21
exposés à
la
lumière
ont révélé
qu'il
se produit
des
mouvements
d'ions entre l'intérieur et
l'extérieur de ces
plastes.
Ces auteurs
précisent que la lumière
induit une
entrée
de H+ et de Cl- dans le
chloroplaste alors qu'elle
facilite la sortie des ions Mg 2+ et K+.
Ces
mêmes
résultats
montrent
que
la
synthèse
du
phytoène est régulée par
le Mn 2 + (Fig.2 et 3, article 2).
L'analyse de cette synthèse permet de penser
que les ions
interviendraient dans la synthèse du GGPP
en fragilisant
la liaison
du
pyrophosphate
et
de la
chaine
carbonée
~
(CORI,
1983).
En effet
la synthèse du
GGPP à partir
de
l'IPP
(Fig.d) comporte
une
série
de
condensations
de
molécules terpéniques
avec
départ
de pyrophosphate.
La
rupture de la
liaison chaine carboné-PPi
favoriserait la
condensation et donc la
formation d'intermédiaires en C2ü
intervenant directement dans la synthèse du phytoène. Lors
de la synthèse du
farnésylpyrophosphate (intermédiaire en
C~5 résultant
de
la
condensation
d'IPP
avec
du
GPP,
intermédiaire en
ClO,
LASKOVICS
et POULTER
(1981)
ont
remarqué que,
lorsqu'ils
utilisaient comme
précurseurs,
des complexes Mg 2 +
-
IPP et E - Mg 2 +
-
GPP (enzyme - Mg 2 +-
Géranyl PP),
le substrat le plus métabolisé
est celui qui
se trouve
sous forme
de
complexe substrat
phosphorylé-
ions. Les
résultats obtenus
par ces
auteurs incitent
à
penser que
les ions pourraient
aussi intervenir dans
le
positionnement des molécules, c'est-à-dire orienteraient

22
les molécules ,les unes par rapport aux autres
de
manière
à faciliter la réaction.
L'utilisation
de ces
informations nous
a permis
de
réaliser
la synthèse du phytoène
à partir de l'IPP
et de
stroma
de chloroplastes,
d'étioplastes et
d'amyloplastes
(Tableau
IV, article 1). Ces résultats ont reçu l'appui de
ceux
de LOTKE-BRINKHAUS
et KLEINIG (1987a) qui,
à partir
de
ce
même
substrat et
de
stroma
d'étioplastes ou
de
chloroplastes
de cotylédons
de moutarde,
ont obtenu
une
synthèse du phytoène.
2 - Influence de l'ATP sur la synthèse du phytoène
par le stroma de chromoplastes.
Nous
avons incubé du stroma de
chromoplastes avec de
l'IPP
en présence ou non d'ATP et
de trois intermédiaires
(fructose
1,6 - diphosphate, glycéraldéhyde
-3- phosphate
et
1,3-
diphosphoglycérate) de
la séquence
glycolytique
(Fig.e).
Dans
les
conditions
optimales
de
synthèse
de
phytoène,
les résultats présentés dans les
tableaux II et
III
de
l'article 2
montrent
que, en
présence d'ATP
ou
d'intermédiaires
de la séquence glycolytique,
la synthèse
du phytoène est stimulée.

23
~CH,O-®-Cl') -
~CH,O-®-®
DMAPP
IPP
~CH:O-®-®
GPP
·IPP
Figure d
Réactions de condensation de l'isopenténylpyrophosphate en
géranylgéranylpyrophosphate.
DMAPP : diméthylallylpyrophosphate
FPP
: farnésylpyrophosphate
GPP
: géranylpyrophosphate
GGPP
: géranylgéranylpyrophosphate
IPP
: isopenténylpyrophosphate

24
fructose 1,6 - diphosphate
dihydroxyacétone phosphate
glycéraldéhyde 3 phosphate
1 t: NAD + Pi
1 ~- ~ NADH + H
1,3 - diphosphoglycérate
1 1C ADP
~-... ATP
3 - phosphoglycérate
"1 1l1
2 - phosphoglycérate
phosphoénolpyruvate
1FADP
1
ATP
1
énolpyruvate
Figure e
Production d'A TP au cours d'une séquence glycolytique.

25
Ces
résultats
laissent
penser
qu'une
séquence
glycolytique
fonctionne dans les chromoplastes de poivron.
Or,
les études
effectuées sur
les plastes
au cours
des
diverses
étapes
de différenciation
ont
montré qu'il
se
produit
des remaniements au cours
de ces transformations.
Alors
que le plaste acquiert certaines fonctions, d'autres
peuvent
disparaître. Ainsi,
au cours de la
maturation du
fruit,
les réactions de photophosphorylation (génératrices
d'ATP),
déjà
faibles
dans
les
chloroplastes
de
ce
matériel,
déclinent
au
cours
de
l'évolution
en
chromoplastes.
Mais dans
le fruit de poivron,
ZIEGLER et
al.
(1983), qui ont étudié la composition
chimique de ces
organites
et le métabolisme en relation avec l'activité de
quelques
enzymes
au cours
de la
maturation, ont
montré
que,
lors des
transitions chloroplaste/chlorochromoplaste
et
chlorochromoplaste/chromoplaste,
certaines
enzymes
restent
fonctionnelles,
mais leur
activité devient
plus
faible.
Ainsi, dans les chromoplastes, on peut observer la
synthèse d'ATP à partir de trioses phosphates.
Des
phénomènes comparables avaient été
observés lors
de
la synthèse
de chlorophylles par des
chromoplastes et
des
chloroplastes
de
fruits de
poivron
en présence
de
phytol
(DOGBO,
1983). Les résultats obtenus
avec les deux
types
de plastes montraient que
l'incorporation du phytol
dans
les
chlorophylles
était
plus
importante
si
l'incubation
s'effectuait
en
présence
d'ATP
ou
d'intermédiaires de la séquence glycolytique.

26
Ces
résultats et ceux obtenus par
d'autres auteurs (WATTS
et
KEKWICK,
1974;
RUDIGER
et
al., 1980)
nous
avaient
conduits
à penser que l'ATP pourrait
inhiber l'action des
phosphatases
qui diminuent l'efficacité de l'incorporation
des
prénylpyrophosphates.
Cependant les
études que
nous
avons
entreprises
(article
1)
·montrent
que
le
rôle
stimulateur
de l'ATP
ne peut
être envisagé qu'au
simple
niveau d'un inhibiteur des phosphatases endogènes.
3 - Influence de détergents (Tween 80, Triton X -
100, cholate), de galactolipides, du PEG 6000 ou
du CTAB sur la synthèse du phytoène (Fig.l,
article 2).
La
synthèse
du
phytoène
est
stimulée
par
les
détergents
neutres
(Tween
80
et
Triton
X -
100),
le
digalactosyldiacylglycéror
ou
le
PEG 6000.
Par
contre,
elle
est
inhibée par
le monogalactosyldiacylglycérol
et
complètement supprimée par le CTAB.
Les
mécanismes
par
lesquels ces
facteurs
agissent
sont
encore
inconnus. Cependant
on peut
penser que
les
détergents
neutres
pourraient
simuler
des
structures
membranaires,
permettant ainsi aux enzymes impliquées dans
la
synthèse du
phytoène de s'organiser
spatialement afin
de
faciliter
le déroulement
de la
chaîne de
réactions.
Cette
hypothèse est
étayée par les résultats
obtenus par
CAMARA et ses collaborateurs (1982a), qui montrent que la

27
synthèse
du phytoène
est stimulée par
la présence de
la
fraction membranaire dans le milieu d'incubation.
L'ensemble des résultats exposés ci-dessus permet de
conclure que :
-
La synthèse du phytoène dans le stroma est contrô-
lée par des ions divalents (Mg 2 +,
Mn 2 +).
L'addition d'ATP ou d'une molécule de la séquence
glycolytique (susceptible de produire l'ATP)
stimule la synthèse du phytoène à partir du stroma.
Ceci
suggère
le
fonctionnement,
in
vivo,
d'une
séquence glycolytique pouvant assurer
la disponibilité en
ATP. Une
telle expérience
a
déjà
été
faite avec
les
autres types de
plastes. Ainsi,
SIMCOX
et al.
(1977) et
SIMCOX et
DENNIS
(1978) dans
les
proplastes de
ricin,
IRELAND
et
al.
(1979)
dans
les
étioplastes
et
les
chloroplastes de
feuilles
de
ricin,
et STITT
et
REES
(1979 ) dans les chloroplastes de pois, ont mis en évidence
la présence
de certaines
enzymes du cycle
glycolytique,
permettant,
in vitro,
la synthèse de molécules
d'ATP.
Il
en est de même pour les chromoplastes de poivron. Dans ces
organites,
CAMARA
et
BRANGEON
(198la)
ont
décelé
l'activité de
kinases capables
de catalyser la
synthèse
d'IPP à partir de mévalonate.

28
CHAPITRE 2
ETUDE DE L'EFFET D'UN ANALOGUE DE L'IPP
(AMINOPHENETHYLPYROPHOSPHATE) SUR LA SYNTHESE
DU PHYTOENE
In vitro
inhibition
of phytoene
synthesis by
phenethyl
pyrophosphate der1vat1ves. FEBS
LETTERS (1987),
210
(2),
211-215.

art icle 3
Volume 210, nllmber 2,211-215
FEB 04349
January 198-:"
Metabolism of plastid terpenoids: in vitro inhibition of
phytoenè synthesis by phenethyl pyrophosphate derivatives
Odette Dogbo, Françoise Bardat, Joelle Quennemet and Bilai Cama ra
Laboratoire d2 Biochimie du Développement Végétal. Equipe de l'UA 1180 CN RS. Université Pierre et Marie Curie.
Tour 53.4. Place Jussieu. 75252 Paris Céd2x 05. France
Received 10 October 1986; revised version received 17 November 1986
The inhibition of partially purified phytoene synthetase activity from Capsicum annuum chromoplasts was
investigated using aminophenethyl pyrophosphate and azidophenethyl pyrophosphate. These compounds
were effective inhibitors of phytoene synthesis and kinetic analysis showed that they were competitive with
respect to the substrate isopentenyl pyrophosphate. These data were strengthened by the ability of azido-
phenethyl pyrophosphate to photoinactivate irreversibly the activity of the enzyme complex. These resuhs
suggest that the primary targets of these analogs are at the level of isopentenyl pyrophosphate isomerase
and geranylgeranyl pyrophosphate synthetase.
Plaslid; Carotenoid; Phytoene synthesis; Phytoene synthetase; Inhibitor

1. INTRODUCTION
pyrophosphate-geranylgeranyl
transferase
and
phytoene synthase {I].
ln higher plants, the plastid compartment is a
Using a partially purified phytoene synthetasc
site
of
synthesis
of
specifie
terpenoids
and isopentenyl pyrophosphate as a precursor, \\1. e
(carotenoids, chlorophylls, plastoquinones, toco-
have previously reported the inhibition of phy-
pherols, kaurene ..• ) which play important roles in
toene synthesis by different allylic substrates as
plant development. For this reason a large number
weil as inorganic pyrophosphate (2]. In these
of chemicals have been screened for the ability to
studies the concentrations required for significant
inhibit their formation at various control points.
inhibition were approx. 5-50-times higher than the
There is liule' appareilt structure or biochemical
Km value for isopentenyl pyrophosphate. In comi-
relationship among these chemicals. Moreover,
nuing this work, our interest in this approach 'oIoas
none of them inhibited the synthesis of phytoene,
stimulated
by
the
ability
of
azidophenethyl
the first C40 carotenoid formed in higher plants
pyrophosphate to site-affinity label and inhibit
through a series of reactions catalyzed by an en-
farnesyl
pyrophosphate synthetase from avian
zyme complex (phytoene synthetase) involving
liver which apparently shows a broad specificity (3]
isopentenyl
pyrophosphate
isomerase,
geranyl·
compared to geranylgeranyl pyrophosphate syn-
geranyl pyrophosphate synthetase, geranylgeranyl
thetase (4].
We have therefore synthesized aminophenethyl
Correspondence address: B. Camara, Laboratoire de
pyrophosphate and its azido derivative and tested
Biochimie du Développement Végétal, Equipe de l'UA
their efficiency as inhibitors of phytoene synthesis,
1180 CNRS, Université Pierre et Marie Curie, Tour 53,
using Capsicum chromoplast stroma and a partial-
4. Place Jussieu, 75252 Paris Cédex 05, France
Iy purified phytoene synthetase enzyme comple".
Pub/ished by Elsevier Science Publishers B. V. (Biomedical Di~'ision)
00145793/87/$3.50 © 1987 Federation of European Biochemical Societies
: li

Volume 210, number 2
FEBS LETTERS
January 1987
2. MATERIALS AND METHODS
ferent e1ution procedures (system 1: mcthanol/
cyclohexane/hexane. SO: 10: 10, v/v, dctection at
2.1. Inhibitors
215 nm;
system
Il:
acetonitrile/ethyl
acetate/
o-Aminophenethanol
was
purchased
from
chloroform, 70:20: 10, v/v, detection a,t 280 nm).
Aldrich. The azido derivative was prepared as
AIternatively the reaction products were spolled
described (5]. The corresponding pyrophosphate
on silica gel plates developed with benzene/ethyl
derivatives were synthesized as reported earlier (6].
acetate, 90: 10, v/v. To test for dimethylallyl
pyrophosphate, geranyl pyrophosphate, farnesyl
2.2. EnzYme systems
pyrophosphate and geranylgeranyl pyrophosphate
Chromoplast stroma was prepared from Cap-
formation, the reaction mixture was treated with
sicum annuum fruits [6]. The procedure for partial
acid phosphatase (7]. At completion, the lipid frac-
purification of phytoene synthetase was as follows:
tion was subjected to high-performance Iiquid
chromoplast stroma isolated from 5 kg of fruit
chromatography using system 1. For a more
was subjected to precipitation by sequential addi-
precise assay of dimethylallyl pyrophosphate for-
tion of 50010 (w/w) solution of polyethyleneglycol
mation, 4 ml of dichloromethane were added after
6000 in 50 mM Tris-Hel buffer, pH 7.6, contain-
acid phosphatase hydrolysis, then free terpenols in
ing
5 mM
dithiothreitol
(1 ml
of
polyethy-
the lipid
were esterified
in
the
presence of
leneglycol per 4 ml of stroma). The homogenate
naphthoic acid and carrier amounts of unlabelled
was equilibrated for 30 min before each cen-
isopentenol and dimethylallyl alcohol (8]. The
trifugation at 100000 x g. Using this method, 4
purified ester fraction was analyzed by high-
successive precipitations were performed and the
performance Iiquid chromatography using the
last precipitate was dissolved in 50 mM Tris-HCI
above described column and a mobile phase of
buffer, pH 7.6, containing 30010 glycerol (buffer
acetonitrîle/H20,
60: 40,
v/v.
Elution
of
A). Fractions of this preparation were applied to a
naphthoic acid esters was detected at 240 nm. The
DEAE-Sephacel column (1.5 x
15 cm) equili-
incorporated radioactivity was determined by li-
brated with buffer A and el ut ion was accomplished
quid scintillation.
by a step gradient of 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 M
KCI in buffer A.
2.4. Photo/ysis of azjdophenethy/ pyrophosphate
A stock solution of enzyme was transferred to
2.3. Assay of phytoene synthetase
25 mM Hepes buffer, pH 7.6, containing 0.2 M
Phytoene synthetase was assayed by following
NaCl, 1 mM 2-mercaptoethanol and 1 mM MgCI
the incorporation of isopentenyl pyrophosphate
by filtration through a Sephadex G25 disposable
into phytoene. The assay mixture (1 ml final
column (V = 4 ml) equilibrated with the same buf-
volume) contained: 2 mM MgCh, 1 mM MnCh.
fer. This step prevents the non-enzymic reduction
5 mM dithiothreitol, 1 mM ATP, 0.2 M sorbitol,
of the azide group which might occur in the
400 pg Tween-SO, 50 mM Tris-Hel buffer, pH 7.6,
presence of dithiothreitol(3,9]. Irradiation was ac-
0.1 pCi
of
(1-14C)isopentenyl
pyrophosphate
complished
in
the
presence
of
100 pM' of
(10 mCi/mmol), 1 mg stromal protein or 300 pg of
azidophenethyl pyrophosphate and 1 mg of en-
partially
purified
phytoene synthetase and
a
zyme proteins at 4°C in quartz tubes placed under
definite amount of aminophenethyl pyrophos-
a Mineralight lamp emilling at 254 nm. After each
phate or azidophenethyl pyrophosphate. The reac-
1 min irradiation the enzyme solution was filtered
tion was allowed to proceed at 25°C for 4 h except
through the Sephadex disposable column before
for the determination of initial rates where lineari-
determination of the activity.
In control ex-
ty was observed for 90 min. Kinetic parameters
periments, the treated enzyme was kept in the
were evaluated by filling the initial rate data to the
dark. The reaction mixture was filtered through
Michaelis-Menten equation using a curve filling
the Sephadex G25 column before determination of
program. Phytoene was purified as described (6].
enzymic activity as described above.
The identity of phytoene was further verified by
high-performance ]iquid chromatography using a
2.5. Unspecijic phosphatose assay
p-Bondapak CI8 column (Waters) and two dif-
Nitrophenylphosphate (1 mg) was added to the
212

Volume 210. number 2
FEBS lETTERS
January 1987
basic reaction medium used for phytoene synthesis
(fig. la). Isolated phytoene [6] was further unam-
and aCter incubation for 1 h at 35°C, 4 ml of 0.5 N
biguously characterized by high-performance li-
KOH were added before reading the absorbance at
quid chromatography in system 1 (retention time,
405 nm.
Il.86 min)
and
system
Il
(retention
time,
7.18 min). Under these conditions, the' reaction
was only 30% inhibited. Since the reaction mixture
3. RESULTS AND DISCUSSION
was not subjected to hydrolysis after the incuba-
The potency of aminophenethyl pyrophosphate
tion period, the appearance of free geranylgeraniol
to act as inhibitor of phytoene synthesis was tested
(fig.) a)
was
obviously
due
to
interfering
at 20 pM concentration using chromoplast stroma
phosphatases or prenylhydrolases, which actively
which
synthesizes
phytoene
from
isopentenyl
hydrolyzed nitrophenyl phosphate. These data
pyrophosphate [6]. The reaction products in the
allow us to conclude that the latter probably
total lipid extract from treated and untreated
hydrolyzed aminophenethyl pyrophosphate thus
chromoplast stroma
were
absolutely identical
vitiating its efficiency. This observation prompted
us to use a partially purified phytoene synthetase
as described in section 2. Phytoene synthetase
emerged from the column at 0.25 M KCI. This par-
8
b
tially purified enzyme complex remained un-
dissociated and
was devoid of contaminating
unspecific phosphatases or prenylhydrolases. In-
cubation of phytoene synthetase was 20 pM of
aminophenethyl
pyrophosphate
resulted
in
a
strong loss (90% inhibition) of enzyme activity
(fig.) b). Furthermore, this inactivation was not
GL
followed
by
accumulation
of
intermediates
(geranyl pyrophosphate, farnesyl'" pyrophosphate
or geranylgeranyl pyrophosphate) resulting from
prenyl transfer reactions. In addition dimethylallyl
pyrophosphate
resuJting
from
isopentenyl
GGe
pyrophosphate isomerization was not detected.
The inhibition of phytoene synthesis was c10sely
paralleled
by
a
decreased
incorporation
of
isopentenyl pyrophosphate into the total extract
(not shown). This observation prompted us to in-
vestigate whether or not the first enzyme in the
biosynthetic pathway (isopentenyl pyrophosphate
isomerase) was inhibited. Attempts to achieve this
s
E
were
made
by
addition
of
dimethylallyl
pyrophosphate (50 pM) to the reaction mixture
Fig.l. Radioautogram of total lipid extract obtained
containing
aminophenethyl
pyrophosphate.
after
incorporation
of
isopentenyl
pyrophosphate.
Studies of these samples showed that ph}10ene
Capsicum chromoplast (S) or partially purified phytocne
synthesis was no longer inhibited. One could simp-
synthetase
(E)
was
incubated
with
isopentenyl
ly interpret this effect to mean that when the reac-
pyrophosphate in the absence of inhibitors. Inhibition
tion
catalyzed
by
isopentenyl
pyrophosphate
experiments with the above enzyme sources (5 or E),
isomerase was artificially by-passed, the capacity
were
pcrformcd
in
the
presence
of
20 pM
to synthesize phytoene was restored and conse-
aminophencthyl pyrophosphate (1). Since the profile of
quently this enzyme was the target for the in-
(S) was similar to that of (5 + 1), only (E + 1) is shown.
hibitor. However this explanation is unsatisfactory
P, phytocne; X, unidentified prenyl derivative; Gl,
geranyllinalool;
GG,
geranylgeraniol;
0,
origin
since one may wonder that the homoallylic site of
including prenyl pyrophosphate derivative.
geranylgeranyl pyrophosphate synthetase remain-
213

Volume 210. numbcr 2
FEBS LETTERS
January 1987
ed unaffected by the inhibilor which is structurally
an analog of isopentenyl pyrophosphate. Con-
sidering
the
results
from
animal
farnesyl
pyrophbsphate synthetase which have established
that homoallylic substrates can occupy the allylic
as weil as the homoallylic site of this enzyme [IOJ
and the reversibility of the reaction catalyzed by
isopentenyl pyrophosphate isomerase, aR overall
explanation
of
our
results
could
be
that
isopentenyl pyrophosphate isomerase and geranyl-
geranyl pyrophosphate synthetase had much more
o
o.,
0.2
1/5 [jJfli'J
affinity for dimethylallyl pyrophosphate than for
aminophenethyl pyrophosphate, thus eliminating
the inhibitory effect.
~ o.....
...---e

ln an attempt to get more insight into the
.-----e
-
...---e
mechanism involved, double reciprocal plots of the
e
initial
reaction
velocities
against
isopentenyl
kô='2jIM
pyrophosphate concentrations were made at 5 and
20 pM inhibitor concentrations. Although a mul-
o
10
20
tienzyme complex was used, the inhibition pattern
1[!lM]
obtained clearly showed
that
aminophenethyl
Fig.2.
(A) Lineweaver-Burk
plot of inhibition of
pyrophosphate acted competitively (fig.2). Dixon
phytoene
synthetase
aetivity
by
aminophenethyl
plot (fig.2) of reciprocal phytoene synthesis versus
pyrophosphate. Phytoene synthetase was determined
the concentration of aminophenethyl pyrophos-
over the indicated range of isopentenyl pyrophosphate
phate gave a Ki of 12 pM.
concentrations (S). Initial velocity (V) is expressed as
nanomoles of isopentenyl pyrophosphëÙe incorporated
Given
the
fact
that
aminophenethyl
per hour. The concentrations of inhibitor are indicated
pyrophosphate efficiently inhibits phytoene syn-
below the trace. (B) Dixon plot of aminophenethyl
thesis we prepared and used the azido derivative to
pyrophosphate
inhibition
of
phytoene
synthetase
photoinactivate
the
enzyme complex.
In
the
activity
in
the
presence
of
10 pM
isopentenyl
absenée of ultraviolet treatment, the inhibition
pyrophosphate and various concentrations of inhibitors
pattern of azidophenethyl pyrophosphate was
(1). Vis expressed as shown above.
similar to that of aminophenethyl pyrophosphate.
100
For photoinactivation treatment,
the enzymic
darI<
preparation
was
incubated
with
100 pM
a - - a - - a - - o _ _ _
azidophenethyl pyrophosphate before gel filtra-
tion. We noted under these conditions a 5 to IOOJo
inhibition in the control preparation kept in the
dark (fig.3). This may not be significant: if it is, it
.~
o
suggests that a small fraction of azidophenethyl
pyrophosphate remains firmly bound to the en-
20
~ uhraviolet
................
zyme after gel filtration instead of a specifie inac-
tivation due to the ultraviolet irradiation alone III]
-----a
o L----.-L--~2--.J..2--.J..4------J
which has not been observed in this study. In spite
irradiation time
tminl
of this, the main observation after ultraviolet ir-
Fig.3. Time-dependent inhibition of phytoene symhetase
radiation was the time-dependent inhibition of
irradiated in the presence of (100 pM) azidophenethyl
phytoene
synthetase
by
azidophenethyl
pyro-
pyrophosphate. Control preparations were kept in the
phosphate (fig.3). Since this inhibition was irrever-
dark while step ultraviolet irradiation was for 1 min up
sible, we conclude that
azidophenethyl pyro-
to a period of S min. After each time the enzymatic
phosphate was covalently linked to the active
solution was filtered through a Sephadex G25 disposable
site(s) occupied by isopentenyl pyrophosphate and
column and incubated as described in section 2.
214

Volume 210, number 2
FEBS LETTERS
January 19Ri
this rein forces the competitive mechanism stated
leads to early abortion of chain clongation by
above.
prenyl transfer.
Considering the fact that phytoene synthetase is
More precise information on these points as weil
a multienzyme complex, plausible targets for these
as the use of these interesting inhibitors and related
analogs could be al the level of isopentenyl
derivatives for site-affinity labelling of different
pyrophosphate
isomerase
and
geranylgeranyl
plastid
enzymes
of
terpenoid
synthesis
is
pyrophosphate synthetase (fig.4). Taking ail the
underway.
results together, we propose that these two en-
zymes were indeed the main targets for the follow-
ing reasons: (i) a drastic reduction of isopentenyl
ACKNOWLEDGEMENTS
pyrophosphate incorporation, in connection with
We thank C. Agnes and
J.
Morando for
an absence of accumulation of dimethylallyl
technical assistance.
pyrophosphate,
geranyl
pyrophosphate
and
farnesyl pyrophosphate occurred when these in-
hibitors were used; (ii) addition of dimethylallyl
REFERENCES
pyrophosphate in the presence of these inhibitors
[1] Porter, J.W. and Spurgeon, S.L. (1979) Pure Appl.
restored the enzyme activity. Sorne recent results
Chem. 51, 609-622.
of our own have sorne bearing on this matter. We
[2] Camara, B. (1985) Pure Appl. Chem. 57, 675-677.
have
observed
recently
that
geranylgeranyl
[3] Brems, D.N. and Rilling, H.C. (1979) Biochemistry
pyrophosphate synthetase can use
isopentenyl
18, 860-864.
pyrophosphate and dimethylallyl pyrophosphate
[4] Shinka, T., Ogura, K. and Seto, S. (1975) Chem.
Leu., 111-112.
to
synthesize
geranylgeranyl
pyrophosphate
[5] Rilling,
H.C.
(1985)
Methods
Enzymol.
110.
(Dogbo and Camara, unpublished). Under these
125-130.
...
conditions, one may understand that an inhibition
16] Camara,
B.
(1985)
Methods
Enzymol.
110,
of isopentenyl pyrophosphate isomerase in connec-
244-253.
tion to geranylgeranyl pyrophosphate synthetase
17] Fuji, H., Koyama, T. and Ogura, K. (1982) Bio-
chim. Biophys. Acta 712, 716-718.
18] Yang, T.H., Zabriskie, T.M. and Poulier, D.
(1985) Methods Enzymol. III, 253-263.
[9] Staros. J.V., Bayley, H., Standring. D.N. and
Knowles. J.R. (1978) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 80. 568-572.
110] Rilling.
H.C.
(1979)
Pure
Appl.
Chem.
51.
597-608.
~C"'OH
III] Ferrini. U. and Zita, R. (1963) J. Biol. Chem. 238.
•,N", ('1
3824-3825 .

•• NJ
(III
inhibitors
Fig.4. General and theoretical scheme of phytoene
synthesis from isopentenyl pyrophosphate and suggested
sites
of
inhibition
by
phenethyl
pyrophosphate
derivatives. The different steps are catalyzed by: (1)
isopentenyl
pyrophosphate
isomerase;
(2)
geranyl
pyrophosphate synthetase; (3) farnesyl pyrophosphate
synthetase; (4) geranylgeranyl pyrophosphate synthe·
tase; (5) geranylgeranyl pyrophosphate-geranylgeranyl
transferase; (6) phytoene synthase. Structure of in-
hibitors: (1) aminophenethyl pyrophosphate; (II) azi-
dophenethyl pyrophosphate. The enzymes involved in
steps 2-4 are generally named prenyltransferase; in
Capsicum chromoplast these steps are catalyzed by one
dimeric prOlein.
21~

29
COMMENTAIRE DE L'ARTICLE 3
Les études menées
sur les biosynthéses
terpéniques
ont
établi le rôle du mévalonate
comme premier précurseur
spécifique
des
terpénoïdes,
dont les
caroténoïdes
font
partie.
Les
travaux
effectués
dans
ce
sens
avec
des
extraits
enzymatiques
de
tissus
végétaux
ont
montré
l'incorporation de
ce substrat dans de nombreux carotènes.
En revanche,
avec les plastes, seuls organites capables de
synthétiser
ces pigments chez les
plantes supérieures,
le
stade
de
différenciation
de ces
derniers
influencerait
l'utilisation
de ce substrat. En effet,
le mévalonate est
...
incorporé
dans les caroténoïdes
par les
chromoplastes de
poi vron
(CAMARA
et
BRANGEON,
1981a)
mais pas
par
les
étioplastes
et les
étiochloroplastes de moutarde
(LUTKE-
BRINKHAUS et KLEINIG,
1987b).
Par contre,
en présence
d'IPP, tous
ces types
de
plastes
utilisés
(amyloplastes,
étioplastes,
chloro-
plastes,
chromoplastes)
sont capables
de synthétiser
le
phytoène et
d'autres carotènes tels que le phytofluène,
le
r-carotène,
l'a-carotène,
le a-carotène (chapitre 1). Dans
ces
conditions la
synthèse des
caroténoïdes, et
d'abord
celle du
phytoène (premier carotène formé), devraient être
affectées
par
des
facteurs
influençant
les
réactions
d'utilisation de ce substrat.

30
C'est
pourquoi
nous
avons
étudié
les
effets
d'anologues
de
l'IPP sur
la synthèse
du phytoène.
Nous
avons
fait appel à des
dérivés du phénéthylpyrophosphate.
Pour
cette
expérience
nous
avons
utilisé
un
extrait
enzymatique
partiellement
purifié,
afin
d'éviter
les
phosphatases
(présentes
dans le
stroma) hydrolysant
des
prénylpyrophosphates
et
des
prénols
dont
les
effets
pourraient interférer avec ceux de l'inhibiteur.
Lorsqu'on incube
cet
extrait partiellement
purifié
~
en
présence d'aminophénéthylpyrophosphate (analogue d'IPP)
et
d'IPP,
on
observe que
la
synthèse
du phytoène
est
inhibée
(90% d'inhibition). De plus, on remarque que cette
inhibition
s'accompagne
de
celle
de
la
synthèse
des
prénylpyrophosphates
(DMAPP,
GPP,
FPP,
et GGPP)
(Figure
l ) .
Par
contre,
si
on
ajoute
du
DMAPP
au
milieu
d'incubation
décrit ci-dessus, on constate que le phytoène
et
les
intermédiaires
(prénylpyrophosphates)
sont
synthétisés.
De plus,
lorsqu'on
fixe
irréversiblement
l'azido-
phénéthylpyrophosphate
(dérivé
de
l'aminophénétylpyro-
phosphate) au site
actif de l'enzyme par
irradiation aux
ultraviolets, on observe
que la synthèse du
phytoène. en
présence d'IPP,
est inhibée. Cette inhibition devient plus
importante lorsqu'on
prolonge le
temps de traitement
du
complexe enzymatique (Fig.3), montrant ainsi une augmen-

31
tation du nombre de sites actifs bloqués par l'inhibiteur.
L'analyse du
K~ montre que
l'aminophénéthylpyrophosphate
est un inhibiteur compétitif (Fig.2).
L'inhibition
de la
synthèse
du
phytoène
et
des
prénylpyrophosphates
en
présence
d'aminophénéthyl-
pyrophosphate d'une
part,
et la
synthèse
de ces
mêmes
composés
en
présence de
cet
inhibiteur
et
du
DMAPP,
d'autre part, permettent de conclure que :
- La
synthèse ~u phytoène
peut être considérée
comme un
ensemble
de
réactions
catalysées
par
un
comp!exe
enzymatique.
- Chaque étape
de la réaction fait
intervenir une enzyme
du complexe.
Enfin, l'enzyme
du
complexe
qui intervient
dans
la
première étape est l'IPP isomérase.
De ces
résultats
et de
ceux précédemment
obtenus
(Chapitre 1),
il se
dégage que
la synthèse du
phytoène
comporte deux étapes essentielles
- La
synthèse des prénylpyrophosphates,
impliquant l'IPP
isomérase
et les prényltransférases.
Dans le plaste
la
production de ces composés est très
importante. En effet,
en dehors
de la synthèse
des caroténoïdes dans
laquelle
ils sont
impliqués, ces prénylpyrophosphates
constituent
également des précurseurs pour la synthèse d'autres terpé-

32
noïdes, tels
que les
chlorophylles, les
phylloquinones,
les plastoquinones et les tocophérols.
La
dimérisation
du
géranylgéranyl
conduisant
au
phytoène.

33
CHAPITRE 3
ETUDE
DES
ENZYMES
INTERVENANT
DANS
LA
SYNTHESE
DE
L'INTERMEDIAIRE EN C20
Purification
of isopentenyl
pyrophosphate isomerase
and
geranylgeranyl
pyrophosphate
synthase
from
capsicum
chromoplasts by affirlity chromotography. Biochim. Biophys.
Acta (1987), 920, 140-148

drLICle 4
140
BlOchlnl/ca et BUll'hl's/ca Acta 920119R71140-141\\
EI~c'ler
BBA 52605
Purification of isopentenyl pyrophosphate isomerase
,1
"
and geranylgeranyl pyrophosphate synthase from Capsicum chromoplasts
by affinity chromatography •
Il
Odette Dogbo and BilaI Camara
lAboratoire de Biochimie du Développement Végétal. Equipe de l'UA. 1180 C.N.R.S.. Université Pierre et Marie CuTte.
Paris (France)
(Received 30 January 1987)
Key words: Terpenoid synlhesis; Gerany1geranyl pyrophosphate synlhase: 1sopenlenyl pyrophosphale isornerase:
Prenyltransferase; (Capsicum chromoplasl)
A procedure based on affinity chromatography ",as used for the purirication to homogeneity of isopcnten)'1
p)'rophosphate isomerase and geranylgeranyl pyrophosphate synthase from Capskum chromoplasts. Iso-
pentenyl pyrophosphate isomerase is a monomeric protein and has a molecular weight of 33500 ± 500. The
Michaelis constant for isopentenyl pyrophosphate "'as 6 #lM. Geranylgeranyl pyrophosphate s)'nthase has a
native molecular ,,'eight of 74000 ± 2000 resulting from the association of two apparently identical'subunits
having a molecular weight of 37000 ± 1000. The dimeric structure of geran)'lgeranyl pyrophosphate synthase
was confinned using a photolabile analog of geranyl p)'rophosphate (2-diazo-3-binuoropr~pionylox)'geranyl
pyrophosphate). Geran)'lgeranyl p)'rophosphate s)'nthase catalyzed the prenyl transfer reaction using iso-
pentenyl pyrophosphate (Km =3 #lM) and either dimeth)'lall)'1 p)'rophosphate (Km =0.95 #lM). geran)'1
pyrophosphate (Km = 1 #lM) or famesyl pyrophosphate (Km = 1.2 #lM) as allylic partners. The three prenyl
transfer reactions were inhibited when the enz)'me was irradiated "ith the photolabile analog of geranyl
pyrophosphate.
1ntroduction
synthase are particularly important
from
the
standpoint of their roIes in the biogenesis of plas-
In plants, isopentenyl pyrophosphate isomerase
tid terpenoids (carotenoids. chlorophylls. pl asto-
(EC 5.3.3.2) and geranylgeranyl pyrophosphate
quinones. tocopherols. phylloquinones. kaurene.
etc.) and several diterpene metabolites. (The terrn
synthase was introduced for enzymes which are
• This paper is dcdicalcd 10 Professor Claude CosIes.
not ATP-dependent. in agreement with the Rec-
Abbrcvialions: APP. aminophenelhyl pyrophosphale; DATFP.
ommendations (1984) of the Nomenclature Corn-
2-diazo-3-lrinuoropropionyloxy; Df\\I!APP. dimelhylallyl pyro-
mittee of the Union of Biochemistry. GGPP syn-
phosphale: FPP. Carnesyl pyrophosphale: GGPP. geran)'l-
gerany1 pyrophosphale; GPP. geranyl pyrophosphale. IPP. iso-
thase reported in this work displayed: dimethylal-
penlenyl pyrophosphale: HPLC. high performance Iiquid chro-
Iyl transferase activiiy. 2.5.1.1; geranyl transferase
malography.
activity. 2.5.1.10: and farnesyl transferase acti\\;ty.
2.5.1.30.) Though sorne properties of these en-
Correspondence: B. Camara. Laboraloire de Biochimie du
zymes have been described using partially purified
Développemenl Végélal. Equipe de l'UA 1180 C.N.R.S.. Uni-
versilé Pierre el Marie Curie. 4 place Jussieu. 75252 Paris
preparations [1-3]. no purification to homogeneity
Cédex 05. France.
of these enzymes has been reported. In view of
0005-2760/87/$03.50 ,f~ 1987 Elsevier Science Publishers B.V. (Biomedical DiviSIOn 1

1':1
this. an approach to purifying these enzymes to
was from a previous stock (14]. while the tritiulll-
homogeneity has been made by exploiting sorne
labelled dcrivative was prepared as described pre-
properties gained from previous studies on iso-
viously
[18].
8-[8- ~ H ]DA TFP-geraniol
(48
pentenyl
pyrophosphate
isomerase
and
pre-
mCijmmol) and the non-labelled equivalent Were
nyltransferases.
synthesized [19.20] and phosphorylated as rc.
Il has been shown that the binding of sub-
ported earlier (16].
strates to the active site of isopentenyl pyrophos-
Coupling procedure. Since an arylamine deriva-
phate isomerase [4,5] and farnesyl pyrophosphate
tive was used as a ligand. we decided to adopt the
synthase (6-8] is mainly controlled by the pyro-
standard coupling method using diazonium salts
phosphate group and that these enzymes accept
[21,22]. This method usually promotes hydro-
modified alkyl chains.
In addition. extensive
phobic interactions but it offers several
ad-
investigations on the properties of farnesyl pyro-
vantages. one of them being the rigidity of the
phosphate synthase have shown the existence of
ligand linkage, a property particularly useful for
homoallylic and allylic sites in this enzyme [8].
small ligands such as the one used in this study. 2
The allylic site, in contrast to the homoallyic site,
g of AH-Sepharose 4B were suspended in 0.2 ~1
shows a broad specificity with respect to the hy-
NaCI (20 ml) and after additional standing at
drocarbon moiety of the substrate [8-11]. Further-
room temperature for 4 h, p-rùtrobenzoylazide
more, isopentenyl pyrophosphate, the normal ho-
(1.25% in tetrahydrofuran, 20 ml) was added. To
moallylic substrate of FPP synthase, can occupy
this mixture, 200 ILl of triethylamine were added
either the homoallylic or the allylic site [8]. Such
over a period of 45 min. At the completion, the gel
detailed studies were not performed with GGPP
was washed successively with 50 ml of tetrahydro-
synthase, which seems more stringent with respect
furan/0.2 M NaCl (1 : l, v/v) followed by 50 ml
to the hydrocarbon chain (10,12].
of dimethylformamide and finally 0.2 M NaCI.
Based on the above considerations and the
Aliquots of the modified gel were withdrawn to
successful affinity chromatography purification of
monitor the disappearance of the amine group of
FPP synthase (13], we reasoned that inhibitor
Sepharose 4B according to the trinitrobenzene-
mimicking the normal homoallylic substrate (lPP)
sulfonic acid (TNBS) method [22]. The resulting
could help in the purification of GGPP synthase
product was suspended in 0.2 M NaCI (45 ml)
and IPP isomerase. A precedent to this was the
and, after addition of acetic anhydride (500 }lI).
efficient
inhibition of phytoene synthesis by
the mixture was gently stirred for 30 min. the pH
aminophenethyl pyrophosphate [14]. an analog to
being continuously adjusted to 6.5, before reduc-
IPP [15]. Accordingly, we used aminophenethyl
tion with Na 2S204 (2.25 g) for 45 min at 50 cc.
pyrophosphate as a ligand for affirùty chro-
The resulting product was washed with 0.2 ~1
matography purification of IPP isomerase and
NaCl and gave a bright orange color after Tl'BS
. GGPP synthase from chromoplast stroma. which
analysis. For diazotization. the gel was suspended
is an active site of phytoene synthesis {16,17].
in 1 M HCI kept at 0 0 C before the addition oi 0.1
vol. of 1 M NaN02 followed by gentle mixing for
Materials and Methods
20 min at 0 0 C. The resulting gel was rapidly and
thoroughJy washed with 0.2 M NaCI before resus-
Chemicols. AH-Sepharose 4B. DEAE-Sephacel
pension in 0.1 M borate buffer (pH 8.5) and
and Sephacryl S-200 were purchased from Phar-
addition of a saturated solution of aminophenethyl
macia France. Ali other chemicals used in the
pyrophosphate dissolved in the same buffer. Fi-
different synthetic procedures were purchased
nally, the resulting mixture was gently stirred
from Aldrich, Sigma or Fluka. [1_14C]IPP (56
overnight at 4 0 C. At the completion. 0.2 vol. 0f 3
mCijmmol) and sodium eH]borohydride (10
M NH 4Cl and 0.2 vol. of 1 M NH 40H were
Cijmmol)
were
respective1y
from
Amersham
added before washing the product with 0.1 ~
France and C.E.A. France. Allylic and homoal-
borate buffer (pH 8.5). The main steps of the
lylic substrates were prepared from the parent
reaction conditions and the structure of the gel are
terpenols (16). Aminophenethyl pyrophosphate
shown in Fig. 1. No altempt was made lO de-

14~
~""(CH')'.H'
containing
]0%
glycerol
and
2
mM
2-
mercaptoethanol (buffer B) and applied to the
aminophenethyl pyrophosphate-Sepharose 48 af-
finity column (0.6 X 4 cm) equilibrated with buffer
O:N-Q-CON3
25'C
B containing 1 mM MgCl 2• The elution procedure
1
was as shown in the Results and Discussion sec-
Na2S204
50 ·c
tion. Before determination of the enzymic activity,
1
the fractions containing inorganic pyrophosphate
HCI/ NaN02
0 ·c
1
were dialyzed against buffer B.
~opp
Gel exclusion
chromatography.
For the de-
termination of native molecular weight, purified
IPP isomerase and GGPP synthase (0.5 ml) \\liere
1
NH2
loaded on a Sephacryl S-200 column (1 X 40 cm)
equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8)
containing 1 mM dithiothreitol, 0.2 M KCI and
30% g1yceroJ. Proteins were eluted with the same
buffer. Marker proteins shown in the Results and
Discussion section were run according to the same
Fig. 1. Synlhesis and slruclure of aminophenelhyl pyrophos-
conditions. The void volume was deterrnined with
phale-coupled Sepharose 48.
blue Dextran 2000. The elution profile \\lias fol-
lowed by plotting the absorbance at 280 nm or
determination of enzymic activity.
termine the exact pOSl11On of the spacer arm on
Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel elec-
the phenyl ring of aminophenethyl pyrophos-
trophoresis. Slab gels with a discontinuous buffer
phate. The extent of coupling as determined with
system were prepared essentially according to the
(3H]aminophenethyl pyrophosphate was 7 Il mol of
method of Hames [24] except that a linear gradi-
aminophenethyl pyrophosphate per où of wet gel.
ent of polyacrylafiÙde 10% (containing 8% sucrose)
Between runs, the column was kept in 10 mM
to 17.5% (containing 16% sucrose) was used for
Hepes buffer (pH 7.6) containing 0.05% NaN3.
the resolving gel. Prior to electrophoresis. samples
Enzyme preparation. Chromoplast stroma pre-
containing KCl were dialyzed against 50 mM Tris-
pared from Capsicum annuum fruits (16] was frac-
HCI
buffer
(pH
8)
containing
2
mM
2-
tionated by four sequential additions of 0.2 vol. of
mercaptoethanol and 5 I1M phenylmethylsulfonyl
50% (w/w) solution of poly(ethylene glycol) 6000
nuoride or precipitated with 10% trichloroacetic
in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6) containing 2
acid followed by ·two diethyl ether washes, to
mM 2-mercaptoethanol (23]. After each addition,
. avoid sodium dodecyJ sulfate precipitation. Gels
the homogenate was equilibrated at 4 0 C for 30
were e1ectrophoresed untiJ the bromophenol blue
fiÙn berore centrifuging at 100000 X g. At comple-
dye reached the end of the gel (18 hl. Proteins
tion, the pellet designated the poly(ethylene gly-
were detected
using the standard Coomassie
col) fraction was resuspended in 50 mM Tris-HCl
staining procedure (24] or the ammoniacal silver
buffer (pH 7.6) containing 30% glycerol and 5 mM
procedure (25].
dithiothreitol (buffer A). This fraction was applied
Enzyme ossoys and analysis of produccs. During
to several DEAE-Sephacel columns (1.5 X 12 cm).
the first steps. IPP isomerase and GGPP syntha~
The columns were equilibrated with buffer A.
behaved as integral components of the phytoene
Residual poly(ethylene glycol) and unadsorbed
synthetase enzyme complex. Therefore. we used
proteins were eluted with the wash buffer (buffer
only IPP as a substrate and followed its enzyfiÙc
A). Adsorbed proteins were eluted using an NaCI
incorporation ioto the appropriate metabolites.
gradient as described in the Results and Discus-
For this reason, the following incubation medium
sion section_ The active fractions were pooled.
(1 ml final volume) was used: 2 mM MgCI 2• 1
dialyzed against 50 mM Tris-HCI buffer (pH 7.6)
mM MnCl]. 5 mM dithiothreitol. 1 mM ATP. 50

1.: :
mM Tris-Hel (pH 7.6), 200 pg Tween-80. [1-
mixture (0.2 ml final volume) containing: 2 m\\1
14C]IPP (0.1 pCi. 10 pM) and a definite amount
MgCI~. 1 mM MnCI~. IPP (1 nmol) and 50 m\\1
of enzyme. ATP is not directly involved in the
borate buffer (pH 8). The rcsulting .mixture Wa~
synthesis of phytoene from IPP but it stimulates
kept at 4 0 C and irradiated for 5 min using a
the reaction in partially purified preparations.
Mineralight lamp enùtting at 254 nm. The pellet
Likewise, the addition of Tween-80 stimulates this
obtained after 10% trichloroacetic acid precipita-
reaction. After incubation at 30 0 C for 4 h, the
tion followed by two diethyl ether washes wa~
reaction products were analyzed as described pre-
subjected to sodium dodecyl sulfate-polyacryl-
viously [14,16].
amide gel e1ectrophoresis as shown above. At
After dissociation of the phytoene synthase en-
completion the gel was impregnated with a scintil-
zyme complex, which occurred during chromatog-
lation
cocktail
(EN 3 HANCE,
New
England
raphy on the affinity column, IPP isomerase and
Nuclear), vacuum-dried onto a Whatman 3 M\\1
GGPP synthase were assayed separately. The re-
filter paper and processed for nuorography using
action mixture for IPP isomenlse contained, in a
Kodak X Omat film according to the instruction
total volume of 0.2 ml: 0.02% bovine serum al-
manuaI. GGPP synthase (20 pg) was inactivated
bumin, 2 mM MgCI
as described above except that 2 nmol of non-
2,
2 mM dithiothreitoI, 50
mM Tris-HCI buffer (pH 7.6), [1- 14 C)lPP (0.1
labelled DATFP-GPP was used in the incubation
pCi, 10 pM). The incubation was initiated by
medium. After irradiation the enzymic acti\\ity
adding the enzyme to the temperature-equilibrated
was determined as described above for GGPP
reaction mixture (30 0 C). After 10 min of incuba-
synthase.
tion, the reaction was terminated routinely by
adding 0.5 ml of ehtanol and 0.1 ml of 6 N HCI.
Results and Discussion
Following incubation at 37 0 C for 10 min the
reaction mixture was neutralized with 6 N NaOH
Iso/ation of [PP isomerase and GGPP synrhase
and, after addition of 1 ml H 0. the mixture was
2
Chromoplast stroma obtained after osmotlc
extracted with 4 ml diethyl ether before de-
shock of isolated chromoplasts contains unspeciilC
termination of the radioactivity in 0.2 ml of the
phosphatase or prenyl pyrophosphate hydro1a.se
diethyl ether phase. The reaction mixture for
activities [14]. Though this effect JTlÏght be 2.t-
GGPP synthase conlained, in a total volume of
tenuated or aboli shed at the low working tempe,3-
0.2 ml: 2 mM MgCI
ture (4°C), we decided to fractionate the stromal
2 ,
1 mM MnCI 2, 2 mM
dithiothreitol, 50 mM Tris-HCI (pH 7.6), [1-
proteins before affinity chromatography. in order
'4C]IPP (0.1 #LCi, 10 #LM), 15 #LM DMAPP, GPP
to avoid any hydrolysis of the pyrophosph2.le
or FPP (unless otherwise specified). After incuba-
group of the ligand. For this reason, the strolT.,jl
tion for 20 min at 30 ° C, the reaction was stoPPed
proteins were subjected to poly(ethylene glycol)
as shown for IPP isomerase and 0.2 ml of the
precipitations
before
chromatography
on
a
diethyl ether phase was counted for radioactivity
DEAE-Sephacel column. According to the con·
by Iiquid scintillation. The nature of the reaction
centration of proteins in the starting homogem. te.
products derived from the assay methods in-
the fraction with the highest specifie activity \\'.2S
dicated above was ascertained after phosphatase
obtained after three to four precipitations. A ty"?i-
hydrolysis and chromatography of the total lipid
cal elution profile of the poly(ethylene glycol)
extract containing free or esterified prenoIs [14,16].
fraction is shown in Fig. 2. Under these condi-
Unspecific phosphatases were assayed spectro-
tions. the active fractions were nearly devoid of
photometrica1Jy using nitrophenylphosphate as
unspecific phosphatase or prenyl pyrophospha te
substrate [14]. Protein concentration
was de-
hydrolase activities. which eluted in fractions 5- :0.
termined by the dye binding method [26] using
The active fractions eluted from this column still
bovine serum albumin as standard.
exhibited phytoene synthetase activity from IPP as
Photoaffinity
/abelling.
8-[8- 3 H]DATFP
(0.2
substrate
without
detectable
accumulation
of
/LCi) was incubated in a quartz tube with 50 #Lg of
DMAPP or prenyl pyrophosphates below C :0'
purified geranylgeranyl synthase in a reaction
Therefore. on this anion-exchange column. 1pp

1.0
phytoene. GGPP and an unidentified prenyl de-
E
o
~
rivative (Fig. 2).
'"
The active fractions from the DEAE-Sephacel
O.,
column (fractions 27-33) were pooled and an
aliquot was applied to the aminophenethyl pyro-
phosphate-Sepharose column (Fig. 3). This step
O,.
o.• ri

~
:
,0.3
..
dissociated the phytoene synthetase enzyme com-
~~I 0.2
ft,
2
plex. and as a consequence IPP isomerase and
z.o
~
['
K
GGPP synthase were e1uted separately (Fig. 3). as
I - - - - J
.....
u
04
;
~
~
shown by the unambiguous characterization of
4~
DMAPP and GGPP (Fig. 4. IPP isomerase was
i \\
t,(
.~li
eluted after a slight increase of the ionic strength
<l
0.2
of the buffer (Fig. 3). When the column was
,".
;
).'6
overloaded. the first fractions (1 and 2) exhibited
..f \\~4./·..:
'.. 9jI
.J '.
IPP isomerase activity which was contaminated. as
o
.....-.-.&-
.-6
...
.&~.'1.,_ .•
0
dctected
after
sodium
dodecyl
sulfate-poly-
40
acrylamide gel electrophoresis (resuIts not shown).
The contaminating polypeptides were easily re-
Fig. 2. lon-exchange chromatography of the poly(ethylene
glycol) 6000 fraction on a DEAE-Scphacel column. The col-
moved after a second passage of these fractions on
umn was cquilibratcd wilh 50 mM Tris-HCI burrer (pH 7.6)
the affinity column. These data are probably due
containing 5 mM dilhiolhreitol and 3O't g1ycerol (buffer A)
to the fact that under the chromatography condi-
and the same burrer was used 10 elute unadsorbcd proleins.
tions. IPP isomerase is loosely bound to the col-
Ihen incrcasing concenlralions of NaCI in buffer A were
umn. Indeed. it was possible to elute IPP iso-
applicd as shown. Fractions (2 ml) were collcclcd. For ail Ihe
aClive fractions.. IPP isomerase and GGPP synlhase elutcd as
integral components of Ihe phylocne synlhetase enzyme corn-
plcx. The total radioactivity incorporated from IPP (e) and the
radioaclivity incorporalcd into GGPP (_) and phylocne (O)
...ere plOllcd. The prolein contenl (6) was delermincd by Ihe
absorbance al 280 nm.
isomerase. GPP synthase. FPP synthase. GGPP
synthase. GGPP-geranylgeranyI transferase and
phytoene synthase eluted together like an enzyme
complex as shown previously after gel exclusion
chromatography on Sephacryl S-300 [23]. This be-
haviour made difficult the exact deterrnination of
IPP isomerase and GGPP synthase. Furthermore.
our enzyme preparation also remained undissoci-
Fig. 3. Arrinity chromalography of Ihe aclive fractions eluled
ated when applied to a DEAE-cel1ulose column
from Ihe DEAE-Scphacel column. The active fraclions from
equiIibrated and processed according to Islam et
the DEAE·Scphacel column were p001ed. dialyzcd againsl 50
al. [27]. This behaviour c1early contrasts with phy-
mM
Tris-HCI
buffer
(pH
7.6) conlaining
2
m~i
2-
toene synthetase from Lycopersicon. which has
mercaplocthanol and 10% gI yce roI (burrer B). The resuhing
solulion was adjuslcd 10 1 mM MgCI
been shown to dissociate after anion-exchange
1
and appücd 10 Ihe
aminophenelhyl pyrophosphale arrinily column. The active
chromatography [27]. Since at this stage any pro-
fraclions were elulcd using buffer B supp1emenlcd ...;th ~aCI
cedure for the exact determination of IPP iso-
or sodium pyrophosphale (PP,) according 10 Ihe sequence of
merase or GGPP synthase must take into account
sleps shown in Ihe figure. The protein conlent (.a.) "'as de-
this phenomenon. we determined the radioactivity
lennined according 10 Hames 1241: IPP isomerasc (., and
in the different end products including mainly
GGPP synthasc (0) ...ere assayed as describcd in the te,,\\.

145
2
@
merase from this column using the wash buffer.
However, in this case the elution time required
E
c
was longer than in the presence of NaCI. Since we
~
..q
have shown that aminophenethyl pyrophosphate
inhibits IPP isomerase [14], we interpret this result
as showing that the phenethyl moiety weakens the
interaction with the enzyme. This agrees with data
[4,28] showing that the inhibitory potency of in-
'il
1
5
organic pyrophosphate on IPP isomerase is re-
duced by alkylation.
4
6
The enzymic fraction corresponding to GGPP
fi
synthase was more tightly bound to the column
..
and eluted after the addition of inorganic pyro-
3
12
phosphate into the wash buffer (Fig. 3). An over-
ail scheme of the purification procedure is sum-
E
®
c
marized in Table 1.
0
~
When the purified IPP isomerase was kept in
q
- - - 1
50 mM Tris-HO buffer (pH 7.6) containing 2 m\\1
5
20
Retention time ,min.
2-mercaptoethanol,
1
mM
MgCI
and
lOtt
2
glycerol, a 50% loss of activity was observed after
Fig. 4. HPLC of the products of IPP isomerase incubatcd with
IPP and GGPP synthase incubated with IPP and DMAPP (the
one freeze-thaw cycle at - 20 0 C. On the other
pattern was the samc when GPP or FPP was used). The
hand, the purified GGPP synthase was stable un-
products obtained after cnzymatic hydrolysis were mixed wilh
der these conditions.
unlabelled standards beforc separation on a p.C 18 Bondapak
column. The numbers above the trace refer to: (1) Farnesol. (2)
Mo/ecu/ar weighr and puriry
geranylgeraniol. (3) phytol, (4) solanesol, (5) phytoene. (6)
isopenlenol esterified with naphthoic acid. and (7) dimethylal-
The native molecular weight of IPP isomerase
Iyl alcohol eSlerified Wilh naphthoic acid. The sol vents used
and GGPP synlhase were estimated from their
from
top (A)
to bottom (B)
were
melhano1jhexane/
elution profile on Sephacryl S-200 gel chromaIOg-
cyclohexane (80: 10: 10. v/v) and acetonitrile/H 20 (60: 40.
raphy using protein markers (Fig. 5). With the
v/v). The flow rate was 1 ml/min.
TABLE 1
, PURIFICATION OF ISOPENTENYL PYROPHOSPHATE ISOMERASE AND GERANYLGERANYL PYROPHOSPHATE
SYNTHASE
Since IPP isomerase and GGPP synthase were not separated during the first steps of the purification procedure (chromoplast stroma.
poly(elhylene glycol) (PEG) fractionation. DEAE-Sephacel). the incorporated radioaclivity wa.~ arbitrarily normalized 1O :he
lheoretical ralio of DMAPP and IPP in the products. DMAPP was used as the allylic panner for the prenyltransferase. The sP\\:'-,flc
acti'üy is expressed as nmol of IPP incorporated (nmol, h -l, mg -1 protein.)
Enzyme
Fractions
Total protein (mg)
Specific activity
Purification
1pp isomerase
Chromoplasl stroma
451
1.4
PEG fraction
54
6.8
4.8
DEAE-Sephacel
13.5
21
15
APP-Sepharose
0.339
372.4
266
GG pp synthase
Chromoplast stroma
451
2.4
PEG fraction
54
11.8
4.9
DEAE-Sephacel
13.5
35.6
14.8
APP-Sepharose
0.367
1019
424.6

146
10

4 ~GPP
~ASE
...
®
_94xlO-3
..
3.""
... _67
5
•S2
)(
2.~
IS~RASE
- - -- - _43
~
:I:
~
w
...
~
_30
a:

~
c(
..J
1 " ' "
:> 2
..
0
W
_20.1
..J
0
~
..-. _14.4
1
1
Fig. 5. Estimation of the native molecular weight of IPP
isomerase and GGPP synthase on Sephacryl S-200. Numbers
are the calibrating protiens: (1) chymotrypsinogen A. M, =
@
.... _94xl0-3
25000; (2) ovalbumin. M, = 43000; (3) albumin, M, = 67000;
..
(4) phosphoryIase b. M, = 97400. The void volume was de-
termined with blue Dextran 2000. The calibration curve was
_67
made by plotting log (M,) of the reference standards versus
..
V./Vo, where V. is the eIution volume and Vo the void volume.
_43
+
-- -30
assumption that these enzymes were globular pro-
teins, the native molecular weights were 33500 ±
500 for IPP isomerase and 74000 ± 2000 for GGPP
-- _20.1
synthase.
~ _14.4
Sodium
dodecyl
sulfate-polyacrylamide
gel
electrophoresis revealed in both cases a single
polypeptide (Fig. 6). The molecular weight de-
termined by sodium dodecyl sulfate-polyacryl-
amide gel electrophoresis was 33500 ± 500 for IPP
Fig. 6. Sodium dodecyl sulfate electrophoresis in a lO-li.5'i
isomerase and 37000 ± 1000 for GGPP synthase
polyacrylamide gel of IPP isomerase and GGPP synthase
purified by the affinity column. A. IPP isomerase; B, GGPP
(Fig. 6). The minor band detected in the over-
synthase (G) and autoradiography (G·) of GGPP synthase
loaded slot containing GGPP synthase has no
site-affinity-Iabelled with the photoprobe eHIDATFP-GPP.
catalytic activity and was probably due to artifacts,
Migration was from top to bouom. The following molecular
as may be seen also in the slot containing marker
weighl markers were used (from top to bouom): phosphorylase
proteins. For GGPP synthase, we exploited the
b. albumin. ovalbumin. carbonic anhydrase. trypsin inhibuor.
a-1actalbumin.
fact that this enzyme accepts GPP as an allylic
partner for the condensation reaction, to photoaf-
finity label the active site with OATFP-GPP. Un-
rography c1early demonstrated that incorporated
der these conditions, sodium dodecyl sulfate-poly-
radioactivity was almost exclusively located in a
acrylamide gel electrophoresis followed by nuo-
polypeptide giving an M, = 37000 ± 1000 which

147
corresponded exactly 10 one subunil of GGPP
cnzymic aetivity with DMAPP. GPP or FPP as
synlhase (Fig. 6) and 10 a negligible extent in
allylie partners. The results obtained showed that
areas containing unspecific products which ohen
under these conditions DMAPP, GPP and FPP
arise during fluorography of affinity-Iabelled pro-
were no longer used for condensation. These data
teins. From these data, we conclude that native
support a common binding site for these allylic
IPP isomerase has a monomeric structure while
substrates and raise important questions concern-
GGPP synthase is a dimeric protein. Il has been
ing the existence of different prenyltransferases
shown that mammal and Claviceps IPP isomerases
involved in the formation of terpenyl derivatives
are monomeric proteins [28] while FPP synthase
lower than C20 , which occurs in leucoplasts [35].
from mammal [29,30] and yeast [31] are dimeric
proplastids [36], or sometimes during in vitro in-
proteins; to this may now he added our results
cubation of isolated plastids with isopentenyl py-
from plant enzyme.
rophosphate. An alternative possibility couId be
that these reactions are catalyzed by the same
Substrate specificity and some properties
prenyltransferase regulated at the level of the
When the reactions were carried out at dirrer-
terrnination of the prenyl transfer reaction. Con-
ent pH, an optimum zone was observed at 7-8. In
sistent with this, it is worth noting that leucoplasts
the range of protein concentration used (0-25 I1g),
which synthesize essentially monoterpenes are a1so
Iinearity was observed. In accord with earlier find-
able to catalyze the formation of GGPP [37].
ings [28,32], the presence of bovine serum albumin
Furthermore, it has been shown that mammal and
in the incubation medium gave hetter linearity in
yeast farnesyl pyrophosphate synthases under
the case of a low concentration of IPP isomerase.
constrained conditions synthesize GGPP [29,31].
IPP
isomerase
was
totally
devoid
of
pre-
Another notable feature was the demonstration
nyltransferase activity and exhibited a Km value
that a partially purified bacterial solanesyl pyro-
of 6 I1M for IPP. GGPP synthase was totally
phosphate synthase formed .prenyl pyrophos-
devoid of IPP isomerase activity and catalyzed the
phates with different chain lengths according to
synthesis of GGPP using IPP (Km = 3 I1M) and
the concentration of magnesium in the incubation
either DMAPP (Km = 0.95 I1M), GPP (Km = 1
medium [38].
I1M) or FPP (Km = 1.5 I1M). These results con-
In addition, using a rnild dissociation proce-
Jrast with those obtained from partially purified
dure. studies in our laboratory demonstrate that in
GGPP synthase from Ricinus communis which
Capsicum annuum stroma, GGPP synthase is
used only GPP or FPP as allylic partners [33].
non-covalently but always associated with IPP
We have not detected prenyltransferase specifi-
isomerase or phytoene synthetase enzyme complex
cally involved in the formation of CIO or C
(Dogbo, O. and Camara, B., unpublished). lbis
15
prenyl derivatives as end products, in good agree-
behaviour, talcen in connection with the fact that
ment with partially purified GGPP synthase from
the phytoene synthetase aetivity was readily disso-
Cucurbita [2] and Micrococcus Iysodeikticus [34].
ciated after chromatography on the affinity col-
Therefore, we condude that GGPP synthase iso-
umn in contrast to colurnn loaded with conven-
lated from plastids catalyzes the formation of
tional gels, suggests that physical interactions oc-
GGPP through the intermediacy of GPP and FPP,
CUTTed hetween the different components of the
but in normal conditions GGPP is probably the
complex. Under these conditions one may imagine
first product leaving the active site. The fact that
that, in vivo, IPP is readily channeled towards the
GGPP synthase has high affi nity for DMAPP,
synthesis of GGPP. Consistent with this view is
GPP and FPP adds support to this view. lbis
the involvement of GGPP in carotenoid bio-
hypothesis supposes that DMAPP, GPP and FPP
synthesis and the preferential prenylation of plas-
couId bind to the same active site. In order to
tid terpenoids (chJorophylls, tocopherols, phyllo-
obtain sorne insight into this fact, advantage has
quinones) with GGPP or its reduced derivative.
been talcen of the ability of GGPP synthase to use
Finally, a procedure has been developed which
GPP to affinity-Iabel the active site with the pho-
allows, for the first time, the purification to homo-
toprobe DATFP-GPP before determination of the
geneity of plant IPP isomerase and GGPP syn-

148
thase. The latter has dimethylallyl. geranyl and
15 Brems. D.N. and Rilling, H.C. (1979) Biochemisll)' 18
f~rnesyl transferase activities. The method pro-
860-8M
.
VIdes the means for further study of mechanism,
16 Cama ra. B. (1985) Melhods Enzymol. 110.244-253
17 Kleinig, H. and Beyer, P. (1985) Melhods Enzymol. 110
structure and biogenesis of these important en-
267-273
.
zymes in relation to plant development.
18 Rilling, H.C (1985) Melhods Enzymol. 110, 125-130
19 Allen, C.M.
and
Baba.
T. (1984)
Biochemislrv
::3.
Acknowledgements
1312-1322
.
20 Baba, T., MUlh, J. and Allen, CM. (1985) J. Biol. Chcm.
260,10467-10473
We thank the P.J. foundation for financial sup-
21 Cualrccasas, P. (1970) J. Biol. Chem. 245, 3059-3065
port.
22 Inman, J.Ie. (1974) Melhods Enzymol. 34, 30-58
23 Camara, B. (1985) Pure Appl. Chcm. 57, 675-677
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26 Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254
1101-1108
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S. (1969) J. Biochem. 66, 117-118
5 Koyama, T., Ogura, K. and Selo, S. (1973) J. Biol. Chcm.
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Acta 661,87-90
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31 Eberhardt, N.L. and Rilling, H.C (1975) J. Biol. Cho=
(1969) Biochem. J. 111, 333-343
250, 863-866
7 Ogura, K., Nishino, T., Koyama, T. and Selo, S. (1970) J.
32 Fujisaki, S., Nishino, T. and KalSuki, H. (1986) J. Bioche.n.
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Physiol. 81, 343-348
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34 Kandutseh, A.A., Paulus, H., Lcvin, E. and Bloch. K.
9 Ogura, K., Koyama, T. and Selo, S. (1972) J. Chem. Soc.
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Chem. Comun., 881-882
35 Gleizes. M., Pauly. G .. Carde, J.P., Marpcau. A. and
10 Koyama, T., Ogura. K. and Selo, S. (1973) Chem. Leu.,
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36 Dudley, M.W., Dueber, M.T. and Wesl. CA. (1986) P~I
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37 Gleizes. M., Camara. B. and Waller, J. (1987) Planla i "0.
12 Shinka. T., Ogura, K. and Selo, S. (1975) J. Biochem. 78,
138-140
1177-1181
38 Fuji. H.• Sagami. H., Koyama, T.• Ogura. K.. SelO. S..
13 Banleu, D.L., King, CH.R. and Poulier, CD. (1985)
Baba, T. and Allen. CM. (1980) Biochem. Biophys. Res.
Methods Enzymol. 110, 171-184
Commun. 96, IM8-1653
14 Dogbo. O., BardaI, F., Quennemel, J. and Camara. B.
(1987) FEBS Leu. 210, 211-215

34
COMMENTAIRE DE L'ARTICLE 4
Les
travaux
déjà
effectués
sur
le
stroma
de
chromoplastes
de
poivron
ont
montré
que
ce
dernier
contient un
complexe enzymatique
capable de réaliser
la
synthèse du
phytoène à
partir de
l'IPP (CAMARA et
al.,
1982a,
1982b;
LAFERRIERE,
1983).
Nous venons de
montrer
aussi que
ce complexe
est responsable,
d'une part,
des
activités IPP isomérase (responsable de l'isomérisation de
l'IPP en DMAPP)
et GGPP synthase (catalysant
la synthèse
du GGPP,
intermédiaire
en
C20), et,
d'autre
part,
de
l'activité phytoène
synthase utilisant cet
intermédiaire
en
C20 pour
réaliser
la
synthèse
proprement
dite
du
,
phytoène. De
ces
informations,
il
ressort
donc que
la
synthèse du
phytoène par le
stroma fait intervenir
deux
groupes
d'enzymes
les
enzymes
responsables
de
la
synthèse des prénylpyrophosphates et
celles qui président
à l'incorporation
de
ces
prénylpyrophosphates
dans
le
phytoène. A partir de stroma nous avons purifié chacune de
ces enzymes
et déterminé
les caractéristiques propres
à
chacune d'elles.

35
A / Différentes étapes de purification des enzymes
intervenant dans la synthèse des prénylpyrophos-
phates :
IPP isomérase et GGPP synthase
L'utilisation de
supports
classiques
tels que
les
échangeurs d'ions (DEAE sephacel ou DEAE cellulose) ou les
tamis moléculaires (séphacryl 5-300) ne nous
a pas permis
de dissocier les enzymes de ce complexe.
Par
ailleurs,
au
cours
des
expériences
sur
la
synthèse
du
phytoène,
nous
avons
montré
que
l'aminophénéthylpyrophosphate,
analogue de
l'IPP, entrait
en
compétition avec
ce dernier pour
les sites actifs
de
l'IPP
isomérase auxquels il se fixe.
Nous
avons montré en
outre
que
la
GGPP
synthase
est
également
capable
d'utiliser
l'IPP et
le DMAPP
comme substrats.
Utilisant
l'ensemble
de ces
données,
nous avons préparé
et utilisé
une
colonne
d'affinité
utilisant
l'arninophénéthyl-
pyrophosphate
comme ligand. Ce support a
pour avantage de
fixer
sélectivement
les
enzymes
(IPP
isomérase,
prényltransferase)
qui utilisent comme substrats,
l'IPP ou
les
prénylpyrophosphates de longueur de
chaîne supérieure
à C5 et qui peuvent par la suite être éluées séparément.
Nous
avons dans
un
premier
temps
fractionné
le
stroma
par
le
polyéthylèneglycol.
La fraction la plus

36
active
issue
de
cette
série
de
précipitations
(4ème
précipitation) est déposée sur la colonne de DEAE sephacel
(Fig. 2).
Ces étapes
préliminaires
permettent d'éliminer
les
phosphatases qui sont présentes dans le stroma brut et qui
pourraient
réduire
l'efficacité
de
la
colonne
par
hydrolyse du
pyrophosphate
du
ligand.
L'extrait
ainsi
préparé
est
déposé
sur
la
colonne
aminophénéthyl-
pyrophosphate. L'IPP isomérase
faiblement liée au
ligand
est éluée par
du NaCl 10
mM,
alors que la
GGPP synthase
n'a pu
être
éluée
que par
l'intermédiaire
du PPi
5mM
(Fig.3).
B / Caractéristiques de l'IPP isomérase et de la
GGPP synthase
l - Détermination du poids moléculaire
Les résultats obtenus
après électrophorèse
sur gel
de
polyacrylamide
en
présence
de
SDS
(fig.
6)
et
filtration
sur gel
sephacryl S-200 (Fig. 5)
montrent que
l'IPP
isomérase est un monomère d'environ 33.500 Da, alors
que
la
GGPP
synthase
est
composée
de
2
sous-unités
identiques avec un poids moléculaire d'environ 74.000 Da.
Nos résultats sont
en accord avec ceux
obtenus sur
la
farnésylpyrophosphate
synthase
isolée
de
micro-
organismes
(EBERHARD et RILLING,
1975) ou de tissus ani-
'"
, R

36
active
issue
de
cette
série
de
précipitations
(4ème
précipitation) est déposée sur la colonne de DEAE sephacel
(Fig. 2).
Ces étapes
préliminaires
permettent d'éliminer
les
phosphatases qui sont présentes dans le stroma brut et qui
pourraient
réduire
l'efficacité
de
la
colonne
par
hydrolyse du
pyrophosphate
du
ligand.
L'extrait
ainsi
préparé
est
déposé
sur
la
colonne
aminophénéthyl-
pyrophosphate. L'IPP isomérase
faiblement liée au
ligand
est éluée par
du NaCl 10
mM,
alors que la
GGPP synthase
n'a pu
être
éluée
que par
l'intermédiaire
du PPi
5mM
(Fig.3).
B / Caractéristiques de l'IPP isomérase et de la
GGPP synthase
1 - Détermination du poids moléculaire
Les résultats obtenus
après électrophorèse
sur gel
de
polyacrylamide
en
présence
de
SDS
(fig.
6)
et
filtration
sur gel
sephacryl S-200 (Fig. 5)
montrent que
l'IPP
isomérase est un monomère d'environ 33.500 Da, alors
que
la
GGPP
synthase
est
composée
de
2
sous-unités
identiques avec un poids moléculaire d'environ 74.000 Da.
Nos résultats sont
en accord avec ceux
obtenus sur
la
farnésylpyrophosphate
synthase
isolée
de
micro-
organismes
(EBERHARD et RILLING,
1975) ou de tissus ani-

37
maux (REED
et RILLING,
1975). En effet, toutes ces données
montrent que. la prény1transferase qui catalyse la synthèse
de prény1pyrophosphates
à partir de l'IPP et du DMAPP, est
composée de 2 sous-unités.
2 - Spécificité de l'IPP isomérase et de la GGPP
synthase vis-à-vis des substrats
La
GGPP synthase
qui
catalyse la
synthèse
du GGPP
à
partir
de
l'IPP
et
du
DMAPP
à travers
une
série
de
réactions
de condensation
(Fig. d)
~tilise également
le
GPP,
le FPP,
intermédiaire en C~o
et C~5 .
L'étude du K~ de chaque substrat de
la GGPP synthase
montre
que l'enzyme
présente une grande affinité
pour le
DMAPP. Ensuite viennent le GPP et le FPP.
Le fait qu'une enzyme comme la
GGPP synthase accepte
plusieurs
substrats
soulève la
question
de savoir
s'il
peut
exister,
au
sein
de
la
molécule
enzymatique,
plusieurs
types
de
sites
actifs;
chaque
type
étant
spécifique
de l'un
de ces substrats. Pour
vérifier cette
hypothèse
nous avons traité l'enzyme par
le DATFP-GPP. Ce
procédé
permet à l'ensemble DATFP - GPP de
se fixer d'une
manière
covalente sur les sites actifs spécifiques du GPP.
L'enzyme
ainsi traitée est ensuite incubée avec chacun des
substrats évoqués ci-dessus.

38
Les résultats obtenus
avec ces différents
substrats
(DMAPP,
GPP,
FPP) montrent
tous une
inhibition de
leur
incorporation
dans le
GGPP. Cette expérience
révèle donc
que
tous
les
substrats
de
la GGPP
synthase
utilisent
probablement les mêmes sites actifs.
Au terme de ce chapitre nous pouvons
conclure que la
synthèse
du GGPP,
intermédiaire en C20 et substrat
de la
phytoène synthase, fait intervenir deux enzymes:
- l'IPP isomérase catalysant la production du DMAPP à
partir de l'IPP.
- la GGPP synthase
utilisant l'IPP et le
DMAPP pour
la
synthèse du GGPP.
Cette synthèse peut être
obtenue si
l'on
fournit directement le GPP ou le FPP
à
l'enzyme. Des
résultats
analogues
viennent
d'être
obtenus
par
A.LAFERRIERE
à
partir
d'étioplastes
de
moutarde
(communicàtion personnelle).

39
CHAPITRE 4
PURIFICATION ET PROPRIETES DE LA PHYTOENE SYNTHASE
Isolation and characterization of a bifunctional enzyme
cata1yzing the synthesis of phytoene. Proc. Natl.
Acad. Sei.
(1988), 85, 7054-7058

'roc. Natl. Acad. Sei. USA
artic le 5
'01. 85. pp. 7054-7058. Oclober 1988
liochemlslry
~arotenoid biosynthesis: Isolation and characterization of a
)ifunctional enzyme catalyzing the synthesis of phytoene
(CtlplkfUJf GIIlfUIUIl/ p1astid terpenoïds/geranylgeranyl-diphosphate geranylgeranyltransferase/ pbytoene syotbase/enzyme regulation)
)DETTE DoGBO, ANDRt LAFERRIÈRE, ALAIN D'HARLINGUE, AND BILAL CAMARA*
~oire de Biochimie du Dtveloppemenl Vl!gl!lal, Associl! au Centre National de la Recherche Scienlifique. Universill! Pierre et Marie Curie, 75252 Paris
.edelt OS. France
~ommll1Ùcated by Pierre JoUot. April 28, 1988 (received for review January 28. 1988)
l.8STRACT
Phytoene is the first C
iotermediate in the
40
liogenesis of carotenoids. ft is formed by two enzyme activities,
2 ~opp
atalyzing (i) the coupling of two molecules of geranylgeranyl
.

liphospbate to yield prephytoene diphosphate and (ü) the
1
ODvenioo of
~OPP
prephytoene diphosphate ioto phytoene. We
how DOW, wilb Capsicum chromoplast stroma, that the overall
divity resides in a single protein, which has been purified to
IOmogeoeity by affinity chromatography. The monomeric
trudure and the molecular size (Mr 47,5(0) were demon-
lrated by NaDodS04/PAGE and glycerol gradient centrifu-
.ation. Further charaderization was achieved by using specific
ntibodies which a1lowed immunofractionation and immuno-
,recipitation of the enzymatic activity from chromoplast
lroma. The two readions followed conventional Michaelis-
,fenten kioetics, with Km values of 0.30 pM and 0.27 pM,
espectively, for geranylgeranyl diphospbate and prephytoene
7
liphosphate. The activity of the enzyme depends stridly upon
he presence of Mnl + • This selectivity may be one of the fadors
Phytoene
egulating the competition wilb potentially rival enzymes
Scheme 1
onverting geranylgeranyl diphosphate ioto other plastid ter-
leooids. The twet enzymatic reactions were inhibited by mor-
:anic pyrophosphate and by the arginine-specific reagent
question is whether the two activities reside on two ditTerent
Iydroxyphenylglyoxal. In no instance were the two reactions
enzymes or on the same enzyme.
.
inetically uncoupled. These properties strongly suggest that
The present paper answers this question. We show. with
he sallie enzyme catalyzes the two consecutive reactions, and
Capsicum chromoplasts, previously selected for studies of
Fe propose to name it phytoene synthase.
carotenogenesis (3, 10-12), that a single monomeric protein
catalyzes the dimerization of geranylgeranyl diphosphate
into prephytoene diphosphate and the conversion of the latter
:arotenoids are required for the normal differentiation and
unction of plastids. Phytoene, the first C
intermediate in
into phytoene. Kinetic properties of this homogeneous ca-
40
he carotenoid pathway, is synthesized by a soluble enzy-
rotenogenic enzyme are also reported. As the reactions
Ilatic complex localized in plastid stroma (1-5), by the
catalyzed by this bifunctional enzyme are tightly coupled, we
Ilultistep process outlined in Scheme I. The early steps, for
propose the name "phytoene synthase" to account for the
vhich the individual enzymes were recently isolated and
whole activity.
luritied (6), are the isomerization ofisopentenyl diphosphate
1) into dimethylallyl diphosphate (2). foHowed by three
MATERIALS AND METHODS
Irenylations forming successively geranyl diphosphate (3),
Chemicals. [l_14C]lsopentenyl diphosphate (56 mCi/mmol;
arnesyl diphosphate (4). and geranylgeranyl diphosphate (5).
llis sequence of reactions is common to ail terpenoids,
1 Ci = 37 GBq) was purchased from Amersham. [3H]Pre-
Ilcluding other plastid terpenoids (chlorophylls. plastoqui-
phytoene diphosphate (25 mCi/mmol) was synthesized as
lones, tocopherols, phylloquinones, and polyterpenes). On
described (5). [l,5,9- 14C]Geranylgeranyl diphosphate (40 mCi/
he other hand, the next two steps, in which prephytoene
mmol) was synthesized enzymatically from [1- t4C]isopentenyl
liphosphate (6) and phytoene (7) are formed, are catalyzed
diphosphate and dimethylallyl diphosphate by the action of
Capsicum chromoplast geranylgeranyl-diphosphate synthase
'y the tirst carotenoid-specific enzymes in the pathway,
entatively termed "geranylgeranyl pyrophosphate geranyl-
(6). The reaction (1.5-mI final volume) was stopped by the
:eranyltransferase" and "phytoene synthase" (7) since they
addition of 14 M NH 0H (0.1 ml), 0.25 M EDTA (0.1 ml) and
4
lave been neither isolated nor characterized previously from
ethanoJ (l ml). Geranylgeranyl diphosphate was extraeted twice
Iny other source (5, 8, 9). Therefore. the identification of the
with 3 ml of butanol. After evaporation of the organic solvent.
:nzyme components catalyzing these two steps is crucial for
labeled geranylgeranyl diphosphate was purified (13) and mixed
mr understanding of the molecular mechanism of carotenoid
with a known amount of unJabeled geranylgeranyl diphosphate.
,iosynthesis and of its regulation; a particularly interesting
Fractionation of Chromoplast Proteins and Affinity Chro-
matography. Chromoplast stroma isolated from 5 kg of Cap-
sicum annuum
fruits (13) was subjected to sequential precip-
"he publication costs of this article were defrayed in part by page charge
l8yment. This article must therefore be hereby marked .. advu'isemen'"
n accordance with 18 V.S.C. §l734 solely 10 indicale this facto
·To whom reprint requesls should be addressed.
7054

Biochemistry: Dogbo el al.
Proe. Nall. Aead. Sei. USA 85 (/988)
7055
itations with polyethylene glycol 6000 followed by DEAE-
solved in 200 p.1 of 50 mM Tris'HCI, pH 7.6/2 mM dithio-
Sephacel column chromatography as described (6). The active
threitoI/0.4% Triton X-1oo/0.06% n-octyl j3-o-glucopyrano-
fraction from the DEAE-Sephacel column, which includes the
side and applied to a Iinear 10-40% (vol/vol) glycerol density
component enzymes involved in the synthesis of phytoene
gradient (4 ml per tube) made in 50 mM Tris'HCI, pH 7.6/2
from isopentenyl diphosphate (6, 7), was collected and dia-
mM dithiothreitol. Identical gradients containing calibration
Iyzed ovemight with two buffer changes against 50 mM
proteins (aldolase, 7.35 S; bovine serum allmmin, 4.4 S;
Tris'HCI, pH 7.6/2 mM 2-mercaptoethanol/10% (vol/vol)
ovalbumin, 3.5 S; a-chymotrypsinogen, 1.95 S) were run in
g1ycerol. The dialyzed enzyme prepamtion was adjusted to 1
parallel. After 15 hr of centrifugation at 45,000 rpm in a
mM Mg2+ and applied to an aminophenethyl diphosphate-
Beckman SWSO Ti rotor, fractions (200 p.1) were collected in
Sepharose affinity column (0.8 x 10 cm) equilibrated as
a test tube. The presence of proteins in each fraction was
described (6) with 50 mM Tris'HCI, pH 7.6/2 mM 2-mercap-
toethanol/10% glycerol/l mM MgCI
determined either by enzymatic assay or by absorbance at
2 (buffer A). The column
was subsequently washed as shown in Fig. lA and the active
280 nm. Linear regression analysis ofthe relative mobility vs.
fraction was eluted with a linear gradient of NaCI (0.5-1.5 M)
sedimentation coefficient of calibration proteins was per-
in buffer A. The active fractions were pooled and dialyzed for
formed for each experiment and gave correlation coefficients
6 hr with three buffer changes against buffer A devoid of
>0.97. The subunit molecular weight was determined under
2-mercaptoethanol and Mg2 + (buffer B). After dialysis the
reducing conditions by NaDodSO../PAGE as described
~tive fraction was applied to an organomercurial agarose
above.
column (Affi-GeI501, Bio-Rad; 0.8 x 5 cm) equilibrated with
Production of Anti·Pbytoene Synthase Antibodies. Preim-
buffer B. After the column had been washed with buffer B, 10
mune IgG and anti-phytoene-synthase IgG were prepared as
mM dithiothreitol was added to elute the active fraction.
described (5) except that two additional purification steps
Enzyme Assay. Phytoene synthesis was assayed in two
involving the use of CM-Affi-Gel Blue (Bio-Rad) and DEAE-
ways. (i) During the initial steps of the purification proce-
Affi-Gel Blue (Bio-Rad) were included to eliminate contam-
dure, the high prenyl-diphosphate hydrolase activity in the
inating serum proteases. Fractions containing anti-phytoene-
stroma, and in the fraction obtained after polyethylene glycol
synthase IgG were eluted from these columns according to
fractionation, reduced the extent of geranylgeranyl diphos-
the instructions provided by the supplier.
phate incorporation into phytoene. Compounds generally
Coupling of Antibodies to Hydrazide Beads and Irnmunose-
used as phosphatase inhibitors did not significantly abolish
lection of Phytoene Synthase. Anti-phytoene synthase IgG (3
this side effect. Therefore, the reaction mixture used for the
mg) was coupled to hydrazide beads (4 g; Pierce) according
synthesis ofphytoene was 50 mM in Tris'HCI (pH 7.6),2 mM
to the instruction manual. Before immunoselection, stromal
in MgC12, 1 mM in MnCI2 , 2 mM in dithiothreitol, and 5 p.M
proteins (2 mg) obtained after the polyethylene glycol frac-
in [V"Cjisopentenyl diphosphate; to a final volume of 200 p.1
tionation and the DEAE-Sephacel column chromatography
were added 50 p.g of Tween 80 and a known amount of
were rocked for 1 hr in the presence of 10 ml of 20 mM
enzyme. After incubation for 20 min at 30°C, the reaction
products were analyzed as described (5, 13). The incorpo-
Tris'HCI, pH 7.5/0.5 M NaCI (bufferC) at room temperature
rated radioactivity was normalized to the theoretical ratio of
with uncoupled hydrazide beads (4 g) to remove materials
geranylgeranyl diphosphate in phytoene. (ii) During the
adsorbing nonspecifically. This partially purified solution
subsequent steps (DEAE-Sephacel, aminophenethyl diphos-
was then added to the antibody-hydrazide beads. After
phate-Sepharose, Affi-Ge1501 chromatography), the conver-
mixing at room temperature for 1 hr in the presence ofbuffer
sion of geranylgeranyl di phosphate to phytoene via prephy-
C, the beads were washed three times (5 min per wash) with
toene diphosphate was routinely used as the basis for the
buffer C (10 ml) containing 0.05% Tween 20. Finally, phy-
assay of enzyme activity. The reaction mixture was 50 mM
toene synthase protein specifically bound to the beads was
in Tris'HCI (pH 7.6), 2 mM in MnCI
eluted by the addition of 8 M urea (5 ml) containing 27é
2 , 2 mM in dithiothreitol,
and 2 p.M in U,5,9-1"C)geranylgeranyl diphosphate; to a final
NaDodSO... The released protein was dialyzed against 20
volume of 200 p.1 were added 50 p.g of Tween 80 and a known
mM Tris'HCI (pH 7.6) and concentrated by addition of
amount of enzyme. In some experiments with prephytoene
polyacrylate beads (17) before NaDodSO../PAGE as de-
diphosphate, the same reaction mixture was used, except that
scribed above.
geranylgeranyl diphosphate was replaced by 2 p.M [lH]pre-
Protein Blot Analysis and Immunoprecipitation. After Na-
phytoene diphosphate. Protein was measured by the method
DodSO../PAGE, separated proteins were transferred elec-
of Bradford (14).
trophoretically from the siab gel to strips of nitrocellulose
Analytical NaDodSO../PAGE. Gel electrophoresis under
paper (18) at 400 mA for 90 min at 10"C. The efficiency of
dissociating conditions was routinely performed in slab gels
transfer was followed by using prestained molecular weight
prepared as described (6). Before electrophoresis, protein
markers (Sigma). After blocking additional binding sites with
samples were denatured at 9O"C for 2 min in 20 mM Tris'HCI
3% bovine serum albumin dissolved in buffer C, the nitro-
(pH 6.8) containing 6% (wt/vol) NaDodSO.., 6% (vol/vol)
cellulose strips were probed with anti-phytoene synthase IgG
2-mercaptoethanol, 1% (wt/vol) dithiothreitol, 0.07%
(wt/vol) EDTA, and 10% (wt/vol) sucrose
(1:1000 dilution) at 5°C ovemight. The antibody solution was
(1.5 p.1 per 10 p.g
of protein). Gels were stained with Coomassie blue or silver
removed and the nitrocellulose paper was washed three times
nitrate (15).
with buffer C containing 0.05% Tween 20 and twice with
Molecular Weight Determination. Estimation of native
buffer C (10 min per wash). After this treatment, the antigen-
molecular weight was attempted by chromatography on a
antibody complex was visualized according to the "golden
Sephacryl S-2OO column (1.5 x 40 cm) equilibrated with 50
blot" procedure (19, 20) using the protein A-gold kit (Bio-
mM Tris'HeI, pH 7.6/1 mM dithiothreitol/0.3 M NaCI/30%
Rad).
g1ycerol. The standard protein markers were aldolase (M =
Immunoprecipitation of phytoene synthase from chromo-
r
158,000), albumin (M = 67,000), ovalbumin (M = 43,000)
piast stroma and sedimentation of the resulting precipitates
r
r
and a-chymotrypsinogen (M = 25,000). The eluent extinc-
were carried out as described (5). Phytoene synthase activity
r
tion was recorded at 280 nm for the standard protein markers
in the supematant was determined with [l.l"C]isopentenyl
or by enzymatic assay for phytoene synthase. As an alter-
diphosphate as the assay substrate. The crude supematant
native method, we used glycerol density gradient centrifu-
always contains ail the enzymes necessary for metabolizing
gation (16). In this case 200 p.g of purified enzyme was dis-
isopentenyl diphosphate.

7056
Biochemistry: Dogbo el al.
Proe. Nall. Aead. Sei. USA 85 (1988)
RESULTS AND DISCUSSION
and 57,000. The active fraction (indicated by the double-
headed arrow in Fig. lA) was pooled and applied to an
Purification of Phytoene Synthase. To purify the enzyme(s)
Affi-Ge1501 column (Fig. lB). Ali the activity involved in the
involved in the conversion of geranylgeranyl diphosphate to
synthesis of phytoene from geranylgeranyl diphosphate or
phytoene via prephytoene diphosphate, the chromoplast
prephytoene diphosphate was eluted as a single peak after
proteins obtained after polyethylene glycol fractionation and
addition of 10 mM dithiothreitol to the butTer. NaDodSO./
DEAE-Sephacel column chromatography (6) were applied to
PAGE analysis revealed a single polypeptide of M 47,500
r
the aminophenethyl diphosphate-Sepharose affinity column
(Fig. 2A) even when as much as 50 p.g of protein was analyzed
(Fig. 1 A). The active fractions were strongly retarded, since
(data not shown). When these active fractions were pooled
they were eluted with the linear (0.5-1.5 M NaCI) gradient.
and applied to a Sephacryl S-2OO column, we observed a
Such tight binding suggested that the diphosphate moiety was
considerable trailing of the enzymatic activity. Since this
involved. This conclusion was confirmed by the inhibitory
trailing, which might be due to the hydrophobicity of the
etTect of inorganic pyrophosphate reported below and is
protein, was not suppressed by the inclusion of 0.4% Triton
reinforced by studies based on the use of a transition-state
X-loo and 0.06% n-octyl !3-D-glucopyranoside in the butTer,
analog inhibitor of squalene synthetase, which catalyzes a
we decided to adopt the glycerol gradient centrifugation
very similar reaction (21).
method. During centrifugation, the enzymatic activities in-
At this stage of the purification procedure, 90% of the
volved in the synthesis of phytoene from geranylgeranyl
material visualized by staining with Coomassie blue or silver
diphosphate or prephytoene di phosphate comigrated and
nitrate was detected in two bands corresponding to M 47,500
gave a single peak corresponding to an apparent sedimenta-
r
tion coefficient of 4 S. NaDodSO./PAGE again gave a single
band at M 47,500. A summary of the purification procedure
r
is given in Table 1. The purified enzyme was kept frozen at
- 20°C in 50 mM Tris'HCI, pH 7.6/2 mM dithiothreitol/0.3 M
0.6
NaCI/30% glycerol for as long as 1 year without loss of
activity.
Production and Characterization of Anti·Phytoene Synthase
Antibodies. To further check the involvement of the Mr
47,500 protein in the last steps of phytoene synthesis.
antibodies against this protein were raised. To test the
specificity of the antibodies, several experiments were car-
ried out in parallel. (i) The purified anti-phytoene IgG
covalently attached to hydrazide beads was gently rotated for
1 hr in the presence of the crude proteins obtained by
DEAE-Sephacel column chromatography. After this treat-
ment, NaDodSO./PAGE revealed only one polypeptide, of
M 47,500 (Fig. 2B). (ii) The soluble and membrane-bound
r
proteins of the isolated chromoplasts were separated by
NaDodSO./PAGE and transferred to nitrocellulose paper.
which was then incubated with the purified anti-phytoene
synthase IgG. A single protein, belonging to the soluble
fraction, forrned an antigen-antibody complex (Fig. 3). This
0.6
16 ~
...
A
B
0.4
94 -
67
-
-~
-
-
o
2
10
18
--
43
~ -
-
-··1
-
~:~ - ..
~
R
fraction. Sml
..
30
- -
- ....... -
. FIG. 1.
Affinity chromatography of Capsicum chromoplast phy-
~
toene synthase on aminophenethyl diphosphate-Sepharose and Affi-
20.1- -
--
Gel SOL (A) Aminophenethyl diphosphate-Sepharose chromatogra-
14.4- -
-
-
--
phy of the DEAE-Sephacel fraction (6). The column was washed
sequentially with butTer A. 0.2 M NaCI in buffer A, and 5 mM
inorganic pyrophosphate (PPi) in buffer A. Finally, the column was
washed wilh buITer A followed by a linear gradienl of 0.5-1 M NaCi
2
3
4
2
3
in buITer A. Fractions containing phyloene synlhase activity were
pooled and dialyzed in the absence of 2-mercaptoethanol. (B)
FIG. 2.
NaDodSO./PAGE of purified phytoene synthase. <A)
Affi-Gel 501 chromalography of the aminophenethyl diphosphale-
Lanes: 1, molecular weight standards (M x 10- 3 at left); 2 and 3.
r
Sepharose fraclions indicated by the double-headed arrow in A. AfJer
purified phytoene synthase (10 and 5 ILg) obtained after Affi·Gel SOI
seleclive retention of Ihe ac~ive fraction during the elulion with buITer
column chromalography; 4. stromal proteins obtained after polyeth-
B, phyloene synthase wàs eluted by the addition of 10 mM dithio-
ylene glycol fractionalion and DEAE-Sephacel chromatography <50
threilol to buffer B. Vertical arrows mark the start ofelution with the
ILg of protein). (B) Lanes: l, molecular weight standards similar to
indicated buITer. Fractions were collecled as shown and phytoene
Ihose used in A; 2. slromal proteins (as in A. lane 4); 3. slroma!
synthase aClivity was determined in the presence of P'C]geranylge-
protein adsorbed ante anti-phytoene synlhase IgG-hydrazide beads
ranyl diphosphate (0) or (3H]prephytoene diphosphale (.). Protein
and then eluted with 8 M urea containing 2% NaDodSO•. Arro\\',s
content <.) was deterrnined by measuring the absorbance at 595 nm
indicate the posilion of phytoene synthase. Proteins were visualized
after addition of Coomassie blue G-25O (14).
by slaining with Coomassie blue R-2SO.

Biochemistry: Dogbo et al.
Proe. Natt. Acad. Sci. USA 85 (1988)
7057
Table 1.
Purification of phytoene synthase from
2
3
4
Capsicum chromoplasts
p
.....
Total
-
)(
protein.
Specific
Purification
-
Fraction
mg
activity·
factor

Chromoplast stroma
1.2SO
8
1
Polyethylene glycol
275
25
Gl
3.12
DEAE-SephaceJ
60
80
10
Aminophenethyl diphosphate-
Sepharose
1.1
3500
437.5
GG
Affl-GeJ SOI
0.9
4000
500
·Exprcssed as nmol ofgeranylgeranyl diphosphate incorporated into
phytoene per ma of protein in 1 hr.
polypeptide (Mf 47,5(0) corresponded to the position of the
purified enzyme. thus confirming previous data on the
'-
locaJization of phytoene synthesis in is~lated plastid stroma
(3,5). (iii) Additional evidence of the immunoreactivity ofthe
enzyme was obtained by immunoprecipitation of phytoene
o·~.i"
synthase from the chromoplast stroma. Assay of the super-
natant demonstrated the concentration-related removal of
FIG. 4.
RemovaJ of phytoene synthase activity from chromorlast
phytoene synthase activity by the antibody (FÎ8. 4). Thus.
stroma by antiserum raised against the purified enzyme. Preimmune
chromatographie. electrophoretic, and immunologicaJ data
19O or anti-phytoene synthase 19O (20 and 10 ~I) was added to a
provide conclusive evidence for the purity of the enzyme and
constant volume of chromoplast stroma (500 ~g of protein) and
its monomeric structure. From these results, the enzyme may
incubated for 1 hr at 3O"C and then ovemight at 5"C. The resulting
immunoprecipitate was sedimented. TIte supematant was used for
be c1assified as a multifunctional polypeptide according to the
the determination of phytoene synthase activity using P'C)isopen-
nomenclature of Kirschner (22).
tenyl diphosphate as the assay subslrate. Lanes: 1 and 2. 20 and 10
Sorne Calalytk Properties oC Phytoene Syntbase. The puri-
~ of anti-phytoene synthase 19O were included; 3 and 4. 20 and 10
fied enzyme has an optimum pH at 7.6 in Tris'HCI buffer.
l'lof preimmune 19O were included. TIte reaction produets "'c:re
Kinetic constants for the enzyme were determined from
isolated by thin-layer chromatography followed by autoradiography
double reciprocal plots of velocity as a function of substrate
(7). The positions ofphytoene (P). unknowD compound (X). geranyl-
linaJool (GL). geranylgeraniol (00). and the chromatographie ongin
concentrations. The Km values of phytoene synthase for
(0) are indicated.
geranylgeranyl diphosphate and prephytoene di phosphate
were 0.30 #LM and 0.27 #LM.
of Sn2 + and Zn2 '" • the radioactivity incorporated into the
Several divalent cations were tested for the ability to
total Iipid fraction was comparableto that observed in the
activate the purified enzyme (Table 2). The enzymatic activ-
presence ofMn2 "'; however, during subsequent purification,
ity was strictly dependent upon the presence of divalent
phytoene was apparenlly degraded. The preferential involve-
cations. The purified enzyme has an absolute requirement for
ment of Mn2 + relative to Mg2 '" confirms a recent observation
Mn2 + • and half-maximal activity was observed at 200 #LM.
on the regulation of phytoene synthesis in plastid stroma (23).
Higher concentrations of Mn2 +
up to 4 mM were not
In this connection. it may be interesting to refer to earlier
inhibitory. No other divalent cation couId be substituted
studies with crude enzymatic preparations where a similar
,efficienlly for Mn2 '" at any concentration tested. In the case
conclusion had been reached (24. 25). When considering the
A
B
role of Mn2 ... , note that this requirement is a property shared
by dehydrosqualene synthetase (26.27), which calalyzes {he
2
1
2
synthesis of the CJO homolog of phytoene (diapophytoene),
detected in bacteria producing C]o carotenoids (diapocarot-
enoids) (28). In addition. this absolute specificity for Mn:: - is
an intrinsic property of phytoene syntha:ie. since Mg2 + could
94 -
67 -
-
Table 2.
Divalent cation requirement of purified
....
phytoene synthase
43 -
e
Activity. %
Cation (2 mM)
of control
••
30 -
None
o
1;
Mn2 +
100
20.1-
......
Mg2 +
S
~
Cul +
14.4- ....... '
67
Zn2 +
10
Cal +
9
FIG. 3.
Identification of phytoene synthase in chromoplast sub-
Pbl +
5
fractions. (A) Membrane-bound proteins (lane 1) and soluble proteins
Fel +
4
from the stroma obtained after polyethylene glycol fractionation and
Ni:!·
21
DEAE-Sephacel chromatography (Iane 2) were separated by
Sn2 +
18
NaDodSO./PAGE. (B) The polypeptides seen in lanes 1 and 2 of A
were electrophoretically transferred to strips of nitrocellulose paper.
The purified enzyme OS l'g) was incubated with one of the
The paper strips were then incubated with anti·phytoene synthase
indicated cations, and the reaction ....as staned by the addilion of
IgO. The resulting immune complexes were detected with protein A-
geranylgeranyl diphosphate. Result5 are expressed as percent of
gold. Arrow indicates the position of phyloene synthase.
control values determined in reaction mixtures that contained ~inl •.

7058
Biochemistry: Dogbo n al.
Proe. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988)
replace Mn2 + in the reaction catalyzed by isopentenyl
7.
Dogbo. O .. Bardat. F.. Quennemet. J. & Camara. B. (987)
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8.
Altman. L. J., Ash, L.. Kowerski. R. c.. Epstein. W. W..
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9.
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preference for Mg2 + has becn reported (26, 27, 29-31).
10.
Camara. B. & Mo~ger. R. (1980) in Biof(~nnis and FunClions
Paralleling this observation was the fact that when phytoene
ofPlant Upids. eds. Mazliak, P.• Benveniste. P., Costes. C. &
synthase was incubated with labeled geranylgeranyl diphos·
Douce, R. (Elsevier. Amsterdam), pp. 363-367.
phate, 2 mM NADPH, and S, 10, or 20 mM Mg2 +, we noted
Il.
Camara. B. &: Monfger, R. (1982) Phy.dol. Vif(. 20,757-773.
no radioactivity in hydrocarbon products homologous to
12.
Camara, B., Payan, C., Escoffier, A. &: Mon~ger. R. (1980)
C.R. S~ancn Acad. Sc;. S~r. 0291, 303-306.
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13.
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lnorganic pyrophosphate is a potentiaJ inhibitor of en·
14.
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zymes involved in the biosynthesis of terpenoids (2, 32, 33).
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The addition of SOO #LM inorganic pyrophosphate to the
16.
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standard incubation medium resulted in a 98% loss of
1379.
activity. This result, along with the observation that phytoene
17.
Vartak. H. G., Rele, M. V., Rad. M. & Desphande. V. V.
synthase has a strong affinity for the aminophenethyl diphos-
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phate·Sepharose column, suggests that the diphosphate moi·
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19.
Brada. D. &: Roth, J. (1984) Anal. Bioch~m. 142, 79-83.
phate plays a pivotai role in the binding of the substrate to the
20.
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ranyl diphosphate, led to 70% inhibition of activity. This
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result suggests the presence ofan essential arginine residue(s)
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Graebe, J. E. (1968) Phyloc:h~m;slry 7, 2003-2020.
(34) that may be involved in the binding of the prenyl
25.
Maudinas, B., Buchollz, M. L.. Papastephanou, c., Katiyar,
diphosphate substrate.
S. S., Briedis, A. V. &: Porter, J. W. (19TI) Arch. Bioch~m.
These results, along with those described for geranylger-
Biophys. IBO, 354-362.
anyl diphosphate synthase (6), extend the number of multi·
26.
Nishino. T., Suzuki. N., Takatsuji, H. &: Katsuki, H. (1981/
catalytic enzymes known to be involved in the biogenesis of
M~m. Fac. Sei. Kyolo Uni\\!. S~r. Phys. Astrophys. G~ophys.
sterols (29, 31) and plastid terpenoids. This mechanism
Ch~m. 36, 67-72.
greatly reduces the time (3S) required for the substrate to
27.
Takatsuji. H., Nishino. T., Izui. K. &: Katsuki, H. (1982) J.
diffuse from one catalytic site to another. One may postulate
Bioch~m. 91, 911-921.
that this entropically economical mechanism (36) has prob-
28.
Suzue, G., Tsukada. K. &: Tanaka, S. (1968) Bioc:him. Biophys.
Acla
164, 88-93.
ably becn favored by selective pressure for better cellular
29.
Agnew, W. S. &: Popjak. G. (1978) J. Biol. Ch~m. 253,4574-
function.
4583.
This work was financially supported by the Fondation Post-
30.
Kuswik-Rabiega,G. &: Rilling, H. C. (1987)J. Biol. Ch~m. 202,
Interuniversitaire and by the United Nations Educational, Scientific,
1505-1509.
and Cultural Organization (Grant 5333).
31.
Sasiak, K. &: Rilling. H. C. (1988) Arch. Bioch~m. Biophys.
260, 622-627.
1.
Porter, J. W. &: Spurgeon. S. L. (1979) Pur~ Appl. Ch~m. 51,
32.
Ogura. K .• Koyama, T .• Shibuya. T., Nishino. T. &: Seto. S.
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(1969) J. Bioc:h~m. 66, 117-118.
2.
Camara, B. (1985) Pur~ Appl. Ch~m. 57,675-677.
33.
Poulier, C. D. &: Rilling, H. C. (1981) in Biosynlh~sis of
3.
Camara, B. &: Mon~ger, R. (1982) Eur. J. Bioc:h~m. 127,255-
Isopr~noidCompounds.eds. Porter. J. W. &: Spurgeon, S. L.
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(Wiley. New York)', Vol. 1, pp. 413-441.
4.
Kreuz, K., Beyer. P. &: Kleinig, H. (1982) Planla 154,66-69.
34.
Riordan, J. F .• McElvany, K. D. & Borders, C. L.. Jr. (1977)
5.
Dogbo. O .• Bardat, F., Laferri~re, A.• Quennemet. J., Bran-
Sei~nCl' 195, 884-886.
gean. J. &: Camara. B. (1987) PianI Sei. 49, 89-101.
35.
Webb. J. (1963) in Enzyme and Ml'Iabolic Inhibilors. ed. Webb.
6.
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J. L. (Academie. New York). Vol. 1, pp. 319-392.
140-148.
36.
Welch, G. R. (1977) J. Theor. Biol. 68, 267-291.

40
COMMENTAIRE DE L'ARTICLE 5
AI Différentes étapes de purification de la phytoène
synthase
La purification de la phytoène synthase est réalisée
à
partir
du
complexe enzymatique
du
stroma de
chromo-
plastes.
La phytoène
synthase séparée de
l'IPP isomérase
et
de
la
GGPP
synthase
est
éluée
de
la
colonne
à
aminophénéthylpyrophosphate
par le
NaCl
(0,5M
-
lM).
La
purification
de l'enzyme
est achevée par passage
sur une
colonne spécifique des groupements SH (Affi-Gel 501).
BI Caractéristiques et propriétés de la phytoène
synthase
1- Poids moléculaire et pureté de l'enzyme
Les
résultats obtenus après filtration
de l'extrait
purifié sur
gel
sephacryl S
200, centrifugation
sur
gradient
de
glycérol
et
électrophorèse
sur
gel
de
polyacrylamide en conditions dissociantes, montrent que la
phytoène synthase est un monomère de 47.500 Da.
En
utilisant cet extrait purifié
nous avons préparé
de
l'anticorps
anti-phytoène
synthase.
Les
tests
de
transfert réalisés
avec
cet
anticorps et
les
extraits
purifiés ou
partiellement purifiés
ont
montré dans
les
deux cas
la présence
d'une seule
bande correspondant
à
47.500 Da (Fig. 2).

41
Pour compléter
les résultats
ci-dessus, nous
avons
poursuivi
notre
expérience
en
réalisant
une
immunoprécipitation
du
stroma.
Après
incubation
du
surnageant
en
présence
d'IPP,
l'extrait
lipidique
est
chromatographié
sur
plaque,
puis
autoradiographié.
Les
résultats
présentés sur la figure 4
de l'article montrent
que seuls les témoins synthétisent le phytoène.
L'ensemble de
ces
résultats
permet d'affirmer
que
l'enzyme
purifiée est
celle qui
catalyse la synthèse
du
phytoène.
2- Spécificité vis-à-vis des substrats
A partir du complexe enzymatique du stroma nous avons
effectué
la
synthèse
du
phytoène
en
utilisant
du
pyrophosphate de préphytoène ou du GGPP comme substrats.
La phytoène synthase, débarrassée
des autres enzymes
et
purifiée, catalyse également la synthèse
du phytoène à
partir
de ces substrats. L'ion requis pour cette opération
est
le Mn 2 •• Les K~
de ces substrats
sont respectivement
0,30
pM et
0,27 pM
pour le GGPP
et le pyrophosphate
de
préphytoène.

42
CONCLUSION PARTIELLE
Au
terme de
ce travail
sur les
enzymes impliquées
dans la biosynthèse du
phytoène par le stroma
de chromo-
plastes
de
poivron,
nous
pouvons
dégager
les
faits
suivants
l - La synthèse d'un intermédiaire en C20 dans le fruit de
poivron fait
intervenir deux
enzymes:
l'IPP
isomérase,
qui catalyse l'isomérisation de l'IPP en DMAPP, et la GGPP
synthase, qui effectue la synthèse du GGPP
à partir d'IPP
et de DMAPP. Ces
deux enzymes exigent pour
leur activité
l'ion Mg2~ mais acceptent aussi l'ion Mn2~.
2 - La phytoène synthase catalyse
successivement la dimè-
risation
du
GGPP en
prèphytoène
et
la
conversion
du
préphytoène en phytoène.
L'ion requis pour
ces réactions
est le Mn2~ .
3 - La synthèse du phytoène
peut être effectuée par tous
les types de
plastes (amyloplastes, étioplastes,
chloro-
plastes et
chromoplastes)
si
l'on respecte
la
concen-
tration des ions du milieu d'incubation.
A
partir
de
l'anticorps
anti-phytoène
synthase
préparé
à
partir
de
la
phytoène synthase
purifiée
du
stroma de chromoplastes de poivron, nous avons réalisé une

43
immunoprécipitation
de
phytoène
synthase
isolée
d'amyloplastes
(pois), d'étioplastes
(maïs et blé)
et de
chloroplastes (épinard, pois, poivron).
Nous concluons que
la phytoène synthase
purifiée à
partir des
chromoplastes de fruit
orangé de poivron
est
immunochimiquement identique
à
celle
présente dans
les
amyloplastes,
les étioplastes et
les chloroplastes (Fig.6
et 7, article 1).
4 -
Enfin,
la phytoène
synthase est une enzyme
soluble
localisée dans le stroma.

44
DEUXIEME PARTIE
ACTIVITE METHIONINE
ADENOSYL TRANSFERASE:
MISE EN EVIDENCE DE TROIS FORMES
ET ETUDE DES EFFETS DE QUELQUES
FACTEURS SUR SON ACT/V/TE.

45
Nous venons de
montrer la synthèse du
phytoène par
les
plastes à différents stades
de différenciation. Cette
accumulation
de phytoène
est précèdée par la
synthèse de
prénylpyrophosphates.
Ces
derniers
sont les
précurseurs
communs
d'une
grande
variété
de
composés
terpéniques,
parmi
lesquels figurent,
outre les caroténoïdes,
les chlo-
rophylles
et les prénylquinones (GAUDILLIERE et al.,
1984;
d'HARLINGUE
et CAMARA,
1985), dont
la synthèse
comporte
par ailleurs des réactions de méthylation.
Nous avons donc
cherché à savoir de
quelle manière
évolue,
au cours de la maturation du
fruit,
l'activité de
l'enzyme
(méthionine adénosyltransférase) qui
catalyse la
synthèse
de la S-adénosylméthionine, principal
donneur de
méthyle pour ces réactions de méthylation.

HISTORIQUE
La S-adénosylméthionine
(SAM)
fut
découverte
par
CANTON 1
en 1953. Celui-ci montre,
avec
une préparation de
foie,
que ce composé est
synthétisé è partir de
la L-mé-
thionine
et
de l'adénosine
S'
-
triphosphate (ATP).
La
réaction
est
catalysée
par
la
méthionine
adénosyl-
transférase (MAT).
Les études détaillées
concernant les mécanismes
de
réaction
(MUDD et CANTONI,
1958; MUDD,
1962; MUDD et MANN,
1963;
CHOU et
TÀLALAY,
1972)
montrent non seulement
que
l'ATP
et la méthionine sont convertis stoechiométriquement
en
SAM,
mais
que
l'ATP
subit
une
déphosphorylation
compléte (pyrophosphate et orthophosphate).
E + Met + Ado - pa P~ p8 ---+
AdoMet + E + pa P~ + pT
Cette
réaction,
qui
est
dépendante
d'un
cation
divalent
(Mg 2 ., Mn 2 •
ou Co 2 "), est stimulée par la présence
d'un
cation monovalent,
K'
ou Na·
(MUDD
et CANTONI,
1958;
MUDD,
1963; MARKHAM et al.,
1980).
Depuis cette
découverte,
la
MAT a
fait l'objet
de
plusieurs
travaux.
Les
expériences
réalisées
dans
ce
domaine
ont porté surtout sur
les microorganismes (DUERRE
et SCHLENK,
1962; MUDD et MANN,
1963; SHAPIRO et al., 1964;

47
SHAPIRO et al.,
1965; GREENE,
1969; HOLLOWAY et al.,
1970;
CHOU
et TALALAY,
1972;
HOBSON et SMITH,
1973;
MARKHAM et
al.,
1980)
et
sur
les
tissus animaux
(CANTONI,
1953;
LOMBARDINI
et
al.,
1973;
FINKELSTEIN
et
al.,
1975;
ELORANTA,
1977;
LIAU et al.,
1977; GUCHHAIT et GRAU,
1978;
JACOBSEN
et al.,
1980; HIEMKE
et GHRAF,
1981; TABOR
et
TABOR, 1984).
Dans ces
matériels,
la
méthionine
adénosyltrans-
férase
peut
se
présenter
sous
diverses
formes
ou
isoenzymes,
appelées selon les auteurs,
forme a
ou MAT 1,
forme
~
ou MAT
III et
forme (ou
MAT
II
(CHIANG
et
CANTONI,
1977; HOFFMAN et
KUNZ,
1977; LIAU et
al.,
1979;
ABE
et al.,
1980).
Ces isoenzymes diffèrent les
unes des
autres
par leurs
propriétés chimiques et par
leurs poids
moléculaires (HOFFMAN et KUNZ,
1977; ABE et al.,
1980).
Le
rôle
joué
par
la
SAM
dans
la
plupart
des
réactions
biologiques,
chez
les
procaryotes
et
les
eucaryotes,
a
suscité
un
intérêt particulier
pour
les
études
consacrées
à
la MAT.
En
effet,
la SAM
est
un
donneur
de méthyle
pour les réactions de
méthylation, et
un
précurseur pour
la synthèse de
plusieurs constituants
cellulaires
comme les acides nucléiques (MESELSON et YUAN,
1968;
HABERMAN et
al.,
1972; DOERFLER,
1983),
les flavo-
noïdes
(WENGENMAYER et
al.,
1974),
les
lignines (SHIMADA
et
al.,
1973; EBEL et al.,
1974; KU RODA et al.,
1975),
les
phénylpropanoïdes
(SHlMADA et al.,
1972; LEGRAND et al.,

48
1976; POULTON
et al.,
1976;
JAHNEN et HAHLBROCK,
1988),
les
stérols (HARTMANN et al.,
1977),
les polyamines (TABOR
et
al.,
1961;
TABOR et
TABOR,
1964;
PEGG et WILLIAMS
ASHMAN,
1969; KONISHI et
al.,
1972; SMITH, 1975)
et l'é-
thylène (KONZE et KENDE,
1969; BERTHALON,
1987) (Fig. f).
Les
études
menées
sur
la
synthèse
de
certains
composés
terpéniques
(chlorophylles,
phylloquinones,
plastoquinones
et tocophérols)
au
cours
de
la
diffé-
renciation de
plast~s, ont
montré que
les réactions
de
méthylation intervenant lors
de la formation du
noyau de
ces molécules
se font
exclusivement à
partir de la
SAM
(GIBSON et al.,
1963; RADMER et
BOGORAD, 1967;
EBBON et
TAIT, 1969; ELLSWORTH et PIERRE,
1976; GAUDILLIERE et al.,
1984;
CAMARA,
1985b;
CAMARA
et
d'HARLINGUE,
1985;
d'HARLINGUE et al.,
1985) (Fig. a).
Or,
chez les
végétaux,
les
travaux
consacrés
à
l'étude de la MAT,
enzyme qui effectue la
synthèse de ce
composé, sont très limités (MUDD,
1960; TURNER et SHAPIRO,
1961;
DDDD et COSSINS,
1968,
1969; AARNES,
1977).
C'est donc
dans le
but d'apporter des
compléments
d'information aux résultats
déjà obtenus sur
les enzymes
impliquées dans la
biogénèse de ces
terpénoïdes (chloro-
phylles,
phylloquinones,
tocophérols)
que
nous
avons
concentré notre
attention
sur
la
méthionine
adénosyl-
transférase.

49
CH) - S
1
HC000
CH~l.o t=l

PO,N-
8
OH OH
CH ) - 5 - CH Z - CH 1 - CO - C00
l MTIt-I-P 1
(1(M8/
CH) - 5
1
b-oK
ft - CO - CO&=>
OH OH
UHRI
<:>
HH)
1
1:'\\
CH) -5 -CH
-CH
-CH-CO~
ACt
Z
Z
IMell
ATP
04) - 5
1
~P, •
Pi
\\:f'"
OH OH
( "'TAI
e
2
C, ............
/N"")
/C~
C
COP
(ACC]
polyamines
V- 'n 0
~ co,:"CN
CHZ • Cl-t
chlcrophyU.es
Z
phyUoquinones
plastes
éthylène
plastoquinones
tocophérols
}
acides nucléiques
lignines
stérols

50
Figure f
Principales voies
de métabolisme de
la S-adénosyl-
méthionine chez les végétaux.
1 - voie conduisant à
la synthése de l'éthylène
2 -
voie impliquant la SAM dans les réactions de
méthylation
3 - voie conduisant à
la synthèse des polyamines.
ACC
acide 1 -
aminocyclopropane -
1 -
carboxylique
Ade
adénosine
.KMS
2 - Kèto -
4 - mèthylthiobutyrate
Met
méthionine
. MTA
5'
- méthylthioadénosine
MTR
5 - méthylthioribose
MTR-l-p
5 - méthylthioribose -
1 - phosphate
SA!'!
S - adénosylméthionine.

51
RESULTATS ET DISCUSSION

article6
C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Shic III, n° 3, 1986
93
PHYSIOLOGIE VÉGÉTALE (BIOCHIMIE CELLULAIRE). -
La méthionine adé-
nosyltransférase des végétaux: mise en évidence de 3 formes. Note de Odette Dogbo et
BilaI Camara, présentée par Alexis Moyse.
.
L'activité méthionine adénosyltransférase (MA1) mesurée à panir de la fraction soluble de fruits vens de
poivron (CapsiCIIPII CZMUum L. cv Volo wonder) est la résultante du fonctionnement de 3 différentes enzymes,
que nous avons dénommées MATI, MAT Il et MA Till. Ces 3 formes ont été séparées par chromatographie
sur suppon hydrophobe. Ces 3 enzymes diffèrent par leur thermostabilité, leur sensibilité au diméthylsulfollyde
et à !"acide abscissique.
PLANT PIIYSlOLOGY (CELLULAR BJOCHEMISTRY). -
Plant methionine adenosyltransferase: evi-
dence for the ellistence of 3 forms.
.
Through Ihe use of hydrophobie chromalography, the 101al soluble methionine adenosyllransferase (M A1) fram
green pepper fruits has been fractionated into 3 different enzymes lhot we have lermed MAT l, MAT lI,
MAT 111.
These forms have different Ihermostabilities, sensibi/ities 10 dimelhysulfoxide and abscisie acid.
With the demonstration that S-adenosyl methionine is the methyl donor involved in
terpenoid biosynthesis, allempt has been made to study its formation through the activity
of the
soluble
([I]-[S])
methionine
adenosyltransferase
(MAnin
green· pepper
fruits.
S-adenosyl met1tionine was purified according to ([6]-[8]) and proteins were estimated
according to Bradford [9].
The bulk of activity precipitated at 40 to 60% saturation with ammonium sulfate.
17Je
reaclÎon was linear up to 1hr.
By plolling the saturation curve according to michaelis
equation, a straight line was not observed.
This deviation from normal michaelis kinetic,
though not exduding a cooperative effect and the participation of S-adenosylmethionine to
different pathways, made the existence of several forms of methionine adenosyltransferase,

a reasonable hypothesis.
Therefore, use has been made of different procedures in the
fractionation of the soluble extract.
After chromatography on several supports induding
Sephacryl S-300, DEAE Sephacel, Blue Sepharose CL-6B and Phenylsepharose, three
forms were oblained.
The fallacy of an artifact is weakened by the fact that (1) protease
inhibitor M'as added during the extraction procedure (2) similar work up of more than five
different batches of fruits gave exactly the same profile.

For convenience we term these
different forms MATI, MATlI and MATIJI.
Their existence gained added support
in the sense that they have different properties: only MAT III was stimulated at 20%
dimethylsulfoxide concentration in the incubation medium.

In addition, after exposure at
Ssoc for Smin., the activity of the 1 and II forms were 100% and 10% preserved, while
tllOt of the III was completely lost.

Furthermore at 10 IJ.M abscisic acid concentration,
only the Il and III forms were stimulated.
INTRODUCTION.
-
La méthionine adénosyllransférase (A TP-L-méthionine S-adéno-
syltransférase, EC2. S:I.6) ca,talyse la formation de la S-adénosylméthionine qui, chez
les végétaux, intervient dans la synthèse des polyamines, des acides nucléiques, de
l'éthylène... et des terpénoïdes (chlorophylles et plastoquinones) dont les dernières étapes
comportent plusieurs C-méthylations. A notre connaissance, la méthionine adéno-
syltransférasc a été peu étudiée chez les végétaux ([1 ]-[S}).
Dans le cadre de notre travail sur l'organisation et la régulation des enzymes impliquées
dans la biogenèse des terpénoïdes plastidiaux, nous avons, pour la première fois, mis en
0249-6313/86/03030093
$2.00 © Académie des Sôenœs

94
C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 3, J986
21
_ _ e
40
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-
~
i
"
e
o "'-_ _"'-_ _-'--_ _~,"'__ __',"_
0,5
5
60
120
180
240
protéines, mg
temps. min
Fig. 1
Fig. 2
Fig. 1. - Effet de la ten~ur ~n protéines sur l'activité de la méthionine adénosyllransférase, (0) témoin bouilli.
Fig. 1. -
Effecl ofprolein conlenl on lhe aclivily of melltionine adenosy/lransferase, (0) boi/ed COn/roI.
Fig. 2. - Formation de la S-adénosylméthionine en fonction du temps.
Fig. 2. -
TIme course of S-adenosy/melltionine formalion.
évidence et caractérisé 3 formes de cette enzyme. Nous présentons brièvement les résultats
obtenus au cours de ce travail.
MATioRJEl ET MioTHOOES. - Le péricarpe des fruits vens de poivron est broyé (1 g de matière fraîche pour
~ ml de milieu) pendant 5 le lOs dans le milieu comprenant: Tris-HO 50 mM, EDTA 2 mM, de phénylméthylsul-
fonyl de nuor 3 J1M. 2-mercaptoéthanol 20 mM, pH final 8. l'extrait est filtré à travers 4 épaisseurs de toile
Blutex et centrifugé à 20000 le g pendant 2Omn. Les protéines du surnageant sont précipitées après addition
de suJrate d'ammonium selon le nomogramme de Dixon. Les culots de précipitation sont repris par le tampon:
Tris-HO 10mM, OTT 2 mM, glycérol 20'Y.. pH 7,8 et dialysès contre ce même tampon.
l'activité méthionine adénosyltransférase est déterminée dans le milieu (0.6ml volume final) contenant:
Tris-HO 10mM, 3-4'4C,l-méthionine (C.E.A., France 7,4kBq, 1665MBqfmmole), ATPSmM, MgCJ)
20mM, KOO,I M, OTT 2mM, pH final8. l'incubation se déroule à 37°C. Le milieu réactionnel est plongé
dans la glace pour arrêter la réaction. Une fraction aliquote est déposée sur une rondelle de papier échangeur
d'ions Whatman PSI. Après séchage, la rondelle est lavée dans différents bains d'une solution de formiate
d'ammonium lOOmM, pH3 pendant 10, 10 et Smn. Elle est ensuite plongée dans de l'éthanol absolu, puis
dans J'éther éthylique, avant d'être séchée et comptée dans le mélange scintillant (0,1 g POPOP, 4gPPO,
300 ml éthanol et 11 de toluéne). Celle méthode, inspirée de celle précédemment décrite «(6], 17]), permet un
taux de récupération de la S-adénosylméthionine supérieur à 80%. la pureté de la S-adénosylméthionine
formée est vérifiée par chromatographie liquide haute performance (HPlq sur colonne de panisil 10 SCX (8].
Les protéines ont été dosées selon la méthode de Bradford (9]. les suppons chromatographiques ont été
fournis par Pharmacia France.
RÉSULTATS ET DISCUSSION. -
Mise en évidence de faclivilé mélhionine adénosyllransférase
el élude de quelques facleurs. - L'extrait soluble est obtenu par broyage et centrifugation.
Au cours de la saturation par le sulfate d'ammonium, ]a majeure partie de l'activité est
récupérée dans la fraction qui précipite entre 40 et 60% de saturation. Nous l'avons
utilisée pour ]a première partie du travail.
TABLEAU
Effet de la concentralion en ATP et en MgCJ) sur l'activité de la méthionine adénosyltransférase.
Effecl of ATP and MgC/, concenlralions on rhe aClil'ily of ",elhio"ine adenosy/rransferase.
Concentration en ATP ou MgCJ) (mM)
/ ' -
Conditions
2
3
4
5
10
15
20
30
Radioactivité en DPM (%)
ATP 5 mM MgO) variable . . . . . . . . . . .
18
22
19
27
14
ATP variable MgC1) 20 mM .... '"
. . .
12
16
17
18
18
14
4
1

C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 3, 1986
95
40
T,t6moin
• 3
~
A, tripolyptlosphet.
~
$l
B,cycloloucino
"
-~
•i C.clirn6thybullOllido
""E
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20
"5

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r
j,.~
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1
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...
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E
~
0
2 • • •
2
2510.10
.'!!O
mM
mM
%
10
. ~
-1
100
T --A-a
C
Méth'Oflln8, mM
Fig. 3
J.;: 4
Fig. 3. -
RC1!ulal"m de l'activité méthionine adénosyltransférase par le tripolyphosphatc,
la cyc10leuciDe et le diméthylsulfoxyde.
Fig. 3. -
Regulalion of me.hionine tuIenosyl.ransferase ae'ivily by .ripolyphosphale,
cycloleucine an4 dimelhylsulfoxide.
Fig. 4. - Effet de la concentration en méthionine sur l'activité de la méthionine adénosyltransférasc
(représentation scIon la méthode de Linewcaver et Burk).
Fig. 4. -
Effed of melhionine conulllra'ion on .he oclivily of melhionine tuIenosyllransferase
(graphie dala presented according '0 Lineweaver and BUT").
La courbe (fig. 1) montre que l'activité de cette enzyme augmente en fonction de la
teneur en protéines de l'extrait soluble. On n'observe aucune synthèse de S-adénosyl-
méthionine lorsque le milieu réactionnel est dépourvu d'ATP. L'influence conjuguée de
la concentration en magnésium et en ATP est présentée dans le tableau J. L'optimum se
situe à une valeur du rapport Mg2+ /ATP=4. Cette valeur confirme celle précédcmme,n
obtenue par Aarnes [4]. La zone optimale de pH de la réaction se situe dans la z0fte
basique (8-8,2). La cinétique de la réaction est présentée dans la figure 2. La décroiss".nte
observée à partir de 1h d'incubation pourrait être due à une dégradation en pH basique
de la S-adénosylméthionine fonnée.
L'activité de l'enzyme est fortement inhibée par le tripolyphosphate et la cycloleucine
(fig. 3). En revanche, le diméthylsulfoxyde stimule considérablement l'activité méthionine
adénosyltransférase.
La courbe de saturation vis-à-vis de la méthionine ne suit pas une cinétique
michaelienne (fig. 4).
Mise en évidence de différences formes de la méthionine adénosylcransférase. -
~ns
exclure un phénomène de coopérativité, et compte tenu de l'utilisation de la S-adénosyl-
méthionine dans différentes voies du métabolisme, la cinétique non michaelienne pourrait
être due à l'existence d'isofonnes de la méthionine adénosyltransférase.
Pour éprouver cette hypothèse, nous avons soumis l'extrait obtenu entre 40 et 60% de
saturation à différentes chromatographies sur des colonnes de Sephacryl S-300, Olt#- E
Sephacel, Blue Sepharose CL-6 B et Phenylsepharose. Nous observons dans ces conditions
l'existence de 3 pics d'activité (fig. 5).
Dans nos conditions expérimentales, l'addition d'inhibiteurs de protéases au cours de
l'extraction de l'enzyme nous pennet d'affinner que ce phénomène n'est pas lié à l'action
de protéases endogènes. Par ailleurs, nous observons le même profil après extraction de
plus de 5 lots différents de fruits. Nous concluons que ce résultat met en évidence
l'existence de 3 formes de la méthionine adénosyltransférase, que nous appellerons MAT J,

96
C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 3, 1986
1
3
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2
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N
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E
G-
u
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"!.
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">
~ 2
i
o

o ~
10
20
fractions,2m1
Fig. 5. -
Profù d'élution d~s différ~nto form~s de la n1clhlllnm~ adcnllsyllransférase sur colonne de Phé-
nylsépharose. La forme 1 est éluéc par Je tampon de base (Tris-Hel 10mM, DTT 2mM, EDTA 1mM,
MgCl2 2mM, g1yc:erol 20%, pH 7,2) contenant du Ka, 0,3 M; la forme Il, par Je tampon de base sans Ka
et la forme III par le tampon de base contenant 40% de dimélhylsulfoxyde.
Fig. 5. - Elulion profile ofthe di/ferenl forms ofmelhionine adenosyllransferase on Phenylseplaarose eolumn.
71Ie
1 form ",as eluled "'ilh the basic buffer (10mM Tris-Hel buffer, 2mM OTT, 1mM EDTA, 2mM MgCl2, 20~~
glyeerol, pH 7.2) conlaining 0,3 M KCI; the II form wilh Ihe same buffer depleled of KCI, and Ihe III form
"'illl lhe basic buffer containing 40"10 dimethylsulfoxide.
MAT II et MA TIll. Ces données sont corroborées par les faits suivants:
- A 20% de diméthylsufoxyde dans le milieu réactionnel, seule la forme III est
stimulée.
- Après préincubation à 55°C pendant 5 mn, l'activité des différentes formes MATI
et MATH est conservée à 100% et 10%. En revanche, l'activité de la forme MATlII
est totalement perdue.
- En présence de 10 ~M d'acide abscissique, seules les formes II et III sont stimulées.
CoNCLUSION. -
Ce travail met en évidence pour la première fois l'existence de 3 formes
- de la méthionine adénosyltransférase chez les végétaux. Une étude plus détaillée portant
sur les propriétés de ces 3 formes et leur compartimentation cellulaire sera fournie.
Reçue le 28 avril 1986.
RtFtRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
(l) S. H. MUDD, Biochim. Biophys. Acla, 38, 1960, p. 354-355.
(2) D. D. DAVIES, J. Exp. BOl., 17, 1966, p. 320-331.
(3) M. T. CLANDININ et E. A. COSSINS, Phylochemislry, 13, 1974, p. 595·591.
(4) H. AARNES, PIanI Sc. Lellers. 10, 1971, p. 381-390.
1.5] R. M. WALLSGROVE, P. J. LEA et B. J. MIFLIN, PIani Physiol., 71, 1983, p. 780-784.
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p.399-405.
[9J M. M. BRADFORD, Analyl. Biochem., 72, 1976, p. 248-254.
LAboraloire de Biochimie du Dér:~loppemenl végétal, tquipe de rU.A.-c.N.R.S. nC 1180,
Universilé Pierre-el·Marie-Curie (Paris- VI), Tour n° 53, 4, place Jussieu, 75230 Paris Cedex 05.

52
1/ MISE EN EVIDENCE DE L'ACTIVITE
MAT ET ETUDE DE
QUELQUES FACTEURS (Mq 2+, ATP et pH) SUR L'ACTIVITE
DE L'ENZYME
A/ Résultats
Nous
avons
mesuré l'activité
MAT
dans
l'extrait
soluble
préparé à partir
du fruit vert de
poivron. Cette
activité,
dépendante
de
l'ATP et
du
Mg~·, atteint
son
optimum pour un rapport Mg 2 +/ ATP = 4.
L'enzyme est
plus active
aux pH basiques
(8/8,2).
Mais,
dans
ces
conditions,
la
quantité
de
SAM
syn-
thétisée,
importante au bout d'une heure d'incubation, dé-
croît
rapidement
si
on
prolonge le
temps
d'incubation
(fig.
2 de l'article). Par contre,
l'activité de l'enzyme
augmente
en
fonction de
la
teneur en
protéine (fig
l,
article).
L'utilisation de supports
d'interaction hydrophobes
nous
a permis de séparer trois formes de l'enzyme à partir
des
extraits
bruts et
partiellement
purifiés. Nous
les
avons
appelées MAT l, MAT
II, MAT III suivant
leur posi-
tion
sur
le
profil
d'élution
de
la colonne
(Fig.
5,
article).

53
BI Discussion
La
concentration
de 20
mM
en
Mg2+ requise
pour
l'activité
optimum de la
MAT est très élevée.
La concen-
tration
inférieure à la nôtre (15mM)
rapportée par PERRIN
et
SHARMA (1966) a conduit
GREENE (1969) à penser
que le
Mg 2 +
jouerait
un double
rôle dans
l'activité MAT.
Selon
lui,
il interviendrait d'abord pour former
le complexe Mg
ATP,
qui serait
le substrat,
et interagirait
ensuite
avec l'enzyme.
La baisse de
la quantité de SAM
détectée après une
heure
d'incubation peut être due à son
instabilité aux pH
basiques.
Déjà, en 1958 PARKS et
SCHLENK soulignaient que
la
SAM
se
dégrade rapidement
en
milieu alcalin.
Cette
baisse
peut être aussi une conséquence
de l'inhibition de
l'enzyme.
En
effet, CHOU
et TALALAY
(1972) ont
montré,
avec
des extraits de levure partiellement
purifiés que la
SAM,
à
faible
concentration, stimule sa
propre synthése,
alors
qu'elle devient inhibitrice lorsque sa concentration
augmente.
Ces résultats
ont été confirmés
par LOMBARDINI
et ses collaborateurs (1973).
I I I CARACTERISTIQUES DES ISOENZYMES ET ETUDE
DE
QUELQUES FACTEURS
Si les
trois formes
de la
MAT catalysent la
même
réaction, elles peuvent présenter quelques différences.

54
Nous avons passé en revue quelques
points susceptibles de
caractériser ces isoenzymes.
AI La constante cinétique et le poids moléculaire
1 - Résultats
La détermination des constantes
cinétiques vis-à-vis
de
la méthionine
[K~ (Met)]
donnent l5,60pM,
l7,86pM
et
2l,70pM
pour la
MAT l,
la
MAT II et
la MAT
III respec-
tivement.
Le poids moléculaire
de chaque isoenzyme
est estimé
aprés
filtration
sur
gel
sephacryl S-200.
Ainsi,
nous
avons
67.000 Da pour la MAT l, 77.500 Da pour la MAT Il et
62.000 Da pour la MAT Ill.
2 - Discussion
Les valeurs
de
K~
(Met)
que nous
avons
obtenues
différent
de celles
mentionnées dans
la littérature.
De
plus,
ces dernières varient selon
les auteurs. Récemment,
TABOR
et TABOR (1984)
ont estimé que cette
disparité est
liée
à
la
variabilité
de
la
composition
du
milieu
d'incubation.
Cependant, nos résultats et ceux obtenus par
la
plupart des
auteurs (LIAU et
al.,
1980) montrent
que
les
formes
a ou l,
r
ou II et ~ ou III ont des Km (Met)
de valeurs respectivement faible,
intermédiaire et élevée.

55
Les
valeurs
de
poids
moléculaire
rapportées
présentent
elles
aussi
des
différences
selon
les
chercheurs.
Mais
d'une
manière
générale,
les
travaux
réalisés
dans ce domaine montrent que
les enzymes isolées
à
partir de
tissus d'animaux
et de microorganismes
ont
des
poids
moléculaires
élevés
(100.000
à
200.000
Da)
(TABOR
et TABOR,
1984). Chez
les végétaux aucune
valeur
n'a été publiée.
BI Influence de différents facteurs sur
l'activité des différentes formes de la
méthionine adénosyltransférase
1 - Stabilité thermique
a) Résultats
Le traitement
des MAT
par
la température
de 55-C
montre
que
les
MAT III
et
II
perdent totalement
leur
activité
respectivement au bout de 5 et
10 minutes, alors
que
la MAT 1 conserve
encore 30% de son
activité au bout
de 30 minutes.
b) Discussion
Nos résultats
rejoignent
ceux
rapportés chez
les
mutants
de certains microorganismes (GREENE
et al.,
1973;
HUNTER
et al.,
1975). Chez E. Coli, HAFNER
et ses colla-
borateurs
(1977) ont isolé une MAT instable, sensible à la
dialyse
et à
une température de
42"C. Chez le
mutant de
Neurospora
crassa,
l'incubation à
37-C désactive l'enzyme
(JACOBSON et al.,
1977).

S6
2 - Effets du bicarbonate de sodium et
du DMSO sur les activités MAT
(Fig.3, article; Fig.g).
a} Résultats
Le bicarbonate de sodium et le
DMSO stimulent d'une
manière
générale les activités MAT.
Mais cette activation
est
plus ou
moins importante
selon la forme
considérée.
Ainsi,
à la concentration 10 mM,
le
bicarbonate de sodium
stimule
plus la MAT II que les autres formes. Son activité
atteint
756% de celle obtenue en l'absence de NaC03H. Pour
les
MAT 1 et III, on enregistre seulement des taux de 213%
et
331%. En
présence de
DMSO à 10
%, toutes les
formes
sont
légèrement
'stimulées.
En
revanche,
pour
une
concentration
de
20
%,
chaque
isoenzyme
réagit
différemment
l'activité
de la
MAT
1
est réduite
de
moitié,
celle de
la MAT
II est
peu modifiée tandis
que
celle de la HAT III est multipliée par 47.
b) Discussion
Le DMSO
stimule
les
activités
HAT
1 et
HAT
II
jusqu'à
10%. Au
delà de
cette concentration, on
observe
une
baisse
de leur
activité, alors
que la
HAT III
est
stimulée
jusqu'à
20%
(Fig.g).
Lorsqu'on
élimine
par
dialyse
le DMSO de
l'extrait enzymatique de forme
III et
qu'on
conserve
cet
extrait
à
20·C
en
présence
de
glycérol
à 20%, on constate non seulement que son activité
,
baisse,
mais qu'elle peut être totalement
perdue après un
cycle
de congélation-décongélation. Le DMSO, en plus de la
stimulation, pourrait jouer le rôle de "cryoprotecteur" au

57
même
titre que le glycérol dans le cas de cette forme. Des
résultats
similaires ont
été obtenus par HOFFMAN
et KUNZ
(1977)
et par
OKADA et
al.
(1979)
au cours des
travaux
effectués
sur
le foie
de
rat. Ceux-ci
ont montré
que,
parmi
toutes les isoenzymes isolées, seule la
forme a est
très fortement stimulée par le DMSO.
Le bicarbonate de sodium agit préférentiellement sur
la MAT II, dont l'activité est très
augmentée. Ce critère
a étè utilisé par
CHEREST et SURDIN -
KERJAN (1978) pour
distinguer deux
formes
de
MAT qui
ont
été isolées
de
Saccharomyces cerevisiae. Chez ce
mliroorganisme, seule la
forme II est très stimulée par ce produit.
Alors
que la
plupart
des
auteurs
s'accordent
à
penser
que
la
stimulation de
la
MAT
par le
DMSO
est
.
obtenue
par une augmentation de l'affinité de
l'ATP et de
la
méthionine
pour
l'enzyme,
le
mode
d'action
du
bicarbonate
de sodium reste encore
inexpliqué. Cependant,
on
pense que la stimulation serait due sans doute plutôt à
l'ion
bicarbonate qu'au cation monov~lent, étant donné que
le
bicarbonate de potassium donne le même
résultat que le
bicarbonate de sodium.

58
C')
10
MAT 1

MAT Il ('41
MAT III
~
0
x
...
E
Q; 450
4~
U
?P-
UoI
o
.....
~
-> 350
35
350
~
C-)
ce
e
Q
~
·.
ce
0
·.
-
CI: 250
25
~
250
·.
0
-
·.
•C"4
150
1
·.
0
·.
-
·.
l!-
·.

·.
~
0
·.
1
·. ·.
50
..
50
-
0
..
·. ·.
·. ·.
Fjgure g
Régulation des activités MATI, MAT Il et M:'\\ T III par Ja diméthyJsuJfoxyde et Je
bicarbonate de sodium.
o témoin

diméthylsulfoxyde
ëI bicarbonate de sodium

59
3 -
Influence des produIts du métabolisme de la SAM
(ACC, MTA), de l'inhibiteur de la synthèse de
l'éthylène (acide aminooxyacétigue) et de cer-
tains régulateurs de croissance (ABA, AIA, GA3)
sur la synthèse de la SAM
Les études
menées
sur la
voie
de biosynthèse
de
l'éthylène
à
partir de
la
méthionine (DE
LAAT et
al.,
1981;
CHAPPELL et
al.,
1984)
ont montré
que la SAM
est
d'abord
dégradée en MTA
et ACC avant d'être
convertie en
éthylène
(ADAMS et YANG,
1977; KONZE et al.,
1978; JONES
et
KENDE,
1979; KONZE et KENDE,
1979). Par ailleurs, après
décarboxylation,
la
SAM
fournit le
groupe
aminopropyle
pour
la synthèse des polyamines qui
sont,
comme certain~s
hormones
(ABA, AIA, GA3), des facteurs de régulation de la
croissance
des
végétaux (TABOR
et
al.,
1961;
WILLIAMS-
ASHMAN et al.,
1969; SMITH,
1975).
Nous avons donc mesuré
les effets de chacun
de ces
produits
sur l'activité
des
différentes
formes
de
la
méthionine adénosyltransférase.
a) Résultats
L'addition
de chacun
de
ces
composés
au
milieu
d'incubation a montré qu'à la concentration lOpM :
. La MAT II
est stimulée par l'ensemble
de ces produits
et son
activité est
multipliée
par 6,8
en présence
de
l'ABA.

60
. La
MAT
III est
2,6 fois
plus active
en présence
de
l'ABA .
. La
MAT
l,
légèrement
stimulée
par l'acide
aminooxy-
acétique, ne réagit vraiment qu'à la
concentration 50 pM.
Son activité est alors multipliée par 2,9.
b) Discussion
Parmi
tous
les
produits
utilisés
pour
cette
expérience,
nous
avons
retenu
les
effets
exercés
par
l'acide
aminooxyacétique et
par l'ABA
sur les
activités
MAT
1 et MAT III. En effet,
les résultats obtenus montrent
que
l'acide aminooxyacétique,
inhibiteur de la synthèse de
l'éthylène,
stimule la
MAT l,
alors que
la MAT III
est
activée
par
l'ABA,
hormone
qui
induit la
synthèse
de
l'éthylène
(DE LAAT et
VAN LOON,
1982). Le
mécanisme par
lequel
ces composés exercent leur action
n'est pas connu.
Cependant,
un mode d'action directe sur les enzymes paraît
hypothétique.
Ce
comportement
des
isoformes
en
réponse
à
ce
dernier
traitement,
non
seulement
accentue
leur
différence,
mais
conduit à
émettre
deux hypothèses.
On
peut
penser soit que
ces formes sont localisées
dans des
compartiments
cellulaires
différents,
soit
que
les
molécules
de
SAM synthétisées
par les
deux formes
sont
engagées dans des voies métaboliques différentes.

61
Chez
les
anlmaux,
les travaux
de
JUDES et
JACOB
(1972)
ont montré une compartimentation de la SAM dans les
hémisphères
cérébraux
du
poussin
au
cours
de
son
développement
embryonnaire.
Ceux
de
LIAU
et
de
ses
collaborateurs
(1980)
ont
mis
en
évidence le
rôle
de
chaque
forme de
la MAT au
sein de la cellule.
Ainsi,
la
forme
a est fonctionnellement liée
aux méthyltransférases
des
ARNt, alors
que
la forme
~
est liée
à
la
glycine
méthyltransférase.
Chez
les végétaux,
la MAT mise en
évidence dans les
chloroplastes
(SHAH et
COSSINS,
1970)
et dans les
mito-
chondries
(CLANDINI et COSSINS,
1974) n'a
pas été identi-
fiées à une forme bien précise.
Dans
les cellules
de tabac en culture,
les travaux
de
BERTHALON (1987)
sur l'émission
de l'éthylène en
ré-
ponse
au
traitement
par
les
éliciteurs
fongiques
ont
montré
que l'élicitation de la forme stimulée
par le DMSO
est
accompagnée
par la
stimulation de
la production
de
l'ACC
et de
l'éthyléne. Mais,
là aussi,
on ne peut
pas
conclure
que seule
la forme
élicitée est
associée à
la
production
de
l'éthylène.
De
sorte
que
si,
chez
les
animaux,
on peut établir une corrélation entre le stade de
développement
de la
cellule et l'activité d'une
forme de
la
MAT (LIAU
et al.,
1977; LIAU et
al.,
1980; OKADA
et
al.,
1980; TSUKADA et
OKADA,
1980), une telle
voie reste
, encore inexploitée chez les végétaux.

62
4 - Effets de la cycloleucine,
du tripolyphosphate,
du p-CMB et du traitement des MAT par l'hydro
-xyphénylglyoxal sur la synthèse de la SAM
Le
traitement
des
enzymes
par
l'hydroxyphényl-
glyoxal
100 mM se déroule à
4-C, pendant 30 minutes, dans
le
tampon borate de sodium 25 mM,
pH 8,2. Au bout du temps
de
traitement,
une fraction de l'extrait
est utilisé pour
l'activité
enzymatique.
L'autre
fraction,
utilisée
pour
l'établissement
du spectre,
est d'abord
déposée sur
une
colonne
de sephadex
G-25 (Pharmacia),
puis éluée par
le
tampon
borate,
ce
qui
permet
d'éliminer
l'excès
d'hydroxyphénylglyoxal.
Les
conditions
d'incubation
sont
identiques
à
celles
déjà décrites.
Mais, pour les expériences
avec le
p-CMB,
l'incubation s'effectue en l'absence de DTT.
a) Résultats (Fig. h et il.
La cycloleucine,
le tripolyphosphate,
le p-CMB
et
l'hydroxyphénylglyoxal inhibent tous les activités MAT.
Les
spectres
d'absorption de
la
lumière
mesurés
avant
et aprés le
traitement de la protéine
enzymatique
(Figure i) présentent les caractéristiques suivantes:
- Témoin
A Max,
tampon borate
260 nm)
- Trai té
A Max,
tampon borate
275 nm,
330 nm).

MAT 1
1
MAT Il
1
MAT III
..-..
-;:...:
1 0
1
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1
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l
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.
~
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·.

• •
·
·.

·.
·.
Figure h
Régulation des activités MAT par le tripolyphosphate, Je para-chJoromercuribenzoate et la cycJoleucine.
(radioactivités exprimées en % de celles obtenues pour le témoin).
o témoin

tripolyphosphate
Iill para-chloromercuribenzoate
am cyc10leucine
.
14
3_4
C, L-méthionine (1665 MBq/mmole, 7,4 KMq)

l
J
\\
\\
1
\\
/
,~/
\\
\\
330
\\
/
.....
\\
/
\\
\\
/
\\
\\
/
\\
_ /
\\
\\\\\\\\\\\\
\\
240
300
400nm
Figure i
Spectres de la MA T 1 témoin ( - ) et trai tée par l 'hydroxyphénylgJyoxal
(---) dans le tampon borate de sodium.

65
b) Discussion
L'inhibition de la
MAT par le
tripolyphosphate,
la
cycloleucine
ou le p-CMB a été
largement étudiée (GREENE,
1969;
LOMBARD 1NI
et
al.,
1970;
CHOU
et TALALAY,
1972;
LOMBARD 1NI
et al.,
1973; COULTER
et al.,
1974; LIAU
et
al.,
1977; AARNES,
1977; OKADA et al.,
1981). L'étude des
mécanismes
de la réaction a montré que
la cycloleucine et
le
tripolyphosphate
sont
des
inhibiteurs
compétitifs
respectivement
de la méthionine
et de l'ATP. A
ce sujet,
on
peut noter
que.MUDD
(1963) avait observé
l'existence
d'un
complexe
intermédiaire
formé
par
l'enzyme
et
le
tripolyphosphate
au cours de la
réaction. La dissociation
de
ce complexe
dépendant de
la SAM
est stimulée par
un
cation
monovalent (Na·,
K·).
Les produits de
l'hydrolyse
du
tripolyphosphate (PPi et Pi)
constituent également des
inhibiteurs
potentiels pour la synthèse de
la SAM (CHJANG
et CANTONI,
1977).
La séquence
de
la réaction
peut
donc se
résumer
ainsi
Mg 2 •
Met -+ Ado - pa pp p 1r

Met... Ado - pu pp P~ .. E
~
AdoMet -+ E
pa pp p" K.... Na; E..
PPi .. Pi
Au cours des
expériences effectuées en
présence de
"ces
analogues,
nous n'avons
pas
observé l'effet
stimu-
lateur du tripolyphosphate rapporté par LOMBARDINI et ses

66
collaborateurs (1973). Ceux-ci avaient remarqué une aug-
mentation de
l'activité MAT de
l'extrait de foie
de rat
en présence de tripolyphosphate à faible concentration.
Le p-CMB inhibe les
trois formes de la
MAT isolées.
Ces
résultats sont
en accord
avec ceux
obtenus sur
les
formes
a et ~ isolées à partir du foie de rat (ABE et al.,
1980,
ORAnA et al., 1981), mais diffèrent
de ceux obtenus
pour
la
forme
extraite des
tissus
non hépatiques,
peu
sensible
à
l'effet du
p-CMB. Toutes les isoenzymes
de la
MAT
isolées à
partir du fruit
vert de poivron
possèdent
donc des groupements SH dans leurs sites actifs.
Les
spectres
obtenus
à
partir
des
extraits
enzymatiques
témoin et
traité par
l'hydroxyphénylglyoxal
présentent
une
nette différence.
Cette modi,fication
est
accompagnée
par une diminution
de la synthèse de
la SAM.
Ces
résultats
témoignent
de
l'existence
de
résidus
arginiques essentiels au sein de ces trois isoformes.

67
5- Existence de trois formes de la MAT chez des
espèces et matériels autres Que le fruit de poi~
vron:feuilles de poivron,
feuilles de tomate
et cellules isolées de fruit de poivron. (Tableaul)
(Les cellules
sont extraites
après broyage dans
l'azote
liquide) .
Tableau 1
Activités \\1AT dans les fE'uilles (poivron et tomate)
et dans les cellules de fruit de poivron
Radioactivité exprimée en cpm
Isoformes feuilles tomate
feuilles poivron
cellules poivron
1
.'1.1 A T 1
33.1.93
71.611
85.944
MAT Il
546
4.729
191.86?-
"1.I\\T III
474
68.442
7 5.695
Incubation: 1 heure à 37°C
14
3_4
C, L-méthionine (I665 MBq/mmole, 7,4 KBq).

68
Résultats
Les résultats présentés
dans le tableau
l montrent
que
les trois formes existent aussi bien dans les feuilles
que
dans les cellules. Elles ne sont
donc pas spécifiques
du fruit de poivron.
CI Conclusion
Les trois formes de la MAT isolées à partir du fruit
vert
de poivron sont toutes inhibées par
les analogues de
la
méthionine
et
de
l'ATP,
par
le
p-CMB
et
par
l'hydroxyphénylglyoxal.
Par contre,
le traitement
des extraits enzymatiques
par
certains composés ainsi que les valeurs de K~ (Met) et
de
poids moléculaire
obtenues, ont permis de
montrer que
ces
formes
diffèrent
bien
les
unes
des
autres.
Ces
isoenzymes
présentent des similitudes avec
celles isolées
des
tissus animaux ou de
certains microorganismes. Ainsi,
les
MAT 1 et II correspondent respectivement aux formes a
et
~
et la
l".tAT III,
à
la forme a (HOFFMAN
et KUNZ,
1977;
ABE et al.,
1980; OKADA et al.,
1980).
Ces trois
isoformes sont
aussi présentes dans
les
feuilles
et dans les cellules isolées de fruit de poivron.
Elles ne sont donc pas spécifiques du fruit.

69
III /
ETAPES DE PURIFICATION DE LA MAT
L'extrait de fruit vert de
poivron (surnageant) est
d'abord
fractionné par le sulfate
d'ammonium.
La fraction
active
(fraction précipitant
entre 40-60% de
saturation)
est
déposée sur la colonne d'hydroxyapatite (3,5
x 15 cm)
(Bio
Rad) équilibrée par le NaH2P04 5mM,
pH 6,8 contenant:
2-mercaptoéthanol
5mM , g1ycéro1 20%. L'enzyme éluée par du
NaH2P04
25mM ,
pH
7 / 8
est
précipitée
par
le
sulfate
d'ammonium
(60%
de saturation)
et
dialysée pendant
une
nuit.
L'extrait ainsi obtenu est déposé sur une colonne de
DEAE-A50
sephadex (3
x 15 cm)
(Pharmacia)
équilibrée par
du
tampon tris-HCl 10mM , DTT 2mM,
EDTA
ImM,
glycérol 20%,
MgC12 10mM, pH 7,8 , appelé tampon A.
La colonne est traitée par un gradient discontinu de
NaC1
et l'enzyme, éluée
par le NaCl,
a,2M
est précipitée
et
dialysée comme
précédemment indiqué.
Elle
est déposée
successivement
sur les colonnes de CM Affi-Gel
blue et de
DEAE
Affi-Gel blue (1,5 x
5 cm)
(Bio Rad)
équilibrée par
le
tampon A.
L'enzyme éluée
de la colonne de
CM Affi-Gel
blue
par
le tampon
A
est immédiatement
déposée sur
la
colonne
de DEAE Affi-Gel blue. Après lavage
de la colonne
par
le tampon A,
l'enzyme est éluée par
l'ATP 10mM. L'ex-
trait
est
dialysé
avant d'être
utilisé.
Les étapes
de
purification sont résumées dans le tableau 2.

70
Tableau 2
Etapes de purification de l'ensemble des ~'AT.
Les trois formes n'ont pas été séparées au cours de la purification.
L'extraction a porté sur 5 Kg de fruit vert de poivron (Capsicum annuum).
étapes
protéines totales
A.S
F.P
- 1
-1
mg
u:'vth
.mg
surnageant
7.350
0,8
40 - 60%
2.067
4,6
5,7
hydroxyapatite
446,4
12,8
16
DEAE-A50 séphadex
26,5
20
35
CM Affi-Gel blue
7,4
51,4
64
DEAE Affi-Gel blue
0,158
381,3
476,6
A.S : activité spécifique
F.P : facteur de purification

71
IVI EVOLUTION DE L'ACTIVITE MAT AU COURS DE LA
MATURATION DU FRUIT VERT DE POIVRON
Les travaux
déjà réalisés sur
le fruit de
poivron
ont
montré
que
la
transformation des
chloroplastes
en
chromoplastes
au cours
de la
maturation est
accompagnée
par
la
régression des
chlorophylles et
par une
accumu-
lation
de
caroténoïdes
et
surtout
de
prénylquinones
(CAMARA,
1980; CAMARA et BRANGEON,
1981b; CAMARA,
1985b).
Or,
ces mêmes travaux, et ceux d'autres auteurs (RADMER et
BOGORAD,
1967; EBBON
et TAIT,
1969; ELLSWORTH
et PIERRE,
1976;
GAUDILLIERE et al.,
1984; d'HARLINGUE et al.,
1985),
ont
montré que la
synthèse des chlorophylles et
des pré-
nylquinones
comporte des réactions de
méthylation dont le
méthyle
provient
presque exclusivement
de
la SAM.
Nous
avons
donc suivi l'évolution de la synthèse
de ce dernier
composé
au cours
de la différenciation
des chloroplastes
en
chromoplastes
associée
à
la
maturation
du fruit
de
poivron.
AI Résultats
l - Stade de maturité (Tableau 3)
Le stade
de maturité
est défini
en prenant
comme
critère
de
base,
le contenu
pigmentaire
du fruit.
Les
pigments
sont
extraits
selon
le protocole
utilisé
par
CAMARA
(198l).
Les
chlorophylles
sont
dosées
spectro-
photométriquement par la méthode de MACKINNEY (1941) et la

72
teneur
en chlorophylles
totales
est
estimée
selon
la
formule
de
BRUINSMA
(1963).
Pour
chaque
stade
ainsi
défini,
nous avons mesuré l'activité MAT (Tableau 3).
Au cours de la maturation du fruit
de poivron,
il se
produit un phénomène caractérisé, d'une part, par la dimi-
nution,
puis la disparition de l'activité
MAT et, d'autre
part, par l'apparition d'un inhibiteur inhibant l'activité
MAT de l'extrait de fruit vert (Tableaux 3
et 4). Des ré-
sultats similaires
ont été
obtenus avec
le fruit de
la
tomate. L'activité MAT,
importante dans le fruit
vert de
tomate,
disparaît totalement dans le fruit rouge. De même,
l'extrait de tomate inhibe l'activité MAT.
L'absence de synthèse
de SAM par l'extrait
de fruit
orangé, et surtout l'inhibition de l'activité
MAT par cet
extrait,
nous
ont
conduits
à
chercher
par
quel(s)
mécanisme(s)
il
exerce son
action (inhibition de
l'en-
zyme, ou/et
dégradation
de
la SAM
formée
au cours
de
l'incubation; ou bien
incorporation de la SAM
dans d'au-
tres composés).
2 - Nature de l'inhibition (Tableaux 5 et 6)
Nous avons cherché à savoir si la SAM formée au cours
de l'incubation est dégradée par l'extrait de fruit orangé
ou est tout simplement incorporée
dans d'autres composés,
par exemple,
dans les lipides comme l'a
signalé CRONAN en
1968.

13
Tabl~au 3
Teneurs en Pigments(ug./g.~.1f)~t activité 'L\\ T dans Je fruit
de poivron à différents stades de maturité
(radioactivité exprimée en cpm)
stade de maturité
vert
intermédiaire
orange
Chlorophylles totales
18,23
38
0
Caroténoides totaux
2,7
J 4,8
90,2
MAT
10.984
388
0
Incubation: 1 heure à 37°C
L'extrait incubé contient 600 ,ug de protéines
14
3_4
C, L-méthionine (1665 MBq/mmoJe, 7,4 KBq)

74
Tableau 4
Effets de J'extrait de fruit orangé à diverses
concentrations sur la synthèse de la SAM
radioactivité exprimée en cpm
témoin
.. 21
+ 31
S/\\\\1
~.2')7
1.637
1050
4GS
Incubation: 1 heure à 37°C
L'extrait incubé contient 691 ,ug de protéines
et J'extrait de frUIt orangé 1 (surnageant) contient 250 )Jg de protéines.
14
3_4
C, L-méthionine (1665 j\\\\Bq/mmole, 7,4 K Bq)

75
Pour répondre
à ces questions,
nous avons, dans
un
premier
temps,
incubé
directement
l'extrait
de
fruit
orangé
en
présence de
SAM
radioactive,
le
témoin
ne
contenant que
la SAM (sans
extrait).
Les résultats
sont
présentés dans le tableau 5. Nous avons ensuite incubé en-
semble l'extrait enzymatique
et l'extrait inhibiteur;
l'
extrait enzymatique seul servant de témoin. Nous avons me-
suré la radioactivité incorporée
dans la SAM et
dans les
lipides au cours de chacune de ces incubations (Tableau 6)
En
présence
de
l'extrait
de
fruit
orangé,
on
enregistre une perte
d'environ 6% de SAM
introduite dans
le
milieu
d'incubation
(Tableau
5).
Dans
les
mêmes
conditions,
la SAM
synthétisée est faiblement
incorporée
dans les lipides (0,4%)
(Tableau 6). Mais
ces deux phéno-
mènes, même
considérés ensemble,
sont insuffisants
pour
expliquer
la
forte diminution
de
la
synthèse
de
SAM
observée en présence
d'extrait de fruit
orangé. Celle-ci
résulterait donc de l'inhibition de l'activité de l'enzyme
qui catalyse la synthèse de ce composé.
3 - Nature de l'inhibiteur
A partir
de
l'extrait total
(surnageant) de
fruit
orangé,
nous
avons
obtenu
les
fractions
liposoluble,
hydrosoluble et
protéique.
Chaque
fraction,
ainsi
que
l'extrait total, est incubée> avec l'extrait enzymatique.

76
Table,au 5
Effets de l'extrait de fruit orangé 1 (surnageant) sur la
stabilité de la SAM.
(radioactivité retrouvée exprimée en pourcentage
de la radioactivité récupérée dans le témoin).
Conditions d'incubation
radioacti v i té
14
St\\M -14C
100
SAM - 3C +
94
SAM - 3H
100
SAM -
H +
99
Incubat ion : 1 heure à 37°C
L'extrait du fruit orangé contient 21 J 2 ,ug de protéines
la SAM radioactive est incubée seule (témoin) ou avec
l'extrait 1 dans les conditions habituelles.
14
(carboxyJ J
C) SAM (1850 MBq/mmoJe, 3,7 KBq)
(méthyl - H)
SAM (1775 MBq/mmoJe, 3,7 KBq)

71
Tableau 6
Effets de l'extrait de fruit orangé sur la synthèse de SAM.
Incorporation de la 5..\\\\1 dans les Jirides.
Conditions
radioactivité
répartition de la
d'incubation
totale
radioactivité %
.
.
mcorporee "ô
1
SAM
lipides
1
Témoin
100
9g ,6
0,4
Témoin + 1
17
16,6
0,4
Incubation: 1 heure à 37°C
L'extrait enzymatique et J'extrait de fruit orangé 1 (surnageant)
contiennent respectivement J mg et 0,5 mg de protéines.
3-4 14 C, L-méthionine (1665 MBq/mmole, 7,4 K Bq).

78
Les résultats obtenus (Tableau 7)
montrent que seuls
l'extrait
total et
la
fraction
protéique
inhibent
la
synthèse de la
SAM. On observe
que les
fractions hydro-
soluble et liposoluble
stimulent l'activité MAT.
L'inhi-
biteur serait donc de nature protéique.
4 - Effets de dénaturants protéiques sur
l'extrait inhibiteur de fruit oranqé
Pour dénaturer les protéines
de l'extrait inhibiteur
avant de
l'incuber avec l'enzyme,
nous avons retenu
des
traitements par la chaleur,
l'urée,
l'acide chlorhydrique,
la soude et la trypsine
(protéase):
Le
traitement
thermique
nous
avons
po~té
l'extrait inhibiteur à
100·C pendant l
à
60 minutes.
Au
terme
de ce
traitement,
l'extrait
est
refroidi,
pëàs
incubé avec l'enzyme.
-
Le traitement
par l'urée
6M,
le NaOH 50mM
e t . c l
50mM se fait
à
4'C pendant
30 minutes.
L'extrait
traité
est dialysé pendant une
nuit dans un tampon
avant d'être
incubé.
-
Le
traitement par
la trypsine
se déroule
à
37-C
pendant l
heure
(250
pg de trypsine pour
200pg d'extrait
inhibiteur).
La
réaction
est
interrompue
en
ajout.nt
l'inhibiteur
de
trypsine
(Sigma)
dans
le
milieu
de
réaction.

79
Tableau 7
Effets de l'extrait de fruit orangé et de ses sous-fractions
(hydrosoluble, liposoluble, protéique) sur la synthèse de la SAM.
Radioactivité exprimée en pourcentage de la radioactivité
de la SAM formée dans l'extrait témoin.
fractions de l'extrait inhibiteur
témoin
S,A.\\\\
100
32,9
13,6
112,4
120
1
- - '
Incubation: 1 heure à 3JOC
L'extrait enzymatique contient 691 )Jg de protéines
FT : fraction totale (surnageant) correspond à 250)Jg de protéines
F p : fraction protéique
F
: fraction hydrosoluble
obtenues à partir de la
H
}
F
: fraction liposoluble
fraction total ci-dessus
L
3-4 14 C, L-méthionine (1665 MBq/mmole, 7,4 K Bq)

80
Tableau 8
Influence du traitement thermique (J OO°C) de l'extrait
de fruit orangé sur sa capacité inhibitrice de la
synthèse de SAM: effets du temps de traitement.
radioacti vi té de la SAM formée expr imée en pourcentage
de celle du témoin.
temps de traitement (mn) de l'inhibiteur à lOO°C
témoin
a
5
la
30
60
radioactivité
100
62
100
103
119
124,2
125,3
de la SAM
formée
Incubation: 1 heure à 37°C
L'extrait enzymatique contient 691 fJg de protéines
L'extrait de fruit orangé utilisé correspond à 200 }Jg de protéine.
3-4 14 C, L-méthionine (1665 MBq/mmole, 7,4 K Bq)

81
Tableau 9
Effets du traitement de J'extrait inhibiteur par les
dénaturants protéiques sur sa capacité inhibitrice.
Conditions d'incubation
radioactivité de la SAM formée
(en % de celle du témoin)
témoin
100
+1
49.9
+I
93,3
N
+I
114
H
+I
78,9
U
+I
86,7
T
Incubation: 1 heure à 3rc
L'extrait enzymatique et l'extrait inhibiteur 1 (surnageant) contiennent
respectivement 691 }Jg et 250 }Jg de protéines.
3-4 J4 C , L-méthionine (1665 MBq/mmoJe, 7,4 KBq)
1 :
inhibiteur (surnageant)
IN
inhibiteur traité par NaOH 50 mM
'H
inhibiteur traité par HC 1 50 mM
lU
inhibiteur traité par J'urée 6 M
'T:
inhibiteur traité par la trypsine (250 J.-1g pour 200 }Jg de protéines
d'extrait inhibiteur).

82
Les tableaux 8
et 9
montrent que le
traitement de
l'extrait de
fruit
orangé
par
des agents
clivant
les
chaînes
polypeptidiques
(trypsine)
ou
détruisant
la
structure native
de la
protéine (température élevée;
pH
extrême: HC1, NaOH; urée) supprime ou
réduit sa capacité
d'inhiber l'activité MAT de l'extrait de fruit vert.
BI Discussion
L'ensemble
des résultats
obtenus
nous
permet
de
montrer que,
dans
nos
conditions expérimentales
et
en
présence de l'extrait
de fruit orangé,
la
dégradation de
la SAM
ou son
incorporation
dans les
lipides est
très
faible.
La synthèse de la SAM est inhibée
par la fraction
protéique
de
l'extrait
de
fruit
orangé.
Ce
dernier
résultat permet de
suggérer qu'au cours de
la maturation
du fruit,
il y
a apparition,
soit par
synthèse, soit par
modification de
molécules
préexistantes, d'une
protéine
qui inhibe la synthèse de la MAT (CHEREST
et al.,
1973 ).
MESSENGUY et
WIAME (1969)
avaient
signalé un
phénomène
analogue
dans
la levure
de
bière,
dans
laquelle
une
arginase inhibe
l'ornithine transcarbamylase lorsque
ces
deux enzymes sont présentes à concentration élevée.

83
CONCLUSION PARTIELLE
La MAT est présente sous trois formes
dans tous les
matériels
que nous
avons examinés (feuilles et
fruits de
poivron,
feuilles de tomate,
cellules isolées
de fruit de
poivron).
L'existence de
ces diverses
formes (TALLAN,
1979)
conduit
à
poser le
problème de
leur origine
génétique.
Cette
question a
été, en partie,
abordée par ABE
et ses
collaborateurs
(1982), qui avaient montré
que l'anticorps
de
la forme ~ inhibe la forme a
, mais n'a aucun effet sur
la
forme
r . Chez certains microorganismes et en parti-
culier
chez Saccharomyces cerevisiae les études génétiques
ont
montré que chaque forme
de l'enzyme est codée
par un
gène
différent (CHEREST et
SURDIN - KERJAN,
1981)
et re-
présente
de ce fait une mutation
indépendante (CHEREST et
SURDIN - KERJAN,
1978).
Chez les
végétaux supérieurs
aucune étude n'a
été
effectuée
dans ce
sens.
Il est
donc nécessaire,
dans
un
premier
temps,
d'établir
la localisation
cellulaire
de
chaque
forme
et,
dans
un second
temps, d'en
déterminer
l'origine
génétique par
utilisation d'inhibiteurs
spéci-
fiques et d'anticorps de l'une au moins des formes.

84
Les
résultats
de
telles
investigations
pourront
aider
à déterminer les voies
métaboliques dans lesquelles
ces
isoformes sont impliquées et, de ce fait,
à
comprendre
le
rôle exact de chacune d'entre elles et son intervention
dans la régulation du métabolisme cellulaire.

85
'~CLUSIONGENERALE

La
synthèse
du
phytoène,
premier
précurseur
spécifique
des
caroténoïdes,
constitue
une
étape
importante
dans
la
biosynthèse
de
ces
pigments.
Sa
formation,
à
partir
de
l'IPP,
fait
intervenir
suc-
cessivement les enzymes catalysant la formation du GGPP et
celles qui condensent ce prénylpyrophosphate en phytoène.
La
purification, à partir de
stroma de chromoplastes
de poivron,
des enzymes
de
cette séquence
a permis
de
montrer que celle-ci
fait intervenir seulement
trois en-
zymes : l'IPP isomérase,
la GGPP synthase et
la phytoène
synthase.
Les
études génétiques
réalisées sur
les plastes
et
plus précisément sur les chloroplastes ont
montré que ces
organites
contiennent
un
matériel
génétique
propre.
Cependant, elles révèlent que les protéines présentes dans
ces plastes
ne
sont
pas
toutes
codées par
le
génome
chloroplastique : une
partie d'entre elles est
codée par
le génome
nucléaire
(ELLIS, 1981).
Une
étude de
l'ex-
pression
des
gènes
plastidiaux
et
nucléaires
a
été
réalisée récemment chez le poivron (KUNTZ et
al.
, 1989).
Ces
travaux
indiquent
que
les
profonds
remaniements
structuraux
et
biochimiques
observés
au
cours
de
la
transition du chloroplaste en chromoplaste sont associés à
une
expression
différentielle
des
gènes:
l'appareil
transcriptionnel plastidial est actif; en revanche, au ni-

87
veau de la synthèse protéique, on assiste à une perte des
.
capacités du plaste.
Récemment les travaux
effectués par
CARDE et
al.
(1988)
sur les
plastes
de
fruits et
de
feuilles de poivron vont dans le même sens.
En effet, ces
auteurs montrent que le nombre de
ribosomes présents dans
les chloroplastes diminue au cours de
la maturation. Dans
le fruit
mûr,
les
ribosomes sont
tota-lement
absents.
HANSMANN et
al.
(1985)
avaient déjà
noté une baisse
du
contenu en nucléoïdes des chromoplastes
de narcisse. Dans
ce contexte, il convient de souligner que
la synthèse des
enzymes impliquées dans
la biogénèse des
terpénoïdes est
strictement sous la dépendance du génome nucléaire dans le
cas de
l'IPP isomérase,
de
la GGPP
synthase
et de
la
phytoène synthase (CAMARA, 1984; CAMARA et al.
, 1989, en
préparation).
Les études
menées sur les
voies de biosynthèse
des
chlorophylles
et des
prénylquinones ont
montré que
leur
formation,
en dehors
de celle de l'alcool
en C20 qui est
le
précurseur
commun
à
de nombreux
terpénoïdes
(caro-
ténoïdes
notamment), comporte des réactions de méthylation
dans
lesquelles
le principal
donneur de
méthyle est
la
S~.
L'étude de l'activité de la MAT
(enzyme qui catalyse
la
synthèse
de
ce
dernier
composé)
au
cours
de
la
maturation
du fruit de poivron nous a permis d'obtenir les
résultats suivants : la S~ est synthétisée in vitro par

88
trois isoenzymes isolées du fruit vert. Dans le fruit mûr,
nous
n'avons pas pu mettre
en évidence la présence
de la
MAT.
Le fruit mûr contient même une protéine qui inhibe la
synthèse
de la SAM. Cependant,
le rôle
important que joue
la
SAM dans l'ensemble du métabolisme cellulaire conduit à
s'interroger
sur l'origine des molécules
de SAM utilisées
dans
le métabolisme
du fruit
mûr. On
peut supposer
que
l'inhibiteur
libéré
au
cours
de
l'extraction
pourrait
occuper,
in vivo, un compartiment
cellulaire différent de
celui
où se
trouve le site
de biosynthèse de la
SAM. On
peut
également imaginer
que le fruit
vert soit le
siège
d'une
production de
SAM suffisamment importante
pour as-
surer
ensuite, en l'absence de
nouvelles synthèses,
l'ap-
provisionnement
des diverses voies utilisant ce métabolite
dans
le fruit mûr.
Par ailleurs, MURPHYet
SPENCE (1972)
ont
mis en
évidence un transport
de cette molécule
d'un
compartiment cellulafre à un autre.
Pour cerner le problème
du métabolisme de la
SAM et
de son intervention
dans la biosynthèse
des terpénoides,
il serait utile d'effectuer le dosage de
la SAM endogène,
d'étudier la compartimentation cellulaire des isoformes de
la MAT et de suivre l'évolution de leur
activité au cours
de la maturation.
Les résultats de tels travaux pourraient
fournir des
données
complémentaires
pour une
meilleure
connaissance
de
l'interdépendance
entre
SAM
et
terpénoïdes.

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II?SA.Wf:~~::'.:
~
1.
RESUME
Chez
les
vegetaux
supérieurs,
le compartiment
plastidial est le
site de
biosynthèse de prényllipides spécifiques. Parmi ceux-ci on distingue, d'une part, les
caroténoides,
qui
sont
des
terpénoides au
sens
strict, et, d'autre
part,
les
chlorophylles et les prénylquinones, dont la molécule, en plus d'une chaîne latérale
isoprénique, contient un noyeau non terpénique.
L'étude des enzymes impliquées dans la synthèse de ces composés a fait l'objet
de ce travail.
Les résultats expenmentaux ont été regroupés en deux parties : étude ces
enzymes intervenant dans la synthèse du phytoène (premier carotène formé et
..
précurseur de tous les autres caroténoides) et étude de l'activité méthionine
adénosyltransférase, enzyme qui catalyse la synthèse de la S-aclénosylméthionine,
composé impliqué dans la synthèse des chlorophylles et des prénylquïnones.
1 - ETUDE DES ENZYMES INTERVENANT DANS LA SYNTHESE DU PHYTOENE
Le stroma obtenu à partir de plastes purifiés effectue la synthèse du phytoène
en présence de l'isopenténylpyrophosphate ou du pyrophosphate de préphytoène.
Cette synthèse est suivie de celle des caroténoides plus insaturés si le milieu
dl incubation contient des structures membranaires.
Les expériences effectuées en présence de l'isopenténylpyrophosphate montrent
que la synthèse du phytoène est régulée par la composition et la concentration en
cations divalents, notamment le Mg 2t e t le Mn 2+. En l'absence de ces ions, il n'y a
synthèse ni du phytoène, ni des prénylpyrophosphates. Par contre, en présence de
ces cations, on note une incorporation de ce substrat dans Je phytoène et dans les
prény lpyrophospha tes. Toutefois, cette incorporation dépend de la concentration ce
ces ions dans Je milieu réactionnel.

-
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2.
Pâr ai11eurs, la synthèse du phytoène par le stroma, ainsi que ce11e des
prénylpyrophosphates, est inhibée par l'aminophénéthylpyrophosphate. En revanche,
en présence du diméthyla11ylpyrophosphate et de cet analogue de l'isopentényl-
pyrophosphate, toutes ces molécules sont synthétisées. L'étude du ~ de l'amino-
phénéthylpyrophosphate révèle que c'est un inhibiteur compétitif de l'isopentényl-
pyrophospha te isomé rase.
Les enzymes impliquées dans la synthèse du phytoène ont été purifiées à partir
de stroma de chromoplastes de poivron. Les résultats obtenus montrent que cette
synthèse fait intervenir successivement l'isopenténylpyrophosphate isomérase
03.500 Da), la géranylgéranylpyrophosphate synthase (74.000Da) et la phytoène
synthase (47.000Da).
Toutes ces enzymes sont actives dans le stroma d'amyloplastes, d'étioplastes
et de chloroplastes des espèces végétales examinées (blé, épinard, mats, orge et
pois).
Dès tests d'immunoprécipitation ont été effectués avec un anticorps anti-
phytoène synthase, préparé à partir de phytoène synthase de stroma de chromo-
plastes de poivron. Ils montrent que cette dernière présente les mêmes propriétés
immunochimiques que la phytoène synthase mise en évidence dans les amylo-
plastes, les étioplastes et les chloroplastes.
II - ETUDE DE L'ACTIVITE METHIONINE ADENOSYLTRANSFERASE
L'activité de la méthionine adénosyJtransférase a été étt.ldiée dans le fruit de
poivron au cours de la maturation. L'activité de l'enzyme, importante dans le fruit
vert, décroît rapidement au cours de la maturation. Cette activité n'a pas été
décelée dans le fruit mûr, dont l'extrait inhibe même, in vitro, la synthèse de la
S-adénosylméthionine.
Dans le fruit vert, la méthionine adénosyJtransférase est présente sous trois
formes que nous avons appelées formes l, II et III. Elles sont toutes inhibées par lé
cycloleucine, le tripolyphosphate, le p-chloromercuribenzoate et l'hydroxyphényl-
glyoxal. Par contre, e11es diffèrent les unes des autres par leurs poids moléculaires

3.
et leurs constantes cinétiques vis-à-vis de la méthionine. les résultats expen-
mentaux révèlent que seule la forme Il est stimulée par le bicarbonate de sodium
(l'activité est multipliée par un facteur supérieur à 7), tandis que le diméthyl-
sulfoxyde augmente l'activité de la forme III, qui se trouve multipliée par un
facteur voisin de 50.
La méthionine adénosylytransférase est également présente sous trois formes
dans les feuilles de. poivron et de tomate ainsi que dans les cellules isolées de
poivron.
III - CONCLUSION
Au terme de cette étude, nous pouvons retenir, parmi les faits les plus
saillants, les deux points suivants:
..
- Les enzymes impliquées dans la biosynthèse du phytoène à partir de l' isopenté-
nylpyrophosphate ont pour la première fois été purifiées et les caractéristiques
propres à chacune d'elles ont été déterminées.
- Les différentes formes de la méthionine adénosyltransférase mises en évidence
chez les végétaux présentent des similitudes avec celles isolées de tissus
animaux ou de microorganismes.