,
,.
t.
UNIVERSITE DE DIJON
ECOLE NATIONALE SUPERIEURE DE BIOLOGIE APPLIQUEE .
A LA NUTRITION ET A L'ALIMENTATION
THE s
Présentée par
Babou
en vue d'obtenir le titre de DOCTEUR-INGENIEUR
ETUDE DES PROTEINES DE BRASSICA JUNCEA
AU COURS DE LA FABRICATION
ET DE LA CONSERVATION DE LA MOUTARDE.
...,\\
....
. .
.
. . .
CONSEIL -AFRICAIN ET MALGACHE
\\ POUR L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR
C 1\\. M. E. S. -
OUAGADOUGOU
\\ .' .-:e 0,. ·J1Jl N.1qg~·· ..... \\soutenue le 15 Décembre 1983
2JÎstïé sous. n#·.O 0 ·3 ·7 .'J~;,
--e~mm~sé1on'd'examen
:
Mr P. DUPUY
Président
Mr C. BARON
Mr J.P. HALM
Mr D. LORIENT

---

Barké
Farba DI~~
Wërsëk Marna SARR

---

REMERC IEMENTS
J'exprime ma profonde reconnaissance à Monsieur le Professeur
Christian BARON, Professeur de Biochimie à la Faculté des Sciences de
Dijon, pour l'accueil qu'il m'a réservé dans son laboratoire et pour
la confiance qu'il m'a accordée sur le plan scientifique.
Je tiens à exprimer mes respectueux remerciements à Monsieur
Pierre DUPUY Directeur du Département "Station de Technologie des
Produits Végétaux de l'LN.R.A. de Dijon",
Directeur du G.E.R.A.U.D. (Groupe d'Etude et de Recherche
en Alimentation de l'Université de Dijon),
qui a bien voulu me faire l'honneur de présider le jury.
Que Monsieur Jean-Pierre HALM, Directeur technique de SEGMA
MAILLE, dont nous avons apprécié l'amicale contribution et qui a
bien voulu participer à la commission d'examen, reçoive mes sincères
remerciements.
Que Monsieur le Professeur Denis LORIENT, Professeur de Biochi-
mie à l'E.N.S.B.A.N.A., qui a eu la bienveillance de juger ce travail,
comme il l'avait déjà fait pour mon mémoire d'Ingénieur, soit assuré
de toute ma gratitude
J'aimerais remercier tout particulièrement mes amis des laboratoi-
re de Biochimie Générale et de Biochimie Alimentaire pour leur aide
matérielle et morale.
Que toutes les personnes qui ont contribué de près ou de loin à
la réalisation de ce travail, trouvent ici, l'expression de ma sincère
-:-econnaissance.
Je tiens à témoigner toute mon amitié aux personnes du service
de l'O.C.A.U. (Office de Coopération et d'Accueil Universitaire) qui
ont facilité mon séjour en France.

---

RESUME
Les protéines de Brassica juncea, extraites à l'aide d'une solution de
chlorure de sodium (0,5 M) ont été fractionnées par électrophorèse sur
gel de po1yacry1amide à 10 %.
L'étude des protéines de graines et de différentes pâtes de moutarde
(avec et sans S02)' à mis en évidence une hydrolyse partielle de ces
protéines au cours de la fabrication et de la conservation de la mou-
tarde.
Ces phénomènes d'hydrolyse s'accentuent avec la température et le temps
de conservation de la pâte. A température ambiante et à la lumière, la
présence de S02 semble accroître la stabilité des fractions les moins
mobiles.
Le dosage des acides aminés totaux montre que 91 % de l'hydroxypro1ine
de la graine provient des téguments.
Cet acide aminé peut donc être considéré comme un "marqueur" de sons
de la moutarde. Un dosage de routine de l'hydroxyproline a été proposé.
L'analyse de l'évolution de la lysine libre au cours de la conservation
de la pâte indique que cet acide aminé participe aux phénomènes de
brunissement non enzymatiques.
La présence de S02 retarde, toutefois, le brunissement. L'efficacité
de S02 dure entre 1 et 4 mois.
L'activité de la myrosinase a été étudiée. Il apparaît que:
- cette activité enzymatique baisse rapidement au cours de la
conservation de la pâte.
- S02 diminue l'activité de la myrosinase de Brassica juncea
- la myrosinase de Sinapis alba est 30-40 fois plus active que
celle de Brassica juncea.
MOTS CLES : Brassica juncea - graines de moutarde - pâte de moutarde
fabrication - conservation - dépe11icu1ation - acides aminés -
protéines - hydroxypro1ine - myrosinase - électrophorèse sur gel de
po1yacry1amide.

---

5UMMARY
Brassica juncea proteins extracted with saline solution (NaCl 0,5 M)
have been fractionated by polyacrylamide gel electrophoresis.
The study of seed and different mustard paste proteins points to a par-
tial hydrolysis of these macromolecules after the paste preparation.
These phenomena augment with preservation time and temperature.
At room tempe rature and under light the presence of 502 seems to ~n­
crease the stability of the slow fractions.
The aminoacid measurement indicates that 91 % of seed hydroxyproline
originates in the cuticle. Hydroxyproline may be considered as a "mar-
ker" of the mustard bran.
A routine method of hydroxyproline determination is proposed.
The analysis of the evolution of the free lysine during mus tard pre-
servation demonstrates that this aminoacid participates in the non
enzymatic browning. The presence of 502 increases, nevertheless, the
induction time of the browning reactions. The effect
of 502 lasts
from one to four months.
The myrosinase activity has been studied. It seems that :
- this enzymatic activity decreases quickly during the prepara-
tion and preservation of the mus tard ;
- 502 reacts with the myrosinase and consequently decreases its
specifie activity ;
- the myrosinase of Sinapis alba ~s 30-40 times as active as
that of Brassica juncea.

---

SOMMAIRE
page
AVANT - PROPOS
INTRODUCTION
2
1 - Place de Brassica juncea parmi les crucifères
2
Il - Présentation de Brassica juncea
2
12 - Place de Brassica juncea parmi les cruciféres
2
13 - Etude bibliographique
4
2 - Fabrication de la moutarde
5
3 - Les thioglucosides et leur devenir
7
31 - Structure des thioglucosides
~-;0F.0,
7
~\\'-
' /
,
32 - Hydrolyse des thioglucosid ~;~~j-~~
8
33
Rôles biologiques des thio 'ij~~~' :; vés
9
4 - Propriétés et fonctions des myro °n~__
,,-;-:,Q.
10
t
e'"
41 - Localisation
. 0:;,,.'( n.:~~>
10
42 - Nature et mode d'action de la myrosinase
10
43 - Structure de la myrosinase
13
44 - Effet de l'acide ascorbique
14
45 - Propriétés de la myrosinase
18
451 - Influence du pH sur l'activité de la
myrosinase
18
452 - Influence de la température
18
453 - Influence de l'acide ascorbique
19
454 - Effet des subtances organiques et
inorganiques
19
455 - Stabilité de la myrosinase
20
46 - Les thioglucosidases d'origine microbienne
21
MATERIEL ET METHODES
1 - Matériel végétal
22

---

2 - Broyage des graines, des amandes et des pellicules
22
3 - Délipidation
22
4 - Dosage de l'azote total
23
5 - Dosage des acides aminés
23
51 - Hydrolyse acide des protéines
23
52 - Extraction des acides aminés libres
23
53 - Chromatographie en phase liquide des
acides aminés
24
531 - Dosage des acides aminés
24
532 - Méthode de calcul
26
54 - Mise en évidence de l'hydroxyproline
28
6 - Analyse des protéines hydrosolubles
29
61 - Extraction des protéines
29
611 - Extraction des protéines des pâtes
de moutarde
29
612 - Extraction des protéines des graines,
des amandes et des pellicules
29
62 - Purification des protéines
29
63 - Electrophorèse
30
631 - Préparation des solutions
30
632 - Protocole
31
7 - Activité de la myrosinase
31
71 - Extraction de la myrosinase
32
72 - Mise en évidence qualitative de la myros~nase
32
721 - Diffusion dans un gel d'agarose
32
722 - Méthode de MAC GIBBON et d'ALLISON
33
723 - Méthode d'impression de VAUGHAN
34
73 - Détermination quantitative de l'activité
de la myrosinase
35
731 - Méthode de SCHWIMMER
35
732 - Dosage du glucose
36

---

RESULTATS ET DISCUSSION
1 - Efficacité de la dépelliculation
38
Il - Teneur azotée des parties anatomiques
de la graine
38
12 - Teneurs en eau et en protéines des amandes pures
40
13 - Teneur en pellicules des échantillons "d'amandes"
41
14 - Utilisation éventuelle de la dépelliculation
dans la technologie de la moutarde
42
2 - Etude des protéines de Brassica juncea
44
21 - Extraction des protéines
44
22 - Electrophorèse des protéines
analyse qualitative
45
23 - Electrophorèse des protéines
analyse
quantitative
47
231 - Electrophorèse des protéines des graines
47
232 - Effet de la fabrication de la pâte de
moutarde sur le profil électrophorétique
49
des protéines
49
233 - Evolution des protéines solubles dans une
solution saline de la pâte de moutarde au
cours de la conservation
49
3 - Composition en acides aminés des protéines
61
31 - Acides aminés totaux
61
32 - Cas de l'hydroxyproline
66
321 - Mise en évidence de l'hydroxyproline
66
322 - Teneurs en hydroxyproline des parties
anatomiques de la graine
68
323 - Dosage de l'hydroxyproline de la pâte
de moutarde
69
33 - Acides aminés libres
72
34 - Evolution de la teneur en lysine libre de la
pâte de moutarde au cours de la conservation
76
4 - Etude de la myrosinase
78
41 - Analyse qualitative de la myrosinase
78
411 - Détection du glucose sur gel d'agarose
78
412
Détection du glucose après électrophorèse
78
413 - Détection du sulfate acide par le chlorure
de baryum
78
414 - Localisation de la myros~nase
78

---

42 - Détermination quantitative de l'activité
de la myrosinase
79
421 - Méthode de SCHWIMMER
79
4211 - Calcul des coefficients d'extinction
molaire
79
4212 - Calcul des activités spécifiques
des myrosinases de Brassica juncea
et Sinapis alba
79
4213 - Evolution de l'activité enzymatique
de la myrosinase des pâtes de moutar-
de au cours de la conservation
87
4214 - Influence de l'acide ascorbique
88
422 - Méthode du dosage du glucose
88
CONCLUSION
96
BIBLIOGRAPHIE
99

---

SOMMAIRE DES FIGURES
Figure nO
page
Broassica nigroa
3
2
Fruit de Broassica napus (Silique)
3
3
Domaine d'utilisation des "amandes" dans la fabri-
cation de la moutarde
43
4
Schéma des électrophorégrammes des protéines de
Broassica juncea
46
5
Electrophorèse des protéines de Broassiaa juncea
48
6
Effet de la fabrication de la pâte de moutarde
sur le profil électrophor~tique des protéines
50
7
Evolution des protéines solubles dans une solution
51
de NaCl au cours de la conservation de la moutarde
à 57
8
Mise en évidence de l'hydroxyproline par chromato-
graphie sur couche mince
67
9
Spectre de la sinigrine (solution aqueuse)
80
10
Spectre de la sinigrine (dans le tampon phosphate-
acide citrique pH 5,69)
81
11
Spectre de l'isothiocyanate d'allyle
82
12
Cinétique de la myrosinase de Sinapis aZba à 40°C
84
13
Cinétique de la myros~nase de Sinapis aZba
85
14
Cinétique de la myrosinase de Broassica juncea à 40°C
86
15
Spectre de l'acide ascorbique
89
16
Dégradation de l'acide ascorbique à 20°C
90
17
Effet de l'acide ascorbique à 50°C sur la myrosinase
de la pâte de moutarde avec So~ conservée 1 mois à 4°C
..
91
18
Spectre de la sinigrine (dans tampon citrate-
acide citrique pH 5,38)
92
19
Spectre des protéines brutes (protéines de moutarde
avec S02 "analyse dès réception")
93
20
Spectre des protéines brutes (protéines de moutarde
sans SO2 "analys e dès récept ion ")
94

---

SOMMAIRE DES TABLEAUX
Tableau nO
page
1
Fabrication de la moutarde
6
2
Mode d'action de l'acide ascorbique
17
3
Teneur azotée des parties anatomiques de la graine
39
4
Teneur azotée des parties anatomiques de la graine
selon la littérature
39
5
Rendement d'extraction des protéiaes
44
6
Pourcentage des fractions protéiques dans les
parties anatomiques de la graine
58
7
Pourcentage des fractions protéiques au cours
de la conservation de la moutarde
59
8
Composition en acides aminés des graines entières
62
9
Composition en acides aminés des "amandes grosses"
63
10
Composition en acides aminés des "amandes fines"
64
11
Composition en acides aminés des pellicules
65
12
Rf de la proline et de l'hydroxyproline
68
13
Teneur en hydroxyproline des parties anatomiques
de la graine
68
14
Composition en acides aminés libres du broyat
73
15
Composition en acides am~nes libres de la pâte
de moutarde après tamisage
74
16
Composition en acides aminés libres de la pâte
de moutarde achevée
75
17
Teneur en lysine libre des pâtes au cours de la
conservation
76
18
Coefficients d'extinction molaire de la sinigrine
et de l'allylisothiocyanate à 227,5 nm
79
19
Activités spécifiques des myrosinases des graines
de Brassiaa junaea et de Sinapis alba
83
20
Activités spécifiques de myrosinase des pâtes de
moutarde au cours de la conservation
87
21
Activités spécifiques de diverses myrosinases
95

---

AVANT - PROPOS

---

-
l -
Notre travail a été effectué dans le cadre d'un contr3.t "G.E.R.A.U.D:' (Groupe
d'Etude et de Recherche en Alimentation de l'Université de Dijon) regroupant des
industriels de la moutarde, des chercheurs (Faculté des Sciences - I.N.R.A.)
et des juristes afin de valoriser la moutarde de Dijon sur le marché national
et international.
En effet, ce produit, fabriqué à partir des graines de Brassiaa junaea, est
naturellement sensible aux phénomènes de brunissement. C'est pour les éviter
qu'on ajoute de l'anhydride sulfureux en cours de fabrication. Cependant l'ad-
dition de S02 n'est pas habituelle dans divers pays étrangers, et de ce fait,
les recherches du contrat "GERAUD"'" portent sur "la moutarde de Dij on sans S02".
Le travail qui nous a été confié est le fractionnement des protéines de la
graine. de Brassiaa junaea et l'étude de leurs propriétés enzymatiques (de
type "myrosinase") dans le but d'apprécier le rô~e des fractions protéiques
au cours de la conservation de la moutarde de Dijon (avec ou sans S02).
Nous présentons, d'abord, en introduction, notre ma~ière première biologique,
la graine de Brassiaa junaea, ainsi que les données de la bibliographie (rela-
tivement abondante) sur les thioglucosides de la moutarde et l'action des
thioglucosidases. Puis, après avoir décrit nos méthodes de travail, nous
grouperons nos résultats en quatre parties
- Efficacité de la dépelliculation
- Composition en acides aminés des protéines
- Etude des protéines de Brassiaa junaea
- Etude de l'activité "myrosinase"
En conclusion, nous ferons ressortir l'évolution des diverses fractions
protéiques au cours de la conservation de la moutarde de Dijon, ainsi que les
points à approfondir dans le cadre de recherches futures.

---

INTRODUCTION

---

- 2 -
1 - Place de Erassica junaea parmi les crucifères.
Il. Présentation de Brassiaa junaea
Brassiaa junaea est une plante herbacée anBuelle de la famille des crucifères.
Les fleurs sont hermaphrodites, régulières et complètes avec un réceptacle con-
vexe. La formule florale est : 4 sépales + 4 pétales + 6 étamines + 2 carpelle:
La silique, fruit caractéristique des crucifères, a une structuré constante.
C'est une capsule formée de deux carpelles, à déhiscence paraplacentaire,
s'ouvrant par quatre fentes situées deux par deux de chaque côté des placentas.
Les parois carpellaires stériles se soulèvent de bas en hattt; et les graines
restent fixées sur le cadre placentaire.
La graine, pourvue de deux téguments est exalbuminée. Les cotylédons occupent
la plus grande partie de l'embryon qui remplit toute la aavité séminale. La
graine de Brassiaa junaea est globuleuse, légèrement ovoïde, son diamètre
varie de 1,2 à 1,8 mm ; son poids moyen est de 2,4 mg (VANGHEESDAELE et
FOU~~IER, 1980). Elle possède, suivant les variétés, une teinte allant du brun-
rouge (graine d'origine hongroise ou canadienne), ou jaune-clair (Montana
bLonde ou Montana orientaLe). (DELRUE, 1981). Elle comporte trois constituants
anatomiques principaux: les téguments, l'embryon et les cotylédoBs. D'après
BENGTSONN (1970), les téguments représentent 15 à 21 % de la graiae entière.
La culture de Erassiaa junaea est pratiquement disparue en France au profit
du colza (Erassiaa napus) plus rémunérateur. Les plus gros exportateurs de
moutarde sont le Canada, les Etats-Unis et la Hongrie, mais l'Inde possède,
certainement, beaucoup plus de variétés différentes.
12. Place de Brassiaa junaea parmi les crucifères.
Plusieurs auteurs (MAC KENZIE et BLAKELY, 1972 ; VAUGHAN et WAITE, 1967) sou-
tiennent l'hypothèse selon laquelle Brassiaa junaea serait un hybride de
3rassiaa ni~
et de Erassiaa aampestris.

---

- 3 -
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Figure 2 .' Fruit
.
de 3rassica i'l"V
Süique)
.~'. uz
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. ~gure 1 :

---

- 4 -
Identification de Brassiaa junaea
Embranchement
SPERMAPHYTES
Classe
ANGIOSPERMES
Sous-classe
DICOTYLEDONES
Série
THALAMIFLORES
Ordre
PARIETALES
Sous-ordre
RHOEADALES
Famille
CRUCIFERES
Tribu
BRASSICACEES
Genre
BRAS SICA
S I N A P I S ; etc •••
Espèce B.nigra ; B. aampestris; B. junaea ;etc •• S. aZba; S. arvensis ;etc ••
Les crucifères représentent une famille homogène comprenant environ 380 genres
et 3000 espèces.
Les graines de Brassiaa nigra, de Brassiaa junaea et de Sinapis aZba entrent
dans la confection des pâtes de moutarde. Cependant, pour l'appellation moutar-
de de Dijon, seules les deux premières espèces sont utilisées.
13. Etude bibliographique.
Les protéines de la graine de Brassiaa iunaea ont fait ltobjet de beaucoup de
travaux.
- Analyse par électrophorèse et par immunoêlectrophorèse ~ des fins
taxonomiques (VAUGHAN et DENFORD, 1968 ; VAUGHAN et al., 1968).
- Etude des thioglucosides et des thioglucosidases qui sont respon-
sables de la formation future de ltarôme.
- Analyse des protéines hydrosolubles et des acides aminés (BOUQUET,
1971) •
A notre connaissance, aucun travail portant sur le devenir des protéines au
cours de la fabrication et de la conservation de la moutarde nta été entrepris.
Notre objectif est de contribuer à une meilleure connaissance de ce problème.

---

- 6 -
Tableau 1
Fabrication de la moutarde
MOUILLAGE
PREPARATION VERJUS
Graines nettoyées
Eau + vinaigre
+ acide citrique
+ eau + 502
+ 50 2
MELANGE
l
BROYAGE
TAMISAGE
l
CONDITIONNEMENT

---

- 5 -
2 - Fabrication de la moutarde
Brassiaa nigra et Brassiaa junaea sont, traditionnellement, utilisées dans la
fabrication de la œoutarde de Dijon. Brassiaa nigra possède une plus forte
teneur en a11ysénévo1 ou isothiocyanate d'allyle (1 à 1,5 %) que Brassiaa
junaea (0,8 à 1 %). Néanmoins, et pour des raisons économiques, seule la der-
nière espèce est, actuellement employée dans la confection de la moutarde. En
effet, Brassiaa nigra perd beaucoup de graines lors de l'ouverture de sa
silique déhiscente.
La fabrication de la pâte de moutarde est une suite d'opérations unitaires.
· Nettoyage des graines par tamisage pour éliminer les plus gros
éléments étrangers et par passage dans un cylindre de dépoussiérage.
Mouillage des graines avec de l'eau contenant de l'anhydride sul-
fureux (500 ppm) sous forme demétabisulfite.Cette opération permet un gonfle-
ment des téguments.
• Addition d'une solution qui peut être du verjus (jus de raisin
vert), du vin blanc ou rouge, du moût de raisin ou du vinaigre. Des additifs
sont ajoutés : acides tartrique, citrique et surtout S02 ; ainsi que de petites
quantités de sel, de sucre et éventuellement d'épices et d'aromates.
La moutarde finale doit contenir, au moins, 28 % de matières sèches (décret
du la septembre
1937).
• Broyage des graines avec des meules ou avec des broyeurs à micro-
coupe.
• Tamisage avec des tamis en acier inoxydable.
La moutarde de Dijon doit contenir moins de 2 % de sons. La moutarde à
l'ancienne, quant à elle, n'est pas tamisée.
• Désaération de la pâte par simple malaxage dans des cuves ou à
l'aide d'un disque qui projette la moutarde à travers des trous très fins.
• Stockage de 1/2 à 3 jours pour éliminer l'amertume de la pâte.
• Conditionnement.
La production annuelle française de mouta~de est d'environ 40.000 tonnes.
Caractéristiques. de la pâte de moutarde
· Teneurs réglementaires
Anhydride sulfureux
teneur inférieure à 500 ppm.

---

- 7 -
Sons : teneur inférieure à 2 %.
Matières sèches : teneur supérieure à 28 %•
• Composition de la pâte de moutarde de Dijon, selon COurTON (1977)
Matières grasses
10 à [2%
Matières azotées
6 à 8 %
Sucres totaux
2 à 4 %
Matières minérales
1 % + 6 à 9 % NaCl
• pH
3,5 ~ pH ~ 3,8
3 - Les thioglucosides et leur devenir.
31. Structure des thioglucosides.
Les graines de crucifères ont une teneur élevée en protéines de bonne qualitê
nutritionnelle. Elles renferment, aussi, des thioglucosides dont les produits
de dégradation constituent l'arôme caractéristique des pâtes.
La structure générale, probablement unique, est celle proposée par ETTLINGER
et LUNDEEN en 1956. Les thioglucosides diffèrent par la nature chimique de
leurs chaînes latérales.
5 - C H 0
/
6 11 5
R - C
X étant: souvent K (potassium)
\\.N- 0-50 - O-X-+-
2
Exemple
Pour l'allylthioglucoside(ou sinigrine), Rest
CH2 •
CH -
CH2 -
et X • K
"Les thioglucosides semblent se répartir dans la plante entière: dans les
tissus parenchymateux,
surtout dans l'écorce (GUIGNARD, 1890), et dans l'em-
bryon de la graine. Pour une espèce donnée, KJAER (1960) signale une diffé-
rence quantitative et surtout qualitative sur la répartit~on des thioglucosides
dans la plante. Ainsi les graines de B~siaa nigra, contiennent l'a11J1thioglu-
coside, alors que dans ses racines, on trouve le 2-phényléthylthioglucoside.

---

- 8 -
32. Hydrolyse des thioglucosides.
Les thioglucosides sont dégradés, en présence d'eau et d'une thioglucosidase
communément appelée ~rosinase (thioglucoside glucohydrolase : EC 3.2.3.1),
suivant la réaction (d'après VAN E'ITEN et al., 1969),
/S-~H1,05
•
HO
•
R-C /5-1
Myrosinase
[
R-C
+ KHS0 + Glucose
'N-
4
0-50 -
O· K·
'N-J
2
2
Isothiocyanate
A-C.N
•
52-
Nitrile + Sulfure
[.-<-J
A- S-CiiiN
Thiocyanate
L'hydrolyse des thioglucosides donne toujours du glucose et du sulfate acide
de potassium. La formation d'isothiocyanates, de thiocyanates et de nitriles
dépend de conditions et de facteurs qui ne sont pas encore tous connus
(VAN ETTEN et al., 1969 et VIRTANEN,
1965).
L'isothiocyanate formé, donne en présence de R'OH, du thiouréthane. Cette
réaction est non enzymatique.
H
S
SH
1
Il
1
~'OH
- - - -.......
~
~-N-C-OFr ••- - - - - .
~-N=C-OA·
Lorsque R' appartient à la molécule d'isothiocyanate, il se forme des hé té-
rocycles ou des polymères.
Exemple
S-C~H1'0-
/
Q
::l
CH?- CH-CHOH -
CH2-C~
•
~NOS03K
(R)-2-hydroxy-3-butényl thioglucoside (Progoitrine)
~
CH -
CH-CHOH - C H - N -
C - 5
2
2
2-hydroxy-3-butényl isothiocyanate
!
CH -
N-'4
1 2
1
CH -
CH- CH
C~
2
' 0 / ~S
5-vinyl-oxazolidine 2-thione (Goitrine)

---

- 9 -
Plusieurs oxazolidine-thiones ont des actions goitrigènes (GREER, 1962)
Néanmoins il est heureux de constater que ces composés n'apparaissent
pas dans la moutarde de Dijon car la sinigrine est le seul thiogluco-
side de la graine de Brassiaa junaea (VAN ETTEN et al., 1969).
33. Rôles biologiques des thioglucosides et dérivés.
L'action de la thioglucosidase est recherchée dans la confection de
condiments. La flaveur piquante de la moutarde est liée, essentiel-
lement, à la présence de l'isothiocyanate d'allyle.
Cependant, à très fortes doses, les dérivés des thioglucosides ont des
effets néfastes sur la santé. BARKER (1936) observe que l'ion thiocyanate
utilisé dans le traitement de l'hypertension peut agir comme goitrigène
chez l'homme, en abaissant, probablement, la concentration en iode
dans la thyroide (action antithyroïdienne).
LANGER et collaborateurs ont provoqué une
hyperthyroïdie en gavant des
rats avec des doses journalières élevées d'isothiocyanate d'allyle.
(LANGER, 1964 ; LANGER et STOLC, 1965).
Des rats, recevant des rations riches en nitriles, sont victimes d'une
hyperhépatie, d'une hyperplasie du canal bilaire, d'une fibrose et
d'une mégalocytose des hépatocytes. Les reins sont hypertrophiés avec
des lésions reinales au niveau des cellules épithéliales tubulaires
(VAN ETTEN et al.,1969). Cependant, la dose léthale (DL 50) du nitrile
le plus actif sur les rats, indiquée par ces derniers auteurs est de
170 ppm par kg. Ce qui correspond, si l'on suppose que toute la sini-
grine se transforme en nitrile, à une prise unique de 15 kg de pâte de
moutarde pour un homme de 75 kg.
Les thioglucosides participeraient à la protection de la plante. En
effet, leur hydrolyse enzymatique, après la désintégration cellulaire,
produit des aglycones pourvus de pouvoirs bactéricide et fongicide.
Ces aglycones joueraient donc un rôle "antibiotique" dans les plantes
supérieures.

---

- 10 -
4 - Propriétés et fonctions des myrosinases.
La myrosinaseou thioglucoside glucohydrolase : EC 3.2.3.1 catalyse l'hy-
drolyse enzymatique des thioglucosides. La structure chimique unique
des substrats et la diversité des produits de la réaction ont stimulé
les recherches sur cette enzyme depuis sa découverte par BUSSY en 1840.
41. Localisation.
La myrosinase est présente dans tous les tissus des plantes à thioglu-
cosides. Son activité décro!t tout au long du développement de la
plante mais elle reste décelable au stade floral (IVERSEN et
BAGGERUD 1980).
Elle est localisée essentiellement dans des cellules particulières ou
et
puisque lVERSEN et BAGGERUD
que dans la
tribu des Brassicacées.
MATILE (1980) montre que dans les tissus racinaires du raifort, la
myrosinase est localisée à l'extérieur des cellules: dans la paroi
cellulaire ou liée au plasmalemme.
42. Nature et mode d'action de la myrosinase.
La nature et le mode d'action de la myrosinase ont fait l'objet de
beaucoup de contreverses.
VGN EULER et ERIKSON (1926) signalent que la myrosinase est composée de
2 enzymes
une thioglucosidase et une sulfatase ; l'action de la pre-
mière étant plus rapide. La nature double de la myrosinase a été confir-
mée par SANDBERG et HOLLY (1932) mais pour ces derniers auteurs, les
2 enzymes agiraient en même temps.

---

-
Il -
ETTLL~GER et LUNDEEN (1956) indiquent la possibilité d'une myrosinase
unique et proposent, pour la formation de l'isothiocyanate le mécanis-
me suivant
- La première étape est constituée par l'hydrolyse enzyma-
tique de la iiaison thioglucosidique.
- Il s'ensuit an réarrangement spontané de la molécule
ag1ycone (ou réarrangement de Lossen), qui aboutit à l'élimination
liu sulfate.
NAGASHIMA et ucaIYAMA (1959) apportent une preuve expérimentale de
l'unicité de la myrosinase et appuient l'hypothèse du réarrangement
de Lossen.
Myrosinase
+
CH
0
a 12 a
s
,
~
-
R-C-N--OSO :<
-
3
s
i ,r- rw
R-C-N--OSO K
+
-osa K
•
3
-
3
~
NAGASHIMA et UCHIYAMA observent, ~n 0
est inhibée
par les substances qui réagissent avec
l'acide ascorbique.
GMELIN et VIRTANEN (1959) remarquent, chez Lepidium !'UdaZe, T'hZaspi
arvense ou Lepidiu~ sativum, la production enzymatique de thiocyanate
dont le mécanisme serait analogue à celui de la formation de l'isothio-
cyanate (réarrangement de Lossen) .
Cependant, le facteur qui oriente le radical R- sur l'atome d'azote
ou de soufre est encore inconnu.

---

- 12 -
ETTLINGER et al. (1961) avancent qu'il existe 2 enzymes dont seulement
une est activée par l'acide ascorbique.
GAINES et GOERING (1960 et 1962) pensent avoir séparé àpH3 la thiog1u-
sidase de la sulfatase par méthode chromatographique sur DEAE
cellulose
échangeuse d'ions, à partir des graines de Brassiaa junaea.
SCHWIMMER (1960) a mis en évidence, à partir de la sinigrine, la for-
mation de trouble catalysée par la myrosinase à pH3. Le trouble résul-
terait de la réaction du 3 - butény1 - thiohydroximy1su1fate avec les
protéines ayant des ponts disu1fures selon le mécanisme
suivant:
Myrosinase
s-s
•
R-C
"
/
p
+
KHS04
"N-S./
s-s
R-c
"
/
p
+
"
----------___
Polymère insoluble
N-S ./
A la lumière de ces observations, les conclusions de GAINES et GOERING
(1960 et 1962) peuvent être expliquées par le degré de purification de
la solution enzymatique.
Une préparation très pure donne une solution pauvre en protéines non
enzymatiques. Ce qui peut réduire la quantité de protéines à ponts
disu1fures au point d'empêcher l'apparition de HS04 selon le mécanisme
de SCHWIMMER.
D'autre part la purification peut éliminer des composés avides en
ions H+ d'où une inhibition du réarrangement de Lossen à pH3. Une so-
lution de myrosinase très pure mise au contact de la sinigrine produi-
rait ainsi une accumulation de glucose et de 3 - butenyl-thiohydroxi-
myl sulfate.
La deuxième fraction de GAINES et GOERING pourrait correspondre à une
solution de myrosinase peu purifiée. La quantité d'enzyme pourrait être
si faible que la libération de glucose consécutive à l'hydrolyse de la
sinigrine soit indécelable par la méthode de dosage.

---

- 13 -
Par contre le mélange des 2 fractions apporte suffisamment de myrosinase
et des facteurs favorisant
le réarrangement de Lossen, d'oâ une pro-
duction de glucose, de sulfate et d'isothiocyanate.
Selon ces travaux la myrosinase serait donc une enzyme unique. Cette
thèse est confirmée par les travaux de TSURUO et al. (1967). En effet,
ces auteurs n'ont pas réussi, avec les méthodes utilisées par GAINES
et GOERING, à séparer la thioglucosidase de la sulfatase à partir
des graines de Brassica juncea.
43. Structure de la Myrosinase.
Les thioglucosides sont hydrolysés par une enzyme qui, cependant, est
constituée d'un groupe d'isoenzymes.
L'enzyme est une thioglucoside glucohydrolase classée EC 3.2.3.1
(FLORKIN et STOTZ, 1965).
La purification de la myrosinase des graines et la séparation des
isoenzymes ont fait l'objet de beaucoup d'études.
La myrosinase de graines de Brassica juncea présente 2 isoenzymes
après passage sur cellulose échangeuse d'ions (TSURUO et al. ,1967)
mais une seule isoenzyme
après analyse par électrophorèse sur gel
d'amidon (VAUGHAN et al., 1968).
Le fractionnement de la myrosinase par chromatographie sur DEAE cellu-
lose montre trois isoenzymes pour les graines de Sinapis aZba et
quatre isoenzymes pour les graines de Brassica napus (BJORKMAN et
JANSON 1972. LONNERDAL et JANSON, 1973).
L'étude effectuée par ~lectrophorèse sur gel d'acrylamide, sur plusieurs
espèces de crucifères montre que le nombre des isoenzymes de la myrosi-
nase varie d'une espèce à l'autre mais aussi suivant les organes d'une
même plante (MAC GIBBON et ALLI SON , 1970, PIHAKASI et PIHAKASKI, 1978).
Les isoenzymes purifiées à l'heure actuelle, sont des glycoprotéines
de poids moléculaires variant entre 125 000 et 155 000. La partie
glucidique constituée essentiellement d'hexoses représente suivant les
espèces entre 9 ét 23 % de la molécule. Les pH isoélectriques des
différentes isoenzymes sont compris entre 4,6 et 6,2 (BJORKMAN, 1976).

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- 14 -
Le site actif de la myrosinase de plante semble contenir des groupes
aminés, des groupes sulfhydryles et un résidu histidyle. Ainsi la
myrosinase a, au moins, quatre groupements sulfhydryles,qui sont actifs
à l'état natif (OHTSURU et HATA,1973a).
Les isoenzymes sont composées de sous-unités identiques (BJORKMAN et
JANSON 1972). LONNERDAL et JANSON (1973) ont obtenu 2 sous-unités pour
les molécules de myrosinase
de graines de Sinapis aZba et de Brassiaa
napus par chromatographie sur gel de Sepharose 6B avec le tampon
guanidine - HCl comme éluant. OHTSURU et HATA (1972) trouvent, pour
les isoenzymes d'une poudre de moutarde Brassiaa junaea, quatre sous-
unités après électrophorèse sur gel de polyacrylamide contenant du
SDS (Sodium duodecyl-Sulfate )
44. Effet de l'acide ascorbique.
L"étude de l'influence de l'acide ascorbique sur l'activité de la
myrosinase a donné des résultats divers et parfois contradictoires
depuis que NAGASHlMA et UCHIYAMA (1959) ont considéré cet acide comme
un cofacteur de l'enzyme.
ETTLINGER et al. (1961) séparent par extraction deux enzymes à partir
des graines de Sinapis aZba. Ces deux isoenzymes se comportent différem-
ment en présence de l'acide ascorbique qui n'affecte pas l'activité de
l'une alors qu'il est indispensable pour l'activité de l'autre.
TSURUO et al. (1967) indiquent que les deux isoenzymes de la myrosinase
isolées à partir de graines de Brassiaa junaea ont le même comportement
vis-à-vis de l'acide ascorbique.
VOSE (1972) obtient avec les isoenzymes de Sinapis aZba des réponses
à l'acide ascorbique dissemblables selon la technique de purification.
En effet, les isoenzymes séparées par électrofocalisation sont toutes
activées
par l'ascorbate ; les taux d'activation sont cependant
très différents. Par contre, après étude des 2 isoenzymes purifiées
par chromatographie échangeuse d'ions (DEAE et TEAE cellulose), l'au-
teur note une activation de l'une et une inhibition de l'autre.
BJORKMAN et JANSON (1972) trouvent que les trois isoenzymes de Sinapis
aZba sont activées jusqu'à une concentration de ImM d'acide ascorbique

---

- 15 -
mais le taux d'activation dépend de l'isoenzyme.
HENDERSON et MC EWEN (1972) ont étudié l'effet de l'acide ascorbique
sur les isoenzymes de myrosinase de graines oléagineuses. Sinapis alba
possède uneisoenzyme non affectée et au moins une isoenzyme activée
par l'acide ascorbique.
OHTSURU et RATA (1972) trouvent quatre isoenzymes à partir d'une fari-
ne de moutarde de Brassica juncea qui sont toutes activées par l'acide
ascorbique. Cependant, l'activité d'une isoenzyme est accrue de 50 fois
alors que celle des autres l'est de 100 fois.
Le mécanisme de l'action de l'acide ascorbique n'est pas encore complè-
tement connu mais nous disposons de plusieurs éléments qui sont à
l'origine ou qui renforcent l'hypothèse de TSURUO et RATA (1968c).
L'influence de l'ascorbate sur l'activité de la myrosinase dépend de
la concentration en effecteur. Aux concentrations faibles, toutes les
isoenzy~es testées sont activées. L'activation croît avec la teneur
en acide ascorbique jusqu'à une concentration d'environ ImM. Aux
concentrations élevées, l'ascorbate agit comme inhibiteur de l'activité
de l'isoenzyme ; activité qui est complètement inhibée aux concentra-
tions en acide ascorbique supérieures à 10 mM (BJORKMAN et LONNERDAL
1973).
L'effet de l'acide ascorbique sur la myrosinase n'est pas fondé sur
les propriétés d'oxydo-réduction de l'ascorbate : en effet, ETTLINGER
et al. (1961) ont étudié l'action sur la myrosinase de plusieurs
analogues de l'acide ascorbique. Beaucoup d'entre eux, comme le
2-o-méthyl - L - ascorbate, agissent comme des co-enzymes mais avec
des taux d'activation moindres que celui de l'ascorbate.
De plus, TSURUO et RATA (1967) montrent, en utilisant l'ascorbate
oxydase, que l'acide ascorbique est fortement fixé sur l'enzyme.
Cette fixation de l'ascorbate sur l'enzyme est confirmée par BJORKMAN
et LONNERDAL en 1973.
OHTSURU et RATA (1973b) montrent que l'effet de l'acide ascorbique ne
résulte pas d'un phénomène de dissociation-association des sous-unités
de l'enzyme mais d'un changement dans la conformation de la protéine.

---

- 16 -
REE5E et al. (1958) observent que le p- nitrophényl -S-glucoside peut
~tre un
subtrat de la myrosinase. T5URUO et HATA (1968c) notent que
ce système enzyme-substrat n'est pas activé par l'acide ascorbique.
Cependant, des teneurs élevées en ascorbate, provoquent une inhibition
de la dégradation du p-nitrophényl-S-glucoside par la myrosinase.
Cela a permis à ces auteurs d'élaborer une hypothèse sur le mécanisme
d'action de l'acide ascorbique. La myrosinase aurait un site d'action
(5) pour le substrat et deux sites pour l'effecteur (El et E ).
2
Le site du substrat comprendrait deux parties : le site 51 pour la
portion glycone et le site 52 pour le segment aglycone du thiogluco~
side.
Lorsque l'ascorbate se fixe sur son site El' il y a altération de la
conformation
du site 52 permettant un meilleur contact entre l'enzyme
et le substrat. A haute teneur en ascorbate, il y a inhibition de
l'activité de la myrosinase car le site E
de l'acide ascorbique
2
correspond au site 51 du thioglucoside. (voir tableau 2)
OHT5URU et HATA (1975) montrent que la myrosinase a quatre sites par
molécule qui fixent plutôt fortement l'acide ascorbique et au moins un
site supplémentaire qui fixe moins fortement l'ascorbate.
OHT5URU et HATA (1979) précisent que l'addition d'acide ascorbique
provoque un changement dans la conformation de l'enzyme aboutissant à
une apparition de résidus aminés à la surface et une disparition de
résidus de tryptophane dans la zone altérée par l'acide (près du
site 52).
Les groupes sulfhydryles indispensables à l'activité catalytique de
l'enzyme sont localisés près du site 51'

---

-
17 -
Tableau 2
Mode d'action de l'acide ascorbique (TSURUO et RATA, 1968)
Site SI
Site S2 Site El
(site E )
2
~
1
r
~
f
T
Glycone
Aglycone
MYROSINASE
ASCORBATE
SINIGRINE
(enzyme)
(effecteur)
(substrat)
1 - Hydrolyse de la sinigrine en l'absence de l'acide ascorbique
2 - Activation de l'hydrolyse par l'acide ascorbique
3 - Inhibition de l'hydrolyse par l'acide ascorbique

---

-
18 -
45. Propriétés de la myrosinase.
Il existe environ 60 thioglucosides naturels qui peuvent être substrats
de la myrosinase. BJORKMAN et LONNERDAL (1973) ont analysé l'action des
isoenzymes des graines de Sinapis alba et Brassiaa napus sur plusieurs
substrats et n'ont pas observé de différence ni entre les isoenzymes
de même origine ni entre les myrosinases de Sinapis alba et de_Brassiaa
napus. Il ne semble donc pas y avoir de spécificité marquée des myrosinases
pour un substrat donné.
451. Influence du pH sur l'activité de la myrosinase.
L'activité de la myrosinase est fonction du pH. Chaque isoenzyme pré-
sente une zone de pH optimum qui dépend de la pureté de l'enzyme, du
type et de la concentration du tampon. Cette zone est comprise entre
les pH 4,5 et 9 .
Le pH intervient aussi sur la nature du produit de la réaction. Ainsi,
l'isothiocrranate est obtenu au pH neutre alors que le nitrile se for-
me en milieu acide (pH inférieur à 3).
D'autre part, SCHWIMMER (1960) rapporte qu'à pH 3, la myrosinase cata-
lyse la formation d'un trouble résultant de la réaction du 3-butényl-
thiohydroximylsufate avec des protéines à ponts disulfures.
Il est à noter que le pH de la moutarde de Dijon est compris entre
3,5 et 4,2.
452. Influence de la température.
L'activité de la myrosinase croît avec la température jusqu'à environ
60-65°C. Au delà de cette température la dénaturation de l'enzyme
commence. La température optimum diminue en présence de l'acide ascor-
bique (35°C pour la myrosinase de Brassica junaea ; OHTSURU et HATA,
1979), en raison de la thermosensibilité de l'effecteur.
ANDRE et DUROU-CARBOUERES (1957) ont montré qu'une enzyme, la désulfu-
rase des sénévols dégrade l'allylsénévol en nitrile eten sulfure.
Néanmoin~ cette désulfurase ne doit pas être active dans la pâte
de

---

- 19 -
moutarde puisque son activité est inhibée, à toute température, aux
pH inférieurs à 4,3(VANGHEESDAELE et BICHOT, 1970).
453. Influence ùe l'acide ascorbique.
A faible concentration, l'acide ascorbique active la myrosinase. On
observe,en même temps que l'augmentation de la vitesse de la réaction,
une baisse de l'affinité de l'enzyme pour son substrat.
L'acide ascorbique n'a donc pas le comportement normal d'un effecteur
positif. (BJORKMAN 1976).
ScmiIMMER (1960) signale la production de H S catalysée-par la myrosinase
2
à pH 3, en présence de l'acide ascorbique (AH 2) selon le mécanisme
suivant
Myrosinase
~
A
L'effet inhibiteur de l'acide ascorbique, à fortes doses, provient
d'une part, d'une compétition au niveau du site du substrat entre
·l'ascorbate et le thioglucoside et d'autre part, d'une instabilité du
complexe enzyme-substrat (BJa~~ et LONNERDAL, 1973).
454. Effet des substances organiques et inorganiques.
Divers sucres et glucosides inhibent les myrosinases à des concentra-
tions beaucoup plus élevées que celle du substrat. Ainsi le glucose
est un inhibiteur compétitif lorsque la teneur en sinigrine est faible
(TSURUO et RATA,1968b). Le glucose n'affecte pas la liaison entre l'en-
zyme et l'acide ascorbique. Le saccharose quant à lui, n'inhibe pas
l'activité enzymatique.
TSURUO et RATA (1968a) rapportent que des sels contenant des anions
monovalents ont un effet inhibiteur qui est netable sur la myrosinase
en état d'activation par l'acide ascorbique et faible sur l'enzyme
non activée. Cet effet inhibiteur n'est pas observé avec des anions
divalents.

---

- 20 -
NAGASHIMA (1959) montre que la myrosinase brute est inhibée à 85 %
.
~
2+
2+
3+
2+
par des 10ns de metaux lourds
Hg
,Fe
,Fe
et Cu
Cependant SEARLE et al. (1982) notent que les ions ferreux accélèrent
la dégradation du méthylène-3-indolylméthylglucosinolate en ~éthylène­
3-indolylacétonitrile (précurseur de l'auxine) par la myrosinase de
Sinapis aZba. D'autre part VANGHEESDAELE et FOURNIER (1977)indiquent
que les sels cuivreux désulfurent les thioglucosides pour donner les
nitriles correspondants.
455. Stabilité de la myrosinase.
~4~~lité des myrosinases
de Sinapis aZba
conservation.
enzymatique, du
Les enzymes purifiées
préparations brutes.
En solution, l'enzyme se conserve bien dans le tampon imidazola à
pH 6 et à 4°C.
La congélation complète détruit les enzymes purifiées mais n'entrat-
ne pas de changement notable sur l'activité de l'extrait brut.
46. Les thioglucosidases d'origine microbienne.
Une thioglucosidase appelée sinigrinase a été trouvée chez les moisis-
sures notamment Aspergillus sidOwi dont l'enzyme est constitutive
(REESE et al. 1958, OHTSURU et al., 1969a, 1969b), AspergiZlus niger
(OHTSURU et RATA, 1973c; OHTSURU et al., 1973), chez des bactéries
(OGINSKY et al., 1965 ; TANI et al., 1974a, 1974b) et même chez des
mammifères au niveau de certaines tumeurs (GOODMAN et al.,1959).
La sinigrinase 'possède les deux activités thioglucosidase et sulfatase.
Néanmoins, elle semble être beaucoup moins spécifique que la myrosinase
des plantes. REESE et al. (1958) notent que, contrairement à la myrosi~
nase, la sinigrinase hydrolyse tous les e-glucosides testés, le maltose
l'amidon et le saccharose.
La myrosinase présente une affinité vis-à-vis de la sinigrine vingt
fois plus importante que celle de la sinigrinase (OHTSURU et al., 1969a).

---

- 21 -
La thioglucosidase d'origine microbienne est moins stable dans des
conditions de pH acide ou alcalin. Elle est, également, plus thermo-
sensible que la myrosinase.
L'effet des ions sur l'activité de la sinigrinase dépend de l'origine
de l'enzyme. Ainsi l'ion cuivrique n'a pas d'effet (à une concentration
de 10-3 M) sur la sinigrinase d'Aspergillus sid~wi (REESE et al., 1958),
alors qu'il active la thioglucosidase d'Aspergillus niger (ORTSURU et
RATA, 1973c) et inhibe fortement l'enzyme d'Enterobaoter oloaoea
(TANI et al., 1974a).

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MATERIEL ET METHODES

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- 22 -
l - Matériel
végétal
Notre travail a porté sur trois types diéchantillons de Brassiaa junaea
- Des échantillons de la matière première à savoir la graine et
ses constituants anatomiques.
La séparation des amandes et des téguments a été effectuée par insuf-
flation d'air au laboratoire de l'r.N.R.A.de Nantes. Cette opération
très délicate, en raison de la petite taille des graines, permet
d'obtenir trois fractions "amandes fines", "amandes grosses" et "pel-
licules".
- Des échantillons de pâtes de moutarde en cours de fabrication.
Ce lot comporte le broyat, la pâte tamisée et la moutarde achevée. Nous
avons effectué sur ces échantillons le dosage des acides aminés libres.
- Des échantillons de pâtes de moutarde avec et sans 50 2 en cours
de conservation.
Noua remercions vivement les sociétés SEGMA MAILLE et AMORA ainsi que
l'I.N.R.A. de Nantes qui nous ont fourni ces échantillons.
2 - Broyage des graines, des amandes et des pellicules.
Un broyage, à l'aide d'un broyeur "MOULINEX", est effectué pendant
30 secondes sur 40 g environ de matière première préalablement congelée
dans l'azote liquide. Cette opération est rép~tée 4 fois.
3 - Délipidation
Les broyats, obtenus précédemment, ainsi que les pâtes de moutarde sont
délipidés par lavage sur Büchner avec de l'acétone jusqu'à obtention d'un
filtrat incolore. Les pâtes délipidées sont ensuite séchées, sous vide,

---

- 23 -
dans un dessiccateur.
4 - Dosage de l'azote total.
Ce dosage a été effectué sur les graines, les amandes, les pellicules
et sur les différentes farines délipidées. Nous avons utilisé la
méthode de KJELDAHL
Les protéines brutes sont déterminées par calcul, à partir de l'azote
total en adoptant le coefficient 6,25.
5 - Dosage des acides aminés.
51. Hydrolyse acide des protéines.
L'hydrolyse acide est effectuée sur les farines délipidées des graines,
des amandes et des pellicules.
On introduit une petite quantité de farine délipidée (20 mg de farine
d'amandes; 20 mg de farine de graines entières; ou 40 mg de farine
de pellicules), et 6 ml de solution d'acide chlorhydrique (HCI 5 N)
dans une ampoule qui, après congélation dans l'azote liquide, est scel-
lée sous vide. L'hydrolyse est opérée pendant 12 heures à 120°C. L'é-
chantillon hydrolysé est évaporé dans un dessiccateur, puis repris dans
1 ml de solution d'acide chlorhydrique (HCI 0,1 N), et enfin, filtré à
l'aide d'une seringue munie d'un embout à membrane filtrante. Les acides
aminés totaux, ainsi obtenus, sont placés au congélateur jusqu'au do-
sage.
52. Extraction des acides aminés libres.
Les analyses sont effectuées sur les farines délipidées des pâtes pré-
levées au cours de la fabrication de la moutarde. On met en suspension
2 g de farine dans 15 ml de solution de chlorure de sodium ( solution
NaCI 0,5 M, pH B), puis on centrifuge 20 minutes à BOO g. On réalise
une deuxième extraction avec 15 ml de la solution de chlorure de
sodium. Les surnageants d'un même échantillon sont rassemblés (solution
S). On fait passer B ml de la solution S dans une colonne de résine

---

- 24 -
échangeuse de cations : Dowex 50. Les acides aminés fixés sur la
résine sont élués avec 10 ml d'ammoniaque (5N). Les éluats sont éva-
porés dans un dessiccateur sous vide et les extraits secs sont repris
dans 1 ml d'acide chlorhydrique (O,IN) (Solution S').
Les solutions S' sont conservées au congélateur jusqu'à l'analyse.
53.- Chromatographie en phase liquide des acides aminés.
531. Dosage des acides aminés.
L'analyse est effectuée, à l'aide d'un auto-analyseur Technicon, selon
la méthode de MOORE et STEIN (1951 et 1954) améliorée par BENSON et
al.
(1967).
La colonne est remplie de particules solides d'une résine de polystyrène
sulfoné (type C3), sous forme lithium, c'est-à-dire préalablement équi-
librée avec une solution d'hydroxyde de lithium (LiOH O,3M), de façon
que tous les ions H+ des groupements acides sulfoniques soient rempla-
cés par des ions Li+. Lorsque des acides aminés, chargés positivement
sont introduits dans la colonne, ils déplacent les ions Li+ et se
fixent sur la résine. Cette fixation dépend entre autres, du pH, de
la force ionique et de la température de la colonne. Les acides aminés
sont, ensuite, élués par des solutions tampons dont le pH varie de
2,75à4,10.
citrate
Tampon citrate
Tampon cit:rat:e
Régénération de la
Tampon
colonne
pH 2,75
pH 3,50
pH 4,10
(Solution LiOH O,3M)
- - - - - - - - - _ . _ - - - - - - - - - -~-
Durée ùe
96
46
40
30
passage (mn)
Température
37°C
37°C
55°C
-
de la colonne
Acides
Asp, Hypro,
Cys
Tyr, Phe,
Thr, Ser,
Met
Orn
Ile
Lys
Aminés
Asn, Glu ,
-
Pro, Gly,
Leu
lIis
Eluês
1\\la, Val,
Nle
Arg

---

- 25 -
Pour séparer l'asparagine de l'acide gluLamique, dans le dosage des
acides aminés libres, la température de la colonne en début d'analyse
est portée à 32°C.
Les acides aminés élués sont révélés à 95°C par une solution de ninhy-
drine.
Le mécanisme de la production du composé coloré fait intervenir le
groupement - NH2 en position ~ de la fonction acide.
o
o
NH
OH
~t2
OH
+
11
~-CH-COOH
+
~-C -
COOH
+ Hp
OH
H
o
o
:~inhydrine
Hydrindantine
NH
o
\\1
Il
~-C-COOH
+
+
R-C -
COOH
o
o
1/
~1
~-C-COOH
~-C-H
+
o
0
CX;Z-.OH - Hi ,'-H-- HoXü'
17
+--
1
-
. - ~ . 'N Y -
~
.J_ .•• _..
~
H
1 H
HO 1
--------
o
0
Composé pourpre
0
0
O-NH"
0
1
~
.1
l
'1
N
+
NH
»
3
CC(--==<))
l
l
'1
'
,
1
0
0
a
a
Composé bleu

---

- 26 -
Il se forme, donc, une coloration violette pour l'ensemble des acides
aminés sauf pour la proline et l'hydroxyproline dont l'azote iminé
est engagé dans un cycle. Ces derniers développent une coloration jaune.
L'intensité de la coloration obtenue est mesurée dans un colorimètre
à 410 om.
La durée totale d'une analyse est d'environ 200 minutes.
532. Méthodes de calcul.
L'analyse s'effectue en présence d'un étalon interne, ici, la norleu-
cine qui est un acide aminé de synthèse. Elle se fait en deux temps :
l'analyse d'une solution standard d'acides aminés, puis de la solution
à étudier •
• Première injection
a (ml)
volume de solution standard de mol~rité m ( ~moles/ml)
i l (ml)
volume de solution d'étalon interne
• Deuxième injection
v (ml)
volume de l'échantillon à doser
i
(ml)
volume de solution d'étalon interne.
2
Considérons que l'acide aminé à doser est la lysine. On obtient après
analyses
surface du pic de la norleucine (1 ~re . .
.
)
xI
~nJect~on
. y
surface du pic de la lysine de la solution standard
x
surface du p~c de la norleucine (2° injection)
2
s
surface de la lysine de l'échantillon
surface du p~c de la lysine
On définit le coefficient de réponse K =
surface du pic de la norleucine
surface du pic de la lysine de la solution standard
y
KI = - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - = -
f
d
.
d
1
l '
(1 ère . .
.
)
sur ace
u p~c
e
a nor euc~ne
~nJect~on

---

- Z7 -
surface du pic de la lysine de l'échantillon
. s
K
... - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
= -
Z
surface du pic de la norleucine (ZO injection)
soit
s = KZx Z
Soient ql ( ~moles), la quantité de lysine dans le standard à injection
et
qz ( ~moles), la quantité de lysine de l'échantillon injecté.
La quantité de lysine étant proportionnelle à la surface de son pic on a
KZ
xz
= - =
: : t -
y
En outre, la surface du p~c de norleucine est proportionnelle au volu-
me injecté, on a donc :
iZ
= -
et
=
Or ql = m.a, d'où
K
i
Z
Z
La quantité de lysine de l'échantillon injecté qZ( ~moles) =m·a.- .
~l
- Dosage des acides aminés totaux
Soit b (ml), le volume de récupération de l'hydrolysat de T(mg) de
farine délipidée contenant N(mg) d'azote.
La quantité de lysine Q ( ~moles) d'une farine contenant 100 mg d'azote
est :
b
100
KZ
iZ
b
100
Q = qz
- = rn-a·
v
N
KI
il
v
N
KZ
b
100
Q (~moles) = moa • _ . -
• -
• -
v
N

---

- 28 -
- Dosage des acides aminés libres
S01ent . F (g) la quantité de farine délipidée • contenant N(mg) d'azote,
utilisée
. b 1 (ml) volume total du surnageant
b2 (ml) volume de surnageant passé sur Dowex
. b3 (ml) volume de HCI (0, IN) utilisé pour la récupération des
acides aminés.
La quantité de lysine Q ( ~moles) d'une farine contenant 100 mg d'azote
est :
54. Mise en évidence de l'hydroxyproline.
Elle est réalisée par chromatographie sur couche mince selon la méthode
décrite par RANDERATH (1971). Nous avons utilisé des plaques (20 x 20 cm)
de gel de silice (KIESELGEL) fournies par la société Merck.
Nous avons analysé l'hydrolysat des protéines de pellicules ainsi que
des solutions pures de proline et d'hydroxyproline avec le mélange
éluant suivant :
Chloroforme : méthanol
Ammoniaque 17 % (2
2
1 v/v).
L'identification de ces 2 acides aminés est facilitée par le fait qu'ils
donnent une coloration jaune, en présence de la ninhydrine.
Une chromatographie bidimensionnelle est réalisée avec l'hydrolysat des
protéines de pellicules pour séparer éventuellement la proline de
l'hydroxyproline ; les mélanges éluants suivants sont utilisés

---

- 29 -
Chloroforme : méthanol
Ammoniaque 17 % (2
2
1 v/v)
Propano 1-1
: eau (22
10 v/v).
6. Analyse des protéines hydrosolubles.
61. Extraction des protéines.
611. Extraction des protéines des pâtes de moutarde.
La farine dé1ipidéeest délayée dans une solution de chlorure de sodium
(0,5M)
amenée à pH 8 avec du phosphate disodique (6 ml de solution pour
1 g de farine).
La solution d'extraction contient également du f10rure de phény1méthy1-
su1fony1e
(PMSF 1mM) qui inhibe le développement bactérien. La
suspension est placée à 4°C pendant 24 à 48 heures, puis centrifugée
à 27 000 g, à 4°C pendant 45 minutes dans une centrifugeuse "Sorvall
Superspeed Re - 2". Le surnageant contenant les protéines est soit
utilisé rapidement, soit lyophilisé.
622. Extraction des protéines des graines, des amandes et
des pellicules.
La farine en suspension dans la solution de chlorure de sodium ( 6m1
pour 1 g de farine) est traitée, après refroidissement dans un bain de
glace, aux ultrasons dont l'action destructrice sur les membranes est
liée à la libération importante d'énergie mécanique consécutive aux
phénomènes de cavitation. Nous avons utilisé le modèle "B-12 Sonifier
Ce11 disruptor" de la compagnie "Branson Sonie Power".
La suspension est traitée trois fois aux ultrasons à la puissance de
75 W pendant 3 minutes. Le reste de l'extraction -se déroule comme dans
le paragraphe précédent.
62. Purification des protéines.
Les protéines sont précipitées en ajoutant du sulfate d'ammonium à rai-
son de 0,7 g par ml de surnageant. Après trois jours à 4°C, le précipité
est isolé par centrifugation à 800 g pendant la minutes. Les protéines

---

- 30 -
sont reprises dans la solution de chlorure de sodium, puis dialysées
à 4°C dans la même solution et enfin lyophilisées.
Les membranes de dialyse sont péalablement traitées par trempage pour
éliminer la glycérine, les composés sulfurés et les métaux lourds. Les
membranes sont, d'abord, placées 10 minutes, dans une solution bouil-
lante de carbonate d'ammonium 5 %. Après plusieurs lavages à l'eau
distillée, elles sor~t chauffées 10 minutes dans une solution d'acide
éthylènediaminotétraacétique
(EDTA 10mM). L'EDTA, fixe par chélation,
les métaux lourds. Les membranes sont, enfin, rincées à l'eau distil-
lée jusqu'à disparition complète de l'absorption à 260 nm due à la
présence d'EDTA.
63. Electrophorèse.
Nous avons utilisé un protocole mis au point pendant notre mémoire
d'ingénieur (DI~1 1981, GRUENWEDEL et DIAHAM 1982). L'électrophorèse
est réalisée à l'aide d~ l'appareil 21 17 ~ultiphor LKB.
Une teneur élevée d'urée (5M) dans le gel de polyacrylamide inhibe la
prot~olyse. Elle permet, aussi, une bonne dissociation des protéines
végétales qui ont tendance à s'agglomérer.
631. Préparation des solutions
· Solution A
Acrylamide 5,63M
N,N'-méthylène-bis-acrylamide 17,3mM dans l'eau
distillée.
· Solution B
N,N,N',N'-tétraméthyléthylène diamine (TEMED) O,I7M
acide acétique
7,52M dans l'eau distillée.
· Solution C
peroxydisulfate d'ammonium 5,87mM et urée 8M dans l'eau distillée.
La solution C est préparée extemporanément.
· Solution "cuves électrophorèse". (Acide acétique O,9M)
· Solution de coloration
Solution aqueuse contenant: Ig de bleu de coomassie, 110g d'acide

---

- 31 -
trichloracétique, 40g d'acide sulfosalicyliqoe et 330ml de méthanol
par litre de solution •
• Solution de décoloration
250ml d'éthanol, 84ml d'acide acétique et on complète à un litre
avec de l'eau distillée.
632. Protocole.
Le gel est obtenu en mélangeant 7,5 ml de solution B, 15 ml de solu-
tion A et 37,5 ml de solution C.
Après la polymérisation qui dure 6 heures, le gel est placé sur la
plaque de refroidissement et relié aux solutions des cuves par du
papier Whatman nO 1.
On réalise, ensuite, une préélectrophorèse (100 V pendant 2 heures),
2
pour substituer les ions (S20~-, TEMED + .•. ) du gel aux ions (CH COO
3
et H+) de la solution acétique.
On dépose envir0n 160 ~g de protéines dans des puits ou sur des languet-
tes de papier, situés à 2 cm du bord du gel, du côté de l'anode.
Après l'électrophorèse (220 V pendant 3 h 30), le gel est plongé 8 heu-
res dans la solution de coloration.
Le bleu de coomassie, colorant anionique, réagit avec les protéi~~s
qui précipitent soùs l'action de l'acide trichloracétique. L'excès de
colorant est éliminé par trempages successifs dans des solutions de
décoloration.
Cette opération dure 2 jours. L'intensité des bandes est déterminée,
à l'aide d'un densitomètre, à 575 nm, la longueur d'onde correspon-
dant au maximun d'absorption du bleu de coomassie.
7. Activité de la myrosinase.
L'action de la myrosinase peut être détectée par la mise en évidence
de la disparition du substrat, ou de l'apparition d'un des produits
de la réaction enzymatique.
SCHWIMMER (1961), HENDERSON et MC EWEN (1972), ont étudié l'hydrolyse
de la sinigrine, en se fondant sur la différence d'absorption à 227,5 nm
entre l'allylthioglucoside et l'allylisothiocyanate (à concentrations

---

- 32 -
équimolaires, l'absorption de l'allylsénévol représente 8,2 % de celle
de la sinigrine).
MAC GIBBON et ALLISON (1970) ont mis en évidence l'action de la myrosi-
nase en ajoutant du chlorure de baryum (BaC1 ) qui donne, en présence
2
du sulfate acide de pa.tas-sium (KHS0 ), un composé blanc de sulfate de
4
baryum (BaS0 ) insoluble dans l'eau.
4
D'autres méthodes sont fondées sur la libération du glucose. Elles
mettent en jeu une séquence réactionnelle ayant pour premier substrat
le glucose [BJORKMAN et JANSON (1972) ; VAUGHAN et al. (1968) ;
PIHAKASKI et PIHAKASKI (1978) J
71. Extraction de la myrosinase.
Elle est effectuée selon la méthode de TSURUO et al. (1967).
Les farines délipidées sont délayées dans une solution de chlorure de
sodium (O,SM) contenant du 2-mercaptoéthanol O,OlM. Les protéines sont
extraites par précipitation fractionnée (la myrosinase précipite entre
50 et 70 % de saturation en sulfate d'ammonium), à pH 7.
Les précipités sont isolés par centrifugation à 4°C, à 800 g pendant
10 minutes.
La fraction contenant l'enzyme est reprise dans la solution d'extraction
puis dialysée dans la même solution. La myrosinase, ainsi purifiée,
est stable pendant plusieurs mois à + 5°C.
Les protéines sont dosées selon la méthode de LOWRY modifiée par
SCHACTERLE et POLLACK (1973).
72. Mise en évidence qualitative de la myrosinase.
721. Diffusion dans un gel d'agarose.
L'apparition du glucose est décelée par la formation d'un composé bleu,
produit final de 1a séquence réactionnelle suivante
Glucose
glucose oxydase
GI
l
+ 02
•
ucono actone + H 0
2 2
Péroxydase
-_.....:..-...... Composé bleu

---

- 33 -
7211. Solutions.
1
• Tampon citrate pH 6,2
Solution de myrosinase
40 mg/l dans le tampon citrate
Solution de sinigrine
10 mg/ml dans le tampon citrate
Solution de détection du glucose
a-toluidine
6 mg
Glucose oxydase
1,25 mg
Péroxydase
0,80 mg
Tampon citrate
qsp 5 ml.
7212. Protocole.
L'agarose (0,5g) est délayé dans 100 ml de tampon citrate. La suspens~on
est portée à ébullition jusqu'à obtention d'une solution homogène trans-
lucide. 12 ml de la solution refroidie à 60°C, sont étalés sur une
plaque de verre (84 x 96 mm).
Après formation du gel, on confectionne des sytèmes de puits à l'aide
d'un emporte-pièce LKB de 20 ~l de capacité. Chaque système est cons-
titué d'un puits central et de 6 puits périphériques situés à égale
distance sur un cercle de 2 cm de diamètre. Le puits central reçoit
20 ~l de la solution de détection de glucose et les puits périphéri-
ques le mélange de 10 ~l de solution de sinigrine et 10 ~l de solution
de myrosinase.
Si cette dernière est active, le glucose libéré migre à la rencontre
du complexe enzymatique de détection. La migration du glucose dans le
gel est controlée par un système témoin où les puits périphériques re-
çoivent 20 ~l de la solution de glucose.
722. Méthodede MAC GIBBON et d'ALLISON.
7221. Solutions.
· Solution A'
Acrylamide 3,66M, Bisacrylamide Il,2mM dans l'eau distillée.
· Solution B'
TEMED 0,1 M
acide acétique 7,52 M dans l'eau distillée.

---

- 34 -
• Solution C'
Péroxydisulfate d'ammonium 3,52 mM
urée 4,8 M dans l'eau distillée.
On prépare un gel à 6 % de polyacrylamide en mélangeant les solutions
A', B' et C' dans les proportions 2 : l : 5
• Solution de révélation pH 4,5
BaC1
: 10mg/ml
sinigrine 5mg/ml
acide ascorbique 3mM
acide
2
acétique lM.
7222. Protocole.
Les conditions de migration ,sont analogues à celles utilisées avec le
gel à 10 % de polyacrylamide : préélectrophorèse à 100 V pendant
2 heures suivie d'une électrophorèse à 200 V pendant également
2 heures.
Le gel, plongé dans le révélateur, est incubé 12 heures à 37°C. Si la
myrosinase est active, il se forme des bandes blanches de BaS0 .
4
Pour identifier les bandes ayant une activité myrosinase, les fractions
de quelques échantillons sont colorées au bleu de coomassie.
723. Méthode d'impression de VAUGHAN.
La méthode est fondée sur la détection du composé bleu, produit de la
réaction de l'eau oxygénée avec l'o-toluidine.
La technique d'impression consiste à mettre en contact avec le gel,
un papier préalablement imbibé de solution de sinigrine. Après un temps
suffisant pour permettre l'apparition et la diffusion du glucose vers
le papier
ce dernier est imprégné de solution contenant la glucose
oxydase, la péroxydase et l'o-toluidine.
Après incubation, on observe des taches bleues aux endroits où avait
diffusé le glucose.
7231. Solutions.
Tampon citrate pH 6,2
Solution de sinigrine 1 % dans le tampon citrate

---

- 35 -
• Solution de révélation
Glucose oxydase 7,5 Ul/ml
Péroxydase 2,5 Ur/ml
o-toluidine 1 mg/ml
dans le tampon.
7232. Protocole
Sur un gel à 10 % de polyacrylamide,ayant servi au fractionnement des
protéines, on dépose un papier Whatman 3 MM, préalablement, imbibé de
solution de sinigrine. Après 20 minutes à température ambiante, le
papier est retiré et placé sur une plaque de verre. On y pulvérise
la solution de révélation.
73. Détermination quantitative de l~activité de la myrosinase.
731. Méthode da SCHWIMMER.
7311. Solutions.
· Tampon phospate pH 5,70
Na HP0
,12H 0: 4mM , acide citrique:2mM dans l'eau distillée.
2
4
2
• Solution de sinigrine 100mg/1 dans le tampon
· Solution de myrosinase 50 mg/l dans le tampon.
Ces solutions sont filtrées sur papier-filtre.
7312. Protocole.
Les trois solutions sont chauffées à 40°C. A l'instant t=O, on mélan-
ge la solution de sinigrine et la solution de myrosinase dans les
proportions 1 : 1.
Au bout de 60 minutes à 40°C, le mélange et le tampon sont placés
5 minutes dans un bain glacé. La densité optique du mélange est mesurée
contre la solution tampon à 227,5 nm.

---

- 36 -
732. Dosage du glucose.
La méthode est inspirée de celle de PIHAKASKI et PIHAKASKI (1978).
Elle est fondée sur lJ dégradation du glucose par l'hexokinase.
Hexokinase
Glucose + ATP
~
Glucose - 6 - phosphate + ADP
+
G-6-P
Glucose - 6 - Phosphate + NADP
•
Gluconate - 6 - phos-
déshydrogénase
+
phate + NADPH + H
La quantité de glucose est déterminée par la mesure de l'absorption
de NADPH à 340 nm.
7321. Solutions.
· Tampon citrate pH 5,5
Solution de sinigrine 15 mg/ml dans le tampon
· Solution de myrosinase 5 mg/ml dans le tampon
Solution de glucose 7 mg/ml dans le tampon
• Kit Boehringer
Solution (1)
NADP : 64mg ; ATP : 160mg ; MgS0
et stabilisateur;
4
dans 27 ml d'eau distillée.
Solution (2)
0,7 ml de suspension enzymatique contenant 200 ur
d'hexokinase et 100 U de glucose-6-déshydrogénase.
·7322. Protocole.
L'hydrolyse de la sinigrine est obtenue en incubant 60 minutes à 40°C,
le mélange suivant :
0,2 ml de tampon, Iml de solution de sinigrine et 0,8 ml de solution
de myrosinase.
Deux témoins contenant d'uné part, 1 ml de tampon et l ml de solution
de sinigrine et, d'autre part, 1 ml de tampon et 1 ml de solution de
glucose sont traités dans les mêmes conditions.
Le dosage du glucose se fait comme suit
dans deux cuves de quartz on
met :

---

- 37 -
Blanc
Echantillon
Solution (1)
1 ml
1 ml
Solution à doser
-
0,1 ml
Eau distillée
2 ml
1,9 ml
Les mélanges sont agités et la densité optique de l'êchantillon est
mesurée à 340 nm, puis on ajoute la solution (2)
Solution (2)
0,02 ml
0,02 ml
On agite et on laisse reposer 10 minutes
ensuite la densité optique
de l'échantillon est lue à 340nm, toutes les 30 secondes jusqu'à ce
qu'elle soit constante pendant 5 minutes.

---

RESULTATS ET DISCUSSION

---

- 38 -
1 - Efficacité de la dépelliculation
La dépelliculation permet de séparer les parties anatomiques de la
graine et donc de faciliter leur étude.
Nous nous sommes demandés si ce procédé est utilisable dans la techno-
logie de la moutarde. Cela aurait comme avantage d'éliminer le tami-
sage de la pâte acide (la durée de vie des tamis métalliques inoxydables
utilisés est de dix jours), et de limiter les phénomènes d'oxydation
en diminuant le temps de contact de la pâte avec l'oxygène.
Ce procédé permettrait de valoriser les pellicules dont la teneur en
sel ajouté au cours de la fabrication,
limitait l'utilisation en
agriculture.
11. Teneur azotée des parties anatomiques de la graine.
Les teneurs en eau et en azote des échantillons "graines entières~,
"amandes grosses", "amandes fines" et "pellicules" ont été déterminées
trois fois. Les valeurs moyennes sont indiquées dans le tableau 3.

---

- 39 -
Tableau 3
Teneur azotée des parties anatomiques de la graine
Graine/;
Amandes
Amandes
Pellicules
enti~res
grosses
fines
Mati~re siche en (g)
pour 100 g de mati~re fraîche
91,9
93
93,8
83,5
Pour 100 g de
Quantiti! ~
mati~re fraîche
3,94
4,20
4,40
1,98
d'lizote
en (g)
Pour \\00 g de
mati~re s~che
4,29
4,52
4,69
2,37
Pour 100 g de
Quantité de
mati~re fraîche
24,62
26,25
27,50
12,38
protéines brutes
Pour 100 g de
(N • 6,25)en (g)
matière sèche
26,79
- 28,20
29,32
14,83
Tableau 4
Teneur azotée des parties anatomiques de la graine selon
la littérature
,
1
1 Graines
1
Amandes
i
Pellicules
enti~res !
1
Quantité de protéines brutes (en g)
!
pour 100 g de mati~re
24 à 25
-
-
1
d'après FINLAYSON (1976)
1
!
Quantité de protéines brutes (en g)
1
1
pour 100 g de matière
27,5
30,8
14,7
d'après VANGHEESDAELE ( 1980)
1

---

- 40 -
Les résultats obtenus pour les graines entières confirment ceux de
FINLAYSON (1976), mais sont inférieurs à ceux de VANGHEESDAELE et
FOURNIER (1980). Ces derniers auteurs attribuent cette différence aux
modalités de minéralisation. La sinigrine, composé azoté, se dégrade,
en effet, en substances volatiles qui peuvent être perdues en début
de minéralisation.
12. Teneurs en eau et en protéines des amandes pures.
VANGHEESDAELE et FOURNIER (1980) indiquent que les graines entières de
Brassica juncea sont constituées de 80 % d'amandes et 20 % de pellicu-
les.
121. Teneur en eau des amandes.
Soient h , h
, h , les teneurs en eau respectives des graines entières,
g
p
a
des pellicules et des amandes (h
= 8,1 %, h
= 16,5 %), on peut
g
p
écrire :
20 . h
+ 80 . h
p
a
h
=
g
100
on obtient donc h
= 6 %
a
122. Teneur en protéines des amandes.
De même on a
20 . x
+ 80 . x
p
a
x
=- - - - - - - - -
g
100
x , x , x
étant les teneurs en protéines des graines entières, des
g
p
a
pellicules et des amandes (x = 24,62 %, x
12,38 %)
g
p
De l'équation précédente, on tire x
= 27,68 %
a
Les teneurs en eau et en protéines des amandes pures sont respectivement
6 % et 27, 68 %.

---

- 41 -
13. Teneur en pellicules des échantillons "d'amandes".
soient 1, le pourcentage de pellicules, h la teneur en eau et x la te-
neur en protéines de l'échantillon.
Soient h
et x
les teneurs en eau et en protéines des amandes pures
a
a
(h
= 6 %, x
= 27,68 i.)
a
a
Soient h
= 16,5 i. et x = 12,38 i., les teneurs en eau et en protéines
p
p
des pellicules.
On peut écrire les équations ~uivantes
l
• h
+ (100-1). h
h =
P
a
(1)
100
l
.
x
+ (100-1) • x
x =
p~
--,a
....
(2)
100
131. Teneur en pellicules des "amandes grosses"
h = 7 i., x = 26,25 %
On tire de l'é~uation (1) l = 9,5 i. et de l'équation (2) 9,4 i.,
soit une moyenne l = 9,4 i.
132. Teneur en pellicules des "amandes fines"
h = 6,2 % et x = 27,50 %
Les valeurs de l déterminées à partir des équations (1) et (2) sont
respectivement 1,9 i. et 1,2 i. soit une moyenne de 1,5 i..
Les pellicules représentent 9,4 i. et 1,5 i. respectivement dans les
échantillons "d'amandes grosses" et "d'amandes fines".

---

- 42 -
14. Utilisation de la dépelliculation dans la technologie de la
moutarde.
Nous voulons préparer 100 g de pâte
de moutarde avec x (g) d'''amandes
fines" et y (g) d "' amandes grosses".
La quantité de matières sèches doit être supérieure à 28g
93,8
93
x •
+ y • -
~ 28; soi t 1,0 1 x + y ~ 30, 11
100
100
De plus la teneur en sons doit être inférieure à 2 g
1,5
9,4
.
x •
+ y • _ L2 , soit 0,16 x + y L 21,27
100
100
Pour des raisons économiques, nous pouvons limiter la quantité de matiè-
re
sèche à 33 %
93,8
93
x
•
+ y . - - L 33 soit 1,01 x + y...::::::::'35,48
100
100
Les points de coordonnées (x,y) sont situés dans le polygone délimité
par les droites d'équation
y = 0
y = - 1,01 x + 30, Il
y = - 0,16 x + 21, 17
y = - 1,01 x + 35,48
Du point de vue de la législation, la dépelliculation est pertinente.
Il reste à vérifier si une moutarde préparée de cette façon présente
des qualités organoleptiques comparables à celles d'une moutarde tra-
ditionnelle.
Il semble toutefois, que les polyholosides des pellicules jouent un
rôle important dans la texture de la pâte finale. Ce qui constituerait
un frein à l'utilisation de la dépelliculation dans la technologie de
la moutarde.

---

- 43 -
Figure 3
Domaine d'utilisation des "amandes" dans la fabrication de
la moutarde.
(Quantités pour la confection de 100 g de pâte)
Quantité
"d'amandes
,
grosses"
(g)
,
" , ,
30
, ,
"",
" ,
"
,
" "
" ,
"
,
"
,
"
,
,
,
"
"
" ,
"
,
,
---
,
,
,
20
- - - --
,
- -".,
- y '= -0 J 16x of- 2
-
- - -
_ _ 1J 27
- -
la
la
20
30
Quantité
"d'amandes
fines"
CIIIJ Domaine d'utilisation des"amandes"
(g)

---

- 44 -
2 - Etude des protéines de Brassiaa junaea.
21. Extraction des protéines.
La quantité de protéines extraites est déterminée par le dosage de
l'azote total dans le surnageant, selon la méthode de KJELDAHL. Le
rendement d'extraction représente le pourcentage de l'azote du surna-
geant par rapport à la quantité totale d'azote contenue dans l'échan-
tillon de farine dé1ipidée utilisé pour l'extraction.
Notons, en outre, que la dé1ipidation élimine plus de 80 % ~es matières
grasses de la matière
première.
Tableau 5
Rendement d'extraction des protéines
"eraines
""-antles
"Amandes
Pâte de
,.
1
Pellicules
1
entières
gross~stt
fines"
moutarde
Concentration d'azote (mg/ml)
dans le surnageant
5,7
6,5
7,5
1,1
7
Quantité d'azote (mg)
dans le surnageant
98
109,34
129,82
13,59
100,64
Quantité d'azote (mg)
dans l'échantillon de
175,95
191,82
226,57
79,46
J 75,03
farine délipidée
Rendement de
l'extraction
55,5
57
57,3
17,1
57,5
Il est à noter que l'extraction est d'autant meilleure que la teneur
en pellicules de l'échantillon est moindre. En effet, les protéines des
téguments sont imbriquées dans la cellulose des parois cellulaires.
Le rendement d'extraction des protéines des graines entières est, avec
notre méthode, inférieur à celui mentionné par BOUQUET (1971) qui a
délayé la farine dé1ipidée dans un volume de tampon plus important.
Nous avons limité la quantité de tampon afin d'obtenir un surnageant
dont la concentration est suffisante pour permettre une dilution dans
une solution d'urée. Nous pensons que la fraction extraite est repré-
sentative des protéines solubles dans la solution saline.

---

- 45 -
Les protéines solubles dans la solution de chlorure de sodium (O,SM)
ont été partiellement identifiées par BOUQUET (1971) qui trouve un
tiers de globulines et deux tiers d'albumines (la myrosinase apparte-
nant au groupe des albumines).
Le surnageant contient, également, des composés azotés non protéiques
comme la sinigrine ou des acides nucléiques. BOUQUET trouve dans le
surnageant 85 % àe l'azote total dont 23 % d'azote non protéique.
22. Electrophorèse des protéines
analyse qualitative.
Nous avons analysé les protéines des gra~nes, des amandes et des pâtes
de moutarde par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Les meilleures
migrations sont obtenues avec le gel à la % de polyacrylamide. Les
résultats sont schématisés dans la figure 4.

---

- 46 -
Figure 4
Schéma des électrophorégrammes des protéines
de Brassica juncea
(électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10 7.
à 220 V pendant 3 h 30)
1
,
1
f
1
i
migration
l
distance de(cm)
l 0 c::::==II
===r
10 ====-
c::::::J
9 c:::J
c:::::J
c:=::=
c::::::::a
8 c:=::=
1
1
5 ~
f
78HB
1
ffiffi
~
......
6 GlIIl
~
..
5 c:c:m
a::c:c
1
\\
4 o::IIJ
ŒIID
w::::J
-
2 ~
3 ~
~
c:cz:::ccr
l a:a::D
w::::w:::D
cz:z:za
0 1
t:."=~
dépôt
C:":"-..1
C: -::1
:::..-_'"T
Graines
Il Amandes
I1Amandes
Pâte de
entières
grosses"
fines"
moutarde
Intensité de la coloration des bandes
c=::::::J
faible
~
moyenne
e:tI:I:n
forte
- :
très forte
distance après décoloration
distance de migration indiquée ~ -----------------------------
.
l l
largeur du gel après décoloration
largeur initiale du gel = Il cm

---

- 47 -
On observe, à l'oeil nu, dix bandes pour les protéines des matières
premières (graines et amandes}. Ces bandes sont numérotées dans le
sens de migration. L'intensité de la coloration est plus importante
pour la fraction 3 et plus faible pour les bandes 8 , 9 et 10.
La migration des protéines des pâtes donne un profil électrophorétique
analogue à celui des protéines des graines. On observe huit bandes dont
une (la fraction e) correspond aux fractions 5 , 6 et 7 des protéines
des graines.
23. Electrophorèse des protéines
analyse quantitative.
L'intensité des bandes est déterminée au densitomètre. Les p~cs, notam-
ment, le premier et le dernier, sont délimités par comparaison avec les
distances de migration dans le gel.
Nous n'avons pas effectué de calculs statistiques ma~s une triple dé-
termination au densitomètre des quantités relatives des différentes
fractions d'un même échantillon, indique que l'erreur dûe à la
délimitation des pics est inférieure à 1 %.
231. Electrophorèse des protéines des graines.
Les résultats sont consignés dans les figures 5 et dans le tableau 6.
Les fractions 8 ,9 et 10 ne sont pas détectées par le densitomètre en
ràison de la faiblesse de l'intensité de leur coloration.
Les fractions 3 et 4 sont les plus abondantes.
On note une évolution de l'importance relative de certaines fractions
quand on passe des graines entières aux amandes fines. Ainsi, lorsque
la teneur en pellicules de l'échantillon diminue, le pourcentage des
fractions 2 et 5 augmente tandis que celui des fractions 3 et 7 baisse.
Il apparaît, donc, que les pallicules sont plus riches en fractions
3 et 7
et plus pau~res en fractions 2 et 5 que la graine entière.

---

- 48 -
Figure 5
Electrophorèse des protéines de Brassiaa junaea
solubles dans une solution de chlorure de sodium (0,5M)
DO
l
1
1
1
Fig. 5-1
protéines des
1
0,
1
graines entières
1
1
r
J ::
1
1
J
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0, 1
1
1
1 1 1
1
: 1 :2 1 3
4 15161]1
1
1
1
1 1
1
1
5
la
distance de
migration (cm)
DO
1
f
Fig. 5-2 : protéines des
"amandes grosses"
5
la
distance de
migration (cm)
DO "
1
l
1
1
1
1
~
1
{~ 1\\:
Fig. 5-3 : protéines des
\\
a J
:
"amandes fines"
1
1
\\
'1
1
: 1
{
1
1
1
1
1
1
1
1
1 1
1
1
1
1 1
1
0, 1~
1
1
1 1 1
:1 2
3
4 15 1617
1
1
1
,
1
!
1
•
5
la
distance de migration (cm)

---

- 49 -
234. Effet de la fabrication de la pâte de moutarde sur
le profil électrophorétique.
Les protéines brutes des graines et de la pâte de moutarde sont fraction-
nées et les résultats sont enregistrés dans les courbes suivantes
(figures 6).
La fraction
f, regroupant les trois bandes ayant les mobilités élec-
trophorétiques les plus importantes, résulte
,sans doute, de
phéno-
mènes d'hydrolyse.
Cette fraction augmente au cours de la fabrication de la moutarde, ainsi
que les fractions 2 et 4 ; alors que les fractions 3 et (5 + 6 + 7)
baissent.
L'évolution de l'importance relative des fractions peut s'expliquer par
- une hydrolyse partielle de certaines fractions (3 et 5+6+7).
- une baisse de la solubilité de certaines protéines.
- une destruction des protéines.
Les deux dernières hypothèses sont corroborées par le dosage de l'azote
total dans les surnageants. En effet, pour une coloration comparable des
bandes, l'échantillon des protéines de la pâte injecté contient beau-
coup plus d'azote. Autrement dit le surnageant contenant les protéines
des graines renferme moins d'azote non protéique.
233. Evolution des protéines solubles)dans une solution
saline~de la pâte de moutarde au cours de la
conservation.
Le fractionnement, par électrophorèse des protéines des pâtes de mou-
tarde a été effectué sur gel de polyacrylamide 10 %. Les résultats sont
enregistrés dans les figures 7 et dans le tableau 7.
- Influence de la température.
Pour un temps de conservation donné, l'élévation de la température fa-
vorise l'hydrolyse des protéines qui se traduit par l'augmentation de
la fraction f. On constate, de plus, que la fraction d est inchangée,

---

- 50 -
Figure 6
Effet de la fabrication de la pâte de moutarde sur le profil
électrophorétique des protéines
DO
1
1
1
0,5
1
1
Fig. 6-1
protéines des gra~nes
1
1
entières
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1Z
3
4
15 16 (7 1
1
1
1
1
1
distance de
5
10
migration (cm)
DO
Z
Fig. 6-2
protéines de la pâte
de moutarde sans SOZ
(analyse dès réception)
f
5
10
distance de
migration (Cl'!l)

---

- 51 -
Figure 7
Evolution des protéines solubles dans une solution de NaCl (0,5M),
au cours de la conservation de la moutarde
DO
2
Fig. 7-1
protéines de
moutarde sans 802
"analyse dès récept1on"

---

- 52 -
DO
2
1
Fig. 7~3
protéines de
1
moutarde sans S02
1
1
conservée 1 mois
1
1
à 4°C
1
1
1
,
1
1
1
1
1
t
1
1
1
a1bl
1
cid
e
1
1
;
..
5
la
distance de
migration
(cm)
DO
2
t
l
Fig. 7-4
protéines de
moutarde avec S02
1
conservée 1 mois
1
à 4°C
1
1
1
1
1
1
1
1
Id
e
f
5
la
distance de
migration
(cm)

---

- 53 -
Fig. 7-5
protéines de
moutarde sans 50Z
conservée 1 mois à ZO°C
à la lumière
distance de
migration (cm)
Fig. 7-6
protéines de
moutarde avec SOZ
conservée 1 mois à ZO°C
à la lumière
b
c
~ d
e
5
la
distance de
migration (cm)

---

_ - - - - -.......
~_
.. _ ...
- 54 -
DO
2
Fig. 7-8
pvotéines de
moutarde avec sa?
conservée \\ mois-à 20°
à l'obscurité
d
e
5
\\0
distance de
migration (cm)

---

- 55 -
DO
2
Fig. 7-9
protéines de
moutarde avec 502
conservée 4 mois
à 4°C
f
5
la
distance de
migration (cm)
DO
2
Fig. 7-10
protéines de
moutarde sans 502
conservée 4 mois
à 4°C
a
e
f
5
la
distance de
migration (cm)

---

- 56 -
00
2
Fig. 7-11
protéines de
moutarde avec S02
conservée 4 mois à 20°C
à la lumière
b
1 c
d
e
f
5
ID
distance de
migration (cm)
DO
Fig. 7-12
protéines de
moutarde sans S02
conservée 4 mois à 20°C
à la lumière
0,5
e
5
ID
distance de
migration (cm)

---

- 57 -
DO
2
Fig. 7-13
protéines de
moutarde avec 502
conservée 4 mois à 20°C
à l'obscurité
c
e
5
la
distance de
mi grat ion (cm)
DO
2
+
Fig. 7-14
protéines de
moutarde sans 502
conservée 4 mois à 20°C
à l'obscurité
f
a
b
5
la
distance de
migration (cm)

---

- 58 -
Tableau 6
Pourcentage des fractions protéiques dans les parties
anatomiques de la graine.
~ Graines Amandes Amandes
Fract10ns
entières
grosses
fines
1
6,8
7, 1
7,2
2
12,7
14,4
15,2
3
25, 1
22,3
22, 1
4
17,0
16,9
16,4
5
7,4
12,6
15,8
6
14,8
14,5
14,6
7
16,2
12,2
8,7
Total
100 %
100 %
100 %

---

Tableau 7
Pourcentage des fractions protéiques au cours de la
conservation de la moutarde
---
-:_."~-";';'"'",d'.-::-;'".~-;; .;~";.;~"". ;~:,,",.: 1';'-::_::::.;~:~;:::: ~:::::::-;:;;:;".",
--~-
Moutardes con!l=l:erv~es
Moutardes conse I-V~C!j
~,:t";~:S cün~~~Vé~~
4 mois 11 20"C
4 moi" .'1 20"C
dlls r(oception
1 mois 11 4"C
~ la lumUre
,!I
l'ob"cnrl.té
4 mol" "
4"C
.'1
la
Inmlf1re
.'1 l'obscur! té
0'1
1
1
~:ec _~_o_~ san~_::2 r~-;~~~ ~~~s
~ve" ;~~ 5an:-;~~ r-/\\~~~~o~ --;~;,~~-~~--r-~~~~-;~2 1 San.. 5°2
san:_s:2
__
__
so-:l
1 Avec S021 5""" 502 1 /\\v~c 502
V)
a
6,9
7,8
8,9
q
8,9
10,3
10,2
10,2
1,8
1,5
3,7
2,5
3,6
1
3,5
b
1
21,6
20,1
22,8
21,5
18,1
22,9
36,4
311,5
41,8
44,1
41,9
42,4
42,3
42,4
c
1
17,8
17,9
16,1
16
16,3
20,8
17,5
17,3
1'j,5
15,9
16,8
16,3
15,7
15,4
d
1
20
1
20,2
18
19
20
21,5
20,6
20,3
16,0
17,6
Il,4
19,0
17,4
17,9
e
1
31,3
31,4
31,8
31,9
33,7
21,5
12,1
10,1i
12,7
12,8
12,8
10,5
9,2
8,8
f
1
2,4
1
2,6
2,4
2,6
3
3
3,2
3,1
5,2
8,0
7,4
9,3
1
Il,8
1
12,0

---

- 60 -
les fractions a, b, c augmentent aum01ns jusqu'à un m01S de conserva-
tion. On note aussi, une diminution de la fraction e. Cependant, après
4 mois, l'élévation de la température n'affecte pas la fraction c,
alors qu'elle semble entraîner une diminution de la fraction b.
On peut, donc, penser que les protéines de la fraction e s'hydrolysent
pour donner la fraction f, alors que les protéines des fractions a, b
et c
sont relativement stables. L'augmentation de ces dernières frac-
tions proviendraient de la dégradation des éléments de la fraction f,
qui se superpose à l'hydrolyse des protéines de la fraction e.
- Influence du temps de conservation.
Cette comparaison porte sur un même type de moutarde conservé dans les
mêmes conditions. Il ressort que toutes les fractions,sauf la f,dimi-
nuent après 4 mois de conservation. Les fractions a, b et c sont sta-
bles, surtout en début de conservation.
On remarque que le froid ralentit les phénomènes d'hydrolyse des pro-
téines au moins dans le premier mois de réfrigération.
- Influence de SOZ.
L'anhydride sulfureux n'a pas d'influence notable à 4°C.
A température
ambiante, SOZ réduit la quantité de la fraction e.
Cette diminution est compensée, en présence de lumière naturelle, par
l'augmentation des fractions a, b, c e~ d. Dans l'obscurité, seul le
pourcentage de la fraction b augmente. Autrement dit, en présence de
lumière, la stabilité des protéines des fractions a, b, c, d est accrue
par le SOZ.
Les pâtes de moutarde avec SOZ ont été préparées une semaine avant les
pâtes de moutarde sans §OZ. Ce qui se traduit par une différence dans
l'importance de l'hydrolyse des protéines pour les moutardes analysées
dès réception ou conservées à 4°C. Cette différence s'estompe lorsque
les produits sont placés à température ambiante.

---

- 61 -
3 - Composition en acides aminés des protéines.
31. Acides aminés totaux
Les résultats, exprimés en ~moles et en mg d'acide aminé pour 100 mg
d'azote, sont consignés dans les tableaux nO 8 à Il. Les valeurs cor-
respondent aux moyennes de 3 analyses dont les résultats sont groupés.
Au cours de l'hydrolyse, l'asparagine se tansforme en acide
asparti-
que. De même, l'acide glutamique dosé inclut la glutamine de l'échan-
tillon.
Les acides aminés les plus représentés sont toujours l'acide glutami-
que, la proline et la glycine. Il est, en outre, important du point de
vue
nutritionnel de suivre l'évolution de la teneur en lysine. L'in-
dice chimique de la lysine est 86,5 % pour les graines entières et de
87,9 % pour les pellicules.
Les acides aminés soufrés sont peu abondants (cependant, les teneurs
indiquées sont probablement sous-estimées car notre méthode d'hydro-
lyse entraîne une destruction partielle de ces acides aminés).
BOUQUET (1971) avait indiqué 8,6 % de cystéine dans un broyat de gra~­
ne de moutarde.
Une étude comparative des résultats obtenus pour les différentes par-
ties anatomiques de la graine révèle que :
- les amandes sont plus riches en acide glutamique, en leucine,
en cystéine et en méthionine; alors que la valine, la lysine et l'hy-
droxyproline sont plus abondantes dans les pellicules.
-la quantité d'acides aminés dosée est plus importante dans les
pellicules. Autrement dit, la teneur en azote non protéique est plus
élevée dans les amandes.Ce qui est en accord avec les résultats de
VANGHEESDAELE et FOURNIER (1980) qui ont trouvé nettement plus de si-
nigrine dans les amandes que dans les pellicules.

---

- 62 -
Tableau 8
Composition en acides aminés (AA) des graines entières
1
Acides
Quantité en ~moles
Pourcentage
Quantité en mg
Pourcent.age
d'AA pour 100 mg
"molaire"
d'AA pour 100 mg
"massique"
Aminés
d'N
des AA
d'N
des AA
ASP
285
7,6
37,9
7,7
HYPRO
9
0,2
1,2
0,2
THR
262
7
31,2
6,4
SER
166
4,4
17,4
3,6
GLU
432
11,5
63,6
13
PRO
416
Il , 1
47,9
9,8
GLY
410
10,9
30,8
6,3
ALA
238
6,4
21,2
4,3
VAL
167
4,5
19,6
4
CYS
66
1,8
15,9
3,3
MET
47
1,3
7
1,4
ILE
247
6,6
1
32,4
6,6
LEU
245
6,5
32,1
6,6
1
TYR
114
3
20,7
4,2
1
PRE
129
3,5
1
21,3
4,4
1
1
ORN
9
0,2
1,5
0,3
i
1
LYS
229
6, 1
41,8
8,5
1
HIS
124
3,3
19,2
3,9
1
1
ARG
153
4,1
26,7
5,5
1
,
i
---~
Total
3748
100 %
489,4
100 %
i

---

- 63 -
/1
Tableau 9
Composition dn acides aminés (AA) des"amandes grosses
Acides
Quantité en ~moles
Pourcentage
Quantité en mg
Pourcentage
d'AA pour 100 mg
"molaire"
d'AA pour 100 mg
"massique"
Aminés
d'N
des AA
d'N
des AA
1
ASP
237
7,2
31,5
7,3
HYPRO
5
0, 1
0,7
0,2
THR
161
4,9
19,2
4,4
SER
157
4,8
16,5
3,8
GLU
488
14,8
71 ,8
16,5
PRO
300
9, 1
34,5
7,9
GLY
321
9,8
24,1
5,5
1
1
1
ALA
227
6,9
20,2
4,7
1
VAL
150
4,6
17,6
4, 1
CYS
73
2,2
17,5
4
1
MET
59
1,8
8,8
2
1
ILE
245
7,4
32, 1
7,4
1
;
LEU
250
7,6
32,8
7,6
1
TYR
95
2,9
17,2
4
1
PRE
104
3,2
17,2
4
1
ORN
12
0,4
2
0,5
1
1
LYS
165
5
30,1
6,9
1
HIS
81
2,5
12,6
2,9
1
1
ARG
157
4,8
27,3
6,3
Total
3287
100 %
433,7
100
i
%

---

- 64 -
Tableau la
Composition en acides aminés (AA) des "amandes fines"
Acides
Quantité en ~moles
Pourcentage
Quantité en mg
Pourcentage
d'AA pour 100 mg
"molaire"
d'AA pour 100 mg
"cassique"
Aminés
d'N
des AA
d'N
des AA
ASP
228
6,8
30,3
6,8
HYPRO
2
0,1
0,3
0,1
THR
161
4,8
19,2
4,3
SER
154
4,6
16,2
3,6
GLU
513
15,3
75,5
16,8
1
PRO
283
8,5
32,9
7,3
1
GLY
318
9,5
23,9
5,3
1
ALA
232
6,9
20,7
4,6
VAL
131
3,9
15,3
3,4
CYS
115
3,4
27,6
6,2
1
1
MET
83
2,5
12,4
2,8
1
ILE
243
7,2
31,9
7,1
1
1
i
LEU
310
9,2
40,7
9, 1
i
TYR
1
85
2,5
15,4
3,4
1
PHE
104
3, 1
17,2
3,8
ORN
12
0,4
2
0,4
LYS
163
4,8
29,8
6,7
HIS
71
2, 1
11
2,5
ARG
148
4,4
25,8
5,8
1
, Total
3359
100 %
448,1
100 %
i
1

---

- 65 -
Tableau Il
Composition en acides aminés (AA) des pellicules
Acides
Quaatité en ~moles
Pourcentage
Quantité en mg
Pourcentage
d'AA pour 100 mg
"molaire"
d'AA pour 100 mg
"massique"
Aminés
d'N
des AA
d'N
des AA
ASP
307
7,4
40,9
7,6
HYPRO
83
2
10,9
2
THR
275
6,6
32,8
6, 1
SER
254
6, 1
26,7
5
GLU
400
9,6
58,9
11
PRO
440
10,6
50,7
9,5
GLY
447
10,8
33,6
6,3
ALA
243
5,8
21,6
4
VAL
314
7,5
36,'8
6,9
CYS
50
1,2
i2
2,2
MET
34
0,8
5, 1
0,9
ILE
248
6
32,5
6,1
LEU
242
5,8
31,7
5,9
1
1
TYR
136
3,3
24,6
4,6
!
PHE
136
3,3
22,5
4,2
ORN
9
0,2
1,5
0,3
LYS
256
6,2
46,8
8,7
HIS
125
3
19,4
3,6
1
ARG
157
3,8
27,3
5, 1
Total
4156
100 %
536,3
100 '"10

---

- 66 -
- la quantité totale des acides aminés des graines entières est
comparable à celle trouvée par BOUQUET (1971), soit 3726 rmoles pour
100 mg d'azote. Cependant les pourcentages de certains acides aminés,
comme l'acide glutamique et la proline, sont assez différents. BOUQUET
rapporte 19 % d'acide glutamique et 6,4 % de proline ; alors que nous
avons obtenu pour ces acides aminés
respectivement Il,5 % et Il,1 %.
La différence provient, sans doute, des variétés de Brassica juncea
utilisées.
32. Cas de l'hydroxyproline.
321. Mise en évidence de l'hydroxyproline
Elle est effectuée par chromatographie sur couches minces de gel de
silice. La proline et l'hydroxyproline produisent, en présence de la
ninhydrine, un pigment jaune ; ce qui permet de distinguer nettement
les taches qui leur correspondent et que nous avons identifiées sur les
chromatogrammes.
3211. Chromatographie unidimensionnelle.
On observe pour l'hydrolysat des pellicules (figure 8-1) une seule
grosse tache jaune située sur la zone de Rf comprise~
entre 0,55 et
0,67. Lorsqu'on compare avec les taches correspondant aux solutions
pures de proline et d'hydroxyproline, la présence de ce dernier acide
aminé dans l'hydrolysat de pellicules est démontrée de manière
évidente.
3212. Chromatographie bidimensionnelle.
Une double migration d'une injection d'hydrolysat provoque le dédou-
blement de la tache jaune (figure 8-2). Les pellicules contiennnent de
la proline et de l'hydroxyproline qui sont identifiées par comparai-
son avec les Rf des substances étalons chromatographiées dans les
mêmes conditions (RANDERATH - 1971).

---

- 67 -
Figure 8
Mise en évidence de l'hydroxyproline par chromatographie sur
couche mince
10 cm
CHC1
- MeOH - NH
17% (2
2
1 v/v)
3
3
~-....-"
t.----7-
~
ligne de
"
dépot
•
-
1
, - '
.. - '
solution
hydrolysat
solution
de Hypro
de pellicules
de Pro
Fig. 8.1
Chromatographie unidimensionnelle
10 cm
CHCI
- MeOH - NH
17% (2 / 2 :1 v/v)
3
3
Hypro
Pro
2: Phénol
- eau (75
25 g/ g)
dépat
#
. .
1
\\
Hydrolysat\\~' de pellicules
Fig. 8.2 : Chromatoçr~nhip hi~imQ"~;n""Qllo

---

- 68 -
La détermination des Rf donne les valeurs suivantes
Distance de migration de la substance
Rf = distance de migration du front
Tableau 12 : Rf de la proline et de l'hydroxyproline dans la chroma-
tographie bidimensionnelle
Hydroxyproline
Proline
Première migration
0,52
0,46
Deuxième migration
0,38
0,45
322. Teneurs en hydroxyproline des parties anatomiques
de la graine
Tableau 13 : Teneurs en hydroxyproline des parties anatomiques de la
graine
Graines
"Amandes
"Amandes
Pellicules
1
entières
grosses"
fines"
Quantité d'Hypro ( mg)
10 900
1 200
700
300
nour 100 g d'azote
Quantité d 'Hypro (mg)
pour 100 g de
216
47
29
13
matières premières
Ces valeurs sont obtenues à partir des résultats du triple dosage des
acides aminés à l'autoanalyseur Technicon et de la détermination de
la quantité d'azote de ces différents échantillons.

---

- 69 -
Si l'on tient compte du fait que la graine entière contient 20 % de
pellicules et 80 % d'amande, on détermine que les téguments renferment
91 % de l'hydroxypro1ine de la graine.
Cet acide aminé peut être considéré, pratiquement comme "un marqueur"
des sons dans la pâte.
Légalement, la moutarde doit contenir moins de 2 % de sons. La teneur
en hydroxypro1ine doit être inférieure à 4,3 mg pour 100 g de pâte
de moutarde.
Des protéines caractérisées par une forte teneur en hydroxypro1ine
sont liées aux parois cellulaires des végétaux (LAMPORT, 1970;
CLELAND, 1971).
DARIMONT et al.
(1973) affirment que, parmi les enzymes constitutives
des parois cellulaires, seule la péroxydase paraît susceptible de con-
tenir l'hydroxypro1ine.
ROTSTEIN (1982) a observé une activité péroxydasique insoluble dans
les graines de moutarde. On peut donc penser que les pellicules con-
tiennent une partie de la péroxydase.
Ceci plaide en faveur d'une dépe11icu1ation des graines en début de
fabrication de la moutarde; cela d'autant plus que BONALY (1983) in-
dique que les polyholosides de la pâte de moutarde provenant des pel-
licules sont très peu nombreux.
323. Dosage de l' hydroxyproline de la pâte de moutarde.
3231. Méthode de MOORE et STEIN.
C'est la méthode que nous avons utilisée dans le cadre de notre travail.
Cependant, elle a des limites dans le cas du dosage de l'hydroxypro1ine
en milieu industriel. D'une part, elle demande un investissement trop
lourd pour la cadence des analyses nécessaires. D'autre part, elle n'est
pas spécifique. D'où la difficulté de doser l'hydroxypro1ine dans la
pâte de moutarde dont la teneur relative dans la composition en acides
aminés est faible.

---

- 70 -
3232. Méthode de BERGMAN et LOXHEY (1963).
Cette méthode présente l'avantage d'être moins on~reuse et plus spé-
cifique que la précédente. Elle est fondée sur l'oxydation de l'hydro-
xyproline en un composé proche du pyrole, suivie d'une condensation
avec le p-diméthylaminobenzaldéhyde qui donne une coloration rouge.
Solutions
• Solution tampon acétate-citrate pH 6,0.
• 57 g Sodium acétate (CH COONa . 3H 0)
3
2
• 37,5 g Sodium citrate (C H Na 0
. 2H 0)
6 5
3 7
2
· 5,5 g Acide citrique (C H 0
. H 0)
6 8 7
2
• 385 ml Isopropanol
· On complète à 1000 ml avec de l'eau distillée.
Solution oxydante mère.
Chloramine T (Sel sodique de p- toluène sulfon-
Chloramide) 7 % (p/v) dans de l'eau distillée.
Cette solution est active pendant plusieurs se-
maines mais préparée journellement.
· Solution oxydante prête à l'emploi.
Mélange de 1 volume de solution oxydante mère
et 4 volumes de solution tampon acétate-citrate.
· Solution d'Isopropanol.
· Solutions HCl 6N et 0,001 N.
Solution mère de réactif d'Ehrlich.
On dissout 2 g de p-Diméthylamino-benzaldéhyde
dans 3 ml d'acide perchlorique 60 %
Cette solution est stable dans une bouteille
opaque pendant plusieurs sema~n6S

---

-
71 -
• Solution standard d'hydroxyproline.
Solution à 400 ppm dans une solution de HCl
0,001 M pour minimiser le développement
bactérien.
Cette solution est diluée au dixième avant le
dosage.
Protocole.
Les protéines sont hydrolysées en présence de HCl 6 N, à 110°C pen-
dant 24 heures (40 mg de farine délipidée dans 6 ml de HCl SN).
L'hy-
drolysat est évaporé sous vide puis récupéré dans 2 ml de solution
HCl 0,001 ~.
Le développement de la couleur rouge se fait dans des tubes à essai.
1
Echantillon i
Gamme étalon
à analyser 1:
numéro des
0
1
2
3
4
5·
-6
tubes
1
1
Volume de solution
1
1
diluée d'hydroxy-
a
0,25
0,50
0,75
1
-
proline (ml)
Volume d'eau
1
distillée
1
0,75
0,50
0,25
-
-
(ml)
1
Volume de solution
-
-
-
-
-
1
à analys er (ml)
Chaque tube reçoit, ensuite, 2 ml de solution d'isopropanol et 1 ml de
solution oxydante. Après agitation, on laisse les mélanges reposer
pendant 4 minutes. Puis on ajoute 13 ml de réactif d'Ehrlich et les tu-
bes sont placés pendant 25 mo, dans un bain-marie chauffé à 60 Q C. Ils
sont refroidis pendant 2 à 3 minutes sous un robinet d'eau froide. Le
contenu des tubes est ramené à 50 ml avec de l'isopropanol. L'absorp-
tion est lue à 558 nm dans les 4 heures.

---

- 72 -
33. Acides aminés libres.
Des échantillons de pâtes de moutarde sont prélevés, au cours du pro-
cessus de fabrication et analysés une semaine après leur prélèvement.
Les valeurs obtenues et consignées dans les tableaux 14, 15 et 16 sont
celles d'une farine déli~idée contenant 1 g d'azote et les moyennes
de deux analyses.
L'examen de ces résultats nous inspire plusieurs observations
- les acides aminés libres représentent un faible pourcentage
des acides aminés totaux (1 %).
- Cependant, le broyat contient 9 fois plus d'acides aminés
libres que les graines entières analysées par BOUQUET (1971). Les ré-
sultats sont de 438,6 ~moles contre 50,8 ~moles pour une farine conte-
Ilant 1 g d'azote. Le broyage des graines de moutarde dans le verjus
provoque une hydrolyse des protéines assez importante quand on sait
que les acides aminés dosés par BOUQUET sont extraits à l'eau bouil-
lante.
Les acides aminés les plus représentés sont l'acide glumatique,
l'acide aspartique, l'asparagine et la cystéine (l'abondance de ces
acides aminés dans la graine et le caractère hydrophile et leurs chaî-
nes latérales favorisant leur solubilisation) ; les acides aminés
à chaînes latérales hydrophobes, notamment la proline, la valine et
l'isoleucine,sont
par contre, peu représentés.
- La teneur en cystéine du broyat semble confirmer le résultat
de BOUQUET (1971) et corrobore la destructian partielle des acides
aminés soufrés lors du desage des acides aminés totaux.
- On constate une baisse de l'importance relative de certains
acides aminés (acide glutamique, cystéine et méthionine), au cours de
la fabrication de la moutarde. En fait, on distingue, d'une part, le
broyat contenant les pellicules et d'autre part, les pâtes tamisées.
Cette différence est imputable à l'hydrolyse des protéines des pellicu-
les pendant le séjour d'une semaine dans ce milieu acide.

---

- 73 -
Tableau 14
Compostion en acides aminés (AA) libres du broyat
Acides
Quantité en ~moles
Pourcentage
Quantié en U':~
Pourcentage
d'AA pour 1 g
"molaireIl
d'AA pour 1 g
1
"massique"
Aminés
d'N
des AA
d'N
des AA
ASP
68
15,5
9, 1
14, 1
1
HYPRO
3,6
0,8
0,5
1
0,8
THR
Il ,9
2,7
1,4
2,2
SER
15
3,4
1,6
2,5
ASN
36, 1
8,2
5,4
8,4
1
GLU
108,9
24,8
16
24,9
PRO
4
0,9
0,5
0,8
GLY
13,4
3, 1
1
1,6
ALA
28,8
6,6
2,6
4
1
VAL
4,2
1
0,5
0,8
CYS
31,7
7,2
7,6
Il,8
1
MET
12,4
2,8
1,9
3
1
1
ILE
5,7
1,3
0,7
1, 1
1
LEU
24,8
5,7
3,3
5, 1
1
1
,
TYR
9,2
2,1
1,7
2,6
1
1
PHE
9,6
2,2
1,6
2,5
!
ORN
9,4
2, 1
1,6
2,5
LYS
Il,9
2,7
2,2
3,4
HIS
8,2
1,9
1,3
2
ARG
21,8
5
3,8
5,9
Total
438,6
100 %
64,3
100 %

---

- 74 -
Tableau 15
Composition en acides aminés (AA) libres de la pâte
après tamisage
Acides
Quantité en ~moles
Pourcentage
Quantité en mg
Pourcentage
d'AA pour 1 g
"molaire"
d'AA pour 1 g
"massique"
Aminés
d'N
des AA
d'N
des AA
ASP
58,2
15,5
7,7
14,3
HYPRO
3
0,8
0,4
0,7
THR
7,6
2
0,9
1,7
SER
12,5
3,3
1,3
2,4
ASN
38,5
10,3
5,9
Il
GLU
107
28,5
15,7
29,2
PRO
3,7
1
0,4
0,7
GLY
12,4
3,3
0,9
1,7
ALA
28,5
7,6
2,5 .
4,7
VAL
3,6
1
0,4
0,7
1
CYS
19,7
5,2
4,7
8,8
1
MET
6,6
1,8
1
1,9
1
ILE
5,4
1,4
0,7
1,3
LEU
15,5
4, 1
2
3,7
TYR
5,7
1,5
1
1,9
PRE
Il, 7
3, 1
1,9
3,5
ORN
4
1, 1
0,7
1,3
LYS
9,7
2,6
1,8
3,4
HIS
4,5
1,2
0,7
1,3
ARG
17,6
4,7
3, 1
5,8
j
Total
375,4
100 %
53,7
100 %

---

- 75 -
Tableau 16
Composition en acides aminés CAA) libres de la pâte de
moutarde
Acides
Quantité en ~moles
Pourcentage
Quantité en mg
Pourcentage
d'AA pour 1 g
"molaire"
d'AA pour 1 g
"massique"
Aminés
d'N
des AA
d'N
des AA
ASP
54
15,4
7,2
14,3
HYPRO
2,5
0,7
0,3
0,6
THR
6,6
1,9
0,8
1,6
SER
10,4
3
1, 1
2,2
ASN
36,5
10,4
5,5
10,9
GLU
106
30,2
15,6
31, 1
PRO
3,5
1
0,4
0,8
GLY
Il,8
3,3
0,9
1,8
ALA
25
7, 1
2,2
4,4
VAL
4,2
1,2
0,5
1
CYS
14,6
4,2
3,5
6,9
1
MET
4,8
1,4
0,7
1,4
!
-
1
ILE
3,5
1,6
0,7
1,4
1
LEU
10,5
3
1,4
2,8
1
TYR
5,5
1,6
1
2
1
PHE
12,5
3,5
2, 1
4,2
ORN
3,8
1, 1
0,6
1,2
1
LYS
9,7
2,8
1,8
3,6
1
HIS
4,8
1,4
0,7
1,4
1
1
ARG
18,4
5,2
3,2
6,4
1
Total
350,6
100 %
50,2
100 %

---

- 76 -
34. Evolution de la teneur en lysine libre au cours de la conser-
vation de la pâte.
Tableau 17
Teneur en lysine libre des pâtes au cours de la conservation
Analyse
Conservation à 20°C
Conservation à 4°C
à la lumière
dis
,
Echantillons
réception
1 mois
4 mois
1 mois
4 mois
avec sans
avec
avec sans
avec sans avec sans
sansl
S02
S02
S02
S02
S02
S02
S02
S02
S02
S02
Quantité de
lysine ( moles)
40,7 31,3
43,1 33,5 52,4 42,0
97,4 42,0 126,6,115,6
pour 1 g d'azote
1
i!
1
Î
1
Quantité de
i
i
i
1
1
lysine (mg) pour
7,4:
5,7
7,9
6, 1
9,6
7,7
17,8
7,7 23,1;21,1
1
j
1 g d'azote
!
1
i
1
1
!
1
1
Les teneurs de lysine libre de la moutarde (échantillon "analyse dès
réception") sont plus élevées que celles de la moutarde du tableau 16,
après une période de conservation comparable.
Les différences proviendraient des conditions de traitement ou des va-
riétés de Brassiaa junaea utilisées.
Les résultats nous inspirent plusieurs observations
- la libération de la lysine s'aècro1t avec le temps de conser-
vation.
- la température de conservation joue un rôle important. La te-
neur en lysine libre augmente faiblement à 4°C et fortement à tempéra-
ture ambiante.
- l'effet de la présence de l'anhydride sulfureux est indécelable
à 4°C alors qu'il est très net en début de conservation à température
ambiante.

---

-
77 -
En conclusion t nous pouvons dire que la teneur en lysine libre dépend
de la vitesse d'hydrolyse des protéines et de la disparition momentanée
ou définitive de la lysine consécutive à la participation de cet acide
aminé aux phénomènes de brunissement non enzymatique.
Ce type de brunissement provient de la condensation entre les composés
carbonylés (sucres réducteurs ••• ) et les acides aminés ou les protéines
ayant un groupement
€'-aminé
de la lysine. Cette condensation aboutit
à la formation de cétosamines ou aldosamines. Ces derniers composés
peuvent se transformer en'polymères bruns par la dégradation de Strecker
qui libère du gaz carbonique et de l'ammoniac. Ils peuvent t aussi t don-
ner t par énolisations successives et en restituant l'acide aminé t des
composés dicarbonylés qui sont de puissants facteurs de brunissement.
Il se passetdonc t une période dite "d'induction" entre le début de la
condensation et l'apparition des composés bruns.
Les conditions de pH de la moutarde et l'élévation de la température
de conservation accroissent la vitesse d'hydrolyse des protéines et
donc la teneur en lysine libre. Mais, en même tempst elles catalysent
les réactions du brunissement non enzymatique.
L'anhydride sulfureuxt en réagissant avec les sucres réducteurs, retar-
de la condensation de Maillard t comme l'indique les teneurs en lysine
libre des échantillons conservés un mois à température ambiante. La
duréede l'efficacité de S02 est inférieure à 4 mois, durée au bout de
laquelle, l'augmentation de la teneur en lysine libre est identique
dans les échantillons avec et sans anhydride sulfureux.
Il faut noter que 502 réagit avec les composés dicarbonylés pour donner
des acides sulfoniques stables. Il inhibe t de ce fait, l'apparition des
composés bruns.

---

-
78 -
4 - Etude de la myrosinase.
41. Analyse qualitative de la myrosinase.
411. Détection du glucose sur gel d'agarose.
Le test est positif lorsqu'on met dans les trous périphériques une so-
lution de protéines brutes ou de myrosinase de graines de Brassiaa
junaea ou de Sinapis aZba. Il est à noter que la couleur bleue de la
ceinture qui se forme autour du trou central vire rapidement vers le brun
indiquant un excès de glucose par conséquent d'eau oxygénée par rapport
à la péroxydase.
Le test est négatif si l'on utilise les protéines brutes des pâtes de
moutarde.
412. Détection du glucose après électrophorèse.
Cette méthode met en évidence l'activité de la myrosinase des graines
mais ne permet pas la localisation de la ou des fractions possédant
cette activité. En effet, il n'a pas été possible de contrôler l'atmos-
phère au-dessus de la feuille de papier où s'effectue l'oxydation de
l'a-toluidine par la péroxydase. Ainsi la coloration bleue migre vers
les bords du papier lorsque celui-ci se dessèche.
Nous n'avons pas observé de tache bleue avec les myrosinases des pâtes
de moutarde.
413. Détection du sulfate acide par le chlorure de baryum.
Cette méthode n'est pas plus satisfaisante que la précédente. En effet,
le pourcentage de polyacrylamide du gel utilisé ne permet pas une bon-
ne séparation des fractions protéiques. On observe, sur la zone de mi-
,.
gration des protéines des graines, des dépots de sulfate de baryum.
414. Localisation de la myrosinase.
La myrosinase est localisée par comparaison des migrations des protéines
brutes et des myrosinases purifiées. Il apparaît hautement probable
que la fraction b possède une activité thioglucosidasique.

---

- 79 -
42. Détermination quantitative de l'activité de la myrosinase.
421. Méthode de SCHWIMMER.
4211. Calcul des coefficients d'extinction molaire.
Les longueurs d'onde d'absorption maximale de la sinigrine et l'isothio- ~
cyanate d'allyle sont comprises respectivement entre 227 et 228 nm et
entre 242 et 243 nm.
Les coefficients d'extinction molaire sont déterminés selon la loi de
BEER-LAMBERT:
DO = E l.c
où DO est la densité optique de la solution
E
coefficient d'extinction molaire de la substance
1
largeur de la cuve (1 = 1 cm)
c
concentration molaire àe la solution
Tableau 18
Coefficients d'extinction molaire de la sinigrine et de
l'allylisothiocyanate à 227,5 nm
Sinigrine
Allylisothiocyanate
r
E
7360
520
1
.
-1
-1
1
1 mole
cm
-1
-1
E.
(1 mole
cm)
d'après SCHWIMMER
7800
564
(1961 )
-1
-1
E
(1 mole
cm
)
d'après HEN~ERSON
6900
565
et EWEN
(1972)
:
Ces résultats sont obtenus à partir des figures 9 , 10 et 11.
4212. Calcul des activités spécifiques.
L'activité spécifique de la myrosinase est la quantité de sinigrine
dégradée par unité de masse d'enzyme et par minute.

---

- 80 -
Figure 9
Spectre de la sinigrine
(solution de sinigrine à 128,81 ~moles
par litre dans l'eau)
DO
0,9
0,5
Solution de sinigrine
Eau
° 200
220
227,8
240
260
longueur
d'onde (nm)
À
= 227.8
DO = 0,945
-1
-1
E:
= 7340
l.mole
• cm

---

- 81 -
Figure 10
Spectre de la sinigrine
(solution de sinigrine à 133,34 jJ moles
par litre dans du tampon phosphate-acide
citrique pH 5,69)
DO
0,9
f
~
0,5
sinigrine
°
on
200
220
240
280
longueur
d'onde (nro)
,\\
228 nm
DO = 0,984
-1
-1
E:
= 7380
l.mole
. cm

---

- 82 -
Figure Il
Spectre de l'isothiocyanate d'allyle
(solution d'isothiocyanate 2 mM dans le
tampon citrate pH 5,40)
DO
1,6
0,4
Isothiocyanate
Tampon
200
250
300
240
longueur
d'onde (nm)
-1
À max = 242,5nm
E:
= 710 lmole- I cm
-1
À max = 228
nm
E:
= 520 Imole- I cm

---

- 83 -
Les
cinétiques enzymatiques des myros~nases des graines de Sinapis
alba et de Brassica juncea sont enregistrées dans les figures 12 t 13
et 14.
La constatation de SCHWIMMER (1961~ à savoir que la dégradation de la
sinigrine se fait de façon linéaire en début d'hydrolyse, est vérifiée.
Les activités spécifiques sont déterminées au niveau des portions droi-
tes des courbes soit :
- entre 1 et 15 mn pour la myrosinase de Sinapis alba
et entre 2 et 60 mn pour la myrosinase de Brassica juncea
Tableau 19
Activités spécifiques des myrosinases des graines de
Brassica junaea et de Sinapis aZba.
Myrosinase de
Myrosinase de
Sinapis alba
Brassica juncea
Activité spécifique
-3
° t 15
4
).lmoles sJinigrine
t 8 • 10_3
+
°t 002
+ °t021O
mn . mg de myrosinase
-
-
Activité spécifique
59 t 6
1t 92
).lg sinigrine
+
°t 9
+
Ot 09
mn . mg de myrosinase
-
-
Dans les conditions de notre expérience t la myrosinase de Binapis alba
est 30 fois plus active que celle de Brassica juncea. De plus, ANDRE
et DUROU-CARBOUERES (1957)indiquentque les graines de Sinapis alba ne
contiennent pas de désulfurase des
sénévols. L'utilisation de la myro-
sinase de Sinapis alba dans la fabrication de la moutarde peut favori-
ser à double titre t le développement de l'arôme.
Notons que cette utilisation est interdite dans la confection de la
moutarde de Dijon.
En outre t dans le même ordre d'idées t l'utilisation de myrosinase de
microorganismes est envisageable après des travaux préliminaires de
sélection.
En effet, la littérature disponible sur ce sujet fait état de l'hété-
rogénéité de ces myrosinases. Si l'action S-thioglucosidasique est
identique pour toutes ces enzymes, leurs comportements vis-à-vis de
certains ions sont tout à fait différents. De plus t REESE et al (1958)
notent que la sinigrinase d'Aspergillus sidowi hydrolyse t outre les

---

Figure 12
Cinétique de la myrosinase de Sinapis aZba à 40°C
(solution : myrosinase
12,2 mg/l
sinigrine
132,84 ~moles/l
dans tampon phosphate - acide citrique pH 5;70)
DO
0,7 1\\,,
\\,,,
\\,,
-<t"
co
l \\\\,
0,5
\\,
\\
\\,,,\\
\\
~-;-I__----t--_------+
t
1
0, 1
5
10 _
15
20
30
40
60
Temps (mn)

---

- 85 -
Figure 13
Cinétique de la myrosinase de Sinapis aZba à 40°C
(solution
myrosinase
19,2 mg/l
s~n~grine
128,94 ~moles/l
dans tampon phosphate - acide citrique pH 5,70)
DO
0,7
0,5
0, 1
2
3
5
10
Temps (mn)

---

Figure 14
cinétique
de la myrosinase de Brassica juncea à 40°C
(solution
myrosinase
42.7 mg/l
sinigrine
132.08 ~moles/l
dans tampon phosphate - acide citrique pH 5.70)
DO
0.8
--..-- .,.
+
+-
--~
\\0
00
0.5
0.1
2
5
10
15
20
30
Temps (mn)

---

- 87 -
e-glucosides testés, le maltose, l'amidon et le saccharose. Ce qui pour-
rait avoir une incidence sur la texture de la pâte. S'agit-il d'un pro-
blème de purification de la solution enzymatique ?
L'expérimentation apportera la réponse.
4213 Evolution de l'activité enzymatique de la myrosi-
nase des pâtes de moutarde au cours de la
conservation.
Les activités spécifiques des myrosinases sont déterminées après incu-
bation à 40°C pendant 30 minutes.
Tableau 20 : Act~vités spécifiques de myrosinases des pâtes de moutarde
au cours de la conservation.
Analyse dès
Conservation
Conservation à
Conservation à
ZO°C. 1 mois
ZO"C. 1 .,i,
réception
1 mois à 4°C
à l'obscurité
à "la 1UIIIi~n
Sans
Avec
Sans
Avec
Sans
Avec
Sans
A"c
80
SOZ
S02
S02
SOZ
S02
89
Z
8°2
2
Activité spécifique! 9,3
(.
10 3 'umoles ~inigrine)
1.7
0.9
1• 1
a,6
a,9
a.3
l, a
a.4
, mn • mg myrosln4se
I-------------\\---+-----t----t----- --- -
Activité spécifique! a,l
IJ g sinigrine
)
a.7
a.4
a.4
a,2
a,3
0.1
0,4
a,2
( mn • mg myrosinase
L'activité spécifique de la myrosinase de la pâte de moutarde baisse
considérablement au cours de la conservation. La dégradation de l'en-
zyme est beaucoup plus rapide dans les premiers jours qui suivent la
IPréparat~on de la moutarde. En une sema~ne l'act~v~té spéc~f~que ba~sse
[de plus de 65 %.
ILes activités enzymatiques des myrosinases des moutardes contenant
l'anhydride sulfureux sont plus faibles. Le délai, d'une semaine, qui
1"séPare les dates de préparation des deux types de moutarde ne suffit
pas à expliquer ces différences.

---

- 88 -
4214. Influence de l'acide ascorbique.
L'acide ascorbique stimule la myrosinase. C'est la ra1son pour laquelle
nous l'avons utilisé pour accroître l'activité des thioglucosides gluco-
hydrolases des pâtes de moutarde. Ces essais sont effectués à 40°C et
à 50°C.
Le spectre de l'acide ascorbique(fig. 15)montre que l'acide absorbe à
,
,
227,5 nm. La figure 16 indique que l'ascorbate se dégrade considérable-
ment à 266 nm, et de façon non négligeable à 227,5 nm dans les condi-
tions de conservation à température ambiante et en présence de la
lumière.
La figure 17 montre que l'acide ascorbique se dégrade à 40°C de façon
identique dans le tampon et dans la solution enzymatique. En présence
de sinigrine, cette dégradation est atténuée et cela d'autant plus que
la teneur en thioglucosiàe est grande. Nous observons que la courbe
représentant la moyenne des densités optiques de la solution de sini-
gr1ne et de la solution enzymatique coïncide pratiquement avec la cour-
be du mélange. Autrement dit, l'action de l'acide ascorbique sur la
myrosinase des pâtes de moutarde est imperceptible. Elle est également,
indécelable à 50°C où la dégradation de l'ascorbate est encore plus
importante.
422. Méthode du dosage du glucose.
A la longueur d'onde d'absorption maximale de NADPH (340 nm), les solu-
tions de sinigrine, d'enzyme et d'isothiocyanate d'allyle n'absorbent
pratiquement pas; comme l'indiquent les spectres de ces solutions.
Voir figures Il, 18, 19 et 20.
Les activités spécifiques des myrosinases sont déterminées après incu-
bation,à 40°C pendant 30 minutes, d'une solution de sinigrine et d'en-
zymes de concentrations respectives de 20~moles/ml et 2 mg/ml environ.

---

- 89 -
Figure 15
Spectre de l'acide ascorbique
(solution d'acide ascorbique à 20 mg/l
dans le tampon phosphate - acide citrique pH 5,70
conservée 30 mn à 20°C à la lumière)
DO
1,6
0,6
0,2
200
228
266
320
longueur d'onde (nm)
À
""
266 nm
DO = 1,75
À =
228 nm
DO :: 0,23

---

- 90 -
Figure 16
Dégradation de l'acide ascorbique
(solution d'acide ascorbique à 20 mg/l
dans tampon phosphate - acide citrique pH 5,70
conservée à 20°C à la lumière)
00
1,8 .... .... .... ....
1,5
0,5
... ...............~___,
""'""'\\~--
_...:2:2:7:.:,5:....:n:m:..
-...
0, 1
100
200
300
Temps (mn)

---

- 91 -
Figure 17
Effet de l'acide ascorbique
à 50°C sur la myrosinase
de la pâte de moutarde avec S02
conservée 1 mois à 4°C
DO
1,3
~_.-..-
3
...
~ ..
--
4
- ...- ... ----_L __
-- ----- .....
5
0,5
0, 1
5
15
30
60
120
Temps (mn)
DO déterminée à 227,5 nm contre de l'eau distillée
1 : Tampon pH 5,65
(acide ascorbique 0,375 mM + tampon phosphate - acide
citrique)
2
Enzyme "moutarde avec S02 conservée 1 mois à 4°C"
(solution enzyme 120,96 mg/l dans le tampon)
3
Sirigrine
(solution de sinigrine 126,20
moles/l dans le tampon)
4
Mélange
1 volume de solution d'enzyme + 1 volume de
solution de sinigrine
5
Courbe en pointillé : moyenne des DO des solutions
initiales d'enzyme et de sinigrine

---

- 92 -
Figure 18
Spectre de la sinigrine
(solution de sinigrine à 127,18
moles/l
dans tampon citrate - acide citrique pH 5,38)
DO
0,2
solution de sinigrine
tampon
o
200
225
250
300
325
350
Longueur
d'onde (nm)

---

- 93 -
Figure 19
Spectre des protéines brutes
(solution de protéines de moutarde avec SOZ
"analyse dès réception" à lZI,lmg/l dans
tampon citrate - acide citrique pH 5,38)
DO
0,6
solution de protéines
0,1
tampon
zoo
Z50
300
350
longueur
d'onde (nm)

---

- 94 -
Figure 20
Spectre des protéines brutes
(solution de protéines de moutarde sans S02
"analyse dès réception" à 122,28mg/l dans
tampon citrate - acide citrique pH 5,38)
DO
Solution de protéines
Tampon
200
250
300
longueur
d'onde (nm)

---

- 95 -
Les résultats sont consignés dans le tableau suivant
Tableau 21
Activités spécifiques de diverses myrosinases.
.
Myrosinase ~e
Myrosinase de
Myrosinase de
graines de
graines de
pâte de moutarde
Brassiaa junaea
Sinapis aZba
conservée 4 mois
Activité spécifique
10-4
en Jjmoles de s inigrine
0,010
0,391
inférieure à
par mn et par m~
0,014
0,398
inférieure à 10-4
d'e~zyme (! 10- )
Activité spécifique
en ~g de sinigrine
3,97
155,4
inférieure à 0,05
par mn et par mg
5,46
158,3
inférieure à 0,05
d'enzyme (! 0,05)
Ces résultats sont supérieurs à ceux trouvés par la méthode spectropho-
tométrique. Les teneurs en myrosinases utilisées t plus importantes
dans la deuxième méthode expliquent ce phénomène.
La dégradation de la myrosinase des pâtes de moutarde au cours de la
conservation se confirme.

---

CONCLUSION

---

- 96 -
La graine de Brassiaa junaea contient 80 Ïo d'amandes et ZO Ïo de pel-
licules dont les teneurs azotées sont respectivement 4,43 % et Z,37 Ïo
de la matière sèche.
Les protéines solubles dans une solution de chlorure de sodium (0,5M)
représentant plus de 75 % des protéines totales ont été partiellement
identifiées par BOUQUET (1971). Elles sont formées d'un tiers de glo-
bulines et de deux tiers d'albumines.
Le fractionnement dans un gel à 10 % de polyacrylamide donne dix frac-
tions dont l'identification n'a pas été effectuée. Les 3 fractions
ayant migré, le plus rapidement correspondent, sans doute, à des pro-
duits d'hydrolyse partielle. Ces dernières fractions sont peu abondan-
tes dans les protéines des matières premières biologiques. La compa-
raison des électrophorégrammes des protéines des parties anatomiques
de la graine indique que les amandes sont plus riches en fractions Z
et 5 et plus pauvres en fractions 3 et 7.
La fabrication de la moutarde entraîne une hydrolyse partielle plus
ou moins importante des protéines. Ceci se traduit par l'augmentation
des 3 fractions les plus mobiles. Elle entraîne, également, une désa-
mination des protéines et probablement une diminution de la solubilité
de certaines fractions.
L'électrophorèse des protéines des pâtes de moutarde montre que l'hy-
drolyse des protéines augmente avec la température et le temps de
conservation.
L'effet de SOZ n'est pas significatif à 4°C; par contre à températu-
re ambiante et à la lumière, SOZ semble accroître la stabilité des
quatre fractions les moins mobiles.
Le dosage des acides aminés totaux montre que
les amandes contiennent davantage d'azote non protéique.
- les acides aminés les plus représentés dans les parties ana-

---

- 97 -
tomiques de la graine sont l' acide glutamique, la proline et la gly-
cine.
- les amandes sont plus riches en acide glutamique, en leucine,
alors que la valine, la lysine et l'hydroxyproline sont plus abondantes
dans les pellicules.
- l'hydroxyproline peut être considérée comme un "marqueur" des
pellicules.
Une méthode de dosage de routine de cet acide aminé a été proposée.
De plus, nous avons remarqué que l'hydroxyproline est concentrée sur-
tout dans les téguments. Il découle, de ces observations, que la pré-
sence d'activité péroxydasique est hautement probable dans les pellicules
de Brassiaa junaea. L'élimination des pellicules avant le broyage peut
donc limiter les phénomènes d'oxydation enzymatique, mais elle peut,
également, simplifier le procédé de fabrication en supprimant le ta-
misage.
Ainsi, nous avons vérifié par le calcul que la dépelliculation peut
permettre l'obtention d'une moutarde répondant aux recommandations
réglementaires. Néanmoins, des études, complémentaires sont nécessai-
res pour s'assurer que la dépelliculation n'élimine pas des facteurs
~ndispensables aux qualités organoleptiques de la pâte.
Les acides aminés libres sont un indicateur de l'hydrolyse des protéi-
nes. Ils peuvent intervenir dans des processus qui dégradent les
propriétés organoleptiques de la pâte (ainsi, la lysine peut participer
au brunissement non enzymatique qui aboutit à l'apparition de pigments
bruns).
L'analyse des acides aminés libres au cours de la fabrication de la
moutarde montre que :
- les acides aminés libres représentent un faible pourcentage
des acides totaux (1 %)
- une hydrolyse partielle mais rapide des protéines au contact
du verjus. Les acides aminés, à chatne latérale hydrophile sont les
plus représentés (acide glutamique, asparagine, cystéine, etc ••. ).

---

- 98 -
L'analyse de l'évolution de la lysine libre, au cours de la conserva-
tion, montre que cet acide aminé participe effectivement dans les
phénomènes de brunissement non enzymatique. Ce brunissement semble
faible à 4°C et s'accroît avec la température et le temps de conserva-
tion.
L'action de 802 est peu importante à 4°C alors qu'elle est considéra-
ble à température ambiante; comme on pouvait s'y attendre.
La myrosinase a fait l'objet d'investigations. L'électrophorèse d'une
solution purifiée de myrosinase et des protéines de graines solubles
dans la solution saline, rend hautement probable la présence de l'en-
zyme dans la fraction 2. Cependant, cette présence n'a pas pu être
confirmée par les méthodes de détection de l'activité de l'enzyme.
L'analyse quantitative de l'activité de la myrosinase montre que celle-
ci baisse rapidement, dans les premiers jours après la fabrication de
la moutarde. Cette baisse semble plus importante dans les moutardes
contenant 802'
L'anhydride sulfureux aurait une action sur la myrosi-
nase. 802 réagit, à pH acide, sur les ponts disulfures ou sur les
groupements sulfhydryles (DUPUY, 1959). Il peut, donc réagir sur le
site actif de la myrosinase qui possède 4 groupements sulfhydryles.
L'action de 802 sur une solution purifiée de myrosinase pourrait faire
l'objet de travaux futurs.
On observe que la myrosinase de Sinapis alba est 40 fois plus active
que celle de Brassiaa junaea. La graine de Sinapis alba ne contenant
,pas de désulfurase des sénévols, l'introduction de la myrosinase de
Sinapis alba dans la fabrication de la moutarde paraît intéressante
pour l'industrie, mais ceci nécessiterait une modification de la
réglementation en vigueur pour la moutarde de Dijon.
De même, l'utilisation de myrosinases de microorganismes est envisa-
geable après des travaux préliminaires de sélection.
L'addition de myrosinases exogènes purifiées permettrait de supprimer
802 dans la fabrication de la moutarde. Il serait, en effet possible
d'éviter le bruniseement enzymatique, en dénaturant au préalable les
enzymes des graines de Brassiaa junaea par un traitement thermique.

---

BIBLIOGRAPHIE

---

- 99 -
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RESUME
Les protéines de B~assica juncea, extraites à lra~de d'une solution de
chlorure de sodium (OtS M) ont été fractionnées par électrophorèse sur
gel de polyacrylamide à 10 %.
L'étude des protéines de graines et de différentes pâtes de moutarde
(avec et sans S02)' à mis en évidence une hydrolyse partielle de ces
protéines au cours de la fabrication et de la conservation de la mou-
tarde.
Ces phénomènes d'hydrolyse s'accentuent avec la température et le temps
de conservation de la pâte. A température ambiante et à la lumière,la
présence de S02 semble accroître la stabilité des fractions les moins
mobiles.
Le dosage des acides aminés totaux montre que 91 % de l'hrdroxyproline
de la graine provient des téguments.
Cet acide aminé peut donc être considéré comme un "marque'lr" de sons
de la moutarde. Un dosage de routine de l'hydroxyproline l été proposé .
.......
L'analyse de l'évolution de la lysine libre au cours de la conservation
de la pâte indique que cet acide aminé participe aux phénomènes de
•
brunissement non enzymatiques.
La présence de S02 retarde, toutefois, le brunissement. L'effieacité
de S02 dure entre let 4 mois.
L'activité de la myrosinase a été étudiée. Il apparaît que:
- cette activité enzymatique baisse rapidement au cours de la
conservation de la pâte.
- 802 diminue l'activité de la myrosinase de B~assica Juncea
- la rnyrosinase de Sinapis aZba est 30-40 fois plus active que
celle de B~assica juncea.
MOTS CLES : B~assica juncea - graines de moutarde - pâte de moutarde
fabrication - conservation - dépelliculation - acides aminés
protéines - hydroxyproline - myrosinase - électrophorèse sur gel de
polyacrylamide.

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