THÈSE DE DOCTORAT
présentée
A L'UNIVERSITÉ PARIS VII
par
Marne Diabou GAYE SEYE
Spécialité: CHIMI~~..--_"..,....~,......-,, ~
_
CONSEIL AFRICA\\I~ET MALGACHE 1
• 1
; POUR L'ENSEIGNEMENT SUPER1EUrl !
C. A. M. E. S. -
OUAGADOUGC·
Arrivée . 0 ~..JU1N.1995
.
Sujet de la thèse:
, Enre;ptJ~ sous nO~. 0 .Q ·3 .3 .,. .
'
Soutenue le 29 Juin 1989 devant le Jury composé de :
MM.
P.C. LACAZE
Président
J.J.
AARON
G.
DODIN
J.P.
DOUCET
Examinateurs
B.
VALEUR

---

A me.-6 PMe.n:t.6, l bILalUma GAYE u.
Sopru.e.
NVIAYE, pOUIL ~OU6 vo~ ~a~6~ee.-6
Khaiyl
Me.-6 Ne.ve.u.x u. N~èee.-6

---

Ce :tJr..a.vaJ.1. a été e6 6ectué à. l' l YL6.tU.u.t de Topof..ogie et de Vyl1a.1lt-i..que
de6 SY.6t.ème6 (HOVYS) M.6oué au C.N.R.S., de l'U.u.veJL6Ué PalLi6 1, !.lOU.6
la V-iAection du PJto6eo.6ewt J.J. AARON. Je pJto6ile de c.et.t.e Oc.c.a.6Mn pou.Jt
fuJ.. expJti.meJt ma .6-tnc.èJte Jtec.onna..i..Manc.e pou.Jt .6on enc.a.dJtement., .6a bienvUi..-
lanc.e, pou.Jt le !.lujet qu'il m'a pJtopo.6é et l'int.éJtê.t. qu'U y a poJtt.é.
C'eut. pou.Jt moi li oc.c.a.6ion d' e.xpJt.UneJt au.6!.li me.6 JtemeJtuemen.t..6 et ma
vive Jtec.onn.ai:.6.6anc.e à. MOMiewt le PJt06e.6.6ewt P.C. LACAZE de l'U.u.veMUé
Pa.JL..L6 1, qu.-i.. a bien voulu. m'ac.c.u.Ui..UJt da.n..6 .6on laboJttU:o-iAe. Je le JtemeJt-
ue également de l' honneu.Jt qu' U m'a 6aU en M.6uJta.nt. la PJté..6-i..denc.e du.
Ju.Jty.
Que Me.6!.lie.uJL6 lM PJt06M.6e.uJ!-6 G. VOVIN, J.P. VOUCET de l'U.u.veMUé
PalLi6 1 et B. VALEUR du. C.N.A.M. t.Jtouvent. i u le t.émoignage de ma plLo6onde
gJta.t..Uu.de et me.6 .6inc.èlte.6 JtemeJLuement.!.l pou.Jt avo-iA ac.c.ept.é de palttiupeJt
à. c.e Ju.Jty.
Je ûen!.l au.6.6i à. JtemeJtueJt MM.6ie.uJL6 M. VELAMAR et. M. LEC LERC, pOM
.ta.. Jt~a.ü.on de.6 .6pecbLe.6 ESCA et. pou.Jt t.oute leu.Jt fupo.u.bdilé.
Ma Jtec.onn.a-W!.lanc.e va également. à. t.OU.6 leo membJte.6 du LaboJta.t.o-iAe avec.
leoquw j' cU.. :tJr..a.vaJ:.Ué pendant. pf..U.6ieu.Jtl.l année.6 daYl1l une atmo.6phèJte ..tJtè.6
a.m.-i.c.ale et. qu.-i. m'ont. toujOUJt.6 e.xpJt-i..mé leu.Jtl.l enc.ouJta.gemeJ'l.t.!.l et. lewt .6ympath-i..e.
En6ùl., je r'lemeJtue vivement. Meo dame.6 B. VETRY, J. GUIL LAUME et. C. RAMBAUV ,
a..tn6-t que Mon!.lieu.Jt M. SIMON, pou.Jt la pJté!.lenta.ûon ma.-téJt-i..eUe de c.e :tJr..a.vaJ.1..

---

SOMMAIRE
RE50HE.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
INTRODUCTION
1
CHAPITRE l
: ETUDE DES PROPRIETES DE LUMINESCENCE DES PURINES
ET PYRIMIDINES
1. BII...AN ACTUEL
.
4
1. - Propriétés des états électroniques excités
.
4
a) Transitions électroniques . . . . . . • . . . . . • . . . . . . . . . . . . . .
4
h) Rendements quantiques de luminescence
.
5
c) Durées de vie de fluorescence et de phosphorescence.
5
2.
-
Effet de structure sur la luminescence
.
6
3.
-
Effet de solvant
.
8
4.
-
Ef f et du p H . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
8
5. -
Extinction ("quenching") de la luminescence
.
11
II. ETUDE EXPERTIKKNTALE
.
12
1.
-
Pradu i t s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
2.
- Appareillage
.
12
3.
- Moments dipolaires à l'état fondamental
.
14
4.
-
Principe de la méthode solvatochromique
.
14
5.
- Moments dipolaires théoriques
.
15
III. RESULTATS EXPERIMENTAUX
.
19
1. -
19
19
25
2.
25
3.
-
29
29
cité
.
32
34
CHAPITRE II
I. PRINCIPE DES METHODES DE LUMINESCENCE
45
1.
-
Aspect t h é o r i q u e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
45
2.
-
Principe de la phosphorimétrie
48
a) Phosphorescence à basse température (LTP)
49
b) Phosphorescence à température ambiante (RTP)
49
c) Phosphorescence synchrone...........................
50
II. ETUDE EXPERIMENTALE........................................
51
1.
- P r o d u i t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
51
2.
-
Instrumentation........................................
52
3.
-
P r o c é d u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
52

---

III. RESULTATS.................................................
54
1. - Spectres de phosphorescence des purines et pyrimidines.
54
2. - Effet d'atome l o u r d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
59
3.
- Effet de s u b s t r a t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
66
4.
- Analyse de la surface des substrats par spectrométrie
photoélectronique X (XPS)
72
5.
-
Effet du p H . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
79
a) Propriétés s p e c t r a l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
79
b) Effet du pH sur l'intensité de phosphorescence
79
6. -
Performances analytiques
86
7. - Analyse de purines et de pyrimidines dans les mélanges
de produits pharmaceutiques............................
90
CHAPITRE III
:
ETUDE ANALYTIQUE DE MELANGES DE PURINES ET
PYRIMIDINES PAR SPECTROMETRIE DERIVEE
1. P R I N C I P E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
102
1. - G é n é r a l i t é s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
102
2.
- Procédures.............................................
104
3. -
Identification des mélanges . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
104
4. - Applications
106
II.
PARTIE EXPERIMENTALE ••....••.•••••••••.••••••••••••.••••.••
106
1.
- P r o d u i t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
106
2.
-
Ins trumen ta tion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
107
3. - Procédure d'informatisation
107
III. RESULTATS EXPERIMENTAUX •••••••••••••••••••••••••••••••••••
109
1. - Spectre d'absorption UV, d'ordre zéro, un et deux de
purines, pyrimidines et de leurs mélanges binaires . . . . .
109
2. -
Identification de mélanges de purines et pyrimidines
par les spectres d'ordre deux
116
3. - Application des spectres de dérivée première et seconde
à l'analyse quantitative . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . • . • . . . . . . .
116
4.
-
Identification assistée par microordinateur de mélanges
binaires. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
121
a) Application du programme DESPI-1 : reconnaissance de
mélanges binaires connus
123
b) Application du programme DESPI-2 à l'identification
de mélanges b i n a i r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
123
c) Application du programme DESPI-3 à l'identification
de mélanges b i n a i r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
128
CONCLUSION. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
132
BIBLlOORAPHIE. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
134

---

RESUME
On
a étudié certaines propriétés physico-chimiques dans
l'état excité singulet (moments dipolaires) et spectroscopiques
(phosphorescence et spectres UV dérivés) d'une série de purines
et pyrimidines d'intérêt biomédical.
On
a déterminé
par la
méthode
solvatochromique,
les
moments dipolaires de ces composés dans l'état excité singulet.
La plupart
des pyrimidines
sont
plus
polaires
dans
l'état
excité que
dans l'état
fondamental, tandis
que
les
purines
présentent un
comportement inverse.
Il existe
un bon
accord
entre les
valeurs expérimentales
et théoriques
(méthode PPP)
des moments dipolaires de ces composés.
On a appliqué la phosphorescence à température ambiante (RTP
et RTP
synchrone), à
l'analyse
de
purines
et
pyrimidines.
L'intensité de
phosphorescence (I p )
peut
être
optimisée
en
faisant varier les paramètres suivants :
* Atome lourd : Ip(Tl+»Ip(Pb2+)~Ip(I-»>Ip(Sm3+)
* Substrat: I p (papier filtre W-40»Ip(A~3)~Ip(5~,O~)
* pH : Ip(pH=13»Ip(pH=7)~Ip(pH~4)
Les limites de détection très basses (de ~OO pg à 38 ng)
et les
coefficients de
corrélation des courbes de calibration
proches
de
l'unité
témoignent
de
la
précision
et
de
la
sensibilité de la RTP.
On
a analysé
des mélanges
bi.naires de
purines et
de
pyrimidines à
l'aide d'une
méthode spectrométrique UV dérivée
assistée sur
micro-ordin ateur. Les
spectres dérivés
d'ordre
deux permettent
d'identifier sans
équivoque les composants de
ces mélanges et de les quantifier dans certains cas.

---

INTRODUCTION

---

- 1 -
INTRODUCTION
Les purines et les pyrimidines constituent des familles
de composés
qui présentent
une grande
importance biologique,
pharmaceutique et
médicale. Ainsi,
l'adénine, la
guanine, la
thYmine, la
cytosine et l'uracil jouent un rôle essentiel dans
le contrôle
des processus génétiques, du fait de leur aptitude
à stabiliser
la struture
hélicoïdale
des
acides
nucléiques
(ARN, ADN).
Par ailleurs,
la caféine
est largement
utilisée
dans l'industrie des boissons et en pharmacie; la théophylline
permet
de
traiter
l'asthme
et
certaines
maladies
cardiovasculaires,
et
les
barbituriques
sont
appliqués
au
contrôle d'affections neurologiques.
Les propriétés
physico-chimiques des états excités des
purines et
des pyrimidines
suscitent aussi beaucoup d'intérêt
en raison de leur importance biologique et de leur intervention
dans les
processus photophysiques et photochimiques des acides
nucléiques.
Certains
auteurs
ont
tenté
d'identifier
les
transitions
électroniques
qui
se
produisent
entre
l'état
fondamental et
les états
excités singulet
et triplet
de ces
composés(1-8). D'autres
études
ont
concerné
les
effets
de
structure(3,9-14), du
pH(2,6,15-17), et du solvant(l,3,18-23),
sur la
luminescence des purines et des pyrimidines. Ce type de
recherche constitue
une
voie
importante
pour
élucider
les
propriétés particulières des états électroniques excités. C'est
pourquoi, nous
avons appliqué la méthode solvatochromique à la
spectroscopie d'absorption
et de
fluorescence des
purines et
pyrimidines, et
nous avons
pu
évaluer
ainsi
leurs
moments
dipolaires dans l'état excité singulet(24~25).
Sur
le
plan
analytique,
plusieurs
méthodes
spectroscopiques ont
été appliquées
à la
détermination et
à
l'identification des purines et pyrimidines(2,3,26-28,29,30).

---

- 2 -
Ainsi, la
phosphorimétrie à basse température désignée
sous le
sigle LTP
(Low Temperature
Phos phorescence) puis la
phosphorescence à
température ambiante (RTP, Room
Temperature
Phosphorescence) ont
fait
l'objet
de
nombreux
travaux
ces
dernières années(2,3,21,26,27,31-43).
Il
s'agit
de
méthodes
sélectives
et
très
sensibles
qui
ont
permis
de
réaliser
l'analyse d'une
grande variété
de composés organiques. La RTP
est particulièrement
intéressante, car
elle s'applique
à des
surfaces solides
et ne
nécessite pas
l'emploi d'installation
cryogénique(31-43).
Cependant,
pour
pouvoir
améliorer
les
performances
analytiques de
la RTP,
il s'avère
indispensable
d'optimiser
différents paramètres
physico-chimiques comme la concentration
et la
nature des atomes (ou ions) lourds (qui intensifient
la
phosphorescence), le PH de la solution adsorbée sur la surface,
et le type de substrat solide(2,21,31,37). De telles études ont
été
développées
dans
le
cas
de
la
RTP
d'hydrocarbures
aromatiques,
d'hétérocycles
azotés,
de
pesticides
et
de
substances pharmaceutiques(31,33,42-46).
Dans notre
cas, nous
avons sélectionné les conditions
expérimentales
optimales
pour
l'analyse
des
purines
et
pyrimidines
par
RTP(47,48).
Nous
avons
aussi
examiné
la
possibilité d'appliquer la spectroscopie synchrone à la RTP, en
vue de
caractériser la présence de purines et pyrilnidines dans
certains médicaments.
Récemment, la
spectroscopie UV
dérivée a fait l'objet
d'un regain d'intérêt, en raison des avantages qu'elle présente
pour
réduire
les
interférences
spectrales
des
différents
composants de
mélanges organiques
et augmenter la sensibilité
de
la
détection(28,49-55).
A
la
suite
de
résultats
préliminaires obtenus
récemment au laboratoire(29), nous avons
appliqué la
spectroscopie UV
dérivée première
et
seconde
à
l'analyse
de
mélanges
binaires
de
purines
et
de
pyrimidines(56,57).

---

- 3 -
Notre travail
de thèse
comprendra donc
deux aspects:
l'un sera consacré à l'étude physico-chimique des états excités
singulets des
purines et
pyrimidines, l'autre à l'application
des méthodes
spectroscopiques
de
RTP,
RTP-sYnchrone
et
UV
dérivée à l'analyse de ces composés.
Dans le premier chapitre, après avoir fait le bilan des
principaux résultats
relatifs aux propriétés de lumininescence
des purines
et pyrimidines,
nous avons
montré que la méthode
solvatochromique
permettait
de
déterminer
les
moments
dipolaires dans
l'état singulet excité et qu'il était possible
d'obtenir ainsi
des renseignements
précis sur les différences
de polarité des molécules de purines et de pyrimidines dans les
états singulet excité et fondamental.
Dans le
deuxième
chapitre,
après
avoir
rappelé
le
principe des méthodes analytiques de LTP et RTP, nous avons mis
en évidence
l'importance d'un choix raisonné des conditions de
milieu
(atome
lourd,
pH,
substrat)
pour
améliorer
la
sélectivité et
la sensibilité
de l'analyse des purines et des
pyrimidines par RTP et RTP synchrone.
Enfin, le
troisième chapitre est consacré à la mise au
point d'une
méthode spectroscopique
UV dérivée
assistée
par
micro-ordinateur, que
nous
avons
appliquée
à
l'analyse
de
mélanges de purines et de
pyrimidines.
L'ensemble de
notre travail
a été
effectué
dans
le
cadre des
études systématiques
menées au
laboratoire sur les
propriétés
spectroscopiques
d'hétérocycles
azotés
et
leurs
applications analytiques.

---

CHAPITRE
l
ETUDES DES PROPRIETES DE LUMINESCENCE DES PURINES
ET DES PYRIMIDINES

---

- 4 -
l
-
BILAN ACTUEL
Nous passerons en revue les principales données connues
actuellement concernant
les états
excités des
purines et des
pyrimidines et
l'influence de
différents facteurs
(structure,
solvant,
pH)
sur
les
spectres
de
fluorescence
et
de
phosphorescence.
l
-
1. PROPRIETES DES ETATS ELECTRONIQUES EXCITES
a) Transitions éJectroniqlles
Les transitions
électroniques n,rr*
et
rr,rr*
ont
été
identifiées dans
le cas
des
purines
et
pyrimidines(1,4,S).
Plusieurs auteurs
ont montré que les transitions électroniques
sont
localisées
dans
la
partie
pyrimidinique
de
la
purine(4,S,7,8).
Une transition n,rr* a été mise en évidence par
SMITH(4,S) à
l'aide du spectre d'excitation de phosphorescence
de la
Durine à
20K dans une matrice de Xenon,
avec des maxima
compris entre
290 et
300 Dm.
L'existence de cette transition
n,rr*
(due
à un
état excité
de plus
basse énergie)
a permis
aussi
d'interpréter
les
spectres
d'excitation
de
phosphorescence polarisée
de certaines purines et pyrimidines,
ainsi que
les faibles
rendements quantiques
de
fluorescence
généralement observés(11l8,2~,5i). Par ailleurs, une transition
J 1
rr,rr* est
responsable de
l'état excité
singulet de la plupart
des purines et des pyrimidines(2,3,6,19).
En effet,
les purines
et pyrimidines
présentent généralement
une bande électronique
d'absorption située
entre 250 et 325 nm,
avec des coefficients
d'absorption molaire ~=a~ variant entre 10 3 et Sxl0 4M- 1 cm- 1 ,
ce
qui est en accord avec les critères de KASHA.
AARON et
al.(3,6) ont
confirmé qu'un
état triplet de
type rr,rr*
intervenait dans
la
phosphorescence
de
plusieurs
purines dans le mélange méthanol-eau 10/90 vol/vol à 77K. Cette
at.tribution est
basée
sur
l'existence
de
valeurs
de
t max:
supérieures
à
104M- 1 cm- 1 ,
et
de
durées
de
vie
de
phosphorescence généralement
plus longues
qu'une seconde. Ces
résultats ont
été corroborés
par ANDINO et al.(2) dans le cas

---

-
5 -
de
la
caféine
et
de
la
théophylline
en
matrice
rigide
méthanolique à 85K.
b) Rendements Quantiques de lumjnescence
Il
s'agit
d'un
paramètre
qui
dépend
beaucoup
des
conditions de température et de solvant. Différents auteurs ont
étudié l'effet
de solvants
hydro-alcooliques et du pH sur les
rendements
quantiques
de
fluorescence
(~F)
et
de
phosphorescence (~P)
des purines et des pyrimidines. LONGWORTH
et
al. (58)
ont
déterminé
les
rendements
quantiques
de
luminescence de
plusieurs purines
à 77K
et
à
pH7
dans
la
matrice eau-propylène glycol 50/50 vol/vol. Les valeurs de ~F =
0/06 obtenues
pour la
purine/ l'adénine/
la
guanine
et
la
caféine sont du même ordre de grandeur que celles de EASTMAN et
al.(22)
(~F = 0/035 (pour l'adénine à 170K dans la matrice eau-
éthylène
glycol
30/70
vol/vol).
Cependant/
en
présence
d'isopropanol/
la
valeur de ~F s'abaisse à 0/014. Le rendement
quantique de
phosphorescence dépend
aussi du
pH et
du degré
d'ionisation de
la purine
(ou de
la pyrimidine)
considérée.
Ainsi/
la
thymine s'avère
moins phosphorescente
à pH 7/ dans
une matrice
glycol-eau (~p = 0/006) qu'à pH 12 (~p = 0/1)(20).
Cette différence de comportement de la thymine est probablement
due à
la formation dans l'état excité triplet/ d'un anion plus
phosphorescent que l'espèce neutre.
c) Durées de yie de fluorescence et de phosphorescence
Une autre caractéristique importante des molécules dans
les états
excités est
constituée par
leur durée
de vie.
On
détermine
la
durée
de
vie
de
fluorescence
(T F)
ou
de
phosphorescence (Tp)
en mesurant la décroissance exponentielle
du signal de luminescence en fonction du temps.
La courbe exponentielle obéit à la relation
-t
l
= l
[1]
F,P
0 C" P e
TF ,P
1
,
Intensité
du
signal
de
fluorescence
(F)
ou
de
phosphorescence (P).
IoF,p
Intensité
du
signal
de
fluorescence
ou
de
phosphorescence au temps t
= O.

---

- 6 -
TF,P
=
durée de
vie de fluorescence ou de phosphorescence (en
seconde) ,
Les durées
de vie de phosphorescence de la plupart des
purines
sont
supérieures
à
une
seconde(3,18,19),
ce
qui
confirme que l'état triplet excité est de type rr,rr*, Cependant,
les
purines
(ou
pyrimidines)
substituées
par
des
groupes
mercapto, bromo
ou chloro
possèdent des
valeurs de
T p
très
inférieures à une seconde, ce qui est probablement dû à l'effet
d'atome lourd
intramoléculaire de ces substituants. Cet effet
augmente la
probabilité des
processus
de
conversion
inter-
système et
donc de
phosphorescence. L'étude directe des états
excités triplets
de la
thymine
et
de
l'uracil
est
rendue
difficile par
l'existence de
faibles rendements quantiques et
de courtes
durées de
vie de phosphorescence.
En employant une
source d'excitation
laser, SALET
et al(23) ont pu établir que
les durées de vie de phosphorescence à température ordinaire de
la thymine
et de l'uracil étaient respectivement de 2,5 et 0,6
~s dans l'acétonitrile.
L'effet d'atome
lourd s'exerce
aussi sur
la durée de
vie de phosphorescence du thio-2-uracil, laquelle diminue de 16
ms dans la matrice éthanol-éther-isopentane (EPA) à 110 ~s dans
un mélange
20% CH 3 1
- 80% EPA (77K)(59). Les durées de vie de
fluorescence de la thymine s'avèrent relativement courtes (TF =
0,2 ns
dans le méthyl-2-tétrahydrofuran (2MTHF) et inférieures
à 0,5 ns dans les alcools)(60).
l
- 2.
EFFET DE STRUCTURE SUR LA LUMINESCENCE
Plusieurs chercheurs
ont étudié
l'effet de
structure
sur la
réactivité photochimique
et les
propriétés spectrales
des purines et pyrimidines(3,14,19,59,61).
L'effet de structure peut s'exercer sur la position des
bandes
de
fluorescence
ou
de
phosphorescence,
sur
les
rendements quantiques
ainsi que
sur les
durées
de
vie.
La
position des
substitutants influe
beaucoup sur les propriétés

---

- 7 -
de luminescence
des purines
et pyrimidines. Ainsi, DROBNIK et
al(19) ont
examiné l'effet
de substituant
en position 2 et 6
sur
les
propriétés
spectroscopiques
des
purines
dans
les
milieux: éthylène
glycol
(ETG) + O,lM H3 P0 4
(2:1);
ETG + O,OlM
phosphate pH
=
6,8
(2:1);
ETG + O,OlM NaOH (2:1); isopropanol
et dioxane.
L'amino-2
purine
a
un
rendement
quantique
de
fluorescence
élevé
quelque
soit
le
milieu,
alors
que
la
substitution d'un
second groupe amino en position 6 abaisse le
signal de fluorescence.
L'introduction d'un second groupe ami no
augmente la flexibilité de la molécule,
ce qui provoquerait une
augmentation de
la vitesse
des
processus
de
désactivation:
conversion interne
et conversion intersystème, au détriment de
la fluorescence.
Par contre,
le peuplement de l'état Tl de la
diamino-2,6 purine
entraînerait l'apparition
d'un
signal
de
phosphorescence.
De
même,
la
substitution
d'un
groupe
mercapto
en
position 6
de la caféine et en position 2 de l'uracil provoque
un déplacement vers le rouge des spectres de phos~ph~escence de
la thiocaféine
et du
thiouracil, une diminution de leur durée
de vie(59,61).
Ces résultats pourraient s'expliquer par l'effet
d'atome lourd
du soufre.
Le remplacement d'un atome d'oxygène
par un
atome de
soufre favoriserait
aussi le
couplage spin-
orbitale entre
les orbitales
3d
du
soufre
et
rr
du
cycle
pyrimidinique.
Dans le
cas des adénines,
les spectres de fluorescence
et de
phosphorescence de
la méthyl-7
adénine présentent
une
structure
vibrationnelle
plus
fine
et
un
déplacement
significatif
vers
le
rouge
par
rapport
à
la
méthyl-9
adénine(14). Les
propriétés de
luminescence de l'adénine sont
également dominées
par la
très forte fluorescence de la forme
tautomère possédant
un atome
d'hydrogène ou un groupe méthyle
en position 7.

---

- 8 -
1 -
3. EFFET DE SOLVANT
L'emploi
de
matrices
rigides
aqueuses
en
phosphorescence
à
basse
température
a
fait
l'objet
d'une
controverse(3,lB-20). Alors
que
certains
auteurs(19,20)
ont
trouvé
que
la
structure
vibrationnelle
des
bandes
de
phosphorescence des purines substituées en position 6 était mal
résolue
dans
ces
matrices
aqueuses
à
77K,
d'autres
chercheurs(3,lB) ont
obtenu au
contraire une bonne résolution
dans le
cas de
l'adénine et
de ses dérivés dans des matrices
éthylène glycol-eau
50/50 et
méthanol-eau 10/90
vol/vol. Les
solvants hydroalcooliques
(éthanol-eau, méthanol-eau)
et
les
solutions aqueuses
basiques produisent
en général des signaux
de phosphorescence
élevés(62). Cependant,
le choix du solvant
sera dicté,
en général,
par l'inertie chimique du soluté dans
le solvant,
sa solubilité et le type d'atome lourd utilisé.
Ce choix
s'avère aussi
très
important
sur
le
plan
analytique, car l'identification des purines et des pyrimidines
nécessite une
bonne résolution
du spectre de phosphorescence.
L'étude par
BECKER et
KOGAN(20) des
effets de solvant sur la
fluorescence d'uracils et de thymines montre que les valeurs de
~F et
TF
sont
plus faibles
dans un solvant polaire aprotique
(MTHF) que dans un solvant alcoolique (éthanol-méthanol 3:1).
1 - 4. EFFET DU pH
L'étude de l'effet du pH sur les spectres d'absorption,
de
fluorescence
et
de
phosphorescence
des
purines
et
pyrimidines
indique
l'existence
de
plusieurs
équilibres
prototropiques(6,15,16,58) impliquant,
soit le
cation (C)
et
l'espèce neutre (N):
pK
pK
a
a

---

- 9 -
[~~~r K*
~N
...
~
N
NH
[l~\\r ~)+f-
P il
l
( l /"
>
N
NH
[~] ~"N:Jr +~
N
soit l'espèce neutre (N) et. l'anion (A)
NH
G
a
>
)"
c
<:
N
:) pKa G)
t~! pK
N
lJ:)
N ""
Œ'
+JO
H l h
lNh H
+
N
N
hv\\1h\\J'
hVllh\\J'
il 'lÎ h
ht'\\h,'
J
'
.Ji 1
'il
[~~~]:PKa+ lNJ:~)r
pK
+~
[l)r *a ...
...
[t?}:~
~N
N
Plusieurs méthodes
ont permis d'évaluer les constantes
de dissociation
des purines
et des pyrimidines dans les états
fondamental et excité(6,16,58,63)
(Tableau
1).
AARON
et
al(6,16)
ont
mesuré
par
fluorimétrie
et
potentiométrie
les
constantes
de
dissociation
à
l'état
fondamental pKa(SO) des purines et pyrimidines. Pour la plupart
des
composés,
les
deux
méthodes
donnent
des
résultats
similaires (Tableau l
).
D'autre
part, les
valeurs des pKa-
(S1) et
des pKa*
(T 1 ) ont
été
déterminées
par
la
méthode
thermodynamique du
cycle de
Forster(6). Les
valeurs de
pKa-
(S1) et des pKa- (T1) diffèrent notablement des pKa dans l'état
fondamental.
Pour
l'équilibre entre les espèces cationiques et
neutres, à
l'exception de
la chloro-6 purine
et de l'uracil,
les pKa CN
(S1) et les pKa CN
(T~) sont plus élevés que les pKa
(Sa)' ce qui indique que la basicité de la majorité des purines
et pyrimidines augmente dans les états excités singulet(16)
et
triplet(6) par rapport à l'état fondamental.
En ce qui concerne
l'équilibre entre
espèces
neutres
et
anioniques/
tous
les
composés étudiés
s'avèrent
plus
acides
dans
l'état
excité
singulet. On
observe un
comportement analogue
dans le cas de
l'état excité triplet. Toutefois,
la mercapto-6 purine,
l'acide
urique,
l'uracil
et
le
fluoro-5
uracil,
font
exception

---

Tableau r
Constantes de dissociation dans
les états fondamental
(pK a (Sa»' excité singulet (pKa * (SI»
et triplet
(pK a *(l'I»
de purines et pyrimidines a
1
pK CN b
pK
CN (SI)
a
~aNA(S')
!~:A(~~)
P'aCN CI',)
:
P'a NA (50)
-
1
Composé
a
(So)
1
Fluori-
P~te~- _FlU~ri~ 1
(c)
(L)
1
(c)
Spectropho~ (c)
(L) 1
(c)
1
t 1 orne t r- 1 e me t Ile 1
1
me tri e
mé tri e b
tomé tri e c:
C '
1
1
t-
-- ~--------~-_.
1
1
1
Purine
2,75
4,49
4,3"
5, 08
5, 1
9
8,1
8,95
8,74
B,7!J
4,93
5, 1
.c
--
--: "-...
1
Adénine
4,10
4,1
10,03
9,66
9,5
9,78
9,60
9,76
6,90
7, 1
6 ,~:"~'\\ 5 ,6 1
_/
~lethy 1-6purine
2,6 c
'), 'j'l
1 .. :
9,05
8,89
4,i~' ~}~,5
- 1
'1,32
1
5,2
i
o
'-) ~
1
Hercapl,L6pur-ine
3,4
~~\\
~
7,7
7
J
7,77
7,29
6,99
10,71
t ::;
(~
~:. ~
1
Acide urique
5,3
4,2
5,45
0,05
0,0')
9,4')
1
1 ':3>
(
-
'0
.:'T
ThéoLromine
V~c\\:""~' .~[~./ -
9,6
10,04
9,48
9,27
>/-
11 ,09
r
Théophylline
8,45
8,68
2,!J9
~,"':,,,k'
2,93
7,00
Cuauine
3,5
3,4
'>,47
5,62 1- '''2:16
8,8
8,9
9,35
7,52
7,21
8,72
Chloro-6purine
3,4
- 3 , Il
- 3,3
-4,09
7,7
8,1
7,85
1
- 0, 16
0,29
5,56
6. (1
Uracil
- 3,4
6,74
7,49
-5,n
0,5
9,47
2,74
2,62
1 1 , l '1
Flul'ro-5uraci 1
7,6
7,4
7,98
-1,0
-1,2
10,'>0
Iodo-5uracil
1
-
-
-
-
1
-
-
8,2
-
8,25
1
3,04
3,7','
-
-
l
Thymine
1
-
-
-
-
-
-
9,75
9,5
9,86
3,85
3'9JI
9,44
Cytosine
L 4,7
4,6
1
6,Y!J
6,62
8,85
-
10,04
-
12,24
3,92
3,7
10,14
-
______________ ~
L
_
a Les valeurs de pK a (50) et pKa (SI) salIt déterminées à 298K et celles de pKa (Tl) à 77K.
eN!t NA représentent
respectivement
les équiliLre; entre les e6p~ces catiolli4ues et neutres et entre les esp~ces neutres et anianiques.
b Valeurs litt.
(l6)
C
Valeurs litt.
( 6)
J
Valeurs litt.
(63)

---

- 11 -
puisqu'elles
sont
plus
basiques
dans
l'état
triplet,
probablement
en
raison
de
l'augmentation
de
la
densité
électronique p
du groupe
NH.
Des résultats similaires avaient
été obtenus par LONGWORTH et al(58) dans le cas de l'adénine et
de ses dérivés.
ANDINO
et
al(2)
ont
étudié
l'effet
du
pH
sur
l'intensité
de
phosphorescence
de
la
caféine
et
de
la
théophylline à
basse température et à température ambiante sur
différents substrats
solides. L'intensité de phosphorescence à
basse température
est plus
faible en
milieu acide et basique
qu'en
milieu
neutre,
tandis
qu'à
température
ambiante,
l'intensité du
signal dépend
du type
de substrat et du pH du
milieu.
l
-
5. EXTINCTION ("QUENCHING") DE LA LUMINESCENCE
Certaines molécules
appelées "quenchers" permettent de
réduire l'intensité
de fluorescence
ou de phosphorescence des
molécules organiques.
Ainsi, KNIGHTON
et al(15)
ont
observé
l'extinction de
fluorescence de l'adénine et de ses dérivés en
présence d'ions chlorure et iodure.
Ils ont aussi déterminé les
durées de
vie de
fluorescence (TF)
à l'aide de l'équation de
Stern-Volmer :
l o - 1 = TF - k
rQ]
[ 2 ]
Q
avec :
la et
la
intensité de
fluorescence du
composé
étudié
en
l'absence (la) et en présence de "quencher"
(la).
ka
constante de vitesse du processus de "quenching".
TF
durée de vie de fluorescence du composé étudié.
Les valeurs
de TF
sont plus
longues
(supérieures
à
4 x 10- 9 s)
en
présence
d'ion
chlorure
ou
iodure,
ce
qui
confirme l'existence d'un phénomène de "quenching".

---

- 12 -
L'oxygène joue
également
un
rôle
de
"quencher"
et
réduit
souvent
considérablement
la
fluorescence
ou
la
phosphorescence
de
divers
composés
organiques(2l,22,26,32-
34,36,62,65). EASTMAN et al(22) ont montré, par exemple, que la
présence d'oxygène diminuait la fluorescence à
l70K de solution
d'adénine, alors
que la
purge par
l'azote de
ces
solutions
augmente notablement leur fluorescence.
II - ETUDE EXPERIMENTALE
II - 1. PRODUITS
Notre étude
porte sur les purines et pyrimidines de la
figure 1.
Ces composés
ont été
fournis par
les firmes
U.S.
Biochemical
et
Aldrich.
Nous
les
avons
employée,
sans
purification supplémentaire.
Nous
avons
utilisé
comme
solvants
(qualité
spectrophotométrique)
l'acétonitrile,
l'acide
acétique,
l'acétate
d'éthyle,
le
diéthyl
éther,
le
cyclohexane,
le
dioxane,
le chloroforme,
le méthanol,
l'éthanol,
le propanol-2,
le butanol-l,
le diméthylformamide et le diméthyl-sulfoxide.
Nous
avons
préparé
des
solutions
de
purines
et
pyrimidines de concentrations comprises entre 10- 4
et 10-sM.
II -
2. APPAREILLAGE
Nous avons déterminé les spectres d'absorption à 298K à
l'aide d'un spectrophotomètre UV-Visible Cary, modèle 210. Nous
avons enregistré
les spectres
de fluorescence à
298K à l'aide
d'un
spectrofluorimètre
Perkin-Elmer,
modèle
LS-5.
Les
constantes diélectriques
(0) ont
été mesurées
à
298K avec un
dipolemètre modèle
DM-lO, et les indices de réfraction(n) avec
un réfractomètre Bausch et Lomb.

---

- 13 -
0
CL
NH 2
Il
l~)(~ l~N)
HN~
N~N~
~~N ~~
lN
1
NH
N
NH
N
NH
PURINE
ADENINE
GUANINE
CHLORO-6 PURINE
Me-6 PURINE
MERCAPTO-6 purine
CAF EIrJE
THEOBROMINE
ACIDE URIQUE
THEOPHYLLINE
THIO-2 URACIL
ALLOXANE
H
H
H
H
D~a
('10
i)~a
CI~a
1
NH
1
NH
NH
1
N
~
~c
Il
Il
F
Il
1
0
0
0
NH 2
THYMINE
URACIL
F-5 URACIL
CYTOSINE
0
H
H
H
H
o
Il
a~~}~ (,(a ~I~a ('fa
~
NH
L NH
1
t+1
1
NH
1
NH
0 7
N )':::-0
Br
l
1
a
H
COOH
0
0
0
ACIDE
ACIDE
Br-5 URACIL
1-5 URACIL
CL-5 URACIL
BARBITURIQUE
OROTIQUE
Figure 1
Structure des purines et pyrimidines

---

- 14 -
II - 3. MOMENTS DIPOLAIRES A L'ETAT FONDAMENTAL
Les
moments
dipolaires
à
l'état
fondamental
(Ug)
des
pyr imidines sont tirés de
la littérature.
Par contre,
nous avons
mesuré ce::'les des purines à l'aide de la relation : ~~ b/c/d~
27<T
[ 3 J
- - - - 2
.
CA) - An)
. ~
4TTN
d CD + 2)
avec :
K = constante de boltzman (1,381 x 10-16erg.K-l)
T = Température de mesure (K)
N = Nombre d'Avogadro (6,023 x lo23 mol _l)
d = densité du solvant
AD et An = valeurs numériques obtenues respectivement à partir de
la constante diélectrique
(D)
et de
l'indice de
réfraction
( n ) ,
0 - 0
2
l
-
d
selon les relations classiques:
ni
.~=----
.\\
=
x
::1
X
avec x = fraction molaire du soluté.
M = Masse molaire du soluté
II - 4. PRINCIPE DE LA METHODE SOLVATOCHROMIQUE
Cette
méthode,
qui
permet
de
déterminer
les
moments
dipolaires dans l'état excité est basée sur la théorie de l'effet
de
solvant
sur
les
spectres
électroniques
(65).
Selon
cette
théorie,
le déplacement des fréquences d'absorption des molécules
provient
d'interactions
dipolaires
soluté-solvant.
L'expression
générale des déplacements solvatochromiques
s'écrit:
.j
(vA' v F) = hC:3 . ACu).[AfCn,D)]
[4J
t:. (
VA' VF) ef':
fonction
des 0 nombres
d'onde
(en
cm -1)
des
maXlma
d'absorptic~
(VA)
et de fluorescence
(v F)
du soluté dans les
différents solvants étudiés.
A Cu)
=
fonction
des
moments
dipolaires
dans
l'état fondamental
(Ug)
et
dans
l'état
excité
(ue).
Différentes fonctions
ont
été
proposées :
A (p) = (pe 2_pg 2) dans les corrélations de BAKHSHIEV (66),

---

- 15 -
A (u) = (pe 2_pg 2) dans les corrélations de CHAMMA-VIALLET (67),
A
Cu)
= j-lo:( )le-,Ug)
dans
les
corré la tions
de
MAC
RAE ( 65)
et
de
SUPPAN(68)
f(n,d)
=
fonction de l'indice de réfraction (n) et de la constate
diélectrique (D) du solvant.
h = constante de Planck (6,62 x 10- 27 erg.s)
c = vitesse de la lumière (3 x 1010cm S-l)
a
=
O
rayon de la cavité d'Onsager (en A).
II - 5. MOMENTS DIPOLAIRES THEORIQUES
Nous avons calculé les moments dipolaires totaux
(~t) à
l'état
fondamental
des
purlnes
et
pyrimidines
en
combinant
la
méthode
PPP
(Pariser-parr-Pople,
re-LCI,
SCF-MO)
(69,70)
et
les
contributions
empiriques
des
moments
des
liaisons
~(71).
Ces
valeurs théoriques ont été obtenues à l'aide d'un ordinateur IBM,
4381/4341,
en
collaboration
avec
l'équipe
du
Profes seur
C.
PARKANYI (Université du Texas, El Paso, USA).
-+
Les contributions des électrons
rc CUn: ) ont été obtenues
à
partir
de
la
méthode
PPP
basée
sur
la
formule
de
MATAGA-
NISHIMOTO(71)
donnant
les
intégrales
de
répulsions
électronique
bicentr iques Y)J..ll
L'ensemble
des
paramètres
utilisés pour
ces
calculs ont été testés sur différents types d'atomes et de liaison
14,399
eV
[5J
(Tab l au l l ).
Y~v =
L
+ 1,328
~\\)
avec l~~
= distance
(en À) entre les atomes )l et v
.
Les
contributions
des
électrons
au
moment
dipolaire total ont été calculées à partir des moments de liaison
et des groupes de moment
(Tableau III).
Nous avons donné dans
le
tableau
IV
les
valeurs
des
moments
dipolaires
calculées.
On
remarquera que cette méthode, qui est basée sur la combinaison des
moments de liaison TC et cr;
conduit à des résultats en bon accord
avec les valeurs expérimentales correspondantes (24~25).

---

- 16 -
a
Tableau II
Paramètres utilisés dans les calculs PPP.
- - -
0
(A)
Atome fl
I)J
Afl
Yfl fl
8C - fl
lC-fl
C
11,22
0,69
10,53
-2 , 550 b
1,35
N(pyridine)
14,10
1,80
12,30
-2,550
1,35
N( type pyrale)
23,13
10,15
12,98
-2,550
1,35
O(C=O)
16,10
2,10
14,00
-3,000
1,20
S(C-SH)
20,27
10,47
9,80
-1,623
1,70
Cl
25,07
13 ,80
11,27
-0,927
1,70
c
Me
(N-Me)
24,79
13,12
11,67
-l,lOOd
1,47
Br
22,07
14,50
7,57
-0,695
1,86
---------------------------------------------------------------------------------
a Valeurs en eV.
l
et A
correspondent respectivement au potentiel
fl
fl
d'ionisation et à l'affinité électronique de l'atome )J dans l'état atomique
de valence.
Les intégrales monocentriques de répulsion électronique et les intégrales
de résonance entre atomes les plus proches sont représentées respectivement
par
Yflfl
et BC-)J
lC-)J est la longueur de la liaison covalente entre
les atomes C et
fl.
b La valeur B
= -2,31 eV a été retenue pour les hydrocarbures benzéniques
cc
c Modèle hétéroatomique du groupe méthyle.
d La valeur 8fl-Me = -1,100 eV a été calculée à partir de 0,80 8c-Me

---

- 17 -
Tableau III
Moments de liaison et de groupe
(en Debye) utilisés
pour les contributions 0
du moment dipolaire total.
Réf. a
0,40
08 )
0,40
ce travail
0,86
08 )
0,86
ce travail
0,9
(77 ; 79)
l,56
08 )
0,63
(80)
1,31
(77 .78)
l
0,8
ce travail
0,68
(77
; 78)

---

- 18 -
a
Tableau IV
Moments dipolaires calculés des purines et pyrimidines
->
-~
Composé
6n (0)
-"?
6 (°)
8
0
t (0)
1Jn
1Jo
\\.\\
Purine-7H
4,53
125
1,86
108
6,33 b
120
Purine-9H
3,35
-136
0,93
128
4,35 c
-135
Chloro-6purine-7H
4,67
123
0,72
-144
4,58
133
Chloro-6purine-9H
3,20
-138
2,98
-101
5,87
-120
Mercapto-6purine-7H
5,40
117
1,31
154
6,49
124
Mercapto-6purine-9H
2,52
-154
1,92
- 90
3,79
-126
Hypoxanthine-7H
l,2O
44
1,66
7l
2,78 d
60
Hypoxanthine-9H
5,23
- 77
1,08
- 59
6,26 e
- 74
Théobromine
3,62
172
1,29
97
4,14
155
Théophylline-7H
3,52
173
1,72
116
4,64
156
Théophylline-9H
6,43
-119
1,24
-127
7,66
-121
Caféine
3,57
172
1,00
172
4,58
172
Acide urique
3,09
- 80
0,96
- 73
4,03
- 77
Uracil
3,73
58
1,37
40
5,06
53
Thymine
3,63
53
1,31
51
4,93
52
Cytosine
5,94
- 19
l,3O
- 30
7,21
- 21
Chloro-5uracil
3,69
56
2,15
113
5,18
76
Bromo-5uracil
3,7l
57
2,09
112
5,21
76
Th i 0 - 2ur a c il
4,49
23
l,4O
40
5,84
45
Acide barbiturique
0,63
150
0,28
150
0,91
150
Alloxane
1,66
150
1,73
156
3,83
153
Acide orotique
3,38
- 18
1,41
40
4,72
24
---------------------------------------------------------------------------------
a
--7
(
)
,
,
Les valeurs de 1Jn
en Debye
sont calculees selon la methode PPP. Les valeurs
de ~o sont obtenues à partir de la somme vectorielle des mOments de liaison ~
-'?
et des moments de groupes.
Ut est le moment dipolaire total calculé. 6t cor-
respondant à l'angle entre la direction positive de l'axe desx et le moment
dipolaire total (lu dans le sens contraire des aiguilles d'une montre).
b 6,08 D et 120° (méthode CNDO/2) (9)
c 4,19 D et -135° (méthode CNDO/2) (9)
d 2,6 D et 66° (méthode CNDO/2) (12)
e 5,9 D et -74° (méthode CNDO/2) (12)

---

- 19 -
III -
RESULTATS EXPERIMENTAUX
III -
1.
EFFETS DE SOLVANT SUR LES SPECTRES
Nous avons
étudié l'effet
de solvant sur les spectres
d'absorption et
d'émission
de
fluorescence
des
purines
et
pyrimidines. Nous
avons choisi
les nombres
d'onde des bandes
d'absorption de plus grande longueur d'onde (0A ), correspondant
à la transition TI,TI*,
ainsi que ceux des maxima de fluorescence
(V p ),
pour déterminer
les déplacements
de
Stokes
dans
les
divers solvants (Tableau V).
a) Spectres d'absorption
Les
longueurs
d'onde
des
maxima
d'absorption
des
purines s'avèrent
pratiquement indépendantes de la polarité du
solvant. Par
contre, on
note des
déplacements importants
du
spectre des
pyrimidines avec le solvant. Ainsi, dans le cas de
la thymine,
des halogéno-5
uracils et
du thio-2-uracil,
les
maxima d'absorption
sont déplacés,
en général
vers le rouge,
lorsque l'on
passe d'un solvant peu polaire comme le dioxane à
un solvant très polaire comme le diméthylsulfoxide. Les valeurs
des coefficients
d'absorption molaires
(E=ax)
supérieures
à
10 4 M- 1 cm- 1
permettent de conclure, selon les critères de KAS HA ,
que la transition 0-0 de ces pyrimidines est de type TI,TI*.
Par contre,
les spectres
d'absorption de l'uracil, de
la
cytosine
et
des
acides
barbiturique
et
orotique
sont
légèrement déplacés vers le bleu lorsque la polarité du solvant
augmente.
Les
valeurs
de
E=ax
s'avèrent
plus
faibles
(10 2
<
E=ax < 10 4 M- 1 cm- 1 ),
ce
qui
pourrait
provenir
du
recouvrement des bandes dG aux transitions n,TI* et TI,TI* dans la
région comprise
entre 255
et 290
nm. Nos
résultats sont
en
accord avec
ceux
de
BECKER
et
KOGAN(20)
qui
ont
proposé
l'existence de
ces deux types de transition (en émission) pour
interpréter les propriétés de fluorescence de l'uracil et de la
thymine.

---

- 20 -
Tableau V
Déplacements spectraux des purines et pyrimidines dus aux solvants.
'\\,
'\\,
'\\,
'\\,
Composé
Solvant
(vA - vF) vA + vF
Purine
Acétonitrile
38167
28011
10156
33089
Chloroforme
38167
26810
11357
32488
Ether diéthylique
38167
26850
11317
32508
Acetate d'éthyle
38167
27174
10993
32670
Méthanol
38022
27548
10474
32875
Propanol-2
32857
Mercapto-6purine Acétonitrile
29156
Ether diéthylique
Acétate d'éthyle
28760
Propanol-2
27449
Hypoxanthine
Acétonitrile
40983
32370
8613
36676
Méthanol
32170
Propanol-2
40816
34940
5876
37878
Chloro-6purine
Acétonitrile
38167
33670
4497
35918
Chloroforme
38022
34014
4008
36018
Ether diéthylique
38022
34188
3834
36105
Acetate d'éthyle
37878
32895
4983
35386
Propanol-2
37878
33898
3980
35888
Théobromine
Acétonitrile
37383
32154
5229
34768
Chloroforme
37106
31250
5856
34178
Ether diéthylique
37106
32051
5055
34578
Acetate d'éthyle
37383
31545
5838
34464
Propanol-2
37523
31746
5777
34634
Théophy 11 i ne
Acétonitri le
37665
32894
4771
35279
Chloroforme
37175
31347
5828
34261
Ether diéthylique
37594
32362
5232
34978
Acetate d'éthyle
37594
32258
5336
34926
Propanol-2
37879
32362
5517
35120

---

- 21 -
Tableau V
Déplacements spectraux des purines et pyrimidines dus aux solvants.
(suite 1)
,\\,
a
'le
b
(~A
' 0
Composé
Solvant
vA
vF
- \\IF) vA + vF
2
(cm- l )
(cm- 1 )
(cm- 1 )
Ccm- 1 )
Caféine
Acétonitrile
37183
32342
5041
34862
Butano1-1
37665
32499
5166
35082
Chloroforme
36969
31706
5263
34337
Cyc10hexane
37037
31250
5787
34143
Ether diéthy1ique
37313
31397
5916
34355
Acétate d'éthyle
37313
31867
5446
34590
Propanol-2
37523
31867
5656
34695
Uracil
Dioxane
38760
30675
8085
34717
Ether diéthy1ique
38760
NF
Chloroforme
39063
27397
11666
33230
Acétate d'éthyle
38462
31056
7406
34759
Butano1-1
38610
31056
7554
34833
Propanol-2
18760
30960
7800
34860
Methanol
38760
30581
8179
34670
Acetonitri1e
39063
29851
9212
34457
Thymine
Dioxane
38162
30675
7487
34418
Ether diéthy1ique
38162
3() 395
7Hll
34278
Chloroforme
38162
27397
10765
32729
Acétate d'éthyle
37879
31)675
7204
34277
Butano1-1
37879
30769
7110
34324
Propanol-2
37736
30864
6872
34300
Methanol
377 36
30675
7061
34205
Acetonitri1e
JR168
29851
8317
34009
Dimethy1su1foxide
37453
NF
Cytosine
Dioxane
26525
Chloroforme
27701
Acétate d'éthyle
36232
30030
6202
33131
Butanol-l
37175
28986
8189
33080
Propanol-2
37313
30769
6544
34041
Méthanol
37313
30581
6732
33947
Acetonitri1e
36496
29Q40
6556
33218

---

- 22 -
Tableau V
Déplacements spectraux des purines et pyrimidines dus aux solvants.
(suite 2)
'0
a
b
"v
Composé
Solvant
vA
vF
(v A - vF) vA + vF
2
(cm- l )
(cm- l )
(cm- l )
(cm- l )
Fluoro-5uracil
Dioxane
37879
NF
Ether diéthylique
38168
NF
Chloroforme
377 36
26455
11281
32095
Acetate d'éthyle
37879
NF
Butanol-l
37594
NF
Propanol-2
37594
31746
5848
34670
Methanol
37594
30581
7013
34087
Acetonitrile
37879
29940
7939
33909
Dimethylsulfoxide
37313
NF
Chloro-5uracil
Dioxane
37037
30120
6917
33578
Ether diéthylique
37037
NF
Chloroforme
36765
30303
6462
33534
Acétate d'éthyle
37037
30120
6917
33578
Butanol-l
36496
NF
Fropanol-2
36364
NF
Hethanol
36364
NF
Dimethylformamide
36364
NF
Acetonitrile
36765
NF
Dimethylsulfoxide
36232
NF
Bromo-5uracil
Dioxane
36496
NF
Ether diéthylique
36630
NF
Chloroforme
36496
NF
Acetate d'éthyle
36630
NF
Butanol-l
36232
NF
Propanol-2
36232
NF
!'Iethanol
36232
NF
Dimethylformamide
36101
NF
Acetonitrile
36496
NF
Dimethylsulfoxide
35971
NF

---

- 23 -
Tableau V
Déplacements spectraux des purines et pyrimidines dus aux solvants.
(suite 3)
a
''v
"v
1\\..;
('\\v
Composé
Solvant
(vA - vF) vA + vF
2
(cm- l )
(cm- l )
Iodo-5uracil
Dioxane
3'5971
NF
Ether diéthylique
36364
NF
Chloroforme
35714
NF
Acetate d'éthyle
36232
NF
Butanol-l
35842
NF
Propanol-2
35842
NF
Methanol
35714
NF
Dimethylformamide
35714
NF
Acetonitrile
36101
NF
Dimethylsulfoxide
3'5211
NF
Thio-2uracil
Dioxane
37594
NF
Ether diéthy1ique
37313
NF
Chloroforme
36765
NF
Acetate d'éthyle
37313
NF
Butanol-l
36496
NF
Propanol-2
37037
NF
Methanol
36232
NF
Dimethylformamide
36900
NF
Acetonitrile
37313
NF
Dimethylsulfoxide
36765
NF
Acide barbiturique
Chloroforme
38462
27027
11435
32744
Acetate d'éthyle
38760
32362
6398
35561
Butane-l
39063
NF
Propane-2
39370
NF
Methanol
39216
NF
Acetonitrile
36364
NF

---

- 24 -
Tableau V
Déplacements spectraux des purines et pyrimidines dus aux solvants.
(suite 4)
b
ru
Composé
Solvant
(vA - vF) vA + vF
2
( cm - 1 )
( cm - 1 )
Acide orotique
Dioxane
34602
NF
Chloroforme
34722
27397
7325
31059
Acétate d'éthyle
34965
28986,28011
5979
31975
Butanol-l
35211
31250
3961
33230
Propanol-2
35211
NF
Methanol
35211
NF
Dimethylformamide
35587
NF
Dimethylsulfoxide
34722
NF
a Nombre d'onde du maximum de la bande d'absorption principale (précision
± 2 nm).
b Nombre d'onde de la bande principale de fluorescence (précision ± 2 nm).
NF composé non fluorescent.

---

-
25 -
b) Spectres de fluorescence
Nous
avons
trouvé
que
le
spectre
d'excitation
de
fluorescence de
la plupart
des purines
était déplacé vers le
rouge
de
manière
significative
par
rapport
au
spectre
d'absorption
correspondant
(figure
2)(240.
Une
observation
analogue avait
été faite
dans
le
cas
de
l'adénine
et
la
guanine(12,72).
Nous
avons attribué ce phénomène à l'existence
d'un équilibre tautomère du type:
H
l~)
N N-7H
L'une des
formes tautomères
serait relativement
plus
abondante que
l'autre et
les ~F des deux formes seraient très
différentes.
Ainsi,
le
spectre
d'absorption
de
l'un
des
tautomères serait
complètement masqué
par celui
du tautomère
prédominant.
Par
contre,
la
forme
la
moins
abondante
posséderait le
rendement quantique
de
fluorescence
le
plus
élevé, et son spectre d'émission de fluorescence prédominerait.
En conséquence,
le spectre d'excitation correspondrait à celui
de la forme tautomère la moins abondante.
Dans le
cas des
pyrimidines, seules
la cytosine,
la
thymine et
l'uracil possèdent
des
rendements
quantiques
de
fluorescence
assez
élevés
pour
fournir
des
spectres
de
fluorescence
exploitables.
Le
maximum
d'émission
de
fluorescence de
la cytosine
est déplacé versle rouge quand la
polarité du
solvant augmente
tandis que,
pour l'uracil et la
thymine,
on
n'observe
aucun
déplacement
spectral
notable
(tableau V) (25) .
III -
2.
CORRELATIONS
"NOMBRE D'ONDE-PARAMETRE DE SOLVANT"
La mesure dipolemétrique directe des moments dipolaires
des molécules
dans l'état
excité singulet
serait délicate en
raison de
leurs très
courtes durées
de vie.
Nous avons donc
choisi la
méthode solvatochromique
(équations 6-9).
Pour
la
plupart des
purines et
pyrimidines(24~2S), nous avons employé

---

- 26 -
'J
+\\J
2
4
A
F
___
2~(~~~~-_~~;~) i2n2+1 (D-1 _ n -1 )+ 3(n -1) ] [~
=
2
a~
2
2
2
he
L2 (n +2) \\D+2
n +2
2(n +2)2
Cependant,
dans le
cas de
certaines pyrimidines non
fluorescentes,
nous
avons dû
utiliser les
équations
[8]
de
MAC RAE et
[ 9 ]
de SUPPAN( 66, 68).
rv
f.1'] (~e
-
~g)
:- 2(D-1)]
\\J
=
A
3
L
D+2
[ 8 ]
a
he
0
c,J
~g(~e - ~g)
2(D-1) ]
\\J
=
[ 9 ]
A
3
a
he
l- 2D+1
0
Les
symboles
employés
sont
identiques
à
ceux
de
l'équation
[4].
Nous avons
calculé les
valeurs de
a o
des purines et
des pyrimidines à partir de la relation (Tableau VI)
:
a
= (
3M
) 1/3
[ 10]
o
4rroN
avec :
8
densité du soluté,
M
masse molaire du soluté,
N
nombre d'avogadro,
Les fonctions
de solvant
F~, F 2 ,
F
tirées
des
3
,
F 4
équations
[6-9]
se définissent comme suit
2
2
D-1
n -1
2n +1
F~
D+2
2
2
[ Il]
n +2
n +2
2
2
4
2n +1
D-1
n -1
3 (n -1
F
+
2
2
2
2
[ 12]
2 (n +2) D+2
n +2
2(n +2)2
2(D-1)
[13 ]
D+2

---

-
27 -
A
80
0.7
288
70
0.6
60
0.5
262
,-,
1
\\
, '
1
\\
1
1
l
,
l
,
0.4
1
1
1
1
l
,
1
1
l
,
40
l
,
l
,
0.3
1
1
l
,
1
1
l
,
30
\\\\
",
,
\\
1
1
\\
l
,
0.2
\\
l
,
\\
,
\\
1
\\
20
\\
1
\\
1
.... /
\\
\\
O. 1
\\
\\
\\
10
\\
\\
\\
"- ..... ...............- ....--- ------
o
o
200
250
300
350
À,
nm
Figure 2
Comparaison des spectres
d'absorption (- -
-)
et
d'excitation de fluorescence (
) de la purine.

---

- 28 -
Tableau VI
Densité à l'état solide (dt 2 ) et rayons de la cavité
du soluté (a )a des purines et des pyrimidines.
o
b
o
Composé
(A )
Purine
1,114
3,50
Chloro-6purine
1,443
3,49
Mercapto-6purine
1,521
3,41
Hypoxanthine
1,619
3,22
Théobromine
1,419
3,69
Théophylline
1,358
3,75
Caféine
1,321 c
3,88
Acide urique
1,89l c
3,28
Uracil
1,654
2,99
Thymine
1,485
3,23
Cytosine
1,596
3,02
Fluoro-5 uracil
1,884
3,01
Chloro-5 uracil
1,907
3,12
Bromo-5 uracil
2,411
3,15
Iodo-5 uracil
2,708
3,27
Thio-2 uracil
1,685
3,11
Acide barbiturique
1,721
3,09
Acide orotique
1,745
3,41
a Valeurs de a calculées à partir de l'équation de
(68)
o
Suppan
b Valeurs de ce travail, sauf note contraire
c Valeurs litt.
(76 )

---

- 29 -
2(D-1)
[ 14 ]
2D+1
Leurs valeurs
sont présentées
dans le
tableauVII. La
~
~
détermination des
pentes des
graphes linéaires
r ~(VA,VF)'
~.(n,D)]
= ° des différentes
expressions
[6-9]
permet
d'obtenir les valeurs de ~e.
III -
3. MOMENTS DIPOLAIRES
a) Moments dipolaires dans l'état fondamental
Nous avons
donné dans
les tableaux
IV
et VIII
les
valeurs théoriques
et
expérimentales
des moments dipolaires
dans l'état fondamental des purines et pyrimidines.
Dans le cas des pyrimidines, les valeurs expérimentales
s'avèrent en
assez bon
accord avec
celles calculées
par
la
méthode PPP,
sauf dans
le cas
de l'alloxane et des chloro-S,
bromo-S et
thio-2 uracils, pour lesquels les valeurs calculées
sont de 13 à 82 % supérieures aux valeurs expérimentales.
Pour
les
purines,
nos
valeurs
expérimentales
correspondent bien
à
celles
de la littérature. Ainsi, pour la
caféine, nous
trouvons des
valeurs de
~g de
3,S9D
(acétate
d'éthyle) et
3,88D (acide acétique)
tandis que la valeur de la
littérature est
de 3,70D
(benzène)(11,73). De
même, pour
la
théophylline, notre
valeur de
~g de
3,88D (acétate d'éthyle)
s'avère
assez
proche
de
celle
obtenue
dans
le
dioxane
(3,94D)(74)
et,
dans
le
phénol
à
90%
(3,4D)(10,11,73).
Cependant, nos
valeurs pour
la purine
(2,92D dans
l'acétate
d'éthyle) et
pour
la
chloro-6
purine
(3,89D
dans
l'acide
acétique) sont
plus
faibles
que
celles
de
la
littérature
(respectivement 4,32D(8)
et S,3,4D
dans le
dioxane(ll).
Ces
différences seraient dues à la faible solubilité de ces purines
dans les solvants utilisés. BERGMAN et al(10,12) ont montré que
les moments
dipolaires calculés
par
la
mécanique
quantique
étaient
nettement
différentes
pour
les
diverses
formes
tautomères des
purines.
Il est donc possible de prédire quelle
forme tautomère prédomine En comparant les valeurs calculées de

---

- 30 -
a
Tableau VII
Fonctions de solvant
Solvant
F2
Acetonitri1e
0,8630
0,6659
1,8481
0,9605
Acetate d'éthyle
0,4902
0,4969
1,2519
0,7699
Ether diéthy1ique
0,3762
0,4282
1,0536
0,6901
Cyc10hexane
-0,0028
0,2880
0,5086
0,4055
Dioxane
0,0501
0,3114
0,5882
0,4545
Chloroforme
0,3719
0,4864
1,1189
0,7175
Méthanol
0,8544
0,6512
1,8271
0,9548
Ethanol
0,8117
0,6516
1,7719
0,9395
Propanol-2
0,7651
0,6394
l,726O
0,9265
Butano1-1
0,7532
0,6479
1,6859
0,9148
Diméthy1formamide
0,8356
0,7098
l,845O
0,9597
Diméthy1su1foxyde
0,8377
0,7424
1,8723
0,9670
a Voir définitions dans le texte : équations
[Il],
[12]
,
[13] et
[ ] ! f ]

---

- 31 -
Tab leau VII l
Moments dipolaires expérimentaux des purines et
pyrimidines à 298K (en Debye)a
b
c
Composé
Moment dipolaire
]J g (D)
Réf
d
Purine
2,92 (AE)
4,32
(Di)
(l0)
Chloro-6purine
3,89 (AA ) d.,
5,34 (Di)
(l1)
Mercapto-6purine
3,59 (AA ) d
Hypoxanthine
3,16 (AA) d
Théobromine
3,11 (AA) d
Théophylline
2,70 (AA ) d
3,88 (AE) d
3,4 (PE)
(74)
3,94 (Di)
(l0,11,73)
Caféine
3,83 (AA) d
3,59 (AE) d
4,6 (Di)
(74)
3, 7
CE)
(11 ... 73)
Acide urique e
3,70 (B)
(lt)
Uracil
5,18 (Di)
(81)
Thymine
4,13 (Di)
(82)
Fluoro-5uracil
4,l1CDi)
(82)
Chloro-5uracil
4,07
(Di)
(82)
Bromo-5uracil
4,15 (Di)
(82)
Iodo-5uracil
4,01
(Di)
(82)
Thio-2uracil
4,2l (Di)
(83)
Alloxane
2,10 ( Di)
(102)
a Valeurs déterminées en utilisant la relation (3)
(p.
14); précision ~ lOf:
b Solvants utilisés: Acide acétique (AA); acétate d'éthyle (AE); dioxane (Di);
mélange phénol
(90%)-éthanol
(lO%)(PE); benzpne (E).
c Valeurs de la littérature sauf note contraire
d Ce travail
e Mesure impossible en raison de la faible solubilité de ce composé.

---

- 32 -
~g aux
valeurs expérimentales
pour les différentes structures
tautomères possibles (Tableaux IV
et VIII). Ainsi, dans le cas
de la
purine, la
valeur expérimentale
de ~g (2,920) est plus
proche de celle du tautomère N-9H (4,350) que celle de la forme
N-7H
(6,330).
Nous
pouvons
en
conclure
que
la
structure
tautomère N-9H
de la
purine est
prédominante dans
l'acétate
d'éthyle (solvant
dans lequel le moment dipolaire expérimental
a été mesuré).
De même,
dans le
cas de
la mercapto-6
purine, notre
valeur expérimentale
(3,590) est beaucoup plus proche de celle
de la
forme N-9H
(3,790) que
celle de la formE N-7H (6,490).
Par contre, pour la chloro-6 purine, notre valeur expérimentale
dans l'acide
acétique (3,890)
s'avère plus
proche
de
celle
calculée pour
la forme N-7H (4,580) que de celle correspondant
à
la
forme N-9H
(5,870), ce qui indique que le tautomère N-7H
prédomine.
Enfin,
dans
le
cas
de
l'hypoxanthine
et
de
la
théophylline, nos
valeurs expérimentales (respectivement 3,160
et 3,880)
sont plus
proches des
valeurs calculées
pour
les
formes N-7H
(respectivement
2,780
et
4,640)
que
pour
les
tautomères N-9H (respectivement 6,26D et 7,660).
Dans le
cas de
la théobromine
et de
la caféine, nos
valeurs expérimentales
(respectivement 3,110 et 3,830) sont en
bon
accord
avec
celles
calculées
par
la
méthode
PPP
(respectivement 3,620 et 3,570).
Les valeurs
des
angles
8
entre
la
direction
des
t
-7
moments dipolaires
(~t) des purines et pyrimidines et celle de
l'axe des
x traversant la molécule (Figure
3) varient entre
-135° et
172° (Tableau
IV) selon
la structure
moléculaire du
composé.
b) Moments dipolajres dans l'état excité singulet
Nous avons
calculé sur ordinateur les caractéristiques
des corrélations
de BAKHSHIEV,
CHAMMA-VIALLET,
MAC
RAE
et
SUPPAN (Tableau
IX).
Dans la plupart des cas, les coefficients

---

- 33 -
PURINES
PYR HU DINES
N/ s = -135°
e = 53°
N~
)
NH
~ NH
Nj~o
H
PURINE-9H
URACIL
NH2
M
= 155 °
3 = -21 0
H
o~lN1Me
THEOBRO:-1I:JE
CYTOSINE
Figure 3
Exemples d'orientation des moments dipolaires des
purines et pyrimidines à
l'état fondamental.

---

- 34 -
de corrélation
de BAKHSHIEV
CHAMMA-VIALLET sont supérieurs à
I
0 / 90 aussi
bien pour
les purines que pour les pyrimidines 1 ce
qui traduit une assez bonne linéarité (Figures 4-7). Cependant 1
la
précision
des
corrélations
de
CHAMMA-VIALLET
est
en
l
général 1 meilleure
que celle
de BAKHSHIEV.
Etant donné que la
plupart des
pyrimidines ne
sont pas fluorescentes 1 nous avons
calculé leurs moments dipolaires à partir des équations [8]
et
[9]
de
MAC RAE
et SUPPAN
qui ne nécessitent que l'usage des
I
nombres d'onde
d'absorption. Sauf dans le cas de l'uracil
les
l
coefficients de corrélation s'avèrent supérieurs à 0 / 91
ce qui
1
indique une
assez bonne linéarité des corrélations. Cependant 1
certains
solvants
comme
le
dioxane
l'acétonitrile
et
le
l
diméthylsulfoxide se
trouvent systématiquement
à l'écart
des
corrélations
(Figures
8 et
9). Ces anomalies seraient dues à
des interactions
soluté-solvant spécifiques comme les liaisons
hydrogènes. Pour
tracer
les
corrélations
nous
avons
donc
l
écarté les solvants présentant des déviations supérieures à 300
cm- l •
Pour la plupart des pyrimidines 1 les moments dipolaires
dans l'état excité singulet présentent des valeurs plus élevées
à l'état
excité singulet
que
dans
l'état
fondamental.
Par
contre
sauf
dans le
cas de
la chloro-6
purine
les purines
l
l
possèdent des
moments
dipolaires
plus
faibles
dans
l'état
excité que dans l'état fondamental
(Tableau X).
Les différences
de moment
dipolaire sont
comprises entre 0 / 2 et 4 / 2D selon le
composé.
Ces
résultats
sont
en
accord
avec
les
valeurs
calculées
théoriquement
(10 / 12 / 73).
La
diminution
de
la
polarité
des
purines
et
de
certaines
pyrimidines
(comme
l'uracil et
l'acide orotique)
dans l'état excité signulet par
rapport
à
l'état
fondamental
peut
être
attribuée
à
la
participation de
la transition
n/rr*1
ainsi
qu'on
l'a
déjà
remarqué(12 / 75).
c) Effet de structllre sur les moments dipolaires
Nous avons
comparé
l'effet
de
substituant
sur
les
moments dipolaires
des
purines
et
pyrimidines
dans
l'état
fondamental et dans l'état excité.

---

- 35 -
Tableau IX
Traitement statistique des corrélations solvatochromiques
des purines et pyrimidines.
a
Ordonnée à
Coef. de
Nombre
Composé
Pente
l'origine
corrélation
de données
(cm- 1 )
Corrélations de Bakhshiev
Purine
-2010
12066
0,97
6
Ch1oro-6 purine
830
3587
0,75
4
Mercapto-6 purine
NC b
Théobromine
-1007
6302
0,80
4
Théophylline
-1557
6110
0,83
4
Caféine
- 963
5949
0,87
5
Uraci1
1788
6455
0,83
4
Thymine
-1402
8112
0,84
5
Cytosine
1192
5621
0,94
4
Corrélations de Chamma-Viallet
Purine
2138
31547
0,93
6
Ch1oro-6 purine
- 823
36439
0,97
4
Mercapto-6 purine
1936
27882
0,90
3
Théobromine
826
34150
0,75
4
Théophylline
1163
34436
0,90
4
Caféine
2100
33478
0,92
8
Uracil
265
34665
0,83
4
Thymine
- 892
34694
0,90
7
Cytosine
-20935
47206
0,93
5
Corrélations de Mac Rae
Uraci1
747
37484
0,817
5
Thymine
- 575
38744
0,913
7
Cytosine
2007
33752
0,985
4
F1uoro-5 uraci1
- 833
38996
0,953
6
Ch1oro-5 uraci1
- 639
37517
0,956
8
Bromo-5 uraci1
- 685
37409
0,928
7
Iodo-5 uraci1
- 835
37256
0,997
6
Thio-2 uraci1
- 581
37960
0,971
6
Acide orotique
554
32229
0,966
6

---

- 36 -
Tableau IX
Traitement statistique des corrélations solvatochromiques
des purines et pyrimidines.
a
Ordonnée à
Coe f.
de
Nombre
Composé
Pente
l'origine
corrélation
de données
Ccm- l )
Corrélations de Suppan
Uracil
NCb
Thymine
-1725
39344
0,926
7
Cytosine
6348
31358
0,993
4
Fluoro-5 uracil
-2499
39864
0,959
6
Chloro-5 uracil
-2585
38812
0,935
8
lodo-5 uracil
-2474
38100
0,993
6
Thio-2 uraci1
-1442
38300
0,953
6
Acide orotique
1271
34021
0,995
5
'"
a Valeurs de l'ordonnée à l'origine de
(VA -
VF ) ;
ou \\J A
2
b NC
Aucune corrélation pour ce composé.

---

- 37 -
VA - VF
•
MeeN
(cm- I )
BuOH
•
8.000
o
BuOH
AcOEt
7.000
i-ProH
i-PrOH
MeeN
AcOEt
6.000
--
0.3
0.5
0.7
0.9
Figure 4
Corrélations
de
Bakhshiev
entre les déplacements
spectraux (YA -
Vp )
de pyrimidines et les fonctions
de solvant F~
o thymine
t::. cytosine
.... déviations aux corrélations

---

- 38 -
(~~ - vF) r-------1i--------il-------il-----------,--__
(,a -1)
9.000
~
-
8.000
f-
-
7.000
f-
-
-
AcOE ~
8uOH 1\\
5.000
f-
-
,,--,---~_~_CN...J.I\\~
4.000
~
'~:~Cl~3Jn:):-E-t-20-------------liOë.)PrD-H--;~~~
.
.. __ . _- ..
3.000
~
1
1
1
1
0
0.2
0.4
0.6
0.8
r 1
Figure 5
Corrélation~
de Bakhshiev entre les
déplacements
spectraux (~A - ~F) de purines et les fonctions de
solvants F~
o chloro-6 purine
l:> caféine

---

- 39 -
VA+V:;
2
Dioxane
(cm- 1)
34.000
 AcOEt
33.000
BuOH
32.000
0.2
0.4
0.6
0.8
Figure 6
Corrélations de
Chamma-Viallet e~tre
les
déplace-
~J
ments
spectraux
de
pyrimidines) A + v F
et
les
fonctions de solvant F 2 •
2
o thymine
6.
cytosine
•
Â
déviations aux corrélations

---

- 40 -
(VA + v,r)1 2
( cm - l )
37.000
36.000
... ... ...... ... ....
35.000
34.000
0.3
0.5
0.7
0.9
Figure 7
Corrélations
de
Chamma-Viallet
entre les déplace-
ments
spectraux
de
purines
et
les
fonctions de
solvant F 2
o
chloro-6 purine
1::>.
caféine

---

- 41 -
39.000
..... .....
... .....
Dioxane
e'''1eCN
BuOH
38.000
•
AcOEt
i-?rOH
t'IeOH
37.000
l
1
36.000
0.5
1.0
1.5
2.0
Figure B
Corrélations de Mac R~e entre les nombres d'onde des
maxima d'absorption
(VA) de pyrimidines et les fonc-
tions de solvant F 3
o
thymine
D.
cytosine
.... dévia tions aux corrélations

---

- 42 -
39.000
.... .... ....
MeCN
Dioxane
•
38.000
-
AcOEt
37.000
~ MeZSO
~ ,~eCN
36.000
0.5
0.75
1.0
Figure 9
Corrélations de
Suppan entre les nombres d'onde des
maxima
d'absorption (~A)
des
pyrimidines
et
les
fonctions de solvant F 4
o thymine
f::" cytosine
•
 déviations
aux corrélations

---

- 43 -
Les
moments
dipolaires
dans
l'état
fondamental
se
classent selon les séquences :
Purine >
chloro-6 purine ~ théophylline > caféine > mercapto-6
purine> théobromine, pour les purines et :
Cytosine >
uracil >
acide orotique
> thio-2 uracil > bromo-S
uracil >
thymine >
fluoro-S uracil > chloro-S uracil > iodo-S
uracil, pour les pyrimidines.
D'autre part,
les moments
dipolaires à
l'état excité
singulet se rangent dans les ordres suivants
Chloro-6
purine
>
purine
>
théophylline
>
théobromine
>
mercapto-6 purine> caféine, pour les purines et
Cytosine >
iodo-S uracil
> fluoro-S uracil > bromo-S uracil >
thymine >
thio-2 uracil
> chloro-S
uracil >
uracil >
acide
orotique, pour les pyrimidines.
On constate que les moments dipolaires des purines dans
les états
fondamental et
excité varient
approximativement en
raison
inverse
de
l'ordre
des
effets
électrodonneurs
des
substituants,
à
deux
exceptions
près.
Autrement
dit,
la
présence d'un
atome ou
d'un groupe électrodonneur provoque la
diminution du
moment dipolaire.
Cependant,
la chloro-6 purine
et
la
théobromine
présentent
un
comportement
inverse
puisqu'elles deviennent
relativement plus polaires dans l'état
excité.
Pour les
pyrimidines, on
remarquera que
l'ordre
des
moments dipolaires
est inversé dans l'état singulet excité par
rapport à
l'état fondamental.
Dans la
majorité des
cas, les
composés ayant
de faibles
valeurs de
moments dioplaires dans
l'état
fondamental
présentenL
des
moments
dipolaires
plus
élevés dans
l'état excité.
L'ordre des moments dipolaires des
pyrimidines
ne
correspond
donc
pas
à
celui
des
effets
électrodonneurs
ou
électroaccepteurs
des
substituants.
Ce
phénomène
peut
être
attribué
à
l'existence
de
densités
électroniques
différentes
dans
les
états
fondamental
et
singulet excité.

---

- 44 -
Tableau X
Moment dipolaire à l'état fondamental et à l'état excité
singulet des purines et pyrimidines
Composé
IVf
Purine
4,32 g
3,18
3,09
Chloro-6 purine
3,89
4,32
4,31
Mercapto-f) pur~ne
3,5'3
2,29
Théobromine
3,11
2,16
2,36
Théophy11 ine
3,88h
2,63
2,99
Caféine
3,83
3,00
l,58
Uraci 1
5,18
5,62-
5 , 1 1
Thymine
4,13
3,51
4,48
Cytosine
7,2l i
7,43
10,45
Fluoro-5 uracil
4,11
5,21
7,41
Chloro-5 uracil
4,07
5,02
7,91
Bromo-5 uracil
4,15
5,18
6,82
Iodo-5 uracil
4,01
5,45
8,28
Thio-2 uracil
4,21
5,04
6,23
Acide orotique
4,72 i
3,80
2,60
a Moment dipolaire expérimental à l'état fondamental dans l'acide acétique
pour les purines et dans le dioxane pour les pyrimidines (sauf note
contrai re) .
b Moment dipolaire expérimental à l'état excité singulet.
c Corrélations de Bakhshiev
d Corrélations de Charnrra-Viallet.
e Corrélations de l'lac Rae.
f Corrélations de Suppan
g Dans le dioxane.
h Dans l'acétate d'éthyle.
i Valeurs calculées.

---

CHAPITRE
II
ETUDE ANALYTIQUE DE LA LUMINESCENCE DES PURINES ET PYRIMIDINES

---

- 45 -
1.
PRINCIpE DES METHODES DE I.JIMIBESCRNCE
1-1. ASPECT THEORIQUE
La fluorimétrie
et la
phosphorimétrie constituent des
méthodes d'analyse
basées sur
la
mesure
des
intensités
de
fluorescence et
de phosphorescence
émises par les molécules à
analyser. Ces
deux
processus
radiatifs
diffèrent
par
leur
origine et
leur durée
la
fluorescence
est
issue
d'états
singulets (durée
de vie
TF
comprise
entre
10-9
et
10-S s),
tandis que
la phosphorescence provient d'états triplets (durée
de vie Tp
comprise entre 10- 4 et 10sec)
(figure 10).
Les méthodes spectroscopiques de luminescence ont connu
un grand développement depuis quelques années et ont donné lieu
à de nombreuses applications en chimie analytique, en biochimie
(protéines,
acides
nucléiques,
enzymes),
en
chimie
pharmaceutique (vitamines,
médicaments) et
dans le domaine de
l'environnement
(hydrocarbures
aromatiques
polynucléaires,
pesticides). En
effet, i l S'agit de techniques très sélectives
et très
sensibles, puisque les masses de substance détectables
sont de
l'ordre du
nanogramme ou
du picograrnrne.
La
théorie
quantitative de
la luminescence -est basée
sur les
équations
différentielles
de
KUBELKA
et
MUNK,
que
ZWEIDINGER
et
WINEFORDNER
(85)
ont
appliqué
aux
milieux
homogènes
et
transparents, ou
non homogènes.
L'intensité
de
luminescence
(IL) a pour expression:
_
[(l+s)eXP(Kb) + (1-s)exp(Kb)-2 ]
IL - 2</>F SI o
[15]
(1+S)2 exp(Kb) - (1-s)2exp (Kb)
avec
IL = Intensité de luminescence
le:> =
Intensité incidente
~L = Rendement quantique de luminescence
f3
= k/(k + 28)
k
= 2,303 E: C
s
= Fraction de radiation diffusée sur la longueur moyenne du
trajet optique
e:
= Coefficient d'absorption molaire du composé
C
= Concentration du composé (en M)

---

- 46 -
j
,
TRANS ITIONS
---------~--- T3
NON R~ADIATIVES
CO~VERSION
-----------l~---T 2
I~TERNE
t
S 1
~
TRANSITIONS NON
ABSORPTION
QJ
)
RADIATIVES
TRIPLET-TRIPLET
Cl
CONVERSION INTERNE
1
'-
QJ
SVSTErb
C
11....----,:--_
UJ
FLUORESCENCE
tPHOSPHORESCENCE~ 1T
CONVERSION
ABSORPTION
CONVERSION
ABSORPTION
INTERNE
INT!RDITE
INTERNE
S~
.l...-_ _L-_----lL-
.....L.._ _..J.-_ _:L..-_
Figure 10
Diagramme des niveaux énergétiques de Jablonski.

---

- 47 -
b
= Longueur moyenne de traversée de l'échantillon par
diffusion (en cm)
K
= Vk(k + 2s r
En solution et dans un mU jeu homogène: S = 0, l'équation
[ 15 ] devient :
Aux faibles concentrations, c'est-à-dire pour Kb «
1
IL = ~L 1
Ki)
0
Aux concentrations très élevées, c'est-à-dire pour K.b »
1
IL = ~L 1 0
Ainsi les courbes analytiques log IL = f
(log C) doivent être
linéaires,
avec
une
pente
égale
à
l'unité
aux
faibles
concentrations et une pente nulle aux concentrations élevées.
- Dans un milieu non homogène et non transparent
S > 0,
l'équation [15] devient:
* Aux faibles concentrations
1
IL = 2 ~L 10 K fi (1 + 256)
Si 2 sb «
1 : IL = 2 ~L 1
Kb
0
* Aux
concentrations élevées
ou Kb
» 1 ,
l'équation
[15]
devient :
IL = 2 cp L 1
--:.VK.....;K~
_
0
VK+2S' + Vi<
Si k »
S on a
IL = CPLlo
Si S »
K on obtient l
= 2CPL I v/K
L
0
2s
Les
courbes analytiques log IL = f
(log C) doivent donc
être linéaires
en milieu
non homogène, avec une pente égale à
l'unité aux
faibles
concentrations,
une
pente
de
0,5
aux
concentrations intermédiaires
et une
pente nulle
aux
fortes
concentrations.

---

- 48 -
1-2. PRINCIPE DE LA PHOSPHORIHETRIE
Il s'agit d'une méthode spectroscopique qui a été proposée
par LEWIS
et KASHA
en 1944
(84). Toutefois,
ce n'est
qu'au
début des
années soixante
dix que
des dispositifs permettant
des mesures
quantitatives ont
été conçus
(85,86). A quelques
exceptions près
(biacétyle, solutions
dégazées comportant des
atomes lourds),
la
phosphorescence
n'est
pas
mesurable
en
solution liquide,
en raison
de la
durée de
vie relativement
longue des
molécules dans l'état triplet, laquelle augmente la
probabilité des
processus de désactivation collisionnelle avec
les molécules
de solvant. KASHA (87) a étudié pour la première
fois en
1952 l'effet
d'atome lourd
sur
la
phosphorescence.
Plusieurs auteurs
ont confirmé
par la
suite que
la présence
d'atome lourd
dans la
molécule de soluté (effet d'atome lourd
interne (88»
ou dans
le solvant (effet d'atome lourd externe
(2, 26,
27, 31,
35, 61,
62», favorisait
le couplage
spin-
orbitale entre
les états
excités singulets
et
triplets,
et
entre les
états triplets et l'état fondamental de la molécule.
Il en
résulte une
augmentation considérable de l'intensité de
phosphorescence, une
réduction de
l'intensité de fluorescence
et une diminution de la durée de vie de phosphorescence.
Il existe deux procédures en phosphorimétrie :
- La
phosphorescence à
basse
température
(LTP)
consiste
à
abaisser fortement
la température
de l'échantillon
(azote ou
hélium liquide)
et à
former ainsi
une matrice rigide, ce qui
pennet de minimiser les collisions soluté-solvant.
- la
phosphorescence à
température ambiante
(RTP) consiste à
déposer l'échantillon
dopé par un atome lourd sur des supports
solides à
température ambiante, ce qui réduit les processus de
désactivation bimoléculaire.

---

- 49 -
a) phosphorescence à basse température (LTP)
L'emploi
de
températures
cryogéniques
rend
la
LTP
relativement délicate
et longue à mettre en oeuvre. De plus la
nécessité d'une
matrice homogène
et transparente
a longtemps
restreint le
choix des
solvants organiques à l'éthanol absolu
ou au mélange EPA (éthanol - isopentane - éther)
(37). Ce n'est
que vers
les années soixante dix que le groupe de WINEFDORDNER
(85,86) a
suggéré l'usage
d'un tube
capillaire
tournant
de
quartz comme
cellule de mesure, ce qui a permis de choisir des
solvants partiellement
aqueux comme
matrice rigide en LTP. Il
en est
résulté une
meilleure précision
et
une
plus
grande
sensibilité, et
la LTP
a
pu
être
appliquée
aux
molécules
hydrosolubles. Cependant, le stade de l'analyse de routine, n'a
pu être atteint, en raison des problèmes posés par l'emploi des
basses températures.
Cependant,
AARON
et
WINEFORDNER
(37)
ont
montré
l'intérêt de
la LTP
pour détecter
des composés
organiques à
l'état
de
traces.
Par
ailleurs,
la
bonne
résolution
vibrationnelle des bandes d'émission de phosphorescence rend la
LTP très sélective.
b) Phosphorescence à température ambiante (RTP)
Il s'agit d'une méthode qui s'est développée depuis une
quinzaine d'années.
Le composé
à analyser
est déposé
sur un
support solide
(papier filtre,
gel de silice, oxyde d'alumine
etc ... ) et
sa phosphorescence
est
déterminée
à
température
ambiante. Les
molécules adsorbées et dopées par des atomes (ou
ions) lourds
sont lnaintenues
de manière rigide sur la surface
solide,
ce
qui
permet
de
minimiser
les
processus
de
désactivation
collisionnelle
et
d'exalter
l'émission
de
phosphorescence. L'obtention
de la
RTP résulte d'un processus
complexe qui fait intervenir plusieurs facteurs (37)
:
- des
interactions ioniques
entre
les molécules
ionisées en
solution et le support peuvent augmenter la rigidité
molécu-
laire (32, 33, 64).

---

- 50 -
- des
liaisons
hydrogènes
entre
les
molécules
organiques
polaires ou ionisées et un suppor·t de papier filtre ou de gel
de
silice
comportant
des
groupes
hydroxy, peuvent
aussi
favoriser leur maintien rigide (34, 36).
L'inhibition de la phosphorescence en présence d'humidité
pourrait être
due à
la pénétration
rapide de molécules d'eau
dans
les
interstices
du
substrat,
ce
qui
faciliterait
l'irruption d'oxygène
moléculaire dans
la matrice et gènerait
la formation
des liaisons hydrogènes entre les groupes hydroxy
du
support
et
les
molécules
organiques.
La
présence
de
molécules d'oxygène
dans la
matrice
peut
aussi
inhiber
la
phosphorescence par interaction triplet-triplet (34, 36).
La RTP présente l'avantage sur la LTP d'être une méthode
rapide, simple
et peu
coûteuse. Elle
est aussi
relativement
sensible dans
le
cas
des
composés
possédant
un
rendement
quantique de
phosphorescence élevé.
Les limites
de détection
sont en
général de
l'ordre de
quelques nanogrammes
(37). De
plus, comme
les molécules
organiques ne donnent pas toutes de
phosphorescence à
la température
ambiante,
i l
est
possible
d'analyser sélectivement
les composants
d'un mélange
en
les
dopant au moyen d'atomes lourds.
En général les spectres d'excitation et d'émission de RTP
ressemblent
à
ceux
de
LTP.
Cependant
l'augmentation
de
température provoque
un faible
déplacement bathochrome
de la
bande d'émission,
un léger
élargissement du
spectre
et
une
mauvaise résolution de sa structure fine (32-34, 36).
C) Phosphorjmétrie synchrone
La
phosphorimétrie
synchrone
permet
d'améliorer
la
sélectivité de
la RTP.
Il S'agit
d'une technique récente qui
n'a encore connu que peu d'application (89-92). Elle consiste à
faire défiler
à
la
vitesse
synchrone
les
longueurs
d'onde
d'excitation
et
d'émission,
en
maintenant
un
intervalle
constant ~À tel que :

---

- 51 -
/::"À = À
-
À
[16]
em
ex
À
= longueur d'onde d'émission
em
À
= longueur d'onde d'excitation
ex
Lorsque les longueurs d'onde d'excitation et d'émission se
trouvent
en
coïncidence
avec
les
maxima
d'excitation
et
d'émission de phosphorescence du composé étudié, i l apparaît un
pic de
phosphorescence. Par contre, on ne détecte aucun signal
lorsque la
longueur d'onde
d'excitation
correspond
à
un
maximum
d'excitation,
mais
qu'aucune
émission n'existe pour
À
= À
+ /::"À.
em
ex
La
phosphorimétrie s~~chrone
a permis
d'identifier et
d'analyser
quantitativement
les
constituants
de
mélanges
d'hydrocarbures aromatiques
polynucléaires (89,
91) comme
le
naphtalène, le
phénanthrène,
l'anthracène,
le
pérylène,
le
fluorène et la pyrène, avec des limites de détection de l'ordre
de quelques nanogrammes.
II - ETIIDE EXPERIMENTAI,R
II-1. PRODUITS
Nous
avons étudié
la purine, l'adénine, la caféine, la
chloro-6 purine,
la méthyl-6
purine, la mercapto-6 purine, la
guanine,
la
théophilline, la
théobromine, l'uracil, le thio-2
uracil, la
cytosine, la thymine et le fluoro-S uracil (Aldrich
et D.S. Biochemical). Nous avons utilisé comme sels l'iodure de
potassium (prolabo) et les acétates de plomb, de thallium et de
samarium (Aldrich).
Les substrats employés en RTP comprenaient
du papier
filtre
Whatman
40
(W-40),
de
l'oxyde
d'alumine
(A1203) et du gel de silice (Si02)
(Macherey-Nagel). Nous avons
préparé des mélanges éthanol-eau (70/30 vol/vol), ainsi que des
solutions aqueuses acides (pH = 1,6) et basiques (pH = 13).

---

- 52 -
11-2. - INSTRUMENTATION
Nous
avons
déterminé
les
spectres
d'excitation
et
d'émission de
phosphorescence à
basse température
(77K) et à
température ambiante
(298K), à
l'aide
d'un
spectromètre
de
luminescence Perkin
Elmer
modèle
LS-5,
équipé
d'une
lampe
pulsée au
xénon. Les
temps de
retard (td)
et de mesure (tg)
étaient
respectivement
de
0,1
et
9
msec
et
les
fentes
d'excitation et d'émission étaient réglées respectivement à des
largeurs de
bandes spectrales
de 10
nID et 2,5 nID.
Nous avons
fabriqué
pour
la
RTP
un
porte-échantillons
en
aluminium
permettant de
recevoir des
rectangles de
papier
filtre,
de
plaques de
gel de
silice ou
d'oxyde
d'alumine
sur
support
plastique (figure Il).
Pour
la LTP, nous avons employé une cuve en polystyrène
contenant l'azote liquide et un porte-échantillons Perkin-Elmer
maintenu à
77K par
conduction thermique. La cellule de mesure
était constituée
d'un tube
cylindrique en quartz, de 60 mm de
longueur et de 2 mm de diamètre intérieur.
11-3. - PROCEDURE
Les spectres de phosphorescence des purines et pyrimidines
ont
été
réalisés
dans
une
matrice
rigide,
de
manière
à
minimiser les processus de désactivation non-radiative. En LTP,
on introduit environ 100 III de l'échantillon à analyser dans le
tube en
quartz, lequel
est ensuite
inséré lentement
dans le
porte-échantillon refroidi
par l'azote
liquide. De
plus,
le
tube est
balayé en permanence par un courant d'azote destiné à
empécher la condensation de la vapeur d'eau sur les parois.
Pour
les mesures
de
RTP,
on
place
dans
le
porte-
échantillon des
rectangles de
papier filtre, de gel de silice
ou d'oxyde
d'alumine préalablement
découpés (surfaces environ
80 mm 2 ).
On dépose
successivement sur
le substrat 3 ~l de la
solution à analyser et 2 ~l de la solution de sel d'atome lourd
ou du
solvant à
l'aide d'une
microseringue de 5 ~l. On sèche

---

- 53 -
o
4.Sem
2.Scm
l.lem
o
o
.lem
0.& cm
Figure 11
Porte-échantillons
adapté aux
mesures de RTP
sur
les surfaces solides.

---

- 54 -
ensuite les
échantillons à
l'aide d'un
courant
d'air
chaud
pendant environ
une minute,
puis on
les
introduit
dans
le
compartiment de
mesure du
spectrofluorimètre. Le compartiment
est balayé
en permanence pour un courant d'azote, de manière à
achever le
séchage de
l'échantillon.
Les
temps
de
séchage
varient de
2 à
20 minutes,
selon le
composé et
la solution
d'atome
lourd.
L'étude
des
courbes
de
l'intensité
de
phosphorescence
en
fonction
du
temps
(figure
12),
permet
d'évaluer
pour
chaque
composé
le
temps
optimal
(topt )
correspondant à
l'intensité maximale
de
phosphorescence.
La
reproductibilité
des
mesures
de
RTP
dépend
des
facteurs
suivants :
- localisation identique des dépots d'échantillons
- fluctuations minimales de la source excitatrice
- régularité et habileté de l'expérimentateur
Dans la majorité des cas, nous avons obtenu des déviations
standard relatives
de l'ordre
de 5%. Nous avons soustrait des
intensités
de
phosphorescence
des
solutés,
le
signal
de
phosphorescence résiduelle
du substrat et du solvant, lequel a
été déterminé
à partir
de 5
à 7 mesures, effectuées dans les
mêmes conditions de À ex et
À en>
que le soluté.
III - RESUI.TATS
111-1. SPECTRES DE PHOSPHORESCENCE DES PURINES ET PYRIMIDINES
Nous
avons comparé
les spectres de phosphorescence des
purines et
pyrimidines à
basse température
et à
température
ambiante (tableau
XI). Nous avons observé un léger déplacement
vers le
rouge des bandes d'excitation et d'émission de RTP par
rapport à
la LTP (figure 13 et 14). Par ailleurs, les spectres
RTP se
caractérisent par une bande d'émission particulièrement
large, sans
structure vibrationnelle
notable
et
moins
bien
résolue que
les spectres
de LTP.
Ce comportement
a déjà été
noté pour d'autres composés organiques (38, 93).

---

- 55 -
,-,
l
,
1
,
1
,
1
.----- --- . -.....
1
. /
."
1
/
1
/
1
/
50
./
1
1
.1
1
1
.1
1
1
o
10
20
t (mn)
Figure 12
Effet
du
temps
de
séchage
sur
l'intensité
de
phosphorescence à température ambiante de la purine
en présence de différents atomes lourds
Tl+ - - - - - Pb 2 + -
. -
. - 1-

---

- 56 -
:,
.. 1
LTP - _. --
Ip
RTP
1
,
EXCITATION
.
,
,
1
,
,
•
1
,
1
1
\\
\\
,
,
\\
,
.
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\\
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,
\\
1
,./
\\
\\
,
\\
,
,
\\
,
1
\\
.
1
\\
,
\\ ,
1
\\
\\
\\
\\ ,
", , .."
~
250
1
~O .., 1
..
1
400
450
À(nm)
Figure 13
Comparaison des spectres d'excitation et d'émission
de phosphorescence de la
caféine à basse
tempéra-
ture (LTP) et à température ambiante (RTP).

---

- 57 -
",."
,1
LTP-----
:'1
LI
"
'1
"Il
I
RTP-
1
I l
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p
1
1
I l
1
1
1
1
1
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,,
1
1
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1
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\\.
1
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EXCITATION
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1
,
1
,
.
1
,
,
,
,
,
,
,
,,,
,.,i....
" ,,,..."',......'..j-"•
250
400
450
•
À(nm)
Figure 14
Comparaison des spectres d'excitation et d'émission
de phosphorescence de l'adénine à basse température
(LTP) et à température ambiante (RTP).

---

- 58 -
a
Tableau XI
Propriétés de phosphorescence des purines et pyrimidines.
RTP b;c
LTP c,f
-
d
d
Composé
À
À
II /1
À
À
II /1
ex
em
p
p
ex
em
p
p
(nm)
(nm)
(nm)
(nm)
g
Adenine
(256) ; ~~ (395) ~ 15 ;430
<Xl
280
368;375;387;397
20.7
- -
(275)g
408;(418);428
Caféine
283
438
230
275
400;421;440
13.5
- -
--
e
e
Purine
278
437
41.1 e
237;266
372;385;(395~
14.2
--
--
407;418
e
Chloro-6
280h ,e
438h ,e
7.3
(255);267
(387); (395) ;420;
9.3
--
--
purine
430
e
e
e
Methyl-6
267;278
438;435
6.0;26.2
(240) ;265
(369) ; (393) ;403
12.8
purine
Hercapto-6pllrin
255;340
465
1.3
235;340
462; (472) ;489
12.0
- -
e
e
Guanine
255) ; (268)0280 , i
435 e ,i
3.7
-
-
-
.-
j
Theophylline
282J
435
<Xl
255
(395);415;435
32
- -
--.
- -
e
Theobromine
280 j ,e
440J ,e
82.3
-
-
-
--
- -
a
-4
-3
Concentrations: 10
à 10
M en solution EtOH-H 0 70/30 vol/vol.
2
b Substrat : papier filtre W-40 avec KI lM (T .. 298K).
c Longueurs d'onde du pic principal soulignées. Longueurs d'onde des épaulements entre
parenthèses. Précision des valeurs ± 1 nm.
d Facteur d'exaltation de phosphorescence dû à l'atome lourd (voir définition dans le texte).
e NaOH : lM.
f Matrice d'éthanol-eau 85/15 vol/vol, avec KI (0,5M) (T
77K) •
g Valeurs litt. (26)
À
290 nm
À
.. 470 nm.
ex
em
h Valeurs litt.(26)
À
290 nm
À
'" 460 nm ; en solution basique NaOH(IM).
ex
em
i Valeurs litt. (26)
À
280 nm
À
450 nm.
ex
em
j Valeurs litt.(101) : À
.. 275 nm . À
'" 435 nm, en solution aqueuse de KI lM.
ex
'
em

---

- 59 -
111-2. EFFETS D'ATOME LOURD
L'intensité
de
phosphorescence
des
purines
et
des
pyrimidines augmente de manière importante en présence d'iodure
de potassium
(ou d'autres
ions lourds)
aussi bien à 77K qu'à
298K. On
définit le facteur d'exaltation de phosphorescence dû
à l'effet d'atome lourd (FEPAL) à l'aide de l'équation suivante
.
(26)
AL
.AL
. Al
,
I
C
- 'B
P
s
s
=
[ 17]
1
i
- i
cA l
p
s
B
s
dans laquelle IpA~ représente l'intensité de phosphorescence du
composé
étudié
en
présence
d'atome
lourd
(AL)
et
I p
en
l'absence
d'A.L
(valeurs
corrigées
de
la
phosphorescence
résiduelle du solvant)
;
.A L
,
i
= i.ntensité
de phosphorescence du composé étudié en
s '
s
présence et en absence d'A.L.
.AL
i B
intensité
de
phosphorescence
du
solvant
'B '
=
en
présence et en absence d'A.L.
AL
c
c
= concentration du composé étudié en présence et en
s '
s
absence d'A.L.
Pour les
purines et les pyrimidines, les valeurs du FEPAL dues
à
l'iodure
sont
comprises
entre
1,3
et
~. à
température
ambiante, et
entre 9,3 et 32 à basse température (tableau XI).
Sauf dans
le cas de la mercapto-6 purine, les FEPAL présentent
des valeurs
plus élevées
à basse température qu'à température
ambiante.
Ce
phénomène
peut
s'expliquer
par
l'existence
d'interactions substrat-soluté
plus intenses
dans le
cas des
molécules adsorbées
à température
ambiante que dans le cas de
celles incluses dans les matrices à 77K.
Il
convient
de
noter
aussi
que
l'intensité
de
phosphorescence
des
purines
dépend
également
de
la
concentration d'ion
lourd (CA • Lo ).
En vue
de déterminer
les
valeurs
optimales
de
CA . L .
pour
lesquelles
le
signal
de
phosphorescence est
maximum, nous avons étudié la variation de

---

- 60 -
la fonction
f
(1 p
CA . L .) =
O. L'analyse des courbes obtenues
(figure 15)
nous a
conduit à retenir les valeurs suivantes de
CA.L.
:
1,0 M
(1-);
0,3 M
(Tl-+-);
0,1 M
(Pb2-+-)
; 0,025 M
(Sm 3-+-) .
En vue d'améliorer la sensibilité de la RTP, nous avons
comparé l'effet
de ces différents ions lourds sur les spectres
et les
intensités de phosphorescence de purines et pyrimidines
sélectionnées, adsorbées
sur papier
filtre (48).
En général,
les longueurs
d'onde des
maxima d'excitation et d'émission ne
varient pas
de manière
significative avec le type d'ion lourd
utilisé. Cependant, nous avons trouvé que l'ion Sm3-+- produisait
un déplacement
hypsochrome de 10 à 50 nm du maximum d'émission
par rapport
aux autres
ions lourds
(figure 16
et 17).
Nous
avons adopté
le Tl+
comme ion
de référence ; nous avons donc
exprimé les
intensités de
phosphorescence des différents ions
lourds étudiés par rapport à Tl-+-.
Nous avons trouvé que les rapports d'intensité Ip~-/IpT~-+-,
I p Pb2-+-/IpTI·et Ips~3-+-/IpT~+ étaient inférieurs à l'unité pour la
plupart des purines (Tableau XII), ce qui implique que les
valeurs des FEPAL s'ordonnent de la manière suivante :
Tl-+- > Pb2-+- ~ 1- »
Sm3-+-
Dans
le cas
de la
caféine, de la théobromine et de la
théophylline, cependant,
le rapport Ip~-/IpT~+ est supérieur à
l'unité.
Pour
la plupart
des purines,
l'ion Tl+ est donc l'ion
lourd qui augmente le plus l'intensité de phosphorescence. Nous
avons attribué
ce phénomène
à la
formation de
complexes
de
transfert de
charge (CTC)
entre les ions Tl-+- et les molécules
de purines.
Ces
CTC
seraient
stabilisés
par
des
liaisons
hydrogène entre
le groupe
NB des purines et les groupes OH de
la cellulose (Schéma page n° 61
) •

---

- 61 -
Complexe de Tranfert de Charge (CTC) entre l'ion TL+ et la
purine.

---

- 62 -
A1
A2
[TL+] 1 M
a
100 r------....=,,r-:------~,~----~,3:...-
o
o -
0 -
0"------
/o
o
50
o
a
0,5
1,5 [
2,0
1-J, M
Figure 15
Effet de la concentration d'ion lourd sur
l'inten-
sité de phosphorescence de l'adénine
0: Tl-+-
 :
I-

---

- 63 -
,.
,,,
1 \\
1
\\
,
lp
1
\\
,
1
\\
,
1
\\
,
1
\\
1
1
\\
1
\\
excitation :,
1
1
1
1
1
1";"":'\\1...\\'
emission
\\
: \\
'.
\\
,,
:
~" \\
,
~ ~\\\\
.....
f\\
1
..
1
: .
,
~ : ", \\
f:
'\\ ..... "
'. \\
,,
1/\\ \\\\
!
:
\\ \\.\\"\\
.
\\j
l' :
' \\
j
\\ ......\\
j \\ \\
',\\
""\\
,f \\ \\\\
\\
l'
\\ '.,"',\\
. ~
r ,\\
1 :
\\
...~
~/~ /,' J.l
~ \\ \\
, ' !
/
.:
~
\\:
'" '
.\\1
-:f. ,'"
,' ~
:
1
\\ \\\\
/ ' "
,
'.
,
~'"
\\
'. .
\\
'
..,
..
200
300
500
À(nm)
Figure 16
Effet
d'atome
lourd
sur les
spectres
RTP de la
mercapto-6 purine
Tl-+-
I- + N.OH( lM)
Pb 2 -+-
....... 5m3 -+-

---

- 64 -
excitation -,
emission
1
1
1
1
1
1
\\1
1
1
1
1
/1,
/ \\\\
/
\\
-\\/ /
\\
, ' \\ , . . - /
1
,
1
\\\\\\...
1
.... -
...
200
300
400
500
À(nm)
Figure 17 : Effet
d'atome
lourd sur les spectres de RTP de la
théobromine
Tl'"
I- + N...OH( lM)
Pb 2 ...

---

- 6S -
Tableau XII
Comparaison de l'effet des ions lourds sur l'intensité
de RTP des purines.
+
a
3+
+
Composé
r -
Tl
r
/r
a
r Sm
/ITI a
p
p
p
p
Adénine
O,U b
0,28
0,33
0,006
Caféine
8,99b
6,02
0,68
0,05
Purine
O,l7 b
0,33
Chloro-6 purine
O,38b
1,09
0,03
Methyl-6 purine
O,3l b
0,01
0,12
0,002
Mercapto-6 purine
O,4l b
0,10
0,1
0,015
Guanine
O,9 b
Théophylline
l,02 b
4,24
0,25
0,02
Théobromine
2,53b
3,41
0,4
a
: rapport de l'intensité de RTP
en présence des ions lourds r- , Pb 2+, Sm3+ et de celle en présence de Tl+.
b NaOH
lM

---

- 66 -
Les
molécules de purines seraient donc liées de manière
très rigide
au support,
ce qui
provoquerait
une
exaltation
importante
de
l'intensité
de
phosphorescence.
Cette
interprétation est
analogue à
celle présentée
par
plusieurs
auteurs, pour expliquer des résultats analogues obtenus dans le
cas de
la RTP
des indoles (31) et d'hydrocarbures aromatiques
condensés (42).
Le fait que le signal de phosphorescence de la caféine, de
la théobromine
et de
la théophylline
soit relativement moins
intense
en
présence
d'ions
Tl+
qu'en
présence
d'ions
I-
pourrait être dû à la structure particulière de ces purines qui
ont en
commun de
posséder deux
(ou
plus
de
deux)
groupes
méthyle. Ces
groupes méthyle
produiraient une
gêne
stérique
modérée à
la formation
des liaisons hydrogène qui stabilisent
les
CTC
purines-ions
Tl+
décrits
précédemment.
Il
en
résulterait une
diminution de
la valeur
du
FEPAL
pour
ces
composés, en présence d'ions Tl+.
111-3.
EFFET DE SUBSTRAT
Le choix
du substrat
solide est important en RTP, car
i l permet d'améliorer la sélectivité et la sensibilité de cette
méthode. Diverses
études expérimentales ont montré qu'il était
nécessaire de
trouver pour
chaque
composé
des
combinaisons
optimales de
substrat et de type d'atome lourd pour obtenir le
signal de phosphorescence le plus élevé (2, 31, 36, 38, 39, 41,
42, 94, 95).
Dans le cas des purines et pyrimidines, nous avons retenu trois
substrats:
papier filtre
(Whatman 40),
gel de silice, oxyde
d'alumine, dont l'effet sur la RTP a été évalué en présence des
mêmes ions
lourds que
précédemment. Nos résultats, rassemblés
dans le tableau XIII, montrent que les spectres d'excitation et
d'émission des purines et pyrimidines ne varient pas de manière
significative avec
la nature
du substrat.
Toutefois, i l faut
signaler de
faibles déplacements
vers le
bleu (~À$ 5 nm) des
maxima d'excitation
de phosphorescence
sur gel
de silice
et

---

- 67 -
Tableau XIII
Effet du substrat sur la phosphorescence à température ambiante
de purines et de pyrimidines
~a
b
1
Compose
Ion
À
À
C
ex
et:!
d
Substrat
nette
lourd
- --
I RTP
(nrn)
(nm)
Tl+
W-40
278
415;430
79
- -
Al 0
275
(395) ;415;430
15,5
2 3
- -
Si0
275
420
0,9
2
W-40
280
410;(430)
26
Adénine
Pb 2+
Al 0
-
-
NP
2 3
Si0
272
425
0,7
2
W-40
256;266;275
415;430
9,1
-
l
Al 0
275
430
5,5
2 3
Si0
272
430
0,2
2
W-40
282
440
385
Tl+
Al 0
278
438
36,6
2 3
Si0
278
440
0,8
2
W-40
283
438
51,4
Purine
Pb 2+
Al 0
273
435
5,4
2 3
Si0
-
-
2
NP
W-40
278
437
26,7
-
l
Al 0
275
440
2 3
6,9
Si0
-
-
2
NP
W-40
285
435
17,2
+
Tl
Al 0
-
-
2 3
NP
Si0
280
430
2
0,3
W-40
285
435
II , 7
Caféine
Pb 2+
Al 0
-
-
2 3
NP
Si0
-
-
2
NP
W-40
(270);280
435
385
-
l
Al 0
275
2 3
440
1,5
Si0
-
-
2
NP

---

- 68 .-
Tableau XIII: sUlte 2
1
~a
b
Compose
Ion
C
l '
d
Substrat
À
À
ex
em
RTP nette
lourd
(nm)
(nm)
Tl+
W-40
285,329
(445) :458
2378
-
-
Al 0
-
-
NP
2 3
Si0
329
443;458
9,7
2
-
W-40
285:335
455
233
-
Pb 2+
A1 0
-
-
NP
Mercapto-6
2 3
Si0
330
454:473
peu phosph.
purine
2
-
W-40
265:333
465
983
-
l
A1 0
315
465
34
2 3
Si0
332
443;467
43
2
-
Al 203
320
465
0,8
Sm3+
Si0
330
467
1
2
W-40
288
440
13 ,9
Tl+
A1 0
282
437
3
2 3
Si0
283
430
0,5
2
W-40
288
425
3,5
Pb 2+
A1 0
- ~
-
NP
Théophyll ine
2 3
Si0
-
-
NP
2
W-40
282
435
14
-
l
Ali03
275
440
0,97
Si0
275
440
0,3
2
W-40
280
440
39
Tl+
A1 0
275
430
9,8
2 3
Si0
284
430
1,8
2
W-40
292
435
15,6
Théobromine
Pb2+
A1 0
-
-
NP
2 3
Si0
285
430
1,2
2
W-40
280
440
49,4
-
l
Al 203
278
440
2,9
Si0
275
440
1, 1
2

---

- 69 -
~a
b
Compose
Ion
c
d
Substrat
À
À
I
nette
ex
em
RTP
lourd
(nm)
(nm)
W-40
280
443
31
+
Tl
Al 0
275
435
3
2 3
5i0
280
440
0,7
2
W-40
282
445
34
"+
Chloro-6
Pb~
Al 0
-
-
m»
2 3
purine
5i0
-
-
m»
2
W-40
280
438
12
-
l
Al 0
-
-
NP
2 3
5iO"
-
-
NP
W-40
280
440
180
+
Tl
Al 0
273
1
438
12
2 3
5i0
275
430
0,9
2
W-40
279
435
23
Mét:hyl-6
Pb 2+
AI 0
-
-
NP
2 3
purine
5i0
-
-
NP
2
W-40
278
435
55
-
l
Al 0
277
440
2,7
2 3
5i0
-
-
NP
2
W-40
276;327
443
90
+
Tl
A1 0
328
445
12
2 3
Si0
275;326
440
5,6
2
Thio-2
W-40
280;325
440
4,8
uracil
Pb 2+
Al 0
320
440
2,6
2 3
Si0
263;320
440
1,9
2
W-40
258;265;307
435
23,8
-
l
A1 0
310
443
0,8
2 3
5i0
255;317
450
0,5
2
1
a
-3
-4
Concentration: 10
M, saur pour la mercapto-6 purine sur W-40 (10
M avec
2+
-
-5
+
-4
+
Pb
, l
et 10
~ avec Tl ), pour la purine sur W-40 (5 10
~ avec Tl ), pour
la méthyl-6 purine sur W-40 (10-4~ avec Tl+) et la caféine sur W-40 (5 10-4M
avec l
t- ~aOH) .
b
+
"+
-
3+
[Tl ) .. O,3M; [Pb~ ) . O,IM; [1) .. lM (milieu NaOH (lM) ; [Sm) • O,025M.
c Al 0 • oxyde d'alumine; 5i0 • gel de silice.
2 3
2
d I
nett:e : valeurs corrigées pour la phosphorescence résiduelle du substrat.
RIP

---

- 70 -
oxyde d'alumine
par rapport
au papier filtre. La position des
maxima d'émission
s'avère pratiquement
insensible au
type de
substrat employé,
(figure 18)
à l'exception
du thio-2 uracil
dont le
spectre de phosphorescence est légèrement déplacé vers
le rouge, en présence d'ions iodure.
Pour
tous
les
composés
étudiés,
les
signaux
de
phosphorescence sont
nettement plus intenses sur papier filtre
que sur
oxyde d'alumine ou gel de silice, quelque soit l'atome
lourd utilisé
(Tableau XIII). Ainsi, les intensités présentent
des valeurs
sur papier
filtre W- 40, 65
à
4.300
fois
plus
élevées que
sur oxyde
d'alumine et
55
à
10.800
fois
plus
grandes que
sur gel
de silice. Il convient de noter aussi que
les signaux
de phosphorescence
sont
plus
élevés
sur
oxyde
d'alumine que
sur gel
de silice
dans
la
plupart
des
cas.
L'effet de
substrat sur
l'intensité de
phosphorescence
peut
donc se résumer par la séquence suivante
compte tenu
des résultats obtenus dans cette étude, nous avons
retenu le
papier filtre
W-40 comme substrat, afin d'améliorer
les
performances
analytiques
de
notre
méthode
RTP.
Cette
exaltation
de
phosphorescence
sur
papier
filtre
est
probablement due,
au moins
partiellement à
des
interactions
intermoléculaires par liaisons hydrogène entre les molécules de
purine et les groupes OH de la cellulose. Il en résulterait une
plus grande
rigidité des
molécules de
purines adsorbées
sur
papier
que
sur
A1 2 03
ou
S~02,
ce
qui
provoquerait
l'augmentation
de
la
phosphorescence
observée.
Cette
interprétation est
en accord avec les conclusions de plusieurs
auteurs, qui
ont insisté
sur le rôle prédominant des liaisons
hydrogène
soluté-substrat
pour
empêcher
les
processus
de
désactivation non radiative de l'état excité triplet (31,34,36-
39). Cependant,
le gel
de silice
bien
qu'il
contienne
des
groupes OH,
ne donne
que de
faibles intensités de RTP. Cette
différence de
comportement avec
le papier pourrait être due à
la différence
de porosité et d'homogénéité des deux substrats.
Dans le
cas du
papier les
complexes de
transfert de
charge

---

- 71 -
excitation
,...-.
/ .
"-
\\
.
.
/ . - .
,
/
"
\\
/
...... '\\
/
"
.
,,'-- ..........,
\\.
/
,-- ..
"
\\
1;--·/
/
"
..... ,.
,
"
..."
.....
/.
\\\\.,;
,."
..... , , "- .
(1
/ ,,"
"
'.
/~,.
......~.
-1-'"
'"
250
300
350
LOO
L50
À(nml
500
Figure 18
Effet
de
substrat
sur les
spectres de RTP de la
théophylline.
____
papier filtre W-40 (SxO,S)
____ gel de silice (Sx3)
_. _. oxyde d'alumine (Sx2)

---

- 72 -
(CTC)
Tl+-purine
seraient
situés
dans
des
couches
plus
profondes du
substrat que
dans le cas du gel de silice. Il en
résulterait des
interactions plus
intenses des
CTC avec
les
groupes OH
qu'avec les groupes silanols, ce qui produirait des
signaux de
phosphorescence plus
élevés sur papier que sur gel
de silice.
Par ailleurs,
la
distribution
des
molécules
de
purines (et/ou
des CTC)
serait plus
hétérogène
sur
gel
de
silice, en
raison de
la variété
des
sites
silanols
actifs
existant dans ce substrat (96).
Cette interprétation est confirmée par nos résultats de
spectroscopie
photoélectronique
X
réalisés
avec
ces
deux
substrats.
111-4. ANALYSE DE LA
SURFACE
DES SUBSTRATS
PAR SPECTROMETRIE
PHOTOELECTRONIQUE X (XPS).
Les spectres XPS ont été obtenus à l'aide d'un spectromètre
V.G.
Instruments
Escalab
MK1,
modifié
pour
permettre
l'acquisition numérique
des spectres
(97). Ces
derniers sont
d'abord accumulés
puis lissés
et finalement
reconstruits
en
effectuant
la
somme
de
courbes
gaussiennes
de
largeur
identique. La
puissance de
la source
X était de 100 W (tension
d'accélation:
la ev,
courant
d'émission
la mA)
et
la
pression s'élevait
à environ
10- a mbar. Nous avons étudié par
XPS le papier filtre W-40 et le gel de silice.
a) Etudes XPS du papier fjJtre
Le
signal de
C1S comprend trois raies. La raie de plus
basse énergie
de
liaison
(C1sa )
correspond
au
carbone
de
contamination et
est utilisée
pour
étalonner
l'échelle
des
énergies (énergie
de liaison
: 285,0
ev). Les
raies C1Sb et
C1Bc: correspondent aux carbones du papier liés respectivement à
un (classe II) et deux atomes d'oxygène (classe III).
Nous
avons choisi
l'iodure de
sodium et le nitrate de
thallium de
préférence à
l'iodure de potassium et à l'acétate
de thallium.
En effet,
l'iodure de
potassium ne
permet
pas
,

---

- 73 -
d'élucider
les
variations
d'énergie
et
d'intensité
des
composantes du
signal C~s,
en
raison
de
la
présence
d'un
satellite à
287 ev
accompagnant la
raie K2p3 / 2 qui interfère
avec le massif du signal C~S.
Dans le cas de Tl+, la présence de l'ion acétate pourrait
éventuellement perturber la position et l'intensité relative du
signal
C~s,
malgré
la
faible
concentration
des
solutions
employées.
Les
variations des énergies de liaison de C1Bb, C1BC et
O~S ne
sont pas
significatives, puisqu'elles se trouvent dans
les limites des déviations standard correspondant à ces signaux
(Tableau XIVa, Figure 19a).
Nous avons évalué les rapports de concentrations atomiques
Tl/c et I/C à la surface du papier à l'aide de la relation:
lA = sA.NA
avec lA = aire de
la raie considérée
SA = coefficient de sensibilité (C 1B = 1 i 1 3d5 / 2 = 25 ;
T1 4f7 / 2 = 13, d'après le constructeur de l'appareil).
NA = concentration atomique de l'élément étudié.
Nous
avons utilisé
pour cette évaluation les aires des
raies C~Btota~,
1 3d5 / 2 et
T14f7/2. Nous
avons trouvé que les
rapports atomiques
Tl/c et I/c variaient linéairement avec les
concentrations en Tl+ et I- des solutions imprégnant le papier.
Ceci nous
indique que
la distribution superficielle des ions
Tl+ et I- est assez homogène sur le type de papier étudié.
b) Etude XPS du gel de sj]j.ce
Nous
avons étudié
l'effet de
l'imprégnation du gel de
silice
par
les
solutions
d'ions
lourds
(Tl+,
1-)
et
de
mercapto-6 purine sur la position du signal S~2p et des signaux
O~S, 1 3d5 / 2
et T1 4f7 / 2
(Tableau
XIVb.
et figure
19b).
Les
énergies de
liaison de S~2p et O~S ne varient pratiquement pas

---

TABLEAU
XIV
a
Energies de liaison photoélectroniques et rapports atomiques tirés des spectres
a
X PS du papier filtre
traité
.
h
Energies de liaison (eV)
Rapports atomIques
b
c
d
e
f
g
Solution déposée
C
C
o
l
Tl
I/C
Tl/c
Isb
Isb
Is
3d5/2
4f7/2
-i
286,8
288,5
532,9
NaI (lM)
286,8
288,3
533,1
619,0
2.10- 2
2
-."j
NaI (lM) + Théobromine
287
289
533,3
619,2
1,9.10-
.j:'-
10-3 M
-2
NaI (lM) + Mercapto-
286,8
533,1
619,0
5,3.10
-2
6 purine 10
M
-3
2
NaI (lM) + Caféïne 10
M
286,8
288,5
533,3
619,3
2,210-
-2
Tl+
(O,2M)
286,8
288,5
533,2
119,9
1,08.10
+
-2
Tl
(O,3M) + Mercapto-
286,6
288,2
532,9
120,1
0,88.10
-2
6 purine 10
M
a
Energies de liaison mesurée par rapport au pic C
à
285,0 eV
Isa
b
Volume utilisé
:
6
~ l
c
Photoélectron de C
de classe II
;
déviation standard:
0,1 -
0,2 eV
Is
d
Photoélectron de Clsde classe III
;
déviation standard:
0,2 -
0,4 eV
e
Déviation standard:
0,1 -
0,5 eV
-
f
Déviation standard:
0,1
-
0,2 eV
g
Déviation standard:
0,2 -
0,6 eV
-
h
Rapport d~ la surface du pic.èe l'élémeot considéré et de
celle du massif du pic du carbone
total,
normalisé pour les sensibilités respectives des réponses
des différents éléments. Moyenne des rapports atomiques calculés à partir de 2 à 3 essais.
i
Papier non traité.

---

~~~~
18
~1 BBB
tp.
1
48.8
, A.1
1989 B18211
MRIlJl
12.5
JI
.4A1lO.17.
1989
88
18.~
w. . . n
. . . . n
• •
...
1
818212
48.81
A', "
.
\\
ccu.. ltt iQnJ:6/38s
li' lB kYu 18 • .4
•
.y
tp.
15
1\\
/'1.
MRll31
r
Atcu.. ltt IQns:6/38s
32.8
1
2 • TL B,311
9.21
Anllrll , ;28 .y
Nt2 .TL B,311
24.8
• \\
1"
1
f i '
..
"es B
14611
Ch.
•
.y
286.6
41199
Ch b
5 9
tpS
16.81
J,.
J
' -
288.2
1488
Cls t
•
532.9
!I!l26
Oh
~
!
\\
8.8
,
....
'
" .
y I L o r a..,: 1.81.y
4.2
1
ILora.ur: 2.28.y
~, /
, 1 '
Chor •• : 5.44 Y
1
1
Chora. : 5.44 Y
a.a
- _ - - - - - -- - - - ' - -
li.... ;•• , p"
••5 '
li.... ;•• 1 ph
8.9
282.88
2114.88
286.88
288.88
29ll.88
292.88
S2B.88
S38.1lII
532.88
S34.1lII
53li.1lII
53B.88
En"ai. d. lioinn .y
En"ai. d. Il.inn .y
1" ' ,.~.
1 A i ~
..-J-.,.A
- . .
1
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10 A~
A
l
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...
.,A-." -.... •
~r
'\\Nï\\'Y.
V
·~·V~
j
......
VI
11~~4r'--------------------
1.fllfl.
1989 BI8213
JIB
MRll31
188.
/Il; lB kY 18 ...
An.lr1lUtl211 .y
87.4
Accu.. ltt iQns:6/38s
INt2 • TL B,311
]].9
.y
tp.
12B.1
153
T140/2
68.4
l.orl.ur 1 1.98 .y
'6.'1
IChora. : 5.44 Y
liss.bin. 1 pts
.H.4
19.9 1
~r.;'~i~'~'-'--i
~I
---.--,
116.58
119.1lII
121.58
124.1lII
126.58
129.88
En"ai. d. li.inn .y
1 en
•
V_~J.~\\J "Vï
V 1
~ J
'AA.-..
~v
..
"V*' ~
Figure 19a
Spectre
XPS
de
la
mercapto-6
purine
lO-2M +
TI+(O,3M) sur papier.

---

- 76 -
puisqu'elles
se
trouvent
dans
les
limites
des
déviations
standard correspondant à ces signaux (tableau XIVb.)
c) ComparaisoD des rapports atomiques sur papier et gel de
silice
Les
rapports atomiques IIC présentent des valeurs assez
voisines comprises
entre 2,OJO-2 et 2,6.10- 2 sur papier filtre
et
gel
de
silice,
ce
qui
montre
que
la
distribution
superficielle des
ions
iodure
sur
ces
deux
substrats
est
similaire. Le
dépot
simultané
de
solutions
de
purines
ne
modifie pas
sensiblement ce
rapport, sauf
dans le
cas de la
mercapto-6 purine
sur papier
qui provoque une augmentation de
ce rapport de 2.10- 2 à 5,7.10- 2 . Ceci nous permet de conclure à
l'absence d'interactions
importantes entre
les purines et les
ions
iodure
sur
la
couche
externe
des
substrats
qui
modifieraient la concentration superficielle de I-. Par contre,
la
mercepto-6
purine,
pour
laquelle
on
constate
une
augmentation significative
de IIC,
pourrait donner lieu à des
interactions du type liaison hydrogène combinant les groupes S-
Hf
les
ions iodure
ainsi que les groupes OH du papier ; il en
résulterait un
accroissement de la concentration superficielle
des ions
iodures sur
le papier. Ce résultat s'avère en accord
avec la plus grande rigidité des molécules de mercapto-6 purine
sur
papier
que
traduit
l'augmentation
du
signal
de
phosphorescence de
ce
composé
en
présence
d'ions
1-,
par
rapport au gel de silice.
Les valeurs des rapports atomiques TllC sont plus faibles
sur papier
que sur
gel de
silice (Tableau
XIVb.
), ce qui
indique que
la distribution
superficielle des
ions
Tl+
est
moins importante sur le premier substrat. Il en résulte que les
ions Tl+
se trouveraient
dans des
couches plus
profondes du
papier que
du
gel
de
silice.
D'autre
part,
ces
rapports
diminuent de
manière significative
sur les
deux substrats en
présence
de
mercapto-6
purine
(Tableau XIV a.b.).
L'augmentation de
la concentration
en profondeur des ions Tl+
sur papier
permet
de
confirmer
la
formation
de
CTC
TI+-
mercapto-6 purine qui avait été proposée précédemment (chapitre

---

TABLEAU
XIV
b
Energies de liaison photoélectroniques et rapports atomiques tirés des spectres
a
XPS du gel de silice traité
Energies de liaison
(eV)
.
h
Rapports atomlques
b
c
o
e
f
Solution déposée
d
Si2p
Tl
g
lSa
o lSb
I/c
Tllc
13d5/2
4f7/2
i
-
104,2
533,4
-2
1
Na.I
(lM)
104,1
531,4
533,4
619,8
2,6.10
..".
..".
N al
(lM)
+
-2
mercapto-6purine 10
M
103,6
531,2
533,0
619,2
-2
2,6.10
Tl+
-2
(O,3M)
104,0
533,1
120,1
8,3.10
Tl+
(O,3M)
+
mercapto-6purine 10-2M
104,0
533,3
120,0
-2
3,1.10
a
Energies de liaison mesurée par rapport au pic c
à
285,0 eV
15a
b
Volume utilisé
:
6 ul
c
Déviation standard
:
0,1 -
0,5 eV
d
Déviation standard
: 0,3 eV
e
Déviation st~ndard : 0,4 eV
f
Déviation standard :
0,6 eV
g
Déviation standard
:
0,1 eV
h
Voir note h du tableau XVIII a
i
Gel de silice non traité

---

cps
1~.~~
IAAR049. 8811
~~~1
~49.881
1989 178m
xl8
xIe
MR049
h
19119 118321
MR049
12.S
56.S
Ils 18 kV 18 lIA
IIG 18 kV 18 fIA
Anllritur:28 IV
Anllrllur:28 'V
49.5i
".51
r\\ f\\
IAcCUllUllt ilnl:4eel
GEL SJ02 IL8.3 -Stf'lJRJ
42.4
,V
Cpl
/ \\
ACCUlIIlllt 1ans, 4'39.
GEl. SJ02 IL8.]
-st-:-LAJ
/
B.'i
IV
cps
184.8
1212
5.2p
6.~
t..r ,eur: 2.48 ,V
~.~
CIIer"
: 1.64 V
t
128.8
389
11411/2
J
35.41
~/
Ilu.llln.l1ph
2.4
'fla
124.4
215
114fS/2
28.4
ft
1 L., "ur: 2.11 ,V
DIer"
: 1.64 V
21.4 1
a,,-J
, ,
, - --
11i...llln. Il ph
8.~
14.4 1
1
i
i
i
i
i
1
1911.58
1112.88
183.58
185.88
1&6.58
188.88
116.88
119.88
122.88
12S.88
128.88
131.88
En",I, d, IlolSln ,V
Entr,l, d, Il.han ,V
-..l
f ~;:::JC
~
-~
~
~~.~-vv-
~ ~
A
A
-
.~-
00
f ·.;.?V'V\\fl/..V/\\,A\\f~~~
7J~2 1
1
xIe
63.1
52.9
42.8
'V
Cpl
5.11.3
6119
Oh
l'J.7
t.",ur: 2.55 'V
21.6
CII.,,_ : 1.64 V
lIu.llln. 11 ph
12.5
2. .1
I_~-'
~~
-1
~ - - i
I i i
i
528.88
S3ll.88
532.88
534.88
536.88
s:Jl.88
En",l, de 1il lsan 'V
F • ~A•yqrv
l
-
d ' o r -
Figure 19b
Spectre
XPS
de
la
mercapto-6
purine
lO-:iM +
Tl+(O,3M) sur silice.

---

- 79 -
II, paragraphe
111-4.) pour
interpréter l'intensification
de
l'émission de
phosphorescence des
purines
constatée
sur
ce
substrat en présence d'ions TI+. Par contre, sur gel de silice,
la valeur
beaucoup plus
élevée du
rapport TIte
(3,1.10- 2 en
présence de
mercapto-6 purine)
indique que
les ions TI+ sont
déposés plus
superficiellement que les molécules de mercapto-6
purine, ce
qui défavorise
la formation
d'un complexe
sur ce
dernier substrat.
III-S. EFFET DU PH
Nous avons examiné l'effet du pH sur la RTP des purines
et pyrimidines
en vue
de préciser
les
conditions
optimales
d'application de la RTP.
a) Proprjétés spectrales
A l'exception
de l'uracil, du fluoro-5 uracil et de la
cytosine, toutes
les purines
et pyrimidines
étudiées donnent
des spectres de phosphorescence caractéristiques aux différents
pH employés (Tableau XV). Dans la plupart des cas, les spectres
ne varient
pas de
manière significative avec le pH du milieu.
Toutefois la
mercapto-6 purine
et le thio-2 uracil présentent
des déplacements
vers le
rouge
des
spectres
d'émission
en
passant respectivement
de pH
7 à
pH 1,6
et de
pH 13 à pH 7
(Figure 20).
b) Effet pH sur J'intensjté de phosphorescence
L'effet du
pH sur
le signal de phosphorescence dépend
de la
structure
du
composé
étudié
(Tableau
XVI)
(47).
A
l'exception de
l'uracil, du fluoro-5 uracil et de la cytosine,
les purines
et pyrimidines
phosphorescent en
milieu basique.
Par ailleurs,
la purine,
la chloro-6 purine, la guanine et la
thymine ne présentent aucun signal de phosphorescence en milieu
neutre et
acide, alors que l'adénine, la méthyl-6 purine et le
thio-2 uracil ne sont pas phosphorescents en milieu acide, mais
donnent
un
signal
en
milieu
neutre.
L'intensité
de
phosphorescence est
plus élevé
en milieu basique qu'en milieu

---

- 80 -
Tableau XV
Effet du pH sur les spectres de RTP des purines et
pyrimidines.
b
C
' a
ompose
pH
À
À
b
ex,nm
em,nm
Adenine
Neutre
(256),268,(275)
(395) ,415 ,430
NaOH( lM) c
(256),266,(275)
(398) ,416,430
Caféine e
Neutre
283
438
- -
HCl(O,lM)d
(269),278
440
NaOH(lM)
(269),280
435
Ch1oro-6 purine
NaOH( lM)
280
438
Guanine f
NaOH(lM)
(255),(268),280
435
Mercapto-6 purine
Neutre
255,340
465
HCl(O, lM)
255,335
475
NaOH(lM)
255, (265) ,317
465
Méthyl-6 purine
Neutre
267
438
NaOH(lM)
278
435
Purine
NaOH(lM)
278
437
Théobromine
Neutre
280
440
HCl(O, lM)
280
442
NaOH(lM)
280
440
Théophyllineg
Neutre
282
435
HCl( 0, lM)
275
435
NaOH(lM)
282
435
Thio-2 uraci1
Neutre
238,255,270,325
450
NaOH(lM)
(258),265,307
435
Thymine
NaOH(lM)
294
445
a Concentration 10- 3 sauf note contraire (KI = lM; Solvant = EtOH/HZ070/30 vo1/vo1~
b La longueur d'onde du maximum est soulignée et les À des épaulements sont mis
entre parenthèses.
Précision de
À
±
1 nm.
c Approximativement pH 13
d Approximativement pH 1,6
e Concentration 5.10-4M
f Concentration 1 x 10-4M;
g Concentration 5 x 10-4M en milieu neutre.

---

- 81 -
~,
1
,
1 \\
\\
1
1
\\
,
1
\\
1
\\
1
1
\\
,
\\
excitation
l
'
emlsslon
"
,
\\
l
'
1
1
1
\\
l
,
\\
1
l
,
\\
1
l
,
\\
1
1
\\
,
1
l
,
\\
1
1
\\
1
1
l
,
\\
1
l
,
\\
1
1
1
,
1
1
1
,
1
1
\\
1
1
1
\\
1
,
1
1
,
1
1
,
1
1
\\
1
:
1
.......-..
\\
1
1
::.
....
\\
1
1
,
1
1
1
\\
1
1
\\
1
1
\\
1
1
,
1
1
~.,.
,
1
\\
-
....
.... ., '"
.
1
1
1
,
1
1
1
1
~~
,
250
300
500
À(nm)
Figure 20
Effet du pH sur les spectres de RTP de La
rnercapto-6 purine.
----- basique (s x 0,1)
--neutre
(s x 0,5)
••••• acide
(s x 2)

---

- 82 -
acide
ou
neutre,
sauf
dans
le
cas
de
l'adénine,
de
la
théophylline et de la théobromine.
Bien que les constantes de dissociation dans l'état excité
triplet pKaT
des purines
varient entre
5 et 11,1 (6), seules
les espèces
anioniques peuvent
être présentes
à pH13
sur la
surface du
papier. Comme
les anions
possèdent des rendements
quantiques
de
phosphorescence
plus
élevés,
l'intensité
de
phosphorescence sera plus grande lorsque des solutions basiques
sont
déposées
sur
le
papier.
Des
interactions
polaires
importantes entre
les charges négatives des espèces anioniques
et les
groupes OH
du papier
pourraient expliquer cette forte
émission de
phosphorescence. L'effet
du pH sur l'intensité de
phosphorescence
varie
selon
la
structure
moléculaire
des
purines (histogramme
de la
figure 21
et tableau
XVI). Ainsi
l'adénine la
théophylline et
la
théobromine
s'avèrent
plus
sensibles que
la caféine
aux
variations
du
pH.
En
effet,
l'intensité
de
phosphorescence
de
ces
trois
composés
est
respectivement 48,9
; 17
et 37% plus faible en milieu basique
qu'en milieu neutre. Par contre, l'intensité de phosphorescence
de la caféine est exaltée de 92% à pH1 par rapport au pH~1.
Ces différences de comportement seraient dues aux écarts
de pKa
de ces
composés. Ainsi,
la caféine (pKa = 14 à l'état
fondamental) existe
de manière
prédominante sous forme neutre
dans
tout
le
domaine
de
pH
étudié.
Pour
l'adénine,
la
théophylline et
la théobromine (pKa à l'état fondamental: 9,8
; 8,7 et 10), les espèces neutres ou anioniques seraient seules
présentes sur
la surface
du papier
selon
le
pH
neutre
ou
basique. Les
intensités
phosphorescence
dépendent
donc
des
interactions spécifiques entre les formes neutres et anioniques
et le
substrat. Nos
conclusions sont
en accord
avec
celles
d'ANDINO et
al.
(2),
pour la
RTP de
la
caféine
et
de
la
théophylline
adsorbées
sur
des
papiers
filtres
W-1
et
échangeurs d'anions DE81.
Dans
le cas
de la
mercapto-6 purine,
l'intensité
de
phosphorescence est
exaltée de 80 à 500 fois en milieu basique
par rapport
aux pH
neutre et
acide (tableau XVI). Nous avons

---

- 83 -
Tableau XVI
Effet du pH sur l'intensité de RTP de purines et pyrimidines.
~a
a
b
Compose
pH
I
l
/1
c
RT,:>
nette
pH
pH 13
Adénine
neutre
96
2,0
f
acide
NP
-
basique
47
l,a
e
Caféine
neutre
632
0,92
acide
418
0,6
basique
686
l,a
Chloro-6 purine
neutre
NP
-
acide
NP
-
basique
80
1,0
d
Guanine
neutre
NP
-
acide
NP
-
basique
8
l,a
Mercapto-6 purine
neutre
38
0,01
acide
6
0,002
e
basique
2998
1, a
Méthyl-6 purine
neutre
7
0,03
acide
NP
-
basique
210
l, a
Purine
neutre
NP
-
acide
NP
-
basique
137
l, a
d
Théobromine
neutre
668
2,7
acide
266
1, 1
basique
246
1,0
Théophylline
neutre
411 e
5,9
acide
164
2,3
basique
70
l,a

---

- 84 -
Thio-2 uracil
neutre
1
0,01
acide
NP
-
basique
85
1,0
Thymine
neutre
NP
-
acide
NP
-
basique
41
1,0
a Mêmes conditions que dans le tableau xv.
b I
nette normalisée par rapport à l'intensité du thio-2 uracil.
RTP
c l
II
intensité en milieu neutre ou acide relative à celle en milieu
pH
pH 13
basique (pH 13).
d Concentration : 1 x 10-4M•
e Filtre de densité neutre (10%) utilisé.
f NP : pas de phsophorescence.

---

- 85 -
)000
.~
l,.
,.1
~
~
......
......
100
......
ADENINE
CAFFEINE
M~ll.,""rïO ~
THEOBROMINE
THEI1'HYLLINE
_&f'I.'ll.'Né
~
~
......
~
~
......
......
.......
100
.......
.......
......
~
~
8
.......
ro;;;
......
N
N
~
.......
~
......
~
~
0
~
~
1-..
~
1-..
~
....
~
"
~
"
~
A
"
~
1-..
"
'"
400
'"
N
1-..
~
l-
I-..
~
1-..
~
1-..
~
1-..
~
1-..
~
~
A
"
~
8
"
~
200
"
o.
.......
:ro:::
"
.......
......
"
.......
......
A
1-..
.......
......
"
.......
......
.,
......
.......
;~
......
":;
0'
N
......
.......
......
-
......
.......
......
.~.
;(
8
....
......
00.
......
!
8
0'
1-..
N
~
....
ro;;;
1"-
00
A
~ ~':'
'"
" A
~
i
"
r--.
'"
l"-
L -
0"
-
"
Figure 21
Histogramme
des
intensités
de
phosphorescence à
température ambiante de purines à différents pH.
N = Neutre, B = Basique, A = Acide.

---

- 86 -
attribué
cette
augmentation
considérable
du
signal
à
la
formation d'un
dianion résultant de la déprotonation successive
des groupements mercapto et N-7H en milieu neutre et faiblement
basique. Des interactions fortes
(du type liaison hydrogène) se
produiraient alors
entre la double charge négative de l'espèce
dianionique et
les groupements
OH de la cellulose, augmentant
la rigidité des molécules à la surface du papier.
L'intensité
de phosphorescence
de la
caféine,
la
théophylline, la
théobromine et la mercapto-6 purine en milieu
acide ne
représente respectivement
que 66% ; 39,9% ; 39,8% et
16% de
celle en
milieu neutre.
La protonation de ces purines
diminuerait les interactions substrat-molécule adsorbée, ce qui
réduirait de
manière significative
l'intensité d'émission. Le
rendement quantique
de RTP des espèces protonées pourrait être
aussi plus
faible que celui des espèces neutres. ANDINO et al.
(2) ont
trouvé que
la caféine et la théophylline ne donnaient
pas de
signal de
phosphorescence en
milieu acide, sur papier
filtre W-1,
mais étaient phosphorescentes sur les papiers DE81
et PB1.
Ces différences
de
comportement
selon
le
substrat
seraient dues
soit à la neutralisation de l'acidité du solvant
en présence
des groupes
hydroxyles de
la cellulose,
soit
à
l'effet du
type de
papier sur
la protonation
des
molécules
organiques et/ou des sites actifs de la cellulose (2).
III-G. PERFORMANCES ANALYTIQUES
Nous avons évalué les performances analytiques de la RTP
et leur
variation avec l'ion lourd et le pH (Tableau XVII). La
limite de
détection (L.D.)
se définit
comme la concentration
(ou la
masse) de produit donnant un rapport signal/bruit (S/B)
égal à
3. Les valeurs de L.D. dépendent du rendement quantique
de phosphorescence
du composé étudié et des fluctuations de la
phosphorescence résiduelle
du solvant.
Pour
la
plupart
des
purines les
L.D. sont
plus faibles en présence de TI+ qu'avec
1- (Tableau
XVII ). Toutefois,
la caféine, la théophylline et
la
théobromine
présentent
un
comportement
inverse.
Ces
résultats sont
en accord
avec la
différence d'effet des ions

---

- 87 -
a
Tableau XVII
Caractéristiques analytiques de phosphorescence
.
b
c
d
Ion
Doma1ne de
Coefficient
Limite de
Composé
Pente
de
détection
lourd
linéarité
corrélation
( ng)
Adenine
100
0,98
0,991
3,2
200
0,83
0,996
0,6
Caféine
800
0,90
0,991
0,75
400
0,70
0,992
1,4
Purine
n+
10 3
0,91
0,997
0,4
Chloro-6 purine
0,70
0,994
3,25
0,87
0,994
0,4
l
80
0,80
0,980
4,8
Méthyl-6 purine
r+NaOH
330
0,71
0,993
0,24
Mercapto-6 purine
n+
1400
1,07
0,998
0,012
r
550
0,84
0,993
1,2
r+NaOH
150
1,3
0,999
0,047
Théophylline
r
200
1,10
0,998
1,6
n+
30
0,98
0,999
19
Théobromine
r
10 3
0,96
0,997
0,5
n+
1000
0,74
0,996
0,6
Thio-2 uracil
n+
1660
0,88
0,998
0,23
I-
10
1,48
0,975
38
r+NaOH
25
1,23
0,996
15
a Solvant : éthanol-eau 70/30 vol/vol ; papier filtre W-40.
b Correspond à la partie linéaire de la courbe détalonnage log-log.
c Calculé à partir de la courbe de calibration log-log.
d Voir définition dans le texte (volume échantillon = 3 ~l).

---

- 88 -
lourds sur
l'intensité de phosphorescence de ces composés. Les
valeurs des
L.D sont en général très basses, de l'ordre de 400
pg à
3~ ng selon les composés.
Elles sont plus faibles en milieu basique (entre 400 pg et
15 ng) qu'en milieu neutre (entre 1 et 38 ng), ce qui est aussi
en accord
avec la
variation de l'intensité de phosphorescence
en fonction
du pH
(47). Les
valeurs de
L.D que
nous
avons
obtenues en
présence de
Tl..... pour
l'adénine (° 6
'hg)
et
la
/
chloro-6 purine
(3 ng)
sont environra10 fois
plus basses que
celles évaluées
par VODINH et al.
(26) en présence d'iodure de
potassium (4,1
et 31
ng respectivement). De même, nos valeurs
de L.D
de 400 pg et 1,2 ng pour la mercapto-6 purine en milieu
basique
et
neutre
s'avèrent
de
cinq
à
dix
sept
fois
respectivement plus
bas que
celles trouvées
par AL-MOSAWI et
al.
(30)
sur couche
mince de
cellulose. Nos
valeurs de
L.D
déterminées par
RTP sont
nettement
plus
basses
que
celles
obtenues par
détection fluorimétrique
de la mercapto-6 purine
(2 ng/ml
et 10
ng/ml respectivement dans le plasma et dans le
sérum (98,99).
Les L.D.
spectrophotométriques de l'adénine et
de ses dérivés (100 ng)
(100) sont plus élevées que les notres.
La sensibilité particulièrement élevée de la RTP se trouve
donc confirmée pour les purines et les pyrimidines.
Le
domaine
de
linéarité
des
courbes
d'étalonnage
phosphorimétriques s'étend
sur une
assez large
gamme de 10 à
10 3 unités de concentration selon le composé, l'ion lourd et le
pH (Tableau XVII, figure 22).
Les
pentes des
courbes sont voisines de l'unité et les
coefficients de
corrélation supérieurs
à
0,97
dans tous
les
cas, ce
qui indique
une
bonne
linéarité
et
une
précision
satisfaisante des courbes d'étalonnage.

---

- 39 -
log I p
a)
2
o
_1 '-:-_ _---JL-_ _--'L-
L . -
_ _
·6
-5
-4
-3
log c (M)
/
2
6/
b)
Q.
-
/
Cl
.2
o
o
/
/ 1
-1
/ /
-2 ':----~---L----L-_~
~
-5
-4
-3
log C (M)
Figure 22
Courbes de calibration log I p
en fonction de log C
a) chloro-6 purine • pb2+
b) thio-2 uracil
o I- + NaOH
X I-

---

- 90 -
111-7. PHOSPHORIHETRIE
SYNCHRONE
A
TEMPERATURE
AMBIANTE:
ANALYSE DE PURINES ET
DE PYRIMIDINES DANS DES
PRODUITS
PHARMACEUTIQUES
Il s'avère en général difficile d'identifier des
mélanges
à
l'aide
de
leur
spectre
de
phosphorescence
classique.
L'application de
la spectroscopie
synchrone à la RTP a permis
d'améliorer considérablement ce type d'identification (89, 91).
Nous
avons évalué
l'efficacité de cette technique pour
l'analyse de mélanges de purines, de pyrimidines et de produits
pharmaceutiques comme
la cardiophylline,
la prontalgine et le
théolair . Ces
médicaments, qui
sont très
utilisés
dans
le
traitement
de
l'asthme
et
les
maladies
cardiovasculaires,
contiennent comme principale substance active des purines.
Nous avons donné dans le tableauXVIII les caractéristiques
des spectres
RTP synchrones
des
composés
étudiés,
de
leurs
mélanges et de substances pharmaceutiques testées. Les spectres
synchrones des mélanges de purines et de pyrimidines comportent
en général
plusieurs pics bien résolus que l'on peut attribuer
avec
une
précision
satisfaisante
à
chacun
de
leurs
constituants, en
comparant leurs longueurs d'onde à celles des
spectres synchrones
des composés
purs (Figures
23-25).
Nous
avons sélectionné des valeurs de6À
variant entre 120 et 170 nm
selon les maxima d'excitation et d'émission de phosphoresc~nce.
Dans
le cas
des
substances
pharmaceutiques
testées,
(cardiophylline,
prontalgine,
théolair),
les
spectres
synchrones présentent
des maxima
à des
longueurs d'onde très
proches de
celles des composés purs, bien que l'on constate la
présence
de
quelques
pics
supplémentaires
de
plus
faible
intensité
qui
pourraient
être
dus
à
la
contamination
de
l'excipient par
des impuretés
(Tableau XVIII,Figure 26). Ainsi
nous avons
pu identifier
dans le
cas de la cardiophylline la
présence
d'adénosine
et
d'aminophylline,
en
comparant
le
spectre synchrone du médicament à ceux des composés purs (Figure
27).

---

- 91 -
TABLEAU
XVIII
Spectres synchrones RTP de mélanges de purines
et pyrimidines et de médicaments.
a
Spectres RTP normal
Spectres synchronesa,b
'
c
C omposes
Àex
(nm)
Àem (nm)
6.À
(nm )
À ex
(nm)
d
Produits purs
Adénine
(256)
;
266
;
415
430
140
277
j
- -
- -
- -
275
- -
caféine
(257);(270);
438
160
280
- -
280
- -
Mercapto-6purine
255 ;
265;
318
465
- -
160
317
- -
Théobromine
237;
255;
440
160
(257);
280
- -
(270) ;
280
Thio-2 uracil
278;
325
443
120
325
- -
- -
Ami nophy 11 i ne
(242);(264);
435
150
282
- -
280
- -
160
280
- -
170
(245);(262);
275
- -
Adénosine
(250);260;
(395) ;415.435
150
- - 1 - -
(245);262.270
- ) -
(272)
160
260;
270
170
( 248) ; 261. ( 270 )
-~J
e
Mélanges
Mercapto-6purine+eaféine
237;255; (270);
463
150
288;
317
- -
280;319.
237;255; (270); 440
160
280;
315
280.319
- -
- - 1
Mercapto-6purine+Théobro-
255;(270);282;318
463
150
(255) ; 285; 317
mine
255; ( 270) ; 282; 318
445
160
(257);280;315.
Thio-2uracil+Adénine
270;
326
443
120
280 ;
325
Thio-2uracil+ Méthyl-
278;
325
443
120
297
;
323
- -
- -
- -
6 purine

---

- 92 -
TABLEAU .XVI l l
(Suite)
Médicaments
prontalgine f
242;(260);(274)
440
150
282
282
160
170
(245);(260);(27
282)
g
Théolair
241;259;272;
438
150
( 248) ; (260) ; 283.
284
h
cardiophylline
243;262; (275);
438
150
245) ; (261) ; 284
284
160
247) ; ( 263) ; 273; 2.§.
170
~; 262;273
Cardiophylline +
242;259; (273);
150
248);(260);(275);
- -
465
285).;(310)
Mercapto-6purine
(284) ;310
160
245;260;273;282.
b42; 259; (273);
440
F - = - - - J
~
284); 310
170
~i 260; 272.283;
~
prontalgine+Mercapto-
242;(260);(274)
465
150
282. 320
- / -
6 purine
282;320
160
(245);(260);282.
- - 7
242;(260);(274);
440
31S
282; 220
170
(245");(260);(275)
282. 313
- " ) -
Théolair+Mercapto-
242;259;273;
465
242. 260;284. 310
- : 1 - - 1 -
6 purine
285;310
160
24S.2GÜ;(275);283
- J -
-
242; 259; 273;
440
310.
225; 3lG
170
45.2fC'i 272 j2Û3;3C

---

- 93 -
TABLEAU
XVIII
(Suite)
a
Longueurs d'onde du pic principal soulignées.
Longueurs d'onde des
épaulements entre parenthèses.
Précision des valeurs ~lnm
b
Àex
À em
+
!).À
où f::.À
est un intervalle constant
de longueur d'onde entre les maxima
d'excitation et d'émission
c
En présence de KI
(ln
sauf:
thio-2 uracil/Tl+
(thio-2 uracil +
Adénine)
/
Tlj (thio-2 uracil + méthyl-6 purine)
/
Tl+
3
-4
d
Concentrations
10 -
M sauf
: mercapto-6 purine
10
M
méthyl-
3
6 purine : 10-4 M ; thio -
2 uracil
:
10 -4 M ; aminophylline :
2 X 10- 1
5
adénosine
:
4 X 10-
M.
e
Mêmes concentrations que celles de la note b,
sauf
mercapto-6 purine
5
5 X lë M
f
Comprimé contenant 50 mg de caféine dissout
dans 100 ml du mélange
EtOH-H 0
(équivalent à 2 X 10-3 M).
2
g
Comprimé contenant 175 mg de théophylline dissout dans 100 ml du
mélange EtOH -
H 0
(équivalent à 10-2 M).
2
h
Comprimé contenant 0,100 g d'aminophylline et 0,001 g d'adénosine
dissous dans 100 ml du mélange EtOH-H
(équivalent respective-
20
ment à 2,~10 -3 M et 4~0-5 M).

---

- 94 -
.. 3
...-2
I p
250
300
400 À(nm)
Figure 23
Spectre
RTP
synchrone
de
l'adénine,
du
thio-2
uracil et de leur mélange (1:>). = 110 nm)
1
Adénine ( 10- 3 M)
2
thio-2 uracil (5.10- 4 M)
3 : Adé~ne + thio-2 uracil

---

- 95 -
lp
200
À(nm) 400
Figure 24
Spectre
RTP
synchrone de la mercapto-6 purine, de
la caféine et de leur mélange (à,), = 150 nm)
1 : caféine (10-3M)
2
mercapto-6 purine (lO-4M)
3 : rnercapto-6 purine + caféine

---

- 96 -
I p
200
300
400
À(nm)
Figure 25
Spectres RTP synchrone de
la mercapto-6 purine, de
la théobromine
et
de
leur
mélange (~). = 150 nm)
1
mercapto-6 purine (lO-4M)
2
théobromine (10- 3 M)
3 : mercapto-6 purine + théobromine

---

- 97 -
250
300
À(nm)
Figure 26 : Spectre
RTP
synchrone du théolair mélangé avec la
mercapto-6 purine (b,À = 160 nm)
1
mercapto-6 purine (S.lO-SM)
2
théolair (10-2M)
3 : mercap~6 purine + théolair

---

- 98 -
262
250
300
, \\ (nm)
Figure 27
Spectre
RTP
synchrone de
la cardiophylline et de
ses composants (~~ = 179 nm)
1
Adénosine (10- 3 M)
2
Cardiophylline (10- 3 M)
3
AMinophylline (2,2.10- 3 M)

---

- 99 -
Pouré~udier
l'effet d'un composé très phosphorescent
sur le spectre synchrone des médicaments, nous avons mélangé de
la mercapto-6
purine (SI0- S M)
avec les
solutions de composés
pharmaceutiques déposés
sur le
papier. Dans
ces
conditions,
nous n'avons
pas observé
de déplacement significatif des pics
synchrones attribués
aux
divers
composants
des
médicaments
(Figure 26,
28, 29).
Nous pouvons en conclure que la présence
d'un
composé
additif
très
phosphorescent
ne
perturbe
pratiquement pas
l'identification
par
RTP
(synchrone
d'une
substance pharmaceutique.
En
vue d'examiner
si la
RTP synchrone
pourrait
être
appliquée au contrôle de la qualité des médicaments, nous avons
effectué
une
étude
quantitative
sur
les
comprimés
pharmaceutiques
dont
nous
disposions.
En
comparant
les
intensités synchrones de phosphorescence des ingrédients actifs
des médicaments
à celles
des courbes détalonnage des composés
purs, nous
avons
déterminé
les
concentrations
de
composés
actifs dans les solutions médicamenteuses. Nous en avons déduit
les taux
de récupération qui s'élèvent à 91% (caféine) pour la
prontalgine et à 85% (théophylline) pour le théolair.
Nous pouvons déduire de nos résultats que la spectroscopie
RTP synchrone
est une
méthode qui
permet
d'identifier
sans
ambiguïté les
composants de mélanges binaires de purines et de
pyrimidines, alors
que la
RTP classique
ne permet
pas cette
attribution. Par
ailleurs, la RTP synchrone peut s'appliquer à
l'identification
et
à
l'analyse
quantitative
de
produits
pharmaceutiques.

---

-
100 -
..ci)
.'
0 ...
CD.
250
300
350
Figure 28
Spectre
RTP synchrone
de la
prontalgine mélangée
avec la mercapto-6 purine (~~ = 170 nm)
1
mercapto-6 purine (S.IO-SM)
2
prontalgine (2.10- 3 M)
3
mercapto-6 purine + prontalgine.

---

-
101
-
250
300
350
1\\ (nm)
Figure 29
Spectre
RTP synchrone de la cardllphylline mélangée
avec la mercapto-6 purine (~~ = 170 nm)
1
mercapto-6 purine (S. la-SM)
2
cardiophylline (2,2.l0- 2 M)
3
mercapto-6 purine + card~hylline.

---

CHAPITRE
III
ETUDE ANALYTIQUE DE MELANGES DE PURINES ET PYRIMIDINES
PAR SPECTROMETRIE DERIVEE

---

- 102 -
1- PRINCIPE
1-1. GENERALITES
Il
s'avère généralement
très difficile
d'appliquer la
spectrométrie UV
ou de luminescence à l'analyse qualitative et
quantitative
de
mélanges
de
composés
possédant
des
caractéristiques
spectrales
très
proches.
Toutefois,
la
dérivation de
ces spectres permet de réduire les interférences
spectrales,
d'augmenter
la
sensibilité
de
détection
et
d'analyser
des
mélanges
complexes.
Cette
technique
spectrométrique consiste
à différencier
l'absorbance
(A)
ou
l'intensité de
luminescence (IL)
en fonction
de la
longueur
d'onde (À).
L'étude
qualitative
des
spectres
s'en
trouve
améliorée grâce
à la
résolution des bandes d'absorption ou de
luminescence en
plusieurs maxima
ou minima, de structure plus
fine
suivant
l'ordre
de
la
dérivée,
ce
qui
augmente
la
sélectivité de la méthode.
La
dérivée
d'un
spectre
d'absorption
s'obtient
en
différenciant l'absorbance
par rapport
à la
longueur d'onde.
Les expressions
dA/dÀ,
d 2 A/d À2
• • • • •
dn.A/d Àn.
correspondent
respectivement aux dérivées de 1er, 2nd, .... nième ordre.
Le
maximum de la bande d'absorption normale (ou dérivée
d'ordre zéro)
correspond à
une valeur
nulle de
la courbe de
dérivée première.
Les points
d'inflexion du
spectre
d'ordre
zéro correspondent
à des
maxima et
minima du spectre dérivée
première (figure
30). Par
ailleurs, le
maximum de
la
bande
d'absorption d'ordre
zéro équivaut
à un
minimum de la courbe
dérivée seconde, laquelle s'annule aux points d'inflexion de la
courbe d'absorption
normale.
Les
amplitudes
Yn
des
bandes
gaussienne et
lorentzienne des spectres dérivés d'ordre n sont
inversement proportionnelles
à la
largeur wn.
de
ces
bandes
( 29 ) :
Yn. a w-n.
Il en
résulte que les bandes deviennent plus étroites et mieux
résolues lorsque
l'ordre n
augmente. Les
bandes des spectres

---

- 103 -
A
À(nm)
dA.,.<
~I\\
À (nm)
À(nm)
Figure 30
Spectre
d'absorption
d'ordre
zéro
(A)
et
ses
dérivées première (dA/d~) et seconde (d2A/d~2).

---

- 104 -
dérivée seconde
seront donc plus fines et plus structurées que
celles des spectres d'ordre un.
1-2. PROCEDURES
L'identification des différents composants d'un mélange,
se fait
sur la
base de
la comparaison
directe des longueurs
d'onde des maxima et des minima des spectres dérivés, ainsi que
sur les séquences des amplitudes relatives des différents pics.
On
peut effectuer
la
détermination
quantitative
des
composés selon plusieurs procédures (49a, 51, 103, 104)
:
- La
procédure tangentielle (Dt) consiste à tracer une tangente
commune à deux maxima ou minima, et de mesurer la distance Dt
de
la
valeur extrême
intermédiaire, parallèle
à l'axe des
absorbances.
- La
procédure
"pic à pic" (DI'»
basée
sur
la
mesure de la
distance Op entre deux valeurs extrêmes
(maxima ou
minima),
est la plus utilisée.
- La
méthode de mesure d'un pic par rapport à la ligne de base
(Oz>, qui consiste à évaluer la distance verticale Oz d'un pic
à la ligne de base.
Des
exemples illustrent l'application de chacune de ces
méthodes au spectre dérivée seconde de la caféine (figure 31).
1-3. IDENTIFICATION DES MELANGES
La
dérivation
des
spectres
de
fluorescence
et
de
phosphorescence à
température ambiante
a permis
d'identifier
sans
équivoque
plusieurs
mélanges
binaires
d'hydrocarbures
aromatiques (49b,
50a-b,
105)
comprenant
le
naphtol-l,
le
naphtol-2,
le
pyrène,
l'anthracène
et
le
napthalène.
Des
limites
de
détection
de
0,67
à 3 4
ng
ont
été
trouvées
respectivement pour
le pyrène
et le napthalène (105). De plus
cette technique dérivée réduit la phosphorescence résiduelle du
solvant parfois
génante pour l'interprétation des spectres des
produits peu phosphorescents.

---

- 105 -
+
- - - - ---,-
1'\\
1
1
1
1
1
1
1
01-----
1
250
300
À(nm)
Figure 31
Procédures
d'évaluation
de
l'amplitude (d 2 A/dÀ2 )
dans
le
cas
du
spectre
dérivée
seconde
de la
caféine.
Oz.
méthode de mesure "pic-ligne de base"
Dt
méthode tangentielle
Op
méthode de mesure "pic-pic).

---

- 106 -
1-4. - APPLICATIONS
La
spectrométrie UV dérivée a été appliquée à l'analyse
des purines
et pyrimidines
par notre
laboratoire et d'autres
groupes de
recherche (28,29,52,5G,57). Ces composés présentent
des bandes
d'absorption larges
à des
longueurs
d'onde
très
proches;
leur identification
s'avère alors
très difficile à
partir des spectres normaux d'absorption et de luminescence.
Quelques
applications de
la spectrométrie dérivée sont
connues en
chromatographie (lOG)
et en analyse pharmaceutique
(54,55). L'amélioration
de la résolution spectrale a permis de
déterminer la
pureté de
certains produits
par CLHP (lOG). En
effet, i l
est possible,
en se
plaçant à
une longueur d'onde
sélectionnée d'obtenir une valeur nulle pour le signal dA/dÀ de
l'un des
composés d'un
mélange et
de
n'enregistrer
que
le
signal de
l'autre composé
(correspondant à
un maximum
ou un
minimum). Ainsi, on détectera sélectivement l'un des composants
d'un mélange
lorsque
deux
composés
possèdant
des
spectres
d'absorption d'ordre zéro sont co-éluéS(10G).
Par ailleurs, des résultats satisfaisants ont été obtenus
en utilisant
la
spectrométrie
UV
dérivée
seconde
pour
le
contrôle de
la
qualité
des
composés
pharmaceutiques
comme
l'acide salicylique
contenu dans
l'aspirine (55) ou certaines
drogues telles que l'héroïne et la morphine (54).
11- PARTI E EXpER TMENTAT,E
11-1. PRODUITS
Nous
avons étudié
les spectres
UV dérivée
des
mêmes
composés que
précédemment (chapitre
II paragraphe II.1) et de
leurs mélanges.
Nous
avons
préparé
par
dilutions
successives,
des
solutions aqueuses
de purines,
de
pyrimidines
et
de
leurs
mélanges (concentration: 5 x 10- 6 à 5 x 10- 4 M).

---

- 107 -
11-2. INSTRUMENTATION
Les
spectres
d'absorption
UV
d'ordre
zéro,
dérivée
première et
seconde ont été déterminés à 298K entre 200 et 400
nm, à
l'aide d'un spectrophotomètre UV visible Beckman, modèle
3600, muni de l'accessoire de dérivation série 30.
Les solutions ont été placées dans des cuvettes
de quartz
(1 cm2
de section).
Les vitesses
de balayage
des
longueurs
d'onde et
d'enregistrement des spectres étaient respectivement
de 100
nm/min. et
13 cm/min.
Pour les spectres dérivés, nous
avons utilisé
des sensibilités
de l,
30, 100 ou 200 selon la
concentration de la solution.
Nous avons employé un micro-ordinateur Apple-2 équipé d'un
enregistreur graphique
pour le
stockage et
le traitement des
données spectrales.
11-3. - PROCEDURE D'INFORMATISATION
Pour
le traitement
informatisé des données spectrales,
nous avons
mémorisé sur
disquette les
spectres
d'absorption
dérivés d'ordre
deux des
composés purs
et ceux des mélanges.
Nous avons établi trois progra~nes pour identifier les spectres
dérivés (57).
Le programme numéro 1 d'identification par spectrométrie
dérivée
:
DESPI-1
(de
l'anglais
dérivative
spectrometry
identification) permet d'identifier les bandes caractéristiques
(maxima, minima,
épaulement) du
spectre dérivé
d'ordre
deux
d'un mélange
et de
les comparer
automatiquement à celles des
composés purs,
qui sont
stockées dans
le
micro -ordinateur.
L'identification n'est
considérée comme
acceptable que si les
valeurs d 2 A/d À2 des
composants
du
mélange
correspondent
à
celles des
produits purs,
dans les
limites
de
la
zone
de
tolérance (TOLA)
admise. Cette
zone de
tolérance est définie
comme la
zone d'incertitude
encadrant le
profil des spectres
dérivés (figure 32).

---

- 108 -
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1
J
I,
ft
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+
1
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.
350
Àlnm)
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0 200'1
1
1
1 1
1 1
1
1
\\;
..
\\~:.""" ..'
, . . . .
, ';:::
'. '
\\ :J :
. . :
, .
.'
Figure 32
Comparaison
des
spectres
UV
dérivées
secondes
expérimentaux et par micro-ordinateur d'un mélange
adénine-cytosine (1:9)
courbe A
spectre dérivé obtenu à partir
du progranune 1.
-- - - - courbe B
spectre expérimental
: '. '. '. '. '.: exemple de la zone de tolérance (TOLA).

---

- 109 -
Le programme DE5PI-2 est basé sur la détection de tous les
composants possibles
d'un mélange dans un domaine déterminé de
longueur d'onde
et dans
les limites
de la
zone de tolérance
(TOLA) définie.
Pour cela,
on compare
les valeurs d 2A/dÀ2 du
mélange et
celles des
composés purs
de la banque de données,
avec des
valeurs décroissantes de TOLA i le nombre de composés
possibles
diminue
progressivement
jusqu'à
atteindre
la
composition correcte du mélange binaire étudié.
Dans
le DESPI-3,
la procédure
est analogue,
mais les
composés possibles sont classés selon la fréquence d'apparition
des
'O'aleurs
d 2 AId À 2
dans
le
domaine
de
longueur
d'onde
préalablement choisi.
111- RESULTATS EXPERIMENTAUX
II 1. 1. SPECTRE
D'ABSORPTION
UV D'ORDRE
ZERO, UR ET
DEUX
DB
PURINES, PYRIMIDINES ET DE LEURS MELANGES BINAIRES
Nous
avons rassemblé
dans le tableau XIX les longueurs
d'onde caractéristiques
des spectres
UV d'ordre
zéro, un
et
deux
d'une
série
de
purines
et
pyrimidines. Ces
composés
présentent en
général une
seule bande d'absorption large et à
des longueurs
d'onde voisines, ce qui rend leur identification
impossible par
cette méthode
(figure 33-35).
Par contre, les
spectres de dérivée première présentent plusieurs maxima et des
minima à
des valeurs
différentes de
longueur d'onde,
ce qui
permet d'identifier
certains composés
comme
la
caféine,
la
purine, le méthyl-6 purine et la cytosine.
Cependant,
cette identification
n'est pas applicable à
toutes les purines et pyrimidines étudiées. On doit avoir alors
recours aux
spectres de
dérivée seconde,
qui donnent un plus
grand nombre
de composantes
spectrales que
les précédents et
fournissent une identification plus fiable (29).
Nous avons évalué l'efficacité de cette procédure dans le
cas de
mélanges binaires
de purines et pyrimidines (56). Nous
avons
sélectionné
l'adénine
et
la
purine
pour
une
étude
détaillée. L'adénine
et la
purine possèdent
une seule
bande

---

- 110 -
TABLEAU XIX
Spectres UV d'ordre zéro,
un et deux de purines
4
et pyrimidines
(10- M) en solution aqueuse.
Longueurs d'onde
(nm)a
Composé
Ordre zéro
Dérivée première
Dérivée seconde
Adénine
260
271 ; (266);
246.
282.273; 267;
260;
(245)
- -
--"'--
(238);
(234);
(230);215.
-- --')
205
Caféine
272
284 ;(261);
(258)
;
29l. 271 ; 243.
230;
216;
- -
- -
- - J
(256);
234.
202.
Purine
262
(275);
270;
253;
278.
272;
(265);
261;
- -
- - )
--
(234);
203.
247 ; (226);
(211);
208;
--
( 205 ) .
Méthyl-6 purine
261
(273);
269;
252;
277;
270 ; (.264);
260;
- -
(239);
(232).
248;
( 230) ; 210.
- -
Théophylline
271
283.
256;
232.
289;
269;
242.
227 ; 215.
- -
- - 1
- -
- - ; J
--
Théobromine
272
284.
258;
232.208.
~; 272; 242, 229; 218
- -
- - /
- - ) - -
- -
212.
- -
Guanine
274.
245
286.
266;
252.
232;
290 ; 276;
256 ; 242;
220.
- - " /
- -
- - )
- - 1
--
- -
- -
204
Iodo-6 purine
275
288.
263;
250;
241 ;
291-
281;
272;
258 ; 218;
- -
- - }
- - 1
- -
214.
208.
--
Cytosine
267
282.
256;
225.
213.
285 ; 267;
245: 216.202.
--
- - 1
- - )
- - /
--;1--
201.
--
Thymine
264
277.
248:
218.
289:
286;
265;
227,210.
- -
- - )
- -
Uracil
258
272.
244;
212.
279;
258;
222;(217);
205.
- -
- - )
- -
Acide urique
285
298.
272;
244.
222:
306; (299): 286;252. 231 ;
- -
- -J
- - )
- ; ;
204.
210;
(208) ; (206) •
- -
a Longueurs d'onde des maxima souliqnée~ épaulements entre parenthèses. Les
autres longueurs d'onde corresponaent aux minima.

---

- 111 -
A
1
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CD :\\
CD
: '
l
'
l
,
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l
,
l
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1
A
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l!! \\
\\
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\\
\\
/
\\
\\./
,
\\
\\'-
200
250
300
Figure 33
Spectre
d'absorption
d'ordre zéro, un
et deux du
mélange Adénine {A):2.10- s M + Purine {P):8.10- s M.

---

- 112 -
A
(1))
+
o -
0.5
T
-
200
250
300
À(nm)
Figure 34 : Spectre
d'absorption
d'ordre
zéro, un et deux du
mélange
Cytosine
(C)
:
S.lO-sM
+
Thymine (T)
:
S.lO-sM.

---

-
113 -
~~G)l
dÀ
d Y M P
t~l Ir ~ P
yCAF
A
1
,
((D)
,
1
,
1
+
\\
MP
o
,
\\
\\
\\
1-/ CAF\\
-
~",-j TMP \\
CAf"+MP
\\
\\\\~
200=-----------:2~5~0-------3...L.- ---l.~ 0
0O
À(nm)
Figure 35 : Spectre
d'absorption
d'ordre
zéro, un et deux du
mélange caféine (CAF)
: S.lO-SM
+
méthyl-6 purine
(MP)
:
5.l0- s M.

---

- 114 -
d'absorption large
vers 260-262
nm. Le
spectre d'ordre un de
l'adénine présente
un maximum à 271 nm et un minimum à 246 nm,
alors que
celui de la purine
possède deux maxima à 270 et 203
nm, des
épaulements à
275 et
234 nm
et un
minimum à 253 nm
(Tableau XIX,
figure 33). Le spectre d'ordre deux de l'adénine
se caractérise
par des
maxima et des minima à 267, 260 et 205
nm. Celui
de la
purine présente des maxima à 278, 272, 247 et
208 nm,
des épaulements à 265, 226, 211 et 205 nm et un minima
à 261
nm
(Tableau
XIX,
figure
33).
Les
spectres
dérivés
première
et
seconde
s'avèrent
donc
assez
distincts
pour
différencier théoriquement entre la purine et l'adénine.
Nous
avons examiné
dans le
tableau XX
l'effet de
la
variation de
la composition
sur les
spectres d'ordre zéro et
dérivés
de
mélanges
adénine-purine.
Quel
que
soit
la
composition du mélange, on observe une seule bande d'absorption
d'ordre zéro,
ce qui empêche toute identification. Par contre,
les spectres
de dérivée
première
présentent
des
maxima
et
minima distincts
pour les
deux composés,
mais seuls les pics
correspondant à
la purine
sont identifiés sans équivoque pour
certains mélanges
seulemen"'C. Ce
comportement est probablement
dû au fait que le pourcentage de purine est prédominant dans la
plupart des
mélanges. Bien
que
la
résolution
des
spectres
d'ordre un
s'avère meilleure
que celle
de ceux d'ordre zéro,
ces deux méthodes sont inadéquates pour identifier les mélanges
adénine-purine.
Les
spectres
de
dérivée
seconde
des
mélanges
se
caractérisent par
un nombre
élevé de maxima et de minima, qui
peuvent pratiquement
être attribués sans ambiguïté à l'adénine
ou à la purine, pour tous les mélanges étudiés.
Les spectres d'ordre deux constituent donc une méthode de
choix en
vue d'identifier sans équivoque les mélanges adénine-
purine. De
plus, la
sensibilité de
ces spectres
de
dérivée
seconde s'avère plus élevée que les autres. GIL et al.
(28) ont
abouti à
une conclusion
similaire, dans
le cas
d'un mélange
équimolaire adénine-cytosine.

---

- 115 -
TABLEAU XX
Effet de la variation de la composition sur les
spectres UV d'ordre zéro,
un et deux des mélanges
adénine (A)
- purine
(P)
en solution aqueuse.
Longueurs d'onde
(nm)a
Mélanges
Ordre zéro
Dérivée première
Dérivée
seconde
Adenine
260
271
: (266)
: 246
282
273
267
i
: 260
- -
- -
- -
1
(10-4 M)
(245)
;
(238)
: (234)
(230)
:
215.
: 205 :
Purine
262
(275)
: 270 : 253:
278
272 : (265)
: 26 l
( 10 -4M)
- -
J
(234)
: 203
247
(226)
: (211 ) :
- -
- - i
208 : ( 205) •
Adenine-Purine
261
(276)P : 270 A+P:
(281)A : 278P : (275)
(I0-5- 9 . 10-5 M)
252P :
(234)P :
271A : 265 A : 260 A+P
204(P)
246P : (230) : (211)P
208P : (206)P
- -
Adenine-Purine
257
(276)P : 270A+P i
(282)'1 278 P : 275 A+P
5
5
- -
(2.10- -8.10-
M)
251P : (232)P :
271A : 265 A : 258 A :
- -
205
( P )
245P : (230) : (214 ) A
- -
- -
212 P : 208 P
- -
- -
Adenine-Purine
262
270A + P : 250 A+P: (282) A : 278 A + P :
5
5
(3.10- -7.10- M)
208
(276)
: 272 A : 266 A
- -
259 A : (244)P : (229)
215 A : 212 P
- -
- -
Adenine-Purine
262
270A+P : 250A +P :
(282)A : (279) A+P :
- -
5
(4.10- 5 -6.10- M)
210 :
(275)
: 272A : 265 A'
- -
,)
258A : (246)P : 214 A
- -
Adenine-Purine
260
270A + P:
248 A+P
(282)A : (279)A + P :
- -
(5.10 -5_5.10- 5M)
272A ;
267A :260A : 216 A
- -
a
Mêmes notations des valeurs de À que dans le tableau XIX

---

- 116 -
111-2. IDENTIFICATION DE MELANGES DE PURINES ET PYRIMIDINES PAR
LES SPECTRES D'ORDRE DEUX.
Nous avons rassemblé dans le tableau XXI les spectres UV
d'ordre deux de mélanges sélectionné de purines et pyrimidines.
En général,
i l est
possible
d'attribuer
sans
ambiguité
la
plupart des
maxima et
minima à chaque composant des mélanges.
Les spectres
de dérivée
seconde constituent donc un bon moyen
d'analyse qualitative
des
mélanges
binaires
de
purines
et
pyrimidines. Ainsi,
dans le
cas du
mélange
cytosine-thymine
(figure 34),
les spectres
d'ordre zéro
et un
(courbe 1 et 2
respectivement)
ne
permettent
pas
d'identifier
les
deux
composants, alors
que
le
spectre
d'ordre
deux
(courbe
3)
fournit sept
longueurs d'onde
distinctes de la cytosine ou de
la thymine.
En fait,
l'emploi des
spectres d'ordre
un à des
fins d'identification
ne s'avère
possible que dans le cas des
mélanges
adénine-purine,
caféine-méthyl-6
purine
et
acide
urique-caféine (figures
33 et
35), pour
lesquels on
ne peut
distinguer que
trois à
quatre longueurs
d'onde
spécifiques,
alors que
les spectres
d'ordre deux
contiennent six
à
neuf
maxima ou minima identifiables.
111-3. APPLICATION
DES
SPECTRES
DE
DERIVEE
PREMIERE
ET
SECONDE A L'ANALYSE QUANTITATIVE
En
vue d'appliquer
les spectres
d'ordre un
et deux à
l'analyse quantitative, nous avons évalué les amplitudes Dt, Op
et Oz
des pics
caractéristiques des
purines
et
pyrimidines
selon les
méthodes décrites
ci-dessus (paragraphe
1.2). Nous
avons
établi
les
courbes
d'étalonnage
log-log
amplitudes-
concentrations pour
les
purines
pures (56)
(figure 36a).
Leur traitement statistique est présenté dans les tableaux XXII
et XXIII.
On constate que les corrélations des amplitudes Op et Oz
sont excellentes
pour les
spectres d'ordre
un et
deux.
Les
coefficients de
corrélation (r)
sont supérieurs
à 0,99,
les
pentes voisines de l'unité et les domaines de linéarité varient

---

- 117 -
TABLEAU XXI
Spectres d'ordre deux de mélanges binaires de purines
et pyrimidines en solution aqueuse
a
Composition
Longueurs d'onde
(nm)
b
Composés purs
Adenine
282,
273,
267,
260,
(24S),
(238),
(234),
( 230) ,
21S,
20S
Caf .éine
291,
271,
243,
230,
216,
202
Cytosine
28S,
267,
24S,
216,
202.
Méthyl-6 purine
277,
270,
(264),
260,
248,
( 230) ,
210
Purine
278,
272,
(26S),
261,
247,
( 226) ,
( 211 ) , 208,
(20S)
Thymine
289,
286,
26S,
227,
210
Uracil
279,
2S8,
222,
(217),
20S
Acide Urique
306,
(299),
286,
2S2,
231,
210,
( 208 ) ,
(206)
Mélanges
Adenine(A)- Cytosine(C)
(28S)C,
(283)A,
(276)A,
267A+C,
260A,
246C,
(lolO-SM - 9.10- SM)
216A,
208,
203C
Adenine(A) -
Purine(P)
(282)A,
278P,
27SA+P,
271A,
26SA,
2S8A,
24SP,
S
S
(230),
(214)A,
212P,
208P
(2010- M -
8010- M)
Caféine
(CAF)- methyl-6
288CAF,
27SMP,
270CAF,
263MP,
244,
229CAF,
purine (MP)
(21S)CAF,
211MP,
(208)MP
(SolO-SM -
SolO-SM)
Cytosine (C) -
thymine(T)
286T,
283C,
267C+T,2~, 228T, 21SC, 210T,
203C
---
- - -
(S.lO-SM -
S.lO-SM)
Méthyl-6 purine(MP)-
(279)U,
276MP,
260MP,
(222)U,
212MP,
201MP
uracil(U)
S
(l.lO-SM - 9010- M)
Acide ur ique (AU) -
purine(P)
306AU,
289AU,
277P,
271P,
(266)P,(262)P,
2S0AU
(S.lO-SM - SolO-SM)
233AU,
(211),
209,
(206)
Acide urique (AU) -
306AU,
(290)CAF,
276CAF,
2S0AU,
229,
216CAF,
caféine
(CAF)
(212)AU,
(208)AU,
201CAF
(S.lO-SM -
S.lO-SM)
Acide urique (AU) -
306AU,
287AU,
278U,
260U,
2S0AU,
232AU,
uracil
(U)
(216)U,
(208)AU,
(20S)AU
(S.lO-SM -
S.lO-SM)
a
Memes notations des valeurs de
~
que dans le tableau XIX
b Concentration:
10-4 M

---

- 118 -
TABLEAU XXII
Traitement statistique des courbes d'étalonnage
basées sur les spectres d'ordre un des purines
et pyrimidines
Méthode pic - pica (Dp)
a
Méthode pic-ligne de base (D. )
Z
Composé
c
b
Pente
ordonnéec
Cid
C
c
Cid
r
DDL
pente
ordonnée
r
à l'orig.
à l'orig.
Adenine
20
0.91
6.96
0.998
20
0.92
6.54
0.999
Amino-5 uracil
40
0.93
6.54
0.999
40
0.92
6.21
0.999
Bromo-5 uracil
20
0.88
6.67
0.999
40
0.93
6.09
0.999
Caféine
40
0.89
6.51
0.999
40
0.92
6.62
0.999
ChI oro- 6 purine
20
0.74
6.06
0.989
20
0.86
6.42
0.998
Cytosine
40
0.94
6.75
0.997
40
0.99
6.76
0.999
Fluoro-5 uracil
20
0.97
6.61
0.998
40
0.93
5.78
0.995
Hypoxanthine
20
1.05
7.35
0.995
40
1.04
6.99
0.996
Iodo- 6 purine
20
0.94
6.96
0.998
20
0.92
6.67
0.999
Mercapto- 6 purine
10
0.83
6.73
0.997
10
0.92
6.41
0.998
Méthyl- 6 purine
20
0.90
6.73
0.999
40
0.81
6.ll
0.999
Purine
20
0.93
7.02
0.993
20
0.96
6.93
0.995
Theobromine
20
1.01
7.42
0.995
20
1.01
6.70
0.991
Theophylline
20
0.92
6.84
0.998
40
0.91
6.40
0.998
Thymine
40
0.90
6.61
0.999
40
0.95
6.20
0.998
Uracil
40
0.87
6.55
0.995
40
0.95
6.52
0.999
Acide urique
20
0.85
6.65
0.995
40
0.83
5.95
0.995
a Voir le texte pour les définitions
b
DDL (Domaine dynamique de linéarité) ~ rapport de la plus grande concentra-
tion à la limite de détection dans le domaine linéaire de la courbe d'étal-
lonnage.
c Valeurs calculées en utilisant 5 à 7 mesures pour chaque courbe d'étalonnage
dr ~ Coefficient de corrélation

---

- 119 -
logI p
a)
/
3
/ /
~)'/~
6 /
o
6 /
2
0 /
/~/-
/
1
-5
-4
-3
b)
2
1
O"-----.L..-
~
__J.
__I~
-6
-5
-4
-3 log c (M)
Figure 36a. : Courbes de calibration log-log
obtenues à partir
des spectres d'absorption d'ordre un (0)
(méthode
Op) et deux (d)
(méthode Oz) de la purine.
b.
Courbes de
calibration log-log obtenues à partir
du spectre
d'absorption
d'ordre deux du mélange
Adé1\\ine (0)
(À AN = 272 nm)
+
Purine (d) (ÀAN =
246 nm).

---

TABLEAU XXIII
:
Traitement statistique des courbes d'étalonnage basées sur les spectres d'ordre
deux
des purines et pyrimidines
Méthode pic-pica
(D )
l Méthode pic-ligne de basea(D )
Méthode tangentiellea(D )
p
z
1
t
Composé
c
c,d
c
c,d
b
c
c
c,d
b
c
b
c
r
pente
ordonnée
r
DDL
pente
ordonnée
r
DDL
pente
ordonnée
DDL
à l'origine
à l'origine
à l'origine
-_.
Adenine
-
-
-
-
20
0,86
6.36
0.997
20
0.8oe
6.42e
0.99ge
Arnino~ uracil
20
0.87
5.99
0.998
10
1.07
6.43
0.999
20
0.82
5.67
0.992
Bromo- 5uracil
20
0.84
6.23
0.998
20
0.89
6.09
0.999
20
0.82
6.08
0.997
Caféine
40
0.90
6.55
0.999
40
0.98
6.64
0.998
40
0.26
3.59
0.843
Chloro- 6 purine
20
0.88
6.47
0.999
40
0.90
6.39
0.996
40
1.43
8.81
0.898
~
Cytosine
40
0.78
5.83
0.992
40
0.86
5.93
0.996
40
0.72
5.55
0.991
N
0
Fluoro- 5 uracil
40
0.90
6.19
0.999
10
0.94
6.12
0.986
40
0.83
5.84
0.999
1
Hypoxanthine
-
-
-
-
20
1.06
7.07
0.992
15
0.97
6.85
0.996
Iodo- 6 purine
-
-
-
-
20
0.92
6.27
0.999
20
0.78
6.18
0.992
Mercapto-6 purine
10
0.78
6.18
0.995
10
0.74
5.65
0.998
10
0.79
6.24
0.993
Méthyl- 6 purine
-
-
-
-
20
0.83
6.11
0.999
40
0.78
6.30
0.997
Purine
-
-
-
-
20
0.88
6.36
0.995
10
0.85
6.60
0.988
Theobromine
20
0.97
7.00
0.995
20
0.82
6.07
0.999
20
0.94
6.90
0.996
Theophylline
40
0.90
6.48
0.998
20
0.78
5.56
0.998
40
0.83
6.27
0.997
Thymine
40
0.89
6.40
0.998
40
0.82
5.87
0.999
40
0.89
6.40
0.998
Uracil
20
0.87
6.41
0.999
40
0.83
5.97
0.998
20
0.86
6.34
0.999
Acide Urique
40
0.81
6.14
0.995
40
0.85
5.89
0.989
40
0.79
6.06
0.992
aVoir le texte pour les définitions
bMêmes définitions que dans le tableau XXII
dcvaleurs calculées avec 5 à 7 mesures pour chaque courbe d'étalonnage.
r=coefficient de corrélation

---

- 121 -
entre 10
et 40.
Cependant, les
courbes d'étalonnage obtenues
par la
méthode tangentielle (Dt) à partir des spectres d'ordre
deux sont
de moins
bonne
qualité
(0,84 < r
<
0,99)
(Tableau
XXII I) .
Pour
l'analyse quantitative
des mélanges de purines et
pyrimidines, nous
avons appliqué la méthode de l'amplitude pic
- ligne
de base (Dz ) aux spectres d'ordre deux (Tableau XXIV).
Nous
avons
comparé
les
caractéristiques
analytiques
des
mélanges à
celles
des
produits
purs
(Tableau
XXIII).
Les
corrélations
Dz
concentration
des
mélanges
s'avèrent
satisfaisantes pour
l'adénine, la
cytosine, la
purine et
la
méthyl-6 purine,
pour un
domaine de
concentrations comprises
entre 10- 4
et 10-sM (valeurs de r
~ 0,99 et pentes voisines de
l'unité)
(figure
36b).
Leurs
caractéristiques
sont
très
voisines de
celles des corrélations obtenues pour les produits
purs. Ceci
confirme l'intérêt
de la
méthode
spectrométrique
dérivée pour
l'analyse quantitative des mélanges de purines et
pyrimidines.
Cependant,
nous
n'avons
pu
établir
aucune
corrélation satisfaisante
dans le
cas des
mélanges
méthyl-6
purine-uracil
et
cytosine-thymine,
pour
analyser
quantitativement l'uracil
et la
thymine (Tableau XXIV). Cette
absence
de
corrélation
pourrait
résulter
du
recouvrement
partiel des
maxima et
minima de
ces composés,
et de la plus
faible absorbance
de l'uracil et de la thymine que de celle de
la méthyl-6
purine et
de la
cytosine, aux
longueurs d'onde-
analytiques sélectionnées.
111-4. IDENTIFICATION
ASSISTEE
PAR
MICRO
ORDINATEUR
DE
MELANGES BINAIRES
Nous
avons
évalué
les
performances
des
programmes
informatiques décrits
précédemment pour
l'analyse qualitative
automatique des
mélanges à
partir des
spectres d'ordre
deux
stockés sur micro-ordinateur (57).

---

- 122 -
TABLEAU XXIV
Traitement statistique des courbes d'étalonnage
a
des mélanges de purines et pyrimidines
ÀAN b
c
c
c
Mélanges
Composés
pente
ordonnée
Coefficient de
(nm)
à l'origine
correlation
Adenine-cytosine
A
216
0.84
6.65
0.999
(A)
(C)
c
246
0.58
4.35
0.918
Adenine-purine
A
272
1.09
7.34
0.999
(A)
(p)
P
246
1.20
6.85
0.943
Méthyl- 6 purine-uracil
MP
276
0.80
6.Ô2
0.985
(MP)
(U)
U
Cytosine-thymine
C
202
1.31
8.07
0.996
(C)
(T)
T
a
Mesures effectuées à partir des amplitudes D
des spectres d'ordre deux.
z
b ~AN = Longueurs d'onde analytiques utilisées pour la courbe d'étalonnage
c
Valeurs calculées à partir de 4 à 5 Mesures pour chaque courbe d'étalonnage

---

- 123 -
a) Application
du
programme
DESpI-J
; reconnaissance de
mélanges binaires connus
L'emploi du programme DE5PI-1 nous a permis d'effectuer la
reconnaissance des
principales caractéristiques
spectrales de
mélanges
binaires
en
les
comparant
avec
les
valeurs
des
longueurs d'onde
des produits
purs (Tableau
XXV). En faisant
varier les
valeurs de
TOLA, nous avons pu rendre plus précise
l'identification assistée par micro~ordinateur de ces composés.
Les
longueurs
d'onde
des
maxima
et
minima
identifiées
automatiquement sont
pratiquement identiques à celles obtenues
manuellement,
pour
la
plupart
des
mélanges.
On
observe
cependant des
attributions erronées
dans le
cas des mélanges
adénine-purine (1:9)
et
méthyl-6
purine-thymine
(1:1),
aux
quelles on
pourrait remédier en utilisant des spectres dérivés
d'ordre supérieur.
b) Application du programme DE5PI-2 à
l'identification
de
mélanges binaires
Nous avons pu identifier des mélanges binaires à l'aide du
programme DE5PI-2,
en comparant
automatiquement les longueurs
d'onde des
maxima et minima des mélanges à celles des produits
purs stockées
sur micro- ordinateur. Nous
avons ainsi exploré
les caractéristiques
spectrales
de
l'ensemble
des
produits
susceptibles d'appartenir
aux mélanges, en étudiant l'effet de
la variation de la valeur de TOLA sur l'identification dans une
région donnée de longueurs d'onde (Tableau XXVI). La diminution
de la
valeur de
TOLA
entraîne
la
réduction
du
nombre
de
composés que
l'on suppose
présents dans
le mélange,
ce
qui
améliore la précision de l'identification. Le programme DE5PI-2
permet d'identifier
complètement les
mélanges:
théobromine-
théophylline (1:1)
et (1:9).
Cependant, pour
la plupart
des
mélanges, un
seul composant
est identifié
avec certitude,
à
l'aide de
faibles valeurs
de TOLA.
Ainsi, dans
le
cas
des
mélanges adénine-cytosine
(1:9)
et
cytosine-thymine,
on
ne
reconnait que la cytosine, alors que dans les mélanges adénine-

---

- 124 -
TABLEAU XXV
Identification spectrométrique d'ordre deux assistée
par micrQOrdinateur et manuelle de mélanges binaires
de purines et pyrimidines
b
Identification des longueurs d'onde
(nm)
a
c
Mélanges
Assistée par microordinateur
Manuelle
Adenine (A)-Cytosine(C)
(284)Ci 266 A+Ci 254Ai 246Ci
(285)Ci (283)Ai (276)Ai 267 A+Ci
(1:9)
216 A.
260 Ai 246 Ci 216 Ai 208i 203 C
Adenine(A)-Cytosine(C)
272 Ai 268 A+Ci 256 Ai 216 A.
282 A+Ci 272 Ai 266 A+ Ci 258 Ai
(1:1)
215 Ai 206 A
Adenine(A)-Purine(P)
278 Pi 272 Pi 260 Pi 210 P.
-
-
(281) Ai 278 Pi (275); 271 Ai 265 A
(1:9)
260 A+Pi 246 Pi 230i (211) Pt
208 Pi 206 p.
Adenine(A)-Purine(P)
280 Ai 272 Ai 266 Ai 216 A.
(282) Ai (279) A + Pi 272 Ai 267 Ai
(1:1)
260 AI 216 A
Cytosine(C)-Thymine(T)
286 Ti 266 Ti 250 Ci 240 T
286 Ti 283 CI 267 C+ Ti 248 Ci 228.
j
- /
(1:1)
228 Ti 212 Ci 210 T.
215 CI 210 Tj 203 C
Guanine(G) -Iodo-6puri-
292 IPi 274 IPi 216 IPi
291 IPi 281 IPi 273 IPi 266 IPi
ne (IP)
210 IP,. 202 IP.
260 IP,. 257 IPi 243 Gi 218 IP,
-
-
(1: 1)
216 IPt 210 IP, 208 IPi 202 IP
Thymine(T)-uracil(U)
282 T+Ui (276) UI 224 T +Ui
282 TI (278) Ui 224 T+Ul (209)T+Ui
(1:1)
(208)U.
(206) U
Thymine (T) - Méthyl -
288 MPi 286 MPi 282 MPi
-
-
(288) Ti (286) T/ (282) Ti 275 MPi
6 Purine (MP)
276 MPi (264) MPi 256 MPi
(264) T + MPi 258 MPi 246 MPi
(1:1)
244 T + MPi 226 MPi 210 MP.
225 Ti 210 MPi (208) MPi 200 MP
a
5
Concentrations entre
10 -5 et 9 X 10-
M
b
Même notation des valeurs de )., dans le tableau XIX
c
Programme DESPI-l

---

- 125 -
TABLEAU XXVI
Effet de la variation de la zone de tolérance
(TOLA) sur l'identification assistée par ordinateur
des mélanges binaires de purines et pyrimidines
(programme DESPI-2)
a
b
Mélange
Domaine deÀ
TOLA
Nombre de
Identification c
composés
Adenine-Cytosine
200-300
1,5
7
3, 9,
10, 12, 14, 16,
( 1 : 9 )
17
1,2
4
3, 9, 10, 16
1,0
1
16
0,9
1
16
0,8
1
16
Adenine-Cytosine
200-300
1
7
2,
3, 4,
5,
6, 8, 18
( l : 1 )
0,8
3
2,
5, 6
0,75
2
~, 6
0,7
1
2
Adenine-Purine
200-250
1,0
7
3, 5,
Il, 12, 15, 17,
( 1 : 9)
19
0,5
2
12, 17
0,4
2
12, 17
250-300
Lo
17
l,
2,
3, 4,
5, 6,
7,
8, 10, Il, 12, 13,
14, 16, 17, 18, 19
0,5
4
2,
11, 12, 17
0,3
2
12, 17
Adenine-Purine
200-300
0,9
6
2,
3, 4,
S, 6, 18
( 1 : 1 )
0,7-0,5
1
2
200-250
0,5
3
2,
S, 6
0,4
2
2,
6
250-300
0,5
4
~, Il, 12, 17
0,4
3
2, 12, 17
0,3
1
2

---

- 126 -
TABLEAU XXVI
(Suite)
Cytosine-Thymine
250-300
0,7
15
l,
2,
3,
4,
S, 6, 7, 8,
(9: 1 )
10,
Il,
12,
13,
16,
17,
19
0,4
5
4,
S, 6, Il, 16
0,3
3
4,
S, 16
0,2
2
5,
16
Cytosine-Thymine
200-300
1 ,7
10
l,
3,
9,
10,
12,
13, 14,
(1:1)
16,
17, 19
1 ,5
8
l,
3,
9,
10, 12, 14,
16,
17
1 ,2
4
3, 9,
10,
16
1-0,5
1
16
Theobromine-Theophylline 200-300
0,7
4
2,
4,
S,
6
(1: 9)
o ,6S
3
4, ~, 6
0,63
2
4,
S
o ,6
1
4
Theobromine-theophylline 200-300
1
9
2,
3,
4,
S,
6,
Il,
lS,
18,
(1: 1)
19
o ,8
4
2,
4,
S,
6
O,S
2
i, 5
Guanine - Iodo-6purine
200-310
1
8
3,
4,
S,
9,
Il,
12, 17,
(1: 9)
19
0,7
2
3,
19
0,6-0,5
1
19
200-260
1
8
3,
4,
S,
9,
Il,
12, 17,
19
O,S
1
19
260-310
1
9
l,
2,
3,
4,
S,
6,
7,
9,
10
o ,6
1
19

---

- 127 -
TABLEAU XXVI
(Suite)
Guanine - 1000-6 purine
200-320
1
4
3,
9,
16, 19
( 1 : 1 )
0,7-0,5
1
9
Thymine - Uracil
200-300
1
3
8,
13, 18
-
( 1 : 1 )
0,8
3
8,
13, 18
0,7
2
8,
13
o ,6-0,5
1
13
Thymine- rréthyl-6purine
200-300
1,0
7
3,
4,
S,
Il,
12, 17
( 1 : 1 )
19
0,5
2
Il,
17
0,45
2
Il,
17
0,4
1
17
200-250
0,5
2
Il,
17
0,45
2
Il,
17
0,4
1
17
250-300
0,4
4
Il,
12, 16, 17
o ,35
3
Il,
12,
17
-
0,3
3
Il,
12, 17
0,2
1
17
a Domaine de longueur d'onde sélectionné ~ur l'application du programme
DESPI-2
b TOLA = tolérance (exprimée en unités relatives)
c Les numéros des composés sont les suivants:
1 :
iodo-5 uracil
: 2:adénine
3
hypoxanthine:
4
théobromine:
5 :
théophylline
:
6 : caféine :
7
bromo-5 uracil
8 :
fluoro-5uracil
: 9 :
iodo-6purine : 10 : mercapto-
5 uracil
:
Il
: Chloro- 6 purine :
12 : purine : 13 : Thymine
: 14 : acide
urique:
15
amino- 5 uracil
: 16 : cytosine:
17 : méthyl-6purine
:
18 : uracil
19 : guanine.
Les numéros des composés présents réellement dans le mélange sont soulignés.

---

- 128 -
cytosine (1:1)
et adénine-purine
(1:1),
on
n'identifie
que
l'adénine.
Ce
programme ne
nous semble
donc pas
très
adapté
à
l'identification
des
mélanges
binaires.
Nous
tenterons
d'appliquer le programme DESPI-3.
c) Application
d,] programme DE5PI-3 à
l'identification de
mélanges bjnajres.
Dans
ce programme,
on classe
les
composés
selon
la
fréquence d'apparition
des valeurs
caractéristiques d 2 A/d À 2 ,
dans la
région de
longueurs d'onde
choisies, en fonction des
valeurs de
TaLA. On
admet que
les produits
qui apparaissent
avec la
plus grande
fréquence appartiennent
au
mélange.
La
diminution des
valeurs de
TaLA permet d'améliorer notablement
la qualité de l'identification par rapport au programme DESPI-2
(Tableau XXVII).
En
effet,
nous
avons
pu
identifier
sans
équivoque, les
mélanges adénine-cytosine (1:9), adénine-purine
(1:1), cytosine-thymine
(1:1), théobromine-théophylline
(1:1)
et (1:9),
guanine-iodo-6 purine
(1:1) et
(1:9)
et
thymine-
uracil (1:1).
Cependant, nous
n'avons pu attribuer qu'un seul
des composants
des mélanges
adénine-cy~osine (1:1),
adénine-
purine (1:9), cytosine-thymine (9:1) et thymine-méthyl-6 purine
(1:9). Le composant identifié correspond en général à celui qui
se trouve dans la proportion la plus abondante dans le mélange.

---

- 129 -
TABLEAU XXVII
Effet de la variation de la zone de tolérance
(TOLA)
sur l'identification assistée par ordina-
teur des mélanges binaires de purines et pyrimi-
dines
(programme DESPI -3).
b
c
Mélange
Domaine de~a
TOLA
Identification
(fréquence)
Adenine-Cytosine
200-300
1,0
..!..§.(51) ,
9(50),3(49),4(49),
(1: 9)
5(49),
10(49),
12(49),
19(49),
~ (48), 6 (48), 8 (48),
11 (48) ,
17(48),18(48)
0,5
..!..§.(47) , ~(46),
5(46)
0,4
..!..§.(46) ,
5(42),
6(42),
2(41),
4(41)
0,35
..!..§.(46) , ~(41)
Adenine-Cytosine
200-300
1,0
~(51), 3(51), 4(51), 5(51),
(1:1)
6(51),
18(51),
8(51),
9(49),
11(49),
13(49), 16(48),
12(48),17(48), 19(48),
7(48).
0, 5
~ ( 50), 4 ( 46 ), 5 ( 47), 6 ( 48 ) ,
..!..§. ( 44 ),
17 ( 44 ) •
0,4
~(49), 5(44), 6(44), ..!..§.(43) ,
12(43),
11(43),
3(43).
Adenine-Purine
200-300
l, 0
12(51),
3(51),
5(51),
11(51),
(1: 9)
17(51),
19(51),
4(50),14(50)/
16(50),
10(49), ~(48), 6(48).
0, 5
g(51),
17(51),
11(49),~(45)
0,2
17(49), g(45),
11(41),
~ (38)
0,1
1l(33), 11(33), 17(32),
~ (23)
250-270
0,2
ll(1O) ,
17(10), ~(9)
270-290
0,2
12(11),
17(11),1(10),
3(10) .
Adenine-Purine
200-300
0,5
2(51),
5(48),
6(46),
4
(45),
(1: 1)
11 ( 45),
17 (45),
3 ( 44) ,
12(43)
0,2
2(48),11,(38)
0,1
2(36), 11,(28)

---

- 130 -
TABLEAU XXVII
(Suite)
Cytosine-Thymine
200-300
1,0
!§.(51) , 10(50), Q(49) ,
19(49),
( 1 : 1 )
9(49) ,
5(49),
3(49),
4( 49) •
0,7-05
.!..§.( 51), .!l(48)
Cytosine-Thymine
200-300
1,0
~(50) , 10(50), 12(50), 17(50),
(9: 1 )
3(49),
9(49),19(49) , 4 ( 48 ) , 5 ( 48 ) ,
15(48),
2 (47) , 6(47) , 11(47),
14(47), l1. (46 ) .
0,7
.!..§. ( 50) , 10(49) , 12(48) , 4 (46) ,
6(45),
7 (45) , 17(45), 11(45) ,
5(44) ,17(44),
2(43),
3(43),
.!l(42)
0,5
!§.(50), 10(49) ,
4(46),
12(46) ,
17(44),
5(43),
6(43),
Il ( 43 ) ,
2 (41) , 3 (40) , Q(36) •
Theobromine-Theophylline
200-400
0,5
i(101) , .? (10l)
(l: 1 )
0,2
i ( 50) , 1( 49)
Theobromine-Theophylline
200-300
0,5
i(51), 1 (50) ,
6(50)
( l : 9)
0,2
~(49) , 1(48)
0,1
i ( 46), 1(35 )
Guanine-Iodo-6purine
200-300
1,0
~(56), ~(56) , 3(56), 4(56),
( 1 : 9)
5(56).
0,7
~(56) , 3 (56) , ~( 54)
0,4
12.(53), ~(47)
0,2
12.(41), ~(33 )
Guanine-Iodo-6purine
200-300
1,0
12.(61), ~(6l), 16(61), 3(61).
( 1 : 1 )
d, 5
~(6l), 6(57), ~(56)
0,4
~ (60) , 6(55), ~(48)
9(59),
19(42)

---

- 131 -
TABLEAU XXVII
(Suite)
Thymine-Uraci1
200-300
1,0
.!2(51), ~(51), 8(51)
(1:1)
0,7
.!2(51), 8(51), 18(50)
0,5
.!2(51), ~(49)
0,3
~(43) , .!2(42)
Thymine-méthyl-6Purine
200-300
0,6
12(51), 5(51), 1l(51l,
5(49),
(1: 1)
12(49), 16(47),2(46),
3 ( 46) ,
10(46), 6 ( 44) , 13(42)
0,5
12(51), 1l(51l, 12(49),
4(46),
5(44),
2 ( 44) , 6 (43) , 10(45),
16(47), }2{39 )
0,4
1 7 ( 50 ) ,
ll(50), 12(47) , 4 (45) ,
5 ( 43) , .!2(33).
a
Domaine de longueur d'onde sélectionné pour l'application du programme
DESPI-3
b
TOLA = zone de tolérance (exprimée en unités relatives)
c
Voir note c du tableau XXVI.
Les nombres entre parenthèses correspon-
2
dent aux fréquences d'apparition des valeurs caractéristiques d A/dÀ 2
pour la valeur de TOLA donnée.

---

CONCLUSION

---

- 132 -
CONCLUSION
Nous avons pu atteindre les trois buts principaux que nous
nous étions
fixés dans
ce travail,
à savoir la détermination
des moments
dipolaires dans l'état excité singulet des purines
et des
pyrimidines d'intérêt biologique et la mise au point de
méthodes d'analyse
par phosphorescence
à température ambiante
(RTP) et
par spectrométrie UV dérivée de ces mêmes composés et
de leurs mélanges.
En ce qui concerne le premier point, nous avons pu évaluer
expérimentalement,
pour
la
première
fois,
les
moments
dipolaires d'un certain nombre de purines et de pyrimidines par
la méthode
solvatochromique. Nous pouvons en conclure que pour
la
plupart
des
pyrimidines,
l'état
excité
singulet
est
nettement plus
polaire que
l'état fondamental (différences de
moment dipolaire
de 0,2
à 4,2
D) tandis
que dans le cas des
purines, un
comportement inverse
est observé.
Nos
résultats
expérimentaux
s'avèrent
en
bon
accord
avec
les
moments
dipolaires calculés par la méthode de Pariser-Parr-Pople (PPP).
Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons mis
en évidence les conditions expérimentales optimales (ion lourd,
substrat, pH)
permettant d'améliorer
l'application de
la RTP
aux purines
et. pyrimidines.
Ainsi, nous
avons pu montrer que
l'effet d'ion
lourd sur
le signal
de phosphorescence variait
selon la séquence suivante, pour la plupart des composés :
Tl+ > Pb 2 + ~ I- »
Sm3 +
Nous avons
attribué l'effet
spécifique
des
ions
Tl+
à
la
formation d'un complexe de transfert de charge (CTC) Tl~purine­
substrat stabilisé
par liaisons
hydrogène. Par
ailleurs, nos
études de
substrat nous
ont permis de démontrer que le papier
filtre W-40
donnait toujours des intensités de phosphorescence
beaucoup
plus
élevées
que
le
gel
de
silice
ou
l'oxyde
d'alumine. L'existence
de liaisons
hydrogène fortes entre les

---

- 133 -
molécules
de
purines
(ou
de
pyrimidines)
et
le~
groupes
hydroxyles
de
la
cellulose
permettent
d'expliquer
ces
résultats. Dans
la plupart
des cas,
nous
avons
trouvé
que
l'emploi
d'un
pH
basique
augmentait
le
signal
de
phosphorescence,
en
raison
de
la
présence
prédominante
d'espèces anioniques
absorbées sur
la cellulose.
L'étude des
performances analytiques
(limites de
détection:
400 pg à 3&
ngi domaine
de linéarité : 10 2 à 10 3 unités de concentration ;
coefficients
de
corrélation
et
pentes
des
courbes
de
calibration proches
de l'unité) nous conduisent à conclure que
la RTP
est une
méthode très
sensible
et
précise.
En
mode
synchrone, elle permet aussi d'analyser des mélanges de purines
et de
pyrimidines et
de
contrôler
la
qualité
de
~ertains
médicaments.
La
troisième partie
de notre
travail est
relative
à
l'analyse
de
mélanges
de
purines
et
pyrimidines
par
spectrométrie d'absorption
UV dérivée.
Nous avons
montré que
les spectres
de dérivée
seconde permettaient
d'identifier de
manière satisfaisante
les composants de mélanges binaires. Sur
le plan
quantitatif, il
est possible d'appliquer les spectres
de dérivée
première et
seconde à la détermination des purines
et des
pyrimidines et
de leurs
mélanges.
La
linéarité
des
courbes
d'étalonnage
"amplitude
(dA/d>..
ou
d 2A/d>.. 2)
concentration" est
vérifiée avec
une
bonne
précision.
Nous
avons également
mis au
point des programmes informatiques qui
permettent de
reconnaître les caractéristiques des spectres de
dérivée
seconde
de
mélanges
binaires
et
d'identifier
automatiquement la
composition qualitative
de
ces
mélanges,
après établissement
de banques
de données spectrales pour les
composés purs.
Nous pouvons
en conclure
que la spectrométrie
dérivée seconde,
informatisée constitue
une méthode
de choix
pour la
résolution de
mélanges binaires de composés possédant
des spectres d'ordre zéro similaires.
Nous nous
proposons d'appliquer
ultérieurement
les
méthodes
mises au
point dans
ce travail
à la
détermination dans
les
milieux biologiques de médicaments contenant des basee puriques
ou pyrimidiniques.

---

BIBLIOGRAPHIE

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