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THÈSE
N° D'ORDRE: 175/92
présentée à la
Faculté des Sciences et"Techniques
de
L'UNIVERSITÉ NATIONALE DE CÔTED'oIVOIRE
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pour obtenir le titre de
DOCTEUR se CYCLE
Spécialité: BIOCHIMIE
Programme: Biotechnologie et AméUoration des Productions Végétales
Option : Sctences et Blotechnolegle des AUments
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Soutenue publiquement le 19/10/92 devant la Commission d'Examen:
Composition du Jury:
Président:
Monsieur Jacques DIOPOH
Professeur à l'Université
Nationale Côte d'Ivolre
Examinateurs:
Monsieur Georges AGBO N'ZI
Maitre de Coriférences d l'Universtté
Nattonale de Côte d'Ioolre
Madame Bretln-Miretlle DOSSO
Professeur Agrégé d l'Untverstté
Nationale de COte d'Ioolre
Monsieur Gutllaume LOUKOU
Professeur Agrégré d l'Université
Nationale de COte d'Ioolre
CENTRE DE REPRODUCTION DE L'ENSEIGNEMeni SUPéRIEUR 9581 92
Heureux l'Homme qui trouve son plaisir
dans la loi de l'Eternel, et qui la médite jonr et nuit;
il est comme un arbre planté près d'un courant d'eau
qui donne son fruit en sa saison
et dont le feuillage ne se tlétrit point: tout ce qu'il fait lui réussit.
Psaumes 1; 1.3
Un bon arbre ne peut porter de mauvais fruits
ni un mauvais arbre de bons fruits
vous les reconnaîtrez donc à leur fruits.
Mathieu 7, 18-20
r
1
Quinconque jugera avec impartialité
les résultats de ce travail
reconnaîtra avec moi que la fennentation
s'y montre correlative à la vie
Louis Pasteur: ·Mémoire, sur la fermentation·
Août 1857
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A TOUS MES FRERES ET SOECRS
A ceux et celles c;~i témoignent d'une sincère fraternité
pour ma personne. pour les soutiens qu'ils m'ont apportés
tout au long de mes cycles universitaires que l'Eternel des années
en gage de ma re:: :nnaissance les comble de sa bonté.
A. TONTON RAPHAEL
Ce travail est le [n::t de tes conseils
de ton soutien tant :noral que matériel
aussi en signe de r~connaissance, cette thèse
je te la dedie avec :'expression de mon attachement fidèle.
A tantie OUSSOC
A tantie Simone
pour son soutien eT sa bonté
attachement filial
A tantie SEC K Thérèse
A toutes mes tantes et
reconnaissance inf::::ie
tous mes oncles
A TOUS ~lES PARE~TS
Pour qui cette reus~:ce constitue une source de joie
que vos enfants err:;:runtent tous cette voie.
A TOCS :\\IES A\\IIS
Rien de plus commun que le nom
Rien de plus rare que la chose
- KO~Ai"l" ~lagloire
- BOGUIFO Charles
- AKA ANGHUI Phillipe
- EHOLIE Serge
- BOKA Thomas.
A TOUS :\\lES A:\\tIIS
- de la FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES D'ABIDJAN
- de la FACULTE DE PHARMACIE D'ABIDJAN.
" in memorium"
- A toi DOUKA Eva
- A Tonton FLANKLIN
- A toi DOLl<A Adolphe
- A toi Nlaître Y AHAUT Théodore
- A toi DION:ffi Ketty
- A toi KOUAME Fabrice
Et A toi KANlA~O Henriette
A ~IO~ ~IAITRE ET DIRECTEl;R DE THESE
A ~lO~SIEUR AGBO N'ZI GEORGES, Ph. D.
~laître de Conférences, Département de Biochimie, Responsable
Technique de l'Option Biotechnologie et Science des aliments du
Programme de Biotechnologie et Amélioration des Productions
Végétales, Faculté des Sciences et Techniques, Université Nationale de
Côte d'Ivoire
Vous avez fait plus que m'accueillir dans votre laboratoire;
Vous m'avez inculqué les exigences de la recherche scientifique.
En contribuant sans cesse à son orientation et son élaboration,
Vos précieux conseils sont à l'origine de ce travail
qui est et demeure le vôtre.
Votre genie irrefutable, marqué par le fait que des personnes mal
intentioonées se soulèvent contre vous, votre rigueur scientifique et
votre disponibilité légendaire m'ont fasciné.
Et pour to~t ceci, trouvez ici l'expression de ma gratitude et mon
Iprofond respect.
A MADA:YIE DOSSO BRETIN MIREILLE
PROFESSEl"R AGREGE
Maître de Confére:1ces agrégé de Bacteriologie - virologie à la
faculté de médeciI:e Université Nationale de Côte d'Ivoire
Chef de service d'J laboratoire de Bactérologie-virologie de
l'Institut Pasteur c:e Côte d'Ivoire.
Malgré vos multiples préoccupations, vous m'avez acceuilli dans votre
laboratoire où vous m'avez même adopté.
Avec beaucoup d'e:1thousiasme vous aviez été associée dès le départ a ce
travail et vous aviez contribué efficacement à l'of!!anisation et à la
....
supervision de la ?artie microbiologique.
Votre dévouement. votre passion pour la recherche appliquée,le sceau de
votre multidisciplinarité et votre esprit de charité m'ont pour toujours
marqué.
Et c'est avec beJ-LlCOUP de reconnaissance que je tiens à vous exprimer
mes remerciements les plus sincères;
A "IO:\\"SIELR DIOPOH K. Jacques
Professeur Titulaire, Département de biochimie
Doyen de la faculté des Sciences et Techniques, Université Nationale
de Côte d'Ivoire.
Votre sollicitude. votre grande ouverture d'esprit, votre sensibilité aux
problèmes des étudiants et votre paternalisme envers ces derniers sont
appréciés par tous ceux qui ont eu comme moi. le privilège d'être vos
étudiants.
J'ai toujours admiré votre constante disponibilité, votre humilité, votre
force de travail et surtout l'homme de coeur que vous êtes.
En acceptant de présider notre jury de thèse avec spontanéité malgré vos
multiples préoccupations. vous .nous honorez et nous en sommes très
reconnaissants.
Veuillez trouver ici l'expression de nos sincères remerciements et de
notre indéfectible attachement.
Hommage respectieux.
A :VI0~SIECR GCEDE Guina
Maître de Confére:1ces, Chef du Département de Biochimie
Faculté des Scienc~s et Techniques, Cniversité ~ationale de Côte
d'Ivoire.
Vous qui m'aviez toujours bien accueilli quand j'ai eu besoin de votre
aide et de V:JS conseils. Trouvez l'expression de ma reconnaissance, de
mon estime et l'hcmmage d'un étudiant.
A MONSIECR LOLKOlJ Guillaume
Professeur agrégé de Nlicrobiologie, Chef du Département de
Microbiologie. Faculté de Pharmacie, université );ationale de Côte
d'Ivoire.
Directeur du Laboratoire National de Santé Publique.
Je garde un excellent souvenir de l'enseignement que vous m'avez
prodigué à la Faculté.
Je suis tout particulièrement sensible à l'honneur que vous me faites en
acceptant de juger ce travail. Je vous exprime l'hommage de mon
profond respect.
- A .\\'I01\\SIELR EHOL~IA~ Armand
Directeur de l'Institut Pasteur de Côte d'Ivoire:
- A ~IO~SIECR YAPO A. Etienne
Professeur agrégé de Biochimie
Doyen de la faculté de Pharmacie d'Abidjan.
- A Monsieur le Directeur des orientations et des bourses.
-A tous les Professeurs du Départrnent de Biochimie de la Fa:..:ulté des
Sciences et Techniques
Pour toute leur contribution à notre formation
A :\\IO~ PARRAI~
~lonsieur Lambert KOCASSI KO:\\.-\\.~
Ministre àe l'Agriculture et des Ressources Animales
v ous avez accepté sans hésiter de parrainer cette thèse avec joie et gaité
et d'y assister en personne malgré vos préoccupations multiples.
C'est un grand honneur pour moi et ma famille.
Votre sollicitude, votre disponibilité, vos immenses qualités humaines et
votre impressionnante bonté forcent l'adminiration que je vous ai
toujours porté.
Veuillez accepter, Cher Parrain, l'expression de ma profonde
gratitude.
A ~lonsieur Patrice KOUA:\\-IE
~linistre de la Fonction Publique et de l'Emploi
A vec tout mon respect et toute ma reconnaissance
A ~lonsieur Alasane SALIF N'Diaye
Ministre de la Recherche Scientifique et de l'Enseignement Technique
A vec tout mon dévouement et toute mon admiration pour l'intérêt que
vous avtt: porté envers ce travail scientifique.
A ~Iadame ÉHOLIÉ Rose
Infinie reconnaissance
A MONSIEUR KOLA A~IIA~
Comme un aimant tu m'as attiré et initié aux techniques de la
microbiologie des aliments
Ton dynamisme et tes conseils ont apporté
une contribution inestimable à l'élaboration de ce travail
Reçois donc mon infmie reconnaissance et mon attachement filial.
- Au Personnel du Département de Biochimie de la Faculté des Sciences
et Techniques Université de Côte d'Ivoire
- A la grande famille de Bactériologie de l'Institut Pasteur de Cocody
A Mlle Ol'ASSA Monique
Spontanément tu as accepté de dactylographier cette étude
Avec beaucoup de patience, d'efficacité, et de dynamisme.
Ta contribution à la confection de ce travail est inestimable
Ton enthousiame et ta gentilesse sont uniques; merci MOYA.
A Mlle BOLA , ~111e Eugénie, ~lme KORE, ~Ime DJRO, "Ir.
KOFFI et ~Ir ~IEGNASSA:\\T
Pour leur concours dans la perfection de la présentation de cette thèse.
A tous ceux dont je n'ai pas pu citer les noms et dont je n'ai pourtant
pas sous estimé la contribution.
SOMMAIRE
AJ.- INTRODUcrIO~
1
A.Ll - LE PAL\\1IER RONIER
1 .
A.LI.l - CLASSIFICATION BOTANIQUE OU POSITION
..
SYSTEMATIQUE
1
A.I.l.2 - ORIGINE ETHNOBOTANIQUE - DISPERSION ET
DISTRIBUTION GEOGRAPillQUE
2
A.I.l:3 - ~10RPHOLOGIE ET BIOLOGIE
.4
/\\.1.1.3-1 - LE STIPE
4
A.I.l.3-2 - LES FEUILLES ET LES PETIOLES
6
A.I.1.3-3 - LES FLEURS ET LES INFLORESCENCES
.......................................................................................................6
A.L1.3-4 - LES FRUITS ET GRAINES
8
A.LiA - UTILISATIONS ALIMENTAIRES
9
A.I.l.4.-1 - LA SEVE
~.:
9
A.I.l.4-2 - LES FRUITS
1 2
A.L 1.5- Autres utilisations
;
,
1 5
A.I.2. - LES CRITERES MICROBIOLOGIQUES
·~_~:~~
.
APPLICABLES AUX FRUITS ET AUX ALI~NTS
1 7
A.l.2~1 -ARGUMENTS JUSTIFIANT L'UTILISATION DE
CRITERES
1 7
AJ.2 2.- LES FRUITS ET LEGUMES
1 9
A.J.2.3 - LES ALIMENTS EN GENERAL
1 9
A.L3A -LES LIMITES DES CRITERES
MlCROBIOLOGIQUES ET LE PLAN
DcCHANTILLONNAGE
22
A.I.3A-l - Les limites des critères
microbiologiques
2 2
A.I.3A-2 - Le plan d'échantillonnage
2 3
A.I.J.5 - LE PROBLEME DES NORMES
MICROBIOLOGIQUES EN ZONE TROPICALE
24
A.I1 - MATERIEL ET !\\ŒTHODES
2 6
A.lI. 1 - MATERIEL
26
A.iLl.l - ~1ATERIEL BIOLOGIQUE: LA PULPE DU
FRUIT DU PALMIER RONIER
2 6
A.ILI2 - LES APPAREILS
26
A ~Ll J - LES MILIEUX DE CULTURE (isolement et
enrichissement)
27
,.\\.11.1.3··1 - Les milieux solides
27
A.IL 1.3-2 - Les milieux liquides
28
A.I1.1.4 - LES' DIVERS MATERIELS DE
~flCROBIOLOGœ
28
Il
A.II.2 -LES METHODES DE DENOMBREMENT ET
.
D'IDENTIFICATIONS DES MICROORGANISMES
RETENUS POUR L'ANALYSE
2 9
A.II.2.1 - LES GERMES AEROBIES MESOPHILES
(G.A.~.)
29
A.Il.~..2 - LES COLIFORMES TOTAUX (C.T.)
2 9
A.H.1.3 -LES COLIFORMES1HERMOTOLERANTS
..
.
(C.Th.)
30
A.II.2.4- LES A.\\lAEROBIES SULFITO REDUcrRICES A
46°C (A.S.R)
..
................................................................................................................ 3 0
A.a.2.S - STAPHYLOCOCCUS aureus (STA.)
31
A.II.2.S-1 - La staphylocoagulase libre
32
A.II.2.S-2 - La désoxyribonucléase : Dnase
3 2
A.II.2.5-3 - L'utilisation du mannitol
3 2
A.ii,2.6 - LES S1REPTOCOQUES DU GROUPE D
3 2
A.II.2.7 - SAL!\\.fONELLA
3 3
A.II.2.8 - LES LEVURES ET LES MOISISSURES
3 6
A.II.2.8-1
- Les tests physiologiques
3 7
A.II.2.8-2 - Les tests biochimiques
d'identification
3 7
AJ 1.2.9 - LACTOBACILLUS
3 9
A.II.2.10 - LEUCONOSTOCS
40
A.II.3. - PROTOCOLE MICROBIOLOGIQUE UTILISE
4 2
A.II.3.1 - PREPARATION DE L'ECHANTILLON ET DE LA
SUSPE~SION MERE
4 3
A.lL3.2 - PREPARATION DES DILUTIONS DECIMALES
................................................................................................................ 43
A.IIJ.3 - INOCCLATION DES MILIEUX DE CULTURE
45.
A.II.3.-3 -1 - La technique par incorporation
.4 5
.\\.11.3.3-2 - La technique par inondation
et étalement
4 6
A.II.3.4 - ANALYSE COMPLETE DE LA PULPE
DU FRUIT DU RONIER
4 7
A.I1.3.4-1 - Jour JO
4 7
A.l1.3.4-2 : Jour J+ 1 (24h)
S 0
A.I1.3.4-j - Jour J+2 (48 h)
5 2
A.II.3.4-4 - Jour J+3 (72 heures)
;
54
A.II.3.4-4 - Jour J + 4 (96 h)
S 6
A.l1.3.4-S - Jour J + 5 (120 h)
5 7
III
A.III -RESULTATS ET DISCUSSIONS
58
A.I1Ll - LES GERMES AEROBIES MESOPHILES
TOTAUX (Critère < 300.000 germes/g)
5 8
A.III.2 - LES COLIFORMES TOTAUX
6 2
A.III ..3. - LES COLIFORMES
.
THERMOTOLERANTS (Critère < 10 germes/g)
6 5
A.IIIA
LES BACfERIES ANAEROBIES
.
SULF1TO - REDUCTRICES
67
A.III.5 - STAPHYLOCOCCUS aureus
6 7
A.III.6. - LES STREPTOCOQUES du Groupe D ENTEROCOCCUS
............................................................................................................................ 7 0
A.I1L7 - L'ESPECE SALMONELLA
72
A.III.8 - LES LEVURES ET LES MOISISSURES
73
A.III.9- LAC.TüBACILLUS
8 2
A.m.10- LEUCO~OSTOCS
82
A.IV - CONCLUSION ETPERSPECfIVES
8 5
B.I -LA PRODUCfIO~ D'ETHANOL A PARTIR DU rus DE RONIER
8 7
B.II - MATERIEL ET ~ŒTHODES
89
B.ILl - MATI~RŒL
8 9
B.II 1.1 - LE MATERIEL VEGETAL
8 9
B.I1 1.2 - LE MATERIEL MICROBIOLOGIQUE
92
B.n 1.3 - LE MATERIEL DE FERMENTATION
95
B.II 2 - METHODES ANALYTIQUES
9 7
B'I1 2.1 - Le potentiel hydrogène (pH)
9 7
B.I1 2.2 - Détermination de la concentration de sucres
totaux
9 7
B.I1.2.3 - LA PRODUCfION D'ETHANOL
9 9
B.I1 2.4 - CALCUL DES RENDEMENTS, ET DES
PROI)ücnvrrES
100
B.III -RESULTATS ET DISCUSSIONS
103
B.I1I. 1 - VARIATIONS DU POTENTIEL HYDROGEl'Π(pH)
1 03
B.III. 1.1. - Avec une concentration initiale en sucre
totaux égale à 100 g/l
l 03
B.III 1.2 - Avec une concentration initiale en sucres
totaux égale à 150 gll
l 03
B.lil. l.3 - Avec une concentration
initiale en sucres
totaux égale à 200 gll
l 06
8.111.2 - COr--:SO\\IMATION DE SUBSTRAT
108
B HI.2.1 - Avec une concentration initiale en sucres
totaux égale à 100 g/l
108
B .111.2.1-1
- Température de fermentation
:
30°C
1 08
IV
B.III.2.1-2 - Température de fermentation :
35°C
1 09
B.111.2.1-3 - Température de fermentation :
37°C
1 09
B.I1L::'.2 - Avec une concentration initiale en sucres
totaux égale 150 g/l
.1 1 3
B.1I1.2.2-1
- Température de fermentation :
30° C
113
B .111.2.2-2 - Température de fermentation :
35°C
1 14
B .111.2.2-3 - Température de fermentation :
37°C
1 14
B.III 2.3 - Avec une concentration initiale en sucre
totaux égale à 200 g/l
.1 1 9
B .111.2.3-1 - Température de fermentation :
30° C
1 1 9
B.III.2.3-2 - Température de fermentation :
35°C
119
B.lII ..2.3-3 - Température de fermentation :
37 ° C
;
1 1 9
B.Il!.3 - LES RENDEMENTS
124
B.III.3.1 - Avec une concentration initiale en sucre
totaux égale à 100 g/l
: 1 24
B.lII.3.1.1.- Température de fermentation :
30°C
124
B.lII.3.1.-2 - Température de fermentation :
35°C
126
B.lII.3.1-3 - Température de fermentation :
37°C
126
h.III.3.2 -Avec une concentration initiale en sucres
totaux égale à 150 gll
.1 .28
H.1I1.3.2-1
- Température de fermentation :
30°C
128
8.111.3.2-2 _ Température de fermentation :
35°C
l 30
i3 .111.3.2-3 - Température de f~rmentation :
37°C
130
B.III
3.3. -Avec une ci)ncentration initiale en sucre
totaux égale 200 g/l
1 32
B.I1l.3.3.1
- Température de fermentation:
30°C
1 32
d.III.3.3-2
- Température de fermentation
35°C
134
v
B .111.3.3-3 :- Température à fermentation
:
37°C
134
B.III.4 -LES PRODUCfIVITES
1 36
B.lH.4.l.
- Avec une concentration initiale en sucres
totaux égale à 100 g/l
.l3 6
B.lII.4.2
- Avec une concentration initiale en sucres
totaux égale à 150 g/l
.l 3 8
B.III .4.3 - Avec une concentration initiale en sucres
totaux égale à 200 g/l
14 1
B.III.5 - CRITIQUES DES RESULTATS
ET RECOMMANDATIONS
143
B.III.5.1 - AU NIVEAU DES ESSAIS
143
B'[II.5.2 - AU NIVEAU DES ANALYSES
.143
B.lIl.S.3 - AU NIVEAU DES CULTURES CELLULAIRES
.............................................................................................................. 1 44
B.III.'jA AU NIVEAU DES RESULTATS
144
B.IV - CONCLUSION ET
PERSPECTIVES
1 4 6
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES
vi
ABREVIATIONS
A.D.N
Acide désoxyribonucleique
AFNOR
Association Française de Normalisation
A.P.1.
Appareils et Procedés d'Indentification
A.T.P.
Adénosine Triphosphate
A.S.R.
Anaérobies sulfito-Réductrices
AUX.
Auxanogramme
·~t)C
Degré Celsius
C.T.
Colifonnes Totaux
C. Th
Colifonnes Thermotolérants
DO
Densité Optique
FAST
Faculté des Sciences et Techniques
g
Gramme
gll
Gramme par litre
G.A.M.
Germes Aérobies Mésophiles
h
Heures
J.O.
Journal Official
mg
Milligramme
ml
Millilitre
pH
Potentiel Hydrogène
Pr
Productivité
R.L.p.
Rendement par rapport au rendement
limite
Pratique
R.L.t.
Rendement par rapport au rendement
limite
théorique
So
Concentration initiale en sucres totaux
T.LA.C.
Toxi-Infections Alimentaires Collectives
U.L
Unité Internationale
VII
LISTE DES TABLEAUX
TABLEAU
Pages
1 -
Localisation géographique et peuplement
5
du Rônier enAfrique
2-
Composition du fruit du Rônier frais
10
3 -
Composition chimique des aliments tirés
Il
du Rônier
4!.
Composition chimique de la sève du Rônier
13
5 -
Critères microbio1ogiques utilisés pour
25
nos analyses
6 -
Conditions de culture des gennes r~herchés
41
'r
•
7 -
Fréquence des G.A.M. isolés des,ffüits du lot 1
60
8 -
Fréquence des G.A.M. isolés des~~tsdu Igt2
60
'.
9 -
Fréquence des colifonnes totaux dans les fruits
63
du lot 1
10 - Fréquence des coliformes totaux dans les fruits
63
du lot 2
Il - Fréquence des coliformes thermotolérants dans
66
dans les fruits du lot 1
12 - Fréquence d'~s coliformes thermotolérants dans
66
dans les fruits du lot 2
13 -
Fréque:'I~e des A.S.R. dans les fruits du lot 1 et 2
68
14 -
Fréquence des S aureus dans les fruits du lot 1
68
15 -
Fréquei ..:e ',!es S.aureus dans les fruits du lot 2
68
viii
16 -
Fréquence des Streptocoques du groupe D dans
71
les frui ts du lot 1
17 -
Fréquence des Streptocoques du groupe D dans
71
ies fruits du lot 2
18 -
Fréquence des Sllmonella dans les fruits
71
du lot 1 et 2
19 -
Fréquence des levures isolées dans les fruits du lot 1
74
2Q'-
Fréquence des levures isolées dans les fruits du lot 2
74
21 -
Fréquence des levures identifiées dans les fruits
76
du lot 1
22 -
Fréquence des levures identifiées dans les fruits
76
du lot 2
23 -
Fréquence I~es Lactobacillus dans les fruits du lot 1
83
24 -
Fréquence des Lactobacillus dans les fruits du lot 2
83
25 -
Fréquence des Leuconostocs dans les fruits
83
du lot 1 et 2
26 -
Synthèse des résultats
84
27 -
Liste des souches présélectionnées et testées
94
28 -
EvolutiüD du pH au cours de la fennentation avec
104
So =100 g/l
29 -
Evoluti')n du pH au cours de la fennentation avec
105
..~o =150 g/l
30 -
Evolution du pH au cours de la fennentation avec
107
So =::00 g/I
31 -
Evaluatiort des pe:fonnances des souches à 30° C
110
avec 50 = 100 gli
IX
32 -
Evaluation des perfonnances des souches à 35° c
"111
avec So ::: 100 g/l
33 -
Evaluation des perfonnances des souches à 37°
112
avec So ::: 100 g/l
34 -
Evaluation des perfonnances des souches à 30° C
115
avec So ::: 150 g/l
35 -
Evaluation des perfonnances des souches à 35° C
116
avec So ::: 150 g/l
36 -
Evaluation des perfonnances des souches à 37° C
117
avec So ::: 150 g/l
37 -
Evaluation des perfonnances des souches à 30° C
120
avec So::: 200 g/l
38 -
Evaluation des perfonnances des souches à 35° C
121
avec So ::: 200 g/l
39 -
Evaluation des perfonnances des souches à 37° C
122
avec So = 200 g/l
40 - Synthèse des résultats avec So = 100 g/l
125
41 - Synthèse ries résultas avec So = 150 g/l
129
42 - Synthèse dt;s résultats avec So ::: 200 g/l
133
43 - Classement des souches avec So =100 g/l
137
44 - Classeme;lt des souches avec So =150 g/I
139
45 - Classement des souches avec So =200 g/l
142
x
LISTE DES PHOTOS
PHOTO
Pages
1 : Le palmier rônier dans la savane Baoulé
2 : Pulpe du fruit de rônier et autres éléments constitutifs
44
3 : ALIQUOT de 25 g de pulpe dilué au 1/1 0
44
4 :. Gennes Aerobies mésophiles isolés du fruit de rônier
61
5 :' Colonies de colifonnes
64
6 : Colonies de Staphylococcus aureus
69
7 : Colonies d·;;: Levures
75
8 : Caractères bio~himiques d'identification de Candida
78
guilliennondii (plaque API 20C aux)
9: Culture pure de Candida guilliennondii
78
10 : Système de fermentation utilisé
96
XI
LISTE DES FIGURES
FIGURE
Pages
1 : Distribution mondiale du rânier
3
2 : Localisations ouest africaines du rânier
3
3 ~'Borassus aethiopum dans la savane de Sakassou
7
4 : Morphologie interne et externe d'une drupe
7
5 : Fréquence des Levures identifiées des fruits du lot 1
79
6 : Fréquence des Levures identifiées des fruits du lot 2
79
7 : Protocole pOlir l'extraction du jus de rônier
90
AVANT-PROPOS
En Côte d'Ivoire, au cours du premier et troisième trimestre de chaque
année, la forte population de palmier Rônier (Borassus aethiopum) située dans
la zone du "V Baoulé" (VIA'ITOUX R., 1968) produit une quantité importante
de fruits très riches en glucides.
Dans ce pays ainsi que dans la sous-région Ouest africaine, le palmier .
Rônier est avant tout un producteur de palme et ses fruits ne sont utilisés qu'à
des fms alimentaires.
Pourtant, la forte teneur en sucres fermentescibles de ces fruits : 65 %
(BUSSON, 1965) constitue une matière première intéressante pour la
prQduction d'alcool médicinal par la voie fermentaire en utilisant des micro-
orgfU1ismes appropriés.
Toutefois, en Côte d'Ivoire, l'utilisation de ce fruit comme substrat
potentiel pour la production d'alcool éthylique n'a jamais été l'objet d'une
étude scientifique. D'où la nécessité d'entreprendre une recherche des micro-
organismes adaptés à la biodégradation de ces sucres ainsi que des facteurs
biochimiques et physicochimiques susceptibles d'augmenter le rendement de
cette production.
Afm donc de valoriser les fruits du palmier Rônier, nous avons réalisé
au Laboratoire de biochimie et de biotechnulogie des aliments de la Faculté de
Sciences d'Abidjan en collaboration avec le Laboratoire de bactériologie-
virologie de l'Institut Pasteur de Cocody, un programme de recherches suivant
les objectifs ci-après:
A • Objectif 2énéral:
Etude du processus de la fennentation alcoolique du fruit du palmier
"Rônier" par des souches microbiennes naturelles et présélectionnées. Ceci
dans le but de produire de l'alcool à usage médicinal.
B • ab iectifs spécifiques:
1 - Isolement, identification et caractérisation des principales souches
microbiennes présentes dans le fruit du Rônier pour une évaluation
sur les plans alimentaire et pouvoir fermentescible.
2 - Détermination des caractéristiques biochimiques de la fennentation
du jus de Rônier.
3 - Etabli~sement des paramètres physico-chimiques de la fermentation
en vue d'une optimisation du rendement des divers essais.
/'Iwlu 1:
/.1:" f':\\UIŒR RÔ/'l/ŒR [)..\\,,\\'S lA S.4VA,'\\ï:"
IUOUI.E
~~lUJIID~ J])J]J JL& :OOIIce~CQ)JFlli©m]]J
ID)UJ JFIJR1IJIT~ II»:JJ J.P&IL~1TIIrrn IR
'-0 (I(r~. ~~f "'r --cp lm
.l~V~, -..' rYI ~~
A.I. INTRODLCTION
A.LI - LE PAL~1IER RONIER
A.I.l.l .
CLASSIFICATION BOTANIQUE OU POSITION
SYSTEMATIQUE
Le palmier rânier est une plante arborescente dioique paléotropicale dont
le classification botanique est la suivante:
- embranchement des Phanerophytes
- sous-err.brarl'.:hement des Angiospermes
classe des Monocotylédones
1
_
- ordre des Palmales, des Spathiflorales ou Spadiciflorales
- famille des Arecacées
- sous famiiL des Borassoidées
- tribu des Horassées
- genre Porassus
Ce genre r{,nfenne un nombre variable d'espèces selon les auteurs.
En effet, BECCARI (1913) distingua:t dans sa classification 7 espèces,
tandis que UHL et DRA~SFIELD (1987) ne reconnaissent que 4 de nos jours.
Quelqut soit :,~ nombre exact des espèces au niveau taxonomique, les 3
espèces les plu, in,port:ir.res économiquement sont:
- Espèce : B. aeth:npum ou palmier rânier africain
H. fl abc r: fer ou palmier rânier asiatique
E.- sund:: :-:us ou palmier rânier indonésien
En Afrique de 1'01-1:' ~ les \\'ariérés existantes sont:
.B. aerhior··:'J. var séné9:alensis
ft. <h'thior - :n var hagamojensis
2
A.I.1.2 - ORIGI:\\E ETHNOBOTANIQUE - DISPERSIO~ ET
DISTRIBUTION GEOGRAPHIQUE
C'était dans les années 1750 que le palmier rânier fut observé pour la
première fois en Afrique et ce au Sénégal. Mais, ce n'était qu'en 1838 qu'une
distinction fut précisée entre le palmier rânier africain Borassus aethiopum
mart et le palmier rânier indien Borassus flabellifer communément appelé
"Palmyrah" et considéré pendant longtemps comme la seule espèce du genre
Borassus (GIFFARD, 1967).
Cette distinction fut par la suite confirmée par de nombreux auteurs
français et britanniques (WILLIAMS ON 1955 ; PORTERES, 1964-1965
BUSSON, 1965 et BLANC PAMARD, 1980)
Toutefois, le Borassu s demeure un genre petit, homogène et facilement
distinguable dans l'ordre des Palmales.
De nos jours, suire aux études génétiques (KOVOOR et HUSSEIN, 1983)
et ethno-botaniques, l'on considère que Borassus aethiopum (Africain) est
l'ancêtre du palmier rânier indien Palmyrah.
En effet, la majorité des auteurs (WATT, 1908 ; CHEVALIER, 1949 ;
THEINVENDIRARAJAH, 1986) sont d'accord sur le fait que le palmier
rânier soit né en Afrique. Seul LUBEIGT (1982) semble être pour une origine
indienne.
Les études de la distribution des populations du palmier rânier naturelles
et cultivées dans le monde ont montré qu'elles occupaient une bande dans la
zone équatoriale et s'étèndaient sur une superficie considérable d'environ 15°
de part et d'autre de l'équateur (DA VIS, 1987) (figure 1).
En Afrique, il forme d'immenses peuplements naturels allant de la
Mauritanie à Madagasc:lr : le palmier rânier caractérise les savanes guinéennes
et dans presque tous les pays d'Afrique de l'Ouest des localisations sont établies
(Figure 2).
3
Figure 1:
DISTRIBUTION MONDIALE DU RONIER
(PAL~IYRAH) ( Davis, 1987).
)_..r
.
Figure 2:
LOCALISA TIONS OUEST AFRICAINES DU
RONIER (Davis, 19H~7U)!-.
- - - - - - - - - - -
L'importance numérique des palmeraies et quelques données statistiques
grâce à des études bibliographiques diverses ont pu être établies.
La localisation géographique du rânier et le peuplement en Afrique est
consignée dans le tableau l.avec plus de précision que dans la figure 2
Le rânier ou rondier prend alors différentes dénominations en fonction
des régions. Ainsi, les principaux noms vernaculaires sont:
Kuhé ou Kùuhé chez les "Akans", Sébé chez les Bambaras et les Malinkés
Ronn chez les Ouoloffs.
, A.I.l.3 - MORPHOLOGIE ET BIOLOGIE
A.I.l.3·! - LE STIPE
Le Borassus aethiopum atteint facilement 15 à 20 mètres de haut en
moyenne (BUSSON, 1965). La taille de son stipe peut toutefois, s'élever
jusqu'à 30 mètre~ et son diamètre, aller jusqu'à 1 mètre (PüRTERES, 1964).
GRISARD (1901) a cependant pu rapporter la présence en Gambie d'un rânier
géant mesurant 40 mètres de haut avec 3 mètres de diamètre.
D'une façon générale, le palmier rânier possède un stipe rigide gris
irrégulièrement cylindrique et présentant plusieurs stries transversales qui sont
des cicatrices la i~;sées par la base des pétioles. Son tronc est malgré tout lisse,
renflé au tiers supérieur qui constitue une sorte de "ventre" caractéristique du
rânier africain et qui joue un grand râle dans la sève débitée. Il est couronné
par un panache ror.d de grandes feuilles palmées en éventail.
Tous ces éléments le font reconnaître de loin; c'est ainsi que les longs
n'mil.?rs ékvés a'JX larges palmes étalées marquent le paysage de la savane
baoulé (tïgun.~ ))
Compte tcnù de sa rigidité, le stipe du rânier est surtout employé commc
pilier de construction avec un choix porté sur les pieds mâles à bois plus épais
ct moelle moins abondante (PORTERES, 196'+). La longévité d'un pied est
estimée à plus de 1(X) ans.
5
TABLEAU 1 LOCALISATION GEOGRAPHIQVE ET
PEUPLEl\\1ENT DU RONIER EN AFRIQUE
((KOVOOR A, 1984)
PAYS
REGIO~
QUANTITE
AUTEURS
MAURITANIE
- TR-\\RZA
1000
Bellouard (1950)
-JOAL
200,000
- PODOR
SENEGAL
-M~TAM
Bellouard ( 1950)
- PIRE-GOUREYE.
60,000
- TA~1BACOUDA
:
- c.~P VERT
MALI
- K.-\\ YES
(60,000)
De Giron coun
- DJENNES
(1912)
GAMBIE
Présence
Grisard (1901)
GUINEE-BISSAU
Présence de denses
Casrel- Branco
forêts
Tordo (1956)
GUINEE
- D.-\\BOLA
Bellouard (1950)
- FÜUTA-DJAL.
- SA VANE COTE.
Poneres (1964)
D:..:'xJu
Busson (1965)
BI: ~~rvillc
Blanc-Pamard
COTE D'IVOIRE
- \\'.::' -V)ULE
( 19RO)
Tl;"
..:1<:
i J: . "-<lkro
B~-", 'ra
(31;RKINA F.-\\S~O
- FF.\\fORA
Bdlouard 11Y50)
\\/(jER/A
B:'-.SS/;.o.: DU
Cheval ia (1 Y-tY)
FLlTVE ','IGER
('()\\(;O
- U~:" \\'(J L 1
Chc\\ ~llJa (1 \\)~\\J)
T·\\\\'I.A~IE
- Z:\\ \\, ZIB.-\\R
Gri~ard 1 1\\J() \\ J
Beccari (1<) 131
- ~1V:;.oVOA y
Parier (il; Li
\\1AfJAGAS( '!\\R
- f3()"'~BETOK
B:lthie
.
- ~1:~; Ul''GA
Becc,ui
6
A.I.1.3-2 - LES FEUILLES ET LES PETIOLES
Les pétioles sont longs, leurs dimensions varient en effet entre 0,6 et 1,2
mètre. Elles sont bordées d'épines, grossièrement échancrées et supportent de
grandes feuilles qui couronnent le sommet du stipe.
La feuille e~~ palmée avec les divisions de limbe indupliquées (BUSSON,
1965). L'arbre produit environ une feuille par mois et une croissance nonnale
fournie 30 à 40 feuilles de 1 à 1,5 mètre de diamètre rangées en 3 tours de
spires (DAVID et JOH.\\'SON, 1987).
Elle est divisée entre 60 et 80 segments qUi mesurent enVIron 3
centimètres (MORTON. 1988).
Les jeunes feuilles déplissées ou non encore déplissées (feuilles de flèche)
peuvent être disjointes en leurs pinnules en vue de tressage ou confection de
chapeaux de différents modèles, des nattes pour cloisons et pour couchage,
d'emballage pour ks produits marchands, de jupes pour diverses cérémonies
religieuses ...
Les feuilles adultes sont employées comme abris-parasols ou abris-
parapluies à u~~ges divers (PORTERES, 1964).
A.LI.3-3 -
LES FLEURS ET LES
I~FLORESCENCES
Les premir'-es flora:sons apparaissent lorsque le palmier a entre 12 et 20
ans (PURSEGLOVE, 19-2).
C'est à cc moment ~:Je le sexe de chaque arbre sera connu. En effet, c'est
une plante dioique ~t l'c~. trouve d'une part, des pieds mâles dont ks spadices
gris plus volumi.l'.'üx m;;~urent environ 2 mètres de long et d'autre pan, des
pieds femelles dont les ~?Jdices d'un nombre variable entre 6 à 12 nroduisent
chacun près de 30 fruits ~lobuleux. orangés à maturité et disposé en régime
(FAIRCHILD, j CJ-l5).
7
---- -------------....--......_-------------
Figure
3
Borassus aethio Il
art. dans 1" savane de
SAKASSOU ( Blan
AMARD, 1980)
JoErr.ARffi
(pùpe)
,-
/ ,
i(ll.
1\\\\ \\
}
'.
\\
\\
-
Figure 4
;\\10RPHOLOGIE INTERNE ET EXTERNE D'UNE
DRUPE MATURE (\\Vhitmore, 1973).
8
. Ces spadices som composés d'épis ligneux, de petites' fleurs staminées et
sont regroupés à l'aisselle de chaque feuille (VEERASMY, 1979).
Ces épis de fleurs mâles séchés, calcinés et pulvérisés se mélangent à du
beurre de karité pour des applications en dermatologie sur les plaques de peau
grise fréquentes sur le torse.
A.I.1.3-4 • LES FRUITS ET GRAINES
. Les fruits et les graines au sens botanique du tenne, sont issus de la
tran~formation pour les uns de la paroi ovarienne ou gynécée, et pour les
au~res de l'ovule après fécondation.
Le fruit à maturité présente une paroi qui constitue le péricarpe avec un
ou plusieurs noyaux qui sont les graines.
Le péricarpe' est composé de 3 zones dont la constance et le
dévéloppement relatif est fonction de la nature du fruit (Figure 4).
Ainsi l'on distingue:
- l'épicarpe qui dérive de l'épiderme externe de l'ovaire
- le mésocarpe qui dérive du parenchyme de la feuille carpellaire
- l'endocarpe qui dérive de l'épiderme interne de l'ovaire.
Les pieds femelles du palmier rânier produisent des fruits dits charnus à
noyaux, dérivant de la transfonnation de la sclérification de l'endocarpe.
Ces fruits sont communément appelés des trupes. Un arbre mature peut
donner annuellement près de 200 à 300 drupes (DAVIS and JOHNSON, 1987
PADMANABHAN·D. and Coll, 1978).
La drupe du rânier est, à maturité, une grosse boule ovoide de la taille
d'une noix de coco.
La paroi du fruit, issue de la paroi ovarienne et initialement verte, prend
la couleur jaune orangé caractéristique à maturité. Le fruit charnu atteint 15
cm de long sur 12 cm de large et pèse de 1,5 kg à 3 kg. Il est doté à sa base
d'un calice fonnant une sorte de cupule.
9
Ainsi sous un exocarpe ou épicarpe fibreux, on trouve un mésocarpe
charnu et fibreux appelé pulpe, de saveur agréable mais à goût de térébenthine.
La pulpe·mûre est jaune, rouge-grenat ou café au lait suivant les variétés.
Elle est sucrée, jut~use et très prisée par les africains. Le mésocarpe est pourvu
du 3 noyaux ligneux comprimés (Figure 4).
La graine quant à elle contient un albumen régulier cartilagineux creux à
maturité et un embryon vertical.
La composition des différentes parties du fruit est présenté dans le tableau 2.
Analyses biochimiques des produits issus des fruits
BUSSON (1965) qui a procédé à l'analyse de l'albumen, des jeunes
rousses et de la pulpe, note une forte teneur en glucides et la présence
d'amino-acides ~nhabitue1s à savoir : l'hydroxy-proline, l'acide amino-
butyrique et surtout l'acide diamino butyrique qui n'a été trouvé que très
rarement chez les végétaux supérieurs.
Les résultat~ de ces analyses sont consignés dans le tableau 3. Ces produits
constituent d'excellents aliments d'appoint et riches en éléments nutritifs tels
que les acides aminés (DIALLO, 1987).
A.I.1.4 - UTILISATiONS ALIMENTAIRES
/\\.1.1.4.-1 - LA SEVE
Le rônier Afr~'2ain est avant tout un producteur de vin de palme ou sève
du palmier feml~ntée spontanément.
En effet, le~ africains ne le plantent pas ,ne l'entretiennent pas mais le
laissent pousser naturellement
principalement dans le but d'en extraire la
sève. Cette sè\\'~ li d'ailleurs la réputation de fournir un vin supérieur à celui
donnée par le faux dattier (Phoenix reclinata.), le palmier à huile (Eleais
guineensis.), et le palmier raphia (Raphia hookeri). Ce "vin de palme"
lcommunément appelée "Bangui" en Dioula et "Nzan" en Baoulé en Côte
\\d'lvoirc. consti ùe une boisson plus ou moins sucrée, peu alcoolisée dont le
,goût fait pense:' au cidre de pomme ou au vin nouveau.
10
T AB.LEAU 2 : COMPOSITION DU FRUIT DE RONIER FRAIS
(DA VIS, 1986)
--
COMPOSITION
POIDS (g)
% PAR RAPPORT
Fruit mûr entier
2,790
100,00
périanthe
0,175
6,27
Epicarpe
0,120
4,30
Fibres du mésocarpe
0,066
2,37
Pulpe (mésocarpe)
1,425
51,07
Graines ou novaux (3)
(1,004)
(35,99)
Coques
0,394
14,12
Amandes
0,609
21,83
Embryons
0,001
0,04
1 1
L\\B.LEAlLJ. : COMPOSITION CHIMIQUE DES ALIMENTS
TIRES DU RONIER (BUSSON, 1965)
% de maheres seches
Albumen
Jeunes pousses
Pulpe
Cellulose
7,9
2,1
25,2
Extrait éthéré
0,5
0,2
0,7
Glucide
83,8
97,8
64,7
Insoi. fonniQue
12,7
9,2
37,2
Protides N x 6,25
6,1
8,0
3,0
Cendres
1,7
1,9
6,4
Ca
0,17
0,11
0,45
P
0,18
0,24
0,07
Âlninn.
N
= 16)
Arginine
9,8
5,0
3,9
Cystine
1,2
1,6
2,1
f
Histidine
1,4
1,4
4,8
lsoleucine
2,3
0,7
J,4
Leucine
3,7
1,3
6,1
Lysme
3,8
3,5
5,0
Méthionine
1,5
0,2
1,4
Phénylalanine
2,7
0~9
4,0
Thréomne
2,3
1,3
4,2
Tryptophane
0,6
0,4
1,6
Tyrosine
1,8
1,3
),5
Valine
3,3
-
1,3
4,5
Acicip. amlno butvrioue
1,1
1,0
0,4
Acide aspaniQue
8,9
28,0
8,3
Acide diamino butyrique
14,3
13,2
0,5
Acide glutamique
10,9
5,2
9,1
Alanine
5,3
3,4
5,4
B. Alanine
traces
0,4
traces
Glycine
3,0
1,3
4,6
Homosérine
0,3
0,9
traces
Hydroxyproline
°
0
1,2
Prohne
2,3
1,2
4,4
Serine
4,0
3,1
5,1
1 2
L'engouem~nt pour cette boisson et son commerce existe depuis
longtemps. Aujourd'hui, très apprécié, elle fait toujours l'objet d'une
consommation importante et de "boisson traditionnelle" ; elle est même
devenue "objet commercial" (MONNIER, 1977) et considérée en milieu rural
comme le "char.1pagne du paysan".
L'extraction du vin de palme est toute fois le travail des hommes qui en
maîtrisent parfaitement les techniques car l'opération de récolte est
dangereuse ct fatigante, nécessitant un travail astreignant qui convient mieux
aux jeunes gens plus agiles.
L'arbre n'est pas abattu pour l'extraction de la sève comme chez le
J
palmier à hui~e. Le bo"quet de feuilles est seulement taillé en partie, puis une
incision, pratiquée dans le bourgeon terminal permet au liquide de couler
dans un récipient grâce à une gouttière.
La sève est opaline, d'abord sucrée; ensuite, elle fermente peu à peu
naturellement t.t devient légèrement alcoolisée et très prisée (AKE ASSI,
1984). On estime qu'un arbre normal est exploitable pendant un à deux mois
et peut fournir 200 à 300 litres de vin (PORTERES, 1964).
Mais, les différentes techniques d'exploitation de la sève en Afrique se
font non pas sab(amièrement à partir des hampes de spadices floraux comme
en Asie mais à partir du bourgeon terminal. Ce sont toutes des techniques
violentes qui en détruisant le bourgeon, entraînent la mort lente de l'arbre;
ce qui constitue I~n véritable probl~me écologique. La composition chimique
de la sève du rônier est présentée dans le tableau 4.
A.I.IA-2 - LES FRUITS
- En Afflque
Le fruit du rânier est utilisé sous différentes formes dans l'alimentation.
Il est en effet conso:'mmé à différents stades de développement.
\\
13
IAB.LEA.ll...J: COMPOSITION CHI~nQUE DE LA SEVE
DU RONIER
(DAVIS et JOHNSON,1987)
CARACTERISTIQUE ET
COMPOSITIO~
PH
6,7 - 6,9
AZOTE
0,056 g / 100 cc
PROTEINES
0,35 g / 100 cc
SUCRE TOTAUX
10,93 gjJOO cc
SUCRES REDUCTEURS
0,96.g / 100 cc
CENDRE
0,54 g / 100 cc
CALCIUM
Trace
PHOSPHORE
0,14 g / 100 cc
FER
0,4 g / 100 cc
VITAMINE C
13,25 mg / 100 cc
VITAMINE Bl
3,9 lU
1 4
- Fruit non mature
i1
Le fruit avec ses embryons de noix a la consistance d'une gelée. Celle-ci
!
très sucrée, est utilisée comme un délicieux et rafraîchissant breuvage,
1
apprécié surtout par les enfants (DIALLO, 1987).
t
1
- Fruit mature
C'est la partie fibreuse ou mésocarpe, entourant les nOiX qUi est
consommée:
\\
- soit comme dessert
- soit rôti c'u en pâte
- soit bouiilie avec de la brisure de maïs
(BUSSON, 1965; AKE ASSI ,1984; DIALL0,1987).
Les noix fermes sont aussi un peu dures à croquer. C'est pourquoi le fruit .
du rônier est cOJTl.munément appelé en Afrique de l'ouest "Coco dur".
Ces noix sont aussi très fréquemment semées côte à côte en vue
d'utilisation, 6 - R semaines plus tard, en germes de semences de 60 - 80 cm
comme "aspergr~s" (PORTERES, 1964 ; BUSSON, 1965)
Cette radicule enlevée constitue ainsi une tubercule très recherchée sur le
marché local. En plus des jeunes pousses très prisées, l'embryon très tendre
est également cvnsommé après cuisson (BUSSON, 1965 ; DIALLO, 1987).
La production de jus à partir du mésocarpe n'est pas encore exploitée
comme la plus part des fruits tropicaux. Toutefois, un procédé efficace, pour
l'extraction du jus Jvec ce doux et bon fruit de rânier, a été mis au point ces
dernières anl1é(.~ par le Professeur AGBO en Côte d'Ivoire (1990). Ce
procédé utilise une macération avec une enzyme à une dose, une température
et un temps hien défini, fournissant de bons rendements d'extraction.
Ces produits constituent d'excellents aliments d'appoints et riches en
éléments tels que les ami no-acides (tableau 3). Il est rapporté que le fruit frais
est riche en vitamine A et C (\\YATT et BREYER BRANDWIJK, 1962).
15
- En Asie
En plus des utilisations connues en Afrique, des mesures industrielles ont
été prises au SRI LANKA pour faire de la confiture et de la liqueur à partir
du mésocarpe du fruit mûr (JEGANATHAN, 1983).
Il est également utilisé pour extraire un produit "Puna too
au ceylan
Il
(MORTON, 1988). Au Cambodge il rentre dans la préparation de gâteaux et
de friandises
(TICillT, 1981).
: A.I.l.S- AUTRES UTILISATIONS
./
Les fruits mûrs sont employés comme appâts pour le piégeage des
Aulacodes ou "Agoutis". Le mésocarpe, outre la pulpe, fournit une fibre
souple utilisée pour tampons - filtres, éponges de nettoyage.
Les noix incinérés donnent des cendres très riches en Potassium et traitées
pour obtenir le carbonate de potasse nécessaire aux travaux de teinturerie
locale ou de préparation de la potasse hydratée en vue de la savonnerie (savon
noir) (pORTERES, , 1964)
Le mésocarpe est également employé en pharmacopée locale par les
asiatiques dans la thérapeutique ophtalmologique ou traitement des maladies
des yeux (TICHIT, 1981).
Les racines de jeunes pousses sont utilisées en décoction en médecine
traditionnelle africaine pour leur propriété béchique probable et dans le
traite nent des bronchites et maux de gorge.
De toutes J.es voies d'utilisation du fruit de rônier, la production de jus
attire notre attention car c'est la première fois qu'une telle exploitation est
mise en valeur à partir de ce fruit.
1 5
- En Asie
En plus des utilisations connues en Mrique, des mesures industrielles' ont
été prises au SRI LANKA pour faire de la confiture et de la liqueur à partir
du mésocarpe du fruit mûr (JEGANATHAN, 1983).
Il est également utilisé pour extraire un produit "Punatoo" au ceylan'
(MORTON, 1988). Au Cambodge il rentre dans la préparation de gâteaux et
de friandises
(TICffiT, 1981).
·:A.I.1.5- AUTRES UTILISATIONS
.'
Les fruits mûrs sont employés comme appâts pour le piégeage des
Aulacodes ou "Agoutis". Le mésocarpe, outre la pulpe, fournit une fibre
souple utilisée pour tampons - filtres, éponges de nettoyage.
Les noix incinérés donnent des cendres très riches en Potassium et traitées
pour obtenir le carbonate de potasse nécessaire aux travaux de teinturerie
locale ou de preparation de la potasse hydratée en vue de la savonnerie (savon
noir) (PORTERES, , 1964)
Le mésocarpe est également employé en pharmacopée locale par les
asiatiques dans la thérapeutique ophtalmologique ou traitement des maladies
des yeux (TICHIT, 1981).
Les racines de jeunes pousses sont utilisées en décoction en médecine
traditionnelle africaine pour leur propriété béchique probable et dans le
traitement des bronchites et maux de gorge.
De toutes les voies d'utilisation du fruit de rânier, la production de jus
attire notre attention car c'est la première fois qu'une telle exploitation est
mise en valeur à partir de ce fruit.
16
Le fruit du palmier rânier étant très riche en glucides (35-65 %) laisse
suspecter la pl ésence de gennes fennentaires, qui pourraient bien se
développer dans un jus extrait de lui.
Cette hypothèse s'est avérée encore plus plausible car, suite à nos travaux
préliminaires, sur la fennentation naturelle du jus extrait de ce fruit, la
production de gaz et de bulles à la surface de ce jus a été constatée après un
temps d'observation.
Mais, l'absence de bibliographie sur ce sujet et la méconnaissance de la
microflore naturelle ont constitué un facteur limitant pour une interprétation
plu~. èxhaustive de ces résultats préliminaires; raison pour laquelle nous avons
déci/dé d'entreprendre une recherche sur les micro-organismes présents dans la
pulpe du fruit de rânier (matière première du jus).
En raison de la hauteur de l'arbre (près de 15 m en moyenne), la récolte
s'effectue à même le sol car les fruits matures se détachent des spadices et
tombent. Leur contact plusieurs jours avec la flore du sol, pourrait être à
l'origine de diverses contaminations notamment celles induites par les excrétats
ou fèces.
Ainsi, pour identifier les micro-organismes contaminants qui pourraient
nuire à la santé dt.$ consommateurs de ce fruit d'une part, et pour identifier les
levures naturelles du fruit, susceptibles d'être utilisées dans des essais de
fennentation pour la production d'éthanol d'autre part, notre étude s'est portée
sur:
- 10/ La caractérisation de la microflore mésophile et fennentaire du fruit
du rânier cueilli ct ramassé.
- 2°/ Le dénor:~brement des gem1es contaminants pathogènes tels que: les
colifom1es, les St,q phylocoques. les Streptocoques et les Salmonelles.
1 7
A.I.2. . LES CRITERES MICROBIQLOGIQUES
APPLICABLES AUX FRUITS ET AUX
ALIMENTS
A.L2.1 -ARGUMENTS JUSTIFIANT L'UTILISATION DE
CRITERES
Les micro-organismes sont des composants extrêmement nombreux et
actifs de notre environnement. Cependant, à cause de leur petite taille, on a
souvent tendance à les ignorer ou à les sous-estimer.
.~
/
Il existe pounant deux domaines où les micro-organismes nous
concernent de façon particulièrement intime:
Celui de la SANTE et celui de L'ALIMENTATION, d'ailleurs
étroitement liée; tous les deux.
Dans le domaine alimentaire, les fruits et légumes constituent une part
importante. Ils sont, en effet, consommés sous forme de produits frais ou
transformés (conserves, surgelés, produits fermentés). Contrairement aux
autres produits alimentaires, ces vivriers sont des végétaux subissant une
évolution continue après la récolte.Celle-ci peut être bénéfique au produit
(maturité) ou néfaste (altérations par les micro-organismes et leurs activités
enzymatiques).
Les maladies dites de "conservation" peuvent être dues à des causes
physiologiques (évolution inteme qui diminue la qualité du produit), des
parasites présents :lU champ (bactéries ou champignons phytopathogènes) ou
des moisissures.
C::, contaminations s'effectuent lors de leur conservation
après récolte.
La détermination des micro-organismes s'avèrent donc nécessaire
aujourd'hui pour perrr;ettre une parfaite maîtrise de la qualité et une véritable
prévention des risque~ infectieux dans ces matières végétales alimentaires.
1 8
Cette recheH.:he a deux objectifs:
- le contrôle de la qualité marchande
- le contrôle de la qualité hygiénique du produit à consommer..
La définition de critères microbiologiques s'avère indispensable pour
protéger
la sa11té des consommateurs.
Dans cett~ perspective, 3 niveaux doivent être spécifiés:
- les nonnes microbiologiques
- les spécifications microbiologiques
- les directives microbiologiques
Dans le c~s des fruits et légumes, les critères microbiologiques
obligatoires sont définis par "L'International Standards Organisation" (ISO) ou
par LtAssociatio~l_ Française de Normalisation (AFNOR)
Les critères retenues concernent trois groupes de germes susceptibles
d'induire
des altérations
- les Levures et Moisissures
- les Lactobacillus
- les Leucon(~tocs
Avec l'avènement de la biotechnologie, l'analyse microbiologique
connaît un 3ème objectif qui est:
- l'isolement et l'identification des germes pathogènes ou non, présents
dans les matières premières végétales ou animales, utilisées dans l'alimentation
ou non.
Ces germes sont utilisés soit comme tels, soit après modulations
génétiques
dans
divers
domaines,
notamment
dans
les
industries
pharmaceutiques e: les industries de fermentations.
19
L'étude de 1:l microflore des produits naturels et surtout des produits
alimentaires, constitue donc une priorité voire un impératif d'une part pour le
contrôle de la qualité et, d'autre part pour l'identification de gennes nouveaux.
A.I.2 2.- LES FRUITS ET LEGUMES
Les fruits et légumes sont des produits végétaux crus dits de la "IVème
gamme"; leur analyse microbiologique est essentiellement dirigée vers la
recherche de germes fermentaires.
Les altérations dues à des mycotoxines sont le fait de contaminations
masSIves.
- les Levures et Moisissures appartiennent aux micro-organismes
fermentaires. Mais, il est plus exact de parler de champignons unicellulaires
pour les levures et des thalles filamenteux pour les moisissures.
Une charge élevée de Moisissures induit la production de mycotoxines,
d'où un -risque sanitaire, une quantité importante de levures, est d'avantage
correlée à un problème d'altération du produit. Les critères microbiologiques
pour ces genres sont fixés en fonction du type d'aliment.
- Les Lactobaci!lus sont des bactéries lactiques homofermentaires
. Les Leucono'itocs.sont des bactéries hétérofermentaires appartenant à
la
famille des Streptococcaceae.
A.I.2.3 - LES ALI\\'lENTS EN GENERAL
Un inventaire exhaustif des caractéristiques microbiologiques applicables
en France aux denrées alimentaires, a été réalisé par VEIT PIERRE
(l987).Cette étude synthétique, correlée aux normes AFNOR (1986) a permis
de définir les critères J prendre en compte dans l'analyse des aliments.
Ces critères microbiologiques visent principalement à réduire les risques
sanitaires et sont presque exclusivement dirigés vers la contamination
bactérienne. La contamination fongique (Levures et tvloisissures) n'étant que
rarement visée.
20
Les groupes bactériens ou espèces bactériennes retenues dans ces critères
sont:
les micro-organismes aérobies mésophiles, l~s coliformes totaux, les
coliformes
thermotolérants,
les
anaérobies
Sulfito-réductrices,
les
Staphylococcus aureus, les Streptocoques fécaux et les Salmonella.
- Les Micro-organismes Aérobies à 30°C (G.A.M.)
Cette "flore totale mésophile" donne une information sur la quantité de
bactéries présentes dans l'aliment.
Une présence importante peut être soit le reflet de conditions
défectueuses et/ou d'une mauvaise conservation.
Toutefois, "le niveau de la flore aérobie à 300 C ne peut-être interprété
que pour un produit donné dans des conditions données".
- Les Coliformes Totaux ou Coliformes à 30°C (C.T.l
Ce groupe bactérien, très large, constitue en quelque sorte un "sous-
ensemble" des micro-organismes aérobies à 30 0 C.
Un nombre élevé de ces coliforrnes, caractérise un mauvais état
hygiénique général.
- Les Coliformes Thermotolérants (C. Th.)
Ils sort isolés à une température plus élevée que les coliformes totaux
(43,5° C). Ce sont les hôtes normaux du tube digestif de l'homme et des
ammaux.
Leur présence dans les aliments indique une souillure d'origine fécale.
Ces germes constituent un bon indice de contamination. Dans ce groupe,
se trouve Escherichia coli, dont certains sérotypes sont responsables de
gastroenté rites.
21
- Les Anaérobies Sulfito-Réductrices à 46°C (A.S.R.)
Il s'agit des bactéries anaérobies sporulées thennorésistantes germant et
se multipliant lorsque les conditions de température et d'anaérobiose sont
favorables.
La principale espèce de ce groupe est le Clostridium perfringens; il est
dangereux pour l'homme et est fréquemment mis en cause dans les toxi-
infections alimentaires en restauration collective. La mauvaise conservation des
aliments après la cuisson, contribue à leur prolifération.
Dans les toxi-infections alimentaires déclarées en France en 1988,
Clostridium perfringens a été incriminé dans 8,2 % des cas (QUENUM
et Coll. 1989).
- Staphylococcus aureus (STA.)
Il s'agit d'une espèce bactérienne souvent rencontrée dans les toxi-
infections
alimentaires collectives (6,3 % des foyers de TIAC en 1988) QUENUM et
Coll. (1989).
Ils doivent être absents ou présents en très faible quantité dans les
aliments. L'intensité des symptômes est brutale.
- Les Streptocoques du groupe D
Ils sont répandus dans les cavités de l'homme et des animaux. Ils sont
fréquemment isolés dans les aliments et à l'origine de manifestations
pathologiques parfois très graves.
- Sai monel la (SA L.)
C'est le genre bactérien le plus rencontré dans les TIAC en France (82
% des cas en 1988) QCENUM et Coll. (1989).
Salmonella enterica sérovar Enteretidis a été le sérotype prédominant en
France en 1988. En raison de leur pathogénicité, l'absence de Salmonella dans
les aliments est de rè~le.
'"'
22
A.I.3.4 -LES LIMITES DES CRITERES MICRO BIOLOGIQUES ET
LE PLAN D'ECHANTILLONNAGE
A.I.3.4-1 - Les limites des critères
microbiologiques
De nombl"~ux paramètres interviennent dans la fixation des critères
microbiologiques.
Il
est donc
important
de
disposer
des
limites
microbiologiques.
Les recommandations internationales soit du "codex alimentarius" ; soit
de~"l'International Commission of Microbiological Spécifications For Foods
"(ICMSF), distinguent deux types de limites:
- Une valeur m correspondant au seuil en dessous duquel le produit est
de qualité microbiologique satisfaisante;
- Un seuil limite M d'acceptabilité correspondant au rejet du produit; ce
seuil M étant un multiple de la valeur m.
La valeur m
est établie par comparaison de nombreux résultats
d'enquêtes effectué-~s par les pouvoirs publics, et les professionnels. Le seuil M
prend en compte le niveau maximum acceptable pour la protection de la santé
publique.
Il faut recor.naître que si la signification hygiénique de plusieurs espèces
ou genres bactériens a été établie
il n'en est rien pour les Levures et
Moisissures, le) L,-:ctobacillus et les Leuconostocs.
Il importe que cc' c:eux limites III et \\1 soient quantifiées pour un poids
ou un volume dc-.mé.
D'après l';CMSF, no:..lS avons les définitions suivantes:
- m =seuil au dessous duquel le produit est de qualité satisfaisante
- M = v'-; .eHr > m au dessus de laquelle, la qualité du produit est
inacceptable.
23
- n =nombre d'unités examinées. (échantillon)
- c = nombre d'unités tolérées au delà de fi
* si c = 0 pas de tolérance
* si c > 1, introduction d'une tolérance pour l'échantillon.
- n et c caractérisent le plan d'échantillonnage.
A.I.3.4-2 - Le plan d'échantillonnage
Pour toute analyse microbiologique, il faut déterminer un plan
d'échantillonnage permettant de donner une interprétation statistique des
résultats mais également de pouvoir moduler l'interprétation.
Le plan d'échantillonnage est caractérisé par la taille de l'échantillon n et
par une valeur de tolérance c permettant l'interprétation des résultats.
Les recommandations internationales distinguent deux types de plans
d'échantillonnage: un plan à 2 classes et un plan à 3 classes.
Le dernier permettant une plus grande modulation dans l'interprétation
des résultats.
- Les plans à 2 classes (c = 0) déterminent 2 groupes d'unités:
satisfaisants (valeur < ou égal m) ou non satisfaisants (valeur> m)
- Les plans à 3 classes (c > ou égal à 1) déterminent 3 groupes d'unités:
satisfaisants (valeur < m), acceptables (M> valeur> m) et non satisfaisants
(valeur> M)
Le choix du plan, ainsi que celui des caractéristiques n et c, est
déterminé selon la signification hygiénique des espèces ou genres microbiens
(importance du risque), le substrat, le traitement subi par le substrat et la
destruction de l'aliment.
Dans le cas du plan à 3 classes, plan qui a été le plus souvent retenu au
niveau français comme au niveau international (ICMSF notamment), nous
avons n =5 et c=2; un tel plan béné.ficie d'une ·t>fficacité correcte et est
réalisable par les entreprises et les services de contrôle.
24
A.I.3.S • LE PROBLEME DES NORMES MICROBIOLOGIQUES EN
ZONE TROPICALE
Comme mentionné ci-dessus, le contrôle microbiologique permet
d'éliminer les produits susceptibles d'être à l'origine de contamination, donc
dangereux pour le consommateur.
Pour ce faire, il faut donc disposer d'un certain nombre de critères
microbiologiques grâce auxquels on peut reconnaître et éliminer les aliments
impropres à la consommation.
Dans la sous-région Ouest-Africaine et singulièrement en Côte d'Ivoire,
il n'existe pas de critères bactériologiques bien définis pour les denrées
alimentaires, en particulier les fruits.
Les normes bactériologiques reconnues et appliquées par le ministère de
la santé publique, pour le contrôle de la qualité hygiénique des denrées
alimentaires en Côte d'Ivoire, sont jusqu'ici celles en vigueur sur le territoire
français (normes AFNOR). Ces normes sont consignées dans le journal officiel
de la République Française sous forme de textes de loi: Arrêté du 24/12/1979
(J.O.-nc du 19-01-1980) modifiées par les arrêtés du 17 septembre 1984 (J.O.
nc du 29 septembre 84),du 5 mars 1985 (J.O. nc du 23 mars 85 et du 2 juin
1988 (J.O. nc du 8 juillet 1988). Elles font état du contrôle de la qualité des
eaux d'alimentation, des jus de fruits, des produits laitiers et des plats cuisinés
à l'avance.
Les critères utilisés pour nos analyses sont consignés dans le tableau 6.
25
TABL.EAU 5 : CRITERES UTILISES POUR NOS ANALYSES
GERMES RECHERCHES
CRITERES
(m)
Nombre de gennejlarg.
Gennes Aérobies Mésophiles
<300.000/g
(G.A.M.)
Colifonnes Totaux (C.T.)
<l.OOO/g
-
-
Colifonnes Thennotolérants
<10/g
(C.Th.)
Anaérobies Sulfito-Réductrices
<30/g
(A.S.R.)
Staphylococcus aureus (STA.)
<100/g
Streptocoques D.
pas de cri tère
Salmonella
absence dans 25 g
Levures
<l00/g
Moisissures
absence
- -
Lactobacillus
absence
Leuconostoc
absence
26
A.II· MATERIEL ET METHODES
A.II. 1 • lV.~_ATERIEL
A.ILl.l
~lATERIEL BIOLOGIQUE
LA PULPE Dl: FRUIT DU
PALMIER RONIER
Notre étud~ a ess~ntiellement été orientée sur les fruits obtenus des
palmiers râniers C1è la ré ~ion du "V Baoulé" plus précisement ceux des villages
Comékro (préfecture':e Dimbokro) et d'Allanikro (sous préfecture de
Didiévi)
Nous avons travaiJé sur 2 lots de fruits
• un l2Lr'Jnstitué de 25 fryits récoltés sur J'arbre et
• un lot constitué de 25 aytres fryits récoltés à même le sol.
Le choix des échJJltil10ns s'est porté sur les fruits mûrs de couleur
orangée et dot~~s d'lm caractère mou au toucher.
Ces fruits sont mis dans des sachets et conservés en chambre froide
(-SOC à 10°C) dès l'arrivée au laboratoire avant l'analyse microbiologique
A.B.1.2 - LES APPAREILS
- Les Etuves: quatre étuves sont nécessaires pour incuber les milieux
ensemmencés ac x tempéntures spécifiques et appropriées.
Ces étuves b'lctério:Jgiques sont donc réglées à différentes températures:
30°C, 37°C, ~oC et 46°C.
- Deux Bain·~·Marie : l'un réglé à 100°C permettant de porter les
milieux gelos~<; ~ ébulI::ion et l'autre réglé à 4SoC en permanence pour
maintenir en surit:sion ces milieux gelosés.
27
- Une balance de précision : pour la pesée des divers milieux de
·cultures et pour la préparation de la suspension mère.
- Un autoclave : pour la stérilisation du matériel et des milieux de
cultures
- Un agitateur de tubes: pour le mélange des solutions et des milieux
à utiliser.
- Un microscope optique à fond clair
- Un compteur de colonies : pour numérer les colonies poussées les
milieux
A.II.I.3 .. LES MILIEUX DE CULTURE (isolement et
enrichissement) (DIAGNOSTICS PASTEUR, 1987)
A.II.l.3..1 .. Les milieux solides
- la gélose PCA (gélose standard avec glucose)
- la gélose au désoxycholate 1 0/00
- la gélose T.S.N (tryptone, sulfite, néomycine)
- la gélose Baird-parker
- la gélose ADN (gélose à l'acide désoxyribonucleique)
- la gélose Chapman Mannité
- la gélose BEA (gélose Bile-Esculine-Azide)
- la gélose SS (gélose Salmonella et Shigella)
- la gélose Hektoen
- la gélose OGA (gélose glucosée à l'oxytétracycline)
-la gélose MRS (gélose MAN, ROGOSA et SHARPE)
-la gélose Hypersaccharosée
Les milieux combinés constituants le portoir réduit de LE MINOR :
• - urée ind'Jle de Ferguson
• - milieu Hajna-Kliger
... -milieu lysine décarboxylase
• - milieu mannitol-mobilité
• - milieu citrate de Simmons
28
A.II.1.3-2 - Les milieux liquides
- le milieu de Rothe
- le bouillon sélénite alcaline
- l'eau peptonée alcaline (tamponnée)
- le bouillon thioglycolate.
A.II.1.4 - LES DIYERS MATERIELS DE MICROBIOLOGIE
- Les tubes et les flacons en verre :
Un nombre important de tubes et de flacons est nécessaire pour la
conservation des milieux gélosés et liquides préparés ainsi que pour la
réalisation des dilutions décimales.
!
- Les bocaux en verre :
Préalablement stérilisés et utilisés pour les préparations de l'échantillon à
analyser.
1
- Le matériel stérile à usage unique :
\\
1
Il est cOJlstüué d'un lot important de :
* . boîtes de Pétri
* - pipettes graduées (1 ml, 2ml, 5ml, et IOml)
* . r,i pettes pasteur et étaleurs stériles
* -~achets (stériles 400 ml)
les réactifs pour la coloration de Gram
violet de gentiane,
alcool,
lugol, f:lschine basique
. Les ré~h:Ufs pour la coloration à l'encre de chine
• Les s.~stèmes d'identification de levures: constitué de plusieurs
coffrets è.!.1XanogrJmme API 20C AUX.
29
A.Il2 -LES METHODES DE DENOMBREMENT ET
D'IDENTIFICATION DES MICROORGA-
NISMES RETENUS POUR L'ANALYSE
A.I1.2.1 • LES GERMES AEROBIES MESOPHILES (G.A.M.)
1ml de l'échantillon pour essai s'il est liquide, ou 1 ml de la suspension
rr~ère dans le cas des autres produits, est placé dans des boîtes de Pétri stériles.
L'on pratique de la même manière pour les dilutions décimales retenues
en fonction du produit à analyser.
Ensuite, dans chaque boîte, 15 ml de gélose standard avec glucose
(P.C.A) préalablement fondue et ramenée à 45°C est coulée; puis, une bonne
homogénéisation est réalisée. Après solidification, une couche de gélose
blanche (AGAR) est coulée.
Enfin, l'on laisse solidifier à la température ambiante puis les boîtes sont
étuvées à 30°C pendant 48 à 72 h.
Pour le dénombrement, toutes les colonies ayant poussées dans la gélose
sont comptées. L'on ne retienl toutefois que les boîtes contenant moins de 300
colonies et plus de 30 si possible en tenant compte des dilutions.
Suivant l'arrêté de la législation française du 21/12/1979 (JO 19/1/1980)
le nombre de colonies doit être inférieur à 300.0oo/g.
A.II.2.2 . LES COLIFORMES TOTAUX (C.T.)
Les coliformes sont dénombrés soit en milieu solide (gélose
désoxycholate
lactose), soit en milieu liquide par la technique du nombre le plus probable
(NPP) à l'aide du bouillon lactosé bilié au vert brillant et réparti dans les tubes
contenant des cloches de DURHAM. Les tubes positifs présentent un
dégagement gazeux dans la cloche et le nombre le plus probable est calculé à
l'aide de tables de référence.
30
Le dénombrement en milieu solide s'effectue à partir de la suspension
mère et des dilutions décimales retenues en portant 1 ml d'inoculum dans des
boîtes de
Pétri stériles. PLis, on coule environ 15 ml de gélose désoxycholate lactose
fondue et ramenée à 45°C.
Après avoir bien mélangé l'inoculum et le milieu, on laisse solidifier;
puis, on recouvre d'une deuxième couche de gélose désoxycholate lactose
vierge (environ ') ml) et on laisse encore solidifier.Les géloses ainsi
ensemencées sont luises à l'étuve à 30°C pendant 24 heures.
~. Le dénombrement s'effectue à partir des colonies caractéristiques rouges
foncées de diamètre compris entre 0,5 et 1 mm. Seules les boîtes contenant
entre 15 et 150 colonies sont prises en compte selon la dilution faite. Suivant
l'arrêté de la législation française, le nombre des colonies doit-être inférieur à
1.0OO/g.
A.II.2.3 • LÉS COLIFORMES THERMOTOLERANTS (C.Th.)
Ce sont des coliformes totaux mais qui ont la possibilité de pousser à
température élevée (43°C).
Leur dénombrement s'effectue en milieu solide suivant les mêmes
modalités que pour les coliformes totaux mais après incubation à 43,5° c
pendant 24 h ..
Le nombre de colonies caractéristiques rouges foncées comptées doit
être inférieur à 10/g suivant les normes de l'arrêté de la législation française
du 21/12/1979
A.lI.2.4· LES A~AEROnIES SLLFITO REDUCTRICES A ~6cC
(A.S.R)
Leur dénombrement peut s'effectuer sur divers milieux notamment la
tryptone sulfite c:ydosérine (TSC) et la tryptone sulfite néomycine (TSN).
3 1
Nous avons utilisé la gélose TSN préparée et répartie dans des tubes
stériles à raison de ]5 ml de gélose par tube.
On ensem~'!lce 1 ml de la suspension mère et 1 ml des dilutions décimales
retenues dans les milieux de culture en tube préalablement fondus et refroidis
aux environs de 45°C.
L'homogénéisation doit être soigneuse par mouvement rotatoires des
tubes en évitant la fonnation de bulles d'air.
,La solidificé 1.ion des milieux ensemencés est obtenue sous un courant d'eau
froide (robinet) ; l'incubation s'effectue à l'étuve à 46°C pendant 24 et 48h.
Cette température sélectionne les anaérobies sulfito-réductrices du genre
Clostridium (C. perfringens). Les colonies de cette espèce sont entourées
d'une auréole noire caractéristique due à la réduction du sulfite qui provoque
une précipitation du sulfure de fer; ce qui facilite le dénombrement. Suivant
l'arrêté de la législation française de 21/12/1979 (JO 19/111980) le nombre des
germes doit être inférieur à 30/g.
A.II.2.S • STAPHYLOCOCCUS AUREUS (STA.)
A partir de la suspension mère (pulpe de rânier diluée dans de l'eau
peptonée tamponnée) et des dilutions décimales retenues, on porte 0, 1 ml
d'inoculum dans des boîtes de Pétri contenant de la gélose Baird Parker.
Ensuite, on étale sur toute la surface du milieu l'inoculum . Puis, les boîtes
retournées sont incubées à l'étuve à 37°C pendant 24 et 48 heures. L'on
compte, après cettl.~ période, les colonies caractéristiques : noires brillantes,
d'un diamètre cxnpr:5 entre 0,5 et 2 mm et entouré d'un halo clair de
protéolyse. On cGnfirr:--.e ce résultat par une coloration de Gram de la colonie
(cocci Gram positif).
Puis, nous .~vons ~'Jit les tests biochimiques de pathogénicité spécifiques à
staphylococcus é't:reus i savoir:
- la staphylocoagulase :hrc
- la désoxyribonudéase ou thermonucléase
- l'utilisation du mannitol
32
A.II.2.S-1 - La staphylocoagulase libre
On met, en présence dans des tubes à hémolyse, 0,5 ml de plasma citraté
ou oxalaté de lapin et 0,5 ml de bouillon de culture de 18 h à 24 heures.
On obserye toutes les 30 mn sur 3 heures la coagulation ou non du
plasma de lapin à 37 oC .
Il faut éviter de faire les observations après 24 h car les souches de S.
aureus sont capahles de produire une fibrinolysine qui va hydrolyser le
coagulum.
A.I1.2.S-2 - La désoxyribonucléase : Dnase
On ensemence en strie une gélose à l'ADN. Après 18-24 heures
d'incubation à 37°C, on met en évidence la DNASE en inondant d'acide
chlorydrique pur ou dilué la gélose. Enfin, on observe sur un fond noir, la
présence d'un halo clair autour de la strie lorsque le test est positif.
A.I1.2.S-3 - L'utilisation du mannitol
On ensemence une colonie noire du milieu Baird parker sur un milieu
Chapman mannité. Après 24 heures d'incubation 37°C, la lecture est réalisée.
L'utilisation dll mannitol par voie oxydative est caractérisée par le virage de
l'indicateur de pH (rouge de phénol) du rouge au jaune.
Seules les souches qui produisent la staphylocoagulase libre sont des
Staphylococcus aureus dont le nombre doit être inférieur à 100/g suivant
l'arrêté de la lég:~lation française.
A.II.2.6 - LES STREPTOCOQUES DU GROUPE D.
On ensemence 1 ml de la suspension mère et des dilutions retenues dans
des tubes cont{;nam 15 ml de milieu de Rothe servant pour le test présomptif.
33
Ces tubes sont incubés à l'étuve à 37°C pendant 24 à 48 heures. A la
suite de ce temps, le5 tubes présentant un trouble bactérien sont considérés
comme positifs.
Ensuite, une ose des tubes positifs au test présomptif est repiquée sur de
la gélose BEA (bil:~ esculine azide) ou sur de la gélose Décocosel
préalablement coulée en boîtes de Pétri et séchée.
Ces boîtes enser::encées sont incubées à 37°C pendant 48 heures à l'issue
desquelles, on fait la ~ecture. Les streptocoques D sont caractérisés par leur
aptitude à hydrolyser l'esculine; ainsi, au niveau macroscopique, leur présence
effective se manifeste par l'apparition de colonies noires allant jusqu'au
noircissement partiel ou total de la gélose.
On confirme ce résultat par un examen microscopique (Gram). L'on
observe au microscore des coccis Gram (+) en courtes chaînettes ou en
diplocoques.
A.II.2.7 • SALMO~ELLA
Les Salmonella ;:oussent à l'étuve en 18 à 24 h à 37°C à pH voisin de la
neutralité et en aéro-ar~~robiosefacultative.
- l'échantillon 1 analyser est d'abord mis dans un milieu de
préenrichissement : l'e lU peptonée tamponnée où il est dilué au 10 ème et
incubé à 37°C pendant :~ h.
- l'enrichissement proprement dit est réalisé par inoculation en duplicata
de 2 ml du milieu pr~-enrichi dans des tubes contenant 20 ml de milieu
d'enrichissement : bou:Jon au sélénite de Leifson (pour notre étude).
Un lot de tube es: :ncubé à 37°C tandis que l'autre lot est incubé à 43,5°C
pendant 24 h.
- les isolements sont effectués à partir des milieux d'enrichissement,
incubés aux différentes :.empératures.
34
A l'aide d'une ôse, ces milieux d'enrichissement sont ensemenCL S à la
surface de géloses sélectives préalablement coulées en boîtes de Pétri et séchées
* - gélose salmonelle-shigelIa (SS)
* -gélose Hektoen
Ces boîte;:; de Pétri sont toutes retournées et incubées à l'étuve à 37°C
pendant 24 heures.
Les caractères macroscopiques obtenues sur ces géloses sélectives sont:
- sur SS les colonies sont dites lactoses moins (-) et sont soit
transparentes, régulièrement arrondies avec une surface lisse et bombées de
1,5, à 3 mm de diamètre, soit à centre noir produisant de l'hydrogène sulfuré
(H2S).
- sur gélo..ie Hektoen, on observe des colonies vertes ou à centre noir
lorsque l'on est en présence de colonies caractéristiques. On repique un
nombre suffisant pour les soumettre d'une part aux essais biochimiques
classiques pour identification et d'autre part pour les adresser au laboratoire
national des Entérobacteries pour sérotypage.
Identifications des Salmonella par leurs caractères biochimiques
L'étude dl"~ caractères biochimiques est facilitée par l'utilisation de
milieux spéciaux ~.)uvent combinés :
1°) - Milicl: Hajna - Kligler (lactose, H2S, gaz en glucose) : Ce milieu
pennet l'étude (if; l'utilisation du glucose, du lactose, de la production de H2S
et d'une bêta galactosidase.
2°) - Lysi~l~ déc3.rboxylasc l LOC) : pem1et l'étude de la décarboxylation
de la lysine de ter.
3°) - Milieu urée-indole: pem1et la mise en évidence d'une uréase, la
production d':ndole et la présence d'une tryptophane désaminase (TDA.)
4°) - Mi~ie~ mannitol-mobilité: pem1et la recherche de la fermentation
du mannitol et ~'é·.lJde de la mobilité.
35
5°) - Milieu citrate de Simmons : utilisation du citrate de sodium comme
unique source de carbone.
Ces cinq milieux constituent le portoir réduit de Le MinoT. L'ensemble
des renseignements obtenus grâce à ces cinq milieux permettent souvent une
identification biochimique précise, ou de façon plus pratique, l'utilisation d'une
galerie API 20E.
Les caractères communs aux Entérobactéries pour leurs identifications
- ne possèdent pas d'oxydase,
- fermentent le glucose avec production de gaz ou non,
- réduisent les nitrates en nitrites
- produisent de lbydrogène sulfurée (H2S) ou non.
De plus, le genre Salmonella possède les caractères suivants:
- ne possède pas d'uréase
- ne produit pas d'indole
- utilise parfois le citrate de Sirnrnons
- ne possède pas de tryptophane-désaminase (TDA)
- ne possède pas de bêta-galactosidase ( ONPG)
- ne possède pas de gélatinase ( Gélat.)
- possède le plus souvent une lysine décarboxylase (LDC).
Caractères biochimiques communs à la majorité des Salmonella
(AHI, 1990)
Caractère
Uréase
s
ONP
Gaz
H2S
LDC
Indole TTR
Citrat
Gélat ~t
biochimi- G
e
irDA
ques
Espèce
Salmo-
-
+
+
+
-
-
+
-
-
nella.
36
A.II.2.8 • LES LEVURES ET LES MOISISSURES
La recherche et le dénombrement des Levures et Moisissures dans les
produits alimentaires s'effectuent sur de la gélose gl_~cosée contenant 0,10 mg
d'oxytétracycline par ml de milieu de culture afin d'éliminer les bactéries
saprophytes.
A partir de la suspension mère et des dilutions décimales retenues, l'on
porte
0,1 ml d'inoculum sur le milieu de culture préalablement coulé dans des boîtes
de Pétri et dont la surface a convenablement été séchée.
L'inoculation est réalisée par la technique d'étalement "au râteau". Les
boîtes sont retournées et ensuite incubées à l'étuve à 30°C pendant 24 à 48 h.
A la suite de ce temps, l'examen macroscopique des cultures met alors en
évidence des colonies de levures crémeuses, blanches ou blanchâtres, peu
luisantes qui sont facilement numérables, ainsi que les colonies de moisissures
caractéristiques.
Une vérification est faite par examen microscopiqu~ pour les Levures
Cet examen à l'état frais permet en outre, dans certains cas, la mise en
évidence de filaments mycéliens, d'arthrospores et de filaments fragmentés
dont la présence et l'abondance sont notées.
Toutefois, un examen microscopique après coloration permet une
meilleure confirmation de leur présence.
En effet, la coloration de Gram permet de révéler des coccis Gram
positif (+) lanceolés et operculés caractéristiques, tandis que la coloration à
l'encre de chine permet 1J révélation de la capsule lorsqu'elle est présentée.
Pour le fait que la deuxième partie de notre pré·sent travail soit axé sur la
sélection des souches levuriennes performantes pour la production d'éthanol,
nous nous sommes intéressés à rassembler des informations appropriées sur la
définition, les généralités et les divers caractères morphologiques ainsi que les
37
tests d'identification des Levures. Toutes ces infonnations sont présentées en
annexe 1
Pour l'identification précise des genres et des espèces, en plus de
caractères morphologiques, divers tests physiologiques et de nombreux tests
biochimiques sont indispensables.
A.I1.2.S-1 . Les tests physiologiques
- La blastèse ou test de filamentation ou de germination
La souche à tester est émulsionnée dans environ 0,5 ml de plasma
noqnal témoin réhydraté. Après 3 heures d'incubation à 37°C, on observe au
miêroscope entre lame et lamelle, la présence d'un tube germinatif
caractéristique du genre Candida et des espèces albicans à 98 % et stellatoidea
dans certains cas. (DRüUHET E. et Coll, 1985).
- La chlamydosporulation
Le milieu PCB (pomme de terre, carotte, bile) est actuellement le
meilleur milieu pour la production de chlamydospores caractéristiques de
Candida albicans.
Notons que le milieu RAT (riz, agar, tween) est également approprié. La
souche est ensemencée en stries soit dans des tubes de PCB, soit dans des boîtes
de Pétri où ce milieu a été coulé.
Après une incubation à 30°C pendant 24 à 48 heures, on observe au
microscope un fragment de culture, soit en tube, soit dans la boîte de Pétri
mettant en évider.ce la présence de pseudomycelium caractéristique du genre
Candida et de chlamydospores spécifiques à l'espèce albicans ou stellatoidea.
A.II.2.8·2 • Les tests bioch imiq ues d'identification ..
Ce sont essentiellement des tests d'assimilation du carbone contenu dans
i 9 sucres qui constituent le principe de base du système d'identification rapide
des levures API 20 CAux.
38
Ces tests sont ré:llisés sur les substrats déshydratés suivant:
- glucose
- galactose
-lactose
- glycérol
- inositol
- maltose
- 2 keto -D- gluconate
- sorbitol
- saccharose
- L - arabinose
- alpha méthyl D glucoside
- trehalose
- D - xylose
- acétyl D glucosamide
- melzitose
- adonitol
- cellobiose
- raffmose
- xylitol
Le système comprend 20 microtubes surmontés chacun d'une capsule
disposée en série sur une lame plastifiée. Les capsules sont inoculées avec un
m~ieu minimum semi-gélosé et les Levures poussent seulement si elles sont
capables d'utiliser le substrat correspondant.
La lecture de ces réactions se fait par comparaison aux témoins de
croissance et l'identification est obtenue soit à l'aide du tableau d'identification
soit à l'aide du catalogue analytique.
La réalisation de ces tests nécessite une application stricte de la
méthodologie. (CUINIER et Coll, 1979).
a) - Préparation de la galerie
- Nous avions réparti environ 5 ml d'eau distillée dans les alvéoles d'une
boîte d'incubation
pour créer une atmosphère humide. Ensuite, nous
inscrivons la référence de la souche sur la languette latérale de la boîte. Puis,
La galerie est retirée de son emballage individuel et elle est disposée dans la
boîte d'incubation.
b) - Préparation de l'inoculum
-Une fraction de c. -)lonic est prélevée à l'aide d'une pipette par aspiration
ou par touches successives et une suspension de turbidite égale à celle de
l'étalon 2 de MC FARLAND est réalisée dans un tube contenant 2 ml d'eau
physiologique ou de suspension médium.
39
- 1 goutte dt' la suspension de levure est déposée sur le milieu RAT.
- Une ampoule de C médium est ouverte et on y transfère 100 Jll soit 3
gouttes de la suspension précédente à l'aide d'une pipette Pasteur. L'ensemble
est bien homogénéisé.
c) • Inoculation de la galerie
- Les cupules sont remplies avec la suspension obtenue dans C médium
en veillant à créer un niveau horizontal ou légèrement convexe mais jamais
concave.
- La boîte d'i:lcubation est refermée et incubée 48-72 h à 30°C.
d) - LechH·~ de la galerie
- La croissa~ce des Levures est observée après 24 heures, 48 heures et
éventuellement -: 2 heures si les tests ne sont pas très nets. La cupule "0" sert
de témoin négati f et une cupule plus trouble que le témoin indique une réaction
positive à noter sur la fiche des résultats.
e) - Identification
L'identification peut être faite avec le tableau d'identification en
comparant les
réactions notées sur la fiche de résultats.
Le catalogue analytique API 20 C AUX permet l'identification du profil
numériql1::" c0nstitué de 7 chiffres.
A.II.2.9 . LACTOBACILLUS
La recherl"oe et le dénombrement de Lactobacillus sont réalisées sur la
gélose MRS (MrITl. Rogosa et Sharpe) coulée dans des boîtes de Pétri.
La tecllll i-:llC b plus utilisée est celle de l'étalement de 0,1 ml de la
suspension mè~'~ et des .Ji lutions retenues à la surface du milieu sélectif
préalablement séché. Les boîtes sont retournées et incubées à 30°C pendant 48
heures.
40
Les résultats de la culture mettent en. évidence des colonies à contours
nets ou irréguliers d'un diamètre de 0,5 à 1 mm. Le.-u.r forme est généralement
circulaire, opaques, de consistance homogène ou discrètement granuleuse,
incolores ou blanchâtres et facilement numérables. L'examen microscopique de
frottis de colonies sur lame et après coloration de Gram est nécessair~ pour
confinnation des caractères culturaux. En effet, il permet la révélation de
bacilles Gram + non sporulés, longs et flexueux.
A.II.2.10 - LEUCONOSTOCS
La recherche et le dénombrement des Leuconostocs, germes appartenant
à la famille des Streptococcaceaes, sont réalisés sur la gélose hypersaccharosée
à 150 g/l coulée en boîte de Pétri. L'inoculation s'effectue à partir de 0,1 ml de
la suspension mère et des dilutions décimales retenues.
Cette quantité sera étalée à la surface du milieu. Ensuite, les boîtes
retournées seront incubées à 30°C pendant 48 heures:
La lecture des boîtes met en évidence des grosses colonies transparentes,
muqueuses et coulantes qui sont comptées.
Un examen microscopique à partir de frottis de colonies sur lame et
après coloration de Gram fait apparaître des cocci Gram + en diplocoques et
en chaînettes.
Au niveau biochimique, la catalase est négative.
Toutes les conditions de température et de temps d'incubation des cultures de
gennes recherchés sont précisées dans le tableau 6
4 1
TABLEAU 6: CONDITIONS DE CULTURE
DES GERMES RECHERCHES
(Les températures et le temps d'incubation)
GERMES RECHERCHES
TEMPERATURES
TEMPS
OPTIMALES
D'INCUBATION
Aérobies mésophiles totaux
30°c
72 h
Coliformes totaux
30°C
24 h
Califormes TI~ermotolérants
44°C
24 h
1
(C.Th.)
Anaérobies
sulfito-
46°C
24 h - 48 h
réductrices
Staphylococcus aureus
37°C
24 h - 48 h
Streptocoques D
37°C
48 h -72 h
*enrichissement
37°C
24 h
* isolement su: B~
37°C
24 h - 48 h
-
Salmonella
37°C
96 h
* préenrichissement
37°C
24 h
* enrichissem(·nt
37°C et 44°C
24 h
* isolement sur SS/ Hektoen
37°C
24 h
* identification ~.Lr
37°C
24 h
portoir réduit de Le Mino!".
24 h
Levures
* isolement
30cC
48 h
:;< identification sur galerie
30c C
24 h - 4R h - 72 h
API 20sC AUX
Lactobacillus
30cC
48 h
_....-.
Leuconostocs
30cC
48 h
.
42
A.II.3. . PROTOCOLE MICROBIOLOGIQUE
UTILISE
Deux principes majeurs de la microbiologie ont été respectés; à savoir:
- les conditions d'aseptie pour éviter toute contamination extérieure
- le temps de manipulation afin de réduire les facteurs de multiplication
des gennes.
En ce qui concerne les conditions d'aseptie, nous avons travaillé dans
l'environnement stérile crée par la flamme du bec bunsen. Etant privé de
hotte, la paillasse a été nettoyée à l'alcool; les cheveux, le nez et la bouche ont
été protégés tandis que les mains ont été lavées convenablement et passées à
l'alcool avant toute manipulation.
Pour la réduction des facteurs de multiplication, nous avons effectué nos
manipulations pendant un temps court fixé à 15 minutes.
Quatre éta?es majeures sont accomplies avant la lecture de résultats. Ce
sont:
- la prépalation de l'échantillon pour l'analyse
- la préparation de la suspension mère et des dilutions décimales
- l'inoculation ou l'ensemencement aux milieux spécifiques
- l'incubation aux températures spécifiques
A.II.3.1 - I-'R[I'ARATION DE L'ECHANTILLON ET DE LA
SLSPE\\SION "ERE
Le fru il de ~ Z,nie:- préalablement conservé en chambre froide (-SoC) et
sélectionné pou:" i'analyse est sorti puis mis pour S à 10 minutes dans un
cristallisoir stéri:t et fenné contenant de l'hypochlorite de sodium dilué. Cette
première étape avait pour objectif de diminuer la charge des micro-organismes
pouvant contaminer l'épicarpe.
43
Le fruit a été ensuite rincé à l'eau physiologique stérile. La dissection de
l'épicaorpe fibreux du fruit
(photo 2) a été réalisée à l'aide d'instruments
stériles.
Un aliquot de 25 g de pulpe a été prélevé aseptiquement et pesé dans un
sachet plastique stérile (photo 3). Une dilution décimale a ensuite été réalisée
avec 250 ml de diluant constitué d'eau peptonée tamponnée.
L'homogénéisation a été effectuée manuellement. La suspension mère
obtenue a
permis: d'une part l'inoculation des milieux de culture, d'autre
part la préparation des dilutions décimales et le préenrichissement pour la
recherche de Salmonella
A.II.3.2 . PREPARATION DES DILUTIONS DECIMALES
La technique des dilutions décimales à partir de la suspension mère
pennet une évaluation rapide et aisée du nombre de gennes contenu dans un
échantillon donné.
Cette tecrnique utilise la tryptone sel (milieu physiologique) comme
diluant préalablement préparé aseptiquement et reparti dans des tubes stériles,
à raison de 9 ml par tube.
Les tubes (\\fit alors été marquées des chiffres : -l, -2, -3, -4,
correspondant~ all,'( dilutions que nous voulions effectuer 1/10, 1/100, 1/1.000
1/10.000.
A l'aidt~ d'une pipette stérile de 1 ml, nous avons prélevé 1 ml de la
suspension mère de pulpe de rânier que nous avons transféré aseptiquement
dans le tube de Jiluant marqué -1, après homogénéisation, la dilution 1/1 0 a
ainsi été réalisée.
Nous aVOf'S changé cte pipette pour effectuer à partir de ce tube -l,
la dilution 1/100 ou -2.
Nous avons à nouveau changé de pipette et ainsi de suite, jusqu'à la
dilution
1/10000 ou - 4.
44
Photo 2:
PUlPE DU FRUIT DE RONIER
(matériel biologique de l'étude)
el Autres éléments constitutufs du fruiJ (noyaux, exocarpe, cupule)
Photo 3 :
AUQUOT DE 25 g de PU I.PE dilué au 1110 dans un sachet Kstérile»
(suspension mère)
45
A.II.3.3 - INOCULATION DES MILIEUX DE CULTURE
En fonction des gennes recherchés, deux techniques ont été utilisées:
- la technique par incorporation ou ensemencement en gélose profonde,
soit en double couche, soit en tube
- la technique d'isolement sur gélose à l'aide d'un ensemenceur de verre.'
A.II.3.-3 -1 - La technique par incorporation
A - Incorporation en double couche en boîte de Pétri
,
A l'aide d'une pipette graduée stérile, 1 ml de la suspension à analyser et
1 ml de chaque dilution retenue est déposé dans des boîtes de Pétri stériles
préparées pour i:hdcune des dilutions.
Puis, environ 15 ml de gélose spécifique à 45°C sont ajoutés. Le tout est
homogénéisé en imprimant des mouvements circulaires soigneux dans le sens
des aiguilles d'tH'.e montre et dans le sens contraire.
Le mélange est laissé à la température ambiante après la prise en masse.
Une deuxième couche de gélose spécifique à 45°C est coulée sur la première.
Enfin, après solidification, les boîtes sont placées à l'étuve aux températures
spécifiques de~ ge:mes recherchés.
Cette technique est utilisée pour la recherche:
- des gem:es aérobies mésophiles avec comme milieu sélectif pour la
première couche la gélose PCA et la gélose blanche pour la deuxième couche.
- des co11fom1es totaux et des coliforn1es thern1otolérants avec comme
milieu sélectif la
gélose au désoxycholate à 1%0 pour les premières et
deuxièmes couches.
46
B - Incorporation en profondeur en tube
B.l - Dans les milieux gélosés
Ces milieux sont préalablement coulés en tube et, ensuite fondus puis
ramenés à 45°C. 1 ml d'inoculum est incorporé d3.ns chaque milieu sélectif
puis l'ensemble homogénéisé. Après solidification, ces milieux sont mis à,
incuber à 46°C. Cette technique est utilisée dans la recherche des bactéries
sulfito réductrices sur gélose TSN en tube.
B.2 - Dans les milieux liquides
Avec une quantité standardisée d'inoculum, les bouillons sélectifs de
culture sont ensemencés.
Cette technique est utilisée pour un enrichissement ayant pour but la
recherche de SalmoneIla et des Streptocoques du groupe 0
A.II.3.3-2 • La technique par inondation et étalement
A l'aide d'une pipette stérile, 0,1 ml de l'inoculum est porté sur les
milieux gélosés ·coulés en boîtes de Pétri et préalablement séchées. Puis, en
utilisant un ensemenceur stérile, l'on inonde et étale la quantité ensemencée sur
toute la surface du milieu.
Cette technique d'inondation et d'étalement est utilisée pour la recherche
de différents gcnnes tels que:
- les Staphylococcus aureus sur Baird parker
- les Levure~ sur OGA
- les LaClOl\\:.cil1us sur MRS
- les Leucopostocs sur milieu hypersaccharosé
La tecbnique d'étalement simple à l'aide d'~n ensemenÇ;eur est très
employée d'un~ ~).I.rt pour l'isolement des Salmonella sur milieu SS et Hektoen
et , des Strepto(oque1i du groupe D sur milieu Décoc.)se1. D'autre part, pour la
réalisation des différents repiquages de souches notaoment dans la confection
du portoir réduit de LE rvlINOR. Les pipettes et étah:urs stériles sont utilisées
dans la zone de :..térilité crée par la flamme du bec bur.sen.
47
A.II.3.4 - ;\\NALYSE CO\\1PLETE DE LA Pl;LPE DU FRUIT DL
RONIER
1
{
1
A.II.3.4-1 - Jour J 0
1
ft
a) - Recherche et dénombrement des germes aérobies
\\ft
mésophiles totaux sur gélose PCA
- Nous avons procédé par la technique des dilutions décimales à partir de.
la suspension mère de la pulpe.
- Nous avons réalisé une inoculation en profondeur en double couche
dans des boîtes avec de la gélose PCA fondue et de la gélose blanche.
- Après solidification, les boîtes ont été retournées et incubées dans cette
position à 30°C vendant 72 heures.
b) -Recherche et dénombrement des coliformes totaux et
de~ coliformes thermotolérants sur désoxycholate à 1%0
- A partir des dilutions décimales préalablement préparées, nous avons
répartis dans des boîtes de Pétri stériles respectivement 1 ml de la suspension
mère de pulpe de rJnier et 1 ml des différentes dilutions à la tryptone sel en se
servant de pipettes stériles.
- Une incorporation en profondeur en double couche des inoculums dans
du désoxycholate à 10/00 fondu a été réalisée.
- Après la solidification complète des deux couches, les boîtes ont été
retournées et incubées dans cette position:
* à 30°C pendant 24 11 pour la recherche des coliformes totaux
* à 44°C pendant 24 h pour la recherche des colifonnes thermotolérams.
48
c) • Recherche et dénombrement des bactéries sulfito·
réductrices sur TSN
La gélose TSN a initialement été préparée et répartie dans des tubes
stériles à raison de 10 ml par tube.
Après avoir fondu et refroidi aux environs de 45°C la gélose, nous avons,
ensemencé 1 ml de la suspension mère et 1 ml de chacune des dilution
décimales
(l à 1/1 00) dans une série de ce milieu en se selVant de pipettes stériles.
- une homogénéisation a été faite de façon soigneuse sans occasionner
l'apparition de bulles d'air.
- Après refroidissement, nous avons incubé l'ensemble à 46°C pendant
24 et 48 heures.
d) ~ Recherche et dénombrement de Staphylococcus
aureus sur Baird parker
- Nous avons préparé une série de boîtes de gélose Baird-parker dont la
surface était rigoureusement sèche. Ces boîtes ont été identifiées en y marquant
les chiffres :
0,1 ; -1 ; -2 ; -3 qui correspondent aux différentes dilutions de la suspension
mère de pulpe d~ rônier en tryptone sel.
- Nous avons réalisé des inoculations par étalement en surface de 0,1 ml
de la suspension mère et de chacune de ses dilutions, en opérant
rigoureusement devant un bec bunsen et en se servant de matériel stérile.
- Ensuite, ks boîtes ont été retournées et incubées dans cette position à
37°C pendant 24 heures et/ou 4R heures.
49
e) - t<echerche des Streptocoques du groupe D en milieu
ROTHE
Le milieu liquide Rothe a initialement été préparé et réparti dans des
tubes stériles à raison de 10 ml.
- Nous aW)flS procédé à une inoculation en profondeur en milieu liquide
de 1 ml de la suspension mère et des dilutions décimales retenues
- Les tubes ainsi obtenus ont été incubées à 37°C pendant 48 heures pour
un test présomptif
f) - Hccherche et dénombrement des Levures sur OGA
•
- La gélose aGA contenant 0,10 mg d'oxytétracycline par ml de milieu a
initialement été ~)~parée.
- Nous avons réparti aseptiquement dans des boîtes de Pétri stériles 10 à
15 ml de gélose aGA fondue et ramenée à la température de 45°C environ.
- Une Sél ie de boîte dont la surface fut rigoureusement sèchée a été
identifiée en y marquant les chiffres: 0,1, -1, -2, -3 correspondant aux
différentes dilutions de la suspension mère de pulpe de rônier.
- Nous ~'lvr.n.~ réalisé aseptiquement des inoculations par étalement en
surface de la gélo::e de 0,1 ml de la suspension mère et de chacune des dilutions
retenues.
- Les boît-.:s ont été retournées et incubées dans cette position à 30c C
pendant 24 à 48 heures.
g) . .Recherche et dénombrement des LactobaciHus sur
~1RS
- Une sélie de boîtes de gélose MRS dont la surface fut rigoureusement
sèchée a été préparée.
50
- Ces boîtes ont été identifiées et nous y avons réalisés des inoculations
par étalement efi surface de 0,1 ml de la suspension mère et de chacune des
dilutions retenues
- Les boîtes ont été retournées et incubées à 30°C pendant 24 à 48
heures.
h) - Rfcherche et dénombrement des Leuconostocs sur
n.ilieu hypersaccharosé
- Une ~érie de boîtes de gélose hypersaccharosé dont la surface fut
rigoureusement f,h:hé a été préparée.
- Les boîtes ont été identifiées et nous y avons réalisés des inoculations
par étalement en surface de 0,1 ml de la suspension mère et de chacune des
dilutions retenue s.
- Les boîtes ont été retournées et incubées à 28-30°C pendant 48 heures.
i) - Rel.herche de Salmonella : Pré-enrichissement
- Le reste de la suspension mère contenue dans le sachet "stérile" a été
incubé 37°C pendant 24 h pour un préenrichissement.
A.II.3.4-2 : Jour J+l (24h)
a) - Les coliformes totaux
- Sur gélo.,e au désoxycholate à 1%0, nous avons dénombré les colonies
de couleur orange bordeaux ou rouge foncé et d'un diamètre compris entre 0,5
et 1 mm.
- Les pctite~ .:olonies roses n'ont pas été considérées et seules les boîtes
où 15 à 150 c()io~j;·:s numérées ont été retenues.
5 1
b) - Les coliformes thermotoléranfs
- Nous avons considéré uniquement les colonies caractéristiques fouges
foncées pour le dénombrement.
c)- Les bactéries sulfito-réductrices
Sur gélose tryptone sulfite néomycine, nous avons recherché les
colonies de Clostridium perfringens sélectionnées par la température
d'incubation.
Elles apparaissent entourées d'une auréole noire de taille importante due
à la réduction du sulfite qui provoque une précipitation du sulfure de fer.
Nous avons laissé incuber à nouveau pendant 2~ h quand aucune colonie
n'avait poussée.
d} - Staphylococcus aureus
- Sur Baird-Parker, gélose sélective d'isolement, les souches de
Staphylococcus aureus fournissent des colonies noires caractéristiques.
Avec ce milieu opaque, la production d'un halo clair autour des colonies
est dû à une zone de protéolyse marquée par l'éclaircissement du jaune d'oeuf
contenu dans le milieu. Nous avons donc dénombré toutes les colonies noires
entourées d'un halo clair.
- 3 à 5 colonies caractéristiques ont été mises sur lame pour la réalisation
d'un examen microscopique après coloration de Gram afin de confinner la
présence de coccis Gram (+) en amas.
- Pour avoir plus de précision, après les examens macroscopiques et
microscopiques positifs, nous avons effectué les tests biochimiques
d'identification suivants:
* - la staphylocaogulase libre
* - la DNASE ou désoxyribonucléase
* - l'utilisation du mannitol
52
e) SalmoneHa (enrichissement)
- L'enrich;.;isement proprement dit par inoculation en profondeur de 2
ml de la suspension mère préenrichie dans 20 ml de bouillon au sélénite en
tube a été réalisé.
- Nous avons fait cet enrichissement en duplicata pour incuber un des
bouillons à
37°C et l'autre à 44°C pendant 24 heures.
A.II.3.4-3 - Jour J+2 (48 h)
•
a) - Les bactéries sulfito-réductrices
- Nous avons recherché les colonies noires de C. perfringens et les
résultats ont été .;omparés à ceux obtenus après 24 heures d'incubation.
b)- Staphylococcus aureus
A partir de la suspension d'une colonie caractéristique isolée du milieu
Baird parker, inoculée au bouillon thioglycolate et incubé pendant 24 heures à
37°C.
Nous avons réalisé les tests biochimiques spécifiques à l'identification de
l'espèce
aureus à savoir ~
- la recherche de la staphylocoagulase libre
- la recherrhe de désoxyribonuclease
- l'utilisatlvn du mannitol
c) • Les Streptocoques du groupe D.
- Au nivea-J des bouillons Rothe, nous avons recherché les tubes
présentant un trouble bactérien considéré comme pouvant contenir des
streptocoques du groupe D.
53
- A l'aide d'une anse stérile, les gennes contenus dans ces tubes ont été
repiqués sur des géloses d'isolement Decoccosel.
- Les boîtes retournées ont été incubées 24 à 48 heures à 37°C.
d) - Salmonella (isolements)
- A l'aide d'une anse stérile (ose bouclée), nous avons ensemencé, par
étalement, chaque bouillon d'enrichissement au sélénite sur deux milieux
d'isolement sélectifs préalablement préparés, coulés en boîtes de Pétri et à
surface rigoureusement séchées :
* -gélose Hektoen
* -gélose Salmonella Shigella (SS)
-
- Les boîte~\\ ont été retournées et incubées dans cette position à 37°C
pendant 24 heures.
e)- Les Levures et les Moisissures
- Sur la gélose OGA, les colonies caractéristiques crémeuses blanches ou
blanchâtres ont été dénombrées.
- Sur lame, nous avons réalisé un examen microscopique à partir de
frottis de colonies à l'état frais et après coloration de Gram pour confinnation.
- Nous avons fait 3 à 5 suspensions dans de l'eau distillée (2 ml) contenue
dans des tubes à hémolyse à partir des colonies isolées de souche pure. Ces
suspensions ont été utilisées d'une part pour les ensemencer sur les milieux de
culture afin de pouvoir réaliser des tests de caractérisation et mieux les
conserver. D'autre part, pour transférer 100 }lI soit 3 gouttes d'une pipette
Pasteur dans une ampoule de C Médium afin d'ensemencer une galerie API 20
C AUX pour l'identification des souches de levures isolées.
- Les galeries API 20 C AUX ont été ensemencées.
- Enfin, nous avons réalisé les tests physiologiques classiques de :
54
* -blastèse
* - chlamydosporulation
f) - LactobaciBus
- Sur MRS, les colonies circulaires opaques, incolores ou blanchâtres
facilement numérables ont été recherchées.
- Nous avons ensuite réalisé un examen microscopique de frottis de
colonies sur lame après coloration de Gram pour mettre en évidence la
présence de bacilles Gram + non sporulés, longs et flexueux caractéristiques du
genre Lactobacillus.
g) . Leuconostocs
- Sur gélose hypersaccharosée à 150 g/l les grosses colonies
\\i
transparentes, muqueuses et coulantes ont été dénombrées.
i1f'
- Nous avons fait un examen microscopique sur lame après coloration de
Gram de frottis de colonies, pour la révélation de cocci Gram + en
diplocoques et en chaînette caractéristique du genre Leuconostoc.
;
1
A.II.3.4-4 - Jour J+3 (72 heures)
1
F
a) • Les germes aérobies mésophiles
- Nous avons dénombré toutes les colonies présentes sur les géloses PCA,
la numération était dirigée vers les boîtes contenant entre 30 à 300 colonies.
b) • Salmonella
- A partir des isolements sur les géloses SS et Kektoen, nous avons dirigé
la recherche vers les colonies dites Lactose négatif (-), de couleur transparente
à centre noir, noire ou verte.
55
3 à 5 colonies catactéristiques ont été repiquées sur les portoi;'s réduits de
LeMinor qui sont incubés à 37°C pendant 24 heures.
c) • Les Levures
- Les galeries API 20C Aux ont été lues les cupules plus troubles que le
t
témoin indiquant des réactions positives sont notées sur la fiche de résultats.
- Grâce à ~a fiche des résultats, nous avons réalisé le codage numérique
pour l'identification du genre et de l'espèce en tenant compte des tests
physiologiques de présence de mycelium, de filamentation, et de
chlamydosporulation.
d) - Staphylococcus aureus
* La staphylocoagulase libre
Nous avomi mélangé dans un tube à hémolyse stérile 0,5 ml de plasmLt
réhydraté et 0,5 ml de la culture en bouillon de la souche à étudier.
Le mélang~ a été porté à l'étuve à 37°C et toutes les 30 minutes il était
vérifié et ce, sur' environ 3 heures de sorte la prise en masse du plasma qui est
généralement totale avec la souche de Staphylococcus aureus soit à un point
tel qu'il est possible de retourner le tube.
* La DNASE = Désoxyribonuclease
Après avoir ~noculé en strie unique des colonies suspectes du milieu
Braird parker sur la gélose à l'acide désoxyribonucléique (ADN) et incubé
pendant 24 heu 1'c:; à l'étuve à 37°C, nous avons inondé la gélose avec une
solution d'acid~ chlorhydrique qui révéle alors une zone claire autour de la
strie tandis que ~;ur le reste de la boîte reste opaque chez les souches DNASE +
notamment les Staphylocoques.
56
* L'utilisation du mannitol
Au moyen d'un fil de platine, nous avons ensemencé par piqûre centrale
ou par étalement, la souche isolée du milieu Baird-parker sur la gélose
Chapman mannité.
Après incubê.tion à 37°C pendant 24 heures, nous avons noté l'utilisation
du mannitol qui induit le virage du milieu initialement rouge ou jaune.
e) - Les Streptocoques du groupe D
- Nous avons lu les résultats donnés par le test présomptif du milIeu
Rothe en considérant les tubes présentant un trouble bactérien comme ppuvant
contenir des streptocoques du groupe D.
- Le test confirmatif a été fait en ensemençant une ose de ces tubes
positifs sur de la gélose Décocosel et en l'incubant à 37°C pendant 24 heures.
A.II.3.4-4 .. Jour J + 4 (96 h)
a) .. Salmonella
- Les portoirs réduits de LEMINOR ont été lus en se référant aux
caractères biocl)jmiques communs à la majorité des Salmonella et qui
permettent également le diagnostic des genres et des espèces.
- Si suspicion de Salmonella; la souche est adressée au laboratoire
national des Ent ~robactéries pour sérotypage.
b) . Les Levures
- Une s\\~con(j.~ lecture de la galerie API 20 C AUX a été faite après 48
heures d'incub:l~L):~ à 30cC pour une meilleure analyse des réactions positives
et une identificati<.:n plus précise des genres et des espèces.
57
c) - Staphylococcus
La lecture de la culture sur milieu à l'ADN et la lecture de l'utilisàtion
du mannitol ont été faites.
d) - Les streptocoques du groupe D
- La lecture de la culture sur milieu Decocosel est faite et ce sont les·
colonies
noires caractéristiques qui ont été recherchées.
, Enfin, une confinnation a été faite par un examen microscopique après
coloration de Gram.
A.II.3.4-5 - Jour J + 5 (120 h)
a) • Les Levures
Une troisième lecture de la galerie pour détenniner le profil numérique
afin d'identifier l'espèce a été réalisée.
58
A.III - RESULTATS ET DISCUSSIONS
A.III.l - LES GERMES AEROBIES MESOPHILES
TOTAUX (Critère < 300.000 gennes/g)
La charge en micro-organismes est variable. Ce résultat se retrouve
aussi bien sur les fruits récoltés sur l'arbre que sur ceux ramassés au sol.
(tableaux 7 et 8)
En se référant aux normes "AFNOR" (nombre <300 000. gennes/g)
pour les gennes aérobies mésophiles (G.A.M.), trois catégories de charge
microbienne ont été distinguées :
- La première où la charge est comprise entre 300 et 3.000 gennes par
gramme (g) de pulpe de rônier. Cette charge est 100 à 1.000 fois inférieure à
la valeur seuil ID.. (nombre au-dessous duquel le produit est déclaré
satisfaisant).
Les échantillons appartenant à cette première classe sont d'une qualité
microbiologique très satisfaisante pour les "G.A.M." car la charge
microbienne est très faible. Nous notons que 32% des fruits récoltés sur
l'arbre contre seulement 16% des fruits ramassés au sol appartiennent à cette
classe.
- La deuxième catégorie où la charge microbienne est comprise entre
3.000 et 30.000 gennes par g de pulpe (photo 4) . La valeur est 10 à 100 fois
inférieure au seuil critique m. Les échantillons de cette catégorie sont dotés
d'une charge microbienne faible et d'une qualité microbiologique satisfaisante
pour les "G.A.M....
- La troisième catégorie où la charge est comprise entre 30.000 et
300.000 gennes par g de pulpe; soit une valeur 1 à 10 fois inférieure au seuil
m.. Ces échantillons sont dotés d'une charge moyennement élevée qui,
d'ailleurs, se rapproche de la valeur critique. Ils sont toujours de qualité
micro-biologique satisfaisante pour les "G.A.M."
59
Le nombre d'échantillons appartenant à cette classe est quatre fois plus
élevée dans le lot ramassé au sol. En effet, 36% des fruits récoltés au sol ont
une charge moyer.nement élevée contre seulement 8% des fruits récoltés sur
l'arbre.
Notons que pour les deux lots, aucun fruit analysé ne présentait une
charge supérieuœ à la valeur seuil m, soit 300.000 gennes par g de pulpe de
rônier. Ce paraw.ètre peut être considéré comme un élément important pour la'
détermination de la qualité microbiologique des fruits de rônier analysés.
Ces résul~ts quantitatifs autorisent certaines remarques:
- la variabilité des charges microbiennes
1
- la charge de ces germes est toujours inférieure à la valeur seuil
infectante
- les fmits ramassés au sol ont une charge plus importante que ceux
récoltés sur l'arb~e ;
Les fruits récoltés sur le sol présentent un degré de maturité plus élevé;
ce qui constillic U~1 facteur favorisant la prolifération microbienne.
Ce fruit de rânier a suscité plusieurs études, notamment en Asie. Mais
seuls les aspects botaniques, physiologiques et biochimiques ont ét~ réalisés.
En Afriqu~, les travaux au niveau de la microflore sont quasi inexistants
; ce qui représente un facteur limitant pour ce travail. Le dénombrement des
"G.A.M." ne con~titue qu'une approche de l'étude microbiologique. Une
analyse plus fine est nécessaire pour apprécier cette microflore au plan
qualitatif quel1~ so:t commensale ou pathogène.
60
TABLEA ll.L:
FREQUENCE DES G.A.M. ISOLES DES FRUITS
RECOLTES SUR L'ARBRE
Nombre de
Nombre d'échantillons
Pourcenta e ( % )
.~. < 300 - 3.000 <
8/25
32
'< 3.000 - 30.000<
15/25
60
< 30.000 - 300.000<
2(25
8
> 300.000
0(25
0
H
TABLEAF
8:
FREQUENCE DES G.A.M. ISOLES
li
DES FRUITS RECOLTES AU SOL
Nombre de
ermes/~
Nombre d'échantillons
Pourcenta2e ( % )
<300 - 3.000<
4/25
16
<3.000 - 30.000<
12/25
48
<30.000 - 300.000<
9/25
36
>300.000
0/25
0
.
61
Photo 4:
GER.'WES AEROBIES MESOPHlLES isolés du Fruit de RONIER.
62
A.III.2 . LES COLIFORMES TOTAUX
(Critère <1000 germes/g)
Les coliformes totaux sont quasi absents de la pulpe des fruits récoltés
sur l'arbre. Seul 4 % des échantillons collectés au sol ont été retrouvés positifs.
La contamination fécale s'est donc produite lors du séjour du fruits sur le sol
(tableaux 9 et 10).
La charge reste faible. Elle est comprise entre 10 à 100 germes par g de
pulpe (photo 5). Cette charge bactérienne est 10 à 100 fois inférieure à la
valeur seuil m, fixée à 1 000 germes/g par les coliformes totaux selon les
normes "AFNOR".
L'origine de cette contamination pourrait être:
- la flore tellurique
- l'environnement avec le concours du véili, des insectes (guêpes,
mouches.... )'.
qui transportent de nombreux germes. .
- et surtout, l'hygiène environnante inexistante. Avec, l'infestation par
les agents pathogènes contenus dans les excretats : selles, urines humaines ou
animales. Ce péril fécal constitue d'ailleurs un véritable problème dans le "V
Baoulé", comme dans tous les pays tropicaux.
-
Une analyse plus fine des coliformes totaux a permis de les classer en :
- coliformes thermotolérants (E. coli)
- Staphylococcus aureus
- Streptocoques du groupe D (Enterococcus)
Comme pour les germes aérobies mésophiles, tous les fruits analysés ont
une qualité microbiologique satisfaisante pour les coliformes totaux.
63
TABLEAU 9.:
FREQUENCE DES COLIFORMES TOTAUX DANS
LESFRUITS RECOLTES SUR L'ARBRE
Nombre de 2ermes 1 2
Nombre
d'échantillons
Pourcentage ( % )
Absence de germes
25/25
100
TABLEAU
JQ:
FREQUENCE DES COLIFORMES TOTAUX ISOLES
DES FRUITS RECOLTES AU SOL
Nombre de germes
Nombre
Pourcentage
par g
d'échantillons
( % )
Absence ( < 10)
21/25
84
< 10 - 100 <
4/25
16
> 100
0/25
0
TOTAL
25
100
64
Photo 5:
Colonies de COL/FORMES
65
A.III..3. . LES COLIFORMES
THERMOTOLERANTS (Critère < 10 gennes/g)
Les résultats obtenus pour la recherche et le dénombrement des
coliformes totaàx, sont identiques à ceux obtenus pour les coliformes
thennotolérants ou colifonnes fécaux. (tableaux Il et 12)
Les colifomles thennotolérants sont absents de tous les fruits récoltés.
sur l'arbre.
Ces colifonT:es ont également la même charge bactérienne dans 16 % de
frui.ts provenant d~ sol. Cette charge est comprise entre 10 et 100 germes par
g <le pulpe. Suivant les nonnes AFNOR, elle est moyennement élevée, car 1 à
10 fois supérieu~'c à la valeur seuil m infectante: fixée à 10 gennes par g de
produit pour les colifonnes thennotolérants.
Les colifonnes totaux présents dans les échantillons, seraient donc tous
des coliformes t:lermotolérants.
La présence d'Escherichia coli affirme donc la contamination fécale de
ces fruits
(photo 5).
La charg~ bactérienne moyennement élevée va, pour sa part, réduire la
qualité microbiologique des fruits récoltés au ~l.
Ainsi 15 % de ces fruits vont passer d'une qualité microbiologique
satisfaisante à ,me autre dite acceptable voire non satisfaisante pour les
colifonnes themlOtolérants.
En Côte (l'Ivoire, les râniers sont en pleine savane Baoulé; soit aussi
près des village~, soit près des plantations des habitants de cette région, ou sur
le trajet de ceux-ci (CHEVALIER, 19..+9 ; PORTERES, 1964 ; I3 USSON, 1965
; BLANC- PAMA"~D, 1980).
Cette cO'1tar.l;nation est maximalisée par les vecteurs tels que: le vent et
les insectes qui b\\ 'Jfisent la dissémination des féces.
66
TABLEAU
J J:
FREQUENCE DES COLIFORMES
THERMOTOLERANTS DANS LES
FRUITS RECOLTES SUR L'ARBRE
Nombre de
Nombre
Pourcentage
~ermes par g
d'échantillons
( % )
Absence de germes
25/25
100
!
TABLEAU
12:
FREQUENCE DES COLIFORMES
THERMOTOLERANTS ISOLES DES
FRUITS RECOLTES AU SOL
Nombre de
Nombre
Pourcentage
germes par ~
d'échantillons
( % )
Absence ( < 10 )
21/25
84
< 10 - 100 <
4/25
16
> 100
0/25
0
TOTAL
25
100
67
A.III.4. . LES BACTERIES ANAEROBIES'
SULFITO - REDUCTRICES
L'absence de bactéries anaérobies sporulées sulfito-réductrices a été de
règle. En effet, aucun échantillon analysé sur milieu T.S.N, n'a permis
l'isolement de germes spécifiques au genre Clostridium. (tableau 13)
A.III.S - STAPHYLOCOCCUS AUREUS
(Critère < 100 germes/g)
-
'!"... :.
Le genre Staphylococcus est très recherché en hygiène et toxicologie
alimentaire. En effet, l'espèce aureus est dotée d'un pouvoir pathogène très
marqué.
Sa recherche à partir de la pulpe du rônier, sur milieu sélectif Baird
Parker couplée à des tests biochimiques de confirmation, a fournie les résultats
consignés dans les tableaux 14 et 15.
Ces résultats mettent en évidence une absence totale de ces germes dans
les fruits récoltés sur l'arbre. Cependant, les fruits ramassés au sol ont montré
32 % contaminés par Staphylococcus aureus
68
TABLEAU 13 :
FREQUENCE DES A.S.R. DANS
LES
FRUITS RECOLTES SUR L'ARBRE ET AU SOL
Absence ou
Nombre
Pourcentage
Présence de
d'échantillons
( % )
2ermes
Absence
50/50
100
Présence
0/50
0
TOTAL
50
100
TABLE.\\U
14:
FREQUENCE DES S. AUREUS
DANS LES
FRUITS RECOLTES SUR L'ARBRE
Nombre de
Nombre
Pourcentage
·2ermes par C
d'échantillons
( % )
Absence de S. aureus
25/25
100
Présence
0(1,5
0
•
TOTAL
25
100
TABLEAU IL:
FREQUENCE DES S. AUREUS
ISOLES
DES FRUITS RECOLTES AU SOL
Nombre de
Nombre
Pourcentage
~ermes par 1L_
d'échantillons
( % )
Absence de S dtlr.~I!S
17/25
68
_.
< 100 - 1000 <
8/25
32
> 1000
0/25
0
.
TOTAL
25
100
69
Photo 6:
Colonies de STAPHYLOCOCCUS allfellS isolées du Fruit de RONIER.
70
Ce qui est remarquable dans ces résultats, c'est que la charge bactérienne
dénombrée est supérieure à la valeur seuil ID. infectante fixée à 100 germes par
g de produit (photo 6).
En effet, cette charge est comprise entre 100 et 1000 germes par g de
pulpe ; soit donc, une à 10 fois supérieure au critère normal pour un fruit de
qualité microbi~logique satisfaisante.
La présence de ce germe en quantité supérieure à la norme dans un tiers
de"s échantillons ramassés sur le sol, met en évidence une contamination de ces
fruits en contact avec le sol, régulièrement infecté par les excrétats des
populations environnantes. Car les fruits récoltés sur l'arbre sont exempts de
ces germes.
Cette conurnination pourrait également être réalisée par les insectes qui
constituent un véritable pont entre les excretats et les fruits.
Ces résultats montrent donc que les fruits du rônier ramassés sur le sol
sont continuellemem contaminés.
Les germes pathogènes retrouvés permettent de présager de leur rôle
inff;Ctant chez les populations qui les consomment crus et sans précaution.
A.III.6. . LES STREPTOCOQUES du Groupe D :
ENTEROCOCCUS
Les Strepto.;oques du groupe D ou Enterococcus sont absents dans les
fruits récoltés 'iur l'arbre. Mais 24 % des échantillons ramassés sur le sol
hébergent ces gennes entéropathogènes (tableaux 16 et 17).
Plusieurs espèces de ces gem1es sont habituellement saprophytes ou manifestent
parfois un pouvoir pathogène (HORODNICEAUMU, 1980).
Ces bactéri~-,s sont constamment rencontrés dans les matières fécales de
l'homme ou d~ la plupart des animaux.
7 1
TABLEAU 16: FREQUENCE DES STREPTOCOQUES du Groupe D
DANS LES FRUITS RECOLTES SUR L'ARBRE
Absence ou
Nombre
Pourcentage
Présence de
d'échantillons
( % )
germes
Absence
25/25
100
Présence
0/25
0
TOTAL
25
100
!
TABLEAU 17:
FREQUENCE DES STREPTOCOQUES du Groupe D
ISOLES DES FRUITS RECOLTES AU SOL
Absence ou
Nombre
Pourcentage
Présence de
d'échantillons
( % )
2ermes
Absence
19/25
76
-
Présence
6n5
24
TOTAL
25
100
TABLE.\\(J
18:
FREQUENCE DES SALMONELLA DANS LES
FRUITS RECOLTES SUR L'ARBRE ET AU SOL
Absence ou
Nombre
Pourcentage
Présence
d'échantillons
( % )
.
de germes
Absence
50/50
100
Présence
0/50
0
h '
TOTAL
50
100
.
72
A ce titre, les Enterococcus sont donc des témoins sensibles de
contamination fécale (GELDREICH et Coll., 1969).
La présence d' E. coli correlée à celle des Enterococcus permet
d'affirmer l'origine fécale de la contamination des fruits ramassés sur le sol.
Ceci constitue un véritable problème car la présence de ces
Enterocoeeus, des E. coli, et des Staphylococcus réduit la qualité
microbiologique des fruits de rânier.
Ceux-ci sont alors susceptibles d'être à l'origine d'infections lorsqu'ils
sont consommés crus.
A titre préventif, devant la présence de certains germes à haut pouvoir
pathogène dans les fruits de rânier, il serait intéressant d'inciter la population
du "V Baoulé" à toujours consommer ces fruits après une bonne cuisson,
comme c'est le cas la plupart du temps.
A.III.7 - L'ESPECE SALMONELLA
La recherche de l'espèce Salmonella constitue un élément majeur en
microbiologie alimentaire.
En effet, sa présence induit une toxicité et entraîne systématiquement la
corruption du produit dans lequel il se trouve.
Aucun isolat de Salmonella n'a été mis en évidence dans nos deux lots
d'échantillons. Ce résultat est un élément non négligeable pour la
détermination de la qualité microbiologique de nos fruits (tableau 18)
Leur absence peut être interprétée comme un biais lié à la faiblesse de
l'échantillonnage.
Ce résultat négatif ne vaut que pour les lots qui ont fait l'objet de notre
étude.
De toute façon, l'espèce Salmonella ne peut en aucun cas appartenir à la
microflore naturelle du fruit de rânier car elle est souvent retrouvée sur les
73
produits halieutiques. L'acidité de ce fruit constitue aussi un facteur très
limitant pour cette bactérie et pour les autres Entérobactéries identifiées.
(OGER C. et Coll, 1976).
A.III.8 · LES LEVURES ET LES MOISISSURES
A.III.S.l- ANALYSE QUANTITATIVE
Les Levures ont été retrouvées dans la presque totalité des échantillons
(tableaux 19 et 20).
.
Le diagnostic d'orientation a fait appel aux caractères morphologiques et
culturaux.
Aucune Moisissure n'a pu être mise en évidence dans la pulpe des fruits
selon nos conditions de travail.
Seuls 12 % des fruits ramassés au sol et 16% pour ceux provenant de
l'arbre sont dépourvus de Levures.
La charge Levurienne est constamment élevée.(photo 7).Elle varie de 10
à 10 ()()(} germes par g de pulpe. Cette charge tend à se superposer à celle des"
G. A. M.".
La richesse en sucre des fruits favorise la prolifération des micro-
organismes notamment des levures (CATTEAU,1988).
Les fruits ramassés au sol accusent une charge en Levures plus élevée
que ceux récoltés sur l'arbre. La maturité et la richesse en sucre sont
étroitement corrélés au taux élevé des Levures.
74
TABLEAU 19:
FREQUE~CE DES LEVURES ISOLEES
DES FRt:ITS RECOLTES SUR L'ARBRE
-
Nombre de germe~/2
Nombre d'échantillons
Pourcentage (% )
Absence de levures
4/25
16
<
100 -
1000<
14/25
56
< 1000 - 10.000 <
5/25
20
> 10.000
2/25
8
TOTAL
25
100
,
.:
TABLEAU 2n:
FREQUENCE DES LEVURES ISOLEES
DES FRUITS RECOLTES
AU SOL
Nombre de germe:)!e
Nombre d'échantillons
Pourcenta2e (% )
Absence de levures
3fl5
12
< 100 - 1000 <
9/25
36
< 1000 - 10.000 <
9/25
36
> 10.000
4/25
16
TOTAL
25
100
~
75
Photo 7:
Colollies de LEVURES isolées du Fruir de RONIER
77
Cette analyse quantitative pennet les remarques suivantes:
1 - Les kvures sont retrouvées dans 84 - 87 % des cas
2 - les charges Levuriennes varient de 10 à 10000 gennes par g.
3 - les Levures constituent la flore dominante des "G. A. M."
4 - la colonisation des fruits par les Levures est très élevée au
niveac du sol
5 - les Moisissures sunt absentes.
A.111.8.2- AN AL YSE QUALITA TIVE
Compte tenu, de l'absence d'études antérieures réalisées sur la
microflore des fruits du rânier , l'identification des germes Levuriens s'est
révélée indispensable.
Les tests biochimiques (API 20 C Aux), couplés à quelques tests
physiologiques ont pennis une détermination précise du genre et de l'espèce
(photo 8). L'étuè.c de l'assimilation de:~ 19 hydrates de carbon~ des plaques
API 20 C Aux a permis de déterminer 3 auxotypes différents pour les fruits
récoltés sur l':ubre et un quatrième pour ceux ramassés au sol.
Quatre espèces de Levures semblent donc occuper une place importante
au niveau de la pulpe du rânier (tableaux 21 et 22).
Il s'agit de 3 Levures appartenant au genre Cand ida et une au genre
Kloeckera:
- Candida <!uilliennOJ:dii
..
- Candida humicola
- Candida krusei
- Kloecker cl apis.
Candida knl~ei, a été retrouvé uniquement dans les fruits récoltés au S('t!.
L'origine tellurique de cette Levure est probable.
78
Photo 8 :
Caractères Biochimiques d'ü!entifuation de Candida eumiermondii
( plaque Api 20 CAux).
Photo 9
Culli~re PURE de Candida euilliermondii
79
o Candida guillermondii
Il Kloeckera apis
52,38%
28,57%
•
Candida humicola
!
Figure 5:
Fréquence des Levures identifiées de la pulpe du
fruit de rânier récolté sur l'arbre
o Candida guilliermondii
lm Candida humicola
54,55%
Il Candida krusei
27,27%
o Kloekera apis
Figure
6
f-'réquence des Levures identifiées de la pulpe du
fruit Je rônier récolté au sol
80
1°) - Candida guilliermondii
Dans plus de 70 % des cas, c'est le genre Candida qui est identifié dans
les fruits du rônier.
La fréquence de Candida guillierrnondii est pratiquement la même dans
les deux lots.
Avec 52,4% pour les fruits récoltés sur l'arbre et 54,6 % pour les fruits
ramassés au sol (tïgures 5 et 6).
Candida guillierrnondii peut être considéré .comme un élément de la
microflore sauvage du fruit de rônier.(photo 9)
Cette espèce assimile pratiquement tous les sucres de la galerie API 20C
Aux, sauf l'inositol et le lactose.
Notons cependant que les tests de filamentation donnent des résultats
variables. Ils sont en effet soit positifs : ce qui confirrne leur appartenance au
genre Candida. Soit négatifs : ce qui entraîne leur assimilation au genre
synonyme Torulopsis car tous les Candida autres que les Torulopsis se
présentent sous fonne filamenteuse (BARNETT et Coll., 1983).
C'est pour cette raison que C. guilliennondii est aussi appelé Torulopsis
candida.
2°) • Candida humicola
Les isolats de Candida humicola, sont légèrement plus élevée chez les
fruits récoltés au sol avec 27,2 % contre 19 % chez les fruits récoltés sur
l'arbre (figure 5 et 6 ).
Cette espèce assimile également presque tous les sucres de la galerie, sauf
l'adonitol et le xylitol. Les tests de filamentation sont toujours positifs; ce qui
confirme leur appartenance au genre Candida.
La pulpe du rônier étant très riche en eau et en sucre , constitue un
milieu favorable au développement de l'espèce humicola.
8 1
Présente dan:, lèS deux lots, cette espèce peut également être considérée
comme appartenant à la microflore sauvage du fruit de rônier.
3°) - Candida krusei
Candida krusei est une espèce qui a rarement été rencontrée dans les
fruits du rônier. En effet, elle ne représente que seulement 9,1 % des isolats
dans les fruits ramassés sur le sol (figure 6). Elle est totalement absente dans
les fruits récoltés sur l'arbre (figure 5)....
L'espèce krusei est caractérisée par son inaptitude dans l'assimilation des
sucres de la galerie. Ce ne sont que deux à trois sucres: glucose, glycérol et
quelquefois le N - acétyl - D glucosamine qu'elle est capable d'assimiler. Les
tests physiologiques de filamentation sont positifs.
L'absence dt" cette Levure dans les fruits récoltés sur l'arbre et sa rareté
dans les fruits ramassés au sol (9,1 %), laisse supposer qu'il s'agit plutôt d'une
contamination d'origine tellurique. Sa responsabilité dans la flore sauvage du
rônier est soit pC'J probable ou soit très variable.
4°) - Kloeckera apis
Les isolats de Kloeckera sont variables.
La fréquence des isolements est de 28,6 % pour les fruits récoltés sur
l'arbre contre 9,1 % pour ceux ramassés sur le sol (figure 5 et 6).
Au nive~u biochimique, l'espèce Kloeckera apis est caractérisée par une
très faible assimi lation des sucres. Ainsi, sur les 19 de la galerie, seulement
trois sucres SOTH assimilés : le glucose, le 2 - keto - D - gluconate et le
cellobiose.
Les résult~:~s des tests de filamentation sont variables.
La présence de cette espèce dans près de 30 o/c des fruits récoltés sur
l'arbre, autorise ?l les considérer comme partie intégrante de la microflore
sauvage du fruit.
82
Toutefois, la diminution de s.a présence dans les fruits ramassés au sol, pourrait
être due à l'installation d'une compétition avec les autres germes Levuriens ou
pathogènes présents.
A.III.9- Lft...CTOBACILLUS
Lactobacillus est isolé de façon irrégulière. Seuls 4 % des fruits récoltés
sur le sol sont contaminés (tableaux 23 et 24)
La faible p~'évalence, voire l'absence de ces germes, n'autorise pas à les
considérer comrrlè appartenant à la microflore du fruit.
Les Lact00acillus sont des bactéries responsables de la fermentation du
lactose. Ce sont également des micro-organismes responsables des altérations
des produits alimentaires et fournissent un goût piquant et aigre à ceux-ci.
Leur absence dans les fruits de rônier est un bon indice de qualité
hygiénique.
A.III.I0- LEUCONOSTOCS
LeuconQ..sto~ est comme Lactobacillus, un micro-organisme d'altération
des produits alimcataires.
Il est f'1cilement identifiable sur la gélose hyper-saccharosée, car il
fournit de grosst'.·: colonies transparentes muqueuses et coulantes.
Il est pratiquement absent des fruits du rânier ; cette absence est notée
aussi bien sur les fruits récoltés sur l'arbre que ceux ramassés au sol.(tableau
25)
Ces résu\\tah constituent un bon indice de la qualité hygiénique de ces
fruits.
83
TABLEAU 23:
FREQUENCE DES. LACTOBACILLUS DANS
LES FRUITS RECOLTES SUR L'ARBRE
Nombre
Pourcentage
d'échantillons
( % )
Absence de ~ennes
25/25
100
Présence de ~eœ~c:s
0/25
0
TOTAL
25
100
TABLEAJL.ll:
FREQUENCE DES LACTOBACILLUS ISOLES
DES FRUITS RECOLTES AU SOL
Nombre
Pourcentage
d'échantillons
( % )
-
Absence de genne,:;
24/25
96
Présence de ~ennes
1/25
4
TOTAL
25
100
-
TABLEAU 25:
FREQUENCE DES LEUCONOSTOCS DANS
LES FRUITS RECOLTES SUR L'ARBRE ET AU SOL
Nombre
Pourcentage
d'échantillons
( % )
"
Absence de g<..·.-meJ
50/50
100
---~
Présence de germ ~s
0/50
0
TOTAL
50
100
84
TABLEAU 26-
SYNTHESE DES RESULTATS
(Pourcentage d'échantillons contenant un nombre de
germes supérieur au critère d'acceptabilité hygiénique)
FRUITS SUR L'ARBRE
FRUITS AU
EN %
SOL EN %
Gennes Aérobies
mésophiles >300 000 g/g
0
0
GERMES PATHOGE~ES
1 - Colifonnes totaux
0
0
>1.000 g/g
2 - Colifonnes thennotolérants
0
16
>10 g/g
3 - Staphylococcus
0
32
au~eus >100 g/g
4 - Streptocoques du groupe 0
0
24
5 - Anaérobies sulfito-
réductrices> 30 g/g
0
0
6 - Salmonella
0
0
GERMES FERMENTAIRES
1 - Levures (présente)
84
88
· candida guilliennondü.
52,40
54,60
· candida humicola
19
27,20
· candida krusei
0
09,10
· kloeckera apis
28,60
09,10
2 - Moisissures
0
0
3 - Lactobacillus
0
4
4 - Leuconostocs
0
0
Les % des espèces indiquées de levures isolées des fruiLS obtenus consùtuent 100% des levures présentes
rrouvées.
85
A.IV -
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Au terme de cette contribution à l'étude de la microflore des fruits du
palmier rônier, réalisé à partir de 50 échantillons récoltés dans le "V
BAOULE" et portant sur deux lots de fruits, l'un récolté sur l'arbre et l'autre
ramassé au sol, nous pouvons faire les constatations suivantes :
1°) - La présence de germes d'origine fécale sur les fruits ramassés au
sol est un argumeilt pour ne pas réaliser une étude uniquement sur ce lot de
fruit.
2°) - Ces germes fécaux isolés : E. coli, Staphylococcus auréus et
Entérococcus réduisent la qualité microbiologique de 25 % des échantillons
ramassés au sol. Ils proviennent certainement de l'hygiène environnante
inexistante
3°) - les Levures constituent la flore dominante de la microflore du
rânier comme le confirme l'absence de moisissures, de Lactobacillus et de
Leuconostocs.
4°) - L'espÈce de Levure dominante est Candida guilliermondii
5°)_ La faible prévalence des autres espèces de Levures ne permet pas de
les inclure ou .;xclure de la microflore microbienne.
6°)_ La faiblesse de l'échantillonnage a pennis de mettre en évidence des
espèces de Levures qui pourraient faire partie de la flore.
Une étud~ exhaustive permettrait d'infirmer ou confinner leur véritable
place et préciser leur rôle.
7°) - Kloekera api\\; est une Levure pouvant faire partie de la microflore
des râniers analysés. Des travaux ultérieurs sur de plus grande série de fruits
permettraient de l' L41firmer ou de le confinner.
86
gO) _ la maturité et la forte teneur en sucres favorise la multiplication de
Candida
guilliermondii.
Mais, il est difficile' de dire lequel de C.
guilliennondii ou de K. apis est dominant au début de la maturation.
9°) - L'équipement enzymatique de .c..guilliermondii lui permettant une
meilleure utilisalÎon des sucres, expliquerait en partie sa prolifération.
Contrairement à K. apis qui est doté d'un équipement réduit.
10°) - Il convient de faire une étude cinétique pour suivre l'apparition
des Levures, selon les différentes étapes de maturation des fruits.
Toutes ces constatations montrent que les objectifs de notre étude ont été
atteints, cependant, au niveau des perspectives:
- La méthode de récolte doit être affinée et un tirage au hasard devrait
être fait dans chaque lot pour une amélioration de l'échantillonnage.
- une étud~ biochimique, et épidémiologique pour savoir le nombre de
sérotype de Candida présents selon les espèces, devrait être réalisée.
Enfin, Ca~1<!ida guiI:iermondii levure dominante de la microflore du
fruit du rônier,
isolé pour la première fois de cette source est dénommé
R.A.K. (Rônier AGBO KOUAME); pourrait être utilisé dans une étude de la
fennentation alcoolique du jus de rônier; objectif de la deuxième partie de
notre travail.
87
B.I - LA PRODUCTION D'ETHANOL A PARTIR DU
JUS DU FRUIT DE RONIER
INTRODUCTION
La recherche pour la production d'éthanol par fermentation, suite aux
différentes crises d'énergies, s'est intensifiée au cours des dernières décennies
dans les pays développés.
Des solutions ont été trouvées dans différents pays du monde pour
l'utilisation de substrats agricoles riches en glucides (manioc, maïs, c~e à
sucre, etc) et des technologies très avancées sont mises en oeuvre à ce propos.
En Afrique de l'ouest, malgré l'abondance de produits agricoles et les
quelques industries qui existent dans ce domaine, les techniques de production
d'éthanol ne sont pas encore bien adaptées et maîtrisées. Toutefois, en Côte
d'Ivoire, le jus d'ananas a particulièrement retenu l'attention des chercheurs
en raison de l'abondance de ce produit.
Environ 100 000 tonnes d'ananas frais sont exportés par an, et les
"déchets" de récoltes impropres à l'exportation sont estimés à 20 000 tonnes
par an de substrat non revalorisé ou revendu sur les marchés urbains.
La fermentation alcoolique du jus d'ananas a ainsi fait l'objet de
programmes de recherche (KOUAKOU et Coll, 1984, 1987). Compte tenu du
fait que le jus brut frais contient entre 6 et 16 % de sucres fermentescibles, ce
fruit constitue une bonne source de sucre et un substrat potentiel pour la
production d'éth,mol médicinal.
Cependant, toujours en Côte d'Ivoire, dans la région du " V Baoulé", il
existe un fruit beaucoup plus riche en sucres fermentescibles que l'ananas et
qui, chaque anné~ sur une période de 4 à 6 mois, se trouve en quantité
abondante dans les savanes ivoiriennes et qui, jusqu'à nos jours, n'est pas
revalorisé: c'est le fruit du palmier RONIER ou RONDIER (65 % en sucre,
BUSSON,1965).
88
Malgré son abondance en Côte d'Ivoire et en Afrique de l'Ouest et sa
forte teneur en glucides, aucun travail de recherche n'a encore été effectué
sur la bioconversion de ce substrat. En effet, du point de vue bibliographique,
outre les récents travaux du professeur AGBO (1992) sur le jus de ce fruit,
aucune autre infonnation scientifique dans ce sens n'a été retrouvée ici
comme ailleurs malgré les nombreuses fouilles
interbibliothèques
internationales.
C'est pourquoi, après avoir étudié la microflore de la pulpe de ce fruit,
nous avons décidé de réaliser une étude préliminaire de fermentation du jus
issu de cette pulpe. Ce, dans l'optique de l'utiliser, nous même, comme
matière première dans la production d'alcool médicinal et industriel qui est,
jusqu'à présent, un produit importé en Côte d'Ivoire, et faisant souvent défaut
dans nos secteurs de santé et secteurs industriels intéressés.
Ainsi, notre étude a essentiellement été portée sur :
- AI l'influence de la température et
- BI
l'influence de la concentration en sucre dans la fermentation
alcoolique du jus de rônier par onze souches de levures qui sont:
1
Saccharomyces cerevisiae CM!
2
Saccharomyces cerevisiae SAKE
3
Saccharomyces cerevisiae S'IV-89
4
Saccharomyces cerevisiae Y.978
5
Saccharomyces cerevisiae AWAMORI
6
Saccharomyces cerevisiae CBS 400
7
Saccharomyces cerevisiae KYOKAI-7
8
Saccharomyces cerevisiae LABBAT
9
Saccharomyces cerevisiae T J 1
10
Saccharomyces cerevisiae K-64-C
Il
Candida guilliermondii RAK 90
Une population mixte de micro-organismes issue du jus a également été
utilisée.
Le choix de certains de ces micro-organismes a été conditionné par des
études préliminaires sur le jus d'ananas (KOUAKOU et Coll, 1987) et de la
mélasse de la canne à sucre (AGBO, 1987)
89
B.II . MATERIEL ET METHODES
B.II.1 - MATERIEL
B.I1 1.1 • LE MATERIEL VEGETAL
B.I1.1.1-1 - Source du substrat
Les fruits murs récoltés au sol comme indiqué dans la première partie de
ce travail sont utilisés pour l'extraction du jus par hydrolyse enzymatique.
B.I1 1.1-2 -
L'extraction du jus par hydrolyse
enzymatique
Le jus extrait de la pulpe du fruit de Rônier Gus brut) constitue le milieu
de culture de n05 travaux. L'extraction de ce jus passe par diverses opérations
résumées dans la figure.?
a) . Lavage des fruits
les fruits murs collectés et triés, sont lavés pendan~ 5 minutes à
l'hypochlon:re dt:' sodium
dilué
pour diminuer la charge des micro-
organismes cl)ntaminants l'exocarpe puis, ils sont rincés à l'eau propre avant
épluchage.
b\\ Ep!uchage et dépulpage
Les fruits sont ensuite épluchés en enlevant l'exocarpe ou péricarpe. Le
mésocarpe ou pulpe con'itituant une masse fibreuse importante, est dépulpé
des noyaux ct (lécoupé : il est ensuite pilé dans un monier de laboratoire
avant de subir l'hydrolyse enzymatique.
90
FRUITS MURS DU RONIER
FHillRE 7 :
PROTOCOLE POUR L'EXTRACTIO:\\
DU JUS DE RONIER
91
c)
Préchauffage et Hydrolyse enzymatique de la pulpe
,
1
Cette hydrolyse est conduite avec de la Pectinase (pectinex ultra RSPL) ;
!
(NOVO FERMENT, 1986) enzyme douée de propriété hydro1ytique des
f
liaisons polygalacturoniques des fibres du mésocarpe.La pulpe pilée est mise
dans bol et ce dernier placé sur un bain chauffant pour une heure de temps
1
afm de pennettre un ramollissement préliminaire des fibres. L'ensemble est
l
ensuite laissé pour refroidissement à la température ambiante.
1t
L'hydrolyse est alors réalisée à cette température appropriée de l'enzyme
1
pendant
1
30 à 45 minutes. La concentration d'enzyme utilisée est de 0,1 ml, diluée dans
1
50 ml d'eau distillée pour 1 Kg de pulpe.
Pour un meilleur rendement, la pulpe est continuellement malaxée. Après
1
le temps de contact avec l'enzyme, la masse de pulpe initialement compacte,
devient très juteuse.
d)
Pressage
La masse hydrolysée est mise dans un filet de· 0,5 cm de diamètre de
mailles jouant le rôle de filtre.
t
A l'aide d'une presse mécanique manuelle souvent utilisée dans la
î1
fabrication de l'attiéké, le jus brut est extrait et recueillis dans des fioles
1
tandis que les fibres sont retenues par le filet.
1
B.I1 1.1-3 • Le substrat des fermentations
f
1t
Le milieu de culture utilisé pour les différents essais de fermentation est
!
essentiellement composé de jus brut extrait de la pulpe du fruit de rônier.
Le jus brut est d'abord stérilisé par la chaleur hwnide à 120 0 C, à une
pression de 120 nanomètres pendant 20 minutes grâce à un autoclave vertical
de type "LEQUEUX".
92
Le taux de sucre du jus est ensuite dosé par la méthode de DUBOIS ou
. méthode au phénol-sulfurique (1965).
Trois lots de jus dont les teneurs en sucre sont fixées à 1()() g/l ; 150 g/l et
200 g/l
ont constitué les substrats de base de nos essais de fermentation.
A ces jus, on ajoute des inoculums (préparation 1/10) de souches de
levures présélectionnées à utiliser dans nos essais.
B.I1 1.2 • LE MATERIEL MICROBIOLOGIQUE
B.I1 1.2·1 . Les souches de levures
Au total, Il différentes souches levuriennes et une population
mixte de micro-organismes obtenue de la pulpe du rônier ont été utilisées
pour nos essaIS.
En effet, nous avons ajouté aux 4 souches présélectionnées et testées sur
le jus d'ananas (KOUAKOU et Coll. 1987), 6 autres souches de levures
testées auparavant sur la mélasse de canne à sucre et la souche isolée de "la
pulpe du Rônier (Candida guililennondii).
Nous avons également réalisé des essais avec une population mixte
constituée de micro-organismes naturels de la pulpe du fruit et présents en
grande quantité dans le jus extrait du fruit de Rônier.
Les souches sont repiquées aseptiquement sur un milieu glucosé-gélosé
dont la composition est consignée en annexe 2 ; le milieu est coulé en pente en
tube à vis.
Après inoculation des souches pures de levures présélectionnées, les
milieux de culture, répartis en tube, sont incubés à l'étuve à 30 0 C pendant
48 h pour une rr,eilleure multiplication ou croissance des germes.
93
Ces gennes sont ensuite utilisés pour la préparation des inoculums où ils
sont conservées en chambre froide à-5 0 C en attendant une préparation
ultérieure d'inoculums de fermentation.
La liste des souches utilisées est présentée dans le tableau 27 indiquant
leur désignation, leur nom de genre et d'espèce puis leur source. Ce sont
principalement des Saccharomyces cerevisiae d'origine diverse : Amérique,
Japon, France, Mali.
Ces souches sont issues le plus souvent de matière végétale ; elles
subissent ensuite plusieurs modulations génétiques qui fournissent des mutants
plus performants et dotés de spécificités qui leur sont propres.
A titre d'exemple, la souche Saké initialement isolée du riz a fourni les
souches suivantes :
- Kyokaï-7 - sensible à la chaleur
- K64-C - tolérante à l'alcool
-Tn -résistante à la température.
B.I1 1.2-2 - L'Inoculum
L'inoculwn est préparé en propageant une anse bouclée stérile remplie de
Levure présélectionnée, dans 10 ml de jus de rônier stérilisé contenu dans des
tubes à essais.
Les tubes sont ensuite placés dans des bains-marie thermostatés agités va
et vient pour 15 à 24 heures.
Ce temps correspond
à la phase exponentielle de la croissance
Levurienne, ayec la capacité maximale de production d'éthanol (MONOD,
1942).
94
TABLEAU 27
Liste des souches présélectionnées et testées
DESIGNATION
GENRES ET ESPECES
SOURCE
1
CMI
Saccharomyces cerevisiae
ON MALI
2
SAKE
Saccharomyces cerevisiae SAKE
INSAT
3
STV-89
Saccharomyces cerevisiae
INSAT
4
Y.978
Saccharomyces cerevisiae
NRRL
5
AWAMORI
Saccharomyces cerevisiae
6
CBS400
"
7
KYOKAI-7
"
ICBIOTECH
JAPON
8
LABBAT
"
9
T JI
"
..
10
K-64-C
11
RAK90
Candida guilliermondii
lPCI-FAST
Population mixte de micro-
FAST =Faculté des
12
fenn. Nat.
orgamsmes
Sciences et
Techniques
- CBS =Central Bureau Voor Schinmdel Culture
- INSAT = Institut National des sciences appliquées de Toulouse
- lPCI =Institut Pasteur de Côte d'Ivoire
- FAST = Fact:lté des Sciences et Techniques
- ON MAU : Office Niger Mali
- NRRL = Nœ1.hern Regional Research Laboratory USA
95
Le levain est ainsi cultivé sur jus de rônier stérilisé et de teneur en sucre
déterminée ; son volume est équivalent à 10
% du volume de
fennentation, et sa
charge correspond à environ 3 à 20. 107 cellules par millilitre après 15 à
24 heures. La numération des Levures au départ de la fermentation, est
réalisée au microscope à l'aide d'une cellule de Mallasez.
B.I1 1.3 • LE MATERIEL DE FER~IENTATION
Les essais de fermentation sont réalisés en utilisant des systèmes
d'erlenmeyers placés dans des bains-marie agités va et vient.
Un système est composé:
- d'un erlenmeyer de 250 ml de volume utile
- d'un bouchon de fenneture en caoutchouc doté d'une voie de sortie
- et d'un tube en "5", en pyrex inséré dans la voie de sortie et doté de
trois renflements (Photo 10). (système développé par le Centre International
de Biotechnologie, le ;Biotech Université d'OSAKA, Japon).
Chaque système contient alors 90 ml de milieu de culture stérile (substrat
de fermentation), d'une concentration en sucre déterminée et 10 ml
d'inoculum de souche de levure présélectionnée.
Les renflements du tube en "5", voie de sortie pour le gaz carbonique
(COz) produit au cours de la fennentation, sont remplis de 5 ml d'acide
sulfurique concentré pour créer les conditions d'anaérobiose.
Ces systèmes sont placés dans des bains-marie agités et thermostatés aux
différentes températures retenues pour les essais (30° e, 35° C et 37° C).
Ces essais de fennentation sont réalisés en duplicata, pendant 4 jours soit
une durée de 96 heures. Trois séries d'essais sont effectuées afin d'obtenir des
résultats plus fiables.
3SrIIJ./1 NOIJ.V1N'3WH.';f.1 3a '3H''31S,{S
: Of oJolfd
97
B.112 - ~ETHODES ANALYTIQUES
Les analyses sont essentiellement dirigées sur:
- le potentiel d'hydrogène (pH),
- la concentration de sucres totaux,
- la concentration d'alcool produit.
Ces dosages penneUent ensuite la détermination:
- du rendement et
- de la productivité de chaque souche testée.
Tous les dosages sont réalisés en duplicata par les méthodes usuelles et
avec un matériel approprié.
B.II 2.1 - LE POTENTIEL HYDROGENE (pH)
il pennet de caractériser le degré d'acidité ou d'alcalinité du substrat:
n est donc mesuré au début et à la fm de chaque période de fennentation
à l'aide d'un Pragision - pH mètre de type E 510.
B.II 2.2 • DETERMINATION DE LA CON~Er TTRATION DE
SUCRES TOTAUX
B.I1 2.2.-1 • Principe
Le dosage des sucres totaux est réalisé par la méthode de DUBOIS, ou
méthode au phénol-sulfurique 1965
Son principe est qu'en présence du phénol et d'acide sulfurique
concentré, les sucres fonnent des composés phénoliques complexes de
coloration jaune dont l'intensité est proportionnelle à la concentration des
sucres totaux présents dans le milieu.
Le dosage est réalisé par spectrophotométrie et la détermination
lquantitative se fait à partir d'une courbe d'étalonnage ou standard.
99
B.11.2.3 - LA PRODUCTION D'ETHANOL
La fennentation alcoolique est un processus anaérobie qui aboutit à une
dégradation partielle des glucides fermentescibles (substrat de fermentation).
En fin de chaîne, on obtient:
- du gaz cartonique qui est dégagé
- de l'alcool éthylique
- et de l'èl~er:;ie utilisée par la levure.
Selon TABERA, (1 C BIOTECH, Japon) il existe une relation étroite
entre la variation de poids du substrat de fennentation liée au dégagement de
gaz carbonique ~t la quantité d'éthanol produite au cours d'une fennentation.
TABERA (1 C BIOTECH, Japon) a pu établir une fonnule pennettant
ainsi de détennir.er la quantité produite d'éthanol par 100 ml de substrat de
fennentation :
ro_----------------------------.......
QUANTITE D'ETHANOL PRODUIT =
Variation de poids du système de fennentation
a rès cha ue tem s fixé x 1,045
Le facteur
1,045 est le rapport entre la quantité produite d'éthanol et
celle de gaz carbonique obtenue.
Nous effl~cLuons au début des expériences, grâce à une balance de
précision, la ptsée des systèmes de fermentations. Ces systèmes contiennent
100 ml de jus de rânier et d'inoculum à une concentration donnée et ils sont
placés au bain-marie thermostaté aux températures retenues. A chaque 24
heures, les systènles de femlentatioll sont pesés puis remis au bain-marie:
ceci est répét~ plusieurs fois jusqu'à.
l'observation d'une valeur constante des pesées du système
Nous ca1cuk1ns alors les différences de poids des systèmes toutes les 24
heures. A partir rie ces différences de poids et de la fomlule proposée , les
quantités produit~5 d'éthanol au cours des fermentations sont déterminées.
100
Les procbctions d'éthanol par les différentes souches' utilisées dans des
concentrations et ades températures différentes retenues sont déterminées en
fonction du temps qui est fixé à 96 heures.
B.I1 2.4 - CA LCUL DES RENDEMENTS, ET DES
PRODUCTIVITES
La formation d'éthanol à partir du glucose est décrite par l'équation de
Guy Lussac:
CE- H 11-06 --------------- 2 C2HSOH + 2 C02 - 40 Kcal
1 mole
-------------------2 moles
+ 2 moles
180 g-----------------------92 g
+ 88 g
soit 1 g---------------------0,51 g
+
0,49 g
ou 51 %
+ 49 %.
Pour 1()() % ~ie rendement théorique, 1 gramme de glucose produit 0,51
g d'éthanol et 0,+9 g de gaz carbonique. Ce rendement théorique (100 % ),
compte tenu d~s pertes en sucres par transformation en sous-produits
(glycérol) et en biomasse, ne peut être atteint. Les rendements effectivement
observés ne repésentent que 90 à 95 % de la valeur théorique.
Pour les calculs des rendements pratiques. nous nous sommes limités
alors à une valeur de 90 % du rendement théorique pour le fait d'une part,
que les conditions de milieu jouent un rôle extrêmement important sur les
rendements (,l)servés et d'autre part, que les milieux utilisés par la majeure
partie de nos eS'lais ~oient relativement pauvres (sans rajouts d'éléments
nutritifs).
Les calculs (t rendements tiennent compte :
a)
dèS taux de ,ucre consommé et
b)
des ci)Occr.tr:.ttions d'éthanol produit.
101
Les tennes utilisés dans les tableaux de résultats sont défmis comme suit:
• So = concentration initiale en sucres totaux dans le substrat en gramme
par litre (g/l)
• Sr = concentration résiduelle de sucres totaux en g/l après une période
de fennentation de 96 heures.
• S = SO • Sr =concentration de sucre consommé ou converti en alcool
en g/l.
• Production observé = concentration d'éthanol produit en g/l à partir
de la formule de T ABERA = variation du poids du système
de fermentation
x 1,04
• Production théorique = concentration théorique d'alcool à obtenir ou
concentration limite théorique d'éthanol à être produite en g/l
= S x ( 0 , 5 1 1 ) · ..
• Production pratique = concentration limite pratique d'éthanol produit
en g/l
S x (0,511 x 90 %)
=
S x 0,460.
~:
• Ro =rendement observé en pourcentage = P. observée
xl00
S
• RLt =rendement obtenu par rapport au rendement limite théorique
en
pourcentage..
RLt = P. observée
xlOO
P. théoriq ue
102
• RLp = ren~lemçnt obtenu par rapport au rendement limite pratique en
pourn:ntage.
RLP =
P. 0 bservée xlOO
P. pratique
PrQductivit~ (Pr)
• Pr = productivité exprimée en g/l/heure
P··. -
P. observée
T = 96 heures
T
Pourcenjal:e du sucre consommé (Zl
• Z = S
x 100
So
1
' "
t
f
1
103
1
\\
!
B.III -RESULTATS ET DISCUSSIONS
l!\\
B.III. 1 - VARIATIONS DU POTENTIEL
1
HYDROGENE (pH)
Les variations de pH au cours des fermentations conduites à différentes
1
1
concentrations en sucre, et températures, avec des souches retenues pour nos
essais sont consignées dans les tableaux 28, 29 et 30.
...
1
1
B.III. 1.1. • AVEC UNE CONCENTRATION INITIALE EN
1
SUCRES TOT AUX EGALE A 100 g/l
\\t
Les résultats présentés dans le tableau 28, montrent que les pH initiaux se
situent entre 3,6 et 4,1 tandis que les pH finals entre 3,2 et 4,0.
1
Aux trois températures retenues les variations du pH (pHf-pHi)
comprises entre - 0,6
et + 0,1 unité, restent très faibles. Ainsi, nous pouvons indiquer que le pH tend
à se maintenir pendant la femlentation bien que non régulé.
B.III 1.2 • AVEC UNE CONCENTRATION INITIALE EN
SUCRES TOTAUX EGALE A 150 g/I
A cette concentration (150 g/l), les pH initiaux mesurés se situent entre
3,4 et 3,9 ; alors que k~ pH finals sont entre 2,8 et 3,8 (tableau 29).
Les variations de pH sont comprises entre -0,7 et 0,0 unité; elles restent
également très faibles aux trois températures retenues.
Ces résultats som similaires à ceux obtenus avec le substrat de
concentration en sucre de 1()() g/1.
TABLEAU
28 : EVOLUTION DU PH AU COURS DE LA FERMENTATION
AVEC UNE CONCENTRATION INITIALE DE SUCRE DE 100 g/l
Ir
1
1
"- -"--:':-~':'::':-.'- --_.-
~
-
.1
30° C
35° C
3'r C
SOUCHES UTILISEES
Varia-
Varia-
Varia-
PHi
PHf
tion
1
PHi
PHf
tion
PHi
PHf
tion
PHf-PHi
PHf-PHi
PH
AWAMORI
4,1
4
-0,1
1
3,8
3,6
-0,2
3,9
3,6
-0,3
CBS 400
3,9
3,7
-0,2
1
3,9
3,7
-0,2
4,1
3,8
-0,3
CMI
3,9
3,7
-0,2
1 3,8
3,6
-0,2
4, 1
4,0
-0,1
K 64 C
3,9
3,8
-0,1
3,9
3,7
-0,2
3,9
3,7
-0,2
"'::t
o
KYOKAI -
7
3,8
3,6
-0,2
3,6
1 3,2
-0,4
3,8
3,6
-0,2
LABBAT
3,8
3,6
-0,2
3,7
1 3,4
-0,3
4,1
3,5
-0,6
SAKE
3,9
3,8
-0,1
3,8
1
3,6
-0,2
3,9
3,6
-0,3
STV 89
3,8
3,6
-0,2
3,9
1
3,6
-0,3
3,9
3,7
-0,2
1
TJ1
3,8
3,6
-0,2
3,8
3,5
-0,3
4, 1
3,9
-0,2
y
978
3,9
3,7
-0,2
3,9
3,6
-0,3
3,9
3,7
-0,2
RAK 90
4,1
3,9
-0,2
3,6
3,2
-0,4
3,8
3,2
-0,6
FERMENTAT.
NATURELLE
3,8
3,5
-0,3
3,7
3,5
-0,2
3,9
4,0
+0,1
TABLEAU 29 : EVOLUTION DU PH AU COURS DE LA FERMENTATION
AVEC UNE CONCENTRATION INITIALE DE SUCRE DE 150 g/l
-
-
-~
- -
. - , -
-
'-"::"=="'::" •.
~:_-_:~-
._.
30° C
30° C
37°C
--
..
- - - ~
. _ - - - ~
_._~-
SOUCHES UTILISEES
Varia-
Varia-
Varia-
PHi
PHf
tian
PHi
PHf
tian
PHi
PHf
tian
PHf-PHi
PHi-PHi
PH
--
AWAMORI
3,9
3,7
-0,2
3,8
3,6
-0,2
3,8
3,5
-0,3
- - -
cas 400
3,9
3,4
-0,5
3,8
3,2
-0,6
3,8
J, (1
-0,2
-- - - - - ,..
-
1··-----
CMI
3,8
3,4
-0,4
3,4
2,9
-0,5
3,6
J, :1
-0,1
1
---_....-
-.
K 64 C
3,8
3,6
-0,2
3,8
3,6
-0,2
3,7
3,5
-0,3
-- .
Ir.
o
KYOKAI - 7
3,8
3,3
-0,5
3,5
2,9
-0,6
3,6
3,4
-0,2
LABBAT
3,8
3,5
-0,3
3,4
2,8
-0,6
3,9
3,5
-0,4
SAKE
3,9
3,7
-0,2
3,8
3,6
-0,2
3,7
3,4
-0,3
STV 89
3,7
3,2
-0,4
3,8
3,4
-0,4
3,7
3,6
-0,1
. -
--
~--
- ~ ---
. '
-.-.
-,
TJI
1,7
1,4
-0,1
1,7
1
(l. ·1
l, '.
I I
li,
1
- '_."- --- _.-
- - - - ---
---_.-._--_._- -- --_._- _.- --
- - - _ . ~ -
---.--
- - - -
y
978
3,8
3,4
-0,4
3,8
3,4
-0,4
3,8
3,6
-0,2
RAK 90
3,8
3,4
-0,4
3,4
2,8
-0,6
3,9
3,2
-0,7
FERMENTAT. NATURELLE
3,6
3,1
-0,5
3,4
3,1
-0,3
3,8
3,8
0,0
106
B.I1I. 1.3 - AVEC UNE CONCENTRATION
INITIALE EN
SUCRES TOTAUX EGALE A 200 g/l
Pour toutes les souches testées et les températures retenues, les pH
mesurés au début et à la fin des essais, ainsi que les variations du pH sont
présentés dans le
tableau 30.
Les résultats obtenus montrent que les pH initiaux se situent entre 3,4 et
3,9 ; tandis que les pH finals entre 2,8 et 3,8.
Les variations du pH restent dans tous les cas très faibles. En effet, elles
sont comprises entre ·0,6 et -0,1 unité; soit donc supérieures ou égales à - 0,6
unité.
A 30°C, 35°C et 37°C, ces variations sont en moyenne, pour toutes les
souches, respectivement équivalentes à -0,4 ; - 0,3 ; et - 0,2 unité.
Dans ce cas-ci, une diminution des variations est observée lorsque la
température de fermentation s'élève.Ceci indique qu'il y a moins d'effets de
variation de pH lorsque la température augmente dans la fermentation
alcoolique à partir du jus de rânier
En général, l'analyse des différents résultats montre que tous les pH
initiaux du jus de rânier sont acides et sont compris entre 3,4 et 4,1. Quelle
que soit la concentration en sucre et la température, les variations du pH au
cours de la fermentation restent très faibles (supérieure ou égale à - 0,7 unité).
Ces résultats sont en accord avec ceux des travaux de KOUAKOU et
Coll (987) sur la fermentation alcoolique du jus d'Ananas. En effet, ces
auteurs ont montré que les variations du pH restaient également très faibles et
supérieure à - 0,4 unité.
Ces éléments nous permettent de dire que le pH naturel du jus du rânier,
compris entre 3,4 et 4,1 et proche de celui du jus d'ananas (pH;: 3,5), peut
être jugé propice pour une bonne fermentation alcoolique avec les souches de
TABLEAU
30: EVOLUTION DU PH AU COURS DE LA FERMENTATION
AVEC UNE CONC'ENTRATION INITIALE DE SUCRE DE 200 g/l
li
i
1
1
--- --:-
.- _.
1
30° C
30° C
37 () C
SOUCHES UTILISEES
Varia-
Varia-
Varia-
PHi
PHf
tion
PHi
PHf
tion
PHi
PHf
tion
PHf-PHi
PHf-PHi
PH
AWAMORI
3,8
3,5
-0,3
3,8
3,6
-0,2
3,7
3,4
-0,3
CBS 400
3,8
3,4
-0,4
3,4
3,0
-0,4
3,7
3,5
1
CM!
3,6
3,3
-0,3
3,4
3,0
-0,4
3,8
K 64 C
3,8
3,4
-0,4
3,6
3,3
-0,3
3,9
] , 8
1
KYOKAI - 7
3,8
3,3
-0,5
3,4
2,8
-0,6
3,7
3,3
-0,4
r--
LABBAT
3,6
3,2
-0,4
3,5
3,2
-0,3
3,9
3,~
-0,4
o
SAKE
3,6
3,2
-0,4
3,7
3,4
-0,3
3,9
3,6
-0,3
1
STV 89
3,8
3,4
-0,4
3,8
3,6
-0,2
3,7
3 r)
, ,
-0,2
"
1
1
1
1
1
1
1
1 · - .._. ~ -_.
Il
TJI
3,8
3,4
-0,4
3,5
3,2
-0,1
:1,'1
'1 • t1
- o. :1
1
1
y
978
3,8
3,4
-0,4
3,7
3,4
-0,3
3,7
1
RAK 90
3,8
3,4
-0,4
3,4
3,0
-0,4
3,6
FERMENTAT.
NATURELLE
3,8
3,2-
-0,6
3,9
3,3
-0,6
3,7
3,5
1
-0,2
,
r
, .~, '-
1 l, l ,
t
levures. preselectioI:::r:"t'5 i de ditTerentes tempéat~res et concentrations en
1
!
sucre.
De plus, les travaux de \\IATTMf ARA et Coll (1982) ont montré que les
!
variations du pH dans l"intervalle 3.5 à. 6 n"affectent pas le rendement de
production d'éthanol.
1
En outre. OGL:\\YE et COLL (19;8) om uouvé que la concentraIion en
!
alcool produit et la vitesse de production d'alcool à partir du jus d'ananas sont
toujours élevées aux pH acides.
1
1
.
[
BALLERINI et BLA.1\\ICHET (198;) ont indiqué que le maintien de
1
,
l'acidité du substrat pourrait constituer un rôle important dans la protection
contre les contaminants bactériens lors d'une bonne fermentation.
Le pH du jus de rônier, bien que non régulé est donc favorable au
développement des souches de levures utilisées. Ce jugement doit être
considéré sous réserve d'une adaptation effective au substrat par ces souches.
B.III. 2 - CONSOMMATION DE SUBSTRAT
B.III.2.1 - AVEC UNE CONCENTRATION INITIALE EN
SUCRES TOTAUX ÉGALE A 100 gII
B. II 1.2.1-1 - Température de fermentation: 30n C
Les résultab c0:::-.igni:5 dans le tableau 31 montrent que la concentration
de :mcre consommé f',3! ië>:.;; souches testéès vaile èntie 52 et 76 g/l. soit lin
r:,')urcenlage àe .5 2 a -.:. d,.:' "ucre consommé.
109
Tous ces (;jéments mettent en évidence qu'à cette concentration et
température, les levures testées consomment assez bien le substrat.
Cependant, le taux de sucre résiduel reste élevé (entre 26 et 48 g/l) ce
qui indique que l'épuisement en sucre du substrat n'est jamais complet.
B.III.2.1-2 - Température de fermentation : 35°C
A 35°C, les variations de la concentration de sucre consommé se situent
entre 40 et 69 g/J. soit un pourcentage de 40 à 69% du sucre consommé
(tableau 32).
Nous pouvons noter que 10 souches testées consomment plus de 50% du
substrat. Les cons~)mmations les plus remarquables sont: Awamori; K64-C,
Saké, RAK90. Le taux de sucre résiduel compris entre 31 à 60 g/l reste
toujours élevé.
B.II1.2.1-3 - Température de fermentation : 37°C
Lorsque la fennentation est conduite à 37°C, la concentration de sucre
consommée va!"i'~ entre 46 et 74 g/l. soit un pourcentage de 46 à 74% de sucre
consommé (tableau 33).
Les résultats obtenus pennettent la mise en évidence de 9 souches testées
dont la cons.:)mmation du substrat s'élève à plus de 50%. Nous pouvons
également noter qu~ les souches Awamori, K64-C. RAK90 consomment plus
de 70% du substrdi, tandis que les souches Kyokaï-7, STV89 en consqmment
moins de 50l7c.
Nous constuons qu'à cette température et cette concentration. certaines
souches consomment assez bien le substrat initial. Mais, comme dans les essais
précédents. le taux de sune résiduel compris entre 26 et 54 demeure élevé.
En générai, les résuLats obtenus montrent que la consommation de sucre
à cette concentrati, ,11 ( 100 glU varie entre 40 et 80 gll. soit 40 à 80% du
substrat aux trois t~l11pératures retenues.
TABLEAU 32 : EVALUATION DES PERFORMANCES
DES. SOUCHES DANS L'UTILISATION DU SUCRE A 35°C Avec SA = 100 9/1 APRES 96 H
SOUCHES
Sa
Sr
S
Z
P Ob-
P Lim.
Ra
RLP
P Limite
RLT
Pr
g/l
g/l
g/l
%
servé
Pratique
%
en %
Theorique
%
g/l/h
UTILISEES
g/1
g/l
9/1
AWAMORI
100
31
69
69
10,20
31,74
14,78 32,13
35,19
29
0,106
CES 400
100
36
64
64
8,10
29,44
12,65 27,51
32,64
24,81
0,084
CMI
100
37
63
63
8,60
28,98
13,65 29,67
32,13
26,76
0,089
K 64 C
100
34
66
66
7,20
30,36
10,90 23,71
33,60
21,42
0,075
-_
_ _ _ _ o .
_ _ _
._ ....
" .
... -- -- -_.- --_ ..
- . , ' - , - -
KYOKAI-7
100
40
60
60
11,40
27,60
19
41, JO
JO,uO
3'/ ,25
0,118
LAEBAT
100
55
45
45
10,20
25,30
18,54 40,31
28,05
36,36
0,106
SAKE
100
34
66
66
7,30
30,36
11,06 24,04
33,60
21,72
0,076
STV 89
100
50
50
50
15,20
23
30,40 66,08
25,30
60,07
0,158
TJ1
100
57
43
43
9,21
19,78
21,41 46,56
21,93
41,99
0,096
y 978
100
35
65
65
14,10
29,90
21,70 47,15
33,15
42,53
0, ) 116
--
------. -._----_. --
------ .
~
-
- - . ---.- -~._-."--_.-
HI\\K 90
100
34
66
66
12,10
30,36
18,33 39,85
33,66
35,94
0,126
FERM.
NATURELLE 100
60
40
40
8,30
18,40
20,75 45,10
20,40
40,68
0,086
_
. . . _ - " •••. -
•
' 4 U . . . .
~
Il
•
Su - cc. ioiliale co sucrcs totaux
te 0 " r en t.l c Iii C III U II :-..: 1 .. •
.
Sr - cc. résiducllc CD sucres totaux
P r - p r cd 1: ct 1Yi! ~'
S
- cc. de sucrc conso. . .é
1.
- 7. de suc.-,' CUll~'Hll.ll'
l' obsené - cc. d'éthaool produi
Pli • . lhéoriquc - cc. li • . théoriquc d'éthaoul p'VdUll
.. Ii • . pratiquc - cc. lim. pratiquc d'étbaool produll
Ill." - rcndcmcut obtcou par rapport au rcode.,'ul Il.lh· pl dl "I '11'
UI T
_.
F
.4 .. __
__ ••
_ ••
.__
__ a ..
.~._".
a
TABLEAU 33 : EVALUATION DES PERFORMANCES
DES ·SOUCHES DANS L'UTILISATION DU SUCRE A 37°c Avec SA = 100 g/l APRES 96 H
SOUCHES
So
Sr
S
Z
P Ob-
P Lim.
Ro
RLP
P Limite
RLT
Pr
g/l
g/1
g/1
%
servé
Pratique
%
en %
Theorique
%
g/l/h
UTILISEES
g/1
g/1
g/1
AWAMORI
100
28
72
72
17,05
33,12
23,68 51,47
36,72
46,43
0,177
CBS 400
100
44
56
56
12,40
25,76
22,14 48,14
28,56
43,41
0,129
CMI
100
46
54
54
8,93
24,84
16,53 35,95
27,54
32,42
0,093
K 64 C
100
26
74
74
6,90
31,74
9,32 21,73
35,19
19,60
0,071
KYOKAI-7
100
54
46
46
13,60
21,16
29,56 64,27
23,46
57,97
0,141
("1
c-,
LABBAT
100
54
46
46
12,53
21,16
27,17 59,21
7.3.4()
53,41
0.130
_
-
.._------_.--- . _..
.._-
~--------
SAKE
100
40
60
60
6,9
27,60
Il,50 25
30,60
22,54
0,071
STV 89
100
53
47
47
18,60
21,6~
39,57 86,03
23,97
77,59
0,193
TJ1
100
35
65
65
10,20
29,90
15,69 34,11
33,15
30,76
0,106
Y 978
100
32
68
68
15,40
31,28
22,64 49,23
34,68
'1'1,40
0,160
.
r ' _ '
... _ _. ' _ _ ' ___
_
---_._._
-
..._-...•-_ ..
-
-"-- "_
.. - _..
_._---~--,
-~._~.~-----
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' - _ _ 0 "
..._--
-'
.-
.. _-
~---
... _-"._... _---'--_.-
-
, "
~-
HAK. 90
100
27
73
73
22,20
33,58
30,41 66,11
37,23
59,62
0,231
..
------
_ . ~ - -
FERM.
NATURELLE 100
48
52
52
3,7
23,92
7,11 15,46
26,52
13,9~
0,038
.._- -_.--
..
, - , - ,
~-
. So - cc. initiale en sucres totau)[
. ~û ' n:üi2i:m~iit v~~{:.·.-.-'
--',
. Sr - cc. résiduelle en sucres totau)[
JI,. - produclivlll'
S
- cc. de sucrc consom.é
. l
- % dr lOU(;,." .v •. :;,.... ;; ..
JI obseryc - cc. d'cthanol produl
l' li • . lhéoriquc - cc. li • . théoriquc d"éthanol pl"odUil
l' li •. pratique - cc. Ii •. pratiquc d"éthanol p,'oduil
ILl' - rcnde.cnl obtcnu !!~!""r:~!!.J.!.~!"t,~!J rcndcIGcnl liiùÎti: iii;;'''j';'
i11
1
l l 3
1
i1
!
1
1
Nous notons une vanatIon notable en fO:1ction des souches et une légère
1
variation en fonction de la température.
1
Les valeurs l~s plus faibles sont obtenues à 35° C (tableau 32) tandis que
les plus fortes consommations sont à 30° C et à 37° C (tableau 31 et 33).
Cette assez fClte consommation du substrat pourrait s'expliquer par la levée
i
des inhibitions d les aux effets de la concentration initiale en sucre et de
l'éthanol produit.
1
Les meilleures souches sont: TIl (30°C), AWAMüRI (37°C ), K64-C
(37°C), RAK90 (37° C), SAKE (35°C)et Y978 (37°C). Le changement de
comportement des souches, SAKE et A\\VAMüRI à cette concentration
confirmerait la levée de l'inhibition due à la concentration initiale de sucre
dans le substrat.
Cependant, ie sucre résiduel reste à un taux élevé
à toutes les
températures; ce rfsultat nous permet d'évoquer l'existence d'autres facteurs
inhibiteurs.
B.III.2.2 • A. VEC UNE CONCENTRATION INITIALE EN
SUCRES TOTAUX EGALE A 150 g/l
B.III.2.2-1 - Température de fermentation ~ 30° C
Lorsque h. fermentation est conduite à 30° C pour une concentration
initiale de 150 g/l . la concentration de sucre consommé par les levures testées
tik
varie entre 63 ;~t 108 g/l; soit un pourcentage de 42 à 72% de sucre co~sommé
(tableau nC 34 J. Les résultats obtenus montrent que 8 souches consomment plus
1
de 50% du sL'~straI avec particulièrement les souches CBS400 et RAK90 qui
vont jusqu'à ~/ ~/7c (~e substrat. Seules les souches : K64-C, Saké, STV-89 et
CM 1, ont une <':o[1.~ommation du substrat inférieure à 50%. Nous pouvons donc
\\
dire qu'à 30::C. les levures testées consomm~nt assez bien le sucre lorsque sa
!
concentration ;!I:ti .!e eSI de 150 g/l.
Malgr~ tOlll. la tcneur cn sucre résiù~;:l est cumprise entre 42 et 82 g/l
t
demeurant ainsi tJujours très élevée.
114
B.III.2.2-2 • Température de fermentation : 35°C
A 35°C. la concentration de sucre consommé par les souches varie de 58
à 90 g/l. soit un pourcentage de sucre consommé de 38 à 60% (tableau 35 ).
Bien que 9 souches consomment plus de 50% du substrat. avec
particulièrement
y 978 qui monte à 60%, nous pouvons noter que la consommation moyenne
de ce substrat n'est pas très importante.
Les souches qui consomment le moins de sucre sont: CMI. CBS400 et la
population mixte de micro-organismes. Encore. la teneur en sucre résiduel
reste toujours très élevée entre 60 et 92 g/l.
8.111.2.2·3 . Température de fermentation : 37°C
Lorsque la fermentation est conduite à 37° C, nous obtenons une
concentration de sucre consommé qui varie entre 74 et 102 g~, soit un
pourcentage de 43 à 68% de sucre consommé (tableau 36).
Les résultats montrent qu'à part la souche CMI. toutes les souches testées
et la population mixte de micro-organismes consomment plus de 50% du
substrat.
Nous pouvons donc dire que, comme à 30° C, les levures testées à 37° C
consomment assez bien le sucre lorsque sa concentration initiale est de 150 g/l.
' .
Nous notons particulièrement que les souches RAK90 et Kyokaï-7
consomment environ 70% du substrat initial. Comme à 30° C et à 35° C. la
teneur en sucre résiduel, reste toujours très élevée (48 à 96 g/I).
Les résultats obtenus à cette concentration mettent en évidence une
variation notable de la consommation du substrat
selon les souches et une
légère variation selon la température de fermentation.
:"'~'t.~~
..,
;<
- _
TABLEAU 34 : EVALUATION DES PERFORMANCES
DES. SOUCHES DANS L'UTILISATION DU SUCRE A 30°C Avec Sa = 150 9/1 APRES 96 H
SOUCHES
So
Sr
S
Z
P Ob-
P Lim.
Ro
RLP
P Limite
RL1'
Pr
g/1
g/1
g/1
%
servé
Pratique
%
en %
Theorique
%
g/1/h
UTILISEES
g/l
g/l
g/1
AWAMORI
150
70
80 53
8,70
36,80
10,87 23,70
40,80
41,63
0,090
CSS 400
150
42
108 72
12,72
49,68
Il,75 25,56
65,40
21,30
0,132
CMI
150
72
68 45
II,70
31,28
17,20 37,40
55,08
23,05
0,121
K 64 C
150
87
63 42
8,12
28,96
12,88 28,03
34,68
33,73
0,084
KYOKAI-7
150
60
90 60
23,60
41,40
26,22 57,00
32,13
25,27
0,245
LABBAT
150
70
80 53
10,40
36,80
13
28,26
45,90
51,41
0,108
Ir)
-
SAKS
150
82
68 45
10,16
31,28
14,91 32,48
40,80
25,49
0,105
STV 89
150
85
65 43
16,90
29,90
26
56,52
34,68
29,29
0,176
TJ1
150
62
88 58
14,20
40,48
16,13 35,07
33,15
50,98
0,147
Y 978
150
64
86 57
20,80
39,56
24,18 52,57
44,88
31,63
0,216
-
-"-'--- ------~..
RAK 90
150
45
105 70
20,50
48,30
19,52 42,40
43,86
38,31
0,213
Ferm. naturelle 150
62
88 58
12,60
40,48
14,31 31,12
44,88
28,07
0,131
.......
· s
. . . •
R
d
1 "
1
•
0 -
cc. IDl1la e CD sucres totaux
.
u - feu CIùCU
U U h l ; l ' \\:
1
. Sr - cc. résiduelle eD sucres totaux
.... - p .. oduC:livitr
!
- S
- cc. de sucre cODsommé
. Z
- : de sut.', c '.Ull~UU""I.
P abser"é - cc, d'élbanal pradui
, P lim. théorique - cc. lim. théorique d'éthanul p.u-.lull
Pli • . pralique - cc. Ii •. pralique d'étbaoal produ.t
, RLP - rcademcal OblcDU pa.. r~~_o:O.._~'y._,(eadc.cJ1.L.hJù.ilc I.....il. lU .1."
" .. L'-, •. '
l
... J.1..tr. . . ·~ ...... '.
,
\\1~.'..,
;
TABLEAU 35 : EVALUATION DES PERFORMANCES
)
.J
DES SOUCHES DANS L'UTILISATION DU SUCRE A 35°C Avec So = 150 g/l
SOUCHES
So
Sr
S
Z
P Ob-
P Lim. Ro
RLP
P Limite
RLT
Pr
g/l
g/l
g/l
%
servé
Pratique
%
en %
Theorique
%
g/l/h
UTILISEES
g/l
g/l
g/l
- - -
AWAMORI
150
68
82 54,50
Il,20
37,72
13,65 29,69
41,82
26,78
0,116
CBS 400
150
90
60 40
13,40
27,60
22,33 48,55
30,60
43,79
0,139
CMI
150
92
58 38
9,80
26,68
16,89 36,73
29,58
33,13
0,102
K 64 C
150
78
72 52
8,80
33,12
12,22 26,57
36,72
24
0,091
KYOKAI-7
150
74
76 50,60
14,30
34,96
18,80 40,90
38,76
36
0,148
LABBAT
150
65
85 56,60
16,20
39,10
19,05 41,43
43,35
37
0,168
'0
.....
.....
SAKE
150
75
75 50
9,60
34,50
12,80 27,82
38,25
25
0,100
STV 89
150
78
72 52
22,50
34,50
31,25 65,21
38,25
58,80
0,234
TJ1
150
78
72 52
12,50
33,12
17,36 37,74
36,72
34,04
0,130
Y 978
150
60
90 60
19,20
41,40
21,33 46,37
45,90
41,80
0,200
RK 90
150
74
76 50,60
14,10
34,96
18,55 40,30
38,76
36,37
0,146
Ferm. naturelle 150
84
66 44
Il,10
30,36
16,81 36,56
33,66
32,97
0,115
.._."'\\'.~ ,__'"'".,u.•o..........f",...~_.4>...<'-,"":':"'.............'~--~"'~ ....._."!'""...~....~.•.~.~~...~;__.......................,,...... '~"'''''''' ~•....,""_.":_•..""_._""_O__""~'_"~ __~..."~J"'.".,_· ......'_",...,.·.,.....
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....~·,.."·,,{""""""':<._-·....·'-'···'..-·-"'''.- ,.;.",.- ,.,,' - "."C"
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,
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~
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.
'1
.
TABLEAU 36 . EVALUATION DES PERFORMANCES
DES SOUCHES DANS L'UTILISATION DU SUCRE A 37°c Avec Sa ;: 150 9/ 1 APRES 96 H
SOUCHES
So
Sr
S
Z
P Ob-
P Lim.
Ro
RLP
P Limite
RLT
Pr
g/1
g/1
g/1
%
servé
Pratique
%
en % Theorique
%
g/l/h
UTILISEES
g/1
g/1
g/1
AWAMORI
150
72
78 52
13,65
35,88
17,50 38,04
39,78
34,31
0,142
CBS 400
150
59
91 60,60
16,35
41,86
17,96 39,05
46,41
35,22
0,170
- --_.
-
- --
._--- --_. ----_.
._-_._" ..- -
. _ ~ . _ . _ -
- - - ' - ' - - - '
CM!
150
85
65 43,30
16,23
29,90
24,9b ~4,2U
JJ,l~
4U,Y~
O,lb9
K 64 C
150
71
79 52,60
8,63
36,34
10,93 23,74
40,29
21,41
0,089
-- -------- -----
KYOKAI-7
150
50
100 66,60
21,13
46
21,13 45,90
51
41,43
0,220
t"
--
LABBAT
150
76
74 49,30
Il,73
34,04
30,71 66,77
37,74
60,22
0,122
SAKE
150
70
80 53,30
8,10
36,80
10,-12 22,01
40,80
19,85
0,084
STV 89
150
70
80 53,30
26,80
36,80
33,5
72,8
40,80
65,68
0,279
TJ1
150
68
82 54
18,90
37,72
23,04 50,10
41,82
45,19
0,196
Y 978
150
58
92 61
17,80
42,32
19,34 42,06
4b,92
3'/ , <)3
0, HJ5
RAK 90
150
48
102 68
27,60
46,96
27,05 58,70
52,02
53,05
0,287
FERM. NATURELLE 150
55
95 63
5,40
. 43,70
5,68 12,35
448,45
Il,14
0,056
... _--- .
--
--
.-
.
-
-
------_ ,
..
· So - cc. initiale en sucres totaux
_ Ko - rendement ,)bol'r-.-c
1
· Sr - cc. r~siduelle en sucres totaux
. Pl - productivile
1
•
.S
- cc. do sucre conso. . .6
l
'1 de l'U('-1 , .• u .. ,~.; .........
1
1
· P ob.erY~ - cc. d'~tbanol produl
!
· Pli ... tbéorique - cc, li ... tbéorique d'étbanol pl-O~UII
,
· l' li •. pratique - cc. Ii •. pratique d'~lbaDol pruduit
,
· aLp - ronde ..cnt obtonu par rapport au rendemcul 118llle pC .....IUI·
1
· aLT - ronde..ent obteou par rapport au rcnde.l(~nl 1 heui i 'C!.!:_ .__
1
~
.....
i
- - -
- - - - ~ - - - - - -
118
En effet , quelle que soit la température, le pourcentage de sucre
consommé demeure dans la marge 40-70% , soit environ 50 à 110 g de sucre.
Les plus faibles pourcentages sont obtenus à 35° C alors qu'à 30°C et 37° C,
ces valeurs sont plus élevées et tendent à se rapprocher.
Le fait que, la température de croissance maximale des levures soit 30°
C et que, celle de la production maximale d'éthanol soit 37° C, peut expliquer
les meilleures consommations de substrat à ces deux températures.
La variation notable de la consommation du substrat selon les souches
peut s'expliquer par le fait que certaines souches testées soient bien adaptées au
substrat alors que d'autres ne le sont pas.
En effet, les souches comme Kyokaï-7 et RAK90, consommant entre 60
et 70% du substrat, sembleraient bien s'adapter et cela quelle que soit la
température de fennentation.
Par contre, les souches SAKE et CMl sembleraient mal s'adapter au jus
de rônier. Les résuhats de nos es~ais avec ces deux souches sont d'ailleurs
opposés à ceux de KOUA KOU et Coll (1987) sur le jus d'ananas.
A cette concentration initiale égale à 150 g/l de sucre, nous constatons
égalemenr que le sucre résiduel reste à un taux élevé et que l'épuisement total
du substrat n'est jamais obtenu quelles que soient la souche et la température
utilisées.
Les tempérmures les plus indiquées sont: 30°C et 37°C. Les souches les
mieux adaprées sont: RAK90, Kyokaï-7. Des facteurs inhibiteurs sembleraient
être présents pour réduire cette consommation.
l l 9
B.I1I 2.3 - AVEC UNE CONCENTRATION INITIALE EN
SUCRES TOTAUX EGALE A 200 g/l
B.III.2.3-1 - Température de fermentation
30° C
A 30° C, la concentration de sucre consommé par les levures testées
varie de 56 à 121 gIl ; soit un pourcentage de 28 à 60% de sucre consommé
(tableau 37). Les résultats consignés montrent que la majorité des souches
testées sont capables de consommer plus de 50 % du substrat initial. Toutefois,
le taux de sucre résiduel reste très élevé avec une concentration comprise entre
79 à 144 gIl.
Les meiikU!'~s souches consommatrices du substrat sont:
Labbat, K64-C,C'as 400, Kyokaï-7, RAK 90; alors que CM l,SAKE ont
montré une très hible consommation.
B.III.2.3-2 - Température de fermentation : 35° C
A 35 0 C, la concentration de sucre consommé varie de 64 à 120g/l ; soit
un pourcentage de 34 à 60% de sucre consommé (tableau 38).'
La majorité de souches testées consomment plus de 50% du substrat
initial, mais, le taux de sucre résiduel demeure très élevé (entre 80 et 132
gll).Les souches qui utilisent mieux les sucres sont : K 64-C(60 %) ,
AWAMORI ()9 ~n, y 978 (58 %) et CMI (57 %), contre TJl et SAKE qui
consomment de fa~:)les quantités (34 et 37 %).
8.111..2.3-3 - Température de fermentation : 37 0 C
A 37 0 C l~s souches testées consomment entre 73 et 158 g/l de sucre;
soit un pourcentage de 36.S à 79 9c (tableau 39). Contrairement à 30° C et 350
C, les résultats d(.s essais à 37° C montrent une bonne consommation du
substrat par la ma.. ,)rité àes souches. En effet, près de 7 souches utilisent plus
de 70% du t8!IX de;ucre initial.
TABLEAU 37 : EVALUATION DES PERFORMANCES
DES SOUCHES DANS L'UTILISATION DU SUCRE A 30°C Avec So = 200 g/l APRES 96 H
SOUCHES
So
Sr
S
Z
P Ob-
P Limite Ro
RLP
P limite RLT
Pr
g/l g/l g/l
t
servé
Pratique
t
en %
Théorique
%
g/l/h
UTILISEES
g/l
g/l
9/ 1
AWAMORI
200 105
95 47,50
15,30
43,70
16,10 35,01
48,45
31,50
0,159
CSS 400
200
85 115 57,50
13,60
52,90
11,82 25,70
58,65
23,18
0,141
CMI
200 144
56 28
9,20
25,76
16,42 35,71
28,56
::12,22
0,095
K 64 C
200
84 116 58
22,66
53,36
19,53 42,46
59,16
38,30
0,235
KYOKAI-7
200
86 114 57
25,80
52,44
23,50 51,14
58,14
46,09
0,268
LASBAT
200
79 121 60,50
16,40
55,66
13,55 29,46
61,71
26,57
0,170
o
N
......
SAKE
200 127
73 36,50
12,42
33,58
17,01 36,98
37,23
32,87
0,129
STV 89
200 112
88 44
22,53
40,48
25,60 55,65
44,88
50,20
0,234
TJ1
200 104
96 48
16
44,16
16,66 36,23
48,96
32,67
0,166
Y 978
200
92 108 54
24,40
49,68
22,59 49,11
55,OR
44,7Q
0,7'14
--.------
<----~
, •. --
- - ~ -. --
-"- -- ..-.
~
-
-
----_._~--
HAK"90
200
88 112 56
18,60
51,52
16,60 36,10
57,12
32,56
0,193
Ferm. naturelle
200
88 112 56
13,90
51,52
12,41 26,97
57,12
24,33
0,144
· SO - cc. ioitiale eo sucres totaUlt
· Ro - rcode.eot observé
· Sr - cc. r~siduelle ea sucres totaux
· Pr - productivité
· S
- cc. de sucre coasom.~
· Z
- 1 de sucre consolllmé
1
· P obsen~ - cc. d'~tbaaol produi
1
1
· P li... tb~orique - cc. lim. tb~orique d'~tbaool produit
· P li•. pratique - cc. Iim. pratique d'~tbaDol produit
1
1
· ILP - reademeot obteou par rapport au reade"cDt limite pratique
1
· RLT - reade.eat obteau Dar raDDort au reademeDt tbéorique
1
-1
-
TABLEAU 38 : EVALUATION DES PERFORMANCES
DES SOUCHES DANS L'UTILISATION DU SUCRE A 35°C Avec So = 200 9/1 APRES 96 H
SOUCHES
So
Sr
S
Z
P Ob-
P Limite Ro
RLP
P Limite
RLT
Pr
SOLUTIONNEES
g/l g/l g/l
%
servé
Pratique
%
en%
Théorique
%
g/l/h
g/l
g/l
g/l
AWAMORI
200
82 118 59
20,50
54,28
17,37 37,76
60,18
34,08
0,243
CBS 400
200
95 105 52,50
24,12
48,30
22,97 49,93
53,55
45,04
0,251
CMI
200 114
86 57
14,68
39,56
17,06 37,10
43,86
33,47
0,152
K 64 C
200
80 120 60
25,10
55,20
20,90 45,47
61,20
41
0,261
KY9KAI-7
200
96 104 52
28,50
47,84
27,40 59,57
53,04
53,73
0,296
......
LABBAT
200 125
75 37,50
18,40
34,50
24,53 53,30
38,25
48,10
0,191
('1
......
SAKE
200 126
74 37
13,46
34,04
18,18 39,54
37,74
35,66
0,140
STV 89
200 106
94 47
26,90
43,24
28,60 62,21
47,94
56,11
0,280
TJ1
200 132
64 34
13,20
31,28
19,41 42,19
34,68
38,06
0,137
Y 978
200
80 120 60
22,70
55,20
18,91 41,12
61,20
37,09
0,236
RAK 90
200
84 116 58
27,36
53,36
23,50 51,27
59,16
46,24
0,285
Ferm. naturelle
200 118
82 41
17,80
37,72
21,70 47,18
41,82
42,56
0,185
· So - cc. iaitiale ea sucres totaux
. lu - ac.ule.cul UIJl>t~1 "'~
!
· Sr - cc. résiduelle en sucres totaux
. l'r - p,.OdUr.IIVII.~
1
1
· S
- cc. de suc ..e cooso• •6
.Z
- % dc ~Ut;.
1
C
l.UII:>'UW""·
1
,
· P obseryé - cc, d'éthanol produi
· Pli • . théo.. ique - cc. li •. théo.. ique d'6th_aot prod uit
1
i
· P li • . pratique - cc. Ii •. pratique d'étbaool produil
1
· RLP - ..eode.eol obleou p." ,..ppon .u reode.col liatilc l" di..tfUC
1
· Il.T - rende.ent obtenu par rapport au rende ..enl 1 hr.or iq lIr
i
_------
..
..~.l.
TABLEAU 39 : EVALUATION DES PERFORMANCES
DES SOUCHES DANS L'UTILISATION DU SUCRE A 37° C Avec So = 200 9/1 APRES 96 H
SOUCHES
So
Sr
S
Z
P Ob-
P Limite
Ro
RLP
P Limite
RLT
Pr
g/l
g/l
g/l
%
servé
Pratique
%
en %
Theorique
%
g/l/h
SELECTIONNEES
g/l
g/l
g/l
AWAMORI
200
60
140 70
29,73
64,40
21,23 46,16
71,40
41,63
0,309
CBS 400
200
72
128 64
22,26
58,88
17,39 37,80
65,40
34,03
0,231
CMI
200
127
73 36,5
17,26
33,58
23,6
51,39
37,23
46,36
0,179
K 64 C
200
66
134 67
29,40
61,64
21,94 47,69
68,34
43,02
0,306
N
KYOKAI-7
200
44,4
155 78
36,30
71,08
23,32 50,71
79,35
45,74
0,378
N
-
,}
LABBAT
200
52
148 74
30,10
68,08
20,33 44,21
75,48
39,87
0,313
"~
SAKE
200
124
76 38
14,50
34,Y6
19,07 41,47
38,76
37,40
0,151
STV 89
200
99
101 50,50
31,30
46,46
30,99 67,36
51,51
60,76
0,326
TJ1
200
60
140 70
22,36
64,4
15,97 34,7
71,40
31,31
0,232
- - - - - --------
y 978
200
59
141 70,50
21
64,40
15,9'7 32,60
'11,91
29,20
0,218
RAK 90
200
42
158 79
36,80
72,68
14,80 50,63
80,58
45,66
0,383
Ferm. naturelle 200
48
152 76
7,40
70
4,86 10,57
77,52
9,54
0,077
...,
· So - cc. initiale en sucrcs totaux
. Ro ~ rcndement Obl!>~JVl~
1
· Sr - cc. résiduelle en sucres totaux
. Pr - IHotlUl·tÎVj(.·
!,,
· S
- cc. de sucre conso....é
_ l
- t
d t' suc r " COll" Il ni nt "
· P observé - cc. d'étbanol produi
1
1
· Il li ... tbéoriquc - cc. li ... tbéorique d'étbanol produil
1
l ,
· P li ... pratique - cc. li ... pratique d'étbanol produit
1
1
· Il.P - rende..cnt obtcnu par rapport au rcndc.col lilllilt' .' .... Irq."·
j
· ALI - rende..cnt obtenu par rapport au rendement the", Iq tH'
1
_ _ _•____ .• -_0 ' __ !
,
....._..__ ......_..__ ....-.~
123
Malgré cette amélioration, nous n'observons pas un épuisement total du
substrat car la cO:lcentration en sucre reste toujours assez élevé (entre 42 et
127 g/l).
Les souchef, RAK90 (79 %), Kyokaï-7 (78 %), la mixture naturelle (76
%) Labbat (74 ~) ont les meilleures consommations de substrat; par contre,
CMI (36,5 %) et SAKE (38 %) ont les consommations les plus faibles.
En général, les différents résultats mettent en évidence
une
consommation de sucre de 50 à 160 g/l par les souches testées; soit 30 à 80%
de la concentration initiale du substrat.
Ces résu!tats montrent une consommation moyenne du substrat par les
souches testées à 30° C et 35° C et une consommation assez bonne à 37° C.
Nous pc "lvons donc dire que la consommation du substrat varie selon la
température de fermentation. Cependant, dans tous les cas, le taux de sucre
résiduel reste éle\\ é et l'épuisement total du substrat n'est jamais obtenu.
Cette hal\\~e concentration en sucre résiduel peut être liée d'une part, à
l'effet inhibite~: de la concentration initiale du substrat et d'autre part, à
l'effet de l'éthanol produit.
En effet, les concentrations élevées en glucose (au dessus de 150 g/l)
inhiberaient ~I~lon HOlZER (1968) les enzymes de la chaîne respiratoire et
celles du métao,)lis:ne fermentaire : on parle alors d'inhibition par le substrat;
ce qui est notre Cl':'.
STREHAI~O (1984) a également montré dans ses travaux sur les
phénomènes .1 n:h. ')itie-n en femlentation alcoolique, le rôle important du taux
de substrat initial.
Un autre (h~s fa':'l~UïS limitants de la fèrmentation alcoolique est l'éthanol
lui-même. A pt, tir d'~ne ceruine concèntratÎon (12%), il 3git en polluant
l'environnemelH des le\\ ures jusqu'à ce qu'elles cessent de croître et
éventuellement meurent (CYZE\\VSKI et \\\\lLKE, 1976).
124
Cette observation met en évidence l'existence d'un seuil de tolérance en
alcool pour les souches de levures. L'influence de cet alcool se manifesterait au
niveau du fonctionnement des enzymes de la glycolyse en les inhibant.
B.III.3 . LES RENDEMENTS
Les tableaux 31 à 39 ainsi que les tableaux de synthèse 40, 41 et 42
présentent les rendements observés (Ro), les rendements obtenus par rapport
au seuil limite pratique (RLp), et les rendements obtenus par rapport au seuil
limite théorique (RLt) au cours des différents essais réalisés.
Ces rendements ont été calculés en fonction des concentrations d'éthanol
produit, et les concentrations de sucre consommé.
Pour l'analyse de nos résultats, nous nous sommes particulièrement penchés
sur les rendements obtenus par rapport au seuil limite pratique désignés "RLp"
B.III.3.1 - AVEC UNE CONCENTRATION I:\\ITIALE EN
SCCRES TOTAUX EGALE A 100 g/I
Le tableau de sylHhèse 40 présente les différents résultats obtenus à cette
concentration et aux [rois températures retellues.
B.l11.3.l.l.- Température de fer men tation : 30°C
Les concentrations observées en éthanol les plus élevées à 30° C sont les
suivantes:
- 14,40 g/l soit '+6.03 % cie rendement par rapport au rendement limite
pratique "RLp" avec la souche RAK90
- 12.RO g/\\ soit 40.92 o/c clu "R Lp" avec la souche Kyokaï-7
- 12,60 g/I soit 4-+,90 % clu "R Lp" avec ta souche Y978.
Notons que la ~ouche STV~9 avec 11,50 g/I d'éthanol produit, fournit
48,07% clu "RLp". soit donc le meilleur rendement suivi de celui de RAK90
(46,03 %).
125
TABLEAU 40 : PRODUCTION D'ETHANOL: SYNTHESE DES RESULTATS
AVEC 100 g/1 DE CONCENTRATION INITIALE EN SUCRE
30 0 C
35 0 C
37 0 C
SOUCHES UTILISEES
P Observé RLT %
P Observé RLT %
P Observé
RLT %
g/l
g/l
g/l
Pr(g/l/h)
RLP %
Pr(g/l/h)
RLP %
Pr(g/l/h)
RLP %
V/AMORI
6,60
19,90
10,20
29
17,05
46,43
0,068
22,07
0,106
32,13
0,177
51,47
as 400
9,30
25,68
8,10
24,81
12,40
43,41
0,096
28,47
0,084
27,51
0,129
48,14
7,40
26,87
8,60
26,76
8,93
32,42
MI
0,077
29,70
0,089
29,67
0,093
35,95
7,20
23,92
7,20
21,42
6,90
19,60
64 C
0,075
26,52
0,075
23,71
0,071
21,73
e 12,80
36,90
Il,40
37,25 • 13,60
57,97
YOKAI - 7
0,133
40,92
0,118
41,30
0,141
64,27
8,60
26,34
10,20
36,36
12,53
53,41
~BBAT
0,089
29,21
0,106
40,31
0,130
59,21
7,60
28,67
7,30
21,72
6,90
22,54
\\KE
0,079
31,79
0,076
24,04
0,071
25
.
(
11,50
43,36
15,20
60,07 0
18,60
77,59
'V 89
0,119
48,07
0,158
66,08'
0,193
86,03
11,90
30,70
9,21
41,99
10,20
30,76
l
0,123
34,03
0,096
46,56
0,106
34,11
• 12,6C
38,05[
14,10
42,53
15,40
44,40
978
0, l ~:..
44,90
0,146
47,1~
0,160
49,23
14,4C
41,52
12,10
35,9';
22,20
59,62
K 90
O,lS':!
46,03
0,126
39,85
0,231
66,11
9,4C
28,79
8,30
40,68
3,70
13,95
KMENTATION
rURELLE
0,097
32,60
0,086
45,10
0,038
15,46
126
Les concentrations l~s p.'us faibles en éthanol observées sont également
les suivantes:
- 06,60 g/1 sv1t 22,07 o/c de rendement par rapport au rendement limite
pratiqt.;t.; "RLp" avec la souche AWAMORI
- 07,20 gll s(Jit 26,52 % du "RLp" avec la souche k64-C
- 07,40 gIl soit 29,70 % du "RLp" avec la souche CMl.
H.III.3.1.-2 - Température de fermentation : 35°C
Les concentrations observées en éthanol les plus élevées à 35° C sont les
suivantes :
- 15,20 gIl soit 66,08 % de rendement par rapport au rendement limite
pratique "RLp" avec la souche STV89
- 14,10 g/l so;t 47,15 % du "RLp" avec la souche Y978
- 12,10 g/l soit 39,85 % du "RLp" avec la souche RAK90.
Les concentrations les plus faibles en éthanol observées sont également
les suivantes:
- 07,20 g/! ~~it 23,71 % de rendement par rapport au rendement limite
rratique
"RLp" avec la souche K64-C
- 07,30 gll '.oit 2-t.0-l % du "RLp" avec la souche SAKE
- 08,10 gJl _,oit 2i .51 9è du "RLp" avec la souche CBS400.
Le rende:;nem le plu·, élevé obtenu à 35° C est de 66,08 % de rendement
par rapport au ren<!~mef:r limite pratique avec la souche STV89.
l'.. IJJ.3.1-3 - Température de fermentation : 37°C
Les concentntiOJ:- )bser,ées en éthanol les plus élevées à 37°C sont les
•
SUIvantes:
- 22.2C ~i~ ~(it 66.:; c;é Ju "RLp" avec la souche RAK90.
- 18,60 g/I ~.(jit X6. _~ c;é du "RLp" avec la souche STV 89
- 13.60 g/l ,;oit 6:'.~- SC Ju "RLp" avec la souche Kyokaï-7.
i;;'~
__ , - , , _
. '
_
.-
_,.
127
Les concentration., les plus faibles en éthanol obseryées sont également les
suivantes:
- 03,70 g/l ~oit 15,46 % du "RLp" avec la population mixte de micro-
orgamsmes
- 06,90 g/l ~;oit 25 % du "RLp" avec la souche SAKE
- 06,90 g/l soit 21,71 % du "RLp" avec la souche K64-C.
A 37°C le rendement le plus élevé est de 86,03 % de rendement par
rapport au rendement limite pratique avec la souche STV89.
Ces résultats mettent en évidence l'influence de la nature de la souche et
de la température dans le processus de la fermentation alcoolique.
En effet, nous notons une nette progression des rendements lorsque la
température augmente. Nous notons également d'une manière générale, une
augmentation des rendements à cette concentration. Ceci pourrait être correlé
à la levée des fact~urs inhibiteurs présents dans les concentrations en sucre plus
élevées lors de la fennentation
La souche STV89 fournit
les meilleurs rendements quelque soit la
température ; ce qui est remarquable, c'est qu'à 37°C, le rendement est
supérieur à 70% de rendement par rapport au rendement limite pratique .
Ainsi, cette $:Juche peut être sélectionnée pour une production industrielle
d'éthanol.
Néanmoins. malgré l'augmentation des rendements, ceux-ci demeurent
relativement faibles en général pour cette co·ncentration.
Le jus I~:t~ur·~l de rânier contenant 100 g/l de sucre semble quand même
être favorable püu; des rerldements économiques en fennentation alcoolique.
128
8.111.3.2 - AVEC UNE CONCE~TRATION INITIALE EN
SUCRES TOTAUX EGALE A 150 g/I
Le tableau de synthèse 41
présente les résultats obtenus à cette
concentration et aux différentes températures retenues.
H.III.3.2-1 - Température de fermentation : 30°C
Les concent.rations obseIVées en éthanol ( P observé) les plus élevées à
30°C sont les suivantes:
- 23,60 g/l ~~it 57 % de rendement par rapport au rendement limite
pratique (RLp) u\\ ec la souche Kyokaï-7
- 20,80 g/l soit 52,57 % de rendement par rapport au rendement limite
pratique (RLp) :JVec la souche Y978
- 20,50 g/l soit 42,40 % de rendement par rapport au rendement limite
pratique (RLp) av,~c la souche RAK90.
Noùs n(,tons aussi que la souche STV 89 avec 16,90 g/l d'éthanol
produit,
fournit 56,52 % de rendement par rapport au rendement limite pratique, soit
donc un meilk!lr r~ndement avec la souche Kyokaï-7.
Les concemrations les plus faibles en éthanol observées sont également
les suivantes:
- 08,12 g/l ':;oit 28,26 % de rendement par rapport au rendement limite
pratique "RLp" 2vec la souche K64-C
- 08,70 g/l soit 23,70 % du "RLp" avec la souche AW AMORI
- 10,16 g./l süit 32,48 % du "RLp" avec la souche SAKE.
Le rendement le plus éle\\'é obtenu à 30° C est de 57% de rendement par
rapport au ren<.1cmeat limite pratique avec les souches Kyokaï-7 et STV 89.
129
TABLEAU 41 PRODUCTION D'ETHANOL : SYNTHESE DES RESULTATS AVEC
150 g/J DE CONCENTRATION INITIALE EN SUCRE
30° C
35° C
37° C
SOUCHES UTILISEES
P Observé RLT %
P Observé RLT %
P Observé
RLT %
g/l
g/l
g/l
Pr(g/l/h)
RLP %
Pr(g/l/h)
RLP %
Pr(g/l/h)
RLP %
WAMORI
8,70
21,30
Il,20
26,78
13,65
34,31
0,090
23,70
0,116
29,64
0,142
38,04
.aS 400
12,70
23,05
13,40
43,79
16,35
35,22
0,132
25,56
0,139
48,55
0,170
39,05
Il,70
33,73
9,80
32,45
16,23
48,95
MI
0,121
37,40
0,102
36,73
0,169
54,28
8,12
25,27
8,8
24
8,63
21,41
64 C
0,084
28,03
0,091
26,57
0,089
23,74
• 23,60
51,41
14,30
39,89
21,13
41,43
YOKAI -
7
0,245
57
0,148
40,90
0,220
45,90
10,40
25,49 • 16,20
37,41 • 22,73
60,22
iABBAT
0,108
28,26
0,168
41,43
0,122
66,77
10,16
29,29
9,60
25,10
8,10
19,85
AKE
0,105
32,48
0,100
27,82
0,084
22,01
'!
16,90
50,98 .. 22,50
58,80
26,80
65,68
TV 89
0,176
56,52
0,234
65,21
0,279
72,80
14,20
31,63
12,50
34,02
18,90
45,19
JI
0,147
35,07
0,130
37,74
0,196
50,10 1
20,80
47,42
19,20
41,80
17,80
37,93 1
978
1
0,2:6
52,57
0,200
46,37,
0,185
42, 061:
,
20,50
38,31
14,10
36,37!
27,60
53, 051
"K 90
"
1
0,2:"3
42,40
0,146
40,30·
0,287
58,70 !:
12,-:':,
28,07
11,10
32,97
5,40
Il,14
~RMENTATION
\\TURELLE
0,:'31
31,12
0,115
36,56
0,056
12,35
130
,{' .
B.III.3.2-2 - Température de fermentation : 35°C
Les concentrations observées en éthanol ( P observé) les plus élevées à
35° C sont les suivantes:
- 22,50 g/! soit 65,21 % de rendement par rapport au rendement limite
pratique "RLp" avec la souche STV89
- 19,20 g/l soit 4637 % du "RLp" avec la souche Y978
- 16,20 g/l soit 41,43 % du "RLp" avec la souche Labbat.
Nous notons que la souche CBS400 avec 13,40 g/l d'éthanol produit,
fournit 48,55 % de rendement par rapport au rendement limite pratique
Les con~ent!'ations les plus faibles en éthanol observées sont également
les suivantes:
- 08,80 g/l 50it 26,57 % de rendement par rapport au rendement limite
pratique "RLp" avec la souche K64-C
- 06,60 gIJ ~oit 27,82 % du "RLp" avec la souche SAKE
- 09,80 g/l soit 36,73 % du "RLp" avec la souche CM!.
Le rendement le plus élevé obtenu à 35°C est de 65,21 % du rendement
limite pratique avec la souche STV89.
8.111.3.2-3 - Température de fermentation : 3'oC
Les concentrations obselVées en éthanol ( P observé) les plus élevées à
370 C sont les :~tiv:tntes :
- 36,80 g/l ~oit 72.~'m % de rendement par rapport au rendement limite
pratique IRLp" avec la ~o;]che STV89
- 27,60 g/i ,vit 58.70 % du IRLp" avec la souche RAK90
- 22,73 b/i soit 66.ï7 7c du "RLp" avec la souche Labbat.
Les conœntl'ation::- \\cs plus faibles en éthanol observées sont égal~mènt
les 'luivantes :
- 05,40 gli seit l2.~5 0'( de rendement par rapport au r~n<.km~nt limite
pratique "RLp" avec la f·"pulation mixte de micro-organismes
131
- 08,10 gll soit 22,01 % derendement par rapport au rendement limite
pratique avec la souche SAKE
- 08,63 g/l soit 23,74 % de rendement par rapport au rendement limite
pratique avec la souche K64-C
Le rendement le plus élevé obtenu à 37° C est 72,80 % de rendement
par rapport au rendement limite pratique avec la souche STV89.
Tous ces résuhats indiquent que les rendements sont variables en
fonction de la nature de la souche et de la température.
En effet, ils augmentent légèrement lorsque la température de
fennentation passe de 30°C à 37°C; ce qui confirme l'effet activateur des
températures élevées su r les systèmes enzymatiques responsables de la
fennentation alcoolique.
Bien que cenaines souches changent de comportement avec une
augmentation du ren(kment ~l cene concentration, la souche STV89 fournit
toujours les meilleurs rendement quelle que soit la température. Les valeurs
obtenues sont :56,52 %. 65.21 % et 72,80 % de rendement
par rapport au
rendement limite pratique respectivement pour les températures de 30, 35 et
37°C.
Nous notons d'une manière générale pour cerre concentration que nos
résultats sone faihles pour la plupart des souches utilisées. En effet, le
rendement le pl us éle\\'~ obtenu HU cours de nos essais est de 72,80 % de
rendement par r<lfJpoft ~IU ren(]cl11ent 1imite pratique. A lors que les résultats
des travaux de OGUNYE et Coll (1978), ainsi que cellx de KOUAKOU et Coll
(19&7) re lèvent près de 90% du rendement limite pratique avec du jus
d'ananas.
Toutefois. la souche STVR9 pourrait être recommandée étant donné qu'à
37°C, son rendement es: ~llI-c1essus du seui 1de sélection (70 %).
132
En tenant compte des aspects économiques de cette fennentati
alcoolique, le jus naturel de rônier contenant 150 gIl de sucre ne semble l=
être un milieu favorable pour les souches testées. En effet, seule la soue
ST V 89 est capable de fournir un rendement économique.
B.III. 3.3. . AVEC UNE CO~CENTRATION INITIALE EN
SUCRES TOTAUX EGALE A 200 g/l
Les résultats obtenus à cette concentration et aux différent
températures retenues sont consignés dans le tableau de synthèse 42.
B.l11.3.3.1 . Température de fermentation : 30°C
Les concentrations observées en éthanol ( P observé) les plus élevées
30° C sont les suivantes:
- 26,80 g/l soit 51,14 % de rendement par rapport au rendement limite
pratique (RLp) avec la souche Kyokaï-7
- 24,40 g/J soit 49,11 % derendement par rapport au rendement limite
pratique (RLp) avec la souche Y978
- 22,66 g/l snit 42,46 % de renc1ement par rapport au rendement limite
pr~ltiqlle (RLp) avec la souche K64-C.
Notons aussi qll~ la soucht: STV~9 avec 22,53 g/l d'éthanol produi
fournit 55,65% de l"elHkmcllt par rapport au rendement limite pratique; so
donc le meilleur rendement malgré la production moyenne d'éthanol.
Les concentratio/ls les plus Ltibles en éthanol observées sont égalemer
les slIiv"ll1tes :
- 09,20 g/l soit ~5.7 1% cie rendement par rapport au rendement limite
pratique (RLp) avec la souche CMI
- 12.42 g/l soit :16.9X% cie rcndement par rapport au rendement limite
pr~lriqlle (R Lp) avec la souche Saké
- 13,60 g/l soit 25.7()% cie rcndement par rapport au rendement limite
j1 rariqllc ((H.p) avec la souche CBS400.
,
,
"_"":..-!
.'
.,
~
~ _...... '·~~"""Oi· ...~,..::._...._~~~ _ ...:.. ~.. , __ ...~ _ .
133
TABLEAU 42 : PRODUCTION D'ETHANOL SYNTHESE DES RESULTATS
AVEC 2009/1 DE CONCENTRATION INITIALE EN SUCRE
30° C
35° C
37° C
P Observé RLT %
P Observé RLT %
P Observé
RLT %
:OUCHES UTILISEES
g/1
9/1
g/1
Pr(g/1/h)
RLP % Pr(g/1/h)
RLP % Pr(g/l/h)
RLP %
rAMORI
15,30
31,50
20,50
34,10
29,73
41,63
0,159
35,01
0,213
37,76
0,309
46,16
IS 400
13,60
23,18
24,12
45,04
22,26
34,03
0,141
25,70
0,251
49,93
0,231
37,80
9,20
32,22
14,68
33,47
17,26
46,36
Il
0,095
35,71
0,152
37,10
0,179
51,39
, 22,66
38,30
25,10
41
29,40
43,02
64 C
0,235
42,46
0,261
45,47
0,306
47,69
• 26,80
46,09 • 28,50
53,73 • 36,30
45,74
'OKAI - 7
0,268
51,14
0,296
59,57
0,378
50,71
.
16,40
26,57
18,40
48,10
30,10
39,87
~BBAT
0,170
29,46
0,191
53,30
0,313
44,21
12,42
32,87
13,46
35,66
14,50
37,40
KE
0,129
36,98
0,140
39,54
0,151
41,47
,
\\
22,53
50,20 c 26,90
56,11
31,30
60,76
V 89
0,234
55,65
0,280
62,21
0,326
67,36
16
32,67
13,20
38,06
22,36
31,31
l
0,166
36,23
0,137
42,19
0,232
34,70
. 24,40
44,29
22,70
37,09
21
29,20
n8
0,254
49,11
0,236
41,12
0,218
32,60
18,60
32,56
27,36
46,24
36,80
45,60
,
1
, 90
0,193
1
36,10
0,285
51,27
0,383
1
50,63 1
1
1
1
13,90
!
24,33
17,80
42,56
7,40
9,54
~MENTATI 0:-;
1
'URELLE
0,144
26,97
0,185
47,18
0,077
10,57
1
134
Ces résultats nOLS pemlettent d'observer que les rendements varient de
façon notable en ionct:0n des souches utilisées pour une température donnée.
Le rendement !e plus é:evé obtenu à 30° C au cours de ces essais est de 55,65
% de rendemt:;nt
par rapport au rendement limite pratique avec la souche
STV89..
B.III.3.3·2 - Température de fermentation 35°C
Les conc~ntratior.scbservées en éthanol ( P observé) les plus élevées à
35° C sont les suiv;;.ntes :
- 28,50 g/l soit 59.57 % de rendement par rapport au rendement limite
pratique (RLp) avec la souche Kyokaï-7
- 27,36 s.11 soit 51.27% de rendement par rapport au rendement limite
pratique (RLp) avec la souche RAK90
- 26,90 g/l soit 62.21 % de rendement par rapport au rendement limite
pratique (RLp) avec la souche STV89
Les concemrations les plus faibles en éthanol observées sont également
les suivantes:
- 13,20 g/! soit 42.1 9 % de rendement par rapport au rendement limite
pratique avec TH
- 13,46 g/l sc·it 3934 % de rendement par rapport au rendement limite
pratique avec SAKE
- 14,68 :YI soit 37.1 Oo/t; de rendement par rapport au rendement limite
pratique avec CMI
8.111.3.3-3 - Température à fermentation
37°C
Les conceillïations ,bsef\\'ées en éthanol ( P observé) les plus élevées à
37° C sont les suivantes:
- 36.80 g/l soit 50/.' CY JI? rendement par rapport au rendement limite
pratique avec la souche RAK90
- 36.30 g/l soit 50.-' (;;. de rendement par rapport au rendement limite
pratique avec la souche Kyokaï-7
- 31 JO g/l s,jit 67.? -) (Ic Je rendement par mpport au rendement limite
pratique avec la souche STV-89.
135
Les concentrations les plus faibles en éthanol obselVées sont également
les suivantes:
- 07,40 gjl seit 10,57 % de rendement par rapport au rendement limite
pratique avec la population mixte de micro-organismes
- 14,50 g/I soit 41,47 % de rendement par rapport au rendement limite
pratique avec SAKE
- 17,26 g/l ~ùit 51,39 % de rendement par rapport au rendement limite
pratique avec CMl.
Le rendeme.1t le plus élevé obtenu à 37° C est de 67,36 % de rendement
par rapport au rer.dement limite pratique avec la souche STV-89 comme à 35°
Cet 30° C.
L'analysl'" des différeats résultats des rendements permet les constatations
suivantes:
- A une température donnée, le rendement varie toujours en fonction de
la nature de la sour:he.
- La souche STV89 fournit le meilleur rendement quelque soit la
température de f~nnentation. En effet, à 30°C, 35°C et 37°C, elle produit
respectivemerl 55.65 %, 62,21 % et 67,36 % de rendement par rapport au
rendement limitt: pratique (RLp), soit les taux les plus élevés obselVés.
- Les renJunents som à des taux très faibles pour la plupart des souches
utilisées. Mais OO'.IS remarquons qu'en général:
- les rendements
tendent à s'élever lorsque la température de
fermentation a·jgm ..~nte ..
- aucun rènde;l1e~t à cette concentration ne peut être considéré comme
économique p~.lr la di~tillation en production industrielle d'éthanol, car ils
sont tous en dc'..sOJS de "";"I)c'c du "RLp".
136
- malgré tout, nous pouvons recommander la souche STV89 à la
température de 37°C et avec un enrichissement possible du jus de rônier pour
des essais de fermentation ultérieurs.
Le jus de rônier naturel contenant 200 g/l de sucre ne semble donc pas
aussi être un milieu favorable pour des rendements économiques en
fennentation alcoolique.
B.III.4 -LES PRODUCTIVITES
En consiJérant le rendement obtenus par rapport au seuil limite pratique
et la productivité spécifique (Pr) exprimée en gramme d'éthanol produit par
litre
par heure, nous avons effectué des classements des souches les plus
efficace en production à partir des concentrations et températures retenues
pour nos essaIS.
B.III.4.1. • AVEC UNE CONCENTRATION INITIALE EN
SUCRES TOTAUX EGALE A 100 g/l
Le tableall 43 présente les résultats obtenus à cette concentration avec les
températures retenues ; ainsi, le classement de 6 souches plus performantes
observées à chaqùe température est établi.
A 30° C les ploductivités sont comprises entre 0,097 et 0,150 g/l/h et les
rendements dans la fourchette de 32,60 % à 48,07 % du "RLp".
A 35 ° (' ~lles sont
comprises entre 0,089 et 0,158 g/l/h
et les
rendements dans la fourchette de 40,31 à 66,08 % du "RLp".
A 37 ° C,
1(:'1 productivités les plus élevées 0.130 à 0.231 g/l/h et les
r~ndements te~i ptu~ hauts 49,23 à 86,03 % du "RLp" ont été obtenus.
Ces résul::as r.lontrent à nouveau, que les mèilleures productivités sont
observées aux tl~n"'rJératures élevées.
Ainsi, la ~,:n' ~rature de fermentation la plus appropriée est 37° C.
137
TABLEAU 43 : LISTE DES SOUCHES LES PLUS PERFORMANTES SELON
LES RENDEMENTS, LES PRODUCTIVITES ET LES DIFFERENTES
TEMPERATURES DES EXPERIENCES AVEC UN TAUX DE SUCRE
INITIAL DE 100 g/L
30·C
3S·C
37·C
RLP
Pr
RLP
Pr
RLP
Pr
,
,
,
g/l/h
g/l/h
g/l/h
.
STV 89
RA)(
90
STV 89
STV 89
STV 89
RA)( 90
1ere
48,07
0,150 ..
66,08
0,158
86,03
0,231
RAK 90
KYOKAI
y 978
y
978
RAI(
90
STV 89
.
2eme
46,03
0,133
47,15
0,146
66,11
0,193
Y 978
Y 978
·.rJl
KYOKAI
KYOKAI
AWAMORI
3eme
44,90
0,131
46,56
0,118
64,27
0,177
KYOKAI
TJ1
FERM. NAT
LABBAT
LABBAT
Y 978
4eme
40,92
0,123
45,10
0,106
59,21
0,160
TJl
STV
KYOKAI
KYOKAI
AWAMORI
KYOKAI
Seme
34,03
0,119
41,30
0,096
51,47
0,141
FERM. NAT
FERM. NAT
LABBAT
FERM. NAT
Y 978
LABBAT
6eme
32,60
0, 097
40,31
0,086
49,23
0,130
138
Au niveau du classement des souches; RAK-90 isolé du fruit et STV 89
à 37° C fournissent les productivités les plus élevées de nos essais avec
respectivement 0,231 et 0,193 g/l/h .
Puis viennent successivement les souches AWAMORI , y 978, Kyokaï-7
et Labbat avec ïespectivement 0,177 ; 0,160 ; 0,141 et 0,130 gIl/h.
Lorsque les essais de fermentation sont réalisés avec du jus de rônier
contenant 100 g de sucre par litre, nous obtenons de très faibles résultats en
productivité et ce même à 37 0 C qui est la température la plus indiquée pour
les souches sélectionnées.
Cette concentration initiale en sucre semblerait, malgré tout, appropriée
pour une bonn~ fennentation alcoolique du jus de rônier car elle fournit avec
la souche STV 89 le rendement le plus important de tous nos essais ( 86,03 du
"RLp").
Les souches de levures RAK 90 ; STV 89,et Awamori réalisent les
meilleures perfonnances en productivité à 37° C.
B.III.4.2 • AVEC UNE CONCENTRATION INITIALE EN
SUCRES TOTAUX EGALE A 150 g/l
le tableau 4(~ présente les résultats obtenus à cette concentration avec les
températures retenues; ainsi, le classement de 6 souches plus performantes
observées à chaq'le température est précisé.
A 300 C, nous observons que les productivités sont comprises entre 0,161
et 0,245 g/l/h et les rendements entre 35,07 et 57 % du "RLp".
A 35 0 C les productivités sont comprises entre 0,139 et 0.234 g/l/h et les
rendements entre LlO,30 et 65,21 %: du "RLp".
A 37 0 C les productivités les plus élevées, entre 0,122 et O,287 g/l/h ,
ainsi que les rel1~k111ents, les plus élevés entre 45,90 et 7~.RO lé du "RLp" sont
obtenus.
139
TABLEAU 44 : LISTE DES SOUCHES LES PLUS PERFORMANTES SELON
LES RENDEMENTS, LES PRODUCTIVITES ET LES DIFFERENTES
TEMPERATURES DES EXPERIENCES AVEC UN TAUX DE SUCRE
INITIAL DE 150 g/L
30·C
3S·C
31·C
RLP
Pr
RLP
Pr
RLP
Pr
%
g/l/h
%
g/l/h
%
g/l/h
KYOKAI
KYOKAI
STV 89
STV 89
STV 89
RAK .90
1ere
57
0,245
65,21
0,234
72,80
0,287
STV 89
y 918
CBS 400
y
918
LABBAT
STY 89
2eme
56,52
0,216
48,55
0,200
66,77
0,279
Y 918
RAI(
90
y 918
LABBAT
RA)(
90
3eme
~
52,57
0,213
46,37
0,168
58,70
0,220
RAK 90
STV 89
LABBAT
KYOKAI
CMl
TJl
4eme
42,40
0,176
41,43
0,148
54,28
0,196
CMl
TJl
KYOKAI
RA)(
90
TJl
CMl
5eme
37,40
0,~47
40,90
0,146
50,10
0,169
TJl
CMl
RA)(
90
CBS 400
KYOKAI
LABBAT
6eme
35,07
0,121
40,30
0,139
45,90
0,123
140
Au niveau quantitatif, ces résultats sont comparables à ceux obtenus lorsque les
essais de fermentation sont conduits avec du jus de rânier contenant 100 g de
sucre par litre.
Les meilleurs résultats sont observés à 30°C et 37°C
toutefois, la
température de fermentation la plus indiquée est 37°C.
La souche de levure classée première suivant le critère de productivité est
RAK 90 avec 0,287 gIllh à 37°C
La 2èllle souche classée à 37 ° C est STV 89 avec 0,279 g/l/h avec le plus
haut rendement (72,80 %). Puis viennent successivement les souches: Kyokaï-
7, TJl,CMf, et Labbat
avec respectivement 0,220 ; 0,196,0,169 et 0,122
gll/h.
Ces résultats nous permettent de dire que les mei lleures productivités des
levures testées avec le jus de rânier sont nettement inférieures à celles obtenues
avec le jus naturel d'ananas .. En effet, KOU AKOU et Coll (1987) ont montré
qu'à 35° C et 30° C. les souches les plus performantes fournissaient à partir du
jus d'anal1as contenant 1~O g/J cie sucre des productivités supérieures à 0,038
glilh avec Ull remps cie fermentatio!l de JO l\\ 46 heures. Ce temps assez court
favorise la productivité en alconl ;1 partir cie ce substrat par rapport au jus de
rânier qui. selon les conditions cie J'essais, a présenté un temps plus long de
fennentation.
Ainsi. aucune sou;..·l1e testé~ Il'alteint Ic seuil de productivité pour une
sélection. l.a f~lihlcss(:' d~s pnHltllïivités scr:\\it liée c\\'une part au temps de
fermentation. ct c1'aulr!..' P:lrt :11I\\ l'acleurs inhibiteurs de la fermentation
alcooliquc qui sembk'r~licIH toujours présents ~l cette concentration limite de
150 g/l cIL- sucres tlll:lll\\.
Malgré tout, les souches RAK 90, STV ~9 et Kyokaï-7 à 30° Cet 37° C
foumissenr les meilleurs résultats.
141
8.111.4.3 - AVEC UNE CONCENTRATION INITIALE EN
SUCRES TOTAUX EGALE A 200 g/l
Les résultats obtenus à cette concentration avec les températures retenues
sont consignées dans le tableau nO 45 qui montre les 6 souches les plus
perfonnantes observées à chaque température.
L'analyse de ce tableau met en évidence que les plus faibles valeurs tant
en productivité (0,129 à 0,269 g/l/h) qu'en rendement (36,12 à 55,65 %) sont
observées à 30°C.
A 35° C, les productivités sont comprises entre 0,185 et 0,285 g/1/h et les
rendements dans la fourchette de 46,16 à 67,36 %.
Les prod1.ictivités les plus élevées comprises entre 0,179 et
0,383 g/l/h, a~nsi que les rendements les plus élevés (46,16 à 67,36%) ont
été obtenus à 37°C.
Ces résultats confirment l'argument général selon lequel, les systèmes
enzymatiques et l,:s fonctions métaboliques sont activés à haute température.
L'augmentation de la température serait donc un facteur activateur de la
fennentation akùolique dB jus de rônier. En effet, elle induit une amélioration
des rendements et èes productivités des souches.
Lorsque les es~ais S·lnt réalisés avec 200 g/l de sucre et à la tempér3:ture la
plus indiquée 37° C , la souche RAK 90 isolé du fruit est classée première et
présente une prudlicti\\'ité de 0,383 g/1/h.
Les sou;'hes , K: okaï-7, STV 89 et AWAMORI
sont classées
respectivemeut 2. l'i ne, 3è~ne et 4 ème avec une productivité de 0,378 ; 0,326 et
0 .. 309 g/l/h. Pui', les sou.:hes K 64 C et CMI avec 0,306 et 0.179 g/l/h sont
~
~
Sème et 6ème.
142
TABLEAU 45 : LISTE DES SOUCHES LES PLUS PERFORMANTES SELON
LES RENDEMENTS, LES PRODUCTIVITES ET LES DIFFERENTES
TEMPERATURES DES EXPERIENCES AVEC UN TAUX DE SUCRE
INITIAL DE 200 g/L
30·C
3S·C
37·C
RLP
Pr
RLP
Pr
RLP
Pr
%
g/l/h
%
g/1/h
%
g/l/h
STV 89
KYOKAI
STV 89
KYOKAI
STV 89
RAX 90
1ere
55,65
0,268
62,21
0,296
67,36
0,383
.
KYOKAI
Y978
KYOKAI
RAI(
90
CH!
KYOKAI
2eme
51,14
0,254
~9,57
0,285
51,39
0,378
y
978
K 64-C
LABBAT
STV
KYOKAI
STV
3eme
49,11
0,235
53,30
0,280
50,71
0,326
K64-C
STV
RAK 90
CRS 400
RI< 90
AWAMORI
4eme
42,46
0,234
51,27
0,251
50,63
0,309
SAXE
RAI(
90
CBS 400
LABBAT
K64-C
K64-c
5eme
36,98
0,193
49,93
0,191
47,69
0,306
RAK 90
SAKE
FERM. NAT
FERM. NAT.
AWAMORI
CMl
6eme
36,10
0,129
47,18
0,185
46,16
0,179
143
Nos résultats mettent en évidence' une faible productivité des souches testées;
et ce, à la température la plus indiquée. En effet, comprises entre 0,179 et
0,383 g/l/h, elles sont toutes 3 à 4 fois inférieures au seuil de productivité en
éthanol pour une sélection de 1 g/ilh (NA VARRO et Coll.,1978).
La faiblesse des productivités est liée au temps nécessaire qui a été trop
long pour une production maximale d'éthanol par les souches testées.
L'intluence des facteurs inhibiteurs, initialement évoquée à cette
concentration pourrair inrervenir clans la faible~se des productivités.
Tou~ ces élémenrs nous permettent de conclure que le jus de rônier
contenant 200 g/l de sucre Ile semble pas être un substrat propice à une bonne
fermentation alcoolique par le~ levures testées ..
Néanmoins. les ~()llchcs RAK 90, Kyokaï 7 et STV 89 à 37 0 C fournissent
les résultars le~ plus sarisfaisallh qui d'ailleurs pourraient être améliorés par
supplémenration cie nUlrimcnrs er lllodulation du système d'agitation.
B.III.5 . CRITI(2UES DES RESULTATS ET RECOM-
MANDA'TIONS
B.III.5.1 - Al" \\l\\:EAU DES ESSAIS
NOU:-i ~Ivon:-i lCsl6 II S(IUC!ll's dl' levures er ulle population mixte de micro-
organisl11\\..'s sur du jl':-- ll;lllll\\.'1 ,k: l'l'Illier ~I 3 cOllcèlHralions et 3 températures
différelllL's : cc qui rt.'pr':.s\\..'IHe 1(IX ('xpériem:l's.
Pour plus dc ri~: :l:r d'lIll,-' p~\\n ct plHlr rendre nos lests statistiquement
significalil's (\\'aull"\\..' IX:iï. IIIIIIS ~1'.'IIII:-i rc?alis0s Irois s~ri~s d'essais pour chaque
souche. \\..'l1aquc CUIL',-':lILlliOIl 1.:1 ... liaqu(' ll'Illp~rature ct c'est la moyenne des
résullah i:-;:-iu.s tk:-; 11"1':' "':'ri\\..,s ,!';.:",,;,i:-; qui l'sl pl"ésclI\\0~ clans les différents
table~ll1x..
Ainsi dnnc. 324 l"'\\110rielll\\.::-; ;lll loral Ol\\[ été r~alisées pour notre étude
afin de g~lr~lIl\\ir la lï~lhilil0 d~ 11<>.'\\ r~sllllais
144
8.111.5.2 • AU \\lVEAU DES ANALYSES
Au cours de notre étude, d'autres paramètres importants en fermentation
alcoolique auraient dû être analysés:
- la croissance cellulaire ou la biomasse par spectrophotomètrie
- et surtout le degré alcool ique par chromatographie en phase gazeuse.
Mais le nombre d'~lllalvse aurait été considérablement alourdi. Nous
recommandons alors de réaliser ces analyses avec les 6 souches les plus
performantes de nos e~~:tis pour UIlC étude plus approfondie de la fermentation
alcoolique du jus de rÔllicr.
B.lII.5.3 - AU \\ïVEAU DES CULTURES CELLULAIRES
Le fail que II~)U:- .<;,\\llb \\..'lhi.'11l\\..'11Cé les substrats etc fermentations par des
inocululllS l'lmtell:tnl t·i;!!":.: 3 ct 2() x 107 cellules par ml, pose le problème d'un
écart probable CIlI re k~ cnllCt.'llll·~11 ions iniliales en biomasse de l'inoculum.
Alors que nous dC\\'dih :Ivoi r lille concentration initiale en biomasse,
rigoureusemcnt idcllli,[uL' pllr Ioules les cultures. Cet écart pourrait être
relativisé aux résultal~ ,;htCIlUS ("\\:tu classement des souches.
Bien ljue ccl:i Jl~·.~'....."il\\..' ~k." volLlllles plus imponants, et l'emploi de
fermentclll", nous 1\\.'C\\JIL.ll:llldo:l.-; 1:1 r~alis:llioJl de précuttures successives avant
les ellSel1lcncclllCl\\ls, 1:1 f:lihL.:~sl.' remarquable des productivités et des
rendemC'llts POU\\'~1111 t'l!.' 1i0~ :l LI p:lll\\' l'cté clu 111 ilieu r~rm~ntaire en nutriments
des tests :"lur milil'u\\ ,ïlricllis <~I\\'L'I'('l1t indispcnsables pour une meilleure
éva luat ion (h.·s pC' rfo 111:::.: ,'~' s ~ks ,; \\luches.
.
,
.
.
.
..
~,
.
.... _ .••.. _.. :...•• __:-...... ~_ .... ~~...:oo:."_, .•\\, ...._. . . . . . .~
145
8.111.5.4
AU NIVEAU DES RESULTATS
Une analyse stati:-::ique aurait due également être faite afin de détenniner
l'existence éventue Ile d'une cl i fférence signi ficative ou non entre les
rendements el les prodL::tivités obtenues avec les souches testées.
Mais, compte tenu des par~lInèlres cie cette étude : 12 souches, 3
températures, 3 conc..:ntrations : le nombre d'élément à intégrer était
considérable et la cOI1c;:ption d'ull programme informatique de traitement de
ces données s'est avé:-5c diftïcik à obtcnir malgré nos contacts dans ce
domaine.
Pour les travaux ultér:~urs. nOliS recommandons le recours à un spécialiste
pour une analyse stati.-;[l.:uc plus fille des résultats.
146
B.IV - CONCLUSION E~r PERSPECTIVES
Nos recherches C:H porté sur la fermentation alcoolique du jus de rônier,
jusqu'à nos jours mécl :1llLl, par une dizaine de souches de levures.
Principalemelll .lxée sur l'influence de la température et de la
concentration du SU]:':C:!I.
l'uhj-:l'lit" cie ce ln.IVail était de détenniner les
paramètres phYSÎljLlè~. ,:hiI11Îljli\\..':- \\.'1 l11icrobil)lügiqlles les plus indiqués pour
une produclÎI)11 illdlh[j..'lL.· ~!'-~lkii;()l.
Au termc clc Cèl\\~' ;lllde. 1101l'; PI)l1VOllS faire les constatations suivantes:
- k jus cie rÔllil'r "LI pl-I n:llurd est fermentescible sans rajout d'éléments
minéraux \\.)U ck f:lcl ...:lI;', de crois~:illr\\.'.
- les v:lri:llilll1'\\ ~k- :111:! ,~\\I, .1.) Cl ,-;rc restellt faibles et ce, quelle que
soit la CI.Hl.....,,·lllr:tti,JlI t: :<,,' ...'11';,: .'i\\'-\\ .lCi[:ll1X.
- la ['~'l11p0":lrllrC :, '\\.·,:IC"L·lbihk'I11l'111 I:t consommation de sucres totaux,
ainsi que b prudul.·( iUI~ ;:llJ:llh,],
.
_.ïil[l,·;-,,;'_iï,·
,'\\I.'111hk
l'[I\\:
Lill
Ltct~lIr activateur des
'
S \\i~t'.. ll1'·....
'[" \\, l, '\\"
'"
.. J~" \\".
' " . , . . . . . . . ' •.• ~,.
.:,_'l' ,'" .. ,: I.Ltll'o il' !'UIIUiulllh..'ll1l·nt du métabolisme
fernlcllt:t i :':
- l.u r.-;q u~' k' \\~. '\\<;:
,ill! ,-'(I~L!llil" :1\\'èC des jus CUlltèl1~ll1t 200 g/1 et 150 g/1
de SUl'!'L':,> l(I::lll". 1.1li :; ,- .lli.·"I:,,'111 LI Slllll"l1è I\\.'sl~e I:t la température de
:-:t[:Ul:
,':1
"lil'I't.'
r:-"idllcl rè'i[e très élevée. Elle est
L •• ' ' • ',' ,.,.
l' '1'" .
.. \\.. .\\ 1., .. ~ l ;'"- ....
\\.., '-
,lllil-,:: ';::, Il,' l':lil gll ...·Iï\\.' dL' dout~. L'inhibition des
l
'-
réactiull" l1:ir k_,..,ui ).::
~'l :l:~, ;,', pr'ltlllih Il'l'Il1ÎI1:tll\\ ~lpparaît donc comme
lin éI011l\\.:lll J-':(\\..'lîli:IL,,;
1\\:-- 1....· ,'", ...·....·:--\\ll\\ lk knllCI1I:lliul1.
147
- Avec des jus contenant 100 g/l de sucres totaux, les plus forts
pourcentages de suére consommé sont observés ; Cependant le substrat n'est
pas épuisé et la production d'éthanol reste moyenne voire faible.
- Le calcul des rendements et des productivités pennet l'évaluation des
perfonnances des souches de levure, ainsi que leur classement. Ainsi, les hauts
rendements en éthanol proviennent des essais réalisés à 37 0 C et avec une
concentration initiale en sucre de 100 g/l et 150 g/l.
-
La souche Saccharomyces STV 89 est la plus perfonnante en
fennentation alcoolique du jus de rônier et sélectionnée dans nos meilleurs
conditions d'expérimentation avec un rendement de 86,03 %.
- Les souches Candida guilliennondii (RAK. 90) et Saccharomyces
Kyokaï-7 classées parmi les 6 premières (tableau 43) possèdent néanmoins des
perfonnances moyennes intéressantes qui pennettent d'envisager leur emploi
pour la fennentation alcoolique du jus de rônier.
- Le temps de fennentation trop long, semble réduire considérablement
les valeurs des productivités. Les facteurs inhibiteurs et la pauvreté du milieu
fennentaire (3 % de protéines) seraient sans doute à l'origine de la faiblesse
des rendements.
Bien qu'il ne soit pas possible d'affinner, avec certitude absolue, les
meilleurs paramètres physiques, chimiques et microbiologiques pour la
fennentation alcoolique du jus de rônier, à l'issue de nos essais et dans nos
conditions expérimentales, nous pouvons toutefois dire que:
1°)
la température favorable est 37 oC,
2°)
la concentration initiale du substrat la plus indiquée est de 100 g/l
de sucres totaux,
3°)
les souches sélectionnées, Saccharomycès STV 89 et Candida
gy.illiermondii (RAK 90) ont les plus hauts rendements.
L'objectif général et les objectifs spécifiques de notre travail ont donc été
atteints
148
Cependant, il semble que les limites des potentialités des souches testées ne
soient pas attein~es. Nos travaux mériteraient donc d'être poursuivis dans le but
d'améliorer nos ;endements et productivités.
L'étude d'autres paramètres qui contrôlent le métabolisme de la
fennentation, pourrait alors être envisagée notamment:
- les nutriments
- l'oxygène
- les facteurs d'inhibition (substrat, éthanol, C02)
- la vitesse d'tLgitation.
l
•
lB JlJB11IICO) CGIR&IPIHIIIml
149
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LES LEVURES
Le mot levure, selon PHAFF et coll. (1968) provient du mot latin
"LEVARE" qui se traduit par lever. Ce mot a été appliqué aux levures en raison
de l'aptitude de ces microorganismes à produire du gaz carbonique (CO 2)
pendant la fermentation et à lever la surface mousseuse d'un milieu liquide de
fennentation.
Nous avons consacré un chapitre à ces microorganismes à cause de leur
utilité dans l'industrie alimentaire et l'industrie des fermentations.
TI est difficile de donner une définition simple et précise du terme
"LEVURE", car il recouvre un groupe hétérogène de champignons.
Les auteurs s'accordent cependant pour le's defmir comme des
champignons microscopiques qui, à un stade de leur cycle biologique, se
présentent sous une forme unicellulaire et se multipliant par scissiparité pour
quelques uns et par bourgeonnement pour la plupart.
Il faut noter égajement rexistence de fonnes plus complexes (champignons
levuriformes) .Ce groupe comporte 60 genres et 500 espèces.
Dans la nature. lèS lt:nm~s vont se trouver principalement sur les végétaux
riches en sucres directement assimilables. Elles pourront se développer
particulièrement au !!i'. ':.aIJ d~':.' bl~ ...surt's et des cicatrices qui laissent écouler du
•
1
jU:; ~ucre.
Dépounu èe :L:_rophyiIe. It:'s levures se nourissent par absorption de
-:;ub:<:mces très di"'I;::-'i:~ Ct: ~(H1t dt:::- ~0.pr()ph)1eS et quelquefois des parasites, le
plus souvent inoffensifs.
Cependant, lorsque des conditions favo'rables se présentent dans
l'organisme hôte, elles 50nt capables de causer dans le règne animal, de
nombreuses pathologies dont s'occupe la mycologie médicale et dans le règne
\\t~gétal, la phytopathologie.
Les levures sont très utilisées dans l'industrie, compte tenu de Jeuï5
possibilités métaboliques. Les applications les plus connues sont sans doute.
depuis l'antiquité.
a) - la fabrication des boissons alcooliques d'un goût sucré,
b) - la production d'alcool industriel,
c) - sans oublier la fabrication du pain quotidien.
De nos jours, elles sont de plus en plus employées pour la production de
composés organiques tels le glycérol, les lipides, les protéines de haute qualité et
même des composés plus nobles comme les enzymes. le vitamines, les
nucléotides...
Récemment, plusieurs espèces ont faits l'objet d'innombrables travaux de
recherches biotechnologiques, notamment génétiques pour les sélectionner et les
rendre plus performantes et utiles.
Tout ceci pour donner aux aliments, des qualités nutritionnelles meilleures,
et développer de nouveaux produits.
Les levures peuvent être classées en 7 catégories:
1 - levures de boulangerie
2 - levure5 de brasserie
3 . l~\\'ures de \\ inification
~ - lt.~\\urc:::; de clistilh:de et des spiritieux
5 - h~\\·ures ces ai iments
L'étude de ia 5ysrématique se reÎère à d'autres classifications.
2
2 - CLASSIFICATION ET POSITION SYSTEMATIQUE
La capacité des levures de former des spores d~origine sexuée, dans un
asque ou à les produire à l'extérieur sur des basides, permet de les .placer
respectivement dans la classe des Ascomycètes et dans celle des Basidiomycètes.
Les espèces pour lesquelles le stade sexué (stade imparfait) n'est pas connu,
sont regroupées dans la classe des champignons imparfaits ou Deuteromycètes
Ainsi, les levures sont des champignons qui se reproduisent aseA"Uellement
par des blastospores et sexuellement par des basidiospores ou des ascospores et
qui fennentent les sucres avec dégagement de CO 2 dans la majorité des espèces.
Certains auteurs modernes ont tendance à considérer les champignons
comme constituant un règne particulier: LE REGNUM
FUNGORUM.
Malgré ces allégations, les levures ou champignons microscopiques sont
classiquement rangées parmi les végétaux principalement les thallophytes.
D'un point de vue taxonomique, la distinction des 60 genres qui composent
les levures repose essentiellement sur :
- les caractéristiques culturaux
- les caractéristiques morphologiques des cellules végétatives et des spores.
- les caractéristiques de la reproduction.
Tandis que la séparation des 500 espèces est principalement faite à partir
des critères physiologiques et biochimiques à savoir:
- l"utilis:ltion des composés carboné~. des glucides (sucres) et des composés
azûtés
- la croissance normale et éie\\'~e sur milieu yitaminé. milieu à haute
pression osmotique.
et d~ pigment
- l"hydrolyse de 1"urée, la liquéfaction de la gelatine.
- la résistance à rAetidione cycloheximide.
3 _ _- - - - - - - - - - - -
-
-
,.._ ... ::.-i""~~_""~
TABLeAU-A : CLAS~lfLCJ\\TION DES LEVURES DA~~
LES EJJMY-C~LES
CLASSES, SOUS CLASSE ET
FAMILLES
ORDRE
a Ascomvcètes
Sous a Ascomvcètes
Ordre Endomycétales
Spennophthoraceae
Saccharomycetaceae
a Basidiomycète
Sous a Ustilaginales
rliobasidiaceae
Levure formant des teliospores
Sous a Tremellales
Sirobasidiaceae
Tremellaceae
a Deuteromycètes
Sous a Blastomycètes
Cryptococcaceae
Sporobolornvcetaceae
La classification des levures présentées par LODDER (19ïO) dans
«THE YEASTS »
fut un progrès dans rétude de la systématique de ces
champignons par rapport à la c!o.ssification de LODDER er KREGER·VA;\\i RIJ
(1952) «
THE YEASTS "--. mais elle Il'~tait pas facile à süivre.
Lâ- cbssitication de réf'~'rt;nce actueIlt:[[,;n' po:.: r ks !t:\\ url." 8.prl?s celle de
LODDE r) (19-:0) qu; ... SUbI' --J';rr;",,,,-t"nts ..<, ...... ', ... ;,->,...,.,.,', ,,.-' ,~<"ile de KREGEiI
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ge:1res con~ti~uams C'~ group~> ~~.-, :T:c~l'org:mi':""':e·.
4
TABLEAU JI: CLASSIFICATION DES LEVURES ASCOSPOROGENES
FAMILLES &
GENRES
GENRES
SIFAMILLES
Famille Spermophthoraceae
Coccidia...~us
Nematûspora
Metschnikowia
Famille Saccharornycetaceae
Sous Famille
Schizosaccharonnyces
Schizosaccharornvcetoideae
SlFamille Nadsonioideae
Hanseniaspora
Nadsonia
Saccharomycodes
Wickerhamia
SlFamille Lipomycetoideae
Lipomyces
S/Fam. Saccharomycetoideae Arnbrosiozyma
Pachysolen
Arthroascus
Pachyticospora
Citeromyces
Pichia
Clavispora
Saccharomyces
Cyniclomyces
Saccharomycopsis
DebarVûtn\\-ces
Schwaniomyces
Oekkera
Sporopachl/dermia
Guilli~l1nûndella
Stephanoascus
Han~nula
Toru!aspora
lssatchenkia
\\\\ïckerhamiëlla
Klu~'''e!''om,"ces
\\\\'imzea
!Lodçjt:fümyù~5
: lygo:S.:iccharomvces
5
,
FA\\1IlLES
GENRES
,
Filobasidiaceae
Chionosphaera
rOI
b
"d" Il
1'-îIO aSI
le e
FiIobasidium
Levures formant des tdiospores
Leucosporidium
Rhodosporidium
1
Sporidiobolus
Sirobasidiaceae
Fibulobasidium
Sirobasidium
Tremellaceae
Goltennannia
Tremella
TABLEAU 0: CLASSIFICATION DES LEVURES IMPARFAITES
FAMILLES
GENRES
GENRES
Crvptococcact:'8e
Aciculo.:onidium
Rhodotoru!a
13 rdiilî1ùln vces
Sarcinüsporon
1t
1C~u1did~1
Sel, izo ~!astosporion
Cr.i.1JtocoL\\.'US
Sh:rignîatomyCl's
1
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6
3 - LES CARACTERES CULTURAUX, 'MORPHOLOGIQUES
ET STRUCTURAUX
3.1 - Les caractères cultu_raux
Les levures poussent à l'étuve en 48 à 72 heures à 30° C en milieu liquide
et sur milieu solide.
- La croissance en milieu liquide peut être effectuée sur:
* -milieu à rextrait de malt (2 % liquide) ou
1
* - milieu glucose - extrait de malt - peptone
La formation de sédiment au fond du tube, une pellicule en surface et la
formation de gaz peuvent être observées après 2 à 3 jours d'incubation..
- La croissance sur milieu solide peut être effectuée sur les mêmes milieux
que précedemment, gelosés à 2 % ou sur milieu YM (Yeast Morphologique,
AGAR, DIFCQ) conditionnés en boîte de pétri ou en tube incliné.
L'ensemencement se fait en strie ou par épuisement.
Il est souvent difficile de différencier, après culture sur milieu gelosé, les
colonies de levures.
Toutefois, l'observation de la culture pennet de définir:
* - la taille des colonies
'" - ta forme (contours nets ou irréguliers. concaves ou con\\'exes)
* - raspect (mat ou brillant)
'" - la pigmentation
'"' - la texture ( lisse, ruguell~t'. muqueuse. membranl:"use)
S"r ICC:
-1- l'\\. nelo ~,,- l'J"~ ;.-lll''\\'~- """!on;es S"'1 t hl1m;'~a, . ne'ne""
....
l .., ml.le "\\. El 1 S .."
, .I
1
' t d
ll.;.~
III
". ,
,
é::
a em~nl
~
couleur crème ou blanchfttrt:: et peu lulsiJ.nks. C(:rtaines colonies deviennelii
sèches et ridées avec ïâge ; d'autres ne changent pas d·aspect. Toutes ces colonies
dégagent souvent une odeur dite de "levure W •
7
"-- - . ~_.... --',,",
, ; - - '
-.-"."'.---
Devant les difficultés de différenciation et d'Identification des levures, il
faut faire des exam~ns microscopiques pour confmnation, la coloration de Gram
est la plus utilisée.
3.2 - CaractëreslIlorp-b_Ql9giques des cellules v~étatives
au microsc.QRe .9ptique à fond clair
• -1;':
A partir des colonies isolées,
des frottis sont réaJisés sur lame et
l'~bservation à l'état frais permet la mise en évidence de certains caractères.
. i
of
;
1
Toutefois les caractères morphologiques sont mieux appréciés après
coloration (Gram) :
-la fonne (spherique. ovoide, allongée, particulière)
-la taille .
- le mode de reproduction végétative
* - scissiparité ou
• - bourgeonnement (nombre et position du ou des bourgeons sur la cellule
mère)
- l'aptitude 3 la filamentation ou blastèse. La bordure de la cellule est
exa~inée si la leyurf filamfnteuse, la natür~ du mycelium (pseudomycelium ou
mycelium vrai), son abondance et sa ramification sont notées:
l'apt'tude ~ :" .~hl.>....,.·,4
.J t·",
-
1
l~
osporu
' -
dvn.
- les formes \\ égétatin~s des ievures sont généralement sphériques.
arrondies ou ovoidt;'~ et dQt~es d'tm seul bourgeon (unipolaire) sauf de rare cas
où il existe un au::--.: büurg~on (bipolaire;. Parfois. l'on nete la présence de
,
formes pal'ticulièî b
plü::- :,p~cifique:)
: ogivales (Dek.~LL~), triangu~aire
(TrigQn9.psis) et àes :o:mes J"avocat ou de cit;-on (Hansenia).
8
- les levures ont une taille qui va de 1 à 10 microns de large sur 2 à 50
microns
- chez certaines levures, les cellules peuvent, après bourgeonnement, rester
liées les unes aux autres et constituer ainsi une chaine de cellules appelée
pseudomycelium plus ou moins differencié suÎ\\'-ant les genres et les esp~es
(Can_dida~Pichi~. Dans certaines conditions. d'autres levures peuvent produire
u~ mycelium caractéristique des champignons tilamenteux comportant des
èloisons transversales ou Septa et présentant une croissance apicale (Iri~ron)
...""1'•
1
3.3 - Caractères morphologiques au microscope électronique
et caractéristiques biochimiques
Le miçroscope électronique permet l'étude plus approfondie de la
structure cellula~e des levures qui est, avant tout, de type eucaryote mais
dépourvue de système photosynthétique.
La cellule typique est constituée d'une paroi, d'un cytoplasme contenant
des vacuoles, des granulations métachromatiques, des globules (souvent d'acides
gras) et un noyau.
La paroi c}1oplasmique épaisse et rigide est surtout caractérisée par la
présence dans sa constitution de deux polysaccharides : mannane et glucane.
Certaines levures produisent une capsule composée de phosphomannanes
ou d'hétéropolysaccharides. L'on note également la présence de protéine
enzymatique telle que t'invertase qui va potentialiser l'activité physiologique
notamment rassimilation de sucre plus variée.
Au r.i\\'eau de la paroi. il existe une petite zone qui renferme de la chitine
et qui est appelée cicatrice du bourgeon.
Le cytoplasme et le noyau
Le c,}1oplasme est relativement dense avec ses vacuoles, ses granulations,
ses globules ses mitochondries, son nucleole, et son noyau,
Le noyau y est entouré d'une membrane qui persiste pendant la division
cellulaire. Le nombre de chromosomes est variable suivant les genres :
Saccharomyces 17, Hansenula 2.
.. Notons pour terminer, que les levures ne sont pas mobiles.
.
..,.;
1
4 - LES CARACTERISTIQUES PHYSIOLOGIQUES
4.1 - La nutrition et les facteurs de croissance
Les levures étant dépourvues de chlorophylle sont incapables de produire
les composés organiques necéssaire à leur croissancè à partir de substrats
minéraux comme le font les végétaux supérieurs, les algues et quelques bactéries.
Elles sont donc des saprophytes et quelquefois des parasites.
Pour leur croissance, elles ont besoin d'oxygène de sources organiques de
carbone, d'azote minéral ou organique de divers minéraux, d'une température et
d'un potentiel hydrogène adéquat.
Certaines d'entre elles ont également besoin d'une ou plusieurs vitamines
(thiamine~ biotine. inositoL acide pantothénique ... ) et d'élUtres facteurs de
Cf01 ssa nce .
~. J A - L.J t~rmt:ntatiol1 des suçre~ (glucides)'
Les )e\\ U;"è::: Uli!!'5t_'nt fn~qUt~n:rr1t'nl li:.''- <-,ucres eLsonl dt.'lh' irnpli(;'-'é~s dans
r.-,,- "'-"O,i,,;,c
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10
r
4.1.8 - L'assimilation de substrats carbonés
Les levures utilisent de nombreux substrats carbonés. Cette utilisation est
réalisée soit par voie oxydative (Cryptococcus rhodotorulae) qui conduit à la
formation eau (H:O) et de gaz carbonique (CÛ2) ; soit pour la plupart des
levures, par un métabolisme fermentaire (anaerobie) après la phase' de
démarrage de la croissance (aerobie) conduisant à la production d'éthanol et de
gaz carbonique (COl) .Les composés carbonés assimilables sont:
".
'. - les hexoses (glucose, fructose, galactose)
ot
,
- les pentoses (xylose, arabinose, ribose, rhamnose)
1
- les disaccharides (saccharose, lactose, maltose, melibiose, tréhalose)
-les polysaccharides (raffmose, melezitose)
-les alcools (ethanol, glycerol, sorbitol, inositol)
-les acides organiques (acide lactique, acide pyruvique)
Les deux derniers groupes de composés sont utilisés par les levures
oxydatives.
Ces composés carbonés procurent aux levures. à la fois, une source de
carbo~e et lDle source d'énergie.
4.1.C - Assimilation de s.Ql~rs:~_az~tées
.. Les produits azotés utilisés peuvent être des composés simples comme
l'azote minéral, l'ammoniaque, l'urée, les nitrates ou des composés plus
complexes comme les acides aminés et les polypeptides.
La température de croissance est com prise entre ~ 5: C et + 3j'êC. L3
vaJ~ur optimale se 5!t,-~ant t:'ntre - 25 d
-
30 C .-:Ud\\ ,;nt \\ ':[5 ' 2~'-' C. LJ.
Dans certains cas. la multipliwtion \\~g0tati\\'e a encore lieu \\'ers 0; C mais
le taux de croissance reste faible.
t t
4.1.E • L'influence du potentiel hydrogène (pH)
Les levures se multiplient bien en milieu acide (pH 4~0 à 4,5), l'optimum
de pH pour leur croissance varie de 4,5 à 6,5.
.
l\\tfais, elles peuvent s'adapter à un milieu plus acide ou plus alcalin ;'en
effet, certaines espèces tolèrent de grandes variations de pH et peuvent encore se
d~velopper à pH 2,8-3,0 et à pH 8,0 - 8,5.
.. 4.2 - La reproduction
•
r
"1-
\\
1
Les levures se multiplient par un processus asexué (mitose) qui s'effectue
par bourgeonnement dans la plupart des cas ou par scissiparité pour quelques
espèces.
Certaines ~spèces de levure présentent cependant des phénomènes de
reproduction sexuée avec alternance d'une phase haploïde et d'une phase
diploïde.
4.2A • La reproduction asexuée ou végétative
- par bourgeonnement :
Pendant la fonnation des bourgeons, le cytoplasme des bourgeons reste uni
i
à celui des cellules mères. Le noyau de la cellule mère grossit et se déplace vers
le bourgeon, la membrane nucléaire divise le noyau en deux. Une moitié du
...
noyau s'installe dans la cellule mère et rautre moitié du noyau dans le cellule
tille. La membrane nucléaire se renferme alors autour d(-' chaqu:e noyau et deux
cellules identiques sont ainsi formées.
Le mode de bourgeonnement est en général unipolaire comme chez les
Klof.d~.~nl ou bipolaire.. U peut ~tre égah:ment ml)ltipl)~21.;re ('l)mme chez les
Debaryomyces ou aux trois sommets d"un triangle comme chez les l rigonopsis
12
- Par scissiparité:
../~
Deux genres de levures se reproduisent végétativement et exclusivement
par fusion et scission. Dans ce cas, la reproduction est réalisée par la formation
de septa sans retrécissement de la paroi. A la fin de ce processus, le septum
divise les deux cellules qui se séparent.
r.p
- La lilamentation :
. '.
Parfois les bourgeons ne se détachent pas, mais restent attachés à la cellule
..·fIlère. narrive ainsi que les cellules fùles bourgeonnent àleur tour. Dans ce cas,
ûne chaine de cellules appelée Pseudomycelium de forme variable se développe.
- Dans certains cas,1a cellule mère est identique à la cellule fille.
Dans d'autres cas, la cellule mère s'allonge et les bourgeons fonnent un
amas de cellules attachées autour de la cellule allongée.
- Dans des situations différentes, la cellule fille s'allonge également pour
donner naissance à d'autres cellules filles. On a alors des Blastospores ou un
appareil sporifère.
. Certaines levures présentent des phénomènes de reproduction' sexuée. On
assiste alors à la conjugaison ou à la fusion de deux cellules de signe opposé;
celle-ci donne naissa:ice à un zygote.
Après differenciation et méiose. un asque renfermant 4 ~~ç.Qspor_es
haploides se forme C::èZ les :\\5comycetés : tandis que chez lc..:~ BasjdiYlJ1yçe,tes, ce
sont de spores exter=:es ou basidiospores qui apparaissent. La sporulation est un
phénomène import:i."lt I:ar t_'l!e o!Tre la l'os~ibiiit~ aux Ir:\\ .i!'"es de se multiplier
,.l ans de" "'O"dl't;O"'S '-:e'f \\·o~ .... bl...c d'" tomp';r'1t" ..~ ,.le f·" ' ~ ... t ..'1t;on en OX\\'gc'n'"
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""
" " ' V l l
ll\\-I'-.&.
&
..
" ' .
de sources de carbof.':. d·J.7.ote d de vitamine déficientes.
13
Elle o!fre en plu,:" la possibilitë d':l.pp!iquer à ces germes, les techniques de
sélection génétique très utilisées en biotechnologie. .
La sporulation est également un critère de base dans la distinction des
genres (KREGER 1984).
Afin de mettre en évidence le plus sûrement possible cette reproduction
sexuée chez les le'ures, ascosporQgène~ plusieurs milieux spécifiques sbnt
utilisés simultanément. Les plus courament employés sont:
a) - le milieu de ~1ac Clary + le milieu de Fowells,
"
.
.-:-
"
b) - le milieu de Gorod Kowa + le milieu V8 ou YM agar.
!
Des préparations microscopiques sont ensuite effectuées entre lame et
lamelle et l'on note alors:
- la fonne des asques
- la facilité de rupture
-le nombre erla forme des ascospores
- la position dans rasque des ascospores.
5 - ISOLEMENT ET DET_ECTION
L'isolement des leuvres totales ou des levures parmi une flore bacterienne,
pour leur d·inombrement. peut être r.§.alis~ par différentes méthodes,
~lais il s'agit principalement de :
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Plusieurs milieux sont courament employés dans le domaine alimentaire
pour mettre en évidence les levures au sein d'urie population microbienne
hétérogène; ce sont principalement:
- le milieu de sabouraud gelosé ou chloramphénicol avec actidione
- le milieu ox:.1etracycline, glucose, gélosé (OGA)
- le milieu "Pomme de Terre", glucose, gélosé (PDA)
- le milieu à l'extrait de levure, glucosé gelosé
- le milieu au moût de bière, gelosé.
..
Ces milieux sont rendus sélectifs vis à vis de nombreuses bactéries par
~cidificationà pH 4 ou 3,5.
!
Toutefois cette sélectivité est sans effet sur les bactéries acidophiles et sur
les moisissures.
Dans ce cas, seuls des antibiotiques tels que le chloramphenicol,
l'oxytétracycline peuvent inhiber le développement des bactéries.
Pour séparer les levures des moisissures, il est possible d'utiliser des
antifongiques connus comme : l'actidione (qui permet l'élimination des
champignons saprophytes), le propionate de sodium ou de calcium ou l'acide
sorbique
Le dénombrement est essentiellement orienté vers les colonies crème uses.
blanches et peu luisantes caractéristiques, après une vérification de là nature de
(ûlonies par un examen microscopique.
Ct~~ méthodes dïs.olement et de dénombrement ~lJr milieux sélectifs ont
cependant ilnccnvénient de nécessiter un temps d"incubation et donc une réponse
tardivè.
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Notons qu'il e.\\:~~c::' trois technique simples èt rapides de détectio'1 de levu:€'
pouvant répondre aux contraintes temporelles, ce sont:
- la bioluminescence
- l'impédance
- la radiométrie
5-1 - La Bioluminescence
Technique fondée sur le dosage de l'ATP par le biais du complexe
luciférine (pigment), luciferase (enzyme) et applicable à la détection des levures
dans les jus de fruits pulpeux
- ! 2
3
Le seuil de sensibilité étant de l"ordre de 10 g d'ATP soit 10 cell:IIes /ml
avec une correlation linéaire entre le nombre de cellules et teneur en ATP
5.2 - L~impédanc~
Sa mesure cùmpJ.;'cè ct Ull témoin :'ikrilè lkl met de détecter ütk activire
microbienne caractéri~~e par un changement de l.1 résistance en courant continu
du milieu.
Le seuil de détection est de l'ordre de 10 cdlules/ml réalisable dans le jus
J'orange et dans les mébnges de fruits pour yaourt
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5.3 - .la,. raJiorrùri...?
La méthode ei.lployée repose sur la mesure du C02 dégagé lors de la
respiration ou de la ft:rmentation microbienne de substrats glucidiques marquées
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:~C et incorporés au milieu de culture.
Ce signa! est J.mp!ifié par la multip!ic3.tior. cdlubire suivant une loi
èxponentielle en fancir"ÏI du kmps (\\-1AFART d BOlJRGOIS, 1985).
Le seuil de de_~ction est de l'ordre de 10
cel!ules Iml applicable en
brasserie et dans les jus d·orange.
L'identification ne peut être effectuée que sur une souche en culture pure.
préalablement isolée sur un milieu gelosé.
Une identitlcation de souche pure est essentiellement concernée par
l'examen et la détermination de ses caractéristiques qui sont ensuite comparées
aux descriptions standards des espèces connues.
Les caractéristiques sont d'ordre morphologique, physiologique et
biochimique.
Pour les espècE~ sporogènes. cenains aspects du cycle sexué som pris en
(·ompte.
La plupart de:' ·~..î(J(Îères sont d(.t'i(I!::- fOi:! k It:~ijii;).r J'un kSi f='<lïtit:uiiè!-
d.lllS des conditior:s :S~:-:·:k_nent sl~lld;lrd:::(~:<
1 t::, m~thüdL'~ lJtir";·.t·,
.;~ ·:·:-]",,1-"1:('-;:;;'" ':l .\\,_. L,:, :,iiïtr:t:-" i dt.::' ;'_'''I:lli',lll:-:
biochimiques plu~ 'c!::_:.~·:l:L;'~~~. [L,il:; (iL:. i,. c. !);'lC~;':(;:; c: r>t:-s dL' :-'\\ii\\. Ït
. '~. : ' .': '.. ,
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'YEASTS" ~ité par LfiUULk. l jt)7l);,.
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Actuellement. les recherches vont dans le sèns d'une simplication et le
nombre de compo5~ carbonés a été ainsi ramené à 18 (KREGER, Coll, 1"983) .
La reproduction sexuée est à la base de la distinction des genres: mais elle
est peu utilisée au ~iveau des espèces. ~~EGER (l98~) propose un schema
dïdentific2.tiol1 de ~:~ plupart des espèces reposant sur plusieurs types de crit~res
tels que:
- Les critères morphologiques comportant {"examen en détail du mode
de reproduction vegétative, de la morphologie cellulaire. de la formation de
pseudomycelium, et de mycelium.
•
- les critères biochimiques indiquant:
* - l'aptitude à la fennentation des sucres ou zymogramme : glucose,
galactose. saccharose, maltose, lactose et raffinose
* - l'aptitude a la croissance sur 18 substrats carbonés ou Auxanogramme
- pentoses: D-xylose, L-arabinose, D-Ribose, L-Rhamnose
- hexoses: D-galactose
- disaccharides: Saccharose, maltose. cellobiose, tréhalose,
lactose
- :risaccharides :
- ;Joiysaccharides : amidon
- <ooh : é!thritl)l. ril:lito!. !J-rnannit(..1. i!1f)'sitol. éthanol
:::::des orgnn iQues : 3c]de succinique .. 3.c:t!e citriqu·e.
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PiïU\\ïque. lactlqut:
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18
La C('!!1;':':1:·3.~;,_:, dr.:'s resu!tats dt..', di\\'ers tests aux descriptions des espècr.:'s
connues peut-ëtre ccnduite par divers moyens aHan't des tableaux et des clés à
l'utilisation de l'informatique.
Il faut souIignd l'intérêt de l'ouvrage de BAfu'JETf et Coll (1983) qui
propose dans ce dcr;:;:;,ine, une clé dïdentification des levures liées aux aliments
ayec 35 tests et liœ~ ail jus de fruits avec 18 test5 physiologiques d biochimiques.
LïdentificatioE des levures nécessite donc un nombre important de tests:
ce qui exige un long.travail.
Actueliement. des dispositifs destinés à ridentification des levures en
milieu hospitalier et !~ur emploi peut-être adapté facilement à lïdentiticatioll des
levures des produits al imentaires.
Il s~agit des systèmes d~identification (APl) 20 Cet 20 CAUX.
Le principe est simple ; la galerie API 20 C AUX est constitué de 20
cupules contenant des substrats déshydratés qui permettent d'effectuer 19 tests
d~assimiIation.
Les cupules sont inoculées avec un milieu minimum semi-gelosé et les
levures poussent st:ulement si elles sont capables d'utiliser le substrat
correspondant.
La lecture de ",es ré~ctions se fait par comparaison aux tèmoins de
croissance. La dtf-ter:j-jinatiol1 de l'espè(e est obtenue soit à raid~ des tabh:aux
àïàentificalion àu Cét2.Iogue analFique ou de ia disquene APILAB.
Il existe 3:..r sc; i lt.- système Pasteur qui est constitué d"ur.e gal~ric de -
,-aves et d'unt:- l;lJii.(: .J ; <l!ioglàlilme Pa::-:eUï (Olïtposée de 16 composés (ilrbon<:s
par ïétude de~ C~l,;.·.. tl.:re5 ph,ysioiogiques des levures en vue de ieu r
!d~ntif~cati0n '
19
Compte tenu èc ieurs caractères métaboii~ues. ies leyures sont très t:tiii:.:.ée~
dal1S les indu'Stries ,-,-gri..:oles et alimentaires.
t:appliLafion :a filus (vflliUè ê~t .";[11':, d'.luit: li:1 labriLatiÜ1i..dè bc·i:":'OiiS
aLcoolis~.es par ferr:eilfation : bière. vin. cié"e et autres boissons à p2rtir de
matières premières \\ z'_!'i~es (riz. fruits tropic8.u\\. __ :1
Il Y a égalelnent l<LP!SJ_,;h.LcJjQJ.L(r~Jc-'i_QLij1idicjnal etjl1_d_.1I~triel à partir de
jus ou de mélasses. de betteraves ou de cannes à sucre.
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Par ailleurs, les levures sont directement utilisées en panification pour
faire "lever" Je pain et participent à raffina~~ de certains fr~es.
De plus en plus. les levures sont employé€s pour produire du glycerol. des
lipides, des protéines de haute qualité et des produits plus nobles comme les
enzymes, les vitamines. les nuèléotides...
li est fort probable que leur utilisation pour la fabrication ,de plusieurs de
ces produits atteigne réchelle industrielle dans un proche avenir car plusieurs
espèces font l"objd dïniiom bïables tra'dU\\ de recherche pour la sdectioli de5
pius performantes ç 3.r I"optimisation àe ieUï cuiture àans ies meilieures
conditions.
Cèpendant. la P:"':"-':'!jLè d(·s le ... lif':-:' n-~·'t pJ:'l 'vühditabl~ ddns k·s pr•.)duii:'l
~il'In('l't~'l'res
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D"une façon générale. les produits alimentaires a base de végétaux (fru its"
jus de fruits, légumes, fruits sechés, sirops, confitures.. ) ainsi que les produits
sucrés (confiserie, biscuits, miel.) sont particulièrement sujets à des altérations
par les levures. l\\1ais, d'autres produits peuvent aussi subir un développement
anarchique de levures. D"un point de "lle hygiénique, il n'est donc pas nécessaire
de rechercher les levures dans les produits alimentaires.L'analyse ne peut se faire
seulement que pour éviter les problèmes d'altérations pouvant rendre la quai ité
marchande moins fiable.
L'industriel fabricant des produits susceptibles de subir une altération dûe
~ ,.un développement de ces germes au cours du stockage, doit donc rechercher
"quantitativement et qualitativement les levures aussi bien dans les matières
premières au cours de la fabrication que dans les produits finis afm de mieux
contrôler l'éfficacité des traitements.
C'est ainsi que l'opportunité nous est donnée dans cette étude, d identifier
les levures naturelles du fruit de rônier et de son jus. Une caractérisation
specifique de leurs potentialités technologiques et d'alteration, pourra servir
d'indice d'utilisation ou de prévention.
21
vu et. l\\pprouW
Abidjan, le .... 1992
Le Doyen cle la FAST
Prof. J.K. DIOPOH
Vu et perll1. cS' 1mpl'iBler
Abidjan, le ......... , 1992
Le Reet:euzo
de l'Univer.it4 N.~1Oft.t. de
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