U.F.R. de LARIBOISIERE-SAINT LOUIS
THESE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITE PARIS VII
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Specialité
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'HEMOSTASE - COAGULATION

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pour obtenir le titre de DOCTEUR de L'UNIVERSITE PARIS VII . -'.
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EVALUATION DE LA PARTICIPATION
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DU FACTEUR WILLEBRAND DANS
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LA THROMBOGENESE IN YJYO.
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Président du Jury: G. TOBELEM, Professeur à l'UnÎYersHrde Paris VII
Directeur de Thèse: L. D'ROUET, Professeur à l'Université de Paris ouest
Rapporteurs:
D. MEYER, Professeur à l'Université de Paris XI
Y. LEGRAND, Directeur de Recherche à l'IN'SERM, (UH3} .
Membres:
J.P. MAFFRAND, Directeur de Recherche à la' SANdFI
T. MOHSEN, Professeur 'à l'Universite de Dakar

l
A
Monsieur 1e Professeur Gérard TOBELBM,
Vous avez,
d'emblée,
accepté de juger ce travail sans
aucun à priori. J'espère qu'il sera digne de la confiance que
vous m'avez
accordé.
Vous m'avez
fait
bénéficier de votre
compétence
et
de
vos
connaissances
qui
ont
fait
votre
renommée.
Je
mesure
l'honneur
que
vous
me
faites
en
présidant le Jury de cette thèse.
Soyez
assure
de
ma
reconnaissance
et
de
mon
profond respect.
__ .~.2!&!.

2
A
Monsieur 1e Professeur Ludovic DROUET,
Il me serait difficile d'exprimer en si peu de lignes
toute la générosité et l'amitié que vous m'avez manifestées
et grâce
auxquelles
j'ai pu m'intégrer dans
votre groupe.
Vous n'avez pas hésité à me confier ce sujet très captivant
et d'une grande actualité et vous n'avez ménagé aucun effort
pour me permettre de réaliser ce travail dans les meilleures
conditions.
A chaque instant,
vous avez cherché à me faire
partager
votre
passion
pour
l ' hémostase.
J'espère
que
ce
travail n'est que le début d'une coopération fructueuse et
durable.
Veuillez
trouver
ici
le
témoignage
de
ma
profonde
gratitude et de mon entier dévouement.

3
A
Madame le Professeur Dominique MEYER,
Vous me faites l'honneur d'accepter de juger ce travail
en y apportant vos suggestions avisées et vos critiques fort
judicieuses.
En
très
peu
de
temps,
malgré
vos
nombreuses
préoccupations, vous m'avez apporté soutien et. réconfort qui
ont été très précieux pour que ce travail puisse aboutir.
Soyez
assurée
de
mon
admiration
et
de
ma
profonde gratitude.

4
A
Monsieur Yves LEGRAND,
Vous m'avez accueillie au sein de votre Unité de
Recherche de l'INSERM avec une grande amabilité et une totale
disponibilité.
Grâce
à
votre
soutien
toujours
chaleureux,
j'ai pu réaliser ce travail en toute confiance.
Vous
avez
accepté
de
juger
ce
travail
en
y
apportant
critiques et suggestions avisées.
Veuillez
trouver
ici
l'expression
de
mon
entière
gratitude et de mon respect.

5
A
Monsieur Jean Pierre MAFFRARD,
Vous
avez
pris
une
part
importante
à
la
réalisation
de
ce
travail
en
me
fournissant
le
matériel
scientifique
indispensable
et
vous
me
faites
l'honneur
d'accepter de le juger.
Veuillez
trouver
ici
l'assurance
de
mes
remerciements et de ma profonde gratitude.

6
A
Monsieur 1e Professeur Tahsin MOSSEN,
Sans vous,
ce travail n'aurait pas vu le jour. Votre
aide efficace pour régler des problèmes tant administratifs
que
matériels,
pour
mon
séjour
en
France,
m'a
permis
d'effectuer
ces
travaux
de
recherche
et
vous
avez
su
m'apporter votre soutien inlassable.
J'ai
eu
le
privilège
de
bénéficier
de
vos
cours
de
Physiologie Animale à la Faculté des Sciences de Dakar. Votre
rigueur et votre persévérance pour le travail bien fait ont
suscité en moi le désir et l'enthousiasme de continuer dans
la recherche.
Veuillez
trouver
ici
le
témoignage
de
ma
profonde
gratitude, de mon respect et de mon profond dévouement.

7
A
Monsieur le Professeur Jacques CAEN,
Vous m'avez accueillie sans aucune réserve dans votre
Institut ~Q j'ai trouvé d'excellentes conditions pour mener
à bien les travaux de cette thèse.
Vous me faites l'honneur de vous intéresser à mon
travail
et
votre
appréciation
est
pour
moi
un
grand
réconfort.
Soyez assure de mon profond respect et de toute ma
reconnaissance.

8
Les travaux de cette thèse
ont pu
se
réaliser grâce à
la
collaboration entre:
- Le Ministère de la Coopération du Gouvernement Français
et
le
Ministère
de
la
Coopération
du
Gouvernement
sénégalais
Je tiens particulièrement à remercier le personnel du
Centre
International
des
Etudiants
et
Stagiaires
qui
n'a
ménagé aucun effort pour que mon séjour en France se déroule
dans les meilleures conditions.

9
Les travaux présentés dans cette thèse ont été réalisés
sous la direction de:
Monsieur le Professeur Ludovic DROUET
au
sein
du
Laboratoire
de
Recherche
sur
les
Protéines Adhésives et Protéases des Cellules Vasculaires
et Sanguines de l'Unité 353 de l'INSERM
Directeur Yves Legrand
- et du Laboratoire de Recherche sur la Thrombose
Expérimentale de l'Institut Des Vaisseaux et du Sang
Directeur Jacques CAEN

10
Cette
thèse
est
le
fruit
de
trois
années
de
travail
commun en particulier avec:
Georges PIGNAUD
INSERM Unité 353, Paris
Claire BAL dit SOLLIER
Institut des Vaisseaux et du Sang, Paris
Jonathan MILLER
Suny Health Science
USA
Pierre PERREAULT
Jacques CHENU
Sanofi Recherche, Toulouse
Jean Pierre GIRMA
Bernadette OBERT
INSERM Unité 143, Bicêtre

I l
Je voudrais aussi remercier tous ceux et toutes celles
qui m'ont apporté leur aide et soutien, en particulier:
Elisabeth
SAVARIAU,
qui
a
effectué,
avec
une
grande
générosité,
toute la partie reprographiée de cette thèse
Et tout le personnel de l'IVS, de L'Unité 353 et de l'Unité
348 de l'INSERM.

12
10 INTRODUCTION

13
Dans les conditions physiolog iques normales de circulation,
le sang qui est composé d'un ensemble de systèmes cellulaires
et
moléculaires
potentiellement
actionnables,
circule.
à
l'état
fluide
dans
les
vaisseaux
sanguins
sans
que
les
interactions avec la paroi vasculaire entraînent l'activation
de
ces
systèmes.
La
non-adhésion
des
éléments
figurés
du
sang,
en
particulier
des
plaquettes,
à
la
monocouche
cellulaire qui tapisse la face interne de la paroi vasculaire
est due à une série de processus passifs et actifs dont les
cellules endothéliales qui constituent cette monocouche sont
le
siège.
Mais
lorsque
cette
monocouche
cellulaire
est
détruite,
les
plaquettes
sanguines
viennent
adhérer
aux
structures du sous-endothélium exposées (fibres de collagène
présentes dans la "membrane basale et microfibrilles): c'est
le
début
du
processus
de
formation
d'un
thrombus.
Ce
processus,
similaire à celui qui aboutit à la formation du
clou
hémostatique
qui
colmate
la
brèche
vasculaire
d'un
vaisseau sanguin percé,
fut décrit il y a cent ans
(Hayem
1882).
Mais
ce
n'est
que
récemment
que
les
mécanismes
complexes
de
la
thrombogenèse
ont
commencé
à
être
mieux
connus. En effet, la thrombogenèse est un processus d'autant
plus
complexe
que
la contribution
respective
de
la paroi
vasculaire,
des
plaquettes
et
de
la
coagulation
sanguine
varie selon le type de vaisseau (artère ou veine) dans lequel
se
forme
la
thrombose;
de
même
ces
réactions
surviennent
simultanément tout en s'influençant mutuellement. Cependant,
!'
pour
que
l'adhésion
des
plaquettes
se
fasse,
il
faut
l'intervention d'une protéine adhésive, le facteur Willebrand

14
(vWF),
qui
va
servir
de
"pont"
entre
les
glycoprotéines
spécifiques de la membrane plaquettaire et les constituants
du sous-endothélium. Ensui te, les plaquettes vont s'étaler et
émettre des pseudopodes qui vont permettre l'interpénétration
des
plaquettes
les
unes
aux
autres:
c'est
la
phase
d'agrégation plaquettaire réversible qui sera stimulée par
des
substances
(en particulier
l'ADP et
les
ions
calcium)
libérées à partir des granules des plaquettes déjà activées.
Ce phénomène aboutit à la formation d'un thrombus lâche qui
va
ensuite
se
consolider
à
la
suite
d'une
cascade
d'événements
qui
aboutit
à
l'activation
des
facteurs
de
coagulation.
Les plaquettes qui constituent l'essentiel du
thrombus et d'autres cellules, telles que les leucocytes et
surtout les globules rouges, sont enserrées dans les mailles
du
réseau
de
fibrine
formé
à
partir
du
fibrinogène
plasmatique
sous
l'action
de
la
thrombine:
le
clou
hémostatique est définitivement formé pour colmater la brèche
vasculaire et arrêter le saignement. Une fois que ce résultat
est atteint, le mécanisme de la fibrinolyse se déclenche pour
détruire la fibrine;
d'autres mécanismes vont simultanément
prévenir
la
formation
incontrôlée
de
nouvelles
fibres
de
fibrine.
Si
ce
mécanisme
régulateur
est perturbé,
il
y
a
risque de thrombose
(Chapmann 1965,
Fuster et coll.
1985).
Les
premières
phases
(adhésion,
activation,
sécrétion
et
agrégation) qui ont donné naissance à un thrombus constituent
l'hémostase
primaire,
dont
les
plaquettes
servent
; ':.
d'intermédiaires
entre
les
autres
éléments
sanguins
et
plasmatiques et ceux de la paroi vasculaire.

15
Diff~rents modêles in vitro,
ex
vivo,
et
in
vivo ont ~t~
utilis~s
pour
d~terminer
les
m~canismes
mol~culaires
(cellulaires,
plasmatiques),
les
facteurs
vasculaires
et
hémodynamiques
de
l'adh~sion
et
de
l'agr~gation
plaquettaires. Mais dans tous les cas, i l est d~montr~ que la
participation relative des différents facteurs impliqu~s dans
la thrombogenêse et la plupart de leurs mécanismes d'action
dépendent essentiellement des conditions circulatoires.
L'~tude
syst~matique
de
l'interaction
des
plaquettes
sanguines
avec
la
paroi
vasculaire
devint
largement
accessible
avec
l'introduction
des
chambres
de
perfusion
annulaires (Baumgartner, 1973). Cette chambre est constitu~e
d'une tige centrale sur laquelle un segment vasculaire, dont
l'endothélium
a
ét~ pr~alablement retiré,
est
retourn~ en
doigt de gant et exposé à du sang circulant,
anticoagul~ ou
non,
permettant
d'~tudier
l'adhésion
et
l'agr~gation
plaquettaires dans des conditions de flux bien d~termin~es.
L'accumulation
des
plaquettes
sanguines
sur
la
paroi
vasculaire
est
estim~e
directement
par
morphomêtrie
ou
indirectement
en
utilisant
des
plaquettes
radiomarqu~es
(Baumgartner
et
Haudenshildt,
1972;
Dosne
et
coll.
1976).
Cette
chambre
connut
de
nombreuses
modifications
et
adaptations au cours des ann~es qui aboutirent à une chambre
de perfusion rectangulaire
(Sakariassen et coll.
1983).
Ce
dernier modêle permit d'étudier l'interaction des plaquettes
avec
des
constituants
(plasmatiques
ou
sous-endothéliaux)
purifiés ou des cellules en culture de la paroi vasculaire
(cellules endoth~liales, fibroblastes, etc ... ) ou encore avec

16
la matrice extra-cellulaire de ces cellules
(Sakariassen et
coll.
1983).
C'est
ainsi
que
la
plupart
des
différents
facteurs impliqués dans l'interaction des plaquettes avec la
paroi
vasculaire
commencèrent
à
être
déterminés;
on
y
distingue:
-des facteurs plasmatiques dont le fibrinogène et le vWF
(Tschopp et coll. 1974, Sakariassen et coll. 1979, Meyer et
Baumgartner 1983, Houdijk et coll. 1986),
-des récepteurs de la membrane plaquettaire (Weiss et coll.
1986, Sakariassen et coll. 1986, Nieuwenhuis et coll. 1986,
Lawrence et Gralnick 1987),
-des constituants de la paroi vasculaire
(Dosne et coll.
1976,
Legrand et coll.
1978,
Fauvel et coll.
1983,
Stel et
coll. 1985, Houdijk et Sixma 1985, Sixma et coll. 1987, Rand
et coll.
1986,
1991,
Nievelstein et coll.
1990,
Baruch et
coll. 1991)
-des facteurs hémodynamiques (Turitto et Baumgartner 1975
et
1979,
Baumgartner et
coll.
1980a et b;
Aarts
et coll.
1983, 1984 et 1986).
Cependant
ces
modèles
in
vitro,
chambre
annulaire
de
Baumgartner et
chambre
rectangulaire
de
Sakariassen,
bien
qu'ayant beaucoup contribué à
l'étude des mécanismes de la
thrombogenèse,
ne
reproduisent
que
de
façon
partielle
la
?/
chaîne de réactions complexes qui surviennent au cours de là
thrombogenèse dans
l'organisme intact;
par conséquent,
l~~
résultats
obtenus
peuvent
être
limités
dans
leur
significativité à
l'ensemble spécifique des conditions qui
prévalent dans un système de test particulier. En évitant ces

17
conditions d'artefacts, les modêles in vivo peuvent pr~senter
des
avantages,
compar~s aux modêles in vi tro ou ex vivo.
Toutefois, ces modêles in vivo doivent être assez performants
pour différencier le rôle respectif des diff~rents m~canismes
impliqu~s dans la thrombogenêse.
Comme
nous
venons
de
le
voir,
le
vWF
joue
un
rôle
primordial dans l'initiation des m~canismes qui aboutissent
à la formation du thrombus. Des ~tudes r~centes ont permis de
d~terminer la structure moléculaire du vWF et de ses domaines
fonctionnels
qui
interagissent
avec
ses
récepteurs
plaquettaires et sous-endoth~liaux. Les glycoprot~ines de la
membrane
plaquettaire
lb/IX
(GPlb/IX)
et
lIb/IlIa
(GPllb/llla)
sont
particuliêrement
connues
comme
les
récepteurs plaquettaires qui se lient au vWF pour
induire
respectivement l'adh~sion des plaquettes et leur agr~gation
(Fressinaud et coll. 1991;
Ikeda et coll. 1991). Mais si le
rôle
de
l'axe
GPlb/IX-vWF
est
bien
connu
dans
la
phase
d'adh~sion, son implication dans
la phase d'agr~gation et
dans
la
stabili t~
du
thrombus
commence
seulement
à
être
admise,
le
fibrinogêne
plasmatique
ayant
~t~
longtemps
consid~r~ comme le candidat privilégi~ qui se fixait à la
GPllb/llla pour induire l'agr~gation plaquettaire.
Ces
données
récentes
sur
les
fonctions
du
vWF
dans
la
formation du thrombus suscitent un intérêt grandissant pour
la mise au point de nouvelles molécules antithrombotiques.
Dans cette étude, nous avons tent~ de mettre en ~vidence le
rôle du vWF et particuliêrement celui de l'axe GPlb/IX-vWF
dans la formation du thrombus,
dans des conditions de f+ux

18
artériel.
L'utilisation
d'anticorps
monoclonaux
et
de
peptides est un moyen de disséquer ce rôle relatif. Mais ces
agents doivent être spécifiques aux espèces et le coût pour
obtenir des quantités nécessaires à tester in vivo sur des
animaux de grande taille est élevé. Aussi, le modèle original
sur
lequel
nous
avons
effectué
notre
étude
concerne
une
espèce de petite taille,
le cobaye.
Ce modèle a été mis au
point pour induire un phénomène récurrent thrombotique à la
suite
d'une
désendothélialisation
spécifique
de
l'artère
mésentérique par un laser pulsé à colorant (Drouet et coll.
1986).
Notre étude a été axée sur les effets pharmacologiques:
d'un
peptide
synthétique,
Arg-Gly-Asp-Ser
(RGDS),
séquence appartenant au domaine des protéines adhésives (dont
le vWF) qui se lie au complexe GPllb/llla,
- des fragments F(ab)'2 d'un anticorps monoclonal (PG-l)
dirigé contre la GPlb/IX de cobaye,
- de deux peptides synthétiques
(les séquences 474-488
et 692-708) appartenant au domaine du vWF humain qui se lie
au complexe GPlb/IX,
-
et des
fragments
F (ab' )2 d'un
anticorps
monoclonal
(ACm 712) dirigé contre le domaine du vWF humain qui se lie
au complexe GPlb/IX
Dans un prochain chapitre, nous allons faire des rappels
sur
les
mécanismes
impliqués
dans
la
physiologie
l'hémostase, sur les facteurs déterminants dans la formation
.,'
du thrombus et sur le rôle du vWF. Un troisième chapitre set~
consacré à la description du modèle utilisé et aux méthodes;
;
~

19
un quatrième chapitre concernera les résultats;
un dernier
chapitre fera l'objet de la discussion et de la conclusion
globales.

20
L'HEMOSTASE

21
A. LES DIFFERENTES PHASES DE LA THROMBOGENESE
La
thrombogenèse
est
divisée
en
trois
phases
principales: l ' hémostase primaire, la coagulation plasmatique
et la fibrinolyse (Fig 1).
1. L'hémostase primaire
C'est
la
première
phase
qui
intervient
dans
le
maintien
de
la
fluidité
du
sang
et
de
sa
conservation
à
l'intérieur
du
vaisseau.
Pour
pouvoir
déterminer
les
mécanismes
d' action
des
agents
anti thrombotiques,
il
est
nécessaire
de
connaître
les
éléments
impliqués
dans
le
processus thrombotique et de déterminer leur niveau d'action.
Les éléments essentiels qui sont impliqués dans cette phase
sont d'origine tissulaire (la paroi vasculaire), cellulaire
(plaquettes sanguines en particulier, leucocytes et globules
rouges),
plasmatique
(vWF,
fibrinogène
et
fibronectine),
hémodynamique (déterminants rhéologiques).
a. La paroi vasculaire
La paroi des artères se compose essentiellement de
trois couches:
l'intima,
la média et l'adventice Fig (2a).
L'intima (Fig 2b) associe la monocouche continue de cellules
endothéliales en contact direct avec
le sang et la couche
sous-endothéliale
qui
comprend
une
membrane
basale,
des
fibres
de
collagène
et
des
microfibrilles;
la
média
est
séparée de l'intima par la limitante élastique interne et de
l'adventice, par la limitante élastique externe. L'épaisseur
de ces couches varie selon le type d'artère.

22
ao. Thromborésistancede l'endothélium
L'endothélium est une surface thromborésistante
d'une importance cruciale dans le maintien de la fluidité du
sang.
Cette
thromborésistance
est
due
à
certaines
de
ses
caractéristiques et de ses propriétés et s'exerce vis-à-vis
des trois stades de l'hémostase et de la thrombose: hémostase
primaire, coagulation plasmatique et fibrinolyse.
aol.
La
thromborésistanèe
des
cellules
endothéliales en relation avec les phénomènes cellulaires de
l'hémostase primaire est liée:
-à la nature de
leur surface qui est riche en
protéoglycannes
(constituants
du
glycocalix
cellulaire)
induisant
une
concentration
en
charges
électronégatives
(Glimelius
et
coll.
1978)
qui
les
rend
répulsives
aux
plaquettes,

leurs
activités
de
synthèse:
parmi
les
substances
secrétées
i l
y
a
la
prostacycline
(ou
PGI2)
(Moncada et coll.
1986),
antagoniste du thromboxane A2,
et
qui, à forte dose, est un puissant anti-agrégant plaquettaire
et
un vasodilatateur.
Un autre agent,
l'EDRF
(Endothelial
Derived Relaxing Factor) aux mêmes propriétés anti-agrégante
et vasodilatatrice est aussi
synthétisé
par
les cellules
endothéliales (Furchgott et Zawadzki 1980)

leur
capacité
de
dégrader,
de
capter,
de
transformer et d'inactiver certaines substances proagrégantes
et/ou vasoactives telles que l'adénosine 5' diphosphate
(ADP),
la 5 hydroxytryptamine (sérotonine),
les
catécholamines etc ...

23
plaquette
discoïde
~ ....:.:.,- ....-.,.
non-activée

;;.. ~
~ ji::t::P~ ~..~
e n d o t h é l i u m . "
\\
/ p
4
~
..
sécrétion facteur de
lame basale-~ ..~ , .
:":. ~.Willebrand
"""
.
.
.
"
sous-
.
endothélium-
/
'·0·
.~~:
.. '..
. ' .
microfibrilles
~ '-collagène
A
plaquette activée
La lésion de l'endothélium peut déclencher un
spasme vasculaire et être le facteur d'initiation de
la fonnation d'une thrombose.
A. Les conditions hémodynamiques d'écoulement
du sang et les globules rouges (GR) vont influencer
l'adhésion des plaquettes au sous-endothélium
thrombogène. L'adhésion des' plaquettes entraîne
la fonnatlon de thromboxane Al (TXAz) et la
sécrétion du contenu des granules.
collagène
B. En même temps, les voies extrinsèque
et
intrinsèque de la coagulation sont activées pour
facteur tissulaire
B
fonner de la thrombine.
C. Le thromboxane Al' l'ADP et la thrombine
THROMBINE
XIII _ XII~
vont agréger les plaquettes et augmenter la masse
du .thrombus.
D. La formation de fibrine à la surface de l'agré-
gat plaquettaire va le stabiliser. Le thrombus
plaquettaire mural est Intravasculalre et va avoir
tendance à se fragmenter et à emboliser la circula-
tion distale. n se produit des substances plaquet-
.talres qui vont contribuer à accroître la lésion de la
paroi vasculaire et qui attirent les polynu-
cléaires (PN). La paroi vasculaire produit des
subst}lnces qui vont limiter la croissance du throm-
c
bus en activant la fibrinolyse et en Inhibant les
fonctions des plaquettes (PGlz).
embols fibrino-plaquetlaires
D
la
Figure
1:
Schéma
montrant
les
différentes
phases
de
de
formation
d'une
thrombose
murale
artérielle
(Extrait
"Vaisseau et Sang", J CAEN et coll.)

24
aa2. La thromborésistance en rapport avec la
coagulation plasmatique est due d'une part aux facteurs liés
à la surface des cellules endothéliales et qui sont les mêmes
que ceux impliqués dans la thromborésistance en rapport avec
l'hémostase primaire (présence de charges électronégatives),
d'autre part, par la présence à leur surface,
des protéines
qu'elles
ont
synthétisées
et
qui
se
combinent
à
l'antithrombine III et au cofacteur II de l'héparine,
tous
deux
plasmatiques
et
inhibiteurs
physiologiques
de
la
thrombine (analogues de l'héparine,
le dermatan sulfate,
la
thrombomoduline,
la protéine S).
aa3.
La
thromborésistance
en
rapport
avec
le
mécanisme de la
fibrinolyse
est due à
la synthèse de deux
sortes d'activateurs du plasminogène dont l'un est de type
urokinase
et
l'autre,
plus
important,
est
l'activateur
tissulaire du plasminogène (tissue plasminogen activator ou
t-PA)
(Rijken et Collen,
1981; Collen et coll. 1982)
aB. La thrombogénicité du sous-endothélium
Lorsque
les
cellules
endothéliales
sont
lésées
ou
l'endothélium
détruit,
l'hémocompatibilité
d~
la
paroi
vasculaire
est
perdue.
Les
plaquettes
sanguines
et
les
constituants plasmatiques,
en particulier ceux qui sont
impliqués dans le déclenchement de la coagulation,
viennent
en contact avec le sous-endothélium. Ce dernier est constitué
de
microfibrilles
(lame
élastique)
et
de
macromolécules
synthétisées par la cellule endothéliale et sécrétées de

25
ADVENTICE
:.::~ ,
;.~~~--
:~~\\-;- MEDIA
A'<'::D__"""""""'ffi;mëi%_~_IIlIIElil:llSZO!IZilIl!ll*lIlifRIliA!lllt*W_.~J2~;:·:-::,/f
Figure 2a. Structure schématique d'une artériole.
La paroi d'une artériole est schématiquement composée de trois couches anatomiques. La
lumière vasculaire est bordée par J'intima
qui se compose d'une monocouche de ceIlules endo·
théliales reposant sur la matrice extra cellulaire sous-éndothéliale. La média. composée de cel-
lules musculaires lisses et de leur matrice conjonctive, est limitée par les limitantes élastiques
interne et externe. A l'extérieur, le vaisseau est entouré par J'adventice contenant des fibro-

blastes et des adipocytes.
Figure 2b. Détail de l'intima
La monocouche de cellules endothéliales est recouverte, au niveau de son pôle vasculaire, d'un
film protéique endo-endothélial. EIle s'amarre sur le sous-endothélium conjonctif contenant du
collagène de type IV, des microlibrilIes et du coIlagène de type III.
R~:i:~tJ~~~~~1t~~~:"~:;::~z~~:'._~::~~é::;
".
, M le
.; .. eOLLAGENE III -...' ::~~:~;.;~~~~::
-.--
Figure. 2. structures schématiques de la paroi d'une artère.
(extralt de:"Introduction à l'hémostase",Boneu et Cazenave)

26
façon polarisée vers les couches sous-jacentes de l'intima,
les
macromolécules
les
plus
connues
étant
les
fibres
de
collagène.
b. Les plaquettes sanguines
ba. Structure
Les plaquettes sanguines ou thrombocytes sont des fragments
cytoplasmiques anucléés (Fig 3). Leur forme discoïde est due
à
un
anneau
de
microtubules
qui
tend
la
membrane
de
la
plaquette: c'est le cytosquelette. Leur cytoplasme contient
des mitochondries et du glycogène qui produisent de l'énergie
nécessaire aux réactions qui se déroulent dans la plaquette
ainsi que des granules. On distingue deux sortes de granules:
des
gran~les denses qui contiennent de la sérotonine,
des
ions calcium,
de l'ADP,
et de l'ATP et des granules alpha
(azurophiles
à
la
coloration
de
MGG)
qui
contiennent
le
facteur
vWF,
le
fibrinogène,
la Béta thromboglobuline, . le
facteur
plaquettaire
4,
des
facteurs
mitogéniques
qui
permettent la croissance des cellules musculaires lisses de
la paroi vasculaire, etc . . . .
bB. Les glycoprotéines de la membrane plaquettaire
impliquées dans l'adhésion et l'agrégation
L'adhésion
des
plaquettes
à
une
surface
conjonctive,
en
particulier au sous-endothélium de la paroi vasculaire lésée,
est l'une des étapes critiques,
initiatrices de l'hémostase
primaire.
La
formation
du
clou
hémostatique
ne
peut
se
dérouler que si, en premier lieu, les plaquettes adhèrent au

27
sous-endothélium ou aux tissus sous-jacents périvasculaires,
exposés
à
la
sui te
d' une
lésion
de
la
paroi
vasculaire.
Ainsi, l'adhésion plaquettaire joue un rôle essentiel dans la
formation du thrombus.
Les plaquettes
contiennent,
comme
la plupart
des
autres
cellules,
une
famille
de
récepteurs
d'adhésion
appelés
intégrines
(Ruoshlati
et
Pierschbacher
1987,
Hynes
1987).
L'interaction des récepteurs plaquettaires avec les protéines
adhésives
est
un
phénomène
commun
aux
autres
systèmes
biologiques, mais particulier parce qu'il se déroule dans des
conditions de flux.
La
plupart
des
connaissances
acquises
sur
le
rôle
des
glycoprotéines de la membrane plaquettaire résulte d'études
effectuées
sur des
patients qui présentaient des
déficits
spécifiques
de
certaines
glycoprotéines
de
la
membrane
plaquettaire.
bBl. Le complexe glycoprotéique Ib/IX (GPIb/IX)
Chez les patients atteints du syndrome de Bernard-
Soulier,
les plaquettes sont déficientes en GPlb (Nurden et
Caen, 1975; Tobelem et coll. 1976; Degos et coll. 1977), et
incapables
d' adhérer au
sous-endothélium aussi
bien
à
des
taux de cisaillement
(définition dans le chapitre lIB) bas
qu'à des taux de cisaillement élevés
(Sakariassen et coll.
1986).
Ces
études
ont
été
confirmées
par
l'utilisation
d' anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre la GPlb
(Ruan et coll. 1981; McMichael et coll. 1981; Sakariassen et
coll.
1986).
La GPlb existe dans
la membrane plaquettaire

28
associée à
une glycoprotéine,
la GPIX,
formant
le complexe
GPIb/IX.
Ce récepteur membranaire est déjà exprimé sur les
plaquettes
non
activées,
ce
qui
en
fait
un
récepteur
privilégié
pour
l'adhésion.
Le
complexe
GPIb/IX
est
le
principal récepteur plaquettaire pour le vWF. Il consiste en
trois
chaînes
polypeptidiques:
GPIba,
GPIbB
et
GPIX.
Des
études
de dégradation protéolytique,
combinées
aux données
obtenues par clonage de l'ADN complémentaire, ont montré que
le fragment C terminal
de
45 Kilodalton
(KDa)
de
la GPIba
contenait le domaine de liaison au vWF (Wicki et Clemetson,
1985;
Lopez et coll.,
1987).
Des études effectuées avec des
anticorps monoclonaux ont montré qu'il y avait 20.000 à 25000
copies de GPlb/IX exposées sur la surface membranaire.
bB2. Le complexe glycoprotéique IIb/IIIa
Ce
complexe
GPIIb-IIla
est
absent
de
la
membrane
des
plaquettes
des
patients
atteints
de
la
thrombasthénie de Glanzmann.
En plus du défaut d'agrégation
plaquettaire observé
chez
ces patients,
une
diminution de
l'adhésion
est
aussi
observée
mais,
à
des
taux
de
cisaillement
élevés
(Weiss
et
coll.
1986;
Sakariassen
et
coll.
1986).
En
effet,
c'est
seulement
à
des
vitesses
de
cisaillement
élevées

partir
de
1200
sc~),
quand
l'étalement des plaquettes est nécessaire pour résister aux
forces élevées de cisaillement, que les anticorps monoclonaux
dirigés
contre
le
complexe
GPIIb/IIIa
ont
un
effet
(Fressinaud
et
coll.
1988).
La
simple
explication
de
ces
observations
est
que
le
complexe
GPIb-IX
est
le
premier

29
récepteur
des
plaquettes
pour
l'adhésion
alors
que
le
complexe GPllb/llla est plutôt impliqué dans l'agrégation des
plaquettes.
Le complexe GPllb/llla est le complexe glycoprotéique
membranaire le plus abondant sur les plaquettes (environ 50
000 copies par plaquette),
mais
contrairement
au
complexe
GPlb-IX,
il
n'est
actif
sur
la
surface
plaquettaire
que
lorsque les plaquettes sont activées par différents agonistes
physiologiques
dont
la
thrombine,
l ' ADP,
le
collagène
et
l'épinéphrine (Fujimoto et coll. 1982a, bi Ruggeri et coll.
1983). Le complexe GPllb/llla joue un rôle important dans la
formation du thrombus
en permettant
le contact plaquette-
plaquette par le fibrinogène mais aussi par le vWF (Ikeda et
coll.
1991;
Fressinaud
et
coll.
1991).
Il
constitue
le
deuxième récepteur de liaison au vWF nécessaire à l'étalement
des
plaquettes
sur
une
surface
(Weiss
et
coll.,
1986,
Fressinaud et coll. 1988).
bB3. Les glycoprotéines plaquettaires: GPIc-IIa et
GPIa-IIa
Les
glycoprotéines
GPlc-Ila
et
GPla-Ila
interagissent
respectivement
avec
la
fibronectine
et
le
collagène
(Nieuwenhuis
et
coll.,
1986;
Kunicki
et
coll.,
1988).
Des
études
ont
montré
que
des
plaquettes
qui
présentaient
une
déficience
au
niveau
du
récepteur
au
collagène, non seulement montraient un défaut d'adhésion au
collagène mais aussi au sous-endothélium (Nieuwenhuis et
coll., 1986). Ceci indique que l'interaction directe

30
..,~.. -_'"
" ",' ,t
.i··' .;
.';" -:
.'. ' .~
Gex
mt
GD
Gly
Gly
Figure 3. Ultrastructure d'une plaquette normale: étudiée en
microscopie
électronique
de
transmission
(G
x
40.000);
(Danièle Tenza et Elisabeth Cramer).
Mit:
mitochondries;
Ga:
granules
alpha;
STD:
système
tubulaire
dense;
STI:
système
tubulaire
interne;
mt:
microtubules;
GD:
granules
denses;
Gly:
glycogène;
SCo:
système canaliculaire ouvert.

31
plaquette-collagène est impliquée dans l'adhésion.
2. La coagulation plasmatique
Cette phase aboutit à la formation de la thrombine
qui
va
transformer
le
fibrinogène
soluble
en
un
gel
de
fibrine.
Elle
débute
par
une
phase
d' ini tiation
pendant
laquelle les premières enzymes sont activées,
suivie d'une
phase
d'activation
en
cascade
des
autres
facteurs
de
la
coagulation.
Selon
le
stimulus
qui
déclenche
cette
activation,
on distingue une voie intrinsèque quand le sang
entre en contact avec une surface chargée négativement (sous-
endothélium)
ou
une
surface
étrangère
(paroi
d' un
verre,
etc ... ) et une voie extrinsèque où le facteur de coagulation
est d'origine tissulaire (thromboplastine tissulaire secrétée
par les tissus lésés). Le système intrinsèque fait intervenir
les
facteurs
XII
et
XI,
le
kininogène
à
haut
poids
moléculaire
et
de
la
prékallikréine
alors
que
le
système
extrinsèque
fait
intervenir
en
plus
de
la thromboplastine
tissulaire
le
facteur
VII
présent
dans
le
sang.
Ces
deux
voies ont en commun d'induire l'activation du facteur X qui,
en
présence
du
facteur
Va,
des
ions
calcium
et
des
phospholipides,
va transformer la prothrombine
inactive en
thrombine active qui est l'enzyme clé de la coagulation.
3. La fibrinolyse
Elle consiste
à
dégrader
les
dépôts
de
fibrine
formés lors de la coagulation plasmatique. Cette dégradation,
qui aboutit à des produits de dégradation de la fibrine,
se

32
fait
principalement
par
la
plasmine
qui
provient
de
l'activation d'activateurs duplasminogène. On distingue deux
voies
pour
ce
processus:
une
voie
extrinsèque,
par
un
activateur tissulaire, le t-PA (tissue plasminogen activator) .
et une voie intrinsèque par l'urokinase et lapro-urokinase.
La lyse de la fibrine est associée aussi à une inhibition des
facteurs
activés de la coagulation par des substances dont
l'antithrombine III,
la protéine C,
l'alpha2 macroglobuline
et
l'alpha,
anti trypsine.
Ce
processus,
qui
prévient
une
exagération de la fibrinoformation et donc une protection du
fibrinogène,
contribue
au maintien
de
la
fluidité
du
sang
dans les vaisseaux.
B. LES FACTEURS RHEOLOGIQUES: DETERMINANTS PRIMORDIAUX DANS
LA FORMATION DU THROMBUS
1. Définitions
La
rhéologie
se
définit
comme
étant
l'étude
de
l'écoulement
et
de
la
déformation
des
globules
rouges
et
blancs dans la circulation sous l'influence des contraintes
qui leur sont appliquées. Ce sont les facteurs essentiels qui
font que les mécanismes impliqués dans la thrombose varient
selon le type de vaisseau.
Le sang est constitué d'un liquide visqueux non homogène
(le
plasma)
dans
lequel
baignent
des
éléments
figurés
(globules
rouges
ou
érythrocytes,
globules
blancs
ou
leucocytes, plaquettes, .. etc).
Tel un liquide laminaire,
le
sang se déplace en couches parallèles à la paroi vasculaire.

33
Les couches qui circulent près de la paroi vasculaire sont
dépourvues de cellules car les globules rouges et blancs ont
tendance à se mouvoir dans l'axe du courant; ce phénomène est

au
fait
que
les
couches
situées
près
de
la
paroi
vasculaire circulent à une vitesse plus lente que celles qui
circulent dans l'axe du courant.
La différence de vélocité
entre les couches
situées
à
des distances variables de la
paroi
vasculaire
détermine
des
phénomènes
de
cisaillement
entre ces couches. Ainsi on distingue:
-le "shear rate"
(en s_1)
ou vitesse de cisaillement qui
est
la
différence
entre
les
vitesses
de
circulation
des
couches; sa valeur dépend de la différence de vitesse de flux
par rapport à la différence de hauteur des couches.
-le
"shear force"
(en dyne)
qui est la force
qu'il faut
exercer pour vaincre le cisaillement entre des couches de
liquide superposées.
-le "shear stress"
(en dyne/cm2 )
qui est la contrainte de
cisaillement par unité de surface.
La vitesse de cisaillement ("shear rate") est directement
proportionnelle à la force de cisaillement ("shear force") et
inversement
proportionnelle
à
la
viscosité
du
sang.
La
viscosité,
elle même,
dépend d'autres facteurs tels que la
déformabilité des érythrocytes,
la valeur de l'hématocrite,
le taux et la taille des molécules protéiques du plasma dont
le
fibrinogène.
Quand
il
se
produit
une
agrégation
cellulaire,
par
exemple,
celle
des
globules
rouges,
la
viscosité augmente et le "shear rate" diminue. Les forces de
cisaillement vont morceler les agrégats,
ce qui va diminuer

34
la viscosité et augmenter le "shear rate".
Les
vitesses
de
cisaillement
sont
inversement
proportionnelles au diamètre du vaisseau. Ainsi, les taux de
cisaillement sont bas
(50 à
200 s~)
dans les vaisseaux de
gros calibre (aorte, veine cave), intermédiaires (500 à 1300
S-1)
dans
les
vaisseaux de diamètre moyen
(artères),
très
élevés
(>
1500
s-1)
dans
les
artérioles
ou
les
artères
sténosées (Turitto et Baumgartner, 1979).
2
Rôle
dans
1 ' adhés ion
plaguettaire
à
la
paroi
vasculaire
Le transport des plaquettes à la paroi vasculaire
est
un
des
principaux
facteurs
déterminant
l'adhésion
plaquettaire.
Il
dépend
particulièrement
des
vitesses
de
cisaillement (Weiss et coll.
1978
;
Turitto et Baumgartner
1979; Baumgartner et coll. 1980a, b; Turitto et Baumgartner
1982) et des globules rouges.
En effet,
sous la contrainte
des globules rouges,
les plaquettes, de taille plus petite,
sont
projetées
vers
la
paroi
vasculaire

elles
se
concentrent
(Aarts et coll.
1983).
Ceci explique de
façon
partielle l'augmentation de l'adhésion plaquettaire en cas de
taux de cisaillement élevés. Cette implication des globules
rouges
dans
le
transport
des
plaquettes
explique
que
les
facteurs
tels
que
l ' hématocrite,
la
taille
des
globules
rouges
(Aarts
et
coll.
1983)
et
leur
rigidité
ou
déformabilité (Aarts et coll. 1984 et 1986; Turitto et coll.
1979) ont un effet dans l'adhésion des plaquettes.
Des
études
de perfusion
ont montré
que
les
vitesses de

35
cisaillement
ont
un
effet
sur
la
nature
des
protéines
impliquées
dans
la
phase
d'adhésion.
A
des
taux
de
cisaillement
bas
«
500
s~),
la
fibronectine
est
la
principale protéine responsable de l'adhésion ( ), alors qu'à
taux
de
cisaillement
élevés
(>
1000
s-')
le
vWF
est
absolument nécessaire pour une adhésion plaquettaire normale
(Weiss et coll., 1978). D'autres protéines adhésives telles
que
la
laminine,
la
thrombospondine
et
la
vitronectine
peuvent participer à l'adhésion plaquettaire mais elles ne
sont probablement pas
essentielles dans
les conditions de
taux de cisaillement élevés.
C.
LE
FACTEUR
WILLEBRAND
(vWF):
PRINCIPALE
PROTEINE
IMPLIQUEE DANS L'ADHESION ET L'AGREGATION
C'est en 1926, qu'Erich von Willebrand décrivit
les
premiers
patients
qui
présentaient
un
désordre
de
saignement assez particulier à qui on donna plus tard son
propre
nom.
La
maladie
de
Willebrand
(vWD)
résulte
d'une
anomalie quantitative ou qualitative du vWF.
En effet,
les
nombreuses
études détaillées
des patients et des
familles
suspectés avoir cette maladie, ont beaucoup aidé à comprendre
les fonctions du vWF aussi bien sur le plan biochimique que
sur le plan physiologique.
1. Synthèse.
structure et localisation
Le
vWF
est
une
glycoprotéine
multimérique
(Meyer
et
coll.
1980),
synthétisée
par
les
cellules
endothéliales
(Jaffe et coll. 1974) et les mégacaryocytes (Nachman et coll.

36
1977; Sporn et coll. 1985). Il est stocké dans les granules
alpha des plaquettes (Slot et coll. 1978; Jeanneau et coll.
1984; Cramer et coll. 1985), dans les corps de Weibel-Palade
des cellules endothéliales (wagner et coll. 1982) et dans le
sous-endothélium
(Rand
et
coll.
1980).
Le
vWF,
qui
est
surtout d'origine endothéliale (Jaffe et coll. 1974), circule
dans le plasma à une concentration de 7 ~g/ml.
La
synthèse
du
vWF
dont
le
gène
se
trouve
sur
le
chromosome 12 (Verveij et coll. 1985), débute par celle d'un
polypeptide
précurseur
(appelé
pré-pro-vWF)
contenant
un
peptide
signal
de
22
acides
aminés,
une
protéine
de
741
acides aminés
(ou vW AgIl) et la sous-unité mature de 2050
acides aminés
(verweij et coll.
1986) dont la séquence est
actuellement déterminée (Titani et coll. 1986). Cette sous-
unité mature de 275 KDa (Chopek et coll. 1986) contient 18.7
% de carbohydrates (Titani et coll. 1986). La dimérisation se
fait
par
la
formation
de
ponts
dissulfures
entre
les
extrémités carboxyterminales de deux sous-unités, le clivage
du peptide
signal
et
une
glycosylation.
Les
dimères
vont
s'associer
par
leurs
ponts
disulfures
pour
former
des
multimères;
c'est sous cette forme multimérique que le vWF
circule dans le plasma.
2. Rôle: relation structure-fonction
Les fonctions du vWF dans l'hémostase sont liées à sa
structure
complexe
et
à
sa
localisation
multiple
(plaquettaire,
plasmatique,
sous-endothéliale).
A la suite
d'une lésion de la paroi vasculaire,
le vWF sert de ligand

37
adhésif
entre
les
plaquettes
et
les
éléments
vasculaires
(Sakariassen et coll. 1979, Bolhuis et coll. 1981).
a. Domaines fonctionnels
Grâce
à
des
études
utilisant
la
dégradation
protéolytique,
une
banque
d'anticorps
monoclonaux
et
des
fragments d'ADN complémentaire, les domaines fonctionnels du
vWF ont pu être localisés (Fig 4). Ces domaines sont:
-
un
domaine
de
liaison
au
Facteur
VIII
(Takahashi et
coll. 1987, Foster et coll. 1987) et un domaine d'interaction
avec l'héparine (Fretto et coll. 1986) situés à l'extrémité
N-terminale,
entre les acides aminés l
et 272;
-
un domaine de liaison à la GPlb
(Mohri et coll.
1988)
situé entre les acides aminés 474-488 et 694-708
- deux sites de liaison au collagène (Roth et coll. 1986)
entre les acides aminés 542-622 et 948-998
- un deuxième domaine d'interaction avec l'héparine (Mohri
et coll. 1989) et un domaine de liaison avec les sulfatides
(Christophe et coll.
1991)
situés entre
les
acides
aminés
512-673
-
un site de liaison à
la GPllb/llla dans
la partie C-
terminale,
avec la séquence Arg-Gly-Asp
(RGD),
en position
1744 -
1746 (Sadler et coll. 1985)
D'autres domaines présentent les séquences assurant la
liaison du vWF aux constituants du sous-endothélium .tels que
collagènes
des
types
l,
III
et
VI,
glycosaminoglycannes,
microfibrilles
(Nyman
1977,
Legrand
et
coll.
1978,
Santoro 1981, Fauvel et coll. 1983, Wagner et coll 1984, Rand

38
et coll.
1986,
de Groot et coll.
1988,
Ingerslev et coll.
1989, Fauvel et Legrand,
1990; Rand et coll.
1991).
b. Rôle dans l'adhésion
La
fonction
d'attacher
les
plaquettes
au
sous-
endothélium,
surtout
dans
les
conditions
de
taux
de
c.:i,.saillement
élevés
correspondant
à
celles
des
artères
de
peti t
calibre
ou
des
artères
sténosées
(Tschopp
et
coll.
1974, Weiss et coll. 1978, Baumgartner et coll. 1980a, 1980b)
est considéré, jusqu'ici, comme le rôle primordial du vWF. En
effet,
dans
l'adhésion,
à
des
taux
de
cisaillement
bas,
d'autres
protéines
telles
que
la
fibronectine
sont
plus
sollicitées (Houdijk et Sixma, 1985). Toutefois, le degré de
l'importance du rôle du vWF dans l'adhésion varie en fonction
des conditions expérimentales.
ba. liaison au sous-endothélium
L'importance
de
la
liaison
du
vWF
au
sous-
endothelium dans l'adhésion a été mise en évidence par des
études
de
perfusion
(Sakariassen
et
coll.
1979)
dans
lesquelles
des
anticorps
monoclonaux
dirigés
contre
le
domaine
de
liaison
du
vWF
au
collagène
ont
été
utilisés
(Fressinaud et coll.
1988).
Mais le vWF se lie surtout aux
---
collagènes
fibrillaires
(Santoro
1981)
de
type
l
et
III
1
(Santoro et Cowan 1982) et récemment démontre,
au collagène
de
type
VI
(Rand
et
coll.
1991).
Des
études
suggèrent
l'existence d'autre(s) substance(s) non encore identifiée(s)
dans
la
matrice
de
cellules
endothéliales
ou
de
cellules

39
musculaires lisses en culture à laquelle le vWF peut se lier
(Wagner et coll. 1984; Rand et coll. 1986; De Marco et coll.
1988; De Groot et coll. 1988; Baruch et coll. 1991). D'autre
part,
une
étude
récente
a
démontré
la
liaison
du
vWF
plasmatique
aux
microfibrilles
artérielles
(Fauvel
et
Legrand,
1990)
Par ailleurs,
les cellules endothéliales sécrètent une
partie
du
vWF
qu 1 elles
contiennent
vers
les
tissus
sous-
jacents et particulièrement dans les couches superficielles
du
sous-endothélium.
Des
études
utilisant
des
anticorps
monoclonaux et polyclonaux ont montré qu'environ la moitié de
l'adhésion plaquettaire était supportée par
le vWF lié au
sous-endothélium (Stel et coll. 1985; Turitto et coll. 1985).
B.
Liaison
aux
glycoprotéines
de
la
membrane
plaquettaire Ib/IX et IIb/IIIa
bBl. liaison au complexe GPIb/IX
Les manifestations hémorragiques observées
chez
les patients
présentant
une
absence
de
l'interaction
GPlb/IX-vWF
(maladie de Willebrand et
syndrome
de
Bernard
Soulier),
confirment
le
rôle
primordial
de
cet
axe
dans
l'adhésion
plaquettaire
dans
la
circulation
normale
artérielle et de sa contribution critique dans l'hémostase
primaire. Différentes techniques in vitro (immunologiques et
agrégomètriques), et ex vivo ont permis d'avoir une approche
des mécanismes de cette interaction bien que le facteur
primordial, qui est l'effet de cisaillements existant dans
les conditions physiolog iques normales, n'est qu'approximatif

40
Figure 4.
Domaines fonctionnels de la sous unité mature du
Facteur Willebrand. Présence de 4 domaines ABCO répétés 2 à
4
fois
chacun.
Les
séquences
peptidiques
appartenant
au
domaine de liaison avec la GPlb
(Mohri et coll.
1988)
sont
mises en évidence.

41
dans ces techniques.
Les trois molécules utilisées pour étudier l'activité
fonctionnelle
du
vWF
sont:
la
ristocétine,
le
facteur
plaquettaire agrégant (platelet aggregating ou agglutinating
factor
(PAggF),
à distinguer du platelet activating factor
(PAF))
et la botrocétine.
Tous ces agents ont la propriété
commune d'induire l'agrégation plaquettaire en présence du
vWF
d'où
l'intérêt
de
leur
utilisation
pour
déterminer
l'étude
quantitative
de
la
réaction
GPIb/IX-vWF
et
l'identification
de
leurs
domaines
de
liaison
mutuels
respectifs.
La ristocétine,
la plus ancienne de ces molécules, est
un antibiotique isolé à partir d'un milieu de culture d'une
bactérie gram-positive Nocardia lurida (Philip et coll. 1960;
Wallas
et
Strominger,
1963).
C'est
en
1971
qu'Howard
et
Firkin
constatèrent
que
l'addition
de
l
à
2
mg/ml
de
ristocétine à une suspension de plaquettes dans du plasma,
soumise à une certaine vitesse de rotation,
entraînait une
formation rapide d'agrégats plaquettaires (Howard et Firkin,
1971).
Le
même
résultat
est
observé
avec
des
plaquettes
lavées
puis
fixées
avec
du
formaldéhyde,
ce
qui
laisse
supposer que l'activation plaquettaire n'est pas requise dans
ce
processus;
le
terme
d'agglutination,
plus
correct
que
celui d'agrégation,
est utilisé dans ce cas.
Des études de
perfusion
utilisant
des
anticorps
qui
bloquent
l'agglutination
induite par
la ristocétine
bloquent
aussi
l'adhésion plaquettaire induite par la liaison GPIb/IX-vWF
(Sakariassen
et
coll.
1986);
ceci
indique
que
ces
deux

42
processus peuvent être similaires puisque les deux réactions
dépendent
de
la
même
protéine
plasmatique,
le
vWF.
Cette
observation
aboutit
à
un
développement
rapide
de
l'utilisation de
la ristocétine comme
un
test
standard de
l'activité fonctionnelle du vWF.
Le
mécanisme
d'action
de
la
ristocétine
n'est
pas
totalement
éclairci
mais
on
suppose
qu·" il
est

à
une
modification des charges au niveau du vWF, normalement chargé
négativement (Coller,
1985). En effet,
le traitement du vWF
avec de la neuraminidase pour dégrader les acides sialiques
chargés
négativement,
induit
la
liaison
spécifique
de
l'asialo-vWF à la GPlb/IX en l'absence de tout inducteur (De
Marco et Shapiro,
1981; De Marco et coll. 1985). Cependant,
les
résultats
obtenus
avec
la
ristocétîne
doivent
être
traités avec prudence du fait de l'absence, dans ce test, de
certains paramètres physiologiques
importants tels que les
facteurs rhéologiques.
La deuxième méthode pour mettre en évidence l'activité du
vWF utilise la propriété du plasma porcin,
bovin ou celui
d'autres ruminants, d'agréger les plaquettes humaines: cette
propriété est due à l'effet du PAggF. Des études ont montré
que
le
plasma de
porcs
normaux
présentaient
une
activité
plaquettaire agrégante contrairement aux porcs vWD (Griggs et
coll. 1973). Le PAggF permet aussi de mettre en évidence les
mul timères
du
vWF
à
haut
poids
moléculaire
(Br inkhous
et
coll. 1983), toutefois son mécanisme d'action n'est pas bien
connu.
La molécule la plus récemment connue est la botrocétine,

43
l'un des composants d'un extrait de venin d'une espèce de
serpent,
Bothrops
jararaca
(Read
et
coll.
1983).
Les
chercheurs
eurent
recours
à
cette
molécule
quand
ils
constatèrent que le vWF plasmatique de certains animaux de
laboratoire (rat, chien), ne réagissait pas à la ristocétine
et au PAggF. Comme la ristocétine et le PAggF, la botrocétine
induit l'agglutination plaquettaire en présence du vWF, mais
sûrement par des mécanismes différents. D'autres études ont
mis en évidence cette différence de modes d'action entre ces
deux inducteurs (Howard et coll. 1984; Girma et coll. 1990).
Récemment, des études ont montré que l'agglutination induite
par
la
ristocétine
était
inhibée
par
des
séquences
peptidiques 474-488 et 692-708 de la molécule vWF (Mohri et
coll. 1988; Girma et coll. 1990; Cissé-Thiam et coll. 1991),
ce qui suggère que la ristocétine agirait au niveau de ces
séquences du vWF. Des études, plus récentes, suggèrent que la
botrocétine agirait au niveau du Willebrand, dans ~a séquence
512-673 (Fujimura et coll. 1991) et particulièrement dans les
séquences
539-553,
569-583
et
629-643
(Sugimoto
et
coll.
1991).
Ces
données
nouvelles
relancent
le
débat
sur
les
mécanismes de l'interaction GPlb/IX-vWF.
bB2. Liaison à la GPIIb/IIIa
La liaison du vWF au complexe GPllb/llla peut
être induite par les agonistes physiologiques tels que l'ADP,
la
thrombine,
le
collagène
et
l ' épinéphrine.
Le
rôle
de
l'interaction
GPllb/llla-vWF
était
généralement
considéré
comme
secondaire,
ce
rôle
étant
conféré
à
la
cohésion

44
plaquette-plaquette,
donc à
la formation du thrombus.
Mais
l'utilisation
d'un
anticorps
monoclonal
dirigé
contre
le
domaine
de
liaison
du
vWF
à
la
GPllb/llla
a
démontré
l'intervention de cet axe dans l'adhésion plaquettaire dans
des conditions de taux de cisaillements élevés (Fressinaud et
coll.
1988).
Comme
nous
l'avons
vu
ci-dessus
(paragraphe
IIbB2), l'absence de GPllb/llla chez les patients atteints de
thrombasthénie
de
Glanzmann
est
responsable
d'un
défaut
d'étalement
des
plaquettes
et
par
conséquent
celui
de
la
formation du thrombus
(Weiss et coll.
1986;
Sakariassen et
coll.
1986). Chez ces mêmes patients,
le défaut d'adhésion
observé serait dû à
l'absence de l'interaction GPllb/llla-
vWF,
plutôt
que
celle
de
l'interaction
GPllb/llla-
fibrinogène, l'adhésion des plaquettes étant normale chez les
patients
afibrinogémiques
chez
qui
l'axe
GPllb/llla-
fibrinogène est absent (Weiss et coll. 1978). Chez ces mêmes
patients, la liaison directe du complexe GPllb/llla au vWF a
été mise en évidence ainsi que son rôle dans l'agrégation (De
Marco et coll. 1986). La possibilité de l'intervention du vWF
plaquettaire
dans
l'adhésion,
par
sa
liaison
au
complexe
GPllb/llla, est de plus en plus évidente. En effet, un défaut
d'adhésion plaquettaire au collagène est observée quand les
-
plaquettes
sont
dépourvues
de
granules
alpha,
lieux
de
stockage du vWF plaquettaire (Gray platelet syndrome, GPS),
aussi bien en la présence qu'en l'absence de vWF plasmatique
(Fressinaud et
coll.
1987).
Toutefois
le
processus
de
la
liaison
vWF
plaquettaire
à
la
GPllb/llla
pour
induire
l'adhésion (Parker et Gralnick,
1986; Sixma et coll. 1991),

45
reste indéterminé. Toutefois,
on peut se demander si le vWF
entre en compétition avec le fibrinogène dans l'interaction
avec
le
complexe
GPllb/llla
pour
induire
l'agrégation
plaquettaire in vivo. Dans les conditions physiologiques, où
le
rapport
fibrinogène/vWF
dans
le
plasma
est
200/1,
la
prédominance de l'axe GPllb/llla-vWF dans
l'agrégation par
rapport à l'axe GPllb/llla-fibrinogène pourrait s'expliquer
par une concentration molaire plus élevée du vWF au niveau de
la lésion.
c. rôle dans la formation du thrombus
Du
fai t
de
l'importance
de
l'interaction
GPllb/llla-vWF dans
la formation d'agrégats plaquettaires,
secondaire à leur implication dans l'adhésion, le rôle du vWF
dans
la
formation
du
thrombus
apparaît
de
plus
en
plus
évident.
Des
études
plus
récentes
suggèrent
que
le
vWF
plaquettaire, non seulement joue un rôle important dans les
premiers stades de l'hémostase en servant de "pont" entre la
surface du sous-endothélium et les plaquettes mais dans le
processus thrombotique en permettant le contact plaquette-
plaquette par sa liaison au complexe GPllb/llla (Gralnick et
coll.
1991).
Des
expériences
in
vivo
par
des
greffes
de
moelle osseuse effectuées chez
des
porcs
vWD sévères,
ont
montré
le
rôle
du
vWF
plaquettaire
dans
la
formation
du
thrombus
(Bowie et coll.
1986).
Ces
dernières
expériences
effectuées
sur
les
modèles
animaux
de
thrombose
expérimentale,
en particulier celui du porc,
sont les plus
concluantes sur le rôle du vWF dans la formation du thrombus.

46
En
effet de
nombreuses
études
ont
été
effectuées
soit en
comparant la thrombose artérielle in vivo chez des porcs vWD
et des porcs normaux, soit en utilisant des anticorps dirigés
contre
le
vWF porcin
chez
des porcs
normaux
ou encore en
faisant
des
greffes
de
moelle
osseuse
d'un
phénotype
à
l'autre (Fuster et coll. 1978, 1982, 1985, 1990 a et b, 1991
a et b;
Reddick et coll. 1982, 1985, 1990; Griggs et coll.
1985; Nichols et coll. 1986, 1990, 1991; Bellinger et coll.
1987; Brinkhous et coll. 1989).
(Ces études seront décrites
plus
amplement
dans
le
chapitre
V).
D'autres
arguments
expérimentaux (Moake et coll. 1986, 1988; Peter son et coll.
1987;
Ikeda
et
coll.
1991;
Fressinaud
et
coll.
1991)
soutiennent le concept selon lequel le facteur vWF peut jouer
un rôle crucial dans l'agrégation plaquettaire à des vitesses
de cisaillement élevées.
Actuellement,
certains
auteurs
(Baruch
et
coll.
1989;
Sakariassen
et
coll.
résument
le
rôle
du
vWF
dans
la
formation du thrombus selon le processus suivant: 1) le vWF
se
lie
au
collagène
et/ou
un
autre
composant
du
sous-
endothélium, 2) le vWF change de conformation qui induit une
exposition de son domaine de liaison à la GPIb/IX,
3) cette
liaison
GPIb/IX-vWF,
non
seulement
produit
l'attachement
initial des plaquettes au sous-endothélium, mais aussi joue
un rôle dans la formation du thrombus en induisant une

47
Plaquette
ACm
RGDS peptide
P G - 1 ' :,'::::;
...::c , /
peptide 692_708 ~ GPlb
GPllb-IIJa
r
r
RISTOCETINE
ADP
.BOTROCETINE
THROMBINE
EPINEPHRINE
ACm 712
Et>-
~~. C'WF~
Plasm.
/
Endothelium
Sous":'endothelium
Figure 5: Représentation schématique (Baruch et coll. 1991)
des

interactions
du
Facteur
Willebrand
(vWF) ,
avec
ses
récepteurs plaquettaires, le collagène du sous-endothélium et
le Facteur VIII
(F VIII)
(flèches en trait fin).
Inhibition
de
ses
liaisons
avec
la
plaquette
par
des
anticorps
monoclonaux
(Acm)
PG-l
(anti GPlb),
712
(anti-vWF)
et des
peptides du vWF:
692-708,
et RGDS = arginine-glycine-acide
aspartique-sérine (flèches en trait large).

48
exposition
du
complexe
GPllb/llla
auquel
le
vWF
et
le
fibrinogène vont se lier, permettant ainsi la formation
d'agrégats plaquettaires stables.
d. autres rôles du vWF
da.
transport du FVIII
L'un des rôles importants du vWF consiste dans le transport
du F VIII dans le plasma (et peut-être aussi, au niveau de la
brèche
vasculaire).
La
liaison
non
covalente
des
deux
protéines empêche la dégradation du F VIII par les enzymes
protéolytiques (Weiss et coll. 1977) et son inactivation par
la protéine C activée (Koedam et coll. 1988; Lollar et coll.
1991; Fayet coll. 1991)
(Fig 5).
dB. rôle dans l'athérosclérose
Le
vWF
semblerait
jouer
un
rôle
dans
l'athérosclérose,
mais ceci n'a pas été bien déterminé.
En
effet, certains auteurs suggèrent que, bien que le rôle de la
thrombose
dans
les
débuts
de
l'athérosclérose
soit
peu
évident, i l est fort probable que la thrombose soit impliquée
dans les étapes
ultérieures de l'athérosclérose spontanée,
dans
les premiers stades des
syndromes de l'athérosclérose
accélérée et dans l'athérosclérose suite à la transplantation
cardiaque. Par conséquent,
sachant le rôle important du vWF
dans la thrombose, i l est naturel d'envisager son implication
dans l'athérosclérose (Fuster et coll. 1991b). D'autre part,
des
études
effectuées
chez
des
porcs
montrent
que
ceux
atteints de la maladie de Willebrand sévère développent moins

49
d'athérosclérose aortique que
les normaux
(Fuster et coll.
1978, 1991a et b). Mais i l est clair que l'absence du vWF ne
provoque pas une protection absolue contre l'athérosclérose
(Griggs et coll.
1981;
Bellinger et coll.
1987;
Nichols et
coll. 1990, 1991).

50
III. MATERIELS ET METHODES

51
Les animaux utilisés sont le cobaye et le rat.
Des cobayes mâles Hartley Strain (Charles River France, st
Aubain Les Elbeufs,
France) de 300-400 g et des rats de 300
à 500 g sont mis à notre -disposition une semaine avant les
expériences.
Toutes
les
études
effectuées
sur
les
animaux
se
sont
déroulées
sur
le
plan
éthique
selon
les
directives
et
principes institutionnels de l'INSERM (Institut National de
la santé et de la Recherche Médicale),
de l'INRA (Institut
National
de
la
Recherche
Agricole)
et
du
CNRS
(Centre
National de la Recherche Scientifique).
A.
ETUDE
IN
VIVO:
MODELE
DE
THROMBOSE
EXPERIMENTALE
INDUITE
PAR
RAYON
LASER
SUR
LES
ARTERES
MESENTERIQUES
DE
COBAYE.
Les
études
in vivo
ont
été effectuées
la plupart
sur
le
cobaye et parfois sur le rat.
1. Choix du cobaye
Ce modèle
est basé
sur
une
lésion
de petites
artères
mésentériques (100-350 ~m de diamètre interne) de cobaye par
un
laser pulsé à colorant
qui
produit,
in vi va,
sous
des
conditions
naturelles
de
flux
sanguin,
une
désendothélialisation
relativement
spécifique
(seule
la
monocouche
de
cellules
endothéliales
est
détruite,
la
limitante élastique
interne est
intacte)
qui
aboutit à un

52
thrombus purement plaquettaire.
Le cobaye a été choisi comme modèle animal pour plusieurs
raisons:
-
1°)
nous avons
la possibilité de nous procurer des
anticorps monoclonaux,
spécifiques de cette espèce,
dirigés
contre les glycoprotéines de la membrane plaquettaire (GPlb-
IX
et
GPllb/llla)
(Becker
et
Miller,
1989;
Kupinski
et
Miller,
1989).
- 2°) nous avons pu obtenir des anticorps monoclonaux,
qui reconnaissent des épitopes dont la localisation est bien
établie,
dirigés contre le vWF humain et qui
interagissent
avec
le vWF de cobaye
(Meyer D,
cissé-Thiam M,
Drouet LO,
travaux non publiés).
- 3°) il Y a une homologie assez remarquable entre le
vWF humain et celui du cobaye puisque nous avons pu montrer
que des peptides, synthétisés à partir de la séquence du vWF
humain,
inhibaient les interactions plaquettes-vWF induites
par
la
ristocétine
et
la
botrocétine
chez
le
cobaye.
Ces
résultats concordent,
en majeure partie,
avec ceux obtenus
par d'autres auteurs dans des expériences similaires avec le
système humain
(Mohri et coll.
1988,
1989;
Girma et coll.
1990).
les
conditions
circulatoires
dans
la
microcirculation mésentérique répondaient
à
nos
impératifs
hémorhéologiques. Bien qu'il n'y ait pas eu de mesure directe
pour chaque artère étudiée, les vitesses de cisaillement sont
estimées
au
dessus
de
1000
sc~,
et
correspondent
aux
conditions rhéologiques où le rôle du vWF dans l'adhésion est

53
prépondérant (Turitto et Baumgartner 1982). Cette estimation
est
basée
sur
des
mesures
directes
des
vitesses
de
circulation effectuées dans des artérioles normales de lapin
(Tangelder et coll. 1988).
2. Protocole expérimental
a. Préparation de l'animal
Les
cobayes
sont
anesthésiés
avec
du
sodium
thiopental
(Nesdonal,
Spécia Rhône Poulenc,
Paris France) à la dose de
50
mg/kg,
administré
en
deux parties,
une
par
voie
sous-
cutanée
et
une
deuxième
par
voie
intrapéri tonéale.
Cette
anesthésie
dure
au
moins
deux
heures,
temps
qui
couvre
largement
la durée
de
l ' expér ience.
L'abdomen est ensuite
rasé et une laparotomie de 3 cm effectuée pour exposer le
mésentère. Les petites artères
mésentériques individuelles
(diamètre externe de 200 à 600 ~m, diamètre interne de 150 à
350 ~m) sont étalées sur la platine thermostatée à 37° C d'un
microscope
de
dissection
(Olympus,
Tokyo,
Japon)
et
transilluminées par
une
source
de
lumière
froide
délivrée
sous la préparation par un faisceau de fibres optiques.
Le
péritoine est régulièrement irrigué par une solution de NaCl
0,154 M à 37° C pour éviter la déshydratation des vaisseaux.
Tous les animaux sont maintenus sous respiration spontanée
sans l'aide d'un respirateur et la température rectale stable
mesurée en permanence pour vérifier si l'animal est dans les
conditions physiologiques normales. A la fin des expériences,
les
animaux
sont
sacrifiés
par
l'administration
d'une
overdose de nesdonal.

54
b. Induction de la lésion
Un laser azote pulsé
(GBM,
Sopra,
Bois Colombes,
France)
capable
de
délivrer
des
pulses
de
5
nanosecondes
d'une
énergie au dessus de 2,5 mJ à une fréquence fixée à 1,5 Hz,
est utilisé pour pomper un laser à colorant. Une solution de
concentration finale
de
2,1 mM de
stilbène
420
(Exociton,
Optilas, Evry, France) dissoute dans un mélange d'éthanol/eau
(75% /
25%, v/v) est utilisée pour amener le laser à colorant
à 427 nm (longueur d'onde qui correspond au pic d'absorption
de l'hémoglobine). L'énergie délivrée par le laser à colorant
est
enregistrée
par
un
énerg imètre
pyroélectr ique
(Laser
Précision Inc.,
Yorkville,
NY). Le rayon laser est focalisé
sur une tache de 100 ~m de diamètre sur la face adventitielle
de la paroi du vaisseau cible. A la longueur d'onde utilisée,
une part minimale
de
l ' énerg ie
est
absorbée
par
la paroi
vasculaire durant la traversée du rayon,
mais à l'interface
entre
la paroi vasculaire et
le
sang circulant,
l'énergie
incidente
photonique
est
transformée
par
l'hémoglobine
contenue dans les globules rouges en énergie calorique. Mais
la durée de pulse est si courte (5 ns) par rapport au temps
de
relaxation
thermique
(estimé
environ
a
l
ms
pour
les
micro-vaisseaux de la peau (Anderson et Parrish,
1981»
que
l'effet n'est pas thermique mais similaire à celui d'une onde·
de choc. L'effet très localisé à l'interface entre la paroi
vasculaire et le sang circulant affecte surtout les cellules
endothéliales qui tapissent la surface interne de la paroi
vasculaire et quelques globules rouges circulants (dont les
débris sont transportés par le courant sanguin dès que les

55
cellules sont détruites). Une séquence de 30 pulses, chacune
délivrant une énergie de 25 ~J est utilisée pour obtenir une
lésion
endothéliale
plus
reproductible
(Drouet
et
coll.
1986).
La
microscopie
électronique
a
été
utilisée
pour
prouver
que
la
lésion
était
localisée
à
la
monocouche
cellulaire
endothéliale,
et
établir
la
composition
du
thrombus qui est principalement plaquettaire (Drouet et coll.
1986).
c. Système d'observation et procédure expérimentale
L'observation
de
l'artêre
mésentérique
choisie
comme
cible
se
fait
par
une
loupe
binoculaire
stéréoscopique
(modêle SZ Olympus, Tokyo, Japon). Le trajet photographique,
qui
n'est
qu'une
diversion
d'une
des
deux
voies
d'observation,
a été adapté pour recevoir une caméra Charge
Couple
Device
(CCD)
(modêle
XC
37
noir
et
blanc
Sony,
Kanagawa-ken,
Japon).
Le signal vidéo
n'a été utilisé que
pour l'observation en temps réel sur un moniteur (Trinitron,
Sony,
Kanagawa-ken,
Japon)
ou pour l'enregistrement direct
magnétique
sur
magnétoscope
(NV9200,
Panasonic,
Osaka,
Japon).
D'autre
part,
grâce
à
un
logiciel
de
traitement
d'image, les images significatives peuvent être digitalisées
toutes les 2 seconds pendant la période d'observation, puis
les séquences digitalisées,
enregistrées.
A
la
sui te
de
la
désendothélialisation
focale
d' une
artêre mésentérique par rayon laser, le vaisseau est observé
pendant
une
période
de
15
mn.
Ensui te
le
mésentêre
est
déplacé en déroulant une autre partie de l'intestin, ce qui

56
permet d'étudier une deuxième artère mésentérique.
De cette
~açon séquentielle, six artères peuvent être étudiées pendant
une période de 100 mn chez
le même animal
(schéma dans le
paragraphe
IIIC).
Ce
modèle
est
approprié
pour
suivre
la
cinétique
de
l'activité
d'une
substance
après
son
administration
ou
pour
comparer
un
vaisseau
contrôle
aux
autres
vaisseaux
étudiés
après
l'administration
d'une
substance à tester chez le même animal.
Durant
la
période
de
15
mn
d'observation
de
chaque
artère,
un
thrombus
apparaît
nettement
après
un
temps
(environ 60 s) qui suit la lésion induite par laser, grossit,
devient
occlusif
puis
se
détache
de
la
paroi
vasculaire
lésée; un autre thrombus se développe à nouveau spontanément,
au même endroit de la lésion initiale et tout ce processus se
répète régulièrement de manière séquentielle. Les paramètres
qui sont enregistrés pour chaque artère sont:
- le délai d'apparition du premier thrombus après la lésion
- le nombre de thrombi qui se sont formés
- le temps que mettent les thrombi à emboliser
- la taille des thrombi,
occlusifs ou non
- le type d'embolisation,
à savoir une embolisation nette
en une seule masse ou en morceaux bien distincts ou alors une
embolisation en dégradation lente et progressive.
B. ETUDE IN VITRO DES FONCTIONS PLAQUETTAIRES
Les
réactifs
utilisés
pour
induire
l'agrégation
plaquettaire sont l'adénosine diphosphate (ADP)
(Sigma,
St-
Louis,
MO),
ristocétine
sulfate
(Diagnostica
Stago,

57
Franconville,
France)
et
la botrocétine,
un
don
du
Dr MS
Read, Université de Caroline du Nord à Chapel Hill.
1. Préparation des suspensions plaquettaires
Le sang est prélevé sur des animaux anesthésiés par une
ponction de l'aorte abdominale avec une aiguille à ailettes
de 19 G dans 0.1 (cobaye) ou 0.2 (rat) vol de 0.13 mol/L de
citrate trisodique dans des
tubes
en plastique.
Le plasma
riche en plaquettes (PRP) est préparé par une centrifugation
du
sang
à
900
x
g
pendant
75
sc.
Le
plasma
pauvre
en
plaquettes (Ppp) est préparé par une deuxième centrifugation
à 1500 x g pendant 15 mn.
La numération des plaquettes est effectuée en prélevant du
PRP
dans
un
tube
capillaire
selon
le
système
de
microcollection par Unopette
(Becton Dikinson,
Rutherford,
NJ),
puis
les
plaquettes
sont
comptées
à
l'aide
d'un
microscope à contraste de phase.

58
Figure 6: Thrombose (T) occlusive dans une artère
mésentérique
de
cobaye
à
la
suite
d'une
désendothélialisation par laser.
V: veine

59
2. Etude des fonctions p1aguettaires
L'agrégation plaquettaire est effectuée en utilisant la
technique turbidimètrique sur un module d'agrégation à deux
canaux
(Payton,
Toronto,
Ontario).
La
concentration
des
plaquettes
est
ramenée
avec
du
ppp
à
5
x
105
/1-11
pour
l'agrégation induite par l'ADP et la botrocétine et à 1.25 x
105/
1-11 pour l'agrégation induite par la ristocétine.
Deux
cuves contenant chacune un barreau aimanté sont placées dans
le compartiment thermostaté de l'agrégomètrei on met 400 1-1 1
de ppp dans l'une et 400 1-11 de PRP dans l'autre.
La vitesse
d'agitation dans
la cuve de l'agrégomètre est de 1200 rpm
(rotations par mn) à 37°C. Les agonistes sont ajoutés aux 400
1-11 de PRP à des concentrations finales de: 1,2 I-1mol/l pour
l'ADP,
l
mg/ml pour
la ristocétine et 6 unités/ml pour la
botrocétine. Les substances à tester sont ajoutées au PRP une
mn
avant
l'addition
de
l'agoniste.
Le
pourcentage
de
transmission
de
la
lumière
du
PRP
avant
l'addition
de
l'agoniste est arbitrairement de 0 % et celui du ppp de 100
%.
La vitesse
d'agrégation
est déterminée
à
partir
de
la
pente
maximale
de
la
phase
initiale
de
l'agrégation
et
calculée
comme
un
changement
du
pourcentage
de
la
transmission par rapport au temps (% T x mn-').
c. ETUDES EX VIVO
1. Etude des fonctions p1aquettaires en ex vivo
L'étude
des
effets
des
substances
testées
sur
les
fonctions
plaquettaires
en
ex
vivo,
a
été
effectuée

60
uniquement chez le cobaye et différemment selon la substance
à tester:
-
dans
le cas
des
anticorps,
deux protocoles ont été
utilisés.
Lorsqu'ils
sont
administrés
par
voie
intrapér i tonéale,
l ' expér imentation
au
laser
débute
24
h
après cette injection,
ce temps permettant la diffusion de
l'anticorps dans les vaisseaux; lorsqu'ils sont injectés par
voie intraveineuse,
l'expérimentation au laser débute 5 mn
après cette injection. Après l'étude complète de leurs effets
sur
la
thrombose
in
vivo
induite
par
laser,
le
sang
est
prélevé par l'aorte abdominale et citraté comme décrit ci-
dessus,
puis centrifugé pour obtenir du PRP et du ppp pour
l'étude de l'agrégation plaquettaire induite par l'ADP,
la
r istocétine
ou
la
botrocétine,
dans
les
mêmes
conditions
qu'in vitro. Les résultats obtenus sont comparés à ceux des
animaux non traités.
-
dans le cas des peptides:
le sang est prélevé par un
cathéter posé dans
l'artère carotide et
anticoagulé comme
précédemment
décrit
15
mn
après
l'injection
par
voie
intraveineuse
des
peptides.
L'agrégation
plaquettaire
est
étudiée
avec
les
mêmes
agonistes
(ADP,
ristocétine,
botrocétine)
et
comparée
à
celle
effectuée
avec
du
PRP
collecté 15 mn avant l'injection des peptides.
2. Mesure du temps de saignement
Les
mesures
du
temps
de
saignement
ont
été
effectuées uniquement chez le cobaye. La technique utilisée
pour mesurer le temps de saignement est adaptée à partir de
la technique d'Ivy, utilisée chez l'homme et consiste en une

61
incision
standardisée
avec
un
instrument
automatique
(Surgicutt,
Internationale
Technique
Corporation,
Edison,
NJ), en se basant sur un modèle déjà utilisé chez le cobaye
(Becker et Miller,
1989). Les pattes postérieures du cobaye
anesthésié sont rasées et désinfectées avec de l'alcool. Un
brassard de tension spécial est construit par nous mêmes avec
une membrane
à
dialyse
(Spectra/Por,
Polylabo
Paul
Block,
Paris,
France)
de
0,6 x 9 cm et connecté,
d'une part à un
tube en T, et d'autre part à un sphygmomanomètre. Le brassard
est gonflé jusqu'à 40 mm Hg près d'une incision faite avec
l'instrument Surgicutt
sur
la face
ventrale de
la cuisse.
Toutes les 30 sc, le sang est absorbé par un papier filtre en
prenant soin de ne pas toucher directement la plaie pour ne
pas perturber le clou hémostatique qui se forme. La mesure du
temps de saignement se fait en 6 points pour chaque cobaye 5
mn après
la fin de
l'étude de l'in vivo
(80 à
100 minutes
après l'injection des anticorps), ou toutes les 15 mn pendant
2 heures (aussitôt après l'injection des peptides).

62
IVo RESULTATS

63
EFFET ANTITHROMBOTIQUE DU KRDS,
PEPTIDE DE LA
LACTOTRANSFERRINE, COMPARE AU RGDS
"'~
(THE ANTITHROMBOTIC EFFECT OF KRDS, A LACTO~ERRIN PEPTIDE,
COMPARED WITH RGDS)
L.
DROUET*oA,
C.
BAL
DIT
SOLLIER OA,
M.
CISSE-THIAMo*,
G.
PIGNAUD*,
E. MAZOYERo, A.M. FIAT+,
P. JOLLES+,
J.P. CAEN*oA.
° I.V.S.,
* unité 150 INSERM, URA 334 CNRS & A Centre Claude
Bernard sur l ' Hémostase et
la Thrombose,
8,
rue G.
Patin,
Hôpital Lariboisière,
Paris 75010.
+
Laboratoire des protéines,
UA CNRS
1188,
Université de
Paris V,
45 rue des st. Pères,
Paris 75006.
Nouvelle Revue française d'hématologie 1990, 32: 59-62

64
Toutes les protéines adhésives se liant aux intégrines ont
en
commun
une
séquence
arginine-glycine-acide
aspartique
(RGD):
c'est
le
cas
du
vWF.
In
vi tro,
les
peptides
qui
contiennent cette séquence RGD inhibent l'interaction de ces
protéines
adhésives
avec
les
plaquettes,
en
particulier
l'adhésion et l'agrégation plaquettaires (Gartner et Bennett,
1985;
Fressinaud et coll.199ü).
Peu d'expériences in vivo
soutiennent
leurs
effets
potentiels
pour
la
thérapie
antithrombotique (Coller et coll. 1986, 1988; Cadroy et coll.
1989a, Shebuski et coll. 1989).
Les similarités fonctionnelles
entre la coagulation du
lait
et
celle
du
plasma,
ainsi
que
les
homologies
moléculaires
entre
une
protéine
plasmatique
(fibrinogène
chaine gamma)
et une protéine du lait
(Kappacaséine),
nous
ont fait rechercher la présence d'une séquence RGDS dans les
protéines
du
lait.
Une
séquence
KRDS
(Lys-Arg-Asp-Ser)
théoriquement analogue à celle du RGDS a été trouvée dans la
lactotransferrine humaine.
Cette étude compare dans
deux espèces
animales
(rat et
cobaye),
in
vitro
(agrégation
plaquettaire)
et
in
vivo
(modèle expérimental de thrombose artérielle) les effets du
KRDS et ceux d'une séquence modifiée:
le KRDR (Lys-Arg-Asp-
Arg), par rapport à ceux du RGDS.
Après vérification de leur effet in vitro sur l'agrégation

65
des
plaquettes
de
cobaye
et
de
rat,
induite
par
l ' ADP,
l'étude
in
vivo
est effectuée
chez
les
deux
espèces.
Les
peptides ont été injectés en bolus intraveineux aux animnaux,
à 5 doses différentes de 0.5 à 3 ~M/kg.
In vitro:
Chez
le
rat,
alors
que
le
RGDS
est
sans
effet
sur
l'agrégation des plaquettes induite par l'ADP,
le KRDS a un
effet
inhibiteur signif icatif ;
chez
le cobaye,
le peptide
RGDS produit un effet inhibiteur dose-dépendant significatif
sur
l'agrégation
induite
par
l ' ADP
(ICso
=
l
~M et
100%
d'inhibition à 1.5 ~M) et le KRDS produit un effet similaire
à celui du RGDS (Fig.l); le KR DR un effet minimal (Tableau 1)
chez les deux espèces.
Chez
les
deux espèces,
l'association
des
deux peptides,
RGDS
et
KRDS,
ne produit pas
plus
qu'un
effet
inhibiteur
additif sur l'agrégation plaquettaire induite par l'ADP.
L'effet inhibiteur du RGDS nous
fait avancer l'hypothèse
que
l'interaction
entre
le
complexe
GPllb/llla
et
les
protéines adhésives pourrait être semblable à celle qui a été
déjà observée chez l'Homme.
In vivo:
Chez les deux espèces animales,
le RGDS a une activité

66
antithrombotique
dose-dépendante
(ICso
= env
l
~M/kg)
similaire à celle du KRDS mais plus prononcée que celle du
KRDR.
Cette activité du RGDS dure pendant 60 minutes après
l'injection
en
bolus
intraveineux
du
peptide
avec
une
déstabilisation des
thrombi
qui
se forment
(ceux-ci étant
moins stables que ceux observés dans les artères contrôles
avant l'injection du peptide).
L'injection
concommittente
des
2
peptides
a
un
effet
potentialisateur dans
les
deux espèces
animales
mais plus
significatif chez le rat que chez le cobaye.
Ces résultats démontrent que le KRDS, peptide présent dans
la lactotransferrine humaine,
a in vitro une activité anti-
plaquettaire et
in vivo une
activité antithrombotique.
Le
mode d'action du KRDS est probablement différent de celui du
RGDSi
l'activité est
spécifique de
la
séquence puisqu'une
séquence proche (KRDR) devient pratiquement inactive.

67
~t;f' ,-
i ;:"l
RAT
COBAYE
l
,.
: ........ i
i ~i-ue
:
\\:
_ KRDS
_ KRDS
j'.
Pi! :;
+ RGDS
+ RGDS
E-l, '
Soo
H '.'
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llI' RG9S
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1 0 · '
1 0 "
1 0 "
::c
10-'
10-'
1 0 "
z
H
CONCENTRATION
(~M)
l'
Figure
1.
Effets
du
KRDS
et
du
RGDS
sur
l'agrégation
plaquettaire induite par l ' ADP
(1. 2~) chez le rat et le
cobaye. Le KRDS et le RGDS sont testés individuellement ou en
association: une dose constante de RGDS (500 ~M) chez le rat
et
(50 ~M) chez le cobaye est ajoutée à des concentrations
variées de KRDS.

68
PEPTIDES
RGDS
KRDS
KRDR
RAT
> 10-2
> 5 X 10-4
> 2 X 10-3
COBAYE
1. 5 X 10-4
6 X 10-4
> 10-2
Tableau 1. Effets des peptides du lait sur l'agrégation
plaquettaire induite par l'ADP. Concentrations
produisant un taux d'inhibition de 50%
(CI 50)
en ~mol/L. La technique est décrite dans
"Matériels et Méthodes".

69
PEPTIDES
RGDS
KRDS
KRDR
DI 50
2
0.75
1. 25
RAT
TEMPS
> 80 mn
> 80 mn
> 80 mn
DI 50
0.75
l
NT
COBAYE
TEMPS
< 60 mn
< 40 mn
NT
Tableau 2. Activité antithrombotique des peptides du lait.
DI: doses des peptides
(~M/KG) produisant 50%
d'inhibition.
Temps (mn): correspond à la durée de l'activité
inhibitrice des peptides.
NT:
non testé

70
RGDS
RGDS
RGDS
KRDS
KRDS
+
PEPTIDES
KRDS
\\-lM/KG
1
0.5
0.35
0.18
0.5
RAT
+
0.18
Effet
( %)
< 10%
< 10%
< 10%
< 10%
70%
\\-lM/KG
0.5
0.25
0.35
0.18
0.25
+
COBAYE
0.18
Effet
( %)
10%
<10%
25%
< 10%
38 %
Tableau 3.
Inhibition de l'activité thrombotique par les
peptides du lait.
Pour tester l'effet
concommittent du RGDS et du KRDS,
les doses
associées correspondent à la moitié de chaque
dose de peptide produisant un effet minimal.

71
REDUCTION DE LA FORMATION DU THROMBUS PAR LES FRAGMENTS
F(ab')2 DE PG-l, UN ANTICORPS MONOCLONAL ANTI-GLYCOPROTEINE
lB PLAQUETTAIRE DE COBAYE
(REDUCTION IN THROMBUS FORMATION BY PG-1 F(ab')2'
AN ANTI
GUINEA PIG PLATELET GLYCOPROTEIN lB MONOCLONAL ANTIBODY).
Jonathan L. MILLERo, Marème CISSE-THIAM*,
Ludovic o. DROUET*
° Department of Patho1ogy, Suny Hea1th Science Center
* Unité 150 INSERM et Institut des Vaisseaux et du Sang
Arteriosc1erosis and Thrombosis, 11: 1231-1236, 1991

72
Récemment (Kupinski et Miller,
1986a, 1986b; Becker et
Miller
1989),
des
études
ont
démontré
que
des
fragments
F(ab')2
de
PG-l,
un
anticorps
monoclonal
dirigé
contre
la
GPIb/IX de cobaye, inhibait complètement l'interaction vWF à
un de ses récepteurs de la membrane plaquettaire GPIb/IX.
Dans cette étude, 12 cobayes ont été injectés avec soit du
F(ab')2 de PG-l (2.3mg/kg), soit avec uniquement une solution
physiologique,
24 heures avant l'étude in vivo.
Toutes les
expériences se sont déroulées de façon aveugle:
l'anticorps
et la solution tampon ont été conservés par aliquotes de Iml
congelés
et
codés;
le
code
n'est
dévoilé
qu'à
la
fin
de
toutes
les
expériences.
A
la
fin
de
l'étude
in
vivo,
l'agrégation plaquettaire induite par la ristocétine et celle
par l'ADP sont étudiées.
In vivo
- Nombre de thrombi formés par vaisseau
* Chez les animaux contrôles, la plupart des vaisseaux
individuels présentent trois à quatre thrombi, alors que chez
les
animaux
traités
avec
l'anticorps,
la
plupart
des
vaisseaux présentent seulement
un
thrombus
ou même
aucun.
(Tableau 1).
* La moyenne du nombre de thrombi par vaisseau chez les
animaux
traités
avec
l'anticorps
(1.125)
est
significativement plus faible que la moyenne chez les animaux
contrôles (3.40),
avec p< 0.001 (Fig.l).

73
- Temps de formation de la première thrombose
En
ce
qui
concerne
le
temps
de
formation
du
premier
thrombus après la désendothélialisation par rayon laser,
il
n' y
a
pas
de
différence
significative
entre
les
groupes
traités (moyenne = 52.8 sc) et les groupes contrôles (moyenne
= 58.5 sec) (Tableau 2).
- Temps d'embolisation de la première thrombose
*Chez
les
animaux
contrôles,
la
moyenne
du
temps
d'embolisation
de
la
première
thrombose
formée
après
la
désendothélialisation
est
de
239
sc.
Le
détachement
des
thrombi de la paroi vasculaire lésée par le rayon laser, chez
les animaux contrôles, survient de façon très nette, avec 75%
des
thrombi qui embolisent en moins de
5 minutes après
la
formation du thrombus avec 100% de thrombi qui se détachent
de la paroi vasculaire en 6.5 mn du début de leur formation.
* Chez les animaux traités avec l'anticorps, la moyenne du
temps d'embolisation est de 374 sc, plus de 1.5 fois de celle
observée chez les contrôles. Une dissolution progressive des
thrombi, plutôt qu'un détachement net de la paroi vasculaire
lésée,
est
typiquement
observée.
Dans
31%
des
vaisseaux
étudiés chez ces animaux,
aucune embolisation ne survient;
pour
les
vaisseaux
restants,
seulement
9%
des
thrombi
embolisent en 5 minutes à partir de leur apparition, suite à
la lésion.

74
ex vivo
- agglutination plaquettaire induite par la ristocétine
*
Parmi
les
6
animaux
traités
avec
les
fragments
F(ab')2 de l'anticorps PG-l, 4 montrent une inhibition totale
de l'agglutination plaquettaire induite par la ristocétine.
Par
contre,
chez
les
2
animaux
restants
injectés
avec
l'anticorps,
l'agglutination
plaquettaire
induite
par
la
ristocétine
reste
intacte,
ce
qui
suggère
une
absence
de
l'action
de
l'anticorps
sur
les
plaquettes
in
vivo.
Mais
cette absence d'activité est due certainement à une mauvaise
administration de
l'anticorps car,
in vivo,
ces
2
animaux
présentent
une
moyenne
du
nombre
de
thrombi
formés
par
vaisseau similaire à celle observée chez les contrôles. Aussi
avons-nous exclu ces 2 animaux du groupe des traités.
* Chez l'un des 6 animaux contrôles qui n'ont reçu que du
PBS,
l'étude de
l'agrégation plaquettaire n'a pas pu être
effectuée (prélèvement sanguin raté). Bien que les résultats
de l'in vivo chez cet animal concordent avec ceux des autres
contrôles, nous l'avons exclu du groupe des contrôles car il
nous
a
été
impossible
de
vérifier
si
l'agglutination
plaquettaire induite par la ristocétine était intacte, le but
de
l'utilisation
de
l'anticorps
étant
de
bloquer
l'axe
GPlb/vWF.
- agrégation plaquettaire induite par l'ADP
L'agrégation plaquettaire
induite par
l'ADP
n'est pas

75
modifiée chez les animaux traités, comparée à celle observée
chez les animaux contrôles.
Le traitement par les fragments F(ab) '2 de l'anticorps PG-
l,
tel qu'il est observé dans ce
système modèle,
brise le
cycle répétitif de la formation,
de l'embolisation et de la
reformation des thrombi.

76
Thrombi formés dans les vaisseaux nO.
Moyennes
Thrombi/
1
2
3
4
vaisseau
Traitement
anticorps
2
o
1
1
1. 00
anticorps
1
o
1
1
0.75
anticorps
1
1
1
2
1. 25
anticorps
1
2
1
2
1. 50
contrôles
4
3
3
4
3.50
contrôles
5
4
3
4
4.00
contrôles
4
3
3
3
3.25
contrôles
3
4
4
4
3.75
contrôles
2
3
2
3
2.50
Tableau 1. Effets de F(ab')2 de PG-l sur la formation du
thrombus induite par la lésion par laser des
artères mésentériques de cobaye.

77
,
::3
rel
..
Q)
lfl
lfl
.,-l
rel
:>
.........
.,-l
3
.0
E
0
\\.-l
..c:
+J
Q)
'0
2
Q)
\\.-l
.0
E
0
C
1
::3
'0
Q)
ccQ);::.,
0
0
::E:
ANTICORPS
CONTROLE
Figure 1. Réduction de la formation des thrombi
vasculaires par les fragments F(ab')2 de PG-
1.
Les valeurs représentent des moyennes ±
SEM du nombre de thrombi formés dans chacun
des 4 vaisseaux étudiés successivement chez
un même animal.

78
N°.
des vaisseaux lésés
l
2
3
4
Temps
Traitement
(sc)
anticorps
40
60
60
53.3
anticorps
50
45
40
45.0
anticorps
60
80
40
80
65.0
anticorps
45
50
45
55
48.8
Moyenne
52.8
contrôles
270
40
85
60
113.8
contrôles
40
45
45
45
43.8
contrôles
45
45
40
50
45.0
contrôles
40
40
45
45
42.5
contrôles
55
45
50
40
47.5
Moyenne
58.5
Tableau 2. Effets des FCab')2 de PG-l sur le temps de
formation de la première thrombose,
suite à la
lésion par laser des vaisseaux mésentèriques de
cobaye.

79
EFFET DES PEPTIDES DERIVES DU DOMAINE DE LIAISON DU vVWF AU
COMPLEXE GPIb/IX CHEZ LE COBAYE
(PEPTIDE 692-708 DERIVED FROM THE GPlb-BINDING DOMAIN OF
VON WILLEBRAND FACTOR IS A POTENT INHIBITOR
OF IN VIVO THROMBOSIS IN THE GUINEA PIG)
CISSE-THIAMO
Marème,
PERREAULT*
Pierre,
CHENU*
Jacques,
GIRMA+ Jean Pierre, MEYER+ Dominique,
DROUETo Ludovic o.
° INSERM U 343,
* SANOFI Recherche,
+ INSERM U 143
Thrombosis and Haemostasis 1991;65(6)
pl180

80
Le domaine du vWF qui se lie à la GPlb a été localisé en
détail
sur deux
séquences
non contiguës de
la molécule du
vWF, chacune contenant 15 acides aminés: les peptides 474-488
et 694-708 (Mohri et coll. 1988).
Dans cette étude, deux peptides, dérivés de la séquence du
domaine du vWF (AA 474-488 et 692-708) ont été synthétisés,
purifiés
et
testés
in vitro,
ex
vivo et in vivo chez
le
cobaye
comparativement
à
un
peptide
contrôle
qui
est
une
séquence du fragment alpha l
CB4 peptide du collagène type
III (Legrand et coll. 1980). In vitro, ces deux peptides sont
ajoutés à des concentrations de 3.4 ~M à 1.2 mM à du PRP afin
de tester leur effet sur l'agglutination plaquettaire induite
par la ristocétine et la botrocétine. Pour l'étude ex-vivo et
in-vivo,
ces
deux
peptides
ont
été
injectés
en
bolus
intraveineux à différentes doses de 0.5 à 3 ~M/kg.
In vitro, les deux peptides (474-488 et 692-708) présentent
une
activité
inhibitrice
similaire
sur
l'agglutination
plaquettaire à la ristocétine.
Le peptide 692-708 est plus
efficace
que
le
peptide
474-488
sur
l'inhibition
de
l'agglutination plaquettaire à la botrocétine. Quand ces deux
peptides
ont
été
associés
pour
tester
l'activité
de
l'ensemble sur l'agglutination plaquettaire à la ristocétine
et à la botrocétine, un effet uniquement additif est observé
dans les deux cas. Le peptide contrôle ne produit aucun effet

81
significatif sur l'agglutination induite par la ristocétine
et par la botrocétine.
Ex vivo,
le peptide 692-708 (2.5 ~M/kg), inhibe totalement
l'agglutination à
la ristocétine et à
la botrocétine alors
que le peptide 474-488 (3 ~M/kg) présente uniquement un effet
inhibiteur partiel
(moins
de
20
%).
De même,
in vivo,
le
peptide 692-708 inhibe remarquablement le nombre de thrombi
formés
(inhibition:
83
.± 17 % à 2. 5 ~M/kg) alors que le
peptide 474-488 a seulement un effet inhibiteur modéré (47 .±
16 % à 3 ~M). En présence du peptide 692-708 (2.5 ~M/kg), les
thrombi qui se forment mettent plus de temps pour atteindre
une taille rarement occlusive et embolisent en des particules
fines contrairement aux thrombi du contrôle,
le plus souvent
occlusifs
et
embolisant
soit
en
une
seule
masse
soit
en
morceaux bien distincts. De nouveau, aucun effet significatif
n'est
observé
de
la
part
du
peptide
contrôle
sur
la
thrombose.
L'injection du peptide 692-708 à 2.5 ~M/kg ne prolonge pas
le
temps
de
saignement
et
ne
modifie
pas
de
façon
significative
la
numération
plaquettaire.
Ceci
laisse
supposer,
que
le
peptide
692-708
agirait
surtout
sur
la
stabilisation du thrombus.

82
ABSTRACT
To test the role of von Willebrand factor (vWF) interaction
with
glycoprotein
lb/IX
(GPlb/IX) -binding
. in
thrombus
formation,
,two peptides
derived
from
the
sequence
of
the
GPlb/IX-binding domain of human vWF (AA 474 to 488 and 692 to
708) were synthesized and purified. Their effect was tested
in vivo in thrombus
formation
in
a
model
of
laser-injured
mesentery small arteries in the guinea pig and compared to
their effects upon in vitro and ex vivo platelet function. In
vivo,
peptide 692-708 markedly inhibited (83 ± 17 % at 2.5
~mol/kg) the number of recurrent thrombi whereas peptide 474-
488
only
had
a
moderate
inhibi tory
effect.
There
was
no
effect of peptide 692-708 upon the bleeding time or platelet
count. Ex vivo, peptide 692-708 (2.5 ~mol/kg) totally blocked
ristocetin-
and
botrocetin-induced
platelet
agglutination
whereas
peptide
474-488
(3
~mol/kg)
only
had
a
partial
effect.
In
vitro,
both
vWF
peptides
exhibi ted
a
similar
inhibitory
activity
upon
ristocetin-induced
platelet
agglutination;
conversely,
peptide 692-708 was more potent
than
peptide
474-488
in
inhibiting
botrocetin-induced
agglutination. When both peptides were simultaneously added,
an additive inhibitory effect was observed upon ristocetin-
as well as botrocetin-induced agglutination. In conclusion,
peptidic
antagonism
of
the
vWF-GPlb/IX
pathway,
without
prolonging the bleeding time, inhibits thrombosis in vivo and
can
thus
represent
a
promising
target
for
designing
new

83
antithrombotic drugs.

84
INTRODUCTION
von Willebrand factor (vWF) is a multimeric glycoprotein
(1) synthesized by endothelial cells (2) and megakaryocytes
(3,4),
stored in the platelet alpha granules (5) and in the
endothelial cell Weibel Palade bodies (6).
Plasma vWF which
is mostly of endothelial origin circulates at a concentration
of 7 ~g/mL (7) without"interacting with platelets. Following
vessel
inj ury
under
high
blood
shear
rates
( 8,
9),
vWF
mediates
the
adhesion
of
platelets
to
the
exposed
subendothelium
(10)
and
this
step
is
crucial
for
the
formation of the hemostatic plug.
The mature vWF subunit consists of 2050 amino acids (11)
and
con tains
distinct
binding
domains
for
the
platelet
membrane
glycoproteins
lb/IX
(GPlb/IX)
(12)
and
lIb-IlIa
(GPI Ib-I lIa)
(13,
14)
as
weIl
as
for
consti tuents
of
the
vessel
wall:
collagen
(15),
glycosaminoglycans
(16)
and
microfibrils
(17).
The
binding
of
vWF
to
GPlb/IX,
which
induces the adhesion of platelets to the subendothelium, does
not
require
platelet
activation
but
a
conformational
modification of vWF. A similar change can be experimentally
reproduced
in
vitro
in
the
presence
of
the
antibiotic
ristocetin (18) or of the Bothrops venom component botrocetin
(19).
The binding of vWF to GPllb-Illa (20),
implicated in
platelet aggregation, requires pre-activation of platelets by
ADP,
epinephrine
or
thrombin
( 21).
Recent
studies
have
indicated that
three
distinct
domains
on
the
vWF protein

85
interact with GPlb/IX, heparin and collagen. The sequence of
these domains is localized between residues 449 and 728. The
binding domain of vWF for GPlb has been further localized on
two non contiguous peptides: 474-488 and 694-708 (22).
In the present study,
these two peptides were analyzed
for
their
abili ty
to
inhibi t
arterial
thrombosis
in
the
guinea pig.
This
species
was
chosen
for
several
reasons.
First,
guinea pig
GPlb/IX exhibi ts
close
homology
to
the
human
prote in
(23).
Second,
the
putative
GPlb/IX
binding
region
of
human
vWF
appears
conserved
in
guinea
pigs
as
suggested
by
studies
with
monoclonal
and
polyclonal
antibodies against various epitopes of the human vWF (Meyer
D,
cissé-Thiam
M,
Drouet
LO:
unpublished
observations).
Previous
studies
in
guinea
pigs
have
shown
that
in
vivo
administration
of
a
monoclonal
antibodie
directed against
guinea pig GPlb reduced thrombosis
(24)
without prolonging
the bleeding time (25).
We report that vWF peptide 692-708
and, to a lesser extent, peptide 474-488, markedly inhibit in
vivo arterial
thrombosis
in guinea pigs.
Our data suggest
that the GPlb/IX-vWF interaction is a promising target for
antithrombotic therapy.
MATERIAL AND METHODS
peptides: Preparation and purification.
The
two
vWF
peptides
used
in
these
experiments
were

86
synthesized by a solid phase method on a Beckman model 990
peptide synthesizer. After completion of the synthesis, the
protected peptide-resin was treated by hydrogen fluoride for
one hour at DoC to cleave the peptide from the resin anchor
as weIl as
to deprotect the side chain functional groups,
except acetamidomethyl on cystein.
Peptide
692-708
was
purified
by
countercurrent
chromatography.
Peptide
474-488
was
purified
by
anion-
exchange chromatography (Pharmacia Q Fast FlowTM)
followed by
reverse phase chromatography
(Waters Delta-Pakm
100 Â,
15
Il).
The
puri ty
of
the
final
products
was
established by
analytical HPLC on a C18 column (VYDAC 218 TP 104); eluant:
A, 0.1 % aqueous trifluoroacetic acid (TFA), B: 0.1 % TFA in
60 % acetonitrilei gradient,
20 % B /
80 % A to 60 % B /
40
% A within 30 min. The identity of the peptides was confirmed
by mass spectrometry on a double-focusing instrument ZAB-2E
(VG Analytical,
Manchester,
UK) equipped with a cesium ion
gun operating at
an energy of
35
kV ~
The
resul ts
clearly
confirmed the molecular weight of the peptides and the MS/MS
spectra
confirmed
their
sequence,
since
the
fragments
observed were those predicted by Roepstorff's fragmentation
nomenclature.
A
peptide
from
type
III
human
collagen
fragment
(designated
as
alpha
l
(III)
CB4
peptide)
was
used
as
control.
This peptide,
lining from residues
76 to 83,
has
been
synthesized
by
the
fragment
coupling
method
as

87
previously described by Legrand et al
(26).
Animals.
Hartley Strain guinea pigs were purchased (Charles River
France,
st Aubain Les Elbeuf,
France)
and delivered to our
facilities at least one week prior to experimentation. Male
guinea pigs,
300-400 g,
were used.
All animal studies were
conducted
within
the
guidelines
of
INSERM
and
CNRS
insti tutional policies. Animal facili ties and experimentators
have the compulsory authorizations and licenses to work with
animals.
In vitro aggregation studies.
The
reagents
used
to
induce
platelet
aggregation
were
adenosine diphosphate (ADP) (Sigma, ST Louis, MO), ristocetin
sulfate
(Diagnostica
Stago,
Franconville,
France)
and
botrocetin,
a
gift
of
Dr.M.S.
Read,
University
of
North
Carolina, Chapel Hill (19).
Preparation of platelet suspensions: Blood was drawn from
anesthesized guinea pigs by an abdominal aorta puncture with
a 19 G needle into 0.1 vol.
of 0.13 mol/L trisodium citrate
in plastic tubes. Platelet-rich plasma (PRP) was prepared by
centrifugation of blood at 900 x 9 for 75 sec. The platelet-
poor plasma (ppp) was prepared by a second centrifugation at
1500 x 9 for 15 min.

88
In vitro studies of guinea pig platelet function:
Platelet
aggregation was assessed by a turbidimetric technique on a
dual channel aggregation module (Payton,
Toronto, Ontario).
Plate let count was adjusted with ppp to 5 x 10s/~L for ADP
and botrocetin-induced platelet aggregation
and to
1.25
x
105/~L
for
ristocetin-induced
platelet
agglutination
and
stirred at 1,200 rpm at 37°C. Agonists were added to 0.4 mL
of
PRP
at
final
concentrations
of:
1. 2
~mol/L
for
ADP,
l
mg/mL
for
ristocetin
and
6
uni ts/mL
for
botrocetin
(19).
Dilutions of peptides were added to PRP l
min prior to the
addition of the agonist. The percent age of light transmission
of the platelet suspension before addition of the agonist was
"assigned a value of 0 % and that of PPP,
100%.
The rate of
aggregation
was
determined
from
the
maximal
slope
of
the
initial phase of aggregation and calculated as a change in
percentage light transmission over time (% T x min-').
For the synergistic effect study,
the two peptides were
simultaneously
added
to
PRP
at
their
least
effective
concentrations.
Ex vivo aggregation studies.
For ex vivo aggregation studies, different doses of the
peptides were individually injected as an intravenous
(iv)
bolus into guinea pigs 15 min before blood collection.
The
blood was drawn through a catheter inserted into a carotid
artery
and anticoagulated as described above.
The peptide

89
692-708 was injected at two concentrations of 1.25 and 2.5
~mol/kg; the peptide
474-488
at
two· doses
of
1.5
and
3
~mol/kg;
and the
control
peptide
at
a
concentration of
5
~mol/kg. A control aggregation response was performed in PRP
from
each guinea pig
collected 15
min
before
the peptide
injection.
In vivo thrombosis studies
The methodology used was according to Miller et al (24).
Animals:
guinea
pigs
were
anesthesized
with
sodium
thiopental (Nesdonal, Specia Rhône Poulenc, Paris, France) at
50 mg/kg in two divided doses,
one half subcutaneously (sc)
and one half intraperitoneally (ip).
This treatment induced
surgical anesthesia for over two hours,
sufficient for the
entire 90-100 min period of observation. The abdomen was then
shaved and a
3 cm incision was made through the abdominal
wall and peritoneum to expose the mesentery. The individual
mesenteric
arterioles
of
300-400
~m
diameter
were
transilluminated
on
a
thermostatically
(37°C)
controlled
stage of
a
specially modified dissecting microscope
(OMl-
Olympus,
Tokyo,
Japan) .
The
peritoneum
was
regularly
irrigated
with
0.154
mol/L
NaCl
at
37°C
to
prevent
dehydratation.
AlI animaIs exhibited stability of rectal temperature
throughout
the
experiments
and
were
maintained
on
spontaneous breathing. At the end of the experiments, animaIs

90
were sacrificed by administration of an over dose of sodium
thiopental.
Induction of the intimal
lesion:
A nitrogen
laser
(Sopra,
Bois Colombes,
France) delivering 5 nanosecond pulses of an
energy up to 2.5 mJ with a fixed repetition rate of 1.5 Hz
was used as the source to pump a dye laser. To tune the dye
laser to 427 nm (the wavelength of the first absorption peak
of hemoglobin),
this cavity was filled with a
solution of
stilbene
(Exociton Optilas,
Evry,
France)
in ethanol/water
(75
%,
25
%,
v/v)
at a final
concentration of 2.1 mmol/L.
Energy
delivered
by
the
dye
laser
was
monitored
with
a
pyroelectric energy meter (Laser Precision Inc.,
Yorkville,
N.Y.). The laser beam was focused on a 100 ~m diameter spot
on the adventitial side of the wall of the vessel.
Intimal
arterial
injury
was
produced
by
a
sequence
of
30
laser
pulses, each delivering 25 ~J of energy.
Measurement of thrombosis:
During
15
min
following
the
intimal
laser
injury
of
an
artery, the target vessel was carefully watched; the time at
which a new thrombus could first be visually detected and the
time
at which
the
thrombus
detached
from
the
vessel
wall
(embolization)
were
recorded.
At
the
end
of
this
15
min
observation period, the mesentery was moved to the region of
another loop of bowel,
allowing the study of another

91
.
Peptide
injection
AD
~ A 1
A2
A :5
01...---0
0
A 4
t
f'---
0
A 5
0
Q.)
1...
Q.)
t
0
CI)
1...
CI)
Q.)
t1...
o
CI)
Q.)
t
-1
o
1...
t
-1
0
CI)
Q.)
1...
....J
0
CI)
Q.)
-1
0
CI)
....J
0
...J
H--Hr----1
-20
0
5
20
40
60
80
100 (min)
Figure
1.
Scheme of
experimenta1
thr~mbosis. This
scheme
represents the procedure used to study the effect of a test
or control peptide upon thrombus formation induced by a dye
pu1sed laser in guinea pig mesentery small arteries. For each
of
6 animaIs,
an artery was prepared
(p)
and injured by a
sequence of 30 pulses of a dye laser,
each delivering 25 ~J
of energy, with a wavelength of 427 nM. Following injury, the
time of appearance of thrombi,
their time to embolization,
the quality of this embo1ization, and the number of thrombi
formed, were recorded over a 15 min observation periode
The
first vessel studied before any injection was used as control
(AO). The test or control peptide was then injected as an iv
bolus through the dorsal penis veine Another artery was then
prepared
andinjured
by
the
laser
and
the
thrombosis
parameters measured similarly to
the
control
artery.
Five
arteries
(Al
to
A5)
were
successively
studied
in
an
observation period of 100 min following the injection of a
peptide.

92
mesentery
artery.
In
a
sequential
manner,
six
mesentery
arteries
per
animal
were
studied
for
their
thrombogenic
response to a laser injury over a cumulative period of 120
min (Fig 1). The total number of thrombi sequentially formed
at each laser injury site of each vessel was the parameter
used to judge the thrombogenicity.
For each animal,
a mesentery artery,
studied before any
injection, was used as control. The control or test peptide
was then injected as an iv bolus through the dorsal penis
vein. Every 20 min, a mesentery artery was subjected to the
induction of the intimaI les ion followed by measurement of
experimental thrombosis (see below) so that 5 vessels were
sequentially studied for
a
period of
100 min,
after
the
injection of the peptide (Fig 1).
Measurement of bleeding time and platelet count
The technique used to measure the bleeding time was adapted
from the
Ivy
technique
used in humans
and consisted of
a
standardized incision with Surgicutt device
(International
Technique Corporation, Edison, N.J.)
(25). Adult male guinea
pigs
were
anesthesized
and
their
hind
limbs
shaved
and
disinfected
with
alcohol.
A
special
pressure
cuff
was
constructed
with
0.6
x
9
cm
of
a
dialysis
membrane
(Spectra/Por, Polylabo Paul Block, Paris, France), connected
to a
T formed tube,
and
joined to a
sphygmomanometer.
The
cuff was placed on the hind limb and inflated to 40 mm Hg

93
near an incision made on the ventral face of the thigh. The
Surgicutt device was
applied with minimal pressure to the
thigh
and
the
trigger
gently
pu shed
while
simul taneously
starting the stop-watch. Every 30 sec, the flow of blood was
wicked
with
filter
paper
(without
directly
touching
the
incision to prevent disturbance of the hemostatic plug) until
bleeding stopped. Blood from one incision was collected in a
capillary
tube
using
the
Unopette
microcollection
system
(Becton Dickinson, Rutherford, N. J .) and platelets counted by
phase-contrast microscopy.
To document the effect of the vWF peptide 692-708
(the
most effective peptide used)
on the hemostatic function in
the
guinea
pig,
bleeding
time
was
recorded
every
15
min
during
2
hours
after
injection
of
the
highest
dose
(2.5
llmol/kg)
used
in
vivo.
Blood platelet
count
was
measured
before and two hours after injection of the peptide.
Statistics.
AlI data represent the mean results from 6 different animaIs
and are expressed as mean ± SD (standard deviation). Student
t-test was used for statistic comparison.
RESULTS
In vitro studies: Both peptides 474-488 and 692-708 strongly
inhibited
ristocetin-
and
botrocetin-induced
platelet
agglutination (Fig 2).
Inhibition of ristocetin-induced

94
,-...
100
~
RISTOCETIN
BOTROCElïN
"'-'
l.L.
80
,
0
z
,
0
.......-1
z ~ 60
692-708
0
692-708
1- Z
a::l 1-
40
474-488
:c ::J
Z
--1
20
'-'
'-'
«
0
5
10
20
50
100
100
500 1000
PEPTIDES - (~mol/L)
Figure 2.
Inhibitory activity of vWF peptides
(474-488 and
692-708)
and
of
a
control
peptide
upon
ristocetin-
and
botrocetin- induced guinea pig platelet agglutination.
The
inhibitory
effect
of
the
peptides
was
assessed
on
the
velocity
of
ristocetin-
or
botrocetin-induced
platelet
agglutination.
Various concentrations of each peptide were
added under the
same volume
to
400
~L of
the
stirred and
diluted PRP (1.25 x 105 platelets/~L) one minute prior to the
addition of ristocetin (final concentration = l mg/mL) or to
400 ~L of the stirred PRP (5 x 105 platelets/~L) one minute
prior to the addition of botrocetin (final concentration = 6
units/mL).
Each point represents the mean result ± 5D of 6
determinations.

95
platelet agglutination appeared more pronounced with peptide
692-708
(100
% inhibition
at
a
dose
of
110
Ilmol/L)
th an
peptide
474-488
(100
%
inhibition
at
230
Ilmol/L).
The
inhibitory effect of both peptides was
less effective when
using
botrocetini
peptide
692-708
induced
an
inhibition
ranging
from
3 to
91
% for
concentrations
from
70
to
400
Ilmol/L. In contrast, peptide 474-488 required a higher range
of
concentrations
ie
300
to
1200
Ilmol/L
to
induce
an
inhibition from 0 to 80 % (Fig 1). The control peptide had no
significant effect
upon
ei ther
ristocetin-
or
botrocetin-
induced platelet agglutination.
When the two peptides were
added together, each peptide was used at its least effective
concentration. In the presence of ristocetin, peptide 474-488
at 7.8 Ilmol/L and peptide 692-708 at 7 Ilmol/L individually
produced a
20 + 6 % and 13 ± 8 % inhibitibn respectively.
Together,
these
peptides
induced
a
32
+
8%
inhibition.
Similarly, in the presence of botrocetin, peptide 474-488 at
460 Ilmol/L produced a 17 ± 3 % inhibition and peptide 692-708
at 130 Ilmol/L a 18 + 2 % inhibition. Together, these peptides
induced a
42 + 4 % inhibition.
Thus
in both cases only an
additive effect was observed.
Ex vivo studies: Both vWF peptides produced a dose-dependent
inhibi tion
of
ristocetin-
and
botrocetin-induced platelet
agglutination
(Fig
2)
but
with
a
markedly
different
efficiency. Peptide 692-708,
at 2.5 Ilmol/kg,
inhibited 99 +

96
............
~
100
"-"
lJ..
0
z
80
z
0
0
t;(
60
1-
Z
CI)
1-
40
l
::::>
Z
-1
0
20
0
«
0
RISTOCETIN
BOTROCETIN
CONTROL
~ 474-488
rzza 474-488
5 umol/Kg
1.5 umol/Kg
3 umol/Kg
692-708
c=J 692-708
1.25 umol/Kg
2.5 umol/Kg
Figure 3. Effect of vWF peptides (474-488 and 692-708) and of
a

control
peptide
upon
ex
vivo
guinea
pig
platelet
agglutination. Each peptide was injected as iv bolus into the
guinea pige
The
474-488
peptide
was
injected at
1.5 or
3
~mol/kg, the 692-708 peptide at 1.25 or 2.5 ~mol/kg and the
control peptide at 5 ~mol/kg.
Blood was drawn 15 min after
the injection of the peptide.
PRP was prepared and used in
platelet agglutination studies as described in the legend of
Fig 2. PRP obtained 15 min before peptide injection was used
as reference (0 % inhibition).
Inhibition was judged on the
velocity of platelet agglutination. Each data is the mean ±
50 of 6 experiments.

97
l % of ristocetin and 90 ± 6 % of botrocetin-induced platelet
agglutination. At 3 ~mol/kg, peptide 474-488 only inhibited
19 ± l % of ristocetin- and 18.6 ± 5 % of botrocetin-induced
agglutination (Fig 3). The control peptide (5~mol/kg) had no
significant effect upon ristocetin and botrocetin-induced ex
vivo platelet agglutination. No inhibition was observed upon
the ADP-induced platelet aggregation in vitro as weIl as ex
vivo with aIl peptides tested (data not shown).
In vivo studies:
Injection of each vWF peptide produced a
dose-dependent inhibitory effect on the number of recurrent
thrombi observed over a 15 min-period following laser artery
injury (Fig 3). Peptide 692-708 induced the most significant
inhibitory effect (83 ± 17%) 20 to 40 min after the injection
of 2.5 ~mol/kg. This maximal effect lasted up to 60 min and
slowly
decreased
but
still
remained
significant
100
min
following
the
peptide
injection.
The
time
delay
for
appearance of the first thrombus following the injection of
peptide
692-708
was
not
modified.
However,
contrary
to
control experiments,
the thrombi formed in the presence of
peptide 692-708 did not usually reach an occlusive size (when
the y did, they required a much longer time) and embolized in
small
pieces
instead
of
one
or
discrete
fragments.
In
contrast
the
antithrombotic
effect of
peptide
474-488 was
only moderate with a 47 ± 12 % inhibition immediately after
the injection of the highest concentration (3 ~mol/kg). This

98
...........
100
~
~
® 692-708
80
CD
:::E
60
0~
:c
l -
40
u...
20
0
~
0
w
CD
100
::'2:
:::::>
® 474-488
z
80
"'-,,--
w
:::c
60
l -
u...
40
0
z
20
0
-
l -
0
-
40-60 .
60-80
CD
0-20
20-40
:c
A1
A2
A3
A4
z
TIME AFTER PEPTIDE INJECTION
Figure
4.
Inhibition
of
thrombus
formation
following
injection of a vWF peptide (474-488 or 692-708) or control
peptide in the guinea pig. For each animal, the first vessel
studied before the peptide injection was used as a control.
After one iv bolus
injection of
a dose of a
peptide,
five
vessels
(Al to AS) were successively studied.
Following the
laser-induced intimal injury of each experimental artery, the
number of recurrent thrombi formed was recorded on a lS min
observation period.
Inhibition
of
the
number
of
recurrent
thrombi
was
evaluated
for
each
experimental
artery
by
comparisvn
to
the
control
vessel.
Peptide
692-708
was
injected at doses of O.S ~ , 1.25 ~ or 2.S ~mol/kgc:J
, peptide 474-488 at 1.5 ~
or 3 ~mol/kg Q222
and the
control peptide at 5 ~mol/kgMiiil. Each data is the me an ± 50
of 6 experi~ents.

99
effect
rapidly
decreased
with
time
following
peptide
injection. Comparatively the control peptide tested at a dose
of 5 ~mol/kg had no significant antithrombotic effect.
Bleeding time and platelet count.
Bleeding time measured in the guinea pig before the iv bolus
injection of peptide 692-708 (2.5 ~mol/kg) was 1.8 ± 0.15 min
(mean ± SO) with a range of 1.6 to 2 min (n = 6 animaIs). The
platelet count was 5.7 ± 0.3 x 105/~L. After the injection of
peptide 692-708, no significant modification of bleeding time
(the
longest
bleeding
time
recorded
was
2 ±
0.9
min)
or
platelet count (5.4 ± 0.3 x 105/~L)
was observed.
DISCUSSION
This is the first report on the in vivo activity of two
peptidic sequences from the domain of human vWF interacting
with GPIb/IX
(amino acids
474 to 488 and 692 to 708)
in a
model
of
experimental
thrombosis
on
guinea
pig
small
arteries.
In
our
model,
vWF
peptide
692-708
strongly
inhibited experimental thrombosis as judged by the number of
recurrent thrombi observed during 15 min following a specifie
intimaI injury of the mesenteric small arteries. Peptide 474-
488 had a much weaker inhibitory effect.
The antithrombotic activity of peptide
692-708 reached
its maximum 20 to 40 min after the peptide was injected to
the guinea pige This surprisingly long lag may correspond to

100
the time necessary for the optimal binding of peptide 692-708
to
the
vWF
platelet
receptor
GPlb/IX.
Addi tionally,
the
antithrombotic activity of peptide 692-708 lasted longer than
expected for a peptide as the maximal inhibitory effect was
still
observed
60
min
after
the
peptide
injection.
The
unusually long duration of activity of this peptide may also
be explained by its binding to GPlb/IX which could prevent
its clearance. This observation, taken together with the lack
of inhibitory effect of a control peptide, strongly supports
the hypothesis that this marked antithrombotic activity was
not an artefact of the experimental procedure and may thus be
valuable for therapeutic use.
Peptide
692-708
was
shown
to
decrease
the
number
of
recurrent thrombi and thus to have an effect on platelet-to-
platelet interaction; in addition, in the presence of peptide
692-708, thrombi were shown to break off as small pieces not
able to subsequently reassemble as coherent thrombi whereas
in control
experiments
thrombi
would break
off
as
one or
discrete pieces which would reassemble very quickly. Contrary
to
this
effect,
peptide
692-708
did
not
significantly
increase
the
time
between
the
intimaI
les ion
and
the
appearance
of
a
first
thrombus,
a
parameter
which
may
include
platelet
adhesion
to
the
injured
subendothelial
surfaces.
In
consequence
peptide
692-708
wou Id
inhibit
thrombus stability without affecting the initial phase which
plays
a
maj or
role
in
the bleeding
time
and
thus
in
the

101
hemorrhagic
risk.
Our
results
appear
to
confirm
this
hypothesis as the in vivo antithrombotic activity of peptide
692-708 was achieved without any prolongation of the bleeding
time or modification of the platelet count.
The role of vWF
in plate let to plate let cohesion and not only in platelet
adhesion has been recently illustrated by Ikeda et al
(27)
using a viscometer and Fressinaud et al (28) using perfusion
chambers
and either
native
(28)
or
hirudin
anticoagulated
(27)
blood.
We can thus
confirm their results
with our in
vivo model. According to Ikeda et al (27), the binding of vWF
to GPlb/IX, a prerequisite step for platelet adhesion to the
subendothelium, would lead to the exposure of GPllb/llla with
subsequent platelet to platelet cohesion. In our experiments,
blocking
of
the
vWF
/
GPlb-IX
axis
with
vWF
synthetic
peptides would inhibit more the exposure of GPllb/llla, thus
the number of recurrent thrombi,
than the platelet adhesion
step.
Alternatively
i t may be that our experimental model
does not allow the measurement of platelet adhesion but only
of secondary platelet to platelet cohesion.
The
inhibi tory
effect
of
both
peptides
upon
thrombus
formation
in
vivo
was
correlated
to
their
effect
upon
platelet agglutination induced by ristocetin or botrocetin in
vitro as weIl as ex vivo, but to a different extent according
to
the
agonist.
In
vitro,
both
peptides
were
pote nt
inhibi tors
of
ristocetin-
and
botrocetin-induced platelet
agglutination. The results with ristocetin using guinea pig

102
platelets
were
concordant
wi th previous
observations
from
Girma
et
al
(29)
and
Fujimura
et
al
(30)
using
human
platelets; results with botrocetin, however, were at variance
with
those
obtained
by
the
latter
authors
using
human
platelets. The two groups established that peptides 692-708
and 474-488 strongly inhibited human vWF binding to platelets
in
the presence
of
ristocetin
but
not
of
botrocetin.
The
latter
observation
may
be
explained
by
the
existence
of
distinct structures on vWF involved in binding to platelets
in the presence of either ristocetin or botrocetin or,
as
suggested by others (31), by a different mechanism of action
of both agonists.
Whereas ristocetin appears to act at the
level of platelets, botrocetin binds to three closely related
regions
(AA 539/553,
569/583
and 629/649)
of vWF subunit,
located in.a disulfide-bonded loop (AA 509-695). This binding
appears
to promote a
conformational change giving vWF the
ability to interact with GPlb/IX.
Thus only species having
the vWF binding sites for GPlb/IX and those for botrocetin
would be able to acquire the right conformation to interact
with
botrocetin-stimulated
platelets.
The
present
data
suggest that the same vWF sequences are involved in binding
induced in the presence of ristocetin or botrocetin and favor
the
second hypothesis.
In addition,
when a mixture of vWF
peptides was tested in vitro upon ristocetin- or botrocetin-
induced
platelet
agglutination,
we
found
no
synergistic
effect.
This
observation,
taken
together
wi th
the
lower

103
efficiency of peptide 474-488
in vivo as weIl as
in vitro,
confirms earlier results from Girma et al (29) and supports
the less important role of this peptide in the mechanism of
GPlb/IX recognition. On the other hand, the close correlation
between
our
resul ts
obtained
wi th
guinea
pig
and
human
platelets represents an additional argument in favor of the
structural homology of the vWF molecule between guinea pigs
and human.
Renee,
these discrepant data indicate that sorne
interspecies differences may occur on the platelets and that
recognition of GPlb/IX by a specifie conformation of vWF may
be less important in guinea pigs th an in man.
In
conclusion,
these
results
show
that
GPlb/IX-vWF
interaction is involved in thrombogenesis and that synthetic
peptides derived from the vWF sequence corresponding to the
GPlb/IX-binding sites may represent efficient antithrombotic
agents by blocking GPlb/IX-vWF interaction; Such peptides are
potential therapeutic molecules
(as
such or as a model for
designing
chemical
analogues)
as
they
exert
their
effect
without inducing a significant hemorrhagic state.
Acknowledgements: We wish to thank Dr Christian Ponthus, from
Sanofi Recherche Toulouse, for the mass spectrometry studies.
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109
EFFET D'UN ANTICORPS MONOCLONAL DIRIGE CONTRE LE DOMAINE DE
LIAISON DU vWF HUMAIN AU COMPLEXE GPIb/IX
(REDUCTION IN THROMBUS FORMATION BY AN ANTI-VON WILLEBRAND
FACTOR MONOCLONAL ANTIBODY IN GUINEA PIGS)
Marême CISSE-THIAMo,
Jean Pierre GIRMA·,
Dominique MEYER·,
Ludovic DROUETo
° INSERM U 353 et Institut des Vaisseaux et du Sang
+ INSERM U 143 Bicêtre

110
Des études préalables in vitro,
(Meyer D, Cissé-Thiam M,
Drouet
L,
observations
personnelles)
avaient
montré
qu'un
anticorp~ monoclonal
(Acm)
712 dirigé contre le domaine du
vWF qui se lie au complexe GPlb/IX bloquait l'agglutination
des
plaquettes
de
cobaye
induite
par
la
ristocétine
sans
affecter l'agrégation plaquettaire induite par l'ADP.
In
vivo,
l'Acm 712 a été testé dans
les mêmes conditions
qu'un
anticorps
contrôle
dirigé
contre
le
domaine
du
vWF
humain qui se lie au facteur VIII,
l'Acm D4Hl.
L'Acm 712 a
été injecté en bolus intraveineux aux doses de 1.2 et 0.6
mg/kg et l'Acm D4Hl à 1.2 mg/kg.
Après
l'étude in vivo,
6 mesures du temps
de saignement
ainsi
que
la
numération
plaquettaire
en
sang
total
sont
effectuées systématiquement pour chaque cobaye.
Puis
le
sang
est
prélevé
par
l'aorte
abdominale
pour
préparer
le
PRP
et
le
PPP
pour
l'étude
en
ex
vivo
de
l'agglutination plaquettaire induite par la ristocétine et
l'ADP.
Chez
les animaux contrôles,
les vaisseaux présentent une
moyenne
de
3.4 ± 0.5
thrombi/vaisseau
alors
que
chez
les
animaux
traités,
les
vaisseaux
présentent
1.8
+
0.2
thrombi/vaisseau à faible dose et 0.85 ± 0.3 thrombi/vaisseau
à forte dose. Aucune différence significative n'est observée
en ce qui concerne le temps d'apparition du premier thrombus
chez
tous
les
groupes.
Par
contre
un
allongement
dose-
dépendant du temps d'embolisation de la première thrombose,

I I I
est
observé
chez
les
groupes
traités
comparés
au
groupe
contrôle.
Ni
le
temps
de
saignement,
ni
la
numération
plaquettaire ne varient parmi tous les groupes.

112
ABSTRACT
The
in
vivo
injection
of
F( ab')2
fragments
of
a
murine
monoclonal antibody (MoAb) 712 directed against the domain of
human
von
Willebrand Factor
(vWF)
that
interacts
with
the
platelet
glycoprotein
lb/IX
(GPlb/IX)
induced
a
dose-
dependent antithrombotic activity in guinea pigs. A recurrent
thrombotic
process
was
triggered
by
a
dye
pulsed
laser-
induced localized deendothelialization in 5 mesenteric small
arteries
(150-350 ~m internal diameter)
in each animal.
The
first artery studied over 20 min served as control. The MoAb
to be tested was then injected as an iv bolus and 4 arteries
were sequentially studied for 20 min each. At the 'end of the
in vivo experiment (80 min after the injection of the MoAb),
bleeding time,
platelet count and function
were studied in
the same animal. MoAb 712 was injected as an iv bolus at two
doses of 0.6 and 1.2 mg/kg. MoAb D4Hl,
directed against the
Factor VllI-binding domain of vWF,
was
used as control and
was
injected at
a
dose of 1.2 mg/kg.
Monoclonal antibodies
were coded and the experiments blindly conducted. Guinea pigs
inj ected
wi th
1. 2
mg/kg
of
MoAb
D4Hl
showed
3.4
+
0.5
recurrent thrombi/vessel while animals injected with MoAb 712
at doses of 0.6 and 1.2 mg/kg only had 1.8 ± 0.2 and 0.85 ±
0.3
thrombi/vessel
respectively.
No
significant
difference
was noted for the time interval to the formation of the first
thrombus
(a parameter which
includes
the
adhesion process)
between the control MoAb
(43.8
+ 10 sec)
and the MoAb 712-

113
treated animals
at
any dose
(48.46 ± 11 at 1.2 mg/kg and
39.84 ± 9.4 sec at 0.2 mg/kg). A dose-dependent increase of
the interval time to embolization of the first thrombus
(a
parameter which appreciates the stability of the thrombus)
was observed in the MoAb 712-treated group (445 ± 68 sec at
1.2 mg/kg and 340.4 ± 75 sec at 0.6 mg/kg) comparatively to
the
control
MoAb-trea ted
group
(208.6
+ 36
sec)
wi th
p<
0.001.
In
ex
vivo
studies,
ristocetin-induced
plate let
agglutination was
normal
in guinea pigs
injected with 1.2
mg/kg of the control MoAb whereas i t was totally or partially
blocked by 1.2 and 0.6 mg/kg of MoAb 712 respectively. None
of the antibodies affected ADP-induced platelet aggregation.
No increase of bleeding time nor decrease of plate let count
were
observed
in
the
guinea
pigs
inj ected
wi th
MoAb
712
suggesting that this antibody, which is directed against the
binding
domain
of
vWF
to
GPlb/IX,
has
a
significant
anti thrombotic acti vi ty wi thout inducing a hemorrhag ic state.

114
INTRODUCTION
von
Willebrand
factor
(vWF)
is
amuI timeric
glyc-oprotein
which by binding to the sub-endothelium thus i t acquires the
capacity to bind to the platelet membrane glycoprotein lb/IX
(GPlb/IX).
vWF
is
the
main
mediator
of
the
adhesion
of
circulating
platelets
to
the
exposed
subendothelial
structures of the injured vessel wall (l, 2). Following their
adhesion, platelets become activated through a complex series
of biochemical events (3) which lead to platelet aggregation
involving the platelet membrane glycoprotein lIb-IlIa (GPllb-
IlIa)
(4).
These
events
lead
to
the
formation
of
the
hemostatic
plug
and
may
also
invol ved
in
other
reactions
inducing
vascular
occlusion
(5,
6).
It
is
thus
of
major
interest to understand the complex mechanisms underlying the
interaction of platelets with the various vascular elements.
Although vWF is known as the adhesive protein that induces
platelet adhesion through the GPlb-IX complex,
its role in
platelet aggregation is not weIl determined as compared to
other adhesive proteins such as fibrinogen.
Ikeda et al (7)
however recently showed that the type of adhesive proteins
participating in platelet-platelet association that led to
the formation of the thrombus mass depended on shear stress.
At low shear forces and in the presence of low concentrations
of
ionized calcium
[Ca2+]
in the medium,
the
formation
of
reversible platelet aggregates was dependent upon fibrinogen
interaction with GPllb-Illa while at higher shear forces and

115
physiological levels of
[Ca2+]
more
stable aggregates were
formed by the interaction of vWF binding to both GPlb/IX and
GPllb-Illa (7). In addition, Fressinaud et al (8), using non
anticoagulated
blood
from
patients
with
von
Willebrand
disease
in a perfusion system,
showed that vWF had a more
pronounced effect upon thrombus formation than upon platelet
adhesion,
at intermediate and high shear rates.
In
the
present
study,
the
role
of
vWF
in
arterial
thrombosis
under
high
shear
forces
(>
1000
sec-1 )
was
examined by the use of a monoclonal antibody (MOAb) directed
against the domain of human vWF implicated in its binding to
GPlb/IX
(MoAb
712).
Thrombosis
was
triggered
by
focal
dendothelialization of guinea pig small mesenteric arteries
induced by
a
dye
pulsed
laser.
MoAb
712
induced
a
dose-
dependent
antithrombotic
activity
without
increasing
the
bleeding
time
or
decreasing
the
platelet
count.
No
significant effect was observed upon the adhesion phase which
was quantified by the time required for the formation of the
first
thrombus after one
laser-induced endothelial
lesion.
"
The time necessary for the embolization of formed thrombi was
significantly increased however in animals injected with MoAb
712. This observation was interpreted as a defect of platelet
cohesion
in
the
treated
animals
under
the
high
shear
conditions of the mesenteric arteries. These results suggest
that
although blocking of
vWF-GPlb/IX
interaction
was
not
sufficient
to
significantly
interfere
with
the
initial

116
adhesion of plate lets to the exposed subendothelium, i t cou Id
disrupt
the
cohesion
of
the
thrombi
to
reduce
arterial
thrombogenesis.
MATERIAL AND METHODS
Obtention of monoclonal antibodies to von Willebrand factor.
Two monoclonal antibodies
(MoAbs),
against human
vWF were
tested:
MoAb
712
specifically
blocked
binding
of
vWF
to
GPIb/IX and
MoAb D4Hl inhibited vWF binding to Factor VIII.
MoAb 712 was injected as an iv bolus at doses of 0.6 and of
1.2 mg/kg and MoAb D4Hl at 1.2 mg/kg.
Preparation of the guinea pigs
Hartley
strain
male
guinea
pigs
(300-400
g)
were
used.
General
anesthesia
was
attained
by
injection
of
sodium
thiopental (Nesdonal, Specia Rhône Poulenc, Paris, France) at
a dose of 50 mg/kg. This anesthesia was maintained during the
entire
period
(about
2
hours)
of
aIl
experiments
(-
experimental thrombogenesis secondary to intimaI mesentery
arterial
lesion
induced by
a
dye
pulsed
laser,
-bleeding
time,
-drawing blood for
plate let
number
and for platelet
function study). AlI animal studies were conducted within the
guidelines of INSERM and CNRS institutional policies.

117
Dye-Pulsed Laser
A pulsed nitrogen laser (GBM,
Sopra,
Bois Colombes France)
at a wavelength of 427 Nm,
with 30 pulses of
25
~J energy
each, was used as previously described (9), to induce intimaI
lesion
on
dissected
mesentery
small
arteries
(150-350
~m
Ld. ).
The' directed
laser
beam
was
focused
on
a
100-~m­
diameter spot on the adventitial side of the target artery.
At this wavelength a minimal part of the energy was absorbed
while going through the artery wall,
but at the
interface
between
the
vessel
wall
and
the
circulating
blood
the
incident photonic energy was transformed by the hemoglobin
contained in
the red blood cells
into caloric energy.
The
pulse duration however was so short (5 nsec) comparatively to
l
msec for skin micro-vessels
(10)
that the effect was not
thermic
but
similar
to
that
of
a
shock
wave.
The
very
localized effect at the interface between the arterial wall
and the
circulating blood affected mainly
the
endothelial
cells
lining
the
internaI
surface
of
the
wall
and
few
circulating red blood cells (whose debris were washed out by
the blood stream
as soon as the cells were destroyed).
To
induce
a
more
reproducible
endothelial
les ion
without
affecting
significantly
the
artery
wall,
the
energy
was
delivered by a sequence of 30 laser pulses,
each delivering
25 ~J of energy as already described (11). The limitation of
the
les ion
to
the
endothelial
cell
monolayer
and
the
composition of
the
thrombus
(only platelets
visible)
have

118
been demonstrated by seriaI electron microscopie examinations
in previous experiments (11).
Measurement of Thrombosis and Embolization
Following the laser-induced focal deendothelialization on
a mesenteric artery, the vessel was observed for a period of
15 min. After a lag time following the laser-induced in jury,
typically a
thrombus
appeared,
grew,
became occlusive and
then detached from the injured vessel wall;
a new thrombus
developed
again
spontaneously
at
the
si te
of
the
initial
injury and the aIl process repeated regularly in a sequential
manner. Apart from the delay for the appearance of the first
thrombus,
a
few
other
parameters
were
recorded:
total
number of thrombi sequentially forming in each artery after
their injury,
- time for formation and embolization of each
of
the
thrombi,
size
of
the
thrombus
which
developed
(occluding or not), - and type of embolization (typically as
one total or several discrete pieces, but possibly as a slow
and progressive degradation).
In
a
sequential
manner,
the
results
of
focal
deendothelialization
of
four
different
arteries from a single animal after iv bolus injection of one
dose of an antibody can be studied over a period of 80 min.
Measurement of Bleeding Time and Platelet Count
After completion of the laser-induced thrombosis study on
the animal,
bleeding time was measured.
The technique used

119
was an adaptation to the guinea pig of the Ivy's technique
used for determination of the bleeding time in humans
(12).
The
standardized
incisions
were
performed
on
shaved
and
disinfected
hind
limbs
of
anesthetized
animals
with
an
automatic
device
(Surgicutt,
International
Technique
Corporation,
Edison,
New
Jersey) .
Six
bleeding
time
determinations were made for each animal.
Blood lost by the
wound
of
one
standardized
incision
was
collected
using
a
microcapillary
collection
device
(Beckton
Dickinson,
Rutherford,
New
Jersey)
and
platelets
counted
by
phase
contrast microscopy.
Ex vivo platelet aggregation studies
After measurement of bleeding time in the animal, blood was
drawn from the abdominal aorta into trisodium citrate (0.9
vol blood /
0.1 vol 0.13 mol/L citrate),
and platelet-rich-
plasma
(PRP)
( 5 . 0
x
platelets/~L)
prepared
by
centrifugation at 900 x 9 for 75 sec at 20° C. Platelet-poor-
plasma (ppp) was obtained following a second centrifugation
at 1500 x 9 for 15 min at
20° C.
For study of ADP-induced
aggregation,
ADP (1.2 ~mol/L) was added to 400 ~L PRP in an
aggregometer cuvette, with the blank cuvette containing PPP.
For
study
of
ristocetin-induced
agglutination,
400
~L
of
diluted (1 vol PRP /
3 vol 0.9 % NaCl)
PRP was added to an
aggregometer
cuvette,
and
ristocetin
(1
mg/mL)
was
then
added; The blank cuvette contained PPP similarly diluted with

120
saline.
Statistical Analysis
Administration
of
the
antibodies
to
the
animaIs
was
conducted blindly.
Aliquots of MoAb
712 or of
the control
MoAb 04Hl were prepared, coded and injected (iv bolus) to the
animaIs at doses which were adapted by the volume according
to the body weight. Before injection of the coded antibody,
a
control mesenteric
artery was
studied
15
min
after
one
laser-induced injury to verify if the response of animaIs to
laser-induced
endothelial
injury
was
similar
to
that
of
previously
studied
control
animaIs;
following
~v
bolus
injection
of
the
antibody,
four
individually
injured
mesenteric arteries were sequentially studied. Bleeding time,
plate let
count,
ristocetin
and
AOP-induced
platelet
agglutination
were
then
performed
on
the
same
animal.
Comparison between MoAb 712-treated and control MoAb treated-
animaIs were performed by the Student t
test.
RESULTS
In vivo studies
Injection
of
MoAb
712
F( ab 1)2
fragment
produced
a
dose-
dependent
inhibi tory
effect
upon
the
number
of
recurrent
thrombi observed over a 15 min-period following laser injury
of a small mesenteric artery This effect did not

lLl
Figure 1. Effect of F(ab')2
MoAb
712
and control MoAb D4H1 upon
-.J
thrombus formation in the guinea
W
(/)
pig.
(/)
A f
t e r
0
n e
l
0
c a l
w
>
deendothelialization
by
the
............
laser
in jury,
each
mesentery
CD
artery
of
each
guinea
pig
was
~
observed in a 15 min period. The
o
Cl:::
number
of
recurrent
thrombi
::r:
formed,
the
time
required
for
~
the
formation
and
that
for
the
z
embolization
of
the
first
<{
thrombus
were
noted.
The
f irst
w
2
vessel
studied
before
the
injection of the MoAb served as
control.
MoAB
712
was
injected
6
at 0.6 and 1.2 mg/kg and control
B)
MoAB
D4H1
at
1.2
mg/kg.
Four
Z
0
areteries
were
sucessively
studied
in
a
period
of
80
min
~
:::E
after
the
injection' of
the
a::::
antibody. Inhibition of thrombus
0
li...
formation
Was
estimated
by
the
mean of thrombi per vessel
(A),
(f)
..........
:::)
u
the
-time
required
for
the
en
Cl)
CI)
formation of the first thrombus
~ '--'
0
(B)
and
the
time
required
for
a::::
I
the
embol ization
of
the
f irst
1--
thrombus
(C).
1--
(f)
a::::
li...
Z
P<O.OOl
0
Cl
-~N
-1
0
en
:::E
controls
w ..........
U
(f)
Cl)
:::)
MoAb D4H1
en
CD '--'
(1. 2 mg/kg)
:::E
0
a::::
I
MoAb 712
1--
( 0.6 mg/kg)
1--
CI)
a::::
MoAb 712
li...
(1. 2 mg/kg)

122
significantly vary over time,
so the mean of the number of
thrombi of the four vessels studied after
injection of the
antibody was estimated for each guinea pige Animals injected
with 1.2 mg/kg
of MoAb
712
showed
0.85 ± 0.3
(mean ± 50)
thrombi
/
vessel
and those
injected with
0.6
mg/kg of the
same
antibody,
1.8
+
0.2
thrombi
/
vessel,
3.4
+
0.5
thrombi/vessel
following
injection
of
1.2
mg/kg
of
the
control MoAb
(Fig lA).
No significant difference was noted
upon
the
time
required
for
the
formation
of
the
first
thrombus
between
the
MoAb
712-treated
or
the
control
antibody-treated groups
(Fig lB).
A dose-dependent increase
of
the
time
required
to
the
embolization
of
the
first
thrombus was observed however in the MoAb 712-treated group
as compared to the control antibody-treated group
(Fig le).
Ex vivo studies
Bleeding time measured in guinea pigs injected with MoAb
712 at 1.2 and 0.6 mg/kg was respectively 191 ± 59 and 175 ±
40 sec and 194 ± 37 sec, n=6,
in the group treated with the
control MoAb.
Platelet count
was
774
+ 237
x
103
platelets/IlL
in
the
control treated group and 660 ± 100 x 103 and 688 ± 110 x 103
platelets /
ilL in the MoAb 712-treated group
(doses of "1.2
and 0.6 mg/kg respectively).
Platelet function.
Nei ther
MoAb
prevented
ex
vivo AOP
-
induced guinea pig platelet aggregation.

123
712
RISTOCETIN
ADP
(O.6mgjKg)
-
(1.2~mol/l)
70
(1.2mg/ml)
D4H1
~
(1.2mgjKg)
'-'"
60
D4H1
Z
(1.2mgjKg)
'-- 712
0
50
(1.2mgjKg)
(f)
(f)
40
~
712
(f)
(O.6mgjKg)
Z
30
<t
0:::
l -
20
l -
'0
:c
c...?
712
.....J
0
(1,2mgjKg)
lmin
lmin
t - - - i
t----"i
Fig 2.
Effects of F(ab ' }2
of MoAB 712 and of control MoAb
D4Hl upon ex vivo guinea pig platelet agglutination.
After
the
thrombosis
and bleeding
time
studies
in
a
cumulative
period of 110 min after the injection of the MoAb, blood was
drawn from the animals as described in Materials and Methods.
PRP and ppp were prepared as described. Platelet aggregation
was
assessed by a turbimetric technique on a
dual channel
aggregation module (Payton, Toronto, Ontario). The percentage
of
light
transmission
of
the
platelet
suspension
before
addition of the agonist was assigned a value of
100 % and
that of ppp 0%. ADP was added at a final concentration of 1.2
~mol/L tO'PRP adjusted with ppp ta 5.105 / ~L. Ristocetin was
added at a final concentration of l
mg/mL ta 400 ~L of PRP
adjusted'with saline to 1.25 x 105 /~L. PRP was stirred at
1,200
rpm
at
37°C.
MoAB
712
inhibited
ristocetin-induced
platelet
agglutination
at
1.2
and
0.6
mg/kg
whereas
the
control
MoAb
had
no
effect.
Nei ther
MoAb
prevented
ADP-
induced platelet aggregation.

124
Ex vivo ristocetin-induced platelet agglutination however
was inhibited by MoAb 712 at doses of 1.2 and of 0.6 mg/kg
whereas
the
control MoAb at
the dose
of
1.2 mg/kg had no
effect (Fig 2).
DISCUSSION
The GPlb/IX-vWF interaction is known to be the initial step
in the formation of a platelet plug on the
injured vessel
wall
and
especially
in
plate let
adhesion
to
the
exposed
subendothelium.
Plate let
adhesion
through
the
GPlb/IX-vWF
axis only occurs however under shear forces higher 650 s-1
(13-16).
In this model of laser-induced endothelial injury,
the shear rates of mesenteric arteries studied appeared to be
in
excess
of
1000
sec-1
although
direct
measurement
of
individual vessels was not possible (17).
In this study we have used MoAb 712 directed against the
domain
of
human
vWF
implicated
in
its
interaction
with
GPlb/IX. Injection of this antibody induced a dose-dependent
reduction of the mean number of recurrent thrombi per vessel
after
dye-pulsed
laser
inj ury.
No
signif icant
effect
was
observed on the time required for the formation of the first
thrombus while the time required for the embolization of the
first thrombus was increased by this MoAb in a dose-dependent
manner.
This
inhibition
of
thrombus
formation
was
not
correlated with a hemorrhagic state and bleeding time as well

125
CONTROLS
MoAb 04Hl
MoAb 712
MoAb 712
untreated
treated
treated
treated
1. 2 mg/kg
0.6 mg/kg
1. 2mg/kg
Platelets
761 + 174
774 + 237
688 + 110
660 + 100
(xl03/1l 1 )
Bleeding
time (sec)
194 + 68
194 + 37
175 + 40
191 + 59
Table 1.
Platelet
count and bleeding time
in
guinea pigs
injected with either control MoAB D4Hl or MoAB 712,
80 min
after the MoAb injection.

126
as platelet count were not affected by the injection of MoAb
712. Ristocetin-induced platelet agglutination was blocked by
the in vivo injection of MoAb 712 but ADP-induced platelet
aggregation was
unmodified.
This
result
suggests
that
the
reduction
of
thrombus
formation
in
guinea
pigs
is
not
mediated
by
inhibition
of
fibrinogen
binding
to
platelet
GPllb/llla.
The
dose
dependent
inhibition
of
ristocetin-
induced ex vivo platelet agglutination by the MoAb to vWF
indicates
that
this
antibody
was
still
functional
when
bleeding time, platelet count and platelet aggregation were
performed and that the corresponding domain of human vWF in
guinea pig was implicated in the GPlb/IX-vWF interaction.
Whereas
the
injection
of
MoAb
712
significantly reduced
thrombus
formation,
the
time
interval
between
the
laser-
induced injury and the appearance of the first thrombus was
not significantly affected.
This observation is of interest
since binding of MoAb 712 to vWF may be anticipated to block
vWF-mediated adhesion to the injured artery.
This result is
concordant with those we have already obtained in guinea pigs
injected with either PG-:-l F(ab' )2'
an anti-guinea pig GPlb
monoclonal antibody (9) or a synthetic peptide derived from
the domain of vWF (AA 692-708) implicated in its the binding
to
GPlb/IX
(12).
In
these
three cases,
thrombi
were
less
cohesive in treated guinea pigs than in control groups and
were
mainly
not
occluding.
Thus
they
did
not
embolize
as
single or several discrete pieces as did thrombi developing

127
in
control
groups
but
they
were
slowly
and
gradually
degraded,
explaining
the
increase
in
time
required
for
embolization
of
thrombi
in
the
treated
groups.
Blocking
GPIb/IX-vWF interaction by these three methods appeared to
break
the
repeti ti ve
cycle
of
thrombus
formation
wi thout
significantly
disturbing
platelet
adhesion.
As
already
suggested (9),
this observation may have two explanations :
1)
GPIb/IX-vWF
interaction
is
not
the
only
mechanism
implicated
in
the
adhesion
of
platelets
to
the
exposed
subendothelium
and
other
domains
of
vWF
interacting
wi th
other platelet membrane sites such as GPIIb-IIIa,
might be
implicated (18); 2) The impairment of thrombus formation by
MoAb 712 treatment may be explained by an interference with
plate let
to
platelet
cohesion.
This
observation
is
in
agreement with results from Ikeda et al (7) showing that vWF
is
the
only
adhesive
ligand
that
mediates
high
shear-
dependent platelet to plate let cohesion. It is interesting to
note
that
Bellinger
et
al
showed a
similar
inhibition
of
plate let to platelet association when a murine MoAb directed
against porcine vWF was injected into normal pigs
(19).
In
their study,
the anti-vWF MoAb did not prevent the initial
adherence
of
platelets
to
subendothelium but
i t
strongly
inhibited the development of occluding thrombi. Nichols et al
showed that platelets from pigs with von Willebrand disease
(vWO) were not able to build occlusive thrombi (20) whereas
they adhered to the subendothelium as well as from those from

128
normal pigs.
In
the
same
study,
neutralization of
vWF
in
normal pigs by a monoclonal antibody prevented the induction
of
experimental
occlusive thrombosis
(stenosis
and pinch-
injury procedure). Our results with a monoclonal antibody to
vWF
injected
to
guinea
pigs
thus
confirm
and
extend the
demonstration of the role of vWF in vivo thrombus formation.
In the present study, the destabilization of thrombi by MoAb
712, an antibody which specifically blocks the domain of vWF
implicated in its interaction with GPlb/IX, not associated to
any bleeding tendency, suggests that the GPlb/IX-vWFaxis is
a
promising
target
for
the
strategy
of
antithrombotic
therapy.
REFERENCES
1.
Weiss
HJ:
Platelet
physiology
and
abnormalities
of
platelet function. N Engl J Med 293: 580, 1975
2.
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3. Kroll MH,
Schafer AI: Biochemical mechanisms of platelet
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4.
Phillips
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Willebrand
factor-mediated
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adhesion
to
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involves
platelet
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as
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132
Vo DISCUSSION ET CONCLUSION

133
A. DISCUSSION
1. Autres modèles expérimentaux et données nouvelles
sur le rôle du vWF dans la formation du thrombus
a. Les modèles animaux
Les
modèles
animaux
présentent
un
intérêt
primordial
puisqu'ils
ont permis
de
combler
d' importantes
lacunes sur la compréhension des divers processus complexes
impliqués
dans
les
maladies
cardio-vasculaires
(syndromes
hémorragiques,
infarctus
du
myocarde,
athérosclérose,
etc ... ) _ Un
progrès
considérable
dans
la
recherche
de
la
thrombose expérimentale a vu la naissance d'une multitude de
modèles utilisant divers mammifères tels que:
- chiens (Salazar 1961; Blair et coll. 1964; Kordenat et
Kezli 1972; Folts 1976a et b; Romson et coll. 1980; Bergmann
et coll. 1983; Collen et coll. 1983; Gold et coll. 1984; Bush
et coll. 1989),
-
singes
(Hampton et Matthews 1966;
Todd et coll.
1972;
Harker
et
Hanson
1979;
Hanson
et
coll.
1980,
1982,
1985;
Malpass et coll. 1981; Hanson et Harker 1983),
- porcs (Sultzer et coll. 1982; Reddick et coll. 1982, 1985
et 1990; Griggs et coll. 1985; Nichols et coll. 1986, 1990 et
1991; Bellinger 1987; Brinkhous 1989; Fuster 1991a)
et
d'animaux
plus
petits
dont
la
plupart
sont
des
rongeurs tels que lapins,
rats,
hamsters,
cobayes
(Dupe et
coll.
1981;
Collen
et
coll.
1983;
Cooley
et
coll.
1983;
Clozel et
coll.
1988;
Shebuski
et
coll.
1988;
Stassen et

134
coll.
1991; Gold et coll. 1991).
Ces modèles sur les petits animaux ont été surtout utilisés
Idans
la
recherche
sur
les
agents
thrombolytiques
dans
la
thrombose
veineuse,
la
thrombose
artérielle
étant
expérimentée
surtout
chez
les
animaux
de
taille
plus
importante.
Toutefois,
la performance de ces
modèles
est
relative à
certaines caractéristiques dont
leur degré d'affinité avec
l'homme,
la reproductibilité des variables physiologiques à
mesurer,
leur
maniement
(donc
leur
taille)
et
aussi
un
facteur non moins important qui est leur coût.
Nous
nous
limiterons
à
décrire
certains modèles
qui
se
sont
investi dans
l'évaluation
de
la participation
du
vWF
dans la thrombogenèse.
L'un des modèles de thrombose expérimentale chez l'animal
le plus utilisé dans ce domaine,
est la technique de Folts
qui consiste à effectuer une sténose (qui réduit la lumière
vasculaire et donc augmente les taux de cisaillement) cumulée
à une altération mécanique
(par exemple,
avec un clamp) de
l'intima
sur
les
artères
coronaires
de
chien
anesthésié
(Folts
et
coll.
1976a et
b).
La
formation
répétitive
des
thrombi est enregistrée grâce à une sonde électromagnétique
(doppler) placée en aval de la zone thrombogène qui permet de
mesurer la vitesse du flux sanguin (en ml/mn) dans l'artère.
Les réductions cycliques du flux,
(cyclic flow reductions ou
CFRs)
correspondent
à la formation
répétitive
des
thrombi

135
plaquettaires suivie d'une reperméabilisation de
l'artère.
Cette
technique
fut
aussi
largement
utilisée
pour
tester
différents
agents
anti thrombotiques.
Ce
sont
surtout
les
anti-plaquettaires
en
particulier
ceux
dirigés
contre
l'interaction
GPllb/llla-protéines
adhésives,
qui
furent
testés (Romson et coll. 1980; Coller et Scudder,
1985; Bush
et coll. 1989; Shebuski et coll. 1989). Par contre certains
agents thrombolytiques utilisés dans ce modèle se sont avérés
inefficaces comparés
à
leurs effets
dans
d'autres modèles
(Smi th
et
Shebuski
1988).
Toutefois,
ce
modèle
présente
l'avantage de la stabilité des CFRs sur un temps assez long
(plusieurs heures) permettant de tester plusieurs doses d'un
produi t
sur
un
même
animal
et
par
conséquent
d' établir
l'effet dose-dépendant de l'agent testé sur un même animal.
L'inconvénient
de
ce
système
est
que
certains
agents
qui
baissent
la
pression
sanguine
systémique
(comme
la
, prostacycline)
baissent
aussi
la pression
de
la perfusion
coronaire, ce qui rend plus difficile l'interprétation de la
variation du flux
(Bush et Shebuski,
1990).
Ce modèle fut adapté chez le porc et a permis de réaliser
d'importantes études pour mettre en évidence le rôle du vWF
dans la formation du thrombus et dans l'athérosclérose.
Le
modèle porc est d'autant plus intéressant pour l'étude des
réactions biochimiques
et
cellulaires
impliquées
dans
les
processus thrombotiques qu'il peut présenter la maladie de
Willebrand
qui
est
phénotypiquement
semblable
a
la
forme

136
sévère de vWD chez
l'homme.
Les patients atteints de cette
maladie (vWD de type III) présentent un allongement du temps
de saignement et une absence de vWF dans leur plasma,
leurs
plaquettes et leurs parois vasculaires;
aucune activité du
vWF n'est détectable dans le plasma ni dans
les plaquettes
telle qu'on la mesure par les tests à la ristocétine ou à la
botrocétine
(Griggs
et
coll.
1974;
Zimmermann
et
Ruggeri,
1987;
Fujimura et coll.
1989;
Read et coll.
1989).
Le porc
vWD, qui est un des plus anciens modèles animaux de maladies
hémorragiques génétiquement déterminées, présente en plus de
ces caractères, un niveau indétectable de facteur agglutinant
les
plaquettes
(Hogan
et
coll.
1941).
Actuellement
trois
colonies de porcs vWD sont entretenues pour les recherches du
ou
des
rôles
du
vWF
dans
l ' hémostase,
la
thrombose
et
l'athérosclérose: deux laboratoires d'hématologie aux Etats
Unis
(celui de
Francis Owen à
l~Université de Caroline du
Nord à Chapel Hill et celui de Mayo Clinic à Rochester) et un
troisième
en
France
(par
une
coopération
entre
L'INRA
et
l'INSERM). Une étude récente effectuée par l'équipe de Chapel
Hill sur
les porc vWD et normaux a permis de postuler des
hypothèses sur le mode d'action du vWF in vivo
(Nichols et
coll.
1991).
Dans
ces
études,
la
première
technique
pour
induire
la
thrombose,
est
une
lésion
superficielle
de
l'intima
(seul
l'endothélium
est
détruit)
d'une
artère
coronaire par un cathéter à ballonnet gonflable. La formation
d'une monocouche de plaquettes qui viennent adhérer au sous-

137
endothélium est observée
chez
les
deux phénotypes
avec
un
nombre similaire de plaquettes adhérentes,
mais seules
les
plaquettes
des
porcs
normaux
s'étalent
et
émettent
des
pseudopodes, ce qui suggère un faible degré d'activation des
plaquettes chez les porcs vWD. La seconde technique de lésion
est celle de Folts,
décrite ci-dessus, et consiste à mettre
à nu la média. Celle-ci induit la formation de microthrombi
mixtes
plaquettaires
et
fibrineux,
mais
seuls
les
porcs
normaux
développent
des
thrombi
occlusifs.
De
plus,
un
anticorps monoclonal anti-vWF (BB3-BD5) administré à des porc
normaux,
avant une sténose suivie d'une lésion,
empêche la
formation
de
thrombi
occlusifs;
administré
après
cette
lésion,
cet
anticorps
brise
la
formation
répétitive
des
thrombi.
D'autre
part,
lorsque
les
deux
phénotypes
sont
soumis à un régime pour induire l'athérosclérose coronaire,
aucune
différence
significative
n'est
observée,
et
particulièrement
sur
l'étalement
des
plaquettes.
Les
conclusions que l'on peut tirer de ces études sont:
1) les plaquettes peuvent adhérer aux constituants de la
paroi vasculaire lésée in vivo en l'absence du vWF
2)
la présence du vWF semble nécessaire à l'étalement et
la formation des pseudopodes des plaquettes
3) l ' athérosclérose induit l'étalement (ou" l ' activation" )
des plaquettes par un mécanisme qui est indépendant du vWF
4) le type de thrombi (composition et taille) varie selon
les
constituants
de
la
paroi
vasculaire
exposés
au
flux

138
sanguin in vivo
5)
le vWF est nécessaire à la formation d'une thrombose
occlusive
expérimentale
et
cette
intervention
survieQt
surtout en cas de lésion artérielle cumulée à une sténose.
Ces deux dernières observations laissent supposer que la
thrombose artérielle se forme sous l'influence des taux de
cisaillement
et
celle
de
la
nature
des
éléments
thrombogéniques de la paroi vasculaire exposés.
La
plupart
de
ces
conclusions
ont
été 'suggérées
par
d'autres auteurs utilisant le modèle porc, à savoir:
1)
la
capacité
des
plaquettes
d'adhérer
au
sous-
endothélium de la paroi vasculaire lésée en l'absence du vWF
(Chesebro et coll. 1991; Lam et coll. 1991; Badimon et coll.
1991)
2)
la corrélation entre la qualité de
la thrombose et
l'étendue
de
la
lésion
vasculaire
(Heras
et
coll.
1989;
Fuster et coll. 1991b)
3) le rôle déterminant des facteurs hémodynamiques tels
que les taux de cisaillement qui potentialisent la réponse
thrombotique
(Badimon
et
coll.
1986,
1988,
1989,
1991;
Lassila et coll. 1990)
4)
le
rôle
important
du
vWF
plasmatique
et
sous-
endothelial
dans
la
thrombogenèse
et
probablement
dans
l'athérogenèse (Fuster et coll.
1978, 1982, 1983,
1990 a et
b, 1991 a et b; Griggs et coll. 1981; Badimon et coll. 1985,
1990; Rand et coll. 1987)

139
Un autre modèle de thrombose artérielle a été mis au point
chez le babouin (Hanson et Harker 1987). Il consiste à placer
chirurgicalement une surface artificielle (tube recouvert de
collagène ou en dacron) soit en ex vivo dans un shunt fémoral
artério-veineux
soit
en
in
vivo
dans
l'artère
fémorale
superficielle. Un thrombus volumineux (3 à 4 mm de diamètre)
de type artériel (riche en plaquettes) se forme pendant 40 à
60
minutes
et,
initialement,
dans
des
conditions
de
flux
laminaire et avec des forces de cisaillement de 600-1000 s-'.
La
formation
du
thrombus
est
déterminée
par
la
mesure
en
temps réel de l'accumulation de plaquettes radiomarquées à
l'indium I I I par
une
caméra à
scintillation.
Bien
que ce
modèle présente l'avantage de pouvoir contrôler la vitesse de
flux et la numération plaquettaire,
son maniement est assez
lourd et
son
coût
est
très
élevé.
L'anticorps
monoclonal
anti-vWF, BB3-B05, testé dans ce modèle en ex vivo, a montré
une diminution de la taille des thrombi plaquettaires sur un
tube
recouvert
de
collagène;
cette
inhibition
était
dépendante des vitesses de flux
(Cadroy et coll. 1989b).
b. Les modèles in vitro et ex vivo
Les modèles in vi tro sur· la thrombose permettent
de
disséquer
les
mécanismes
mais
dans
des
conditions
d'artefacts.
Jusqu'ici
on
a
favorisé
l'idée
que
le
rôle
primordial
de
l'interaction GPlb/IX-vWF dans
le
processus
hémostatique
était
l'adhésion
des
plaquettes
au
sous-

140
endothélium
de
la
paroi
vasculaire
lésée.
En
effet,
les
découvertes obtenues in vitro avec l'agrégomètre (Born 1962),
un appareil généralement utilisé pour l'étude des fonctions
plaquettaires basée sur la réponse des agonistes exogènes,
ont favorisé
le concept courant que
le fibrinogène est la
protéine
adhésive
essentielle
impliquée
dans
le
contact
plaquette-plaquette
(Marguerie
1979,
Mustard
1979).
Dans
l'agrégomètre, cependant, les plaquettes sont soumises à des
forces de cisaillement induites par un mouvement d'agitation
considérablement
diffèrent
de
celui
qui
existe
dans
la
circulation; ainsi, vu que les paramètres rhéologiques jouent
un
rôle
primordial
dans
l'agrégation
plaquettaire,
l'implication
des
mécanismes
démontrés
in vi tro doit être
évaluée in vivo.
Récemment
(Ikeda
et
coll.,
1991),
une
étude
in
vitro
effectuée dans un viscomètre avec du sang anticoagulé avec de
l ' hirudine, dans des conditions de cisaillement réglementées,
a montré qu'aux basses forces de cisaillement,
la formation
d'agrégats plaquettaires réversibles dépend de l'interaction
du
fibrinogène
avec
la
GPIIb/IIIa;
cependant,
cett:e
agrégation
ne
survient
qu'en
présence
de
basses
concentrations d'ions calcium dans le milieu comme c'est le
cas in vitro avec l'utilisation de sang anticoagulé avec du
citrate.
Dans
des
conditions
de
forces
de
cisaillement
élevées et de concentrations physiologiques d'ions calcium
dans
le milieu,
des agrégats plaquettaires
indépendants du

141
fibrinogène,
plus
stables,
se
forment,
ce qui
requiert
la
liaison du vWF à la fois à la GPIb/IX et à la GPIIb/IIIa.
Aucune autre protéine adhésive ne semble être impliquée dans
l'agrégation induite par une force de cisaillement élevée en
l'absence
de
stimulation exogène des
plaquettes,
dans
des
condi tions
hémodynamiques
qui
peuvent
refléter
celles
des
vaisseaux sténosés
(Lipowski
et coll.
1977;
Back et coll.
1991).
Par
ailleurs,
une
étude
ex
vivo,
effectuée
dans
un
système de perfusion avec du sang natif, a montré que l'effet
du vWF était non seulement dans l'adhésion mais aussi dans
l'interaction plaquette-plaquette en comparant des malades
vwo à des normaux (Fressinaud et coll. 1991).
2. Résultats obtenus avec le laser"
a. Effet de l' inhibi tion de l'interaction GPIb/IX-vWF
sur le délai d'apparition du premier thrombus
La durée que met le premier thrombus à apparaître après
la lésion induite par le rayon laser n'a pas varié de façon
significative
avec
tous
les
traitements
(anticorps
anti-
GPIb/IX, anti-vWF et peptides du vWF) qui visaient à inhiber
l'interaction
GPIb/IX-vWF.
Cette
observation
est
d'autant
plus surprenante que l'inhibition de l'interaction GPIb/IX-
vWF
est
supposée
interférer
de
façon
remarquable
avec
l'adhésion des plaquettes à la paroi vasculaire lésée surtout
dans
les
conditions
artérielles
à
taux
de
cisaillement

142
élevés,
comme c'est le cas du modèle choisi ("shear rate" >
1000
sc-1 ).
De
plus,
le
temps
de
saignement
n'est
pas
signif icati vement
allongé
par
les
différents
traitements.
Ainsi
l'adhésion des plaquettes au sous-endothélium semble
être indépendante de la présence du vWF.
Cette observation
concorde avec celle faite par d'autres auteurs
(comme nous
venons
de
le
voir
dans
le
paragraphe
précédent),
et
particulièrement dans le modèle porc (Nichols et coll. 1991;
Fuster
et
coll.
1991).
Il
est
intéressant
de
noter
que
d'autres agents anti thrombotiques, inhibiteurs physiologiques
de la thrombine,
(hirudine, héparine) testés dans le modèle
porc,
n'empêchent
pas
l'adhésion
des
plaquettes
au
sous-
endothélium à
la suite d'une désendothélialisation,
ou aux
constituants
de
la
média
à
la
suite
d'une
lésion
plus
profonde (Lam et coll. 1991; Badimon et coll. 1991).
Il est fort possible que l'adhésion initiale des plaquettes
fasse intervenir d'autre(s) mécanisme(s) compensatoire(s) ou
alternatif(s)
avec
d'autres
composants
de
la
membrane
plaquettaire de cobaye tels que des glycoprotéines analogues
a celles de l'homme,
dont le complexe GPIIb/IIIa.
Par ailleurs un artefact technique dans ce modèle pourrait
expliquer que l'interaction plaquette-plaquette soit mieux
appréciée que celle de plaquette-paroi vasculaire.
De plus la lésion endothéliale,
induite par le laser, peut
générer
localement,
de
la
thrombine
qui
stimulerait
l'adhésion plaquettaire (Zwaginga et coll. 1987; Badimon et

143
coll. 1991) plus difficile à inhiber dans ce cas.
b. Effets de l'inhibition de l'interaction GPIb!IX-
vWF et GPIIb!IIIa-vWF sur la cohésion du thrombus.
Les
anticorps
et
peptides
utilisés
dans
cette
étude
avaient pour effet commun de briser le cycle répétitif de la
production de thrombi; ce cycle est constitué d'une phase de
formation du thrombus,
suivie de l'embolisation du thrombus
puis de la reformation d'un nouveau thrombus au même endroit
de
la
lésion.
La
construction
d'un
thrombus
se
fait
normalement par l'agrégation des plaquettes au niveau de la
lésion,
suivi
de
la
destruction
(ou
"démantèlement")
du
thrombus formé puis d'une nouvelle exposition de
l'endroit
lésé à d'autres plaquettes circulantes.
L'instabilité
des
associations
plaquettes-plaquettes,
observée
après
le
traitement
avec
le
peptide
RGDS,
est
semblable à celle produite par les traitements qui inhibaient
la
liaison
du
vWF
à
la
GPIb!IX.
Cette
instabilité
de
l'association plaquette-plaquette conduit à une dissolution
plus progressive du thrombus qui a plus de mal à emboliser en
une
seule
masse
ou
en
fragments
bien
distincts
comme
le
ferait
un
thrombus
qui
se
serait
développé
de
façon
plus
cohérente
dans
les
artères
des
animaux
contrôles,
non
traités.
A partir de ces observations ~n vivo concernant l'absence
d'une
embolisation
totale ou partielle
en
fragments
nets,

144
induite par les traitements, on peut avancer l'hypothèse que
la destruction lente et progressive du thrombus laisse une
surface
couverte
avec
les
vestiges
du
premier
thrombus,
constitués
de
plaquettes
beaucoup
moins
activées;
cette
surface devient donc moins
thrombogénique pour
les
autres
plaquettes qui viendront constituer un nouveau thrombus.
Il y a une explication alternative concernant la qualité de
l'effet anti-thrombotique, observé au microscope.
Cela peut
être
l'effet
net
de
deux
mécanismes
concomitants:
a)
la
construction
du
thrombus
par
l'accumulation
de
nouvelles
plaquettes et b) la désagrégation permanente des plaquettes.
Si le premier mécanisme prédomine,
comme c'est le cas chez
les animaux contrôles,
non traités,
une embolisation totale
ou partielle du thrombus qui est rapidement transporté par le
flux
peut
être
nettement
observée.
Par
contre,
chez
les
animaux
traités,
la
formation
du
thrombus
étant
ralentie
aussitôt qu'elle débute, une embolisation nette ne peut être
observée
et
le
thrombus
semble
diminuer
de
taille
progressivement. Ces deux explications ne sont pas totalement
exclusives.
Un développement plus spécialisé de ce système modèle afin
de pouvoir mesurer en temps réel de façon morphomètrique les
thrombi en trois dimensions avec une haute résolution pqurra
éventuellement permettre de faire une discrimination précise
des effets de l'inhibition des interactions GPlb/IX-vWF sur
la formation du thrombus en comparaison avec la dissolution

145
du thrombus.
3. Les mécanismes potentiels de l'interaction GPlb!IX-
Pour
induire
l'adhésion
des
plaquettes
au
sous-
endothélium,
le
vWF
se
lie
au
complexe
GPlb-IX
mais
le
mécanisme promoteur de cette liaison n'est pas encore bien
déterminé.
A
l'heure
actuelle,
deux
possibilités
sont
évoquées: -a) sous l'effet de flux et des cisaillements,
la
plaquette subit un changement de conformation permettant la
liaison
du
vWF
au
complexe
GPlb/IX,
ce
qui
permet
à
la
plaquette d'adhérer au sous-endothélium, ou -b) le vWF se lie
d'abord
au
sous-endothélium,
change
de
conformation,
puis
devient
réactif
pour
le
complexe
GPlb/IX
pour
induire
l'adhésion
plaquettaire.
Ces
deux
mécanismes
ne
sont
pas
totalement exclusifs l'un de l'autre (Roth,
1991).
Des
études
réalisées
avec
des
chambres
de
perfusion
(Sakariassen et coll. 1979; Bolhuis et coll. 1981; De Groot
et Sixma, 1987), ont démontré que la liaison du vWF au sous-
endothélium
induisait
l'adhésion
plaquettaire
GPlb/IX
dépendante en l'absence de tout agoniste. Cette observation
plaide en faveur de la deuxième hypothèse qui suggère que la
liaison du vWF au
sous-endothélium précède
l'adhésion des
plaquettes. Mais si tel est le cas, les éléments vasculaires
doivent pouvoir induire une réactivité de la GPlb/IX qui se
lierait
au
vWF
en
l'absence
de
flux.
Aucun
argument

146
expérimental n'a permis d'élucider cette question. Cependant,
certains auteurs (Loscalzo et coll. 1986) ont suggéré que la
fibrine
pourrait
jouer
un
rôle
in
vivo
en
altérant
la
conformation
du
vWF,
ce
qui
faciliterait
sa
liaison
aux
plaquettes.
B. CONCLUSION
Ce modèle de thrombose expérimentale démontre l'inhibition
des
thrombi
occlusifs
à
la
suite
de
l'inhibition
des
interactions GPlb/IX-vWF ou GPI Ib/llla-vWF. D'autre part, les
effets de ces deux types d'inhibition sont similaires sur le
plan qualitatif et quantitatif. Le peptide RGDS est accepté
comme antagoniste de la liaison des protéines adhésives au
complexe GPllb/llla de
la membrane
plaquettaire
(Kroll
et
Shafer,
1989). Ceci favorise
l'hypothèse que aussi bien le
complexe GPlb/IX que le complexe GPllb/llla sont impliqués
dans l'interaction plaquette-plaquette, dans la thrombogenèse
et spécialement dans les conditions rhéologiques de vitesses
de
cisaillement
élevées
comme
celles
rencontrées
dans
la
pathologie artérielle chez l'Homme.
Par ailleurs, le temps d'apparition du premier thrombus
dans
ce
modèle
(qui
inclut
l'adhésion
plaquettaire
a
la
lésion
spécifique
intimale)
n'est
pas
significativement
allongé.
Les résultats cohérents obtenus dans cette étude,
avec
les différents traitements qui inhibaient de façon efficace

147
l'axe GPlb/IX-vWF
avec
l'effet commun de
déstabiliser
les
thrombi sans perturber l'adhésion initiale des plaquettes au
sous-endothélium concordent avec les résultats obtenus dans
d'autres
modèles
(Nichols
et
coll.
1991;
Fuster
et
coll.
1991; Lam et coll. 1991; Badimon et coll. 1991; Fressinaud et
coll.
1991).
Ceci
nous
permet
d'avancer
les
hypothèses
suivantes quant aux rôles du vWF dans
la thrombogenèse in
vivo:
1)
le vWF semble jouer un rôle relativement mineur dan·s
l'adhésion plaquettaire ou tout au moins l'axe GPlb/IX-vWF
n'est pas le seul mécanisme impliqué dans l'adhésion
2)
le
vWF
est
nécessaire
à
la
formation
de
thrombi
occlusifs; cette intervention du vWF se fait par sa liaison
avec les deux complexes GPlb/IX et GPllb/llla
3) L'inhibition de l'interaction GPlb/IX-vWF ne modifie pas
le temps de saignement ni la numération plaquettaire.
Par
ailleurs,
ce
modèle
de
thrombose
expérimentale
présente des avantages importants comparés aux autres modèles
actuels,
à savoir:
-
animaux de petite taille utilisés
(maniement facile,
faible quantité des produits à tester),
maintenus dans des
conditions
physiologiques
normales
(température
à
37°C,
respiration
normale).
De
plus,
il
semble
exister
une
homologie
des
structures
impliquée
dans
la
thrombose
(glycoprotéines
plaquettaires
lb/IX
et
lIb/IlIa,
certains
domaines du vWF) entre l'homme et le cobaye

148
-
plusieurs
vaisseaux
mésentériques
de
même
diamètre
peuvent être étudiés chez un même animal pendant une durée
minimale de deux heures, ce qui permet d'étudier la cinétique
des agents à tester
une
reproductibilité
satisfaisante
des
variables
à
mesurer durant l'expérimentation (temps de formation,
temps
d'embolisation,
nombre,
taille des thrombi)
-
un coût relativement abordable
En
conclusion,
l'inhibition
sélective
de
l'interaction
GPlb/IX-vWF,
soit
par
des
peptides
dérivés
du
domaine
de
liaison du vWF au complexe
GPlb/IX,
soit par des anticorps
dirigés
contre
le
complexe
GPlb/IX
ou
dirigés
contre
le
domaine de liaison du vWF au complexe GPlb/IX,
qui produit
une réduction de la tendance des plaquettes à la formation du
thrombus,
sans
un
allongement
significatif
du
temps
de
saignement ni une thrombopénie
(au moins dans
le protocole
utilisé chez le cobaye), constitue une cible prometteuse dans
les nouvelles thérapies anti-thrombotiques.

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Immunologie
differentiation
of
classic
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(factor
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deficiency)
and
von
Willebrand's
disease
with
observations
on
combined
deficiencies
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antihemophilic
factor
and
proaccelerin
(factor~Yê~~nd on
an
acquired
circulating anticoagulant
ag~~;t-an~t~~7mOPhiliC factor. J
Clin Invest,
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/ : /.,
~~'
,
- l".'· ~'v,: ",
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-~.../v;/,>\\,/
,
.~ '/
ZWAGINGA JJ,
DE GROOT PG,
SIXMA JJ'(t"98'7)
PMA
perturbation
of
endothelial
cells
increased
thrombin
formation in f lowing blood together wi th platelet aggregation
on their matrix.
Br J
Haematol,
66:
420

SOMMAIRE
Page
1.
INTRODUCTION
12
II.
RAPPELS DES MECANISMES DE L'HEMOSTASE
A.
Les diffèrentes phases de la thiombogenèse
1.
L'hémostase primaire
21
a.
La paroi vasculaire
b.
les plaquettes sanguines
2.
La coagulation plasmatique
31
3.
La fibrinolyse
31
B. Les facteurs rhéologiques
1. Définitions
32
2. Rôle dans l'adhésion plaquettaire à
la paroi
vasculaire
34
C.
Le Facteur Willebrand (vWF)
: principale protéine
impliquée dans l'adhésion et l'agrégation
1. Synthèse,
structure et localisation
35
2. Rôle:
relation structure-fonction
36
a.
Domaines fonctionnels
37
b.
Rôle dans l'adhésion
38
c. Rôle dans la formation du thrombus
45
d. Autres rôles
48
III. MATERIELS ET METHODES
A.
Etude in vivo:
modèle de thrombose expérimentale
51
1. Choix du cobaye
~CA!rV?;;;.~
51
2.
Protocole expérimental
fi...:...,p.> ~ ''''?~
53
a.
Préparation du cobaye
I~~I
) ;)
b.
Induc:tion de la lé~ion ifS L? A.- M E
~~
c. Systeme d'observat1on et~proc~ùu~e-g
expérimentale
\\ e,,-, \\ " , i l
B. Etude ~ in vi~ro des fonctio~s plaque~i,~~lj
1.
Preparat10n des suspens10ns plaquett.a"1:,res
57
2. Etude des fonctions plaquettaire~~~
59
C.
Etudes ex vivo
1. Etude ex vivo des fonctions plaquettaires
59
2. Mesure du temps de saignement
60
IV.
RESULTATS
1. Effet du RGDS,
dérivé du domaine d'interaction
des protéines adhésives qui interagissent avec la
GPIIb/IIIa
63
Nouv Rev Fr Hemato1,
32 : 103-106
2.
Effet des fragments
F(ab')2
de PG-l,
un anticorps
monoclonal dirigé contre le complexe GPIb/IX de
cobaye
71
Arteriosc1erosis and Thrombosis 1991;11:1231-1236
3.
Effet des peptides dérivés du domaine de liaison
du vWF au complexe GPIb/IX
79

,r 1"""
. 1"
~
~J":J'
4. Effet d'u~ anticorps monoclonal dirigé- contre le
domaine de liaison du vWF humain au complexe
GPIb/IX
109
v. DISCUSSION ET CONCLUSION
A.
Discussion
1. Autres modèles expérimentaux et données nouvelles
sur le rôle du Facteur Willebrand dans la formation
du thrombus:-=-_ _----;-
133
a.
Les modèles animaux
b.
Les modèles in vitro et ex vivo
2. Résultats obtenus avec le laser
141
- , - - - - - - - - - - - : - - - - - - , - - - -
a.
Effet de l'inhibition de l'interaction GPIbIX-
vWF sur le délai d'apparition du premier
thrombus---,-:-:-----:----:-::-----;-=-----:---=------=---:--:,-----,-----------:---:-------
b.
Effets de l'inhibition de l'interaction
vWF-GPIb/IX et de celle vWF-GPII/IIIa sur la
cohésion du thrombus~-~~----;-;,-----:--------::-;-------
3.
Les mécanismes potentiels de l'interaction
GPIb/IX-vWF
145
B. Conclus ion
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 4 6
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _149