NO D'ORDRE:
ANNEE 1984
THESE
PRESENTEE A
L'UN IVERS ITE D'AIX - MARSEILLE ID
EN VUE 0 E L'OBTENTION DU TITRE DE
Docteur de 3e cycle
_.-.
,
1
.
.c.O•..I.:.;ë:1. .\\.R.,\\:d Er !.,,\\Al.GACHE
d Eco 0 g1e POUR l'ENSE;GNL~lr;;\\rf SUPERIEUR
C. A. M. E. S. -
OUAGf.J)OUGOU
1
PAR , Arrivé.e 3'\\ .M
~~ .199;)
..
PAPA N DIAYE
1.Enreg,stre sous~'O#j).·O·3·~ 13 .
Recherches concernant l'écotoxicité aiguë et
subchronique de trois substances chimiques de référence
(bichromate de potassium. chlorhydrate d'aniline et l'acide
trichloracétique) pour diverses espèces de poissons :
Brachydanio i'ezoio Hamil ton-Buchanan. Dicentrarc1ru.s labra:r
Linné et Salmo gairdnezoii Richardson.
Soutenue le 12 septembre 1984~ devant la commission d'Ezamen :
MM.
G. Pérès
G. Bogé
J. Giudicelli
N. Vicente
A Za mémoire de mon p~roe.
1
1
1
\\
- - - - - - - - - - -
AVANT-PROPOS
Je suis heureu:r: d'expl'imer au seuit de ces pages~ toute ma
reconnaissance et ma gratitude à Monsieur te professeur G. P~r~s~
Directeur du Laboratoire de Physiotogie g~n~rate et compar~e de
t 'Universit~ ctauds Bernard Lyon l et Directeur de t'Institut Michet
Pacha Laboratoire maritime de Physiotogie~ qui grâce à ses conseits
m'a permis ta bonne poursuite de mon travait depuis octob~ 1982.
Je suis profond~ment reconnaissant envers Monsieur te
professeur N. Vicente ~ Directeur du Laboratoire de Bio togie mal'ine
de ta Faautt~ des Sciences Saint-J~r~ ds MarseiUe~ qui a manifesU
d~s te d~but son int~rlt pour mes recherches.
Qus Monsieur te professeur J. GiudiceUi~ Directeur du
Laboratoire de Biotogie animate et Ecotogie de ta FaautU des Sciences
Saint-J~rOme de MarseiUe~ qui a accept~ de faire partie de mon jury
de th~se~ trouve ici t'expression de ma sinc~re reconnaissance.
Je tiens tout partiauU~rement à remercier Monsieur G. Bog~
qui m'a 'largement dispens~ ses connaissances sur tes techniques d'~tudes
d'~coto:riciU et de dosages enzymatiques. Je garde te souvenir de son
amicate patienae~ de sa p~dagogie exemptaire et de t'attention assidue
qu'it a toujours porUe à mon travait.
Mes remerciements ~gatement à Madame H. Roche pour ses conseits
judicieu:r: et son amicate coop~ration.
Je remercie tes techniciens de t'Institut Michet Pacha pour
t'aide qu'its m'ont apport~e dans t'approvisionnement et ta bonne
maintenanae des poisson8~ de mime que t'ensembte du personnet du
Laboratoire de Physiotogie g~n~rate et compar~e de t'Universit~ ctaude
Bernard pour 'leur affectueuse hospitatit~.
Au terme de ces deu:r: ann~es pass~es avec eu:r:~ je garderai te
souvenir de t'ambiance amicate dans taqueUe Dominique~ J~rOme~ Vincent
et moi avons v~au et partag~ tes soucis des tâches domestiques journaU~res
pour tesquettes mes tatents de auisinier ont ~t~ souvent mis à contl'ibution.
;
~
L'amiti~ qu'its m'ont offerte m'a permis d'oubtier ta distance qui me s~parait
1
de Dakar. J'esp~re tes acaueiUi!' un jour sur mon sot natat. "maagui nibi
si diama ak diama·".
1
l
111
1
J'adroess~ mes vifs remerciements à Madame Mane-Ange Royer~
pour son aide efficacs et "La comp~tence qu'eUe a apportEt~; dans "La
dacty"logroaphie d~ ce m~moizoe.
J'ai men~ ces ~tudes en qua"lit~ d'attach~ de recherches de
"l'IFAN (Institut Fondamental d'Afnque Noire - universit~ de Dakar)
et j'e:r:pnme à Monsieur le prof~sseur A. Samb~ Directeur de l'IFAN~
toute ma p1'Ofonds reconnaissance pour son aide pr~cieuse concernant
"les ~ma~~s administratives~ ainsi que son soutien "lors d~ ma
formation de chercheur.
Ces recherches n'auraient jamais vu le jour sans le concours
actif de Monsieur "le Secr~taire d'Etat à "la P8che MaZ"itime et de son
DizoecteuI' de Cabinet~ qui non seu"lement m'ont pems d'assurer
l'essentiel des cours de biologie de l'Ecole des Agents Techniques des
Pêches MaZ"itimes et de "l 'Oc~anogroaphie ~ mais aussi m'ont accord~ une bourse
d'~tude8 dans "le domaine de "la forrmation des cadroes hautement quaZifi~s.
Qu'i"ls acceptent ici mes sinc~res remerciements et mon
~vouement.
J'ai une dette de reconnaissanc~ envers ma m~re ~ mon grand
fr'~re Babacar~ mes groandes soeurs Atda~ Fatou et Aù1a qui m'ont donn~
"les moyens de poursuivre "les ~tudes secondaires lors de "la disparition
de mon p~re.
Je remercie ~ga"lement tous mes parents et amis qui m'ont
apport~ "leurs soutiens et "leurs encouragements.
NO D'ORDRE:
ANNEE 1984
THESE
PRESENTEE A
1
L'UN IVERS ITE D'AIX - MARSEILLE ID
EN VUE DE L'OBTENTION OU TITRE DE
1
Docteur de 3e cycle
1
1
d'Ecologie
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PAR
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11
PAPA NDIAYE
1
Recherches concernant l'écotoxicité aiguë et
1
subchronique de trois substances chimiques de référence
1
(bichromate de potassium, chlorhydrate d'aniline et l'acide
il
trichloracétique) pour diverses espèces de poissons :
1
'Jj
Brachydanio rerio Ham; l ton-Buchanan, Dicentrarchus 1,abra:r:
Linné et Sa1,mo gairdnerii Richardson.
Soutenue 1,e 12 septembre 1984~ devant ta cornnrission d'E:r:amen :
".- --- :
l,
MM.
G. Pérès
- '
Pré~ident l!
G. Bogé
'\\' ./
1
.'
, ,
,
'.,
."'
J. Giudicelli
Exatntnateurs
\\
l
N. Vicente
\\tî
SOMMAIRE
Pages
INTRODUCTION
2
PRODUITS UTILISES
7
A-TOXICITE AlGUE DU BICHROMATE DE POTASSIUM. DU CHLORHYDRATE D'ANILINE
ET DE L'ACIDE TRICHLORACETIQUE.
14
I-Méthodologie
14
1 Le test "Braahydanio rerio"
14
a -
Aperçu de la biologie du Poisson zèbre
15
b -
~ilieu d'élevage
17
a -
Conditions d'entretien des Poissons
17
d -
Déroulement du test
18
2 Le test "Satmo gairdnerii"
18
a -
Aperçu de la biologie de la Truite
18
b -. Conditions d'entretien des Truitelles
19
a -
1éroulement du test
20
3 Le test "Diaentrara1zus tabra:r:"
21
a -
Aperçu de la biologie du Loup
21
b -
Milieu d'élevage
22
a -
Conditions d'entretien des Loups
23
d -
Déroulement du test
23
4 Principe de calculs : estimation de la CL50-24h
23
II-Résultats
24
)~"t ,
1 Toxicité du bichromate de potassium·
':'<-
24
2 Toxicité du chlorhydrate d'aniline
26
3 Toxicité de l'acide trichloracétique
29
a - Toxicité de l'acide trichloracétiquééh~z le Poisson
zèbre et la T r u i t e l l e '
29
b - Toxicité de l'acide trichloracétique chez le Loup
33
III-Discussion
35
B-TOXICITE CHRONIQUE DU BICHROMATE DE POTASSIUM. DU CHLORHYDRATE D'ANILINE
ET DE L'ACIDE TRICHLORACETIQUE.
40
I-Tests chroniques sur Satmo gail'dnerii
40
1 Méthodologie
40
a - Animaux d'expérience
40
b - Déroulement de l'intoxication
41
a - Prélèvement des tissus
42
d - Mesures des activités enzymatiques
43
e - Dosages des protéines
47
f - Dosages de quelques constituants plasmatiques
48
2 Résultats
48
a -
Evolution de la mortalité
49
b -
Rapports intestino-somatiques (RIS)
50
a -
Activitê de la phosphatase alcaline intestinale
51
d -
Activité de la maltase intestinale
52
e -
Activité de la leucine aminopeptidase intestinale
53
f - Activités des ATPases intestinales
54
g -
Activités des ATPases branchiales
55
h -
Paramètres sanguins
57
II-Tests chroniques sur Diaentrarahus Zabrax
59
1 Mêthodologie
59
a -
Animaux d'expérience
59
b -
Déroulement de l'intoxication
59
Dispositif d'intoxication
59
Modalité d'intoxication
61
a -
Prélèvement des tissus
62
d -
Mesures des activitês enzymatiques
62
e -
Dosages de quelques constituants plasmatiques
66
2 Résultats
a -
Evolution de la mortalité
66
b -
Rapports intestino-somatiques (RIS)
67
a -
Activité de la phosphatase alcaline intestinale
68
d - Activitê de la maltase intestinale
69
e -
Activitê de la leucine aminopeptidase intestinale
70
f - Ativité des ATPases intestinales
71
g -
Activité des ATPases branchiales
73
h -
Glycêmi e
75
III-Discussion
77
C-CONCLUSION.
84
ANNEXES
87
:1
!
1
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
132
1
11
\\
1
1
1
1
1
SIGLES ET ABRËVIATIONS UTILISËS
DANS LE TEXTE
1
1
j
1i~l
AFNOR
Association Française de Normalisation
1~
ANSA
Acide-1-arnino-2-naphtol-4-sulfonique
CNERNA
Centre National de Coordination des Etudes et Recherches
1
sur la Nutrition et l'Alimentation
j
CNEXO
Centre National pour l'Exploitation des Océans
Î1
DEVA
Développement, Evaluation et Valorisation de l'Aquaculture
j
J
EDTA
Acide éthylène diamine tétra acétique
! FAO
Foods and Agriculture Organization
INRA
Institut National de Recherche Agronomique
INRS
Institut National de Recherche sur la Sécurité
IRCHA
Institut National de Recherche Chimique Appliquée
ISO
International Standard Organization
NED
Naphthyl éthylène diamine
p.p.m
Partie par million (milligramme par litre)
PVC
Polychlorure de vinyle
q.s.p.
quantité suffisante pour
1
1
1
1
1
lj
2
1 NT R0 DUC T ION
Les problèmes posés par la pollution des eaux se trouvent
aujourd'hui au centre de
débats internationaux. En effet, les
eaux ne respectant pas les barrières étatiques, leur pollution
cause souvent des dégâts importants dans tel ou tel domaine de
l'Economie ou de l'Environnement. C'est pourquoi, il paraît né-
cessaire de mettre sur pied au niveau national et international
une législation règlementant les rejets des produits agro-
industriels dans les cours d'eau et les mers.
Cependant, la prise de conscience au niveau international
a été lente, les ressources halieutiques ayant été pendant long-
temps considérées comme inépuisables. Il a fallu attendre 1967
et l'affaire du Torrey-Canyon, pour que l'opinion publique soit
sensibilisée à ces problèmes. Ce navire citerne s'était échoué
sur les écueils des "Seven Stones" au large des îles Scilly, en
déversant les 117 000 tonnes de pétrole qu'il contenait. L'évène-
ment fut spectaculaire, les dommages sur la flore et la faune
océaniques considérables.
Trois ans plus tard, l'Organisation des Nations Unies
pour l'Alimentation et l'Agriculture, plus connue sous le sigle
anglais de la F.A.O. "Foods and Agriculture Organization" orga-
1
1
nise à son siège à Rome du 9 au 18 décembre 1970 une "Conférence
1
technique sur la pollution des mers et de ses effets sur les
J
ressources biologiques et de la pêche". Depuis cette date, la
1
F.A.O. et d'autres organismes internationaux, notamment le Pro-
1
gramme des Nations Unies pour l'Environnement, la Commission des
3
Communautés Européennes, l'Académie Internationale de Sécurité
de l'Environnement, la Société Internationale d'Ecotoxicologie
et de Sécurité de l'Environnement développent largement leur
action dans le domaine de la protection des eaux et de la coo-
pération internationale en matière de pollution. Dans le cadre
de cette coopération internationale, peuvent être également
cités l'Association Française de Normalisation (AFNOR) et In-
ternational Standard
Organization (ISO) qui sont chargées
d'élaborer une législation ainsi que le "Plan
Bleu" destiné à réunir dans un effort commun les biologistes
des pays circum-méditerranéens sensibilisés par ces problèmes.
1
i
Depuis 1979, dans beaucoup d'Etats aux dispositifs rè-
1
glementaires préexistants, est venu s'ajouter un contrôle
l
"à priori" des produits chimiques. Les producteurs et importa-
teurs de substances nouvelles et, dans certains cas, de subs-
tances anciennes susceptibles de créer un danger nouveau, de-
vront établir les risques qu'elles peuvent présenter pour
1
l'Homme et son environnement.
Cet objectif a conduit à développer des tests effectués
sur des organismes variés, destinés à couvrir un champ d'inves-
tigations aussi large que possible. Les tests les plus couram-
ment pratiqués au niveau des écosystèmes aquatiques ont porté
sur les Poissons
(Broahydanio rerio~ Caro8sius aurotU8~ Charma punata-
tus~ Cyprinu8 aa'PPio~ Gambusia affinis~ IataZu1'U8 punatatu8~ SaZTrK) gaird-
nerii~ etc.), les Microcrustacés (Artemia 8aZina~ Daphnia magna)~ les
1
Algues (Saenedesmus subspiaatus~ SeZenastrum aapriaomutum~ ChZoreUa vuZ-
1
garis),
les Protozoaires (Tetrahymena pyriformis) et des Bactéries
1
hétérotrophes ou autotrophes. Ils consistent le plus souvent
dans l'évaluation de la concentration du produit qui entraîne
1
la mortalité de sa % de la population (CL 50) dans un temps
t
donné, l'arrêt de sa croissance ou de sa reproduction. On leur
associe également des mesures de bioaccumulation pour préciser
le devenir du produit dans un organisme. Certains tests ont été
1
standardisés dans le but de les utiliser comme base d'une rè-
1
glementation pour la protection de la nature et de l'environne-
ment (test Daphnia magna~ test Braahydanio rerio~ test Artemia 8aUna)
1
,
(AFNOR, ISO).
,
!
4
Le Poisson constitue un matériel particulièrement bien
adapté à la réalisation de ces tests d'écotoxicologie. De nom-
breuses espèces font maintenant l'objet d'élevages intensifs
permettant de _disposer d'un grand nombre d'individus,
de bonne qualité sanitaire qui seront conservés dans des condi-
tions bien contrôlées. En outre, le Poisson qui se situe à
l'extrémité d'une chaîne trophique est susceptible d'accumuler
1
de nombreux produits toxiques présents en moindre quantité dans
1
les proies ou dans l'eau ingérée (Takisawa, 1970 ; Barbier et
1
~
at.~ 1973). Enfin, le Poisson entrant pour une part importante
1
1
dans l'alimentation humaine, l'évaluation des niveaux de conta-
1
mination acceptable doit constituer une préoccupation permanen-
te.
1
Dans le cadre du programme de recherche, à l'initiative
du Ministère de l'Environnement: "Effets des produits chimiques",
1
nous avons étudié la toxicité de trois produits : le bichromate
1
i
de potassium, le chlorhydrate d'aniline et l'acide trichloracé-
i
1
tique vis-à-vis de trois espèces de Poissons : Broahydanio rel'io,
1
Hamil ton-Buchanan 1822 (ou Poisson zèbre), Satmo gairdnel'ii~
1
Richardson 1836 (ou Truite arc-en-ciel), qui sont deux espèces
d'eau douce et Diaentrorahus tabrax~ Linné 1756 (ou Loup) qui est un
1
!
poisson marin.
Le Poisson zèbre et la Truite sont des espèces d'eau dou-
1
ce pour lesquelles existent déjà des protocoles d'essai pour
l'évaluation de la CL 50 (AFNOR: 1978, 1981, 1982, 1983 : ISO
Dis 7346/1, Dis 7346/2, Dis 7346/3). Le Loup est une espèce ma-
1
rine qui a déjà été utilisé en écotoxicologie (Pérès et Garin,
t
1978
Pérès et Brichon, 1979 ; Beji, 1981, 1982).
!
La recherche des concentrations de trois produits entraî-
:i
~,
nant la mortalité de 50 % des poissons testés en 24 heures
(CL sa - 24 h) a constitué la première partie de notre travail.
î
Elle a servi de base à une étude des effets sublétaux de ces
1
1
produits sur l'enzymologie de deux organes directement en rela-
1
tion avec le milieu: l'intestin et la branchie. L'importance
1
de chacun d'eux se mesure à la quantité de liquide qui les tra-
1
1
1
1
5
verse. Dans la branchie des P,oissons d'eau douce (la Tanche),
le débit d'eau peut varier selon les conditions extérieures
1
de 10 ~ 100 ml/mn (Shelton, 1970). Dans l'intestin, le flux
hydrique dépend en premier lieu de la salinité du milieu. En
1
eau de mer l'absorption d'eau est toujours plus forte qu'en
eau douce (Smith, 1930 ; MaSDni et Isaia, 1973). Ainsi, l'An-
1
guille d'eau de mer absorbe 6,5 fois plus d'eau que l'Anguil-
le d'eau douce, soit près de 232 ml/kg/24 h (Gaitskell et
1
Chester Jones, 1971).
1
La définition des tests permettant d'apprécier les effets
sublétaux des produits chimiques constitue actuellement un
1!
objectif important en matière d'écotoxicologie. Ces tests pré-
sentent l'avantage sur les tests de mortalité classiques de ne
1
nécessiter qu'un nombre plus limité d'animaux et de permettre
1
i
de caractériser des perturbations métaboliques indésirables,
l
n'entraînant pas obligatoirement la mort des sujets, d'où une
possibilité d'indication préventive.
j
Notre recherche a été effectuée chez des Poissons (Trui-
~
tes et Loups) ayant séjourné au moins une quinzaine de jours en
1
l
présence de concentrations de toxiques égales au 1/10e de la
CL 50 - 24 h.
1
i1
Au niveau branchial, nous avons dosé les adénosine
i
triphosphatases (ATP ases), des enzymes qui hydrolysent l'adé-
nosine triphosphate (ATP) et sont activées par diverses caté-
gories d'anions et de cations. Nous avons dosé les plus impor-
1
2+
tantes: les ATPases totales, les ATPases Mg
et les ATPases
Na+K+ dépendantes. Cette dernière catégorie d'enzyme est impli-
quée dans les échanges de sels responsables de la constance du
i
milieu intérieur (Pfleiler et Kirschner, 1972 ; Moon, 1975 ;
•
Boeuf et Lasserre, 1978). Cette enzyme est égalementprêsente
dans
!
~
l'intestin où nous l'avons également dosée Nous avons recherché
1
en plus, dans ce tissu, la phosphatase alcaline, la maltase et
i
la leucine aminopeptidase (LAP).
l!
tll1j
6
La phosphatase alcaline, catalyse l'hydrolyse des esters
phosphoriques acides à pH alcalin. C'est une enzyme présente dans
l'intestin de la Truite,
elle a déjà fait l'objet de recher-
ches approfondies (Whitmore et Goldberg, 1972 a et b).
La maltase est une disaccharidase qui scinde en deux mo-
lécules de glucose, une molécule de maltose. Elle se trouve gé-
néralement associée dans l'intestin à d'autres disaccharidases
comme la saccharase ou la tréhalase. Elle présente chez la
Truite l'activité la plus élevée (Bogé et al.~ 1981, 1982).
La leucine aminopeptidase est une peptidase qui hydroly-
se les peptides dont l'extrémité NH
libre appartenant à la
2
leucine. La présence de cette enzyme dans 1 t intestin de la Truite
a déjà été démontrée
par Bouck (1980).
Chez les Poissons, comme chez la plupart des Vertébrés,
ces enzymes sont membranaires, insérées
dans la matrice protéo-
lipidique de la bordure en brosse (Crane, 1977 ; Bogé et al.~
1982). Elles peuvent donc être au contact direct des molécules
présentes dans la lumière intestinale.
1
Ces expériences ont été complétées par des mesures de
1
glycémie et d'activités transaminasiques "serum glutamate-
1
1
pyruvate transaminase"(S.G.P.T.), 'serum glutamate-oxaloacetate
transaminase '{S. G. O. T.)
pl asmatiques
en vue de déceler un éven-
tuel état de stress chronique général causé par les toxiques.
\\i
1
1
i
1
1
7
l
1
1
i
1
1
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j
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PRODUITS UTILISES
~1
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1
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8
APERÇU SUR LA NATURE ET LA TOXICIT~ DES PRODUITS
CHIMIQUES UTILIS~S
(FICHE TOXICOLOGIQUE INRS-IRCHA)
1. BICHROMATE DE POTASSIUM (K2 Cr207)
Le bichromate de potassium est un produit qui a déjà
fait l'objet de nombreux tests, en effet il est utilisé par
l'AFNOR comme substance de référence pour les essais sur
Bl'achydanio l'erio. Son emploi est également recommandé dans le
cas des tes ts sur SaZmo gail'dnerii.
Sa masse moléculaire est de 294,20 g.
Il se présente sous
forme de cristaux rouge-orangé lumineux, sans odeur, irri-
tants et solubles dans l'eau (123 g/l à 20°C) . .
Le bichromate de potassium est un composé du chrome
hexavalent. C'est un agent oxydant qui réagit avec les subs-
tances réductrices et donne des solutions aqueuses acides.
Il n'est pas combustible, toutefois il peut provoquer des
incendies et des explosions par contact avec des matières in-
flammables, organiques, et d'une manière générale les subs-
tances facilement oxydables.
Dans l'environnement, c'est un produit qui a une dé-
gradabilité et une biodégradabilité faibles et il ne présente
pas de bioaccumulation.
9
Les applications industrielles de bichromate de potassium
sont en général :
- production de composés du chrome,
- fabrication de pigments,
- tannage de cuir,
- préparation de produits pour la fabrication des bois,
- photogravure
- traitement de surface (conversion)
- impression des textiles
Toxicité expérimentale
La DL 50 (dose létale) par voie intrapéritonéale chez
la souris : 32 mg/kg pour le chromate de potassium (par injec-
tion).
La toxicité aiguë par ingestion se situe entre 1500 -
3000 mg/kg. L'application cutanée est plus toxique entre 300
et 500 mg/kg.
- Chez l'homme
Aiguë:
Chez l'homme 2 % des dérivés du Cr+ 6 sont absorbés par
1
le tractus digestif, le Cr+ 6 est réduit en Cr+ 3 dans l'intes-
1
tin. L'accumulation se fait dans tous les organes, notamment
i
les poumons. L'élimination est essentiellement rénale: 80 %
de la dose. Par ingestion, le bichromate de potassium a une
1
action caustique importante qui se traduit par des troubles
1
1
digestifs. Ensuite, apparaît une insuffisance rénale; une
j
atteinte cardiaque peut également survenir. L'inhalation des
doses importantes provoque une irritation bronchique sévère.
11
1
10
ChPonique :
La peau et les muqueuses sont les organes les plus
atteints. Le bichromate de potassium provoque des ulcérations
torpides qui persistent souvent des mois.
Des dermatoses allergiques des bras et des mains sont
fréquemment rencontrées.
L'action corrosive sur les muqueuses se manifeste au
maximum par la perforation de la cloison nasale.
Le poumon est parfois touché par une pneumoconiose de
surcharge. Mais le risque le plus important est celui des can-
cers
broncho-pulmonaires.
1
1
Aucun effet tératogène n'est actuellement démontré chez
!
l'Homme.
Aux Etats Unis, la valeur moyenne d'exposition aux com-
1
1
posés du chrome hexavalent solubles dans l'eau a été fixée en
1982 à 0,05 mg/m3 exprimé en chrome.
1Î
2. CHLORHYDRATE D'ANILINE
1
L'aniline C H NH
ou phénylamine ou amino-
6 S
Z
benzène, est un produit
souventtitilisé dans
\\
l'industrie. Sa masse moléculaire est 93,13 g et possède à
1
l'état liquide une odeur caractéristique et une couleur jaune
j
ambre. Dans l'environnement il est stable, moyennement biodé-
1
gradable et ne présente pas de bioaccumulation.
1
1
Sa mise en solution dans l'eau synthétique du produit
1
pur, liquide, nous a semblé poser quelques difficultés, c'est
1
pourquoi nous avons eu recours au chlorhydrate d'aniline qui
se présente sous la forme de paillettes colorées plus solubles
dans l'eau.
1
,
1
11
L'aniline s'enflamme spontanément en présence d'acide
nitrique
.
fumant ainsi qu'avec les peroxydes de sodium et
de potassium
Utilisation
- fabrication des matières colorantes
teintures pour
1
cuir, fourrure, coton
- industrie du caoutchouc: préparation d'accélérateurs
de vulcanisation et d'anti-oxygène
1
- fabrication de produits pharmaceutiques (phénacétine,
1
acétanilide ... ).
1;
Toxicité expérimentale
i
L'aniline est toxique par absorption ou inhalation.
1
La DL 50 chez le chien est de 500 mg/kg, chez le rat
440 mg/kg, chez le lapin 8Z0 mg/kg.
1
li
Dans l'organisme l'aniline subit une oxydation qui la
!~
conduit au stade intermédiaire de phénylhydroxylamine (C H
~1
6 s -
1
NHOH) qui est transformée en para-aminophénol (OH - C
- H
~
6
4 -
i
NH
l
Z)' ces produits étant éliminés par les voies pulmonaires
et rénales, accessoirement par l'intestin.
L'aniline est un produit dangereux qui pénètre dans
l'organisme, essentiellement par voie cutanée. Les lésions
produites sont habituellement des dermites eczémaformes.
Le symptôme caractéristique et le plus précoce des in-
toxications aiguës par l'aniline est la cyanose ardoisée pré-
dominant à la face et aux extrémités, ~e à la méthémo-
11
globinisation. Les formes graves s'accompagnent d'anémie hémo-
1
!
lytique avec subictère et même ictère.
1
,
Il est actuellement établi que l'aniline n'est pas can-
j
cérigène.
l
1
12
3. ACIDE TRICHLORACETIQUE
CI
0
1
/
C I - C - C
l'OH
CI
L'acide trichloracétique (CC1 COOH) de masse moléculaire
3
163 g est un produit solide, cristallin, rhombique, déliques-
cent, incolore qui présente une odeur caractéristique légèrement
piquante. Il est très soluble dans l'eau (la kg/l à 20°C).
i
Son comportement dans l'environnement (dégradabilité,
1
biodégradabilité, traitabilité et bioaccumulation) ne paraît pas
être connu. Il est extrêmement irritant.
1
Toxicité expérimentale:
Sa DL 50 chez le rat est de 3,3 g/kg.
4 .
PROTECTION
Lors des diverses experlences que nous avons effectuées
avec le bichromate de potassium, le chlorhydrate d'aniline et
1
1
l'acide trichloracétique, nous avons toujours veillé à porter
des vêtements, des gants et des lunettes de protection spécia-
lement réservés à cet usage.
1
1
1
13
1
l1iil
1
,
!11
1
1î1iJ'~1j
TESTS AIGUS
11
l~
1
1
i1
i1
11~11
1
1
~
!
,~
1
1
1
14
TOXICITË AIGUË DU BICHROMATE DE POTASSIUM,
DU CHLORHYDRATE D'ANILINE ET DE L'ACIDE TRICHLORACËTIQUE
Dans cette partie de notre travail, nous avons recherché pour
chacun des produits la concentration létale pour sa % d'une population
de Poissons donnée après 24 heures (CL sa - 24 h).
Ces tests ont été pratiqués sur les trois espèces de Poissons
1
le Poisson zèbre, la Truitelle et le Loup en utilisant, quand ils
1
existent, des tests normalisés ou en cours de normalisation.
!
1
1 - METHODOLOGIE
1
Nous avons utilisé le test normalisé par l'AFNOR (1978, 1981,
1
1
1982, 1983) et ISO (Dis/7346/1Pis/7346/2, Dis/7346/3).
1
1
1
a- Aperçu de la biologie du Poisson zèbre
1i
Position systématique
i
Sur-classe des Poissons
Classe des Ostéichthyens
Sous-classe des Actinoptérygiens ou Téléostomes
Super-ordre des Téléostéens
Ordre des Cypriniformes
15
C'est une espèce de la famille des Cyprinidae, famille riche-
ment représentée dans les eaux douces d'Europe, d'Amérique du Nord,
d'Afrique et d'Asie. Les traits caractéristiques de cette famille sont
l'absence de nageoires adipeuses, de dents buccales, et·
la présence
de dents broyeuses sur les os
pharyngiens.
La taille des Cyprinidae varie de 3 cm chez Rasbom masauZata
à
2 m chez Bal'bus toro
(Fabré, 1981). Ainsi, entre ces deux extrêmes, la
famille comporte un grand nombre de petits poissons dont les mâles sont
plus minces que les femelles(et particulièrement faciles à reproduir~.
C'est parmi ces espèces de petite taille que se trouve
Broaahydanio roeroio
au maximum 4,5 cm (Hervey et Hems, 1981), poisson d'aquarium originai-
re de l'est de l'Inde. Les raies bleu cobalt de son corps alternent
avec les lignes blanches pour lui donner des reflets dorés. Les femel-
les sont argentées et leur abdomen est plus gonflé, surtout pendant la
période de frai.
Broaahydanio roeroio
est omnivore et capable de supporter de larges
variations de températures (15-43°C) et de pH (6,6-8,2). Sa maturité
sexuelle a lieu à Pâge d'lD1 an.
Sa reproduction peut être réalisée
artificiellement (Hervey et Hems, 1981).
Le Poisson zèbre est rustique, de taille homogène, facile à
manipuler. Il s'acclimate sans difficulté aux conditions du labora-
toire et constitue une espèce très commode pour des tests de
toxicité aiguë.
Nous avons réalisé nos expériences sur des lots homogènes de
Poissons de 3,5 cm et 0,30 g en moyenne.
b- Milieu d'élevage
Il s'agit d'un milieu d'eau douce synthétique préparé au moins
48 heures avant l'arrivée des Poissons zèbres, à partir de trois solu-
tions mères (ISO/TC 147/SC 5).
16
Solution A :
- chlorure de calcium (6H ZO)
320 g
- chlorure de sodium
29 g
- nitrate de sodium
9 g
- eau désionisée q.s.p.
1000 ml
Solution B :
- sulfate de magnésium (7H 0)
151 g
2
- sulfate de sodium
79 g
- eau désionisée q.s.p.
1000 ml
Solution C :
- bicarbonate de sodium
27 g
eau désionisée q.s.p.
1000 ml
1
Pour ZOO litres d'eau désionisée, ajouter 100 ml de chaque solution
1
1
A et B et 1000 ml de solution C.
1
Cette eau douce synthétique présente les caractéristiques
1
suivantes :
1
- une dureté équivalente à 100 mg de carbonate de calcium par
litre d'eau (10 0 TH français)
une composition ionique ainsi définie
1
calcium
29,5 p.p.m
· magnésium
7,5 p.p.m
bicarbonate
100
p.p.m
111
· chlorures
60,5 p.p.m
· sulfate
56
p.p.m
· nitrates
3,5 p.p.m
17
i
i
1
Le milieu est ensuite placé dans une pièce thermostatée à 23°C,
puis il est abondamment oxygéné. Après 48 heures, l'eau ainsi "vieillie"
est débarassée de la majeure partie du chlore initial et son pH est
1
stabilisé à 7,6.
c- Conditions d'entretien des Poissons
1
i
'1
Les Poissons zèbres proviennent d'un fournisseur du commerce.
1
Dès leur arrivée au laboratoire, ils sont placés dans les bacs d'eau
1
douce synthétique à raison de 200 individus par 150 litres d'eau.
A partir du lendemain, nous commençons à les alimenter avec des ali-
1i
ments "Tétramin".
l11
Avant chaque test, les animaux sont adaptés pendant une quin-
zaine de jours au moins à ce nouveau milieu. Pour éviter l'accumula-
,
tion des produits toxiques, en particulier des nitrites, l'eau des
bacs est filtrée sur la mousse de Perlon. Elle est également partiel-
lement renouvelée tous les deux jours (1/3 du volume environ). Par
ailleurs; une aération permanente assure des teneurs en oxygène (do-
sées par la méthode de Winkler, 1888) toujours supérieure à 7 mg.l- l .
Enfin, l'éclairement est assuré par des rampes de néon avec un photo-
périodisme de 12 heures.
d- Déroulement des tests
Pour chaque produit, un test préliminaire est réalisé. Pour
cela, une série de concentrations en progression géométrique est pré-
parée dans des béchers en verre contenant 2 litres de chaque solution.
Ces béchers offrent une interface entre l'air et le milieu d'essai
d'environ 280 cm2. Cinq poissons y sont introduits. L'expérience se
déroule à 23°C pendant 24 heures, sans oxygéner le milieu, les te-
neurs finales en oxygène devant être suffisantes et égales au moins
à 70 % de la saturation.
Cette expérience préliminaire a pour but de définir une gamme
de concentrations utiles pour le test définitif, couvrant de 5 à
95 % de mortalité.
18
Au moins quatre concentrations comprises dans cet intervalle
sont retenues pour le test définitif. Un cinquième bécher contenant
deux litres d'eau douce synthétique servira de témoin. Comme pour les
essais préliminaires, l'oxygénation est interrompue pendant le test.
Après 24 heures, nous procédons au dénombrement
des animaux
morts dans chaque bac.
Le test Truitelle, bien que largement employé actuellement
n'a pas encore fait l'objet d'une normalisation en France. Elle est
maintenant à l'étude par la Commission spécialisée de l'AFNOR.
Nous nous sommes inspirés du protocole proposé par cet orga-
nisme (AFNOR, 1981, 1982, 1983).
a- Aperçu de la biologie de la Truite
• Position systématique
Sur-classe des Poissons
Classe des Osteichthyens
Sous-classe des Actinoptérygiens ou Téléostomes
Super-ordre des Téléostéens
Ordre des Clupeiformes
Famille des Salmonidae
~-famille des Salmoninae
La Truite arc-en-ciel possède une nageoire adipeuse, une li-
gne latérale visible, de petites écailles cycloïdes en rangée longi-
tudinale et ses flancs ont un aspect irisé (Bertin et Arambourg, 1958).
Les nageoires pelviennes sont situées au-dessous de la dorsale, la
bouche est grande avec des dents puissantes.
SaZmo gairdnePii a été décrite pour la prem1ere fois en 1836 par
Richardson sur des individus capturés "dans la Rivière Colombia"
(Mc Crimmon, 1971). Cet animal a commencé a être introduit en 1874
19
dans toutes les eaux du monde sauf en Antarctique. En France, les
premiers oeufs de la Truite arc-en-ciel ont été importés en 1879.
A partir de cette date, elle a fait l'objet d'un élevage intensif.
La Truite aime les eaux claires, bien oxygénées. Il est
admis que 8,5 mg d'oxygène par litre lui sont indispensables
(Mc Crimmon, 1971). Elle ne supporte pas les grandes variations de
température, mais c'est entre 14 et 17°C qu'elle mange le mieux et
grossit le plus vite. Aux températures extrêmes, sa prise alimen-
taire diminue (Possompes et al. 1975). Le pH le plus favorable à sa
survie est compris entre 7,1-7,5 (Mc Crimmon, 1971).
La Truite est carnassière. En captivité, elle s'adapte très
bien à l'alimentation artificielle.
Dans la nature elle ne fraie qu'au printemps et atteint
l'âge adulte au cours de sa quatrième année. La femelle pond alors
entre 400-500 oeufs démersaux lors de son premier frai (Donaldson
et Joyner, 1983).
Aujourd'hui, par sélection, les pisciculteurs ont réussi à
obtenir des lignées qui fraient en toute saison, assurant ainsi une
1
l
base solide à l'élevage commercial (Donaldson et Joyner, 1983).
1
1
i
b- Conditions d'entretien des Truitelles
Les Truitelles d'une taille moyenne de 6 cm et d'un poids
1
moyen de 1,90 g proviennent d'une pisciculture régionale. Après
î,
leur transport, elles sont conservées dans des bacs d'un mètre cube
l
1
remplis d'eau de ville préalablement vieillie et recouverts d'un
1
i
grillage pour empêcher les poissons de sauter. La composition de
cette eau de ville sera donnée en annexe page 88.
1
,
Chaque jour, nous procédons au dosage des nitrites
1
(cf. annexe page 92 ) dont les concentrations sont maintenues à une
valeur inférieure à 0,3 p.p.m, en remplaçant quotidiennement les
1\\
4/5 du milieu.
1
20
Parallèlement, nous veillons à ce que les teneurs en chlore
(cf. annexe 2) ne dépassent pas 0,4 p.p.m car les Truitelles (davan-
tage encore que les Truites) sont particulièrement sensibles à ce
composé.
Pendant la phase d'acclimatation qui se déroule à 14°C, des
granulés pour Truites "Aqualim" sont distribués chaque jour ad libi-
tum et l'oxygénation est maintenue à saturation. La période d'éclai-
rement est de 12 heures.
Les animaux sont maintenus dans ces conditions 15 jours au
moins avant le déroulement des tests.
c- Déroulement des tests
Ils sont dans leur principe analogues à ceux pratiqués sur
les Poissons zèbres. Un test préliminaire est tout d'abord réalisé
en vue de sélectionner pour chaque produit une gamme de concentra-
tions couvrant des taux de mortalité allant de 10 à 90 , environ.
Ces tests sont réalisés dans des ba~? pai~llélipipédiques
en polyéthylène d'une contenance de 20 litres~pt~sentant une surfa-
.
.
j'
ce de contact avec l'air d'environ 950c~?~~~ sont couverts d'un
grillage pour empêcher les Truitelles de sauter. Dix litres de cha-
que concentration de toxique y sont versés. Ces dilutions sont pré-
parées en utilisant de l'eau douce synthétique de même composition
que celle utilisée chez Bl'aahydanio l'eno.
Cinq poissons sont introduits dans chaque bac préalablement
oxygéné. Pendant la durée du test l'oxygénation est supprimée.
Toutes les expériences se déroulent à 14°C.
Après 24 heures, nous procédons au dénombrement des poissons
morts, en vue de calculer la CL 50, ainsi qu'à l'évaluation des te-
neurs en oxygène (méthode de Winkler, 1888). Elles ne doivent pas
être inférieures à 70 % de la saturation.
21
Il n'existe aucune normalisation de test sur le Poisson marin.
Nous nous sommes servis, pour la mise au point de notre protocole, des
premiers travaux de Pérès et Garin (1978)
; Pérès et Brichon (1979).
a- Aperçu de la biologie du Loup
. Position systématique
Sur-classe des Poissons
Classe des Osteichthyens
Sous-classe des Actinoptérygiens ou Téléostomes
Super-ordre des Téléostéens
Ordre des Perciformes
Famille des Serranidae
Le genre Diaentroarahus compte deux espèces très difficiles à
distinguer surtout chez les jeunes.
D'après Barnabé (1976) "le signe distinctif le plus évident
des Diaentrarahus punatatus
est de présenter sur le dos et les flancs
une ponctuation sombre permanente que ne possèdent pas les adultes
de Diaentrarahus Zabrax"~ cette espèce connue sous le nom de Loup en
Méditerranée et de Bar en Atlantique.
Le corps du Loup couvert d'écailles cténoides est allongé
et fusiforme avec deux nageoires dorsales: l'une épineuse, l'autre
constituée de rayons mous. Les nageoires pectorales sont élevées
sur les flancs, les pelviennes sont en position thoracique, l'anale est épineuse
(trois épines), la nageoire caudale échancrée. Le dos est sombre
et le ventre blanc. Selon Barnabé (1976), les femelles présentent
une tête plus longue et plus pointue que les mâles.
C'est une espèce euryhaline. Au printemps, de nombreux ale-
vins se trouvent dans les étangs peu salés ; en hiver, ils vivent
loin des côtes dans les eaux profondes pour éviter les eaux côtières
plus froides.
1
1
l
22
L'aire géographique du Loup est très vaste: Méditerranée,
Mer Baltique, Mer du Nord et Océan Atlantique (Fiche FAO, 1971).
Il peut donc supporter des variations de températures assez
grandes. Toutefois, en-dessous de 6·C, il cesse de ,s'alimenter (Barnabé,
1976). Par contre, en été, à 26°C, son comportement alimentaire est
satisfaisant.
Le Loup est un Poisson carnassier pouvant être nourri à l'aide
d'aliments artificiels lors d'élevage intensif.
En Méditerranée, c'est au mois de septembre que débute la
maturation des gonades, mais c'est en décembre-janvier, lorsque la
température descend aux environs de 12°C, qu'elle atteint son maxi-
mum. La période de reproduction s'étale de décembre à mars (Barnabé,
1976). La phase immature dure deux ans chez les mâles et trois ans
chez les femelles (Barnabé, 1976).
b- Milieux d'élevage
Nous avons utilisé de l'eau de mer en circuit ouvert et bien
oxygénée pendant la phase d'acclimatation des Loups et une eau de
mer synthétique pour la réalisation des tests aigus. Sa composition
est la suivante (formule de Wood's Hole, 1940) pour ZOO litres d'eau
dés ionisée :
4944 g de NaCl
1258 g de MgS0 4·7H O
2
932 g de MgC1 ·6H O
2
2
272 g de CaC1 2·2HZO
134 g de KCl
36 g de Na H C0 3
Cette solution est préparée deux jours avant son utilisation,
elle est aérée par des diffuseurs d'air. Ce traitement permet de sta-
biliser la température, l'oxygénation et le pH de l'eau.
23
c- Conditions d'entretien des Loups
Les Poissons d'âge 0+ (taille moyenne 4,99 cm et poids moyen
1,18 g) proviennent d'un centre d'élevage de la DEVA à Palavas (Hérault), ils
sont transportés au laboratoire dans un bac d'un mètre cube puis
placés dans des aquariums en ciment de deux mètres cubes remplis
d'eau de mer en circuit ouvert. Ils sont alimentés quotidiennement
à l'aide de granulés "Aqualim".
d- Déroulement des tests
Les tests sont pratiqués dans des bacs parallélipipédiques
analogues à ceux utilisés pour les Truitelles, également recouverts
de grillage.
Ils se déroulent à 26°C qui est également la température d'ac-
climatation. Il s'agit de la température saisonnière (été) des mi-
lieux d'élevage.
Ces tests sont dans leur principe analogues à ceux exposés
précédemment pour le Poisson zèbre et la Truitelle.
Pour chaque série de résultats, les pourcentages cumulés
de Poissons morts sont portés sur une échelle de probit en fonction
des logarithmes de concentrations de toxiques utilisées. A partir
du graphe obtenu, la concentration qui tue 50 % des Poissons dans
les conditions de l'essai (CL 50 - 24 h) est extrapolée.
Les limites de confiance à 95 % et les droites de régres-
sion sont ensuite calculées en utilisant l'analyse probit de Finney
(1952) et les tables statistiques de Fisher et Yates (1948).
Pour la réalisation pratique de cette analyse mathématique,
nous nous sommes référés également au D.E.S. de Rajot (1975) (cf. annexes
3-15) •
24
II - RESULTATS
Nous avons rassemblé sur un même tableau les valeurs des
CL sa - 24 h du bichromate de potassium chez les trois espèces de
Poissons (Tableau 1, ci-dessous).
Tai lle
Poids
pH des bacs CL 50-24 h Intervalle
de
moyenne
moyen
confiance sur
Espèces
TOC
témoins
(p.p.m)
(en cm)
(en g)
CLSO-24h â 95%
(p.p.m)
B. l'erio
3,5
0,30
23
7,6
232
322-167
s. gairdnel'ii
6,0
1,90
14
7,5
509
709-364
D. Zabm:r:
4,99
1,18
26
8,0
142
168-120
Tableau 1 - CL 50 - 24 h du bichromate de potassium chez Bl'aahydanio l'erio~
SaZmo gail'dnerii et Diaentl'arahus Zabl'oz
(cf. annexes: 3, 4, 5, 6, 7 et 8)
Des trois espèces étudiées, le Loup paraît être plus sensible
au bichromate de potassium. Toutefois, la différence avec le Poisson
zèbre est assez réduite, d'autant que les intervalles de confiance se
recoupent partiellement.
La différence avec la Truitelle est plus marquée. Chez cette
espèce, la toxicité au bichromate de potassium est nettement moins
grande que chez les deux précédentes, même si l'intervalle de confian-
ce est assez élevé. Il faut néanmoins remarquer que la température de
14°C est plus favorable pour la Truitelle que celle de 26°C pour le
Loup.
25
La présence du bichromate de potassium dans l'eau douce comme dans
l'eau de mer synthétiques entraîne une baisse du pH d'autant plus forte
que la concentration est plus élevée. Nous avons porté sur les figures
1 et 2 l'évolution du pH de ces milieux en fonction de la concentration
de toxiaue.
-t 8,0 --------.--e__
7.0
e
e
6,0
- - e - - e - - - e _ _ e
e_
..
5,0
o
100
200
300
~oo
500
550
Conc~nt["'ation
ppm
Fig. 1 - Influence de la concentration du bichromate de potassium sur le pH
de l'eau douce synthétique a 23°C.
pH
8,Or--
_-e
_
- e_ _ _ e ___
7,0
e _ _ _
e_
o
7S
125
150
175
200
Conc~ntl"'ation
ppm
Fig. 2 - Influence de la concentration du bichromate de potassium sur le pH
de l'eau de mer synthétique à 26°C.
26
Au cours des essais, la plus forte concentration testée a été
de 550 p.p.m chez la Truitelle, ce qui correspond â un pH de 5,5.
En absence de bichromate de potassium, nous avons constaté que ce pH
n'entraînait pas de mortalité au bout de 24 heures (voir plus loin
Tableau 8).
Le bichromate de potassium est une molécule très oxydante qui
agit fortement sur le dosage de l'oxygène par la méthode de Winkler.
Pour cette raison, nous n'avons pas pu mesurer les teneurs en oxygène
des bacs contenant le toxique. Mais celles des témoins indiquent
qu'après 24 heures, le milieu est encore suffisamment oxygéné (plus
de 80 % - cf. annexes 3, 4, 6 et 7).
Les résultats obtenus pour le chlorhydrate d'aniline sont
rassemblés dans le tableau 2 ci-dessous.
Intervalle
de
Taille
Poids
pH des bacs CL 50-24 h confiance
sur
Espèces
moyenne
moyen
TOC
CL50-24h a 95%
témoins
(en cm)
(en
(p.p.m)
g)
(p.p.m)
B. l'erio
3,5
0,3
23
7,6
252
333-191
S. gail'dnerii
6,00
1,90
14
7,5
60
83- 44
D. Zabro.:r:
4,99
1,18
26
8,0
58
66- 51
1
Tableau 2 - CL 50 - 24 h du chlorhydrate d1aniline chez Bl'achydanio l'erio~
Salmo gail'dnel'ii et Dicentl'al'chua Zabl'ax
(cf. annexes 9, Il, 12 et 13)
La Truitelle et le Loup présentent une sensibilité à ce produit
beaucoup plus grande que le Poisson zèbre (nous pouvons cependant faire
la même réserve pour la température que' lors des expériences avec le
bichromate de potassium.
Des mesures de concentration d'oxygène ont pu être réalisées
dans tous les bacs par la méthode de Winkler. En début et en fin
27
d'expérience, elles ont toujours été proches de la saturation et ont
peu évolué au cours de la manipulation (cf. annexes 9, 10, 11 et 12).
Le chlorhydrate d'aniline en solution entraîne une acidifica-
tion du milieu parfois importante en eau de mer comme en eau douce
synthétique (figures 3 et 4).
pH 8.0
7,0 ~e_ ·------e_ -e_______
6,0
e ____
e _ _ _
5,0
e-
o
100
200
300
~ 00
ConcG?ntl"'otion
ppm
Fig. 3 - Influence de la concentration du chlorhydrate d'aniline sur
le pH de l'eau douce synthétique à 23°C.
pH
8,0
.
,,,--.e-
_
- e_ _ _ _
7,0
e---
e_
6,0
L,,..'~'~-__::~--~'~--'-, ---
50
55
60
65 ConcG?ntl"'otion
ppm
Fig. 4 - Influence de la concentration du chlorhydrate d'aniline
sur le pH de l'eau de mer synthétique à 26°C.
28
Lors des tests sur le Poisson zèbre, pour la plus forte
concentration d'aniline (400 p.p.m), le pH est passé de 7,6 à 4,8.
Une expérience complémentaire a été effectuée pour vérifier si
cette baisse du pH affectait les valeurs des CL 50 - 24 h du chlo-
rhydrate d'aniline. Pour la réaliser les pH des solutions testées
ont été ramenés à leur valeur initiale (7,6) par ajonction de
NaOH.2N. Les résultats obtenus sont pratiquement identiques à ceux
de l'expérience initiale (Tableaux 3 et 4).
Concentration
pH des
%de mortalit~
(p.p.m)
bacs
en 24 heures
200
6,2
20
CL 50 - 24 h = 252 p.p.m
250
6,0
60
300
5,5
60
Intervalle de confiance sur
350
5,1
80
CL 50 - 24 h â 95 % (p.p.m)
400
4,8
90
333 - 191
Tableau 3 - Toxicit~ du chlorhydrate d'aniline chez Braahydanio rerio sans
correction de pH (cf. annexe 9)
Concentration
pH ajusté
%de mortalité
(p.p.m)
â 7,6
en 24 heures
200
7,6
la
CL 50 - 24 h = 264 p.p.m
250
7,6
60
Intervalle de confiance sur
300
7,6
70
CL 50 - 24 h à 95 % (p.p.m)
350
7,6
80
327 - 198
400
7,6
90
Tableau 4 - Toxicité du chlorhydrate d'aniline chez Braahydanio rerio aprês
r~ajustement des valeurs de pH (cf. annexe la)
29
a- Toxicité de l'acide trichloracétique chez le Poisson zèbre et la Truitelle
L'acide trichloracétique présente vis-à-vis de la Truitelle
et du Poisson zèbre le même type de toxicité. Il s'agit d'une toxi-
cité particulière obéissant à la loi du "tout ou rien". En effet, con-
trairement aux autres produits, l'acide trichloracétique provoque une
mortalité brutale de tous les Poissons d'un lot dès que la concentra-
tion dépasse 310 p.p.m.
Dans ces conditions, il n'a pas été possible de calculer la
CL 50 - 24 h comme nous le faisons habituellement, car les concentra-
tions d'acide trichloracétique correspondant respectivement à a % et
à 100 % de mortalité diffèrent de moins de 20 p.p.m (Tableaux 5 et 6
ci-après).
Durée de
Concentration
pH
Nbre
sujets
Nombre
de
%de
l' expéri ence
(p.p.m)
testés
morts
mortalité
en heures
200
5,8
la
a
a
24
300
3,9
la
a
a
24
310
3,6
10
a
a
24
330
3,5
la
la
100
3
360
3,5
la
la
100
3
380
3,5
la
la
100
3
Tableau 5 - Toxicité de l'acide trichloracétique chez Brachydanio rerio
30
Durée de
Concentration
pH
Nbre
sujets
Nombre
de
%de
l'expérience
(p.p.m)
testés
morts
mortalité
en heures
270
4,0
la
a
a
24
290
3,8
la
a
a
24
300
3,7
la
a
a
24
310
3,5
la
la
100
24
320
3,5
la
la
100
24
Tableau 6 - Toxicité de l'acide trichloracétique chez Satmo gairdnerii
Nous avons recherché si la toxicité de l'acide trichloracéti-
que résultait de la modification du pH de l'eau. Aux concentrations
létales, ce pH est de 3,5 valeur relativement basse.
Pour ce faire, nous avons étudié la toxicité d'autres acides
\\
comme l'acide chlorhydrique et l'acide sulfurique. Pour ces deux mo-
lécules, les mortalités surviennent brutalement dès que le pH atteint
3,5 (Tableaux 7 et 8 ci-après).
pH
obtenu avec
Nombre de
Nombre de
%de
Durée de l'expé-
11 ad de ch 1orhy-
drique ou sul fu-
sujets testés
morts
mortalité
rience en heures
riQue
4,3
la
a
a
24
4,1
la
a
a
24
3,8
la
a
a
24
3,6
la
a
a
24
3,5
10
10
100
3
Tableau 7 - Toxicité de l'acide chlorhydrique ou sulfurique
chez Brachydanio rerio
31
pH
obtenu avec
Nombre de
Nombre de
%de
Durée de l'expé-
11aci de ch1orhy-
drique ou sul fu-
sujets testés
morts
mortalité
rience en heures
rique
4,8
la
a
a
24
4,5
la
a
a
24
3,8
la
a
a
24
3,7
la
a
O·
24
3,5
la
la
100
24
3,4
la
la
100
24
Tableau 8 - Toxicité de l'acide chlorhydrique ou sulfurique
chez SaZmo gai~dnerii
Il est donc probable que la toxicité de l'acide trichloracé-
tique sur la Truitelle et le Poisson zèbre provient essentiellement
de la baisse du pH de l'eau.
Nous en avons eu la confirmation en remplaçant l'eau douce
synthétique par l'eau de ville déchlorée. Cette eau possède un pou-
voir tampon plus fort que l'eau douce synthétique et la quantité de
l'acide trichloracétique nécessaire pour atteindre le pH 3,5 est
beaucoup plus élevée: 1100 p.p.m (Figures 5 et 6 ci-après).
32
pH
8,0
7,0
6,0 ~.-
- e
-----
5,0
4,0
.~
3,0
e~
2,0
o
100
200
300
400
ConcC?ntl"'ot"lon
ppm
Fig. 5 - Influence de l'acide trichloracétique sur le pH de l'eau
douce synthétique a 23°C
pH
8,0
7,0 "1"' "
6,0
5,0
.~
4,0
e _
- e - - - e -_ _ e _ _ _ _
e~
3,0
~I
600
800
900
1000
1100
1200
ConcC?nt l'''otion
ppm
- Fig. 6 - Influence de l'acide trichloracétique sur le pH de l'eau
courante du laboratoire a 23°C
33
Dans ce milieu, aucune toxicité n'est apparue tant que la
valeur de ce pH n'a pas été atteinte, bien que des concentrations en
acide trichloracétique très fortes aient été utilisées.
Concentration
pH
Nbre
sujets
Nombre
de
%de
Durée de l'expé-
(p.p.m)
testés
morts
mortalité
ri ence en heure!
~OO
5,7
la
a
a
24
800
4,0
10
a
a
24
900
3,8
la
a
a
24
1000
3,6
la
0
a
24
1100
3,5
la
10
100
3
1200
3,3
la
10
100
3
Tableau 9 - Toxicité de l'acide trichloracétique chez Braahydanio re~o
en eau de vi 11 e
b- Toxicité de l'acide trichloracétique chez le Loup
Chez le Loup, l'acide trichloracétique a une toxicité qui ne
résulte pas de "l'effet pH" décrit chez les deux espèces de Poissons
précédentes.
Les premières mortalités surviennent à partir de 200 p.p.m
et à 320 p.p.m tous les animaux testés sont morts.
Dans l'eau de mer synthétique, cette concentration n'a qu'une
influence modérée sur le pH qui passe de 8,0 à 6,6 (Figure 7 ci-dessous)
pH 80
1
-------e_
7,0
-e-e-e_e
-----
- e_ _. -e.
6,0
5,0
a
100
200
250
300 325
Influence de ~ ac~de ~rich'Jra:é:
Con c ~ nt ra t ion
pH de l'ea:.. de mer syr.t~é~~Cl~e ~
ppm
34
Nous nous sommes assurés toutefois que ce dernier pH n'était
pas toxique en 24 heures en utilisant de l'acide chlorhydrique pour
amener le pH à la valeur décrite
(Tableau 10 ci-dessous).
pH obtenu avec
Nombre de
Nombre
de
Durée de 11 expê- .
l' aci de ch l orhy-
sujets testés
morts
rience en heures
driQue
7,0
la
0
24
6,9
la
a
24
6,8
la
a
24
6,7
la
a
24
6,6
la
a
24
Tableau la - Effet dlune modification modérée du pH de l'eau de
mer synthétique (avec HC1) chez le Loup
Nous avons alors recherché la CL 50 - 24 h de l'acide tri-
chloracétique en testant différentes concentrations comprises dans
l'intervalle 150-300 p.p.m. Les résultats obtenus sont rapportés
dans le Tableau 11 ci-dessous.
Concentration
pH des
%de mortalité
(p.p.m)
bacs
en 24 heures
175
7,0
10
CL 50 - 24 h = 253 p.p.m
200
7,0
la
Intervalle de confiance sur
225
6,9
20
CL 50 - 24 h (p.p.m) â 95 %
250
6,8
40
279 - 229
275
6,8
60
300
6,7
80
Tableau Il - Toxicité de l'acide trichloracétique chez Diaent~a~ahU8
~brax (cf. annexes 14 et 15)
35
III - DISCUSSION
Les tests de toxicité aiguë tels que nous les avons pratiqués
ont mis en évidence des différences de comportements vis-à-vis des
produits chimiques entre le Loup, le Poisson zèbre et la Truitelle.
D'une manière générale, le Loup paraît être l'espèce la plus sensi-
ble : il l'est généralement plus que la Truitelle ou le Poisson zèbre
pour le bichromate de potassium, il l'est autant que la Truitelle et
davantage que le Poisson zèbre pour le chlorhydrate d'aniline. Pour
l'acide trichloracétique, nous avons montré qu'il l'était également
plus que Salma gairc1nerii et
Bzoaahydanio zoerio.
Ces différences ont des causes multiples. En premier lieu,
elles peuvent résulter des températures choisies. Chez le Loup, com-
me chez le Poisson zèbre, les expériences (ainsi que les acclimata-
tions) se sont déroulées respectivement à 26°C et 23°C, alors que chez
la Truitelle elles ont été effectuées à 14°C. Or la toxicité de nom-
breux composés augmente souvent avec la température (Demael et Pérès,
1972 ; Reiner et al. 1974 ; Edsall et Rottier, 1976 ; Glova et
Mc Inervy, 1977 ; Pérès et Brichon, 1979-19BO ; Yonemori, 1981
Boudou, 1982). Ceci a été vérifié en ce qui concerne la toxicité ai-
guë du bichromate de potassium chez le Poisson zèbre (Brichon, 1978)
et paraît également confirmé chez le Loup puisque dans un travail an-
térieur (Pérès et Brichon, 1979) il a été trouvé une CL 50 - 24 h de
287 p.p.m à 17°C chez des Loups de 30 g environ (contre 144 p.p.m à
26°C). Ces températures doivent cependant être discutées aussi en
fonction des préférendum de chaque espèce. A cet égard, la tempéra-
ture de 26°C retenue pour les essais chez le Loup (et qui correspond
à la température saisonnière) est probablement plus éloignée du pré-
férendum de cette espèce, que ne le sont les températures de 23°C
chez le Poisson zèbre, ou de 14°C chez la Truitelle. Toutefois, bien
que la température de 26°C puisse être considérée comme une tempéra-
ture élevée pour le Loup, nous n'avons constaté aucune mortalité, ni
aucune modification de leur comportement alimentaire.
36
D'autres facteurs, comme la salinité, doivent être également
discutés puisque deux espèces : le Poisson zèbre et la Truite vivent
en eau douce, alors que le Loup vit en eau de mer. L'influence de la
salinité est connue surtout en ce qui concerne la toxicité des sels
métalliques laquelle diminuerait en eau de mer par suite de compéti-
tions avec les sels minéraux (Nelson et al.
1977 ; Sunda et al. 1978).
Nous ne possédons pas d'éléments bibliographiques en ce qui concerne
les toxiques que nous avons utilisés. Par contre, pour l'acide trichlora-
cétique, dont l'effet sur les Poissons d'eau douce résulte de l'abais-
sement du pH, la qualité de l'eau de dilution, surtout son pouvoir
tampon (et par la même sa composition ionique) ont une influence dé-
terminante puisque nous avons montré chez le Poisson zèbre que la
toxicité de cette molécule passe de 330 p.p.m à 1100 p.p.m lorsque
nous remplaçons l'eau synthétique par l'eau de ville (Tableaux 5 et 9).
Mais les variabilités interspécifiques de la toxicité peuvent
aussi traduire des différences de sensibilité intrinsèques analogues
à celles rencontrées chez les Vertébrés plus évolués (Adelman et al.
1976 ; Mc Corkle et al.
1977 ; Mc Kim et al.
1978 ; Knudtson, 1979 ;
Yonemori, 1981 ; Lima et al.
1982). L'âge des animaux peut alors inter-
venir (Tong et al. 1974 ; Lee et al. 1975 ; Spehar, 1976 ; Nebeker et al.
1978), la sensibilité des organismes diminuant avec leur âge. Ceci
peut avoir de l'importance dans nos résultats, car si les Truitelles
et les Loups étaient de jeunes animaux, les Poissons zèbres étaient
des sujets adultes.
Pour qu'un test puisse être standardisé, il doit
être avant tout fiable et reproductible. Pour s'en assurer, plusieurs
laboratoires participent généralement à un test circulaire. Ce fut le
cas pour l' élabora tion du test sur Braahydanio rerio (Cabridenc, 1979b),
Artemia saUna
(Persoone et Vanhaecke, 1981) et Daphnia magnia
(Cabridenc,
1979a). Au cours de notre expérimentation sur Braahydanio rerio~ nous
avons constaté que ce test était extrêmement reproductible, les CL 50-
24 h du bichromate de potassium mesurées sur plusieurs lots de Poissons
étant toujours très proches les unes des autres (cf. annexes 3 et 4).
Ces valeurs sont tout à fait conformes aux normes de l'AFNOR. Cette
bonne reproductibilité est d'ailleurs à l'origine du choix de
37
l'utilisation du bichromate de potassium comme substance de référence
pour l'homologation de chaque lot de Poissons zèbre.
Pour les Truitelles, des essais sont actuellement en cours
de réalisation avec le bichromate de potassium en vue de définir
un protocole susceptible de faire l'objet d'une normalisation. C'est
pourquoi nous ne disposons pas encore de valeurs de référence pour
cette substance. Néanmoins, dans des conditions assez voisines,
Brichon (1978) a trouvé des valeurs assez proches des nôtres
(CL 50 - 24 h = 502 p.p.m). Au cours de la mise au point de ce test,
nous avons constaté qu'il convenait d'accorder un soin particulier à
la qualité du milieu dans lequel se déroule l'acclimatation préala-
ble des Poissons. En effet, ces animaux présentent une sensibilité
très grande envers le chlore et les ni tri tes (Rus so et aZ.
1974 ;
Escoubet, 1978 ; Huey et al.
1982) qui exclu de les conserver en eau
de ville généralement trop chlorée et nécessite l'utilisation d'un
circuit fermé efficace, contrôlé quotidiennement, maintenant des te-
1
neurs en nitrites inférieures à 0,3 mg.I- . A cet égard, les Truites
adultes et les Poissons zèbres sont beaucoup plus tolérants puisque
nous n'avons jamais constaté de mortalité lorsque nous avons été
amené à stocker ces animaux en eau de ville.
Les tests réalisés sur 24 heures avec l'acide trichloracéti-
que ont révélé un type particulier de toxicité aiguë. Chez les Trui-
telles comme chez les Poissons zèbres cette toxicité se manifeste
brutalement, à une concentration très précise, par la mort de la to-
talité des animaux du lot. Nous avons constaté que pour une concen-
tration inférieure de 10 % à cette dose létale, aucune mortalité
n'apparaissait. Nous observons le même phénomène quand la durée du
test n'est que de quatre heures. Cette toxicité provient de la baisse
du pH de l'eau et peut d'ailleurs se retrouver avec d'autres acides.
Pour ces substances, il conviendrait de réduire de façon conséquente
la durée d'exposition au toxique pour que soit vérifiée la relation
sigmoidale entre la concentration de toxique et le pourcentage de
mortalité qui est à la base de la théorie mathématique du calcul de
la CL 50.
38
En ce qui concerne l'aniline, nous avons précédemment justifié
l'utilisation de cette molécule sous sa forme hydrochlorhydratée.
Néanmoins, ces deux molécules ne semblent pas présenter la même toxicité
puisque chez Bachydanio rerio
la CL 50-24 h de la forme naturelle est
de 1,5 p.p.m. (fiche IRCHA) contre ~~i p.p.m. pour le dérivé hydrochloré.
39
TESTS CHRONIQUES
40
TOXICITË CHRONIQUE DU BICHROMATE DE POTASSIUM,
DU CHLORHYDRATE D'ANILINE ET DE L'ACIDE TRICHLORACËTIQUE
Nous avons recherché la toxicité du bichromate de potassium,
du chlorhydrate d'aniline et de l'acide trichloracétique vis-à-vis
de la Truitelle et du Loup après deux à trois semaines d'exposition,
en prenant comme test la mesure d'activités enzymatiques de la bor-
dure en brosse de l'intestin (phosphatase alcaline, maltase et leu-
cine aminopeptidase) ou du métabolisme énergétique intestinal et
branchial (adénosine
triphosphatases). Au niveau sanguin, nous avons
dosé la glycémie et les transaminases : toutes deux représentent un
indicateur de stress. Nous nous sommes expliqués dans l'introduction
sur ce choix.
1 - TESTS CHRONIQUES SUR SALMO GAIRDNERII
a- Animaux d'expérience
Les expériences ont porté sur des Truites d'un poids moyen
de 180 g et d'une taille moyenne de 24 cm, provenant
d'une pis-
ciculture régionale. Après leur transport au laboratoire, les Pois-
sons sont placés dans des bacs de 250 litres recouverts de grillage,
à raison de 12 animaux par bac.
41
Chaque jour, les 4/5 du volume total d'eau sont renouvelés
par siphonage, une heure après avoir distribué aux Poissons des
granulés
spécialement préparés pour cette espèce. L'eau
utilisée pour les milieux d'élevage est de l'eau de ville déchlo-
rée par une aération abondante pendant 48 heures et passage sur
charbon actif.
Les expériences se sont déroulées au printemps dans un vi-
vier thermostaté à 14°C.
b- Déroulement de 11 intoxication.ii
Les Poissons sont d'abord acclimatés à leur nouveau milieu
pendant 15 jours au moins, puis commence l'intoxication.
Plusieurs éventualités ont été envisagées pour apporter le
toxique dans les milieux d'élevage
- l'utilisation d'un circuit fermé:nécessite de contrôler
règulièrement la concentration des toxiques dans les bacs et de
s'assurer de leur non biodégradabilité. En outre, il convient de
vérifier que ces toxiques n'exercent pas d'action indésirable sur
les bactéries qui assurent le bon fonctionnement des circuits fer-
més. Pour toutes ces raisons, nous n'avons pas retenu ce protocole.
- l'utilisation de circuit ouvert: nécessite d'employer
une pompe péristaltique pour introduire le toxique dans un bac mé-
langeur. Le contrôle rigoureux des débits constitue la partie la
plus délicate et la plus astreignante de ce protocole.
Nous avons préféré recourir à un circuit semi-ouvert dans
lequel nous renouvelons chaque jour, par siphonage, les 4/5 du vo-
lume des bacs que nous remplaçons par la même quantité d'un milieu
préparé 24 heures à l'avance. Les inconvénients inhérents aux mé-
thodes précédentes sont ainsi éliminés. Le taux de renouvellement
des milieux évite par ailleurs toute concentration nuisible de ni-
trites ou d'ammoniaque. Ce protocole nécessite cependant une manu-
42
tention importante et l'utilisation d'une protection rigoureuse
(gants, bottes, lunettes et blouse) contre tout contact éventuel
avec les milieux toxiques, tout particulièrement en ce qui concerne
l'aniline.
Les Poissons s'habituent très rapidement aux diverses mani-
pulations pendant le siphonage, d'autant que nous avons pris soin
de les commencer au cours de la période d'acclimatation. Aussi, ne
manifestent-ils aucune agitation, ni aucun comportement alimentaire
anormal.
Les doses de toxiques retenues ont été calculées à partir
des expériences de la CL 50 - 24 h précédentes et fixées au 1/10e,
soit pour le bichromate de potassium: 50,9 p.p.m et pour le chlo-
rhydrate d'aniline 6 p.p.m. Pour l'acide trichloracétique, nous
avons choisi une concentration égale au 1/10e de la dose qui amène
le pH de l'eau de ville à la valeur létale, soit 110 p.p.m. La va-
riation de pH qui en résulte est minime: 7,5 à 7,4.
c- Prélèvement des tissus
En fin d'intoxication, une ponction cardiaque est pratiquée,
le sang est recueilli sur héparine. Les Poissons sont ensuite sa-
crifiés, les intestins et les branchies prélevés. La muqueuse intes-
tinale est séparée du reste des tissus intestinaux par raclage à
l'aide d'une lame de scalpel. Les filaments branchiaux sont décou-
pés
et soigneusement lavés
dans une solution de NaCl 9 %0, de
manière à enlever le maximum de sang qu'ils
contiennent.
Ces tissus sont alors congelés à - 30°C. Au moment du dosage,
ils sont broyés dans de l'eau distillée à 4°C
à raison
d'un gramme de tissu dans trente millilitres d'eau. La durée de con-
gélation n'excède pas une semaine.
43
d- Mesures des activités enzymatiques
.Phos~hatase alcaline intestinale.
---- ----------------------------
La méthode est basée sur la dégradation du p.nitrophényl
phosphate en p.nitrophénol,
suivant la réaction (Bessey et aZ~
1946) :
phosphatase
p.nitrophényl phosphate ---------------------~) p.nitrophénol + H P0
3 4
Les milieux d'incubation sont préparés d'après Eichholtz (1967)
Tampon
glycine - 0,1 M
MgC1 2 6H20 - 0,5 mM
ajusté à pH 10 par NaOH N.
Ce pH correspond à l'optimum d'activité de la phosphatase alcaline,
comme nous l'avons vérifié (figure 8).
Substrat :
solution de CoC1
=
2
24 m~ dans 10 ml de tampon
solution de p.nitrophényl phosphate (substrat)
40 mg dans 10 ml
d'eau distillée
Ces deux solutions sont mélangées volume à volume. La concentration
du substrat est de 5 mM qui correspond à l'optimum d'activité pour
cette enzyme (Whitmore et Goldberg, 1972 a et b).
A 1,0 ml de mélange, est ajouté
0,1 ml de l'homogénat tissu-
laire
Aux temps 0 et 30 mn, 0,3 ml sont prélevés et placés dans 3 ml de NaOH
0,02 N + 0,03 ml EDTApour arrêter la réaction enzymatique.
44
Les tubes sont ensuite centrifugés et les lectures effectuées
à 410 nm. Parallèlement une gamme est préparée avec du paranitrophé-
nol 0,5 lJM/ml.
III
01
:J
tT
'f 200
'01
E
o
.-.
o
-a 100
III
'01
.-.
c
25
::>
9,5
10 10,5 11
pH
Fig. 8 - Effet du pH sur l'activité de la phos-
phatase alcaline de l'intestin de
Truite
Cette enzyme scinde le maltose en deux molécules de glucose
qui est dosé
ensuite par la méthode à la glucose-oxydase (Huggett
et Nixon, 1957).
La technique utilisée pour cette enzyme est adaptée de celle de
Dahlquist (1964).
Tampon
Maléate 0,1 M
à pH 6,5 ; il s'agit de l'optimum d'action de
cette enzyme, comme nous l'avons vérifié (figure 9).
III
01
:J
.~185
'-
'01
E
.2
~
Fig. 9 - Effet du pH sur l'activité
100
Q.
maltasique de l'intestin
de Truite
50
c
."".
::>
20
~5
6
~5
7
7,5 pH
45
Substrat.
Le maltose est utilisé à une concentration de 28 mt.1 qui
correspond à l'optimum d'activité de l'enzyme. Nous l'avons vérifié
au cours d'expériences préliminaires.
Pour la réaction enzymatique, à 1 ml de la solution de
substrat,
est ajouté
0,2 ml de l'homogénat tissulaire.
Aux temps 0 et 30 min.0,2 ml sont prélevés dans un tube de verre
immédiatement porté à 100°C. Nous procédons alors au dosage du glu-
cose (Huggett et Nixon, 1957).
A 0,2 ml de prélèvement, sont ajoutés
3 ml d'un réactif
contenant 25 mg de glucose-oxydase, 0,5 mg de peroxydase et 0,5 ml
d'O-dianisidinedans 100 ml de tampon phosphate
pH 7; Titrisol).
Il convient d'utiliser une qualité de glucose-oxydase dé-
pourvue de maltase ou un tampon Tris M inhibiteur de l'activité
maltasique contaminante.
Le dosage de cette activité enzymatique par la méthode de Gol-
barg et de Rutenburg (1958) en utilisant comme substrat la L. leucyl
B naphtylamide, a été simplifié par Martinek et aZ
(1964). Ce subs-
trat est dégradé en L. leucyl amine qui se dose à 590 nm.
C'est cette procédure que nous avons adoptée chez la Truite.
Tampon :
Tris pH 7,5
5(1 m~1 qui correspond à l'optimum d' efficaci té de l'en-
Zifu~ (figura 10).
III
01
:J.t;00
tT
"-
\\01
E
o
.-
o
~200
Fig. 10 - Effet du pH sur l'activité
de la leucine aminopepti-
III
dase de l'intestin de la
\\01
..:: 100
Truite
c
::::>
6,5
7,1
7,5
8
46
Substrat.
Solution sigma de naphtylamide toute prête, contenant ZO mg/
100 ml
Le milieu d'incubation est préparé en mélangeant 0,5 ml de
tampon + 0,6 ml de substrat + l ml d'HZO.
La concentration en substrat de ce milieu est alors voisine
de l'optimum d'activité de l'enzyme ainsi que nous l'avons vérifié
au cours d'une expérience préliminaire.
A Z,l ml du milieu d'incubation nous ajoutons O,Z ml de
l'homogénat initial dilué dix fois.
Aux temps °et 30 min.
des prélèvements de 1 ml sont recueillis dans
0,5 ml de l'acide trichloracétique 25 t.
Le dosage se poursuit en ajoutant dans chaque tube, toutes
les trois minutes, 0,3 ml de NaNO~ (1 mg/ml) ; 0,3 ml de sulfamate
d'ammonium (kit sigma) et 0,5 ml de NED (Naphtyl éthylène diamine)
(kit sigma). Après 30 minutes à 37°C et une centrifugation à
6000 t/mn pendant 5 minutes, les lectures sont effectuées à 590 nm.
'~9~DQ~!D~_!!!Q~~~P~~!~~~~_i~IP:~=~2_!~!~~!!~~!~~_~!
Q!~~sh!~!~~·
+ +
Les conditions optimales du dosage de l'activité Na K
dans
la branchie de la Truite ont été définies par Pfeiler et Kirschner
(1972) :
NaCl
- 200 mM
MgC1
6H 0
-
5 mM
2
2
KCl
10 mM
Nous avons utilisé un tampon Tris à pH 7,4 (75 mM) et de
l'ouabaine (36,5 mg/l0 ml de tampon) comme inhibiteur des ATPases
+ +
Na K .
47
La concentration en substrat (ATP) est de 4 mM.
De cette manière peuvent être mesurées l'activité ATPasique
2+
+ +
totale, Mg
dépendante et Na K
dépendante.
A 1 ml du milieu d'incubation, nous ajoutons 0,1 ml d'homogé-
nat. Celui-ci a été au préalable placé
à 25°C pendant 15 minutes
de manière à permettre une meilleure évaluation des ATPases Na+K+ dé-
pendantes (Pfeiler et Kirschner, 1972).
Ces conditions ont été utilisées pour l'intestin et la bran-
chie.
Aux temps 0 et 30 min.des prélèvements de 0,4 ml sont recueillis dans
1 ml de l'acide trichloracétique à 10 %. Après centrifugation, nous
procédons au dosage du phosphore sur le surnageant suivant la méthode
de Fiske et Subbarow (1925)
:
A 1 ml du surnageant, nous ajoutons 0,1 ml d'H S0
10N, puis
Z
4
0,1 ml de molybdate d'ammonium à 5 % et 0,1 ml d'ANSA (acide-1-amino-
2-naphtol-4-sulfonique : 6,3 mg/ml).
Ces deux solutions sont préparées extemporanément.
Les standards sont réalisés à partir de K2HP04 1 ~mole/ml.
Les lectures se font après 30 minutes à 37°C, à 880 nm.
Toutes les activités enzymatiques sont mesurées à 25°C pen-
dant 30 minutes. Elles sont rapportées à la quantité de protéines
estimée par la méthode de LOWRY et aZ (1951).
e- Dosage des protéines
25 ~l et 50 ~l des homogénats des tissus de l'intestin et
de la branchie sont dissous dans 100 ~l de NaOH
N pendant au moins
deux heures. Nous ajoutons ensuite 5 ml d'un réactif contenant 20 g
48
Na 2C0 + 0,265 g de tartrate de NaK et 20 ml de Cu S04 à 0,5 %
3
par litre. Après 20 minutes, nous ajoutons 0,5 ml de réactif de
Folin (dilué 2 fois dans l'eau).
Les standards sont préparés à partir
d'albumine bovine
à 250 lJg/ml.
Les lectures se font après 40 minutes à 660 nm.
f-
Oosages de quelques constituants plasmatiques.
Après centrifugation, le plasma est recueilli, sur lequel
nous dosons :
- la glycémie par la méthode à la glucose-oxydase (Huggett
et Nixon, 1957 : voir plus haut).
- les transaminases SGOT et SGPT grâce à un "kit sigma"
(SIGMA: Chemical company P.O. BOX 14508, St Louis, MO 63178 USA
kit nO 505). Ces dosages doivent être pratiqués rapidement en rai-
son du caractère fragile de la SGOT. Ils
sont réalisés à 25°C
pendant une heure.
2. R~8uZtat8
- - - - - - -
Cinq séries de Truites ont été considérées :
- trois séries, intoxiquées par le bichromate de potassium,
le chlorhydrate d'aniline et l'acide trichloracétique. (Au 1/10e de
la CL 50 - 24 h des deux premiers produits, soit respectivement
50,9 p.p.m et 6 p.p.m et au 1/10e de la concentration d'acide tri-
chloracétique qui amène le pH de l'eau de ville de 7,5 à 3,5 soit
110 p. p. m) .
- une série témoin
- une série d'animaux à jeun: cette série a été réalisée
après avoir observé
que certains produits chimiques pou-
vaient entraîner une diminution, voire un arrêt de la prise de
49
nourri ture. Nous verrons pl us 10 in que le bichromate est susceptible de
produire de tels effets.
Nous avons voulu alors préciser quelle
part revenait au jeûne dans les effets de ces produits sur l'enzy-
mologie intestinale et branchiale.
a- Evolution de la mortalité
Chaque série comportait initialement 12 Poissons.
Aucune mortalité n'est survenue sur les animaux témoins, à
jeun ou intoxiqués au bichromate de potassium.
Dans la série intoxiquée par le chlorhydrate d'aniline, des
mortalités sont apparues dès le 4ème jour. Le 6ème jour, la moitié
du lot était mort. L'expérience a été arrêtée quand d'autres Truites
sont mortes (figure 11 ci-dessous).
tyo
\\
d e . : 00
mOl"'taflte 90
80
70
60
50
';0
30
20
10
0
0
1
2
3
5
6
7
8
9
10 11
12
13
14
nombr-e de joul"'s
d'intoxication
Fig. Il - Evolution de la mortalité de Salmo gai~dnerii pendant
l'intoxication chronique au chlorhydrate d'aniline (e)
et à l'acide trichloracétique (0).
50
Chez les Truites traitées par l'acide trichloracétique, les
premières mortalités sont apparues après une semaine. Au bout de
15 jours, il ne restait que la moitié du lot initial (figure 11).
Ces Truites ont alors été sacrifiées ainsi que celles des autres
séries.
b- Rapports intestino-somatiques(RIS)
% de variation
lots expérimentaux
R. I.S.
xlOO
de la moyenne par
~apport aux témoins
-
lot témoin
X = 0,991
Sm
= 0,098
-
lot â jeun
X = 0,511
Sm
= 0,024
- 58,22"
S
lot traité au bichromate
-
l
X = 0,685
Sm
= 0,094
- 55,84
S
de potassium
1
lot traité
chlorhydrate
-
- 51,13
S
au
X = 0,516
Sm
= 0,034
f
d' ani 11 ne
lot traité â l'acide
-
trichloracétique
X = 1,057
Sm
= 0,05
+ 6,6
Tableau 12 - Valeurs des rapports intestino-somatiques (RIS) des Truites
des différents lots (cf. annexe 16)
S
Différences significatives par rapport aux témoins(p<,0,05).
Ce rapport est calculé entre le poids du segment de l'intestin
(tissu entier) compris entre le dernier caecum pylorique et l'anus et
celui du corps du Poisson. Il permet de déceler les états de malnutri-
tion qui entraînent généralement une fonte de l'intestin beaucoup plus
rapide que celle des autres tissus. C'est en particulier ce qui se
passe au cours du jeûne (Creach, 1972 ; Askerov, 1975 ; Lett et aZ~
1976 ; Pérès, 1979 ; Bogé et aZ~ 1979) et c'est ce que nous avons
retrouvé (tableau 12).
51
Une diminution de ce rapport existe aussi chez les animaux
intoxiqués par le chlorhydrate d'aniline, avec toutefois une dis-
persion des valeurs individuelles assez grande (cf. annexe 16 ).
Chez les Truites traitées au bichromate de potassium, la diminution
de ce rapport est beaucoup plus constante. Le RIS est toujours infé-
rieur à celui de la moyenne des animaux témoins. Les Truites intoxi-
quées à l'acide trichloracétique ne présentent pas de modification
de ce rapport.
Ces diminutions du RIS constatées chez les Poissons intoxiqués
par le chlorhydrate d'aniline, mais surtout par le bichromate de potas-
sium, reflètent des modifications du comportement alimentaire très ca-
ractéristiques que nous avions remarquées chaque jour au moment de la
distribution des aliments. Alors que les Truites témoins ou traitées
par l'acide trichloracétique manifestaient un très fort appétit, les
Poissons intoxiqués par le chlorhydrate d'aniline ou par le bichromate
de potassium restaient immobiles au fond des bacs et ne prenaient
au-
[
cune nourriture. Nous avons constaté ultérieurement que les estomacs et
les intestins de ces animaux étaient totalement vides.
c- Activité de la phosphatase alcaline intestinale (tableau 13)
Phosphatase alcaline
%de variation
Lots expérimentaux
(~moles P-nitrophénol/ 9 protéines/mn)
de la moyenne par
rapport aux témoins
~
Lot témoin
X = 59,34
Sm
= 5,99
~
Lot a jeun
X = 16,32
Sm
= 1,29
- 72,49
S
....
Lot traité au bichro-
mate de potassium
X = 8,71
Sm
= 1,96
- 85,32
~
....
Lot traité au chlorhy- X = 16,88
Sm
= 0,67
- 71,55
S
drate d'aniline
....
Lot traité à l'acide
trichloracétique
X = 54,03
Sm
= 5,25
- 8,94
Tableau 13 - Activité de la phosphatase alcaline intestinale chez les Truites
intoxiquées par le bichromate de potassium, le chlorhydrate d'a-
niline, l'acide trichloracétique, à jeun et nourries (les mesures
sont effectuées a 25°C après 30 mn, cf. annexe 17)
S
Différences
significatives par rapport aux témoins (p<O,05).
52
L'activité de cette enzyme diminue de manière très spectacu-
laire chez les Truites intoxiquées au bichromate de potassium et au
chlorhydrate d'aniline ainsi que chez les Poissons à jeun. Par con-
tre, le traitement à l'acide trichloracétique est presque sans effet.
La plus forte inhibition concerne les Truites traitées au bi-
chromate de potassium ( Tableau 13
). Elle est supérieure même à
celle enregistrée chez les Poissons à jeun.
d- Activité de la maltase intestinale (tableau 14)
Maltase
%de variation
Lots expérimentaux
(lJg de glucose libéré/ g protéines/mn)
de la moyenne par
r~pport aux témoins
-
Lot témoin
X = 71 ,06
Sm
= 9,26
-
Lot à jeun
X = 34,49
Sm
= 2,23
- 51,46
S
Lot traité au bichro-
-
mate de potassium
X = 16,46
Sm = 5,07
- 76,83
S
Lot traité au chlorhy-
-X = 35,86
Sm = 2,60
- 49,53
S
drate d'aniline
Lot traité à l'acide
-
trichloracétique
X = 67,60
Sm
= 4,58
- 4,86
Tableau 14 - Activité de la maltase intestinale chez les Truites intoxiquées
par le bichromate de potassium, le chlorhydrate d'aniline et
l'acide trichloracétique, a jeun et nourries (les mesures sont
effectuées a 25°C après 30 mn, cf. annexe 18)
S
Différences significatives par rapport aux témoins (p< 0;05).
L'activité maltasique présente une évolution semblable à celle
de la phosphatase alcaline. Elle diminue fortement chez les Truites
intoxiquées au bichromate de potassium et au chlorhydrate d'aniline,
ainsi que chez les Truites à jeun, mais ne varie pas chez les animaux
intoxiqués à l'acide trichloracétique.
53
e- Activité de la leucine aminopeptidase (lAP) intestinale (tableau 15)
lots expérimentaux
leucine aminopeptidase
1% d, variation
(~moles de a naphtylamine libéré/ 9
de
a moyenne par
protéines/mn)
rapport aux témoins
-
lot témoin
X = 129,10
Sm = 7,77
-
lot a jeun
X =
66,82
Sm
= 4,27
- 48,24
S
lot traité au bichro-
-
mate de potassium
X = 82,81
Sm
= 11 ,42
- 35,85
S
lot traité au chlorhy-
-X = 63,20
Sm
= 7,90
- 51,04
S
drate d'aniline
lot traité a l'acide
-
trichloracétique
X = 122,00
Sm = 9,83
- 5,49
Tableau 15 - Activité de la leucine aminopeptidase intestinale chez les
Truites intoxiquées par le bichromate de potassium, le
chlorhydrate d'aniline et l'acide trichloracétique, à jeun
et nourries (les mesures sont effectuées à 25°C après 30 mn,
cf. annexe 19)
S
Différences significatives par rapport aux témoins (p(0,05).
Nous observons également pour la leucine aminopeptidase
une baisse d'activité chez les Truites intoxiquées par le bichro-
mate de potassium et le chlorhydrate d'aniline, ainsi que chez
celles ayant jeQné. Mais cette diminution est plus faible que
celle de la phosphatase alcaline ou de la maltase .
•
54
f- Activités des ATPases intestinales (tableaux 16 et 17)
%de variation
Lots expérimentaux
ATPases totales et Mg2+ dépendantes
(~moles de phosphore/ 9 protéines/mn)
de la moyenne par
rapport aux témoins
X =
T
22,27
Srnr
= 5,61
Lot témoin
Xo = 18,37
Sm
=
O
2,41
------------------------~----------------------------------------- ---------------------
X
=
T
22,99
Srnr
= 2,07
+
3,23
Lot à jeun
Xo = 19,72
Sm
=
O
1,22
+
6,06
------------------------~----------------------------------------- --------------------- r
Lot traité au bichro-
XT = 21,94
SmT = 3,39
-
1,48
mate de potassium
X =
=
o
15,24
Sm
2,21
-
17,03
O
------------------------------------------------------------------ ---------------------
Lot traité au chlorhy-
XT = 28,12
SmT = 2,17
+ 26,26
drate dl ani line
vhO = 19,79
Sm
=
O
1,49
+
7,72
----------------------- ------------------------------------------~---------------------
X =
Lot traité
20,18
Srnr
= 3,59
-
9,38
â l'acide
T
trichloracétique
Xo = 18,24
Sm
=
O
3,50
-
0,70
2
T = totale ; ° = Mg + dépendante
2
Tableau 16 - Activités ATPasiques totales et Mg + dépendantes de l'intestin
des Truites intoxiquées par le bichromate de potassium, le chlo-
rhydrate d'aniline et l'acide trichloracétique, â jeun et nour-
ries (les mesures sont effectuées à 25°C pendant 30 mn,
cf. annexe 20 et 21)
+ +
ATPases Na K (~moles
%~e+l 'activité
%de variation
Lots expérimentaux
de phosphore/ 'g pro-
Na K par rapport
de la moyenne par
téines/mn)
â l'activité to-
rapport aux témoins
tale
Lot témoin
X"= 4,75 Sm = 3,37
21,32
Lot â jeun
X=
3,28
Sm = 1,78
14,26
- 30,94
Lot traité au bichro-
X=
6,84
Sm = 1,61
31,17
+ 44
mate de potassium
Lot traité au chlorhy-
X"= 8,35 Sm = 0,77
29,69
+ 75,78
drate d'aniline
Lot traité à l'acide
X=
1,94 Sm = 0,55
9,61
- 59,15
trichloracétique
Tableau 17 - Activités ATPasiques Na+K+ dépendantes (ouabaine sensible) de
l'intestin des Truites intoxiquées par le bichromate de potassium,
le chlorhydrate d'aniline et l'acide trichloracétique, â jeun et
nourries (les mesures sont effectuées à 25-C pendant 30 mn,
cf. annexe 22)
55
Les activités ATPasiques totales sont sensiblement accrues
chez les Poissons traités au chlorhydrate d'aniline. Celles qui dé-
2
pendent du Mg + diminuent après traitement au bichromate de potas-
sium. Toutefois, aucune de ces variations n'est significative d'un
point de vue statistique (cf. tableau 16).
Les activités des ATPases Na+K+ dépendantes représentent
toujours une faible proportion des activités ATPasiques totales
(cf. tableau 17). De ce fait, elles sont souvent difficiles à doser
sur les homogénats. Ceci explique probablement les dispersions que
nous observons.
Ces activités paraissent stimulées chez les Poissons trai-
tés par le bichromate de potassium et par le chlorhydrate d'aniline,
alors qu'elles seraient inhibées après traitement par l'acide tri-
chloracétique. Le jeûne semble les réduire faiblement. Toutefois,
comme pour les autres classes d'ATPases, les effets de ces traite-
ments ne sont pas significatifs d'un point de vue statistique.
(cf. tableau 17).
g- Activités ATPasiques branchiales (tableaux 18 et 19)
ATPases totales et Mg2+
%de variation
Lots expérimentaux
(lJmoles de phosphore! 9 protéines/mn)
de la moyenne par
r~pport aux témoins
r
Lot témoin
T = 81,28
SmT = 7,08
ra = 73,61
SmO = 5,24
r
jeun
T = 80,30
S"T
= 5,16
- 1,20
Lot a
ra = 73,20
SmO = 3,20
- 0,55
r
Lot traité au bichro-
T = 68,72
S"T
= 6,72
- 15,45
mate de potassium
ra =63,61
SmO = 5,23
- 13,58
Lot traité au chlorhy-
XT = 58,67
Sn;-
= 10,85
- 27,81
drate d'aniline
Xo
52,72
SmO = 8,04
- 28,37
=
X
Lot traité a l'acide
T
= 59,59
Sn;-
= 13,58
- 26,68
trichloracétique
Xo =55,86
SmO = 11,94
- 24,11
T = totale ., a = Mg~+ dépendante
2
Tableau 18 - Activités ATPasiques totales et Mg + dépendantes de la branchie des
Truites intoxiquées par le bichromate de potassium, le chlorhydrate
d'aniline et l'acide trichloracétique, à jeun et nourries (les me-
sures sont effectuées à 25°C pendant 30 mn, cf. annexes 23 et 24)
56
+ +
ATPases Na K (~moles
% ~e+l 'activité
%de variation
Lots expérimentaux
de phosphore! 9 pro-
Na K par rapport de la moyenne par
téines!mn)
a l'activité to-
rapport aux témoins
tale
Lot témoin
x= 7,91 Sm =2,85
9,73
Lot a jeun
x= 7,34 Sm =2,61
9,14
- 7,20
Lot traité au bichro-
x= 5,66 Sm = 2,13
8,23
- 28,44
mate de potassium
Lot traité au chlorhy- I= 4,15 Sm =0,93
7,07
- 47,53
drate d'aniline
Lot traité a l'acide
x= 3,82 Sm = 1,93
6,41
- 51,70
trichloracétique
1
Tableau 19 - Activités ATPasiques Na+K+ dépendantes (ouabaine sensible)
des branchies des Truites intoxiquées par le bichromate de
potassium, le chlorhydrate d'aniline et l'acide trichlora-
1
cétique, a jeun et nourries (les mesures sont effectuées a
25°C pendant 30 mn, cf. annexe 25)
Les
~
activites de l'ensemble des ATPases ( totales, Mg 2+ et
Na+K+ dépendantes) sont plus élevées dans la branchie que dans l'in-
testin, chez les poissons témoins.
Toutefois, la proportion des activités ATPasiques Na+K+ dé-
pendantes par rapport aux activités totales est plus faible dans la
branchie (tableau 19).
Sous l'effet des trois toxiques, l'activité des ATPases tota-
2
les ou Mg + dépenrumtes
est légèrement plus basse que chez les témoins,
mais aucune différence n'est statistiquement significative (tableau 18).
Les ATPases Na+K+ présentent une baisse d'activité chez les
Poissons intoxiqués par le bichromate de potassium, l'acide trichlo-
racétique et le chlorhydrate d'aniline, mais du fait des très fortes
dispersions des résultats, cette inhibition ne possède pas non plus
de caractère significatif du point de vue statistique (tableau 19).
57
h- Paramètres sanguins - Glycémie (tableau 20)
%de variation'
Lots expérimentaux
Glycémie (~g glucose/ml de plasma)
de la moyenne par
r~pport aux témoins
Lot témoin
x= 619,4
Sm = 54,5
Lot a jeun
'X" = 552,2
Sm = 52,9
- 10,84
Lot traité au bichro-
'X" = 1050
Sm = 128,8
+ 69,51
S
mate de potassium
Lot traité a l'acide
'X" = 927,2
Sm = 72,0
+ 49,66
S
trichloracétique
Tableau 20 - Influence des produits chimiques et du jeQne sur la glycémie
de la Truite (cf. annexe 26)
S : Différences significatives par rapport aux témoins (p<0,05).
Les teneurs en glucose plasmatique augmentent fortement chez
les Poissons intoxiqués par le bichromate de potassium et l'acide tri-
chloracétique. Chez les animaux intoxiqués par le chlorhydrate d'ani-
line, les prélèvements de sang n'ont pu être réalisés de façon satis-
faisante.
Transaminases (tableaux 21 et 21 1 )
%de variation
de la moyenne par
Lots' expérimentaux
SGOT
uni té/ml
rapport aux témoins
Lot témoin
'X" =
55,6
Sm =
6,9
Lot traité au bichro-
'X" = 105,0
Sm =
7,9
+ 88,84
S
mate de potassium
Lot traité à l'acide
trichloracétique
'X" =
61,8
Sm = 10
+ 11 ,15
Tableau 21 - Influence des produits chimiques sur la SGOT de la Truite
(cf. annexe 27)
S : Différences significatives par rapport aux témoins (p <0,05).
58
~l de variation
Lots expérimentaux
SGPT
uni té/ml
e la moyenne par
rapport aux témoins
Lot témoin
X" = 3,25
Sm =
1,05
Lot traité au bichro-
X" = 2,75
Sm =
0,796
- 15,38
mate de potassium
Lot traité a l'acide
X" = 2,00
Sm =
0,949
- 38,46
trichloracétique
Tableau 21' - Influence des produits chimiques sur la SGPT de la Truite
(cf. annexe 28)
1
,
Les activités de SGOT et SGPT du plasma des Truites sont
très différentes. La première est plus élevée et présente une
grande stabilité. Elle peut être évaluée sur des échantillons
congelés. La seconde, en revanche très labile, doit être mesurée
le plus rapidement possible après les ponctions cardiaques.
LI acti vi té
de la SGOT
est
en augmentation chez
les Poissons intoxiqués par le bichromate de potassium, mais ne
varie
pas chez les Truites intoxiquées par l'acide trichloracé-
tique.
Ces résultats dénotent un état de stress général impor-
tant chez les Poissons intoxiqués.
59
II - TESTS CHRONIQUES SUR DICENTRARCHUS LABRAX
a- Animaux d'expérience
Ces travaux ont porté sur des Loups d'âge 0+ d'un poids moyen
de 13,25 g et d'une taille moyenne de 8,96 cm. Ils proviennent du
Centre de la DEVA SUD (CNEXO) à Palavas. Après leur transport, ils
sont restés un mois au laboratoire à 23°C, en eau de mer constam-
ment renouvelée. Une alimentation leur était distribuée quotidien-
nement sous forme de granulés spécialement fabriqués pour cette es-
pèce, de marque
"Aqualim".
b- Déroulement de l'intoxication
. Dispositif d'intoxication
Pour des raisons évoquées plus haut (paragraphe b sur Satmo
gairœwrii) nous avons eu recours à un dispositif en circuit semi-
ouvert. Il comporte cinq bacs de stabulation des Poissons: trois
recevront les toxiques, un servira de témoin, dans le dernier seront
conservés les animaux à jeun pendant la durée de l'expérience. Cha-
que bac contient 70 litres, il est en communication par l'intermé-
diaire d'un robinet, avec un bac de stockage de même volume
placé
à un niveau supérieur. Il dispose par ailleurs d'une canne en PVC
plongeant jusqu'au fond et d'un dispositif d'aération (voir schéma
ci-après). Les bacs contenant les Poissons sont recouverts d'une
feuille de plastique translucide ou est percée d'une
fenêtre par la-
quelle sera introduite quotidiennement la nourriture.
Ce dispositif est placé dans une pièce thermostatée à 23°C
qui est la température saisonnière au moment de ces expériences
(automne). Chaque jour, nous procédons au renouvellement de l'eau
des bacs de stabulation en ouvrant le robinet de communication avec
le bac réservoir. Nous réalisons en même temps un siphonage du bac
inférieur. Le bac supérieur est alors rempli avec la quantité désirée
60
Schéma du dispositif expérimental pour l'exécution
des tests chroniques chez le Loup
1. Arrivée eau de me"
2. Robinet
3. Bac réservoir (laC 11
4. Bac expérimental des Loups (100 1)
5. Surverse
6. Evacuation du trop plein des bacs expérimentaux
7. Support des bacs réservoirs
8. Oxygénation
9. Feuille de plastique translucide
61
de toxique ou d'eau de mer. En 24 heures, la température atteint
23°C.
Ce dispositif permet de renouveler rapidement le milieu d'in-
toxication en limitant les réactions de stress.
Le taux de nitrites reste ainsi toujours inférieur à
1
0,2 p.p.m.
1
. Modalité d'intoxication
Après un mois de stabulation dans les aquariums en circuit
ouvert, les Poissons sont répartis dans les différents bacs du dispo-
sitif décrit plus haut à raison de 12 Loups par bac.
Pendant un mois, nous renouvelons quotidiennement l'eau des
circuits comme il vient d'être décrit, une heure après avoir nourri
les Poissons. Cette période est suffisante pour qu'ils s'habituent à
leur nouveau milieu. Nous constatons alors qu'ils ont un comportement
alimentaire
normal.
L'expérience d'intoxication commence alors.
Les doses de toxiques correspondent au 1/10e de la CL 50-24 h
calculées précédemment pour le bichromate de potassium et le chlorhy-
drate d'aniline, soit respectivement 14,2 et 5,8 p.p.m. Pour l'acide
trichloracétique, nous avons utilisé une concentration de 60 p.p.m
qui représente le 1/10e de la concentration qui amène le pH de l'eau
de mer de 7,9 à 3,5. Le pH passe alors de 7,9 à 7,5. Les autres pro-
duits entraînent également une légère baisse de pH qui est de 0,3 uni-
té environ.
Ces toxiques sont ajoutés à l'eau des bacs réservoirs où ils
restent pendant 24 heures avant d'être introduits dans les bacs de
stabulation des Poissons.
1
l
62 .
L'expérience d'intoxication a été poursuivie pendant trois
semaines.
c- Prélèvement des tissus
En fin d'intoxication, du sang est prélevé par ponction car-
diaque et recueilli sur héparine. Cette opération est très difficile
à réaliser sur les petits Loups. En particulier, une dilution est
possible au moment de la ponction en raison des très petites quanti-
tés recueillies (moins de 0,5 ml). Pour cette raison, les résultats
des paramètres sanguins seront à considérer avec réserve.
Le Poisson est ensuite décapité, les intestins et les lamel-
les branchiales prélevés. Etant donné la petite taille des intestins,
nous n'avons pas pu racler la muqueuse comme chez la Truite. La tota-
lité de l'intestin (caecums compris) est prélevée puis congelée à
- 30°C. Les lamelles branchiales sont soigneusement lavées dans une
solution de NaCI à 12 °/00 avant d'être congelées à - 30°C aussi.
La conservation au froid avant les dosages n'excède pas une semaine.
Au moment du dosage, les tissus sont décongelés, puis broyés
dans un volume d'eau distillée à raison d'un gramme de tissu branchial
ou intestinal pour 30 ml d'eau distillée froide.
d- Mesure des activités enzymatiques.
Les dosages ont porté sur les mêmes activités enzymatiques
que chez la Truite en utilisant des méthodes analogues. Pour tenir
compte des particularités propres au Loup, nous avons réalisé une ex-
ipérience complémentaire destinée à préciser les concentrations opti-
baIes du substrat. Pour le choix du pH, nous avons utilisé les résul-
Ita ts de Brigaudeau (1981).
63
Le dosage se fait dans les mêmes conditions que celui de la
Truite: c'est-à-dire à une concentration de P.nitrophényl phosphate
de 5 mM et à un pH de 10 qui correspond à l'optimum de l'enzyme et
en présence de CoC1
(1,2 mg/ml).
2
A 1 ml du milieu d'incubation nous ajoutons 0,1 ml d'homogé-
nat (dilué au préalable quatre fois dans de l'eau distillée) (figure 12) •
•
e
_ _ _
'
pH
~
_
~
'
8,4
9
1 a
11
Fig. 12 - Influence du pH sur l'activité de la phosphatase
alcaline intestinale
- substrat p-nitrophényl phosphate
- température 37°C
(Brigaudeau, 1981)
1
64
1
1
. Maltase
intestinale.
--------------------
Pour une concentration en maltose de 30 ~I, l'activité de la
tase du Loup est proche de son maximum. Par ailleurs, comme chez
la Truite, elle présente un optimum à pH 6,5 (figure 13).
cE
""""
III
QI
C
X
\\QI
2000
0
'-
a.
QI
"'0
-~
C1'
~
•
III
'QI
'-
QI
.0
1000
•
QI
III
0
u
:J
Ci\\
---\\
QI
"'0
•
0"
•
:2-
N
pH
"
0
><
5,2
6,5
7
8,~
9
10
Fig. 13 - Influence du pH sur l'activité de la maltase
intestinale
- substrat maltose (amylose)
1
- température 37°C
(Bri gaudeau. 1981)
1
fi
Pour le dosage à 0,5 ml de milieu d'incubation, sont ajoutés
1
ons 0,1 ml d'homogénat dilué quatre fois dans l'eau distillée.
l
1
t
1
-------------~
65
• Leucine aminopeptidase (LAP) intestinale.
----------------------------------------
En utilisant 0,5 ml de substrat LAP sigma, pour 2 ml de milieu
d'incubation, l'activité de cette enzyme est voisine de sa valeur
maximale.
Chez le Loup, l'optimum de pH de fonctionnement de la LAP est
voisin de 7,2 (figure 14).
QI
C
. -
90
E
o
~
.J:.
85
0-
o
C
•
<n., BO
QI
"'0
lit
QI
o
>
E
L ---
_
:2-
N
pH
o
5,2
6,2
7,2
8,4
9
1 0
"
>-
Fig. 14 - Influence du pH sur l'activité de la leucine
aminopeptidase (LAP) intestinale
- substrat L-leucyl naphtylamine
- température 3rC
(Bri gaudeau, 1981)
Pour le dosage à 2 ml du milieu d'incubation (0,5 ml tampon
7,2
50 mM + 0,5 ml LAP substrat sigma + 1 ml H~O) nous ajoutons
...
0, 1 ml d'homogénat dilué quatre fois.
66
. ..:\\_d_(n2..5J.!1_e_-_t.!Jj>_h_o..sj>]1~_t~..s.-e..s _J}}Y~~_e~]_!~!~ ~! !!!~!~ ~ _~!
~!ê!!Sh!~!~~·
Nous avons utilisé un milieu d'incubation analogue à celui
employé par Pfeiler et Kirchner (1972) pour la Truite d'eau de mer
(NaCI
200 mM, MgCl
5 mM, KCI
10 mM) avec un tampon Tris pH 7,4
2
(75 mM) et 36,5 mg/l0 ml d'ouabaine pour inhiber les ATPases Na+K+.
La concentration du substrat est de 4 mM.
Ce milieu est utilisé pour l'intestin et les lamelles bran-
chiales.
A 1 ml du milieu d'incubation, nous ajoutons 0,1 ml d'homo-
génat.
Toutes les réactions enzymatiques sont réalisées, comme chez
la Truite, à 25°C pendant 30 minutes. Les résultats sont rapportés à la
quantité de protéines des prélèvements (Lowry et al, 1951).
e) Dosages de quelques constituants plasmatiques.
Sur le plasma a été évaluée la glycémie selon la méthode à
la glucose-oxydase de Huggett et Nixon (1957) après centrifugation
du sang total.
2. R~8uZtat8
- - - - - - -
Nous avons distingué cinq séries de Loups :
- trois séries d'animaux intoxiqués par le bichromate de
potassium (14,4 p.p.m), le chlorhydrate d'aniline (5,8 p.p.m) et
l'acide trichloracétique (60 p.p.m)
- une série d'animaux à jeun
- une série de témoins
67
a- Evolution de la mortalité
Chaque série comportait au départ 12 animaux. Aucune morta-
lité n'est survenue chez les Poissons témoins à jeun ou intoxiqués
par le bichromate de potassium ou le chlorhydrate d'aniline pendant
trois semaines. Dans la série intoxiquée à l'acide trichloracétique,
trois Poissons sont morts au cours de la première semaine.
L'expérience a été arrêtée après trois semaines d'intoxica-
tion.
b- Rapport intestino-somatique RIS (tableau 22)
% de variation
Lots expérimentaux
RIS
x 100
de la moyenne par
rapport aux témoins
Lot témoin
x= 2,264
Sm = 0,123
Lot à jeun
x= 1,386
Sm = 0,112
- 38,78
S
Lot traité au bichro-
x= 2,127
Sm = 0,244
6,05
-
mate de potassium
Lot traité au chlorhy-
x= 1,978
Sm = 0,111
- 12,63
drate dl aniline
Lot traité à l'acide
x= 2,295
Sm
0,191
+ 1,36
trichloracétique
=
Tableau 22 - Rapport intestino-somatique (RIS) chez les Loups intoxiqués
ou à jeun (cf. annexe 29)
S
différences significatives par rapport aux témoins (p(0,05).
Ce rapport est calculé entre le poids des intestins et le
poids du corps. Il diminue comme chez la Truite au cours du jeûne,
mais non sous l'effet des toxiques qui ne semblent donc pas avoir
entraîné de ralentissement important dans la prise alimentaire.
Ceci a été confirmé par l'examen du contenu de l'estomac toujours
plein.
68
Pourtant des modifications du comportement alimentaire ont
été décelées chez les animaux intoxiqués par l'acide trichloracétique
mais surtout par le chlorhydrate d'aniline. Ceux-ci manifestaient
très visiblement un moindre appétit que les Poissons témoins ou que
ceux traités au bichromate de potassium.
1
c- Activité de la phosphatase alcaline intestinale (tableau 23)
l
%dT variation
Lots expérimentaux
Phosphatase alcaline
de
a moyenne par
rapport aux témoins
{llmoles p.nitrophénoll 9 protéines/mn~
Lot témoin
'1= 215,05
Sm = 16,39
Lot il jeun
'1= 310,92
Sm = 37,27
+ 44,58
S
Lot traité au bichro-
'1=
98,11
Sm = 18,62
- 54,37
S
mate de potassium
Lot traité au chlorhy-
r= 234,39
Sm = 21,98
+ 8,99
drate d'aniline
Lot traité il l'acide
r= 216,74
Sm = 27,41
+ 0,78
trichloracétique
Tableau 23 - Activité de la phosphatase alcaline dans l'intestin des Loups
sous l'effet du jeûne et des différents produits chimiques
(les mesures sont effectuées à 25°C pendant 30 mn,
cf. annexe 30)
S
différences significatives par rapport aux témoins (p(0,05).
L'activité de la phosphatase alcaline présente une forte
inhibition à la suite de l'intoxication au bichromate de potassium.
Elle diminue de 54,37 t.
Par contre, le chlorhydrate d'aniline et l'acide trichloracé-
tique sont sans effet.
Le jeûne exerce une stimulation très nette de cette activité
à l'inverse de ce que nous avions observé chez la Truite.
69
d- Activité de la maltase intestinale (tableau 24)
Maltase
%de variation
lots expérimentaux
de la moyenne par
(lJg de glucosel g protéines/mn)
rapport aux témoins
lot témoin
X"= 67,02
Sm = 3,21
lot a jeun
X"= 75,33
Sm = 8,23
+ 12,39
lot traité au bichro-
x= 59,72
Sm = 6,13
- 10,89
mate de potassium
lot traité au chlorhy-
X"= 68,05
Sm = 4,56
+ 1,53
drate d'aniline
lot traité â l'acide
X"= 65,12
Sm = 7,39
- 2,83
tri ch1oracéti que
Tableau 24 - Activité maltasique dans l'intestin des loups sous l'effet
du jeûne et des différents produi ts chi mi ques (1 es mesures
sont effectuées â 25°C pendant 30 mn, cf. annexe 31)
L'activité maltasique présente les mêmes variations que
la phosphatase alcaline, mais considérablement atténuées. Ainsi,
nous observons une baisse chez les Loups intoxiqués par le bichro-
mate de potassium et une stimulation chez ceux ayant jeûné.
Toutefois, ces modifications ne sont pas significatives
du point de vue statistique.
70
e- Activité de la leucine aminopeptidase (LAP) intestinale (tableau 25)
%dT variation
Leucine aminopeptidase
Lots expérimentaux
de
a moyenne par
1
(~moles de a naphtylamine libéré/' 9
rapport aux témoins
protéines/mn)
Lot témoin
1= 23,81
Sm = 1,42
Lot à jeun
1= 19,87
Sm = 1,42
- 16,54
Lot traité au bichro-
x= 26,31
Sm = 1,92
+ 10,49
mate de potassium
Lot traité au chlorhy-
1= 23,15
Sm = 0,86
+ 2,77
drate d'aniline
Lot traité à l'acide
r= 20,40
Sm = 1,07
- 14,32
trichloracétique
Tableau 25 - Activité de la leucine aminopeptidase dans llintestin des
Loups sous l'effet du jeOne et des différents produits
chimiques (les mesures sont effectuées â 25°C pendant 30 mn,
cf. annexe 32)
L'intoxication par le bichromate de potassium, le chlorhy-
drate d'aniline, comme l'acide trichloracétique, pas plus que le
jeûne n'ont d'incidence significative sur l'activité de cette en-
zyme.
71
f- Activité des ATPases intestinales (tableaux 26, 27, 28)
ATPases totales et Mg2+ dépendantes
%de variation
Lots expérimentaux
(~moles de phosphore/ 9 protéines/mn)
de la moyenne par
rapport aux témoins
r =
T
45,15
S~ = 3,39
Lot témoin
10 = 29,88
Sm
=
O
2,73
r
Lot
= 62,85
à jeun
T
S~ = 8,41
+ 39,20
S
r = 41,63
O
SmO = 7,14
+ 39,32
Lot traité au bichro-
t =
T
45,83
S~ = 4,47
+ 1,50
mate de potassium
Xo = 24,30
SmO = 4,01
- 10,67
Lot traité au chlorhy-
'1T = 44,40
S~ = 2,64
- 1,66
drate d'an"iline
X
!
o = 29,61
Sm =
O
1,33
- 0,90
Lot traité à l'acide
t = 47,65
T
S~ = 6,82
+ 5,53
trichloracétique
1
'1 = 24,85
= 4,61
- 16,83
0
SmO
2
T = total ; ° =Mg + dépendant
Tableau 26 - Activité des ATPases totales et Mg2+ dépendantes dans l'intestin
des Loups sous l'effet du jeûne et des différents produits chimi-
ques (les mesures sont effectuées à 25°C après 30 mn,
cf. annexes 33 et 34)
S
différences significatives par rapport aux témoins(p <0,05).
,
ATPases Na+K+ dépendantes
%de variation
Lots expérimentaux
de la moyenne par
(~moles de phosphore/ 9 protéines/mn)
rapport aux témoins
Lot témoin
t= 15,27
Sm = 1,83
Lot à jeun
t= 21,22
Sm = 2,91
+ 38,96
Lot traité au bichro-
1= 21,50
Sm = 1,69
+ 40,79
S
mate de potassium
Lot traité au chlorhy-
1= 14,79
Sm = 1,44
- 3,14
drate d'aniline
Lot traité à l'acide
1= 22,80
Sm = 3,11
+ 49,31
S
trichloracétique
Tableau 27 - Activité des ATPases Na+K+ dépendantes dans l'intestin des Loups
sous l'effet du jeûne et de différents produits chimiques (les
mesures sont effectuées à 25°C après 30 mn, cf. annexe 35)
S
différences significatives par rapport aux témoins (P<0,05).
72
1% de variation
ATPases Na
Lots expérimentaux
+K+ dépendantes x 100
~e la moyenne par
ATPases totales
~apport aux témoins
Lot témoin
'1= 33,93
Sm = 3,40
Lot â jeun
'1= 35,37
Sm = 4,93
+
4,12
Lot traité au bichro-
'1= 49,19
Sm = 4,97
+ 44,83
S
mate de potassium
Lot traité au chlorhy-
'1= 32,73
Sm = 1,45
3,53
drate d'aniline
Lot traité â l'acide
x= 48,69
Sm
5,19
+ 43,36'
S
trichloracétique
=
Tableau 28 - Influence des produits chimi~u~s et du jeûne sur le pourcentage
de l'activité des ATPases Na K dépendantes par rapport â celle
des ATPases totales de l'intestin des Loups sous l'effet du
jeûne et des produits chimiques (cf. annexe 36)
S : différences significatives par rapport aux témoins (p< 0,05).
Chez le Loup, la répartition des diverses classes d'ATPases
est différente de celle de la Truite: chez les Poissons témoins,
les ATPases stimulées par Na+K+ représentent 33,9 % des ATPases to-
tales, la différence étant constituée essentiellement des ATPases
stimulées par Mg 2+ (tableau 28). Chez la Truite, les ATPases Na+K+
dépendantes ne constituent que 21,32 % de l'ensemble de l'activité
ATPasique.
L'intoxication par le bichromate de potassium, le chlorhy-
drate d'aniline, l'acide trichloracétique et le jeUne affectent di-
versement ces activités enzymatiques :
- les ATPases totales sont augmentées par le jeUne d'une
manière voisine de la signification statistique (tableau 26)
- les ATPases Mg 2+ dépendantes augmentent également chez
les animaux à jeun, mais de façon non significative (tableau 26)
- les toxiques ont davantage d'effet sur les ATPases Na+K+
leur activité est stimulée significativement chez les Poissons
73
intoxiqués au bichromate de potassium et à l'acide trichloracétique.
Le jeOne paraît avoir un effet semblable, mais la différence avec
les Poissons témoins n'est pas significative d'un point de vue sta-
tistique (tableau 27).
- E.nfin, un effet du bichromate de potassium et de l'acide
trichloracétique peut être observé sur le pourcentage des ATPases
Na+K+ par rapport à l'activité ATPasique totale (tableau 28).
Le bichromate de potassium et l'acide trichloracétique sti-
muleraient donc de façon spécifique les ATPases Na+K+ dépendantes,
alors que le jeOne augmenterait à la fois et dans des proportions
2
voisines, l'activité des ATPases Na+K+ et Mg + dépendantes.
g- Activité des ATPases branchiales (tableaux 29, 30, 31)
2
%de variation
ATPases totales et Mg + dépendantes
Lots expérimentaux
de la moyenne par
(lJmoles de phosphorel 9 protéines/mn)
rapport aux témoins
XT = 59,47
SrTT = 5,13
Lot témoin
Xo = 34,21
SmO = 3,17
XT = 53,05
SrTT = 4,82
- 10,79
Lot a jeun
Xo = 42,47
SmO = 3,17
+ 24,14
Lot traité au bichro-
XT = 61,15
SrTT = 7,94
+
2,82
mate de potassium
Xo = 41,80
SmO = 6,34
+ 21,18
Lot traité au chlorhy-
XT = 56,39
SmT = 5,71
- 5,17
drate d'aniline
Xo = 41,88
SmO = 4,14
+ 22,42
Lot traité a l'acide
XT = 60,29
SmT = 4,37
+
1,37
trichloracétique
Xo = 40,42
SinD = 3,21
+ 18,15
T = totale ;
o = MgZ+ dépendant
2
Tableau 29 - Activité des ATPases totales et Mg + dépendantes branchiales
des Loups sous l'effet du jeûne et de différents produits
chimiques (les mesures sont effectuées a 25°C après 30 mn,
cf. annexes 37 et 38)
t
74
ATPases Na+K+ dépendantes
% de variat:fons
Lots expérimentaux
de la moyenne par
(~moles de phosphore/ 9 protéines/mn)
rapport aux témoiM
Lot témoin
1= 25,26
Sm = 4,64
Lot A jeun
X"= 10,61
Sm = 2,86
- 57,99'
S
Lot traité au bichro-
X"= 19,40
Sm = 2,50
- 23,19
mate de potassium
Lot traité au chlorhy-
X"= 14,51
Sm = 3,49
- 42,55'
S
drate dl ani line
Lot traité à l'acide
1= 19,84
Sm = 2,18
- 21,45
trichloracétique
Tableau 30 - Activité des ATPases Na+K+ dépendantes de la branchie des Loups
sous l'effet du jeûne et de différents produits chimiques (les
mesures sont effectuées A 25°C après 30 mn, cf. annexe 39)
S : différences significatives par rapport aux témoins (p.( 0,05).
a
ATPases Na+K+ dépendantes
dT variation
Lots expérimentaux
x 100
e
a moyenne par
ATPases totales
rapport aux témoi~
Lot témoin
x= 41,32
Sm = 5,81
Lot à jeun
x= 18,20
Sm = 4,08
- 55,95·
S
Lot traité au bichro-
X"= 32,73
Sm = 2,35
- 20,78
mate de potassium
Lot traité au chlorhy-
1= 23,86
Sm = 5,02
- 42,25
S
drate d'aniline
Lot traité A l'acide
X"= 32,72
Sm = 2,63
- 20,81
trichloracétique
Tableau 31 - Pourcentage de 1'activité des ATPases Na+K+ dépendantes par
rapport A celle des ATPases totales dans la branchie des
Loups sous l'effet du jeûne et des différents produits chi-
miques (annexe 40)
S : différences significatives par rapport aux témoins (p< 0,05).
75
L'activité ATPasique branchiale totale diffère assez peu de
celle de l'intestin chez les animaux témoins. Elle est peu affectée
par le jeûne ou par les produits testés. Il en est d'ailleurs de
2
même de la fraction sensible au Mg + (tableau 29).
L' acti vi té des ATPases Na +K+ d~pendantes
est plus ~lev~e par
contre que dans l'intestin et elle représente une proportion plus
importante de l'activité totale (tableaux 30 et 31). Cette classe
d'ATPases est extrêmement sensible au jeûne, puisque son activité
diminue de plus de SS \\ après trois semaines de privation de nour-
riture. C'est ~galement la fraction la plus sensible aux toxiques.
Toutefois, leur effet est assez modéré sauf chez les Poissons in-
toxiqués par le chlorhydrate d'aniline, chez lesquels nous observons
une baisse statiquement significative de la proportion de ces ATPases
Na+K+ d~pendantes par rapport aux ATPases totales. Le jeûne a d'ail-
leurs la même incidence sur ce rapport (tableau 30).
h- Glycémie (tableau 32)
Glycémie
%de variation
Lots expérimentaux
(~g glucose/ml plasma)
de la moyenne par
rapport aux témoins
Lot témoin
1= 333,20
Sm = 11 ,19
Lot a jeun
1= 145,75
Sm = 19,47
- 56 .. 26,
S
Lot traité au bichro-
1= 192,85
Sm = 51,77
- 42,12·
S
mate de potassium
Lot traité au chlorhy-
1= 282,00
Sm = 17,76
- 15,37
S
drate dl anil i ne
Lot traité à l'acide
1= 263,57
Sm = 37,28
- 20,89
trichloracétique
Tableau 32 - Effet du jeûne et des différents produits chimiques
sur la glycémie du Loup (cf. annexe 41)
S
différences significatives par rapport aux témoins (p<O,05).
76
Les valeurs de la glycémie sont notablement plus basses
que celles de la Truite. Toutefois, une possible dilution a pu
se produire au moment des ponctions étant donné la difficulté
rencontrée pour les réaliser.
Nous observons une baisse de la glycémie chez les animaux
intoxiqués ou à jeun. Elle est particulièrement prononcée chez
ces derniers.
77
III - DISCUSSION
Dans la seconde partie de notre travail, nous avons décrit
certains effets d'une intoxication à moyen terme par le bichromate
de potassium, le chlorhydrate d'aniline et l'acide trichloracétique
en prenant comme concentration le 1/10e de la CL 50 - 24 h pour les
deux premiers produits et pour le troisième une concentration égale
au 1/10e de celle qui amène le pH de l'eau de ville ou de mer à 3,5.
Des différences spécifiques sont apparues dans les effets
de ces
produits sur la mortalité des Poissons.
Le chlorhydrate d'aniline s'est rapidement révélé être très
toxique pour les Truites. En revanche, il n'a entraîné aucune morta-
lité chez les Loups. Lors des expériences d'intoxication aiguë, nous
avions envisagé, non sans quelques réserves, que le Loup constituait
l'espèce la plus sensible. Ce pourrait être le cas de la Truite lors
d'intoxicationde plus longue durée.
Les paramètres enzymatiques retenus pour les dosages ont été
sélectionnés en vue de distinguer deux catégories d'effets des toxi-
ques : des effets d'ordre général relatifs à des réactions de stress
et des effets spécifiques au niveau de deux tissus significatifs ,
la branchie et l'intestin.
Une forte élévation de la glycémie, associée à une augmenta-
tion des activités transaminasiques, dénote un état de stress géné-
ral chez les Truites intoxiquées par les trois produits.
Cette réponse non spécifique a été déjà observée chez les
Poissons exposés à des effluents pollués ou à des toxiques divers
(Smith et aZ~ 1976 ; Mc Leay, 1977 ; Diwan et aZ~ 1979 ; Ishioka,
1980 a et b).
Toutefois, il ne semble pas qu'elle puisse être généralisée
car nous ne l'avons pas retrouvée chez les Loups intoxiqués. Néan-
moins, des réserves ont été formulées à l'encontre de l'évaluation
78
des paramètres sanguins, en raison des difficultés rencontrées au
moment des prises de
sang
dues à la petite taille des Pois-
sons.
Un autre effet non spécifique des toxiques qui peut résul-
ter de l'état de stress général, concerne leur influence sur le
comportement alimentaire des Poissons.
Chez les Truites, nous avons observé un arrêt complet de
la prise alimentaire dès le début du traitement au bichromate de
potassium. Une réaction analogue a déjà été mise en évidence chez
ce Poisson par Lett (1976) lors d'une intoxication par 0,3 p.p.m
de cuivre.
Chez le Loup, les traitements par l'acide trichloracétique
et par le chlorhydrate d'aniline entraînent une nette diminution
de l'appétit des Poissons qui n'a cependant pas de conséquence sur
le remplissage de l'estomac et de l'intestin, ni sur les valeurs
des rapports intestino-somatiques. Cela peut provenir d'une réduc-
tion des quantités de fécès émises par unité de temps, associée à
une modification du diamètre du tube digestif comme cela a été
montré chez d'autres espèces (Possompes et at~ 1975).
Cette restriction, voire cet arrêt de la prise alimentaire,
a des conséquences très diverses sur l'enzymologie intestinale et
branchiale des Poissons.
Chez les Truites, les activités des enzymes de la bordure
en brosse (phosphatase alcaline, la maltase et la leucine aminopep-
tidase) diminuent fortement chez Poissons à jeun depuis 15 jours.
Elles sont par contre stimulées chez le Loup après trois semaines
de jeûne. Ces divergences résultent probablement des différences
d'intensité dans les processus d'autolyse dont l'intestin est le
siège pendant le jeûne (Askerov, 1975) et qui se traduisent notam-
ment par une perte de poids spectaculaire (Creach, 1972 ; Askerov,
1975 ; Ince et Torpe, 1976).
79
Les activités ATPasiques sont également influencées par
le jeûne, principalement la fraction Na+K+ dépendante. Chez le
Loup, l'activité de cette enzyme diminue de 55 % environ dans la
branchie après trois semaines de jeûne. Cette chute des ATPases
Na+K+ qui participer.t directement à la régulation du milieu inté-
rieur (Skou, 1957, 1960, 1965 ; Epstein et al~ 1967 ; Pfleiler et
Kirschner, 1972 ; Zaugg et Mc Lain, 1972
Moon, 1975 ; Boeuf et
Lasserre, 1978) pourrait porter atteinte à la survie des Poissons
en hiver quand ceux-ci s'alimentent peu en raison des basses tem-
pératures.
A l'inverse, les ATPases Na+K+ intestinales du Loup sont
2
stimulées par le jeûne, comme la fraction sensible au Mg +,
semble-t-il. Cette modification pourrait avoir une signification
physiologique lors de la stimulation des transports intestinaux
observée chez les animaux ayant jeûné (Bogé et al~ 1983) car ces
deux fonctions sont souvent associées (Crane, 1965).
Chez la Truite, le dosage des ATPases Na+K+ dépendantes
présente quelques difficultés car cette activité ne constitue
qu'un trop faible pourcentage de l'activité totale, comme chez la
plupart des Poissons d'eau douce (Dharmamba et al~ 1975).
Pfleiler et Kirshner (1972) préconisent de préincuber les
tissus pendant 30 à 60 minutes à 37°C pour inhiber la fraction
Mg 2+ dépendante. Ce traitement semble être efficace sur la frac-
tion cellulaire microsomiale utilisée par les auteurs, mais il
l'est moins sur l'homogénat total.
Chez les Poissons marins, en particulier chez le Loup,
les dosages sont beaucoup plus fiables car l'activité ATPasique
INa+K+ représente un pourcentage important de l'activité totale
1(34 t). Dans la branchie, comme dans l'intestin, cette proportion
pourrait être plus élevée chez les petits Loups que chez les
Ipoissons adultes. Chez les premiers elle représente 34 % de l'ac-
~ivité totale contre 21 % chez les
adultes (Bogé, commu-
nication personnelle) .
1
80
Certains effets des toxiques sur les activités enzymatiques
résultent à l'évidence de leur action sur la prise alimentaire.
C'est le cas chez la Truite de l'inhibition de la phosphatase alca-
line, de la maltase et de la leucine aminopeptidase par le bichro-
mate de potassium. C'est probablement aussi le cas chez le Loup de
la stimulation de l'activité Na+K+ ATPasique intestinale par l'aci-
de trichloracétique. Chez ces Poissons, le profil enzymatique in-
testinal présente alors beaucoup d'analogie avec celui des animaux
au jeûne.
D'autres effets sont provoqués par une action spécifique du
toxique sur l'enzyme ou sur les processus de sa synthèse. Une illus-
tration en est donnée par l'inhibition de la phosphatase alcaline
intestinale caractérisée chez les Loups intoxiqués par le bichromate
de potassium. L'absence d'action de ce produit sur la prise alimen-
taire de cette espèce paraît éliminer tout effet éventuel du jeûne.
Chez la Truite une action spécifique locale du bichromate de potas-
sium sur la phosphatase alcaline a pu s'ajouter à celle résultant
de l'arrêt de la prise alimentaire. Un effet spécifique du bichro-
mate de potassium sur cette enzyme chez la Truite a d'ailleurs été
clairement mis en évidence par Bussière (1984) qui a montré que la
présence de ce toxique dans la lumière intestinale entraîne immédia-
tement une très forte réduction d'activité. Chez ce Poisson, le bi-
chromate de potassium ne provoque aucune inhibition de l'activité
maltasique, même à forte dose (100 fois la CL 50 - 24 h). Le carac-
tère instantané de l'action du bichromate de potassium sur la phos-
phatase alcaline peut laisser par ailleurs supposer qu'il agit au
niveau du sîte actif de l'enzyme davantage que sur sa synthèse.
L'effet du bichromate de potassium sur la phosphatase alca-
line mériterait d'être recherché chez d'autres espèces de Poissons,
car cette activité enzymatique, aisément mesurable et très sensible,
pourrait alors servir de critère physiologique de détection pour ce
produit.
81
Le bichromate de potassium constitue une molécule largement
utilisée en écotoxicologie comme substance de référence. Elle est
considérée, en essais à court terme, comme une molécule de toxicité
moyenne (AFNOR).
En expérimentation à moyen terme, sa toxicité est considéra-
blement accrue.
6
Buhler et aZ (1977) ont montré que le Cr+
ne se comportait
pas comme la plupart des métaux lourds. Ceux-ci se fixent générale-
ment sur les branchies dont ils inhibent le métabolisme respiratoire
(Sugawara, 1975 ; Riedel et Christensen, 1979). A la différence, le
6
Cr+
pénètre rapidement dans les lamelles branchiales et se fixent
ensuite dans de nombreux tissus. Des Truites arc-en-ciel de deux ans
élevées dans des eaux contenant environ 0,00025 p.p.m accumulent des
quantités appréciables de chrome donnant pour le corps entier des
résidus d'environ 0,18 ~g/g de tissu frais (Buhler et aZ~ 1977).
Ce cation présente une accumulation plus élevée dans l'os opercu-
laire, la rate, le rein, le tractus intestinal, ainsi que dans la
vésicule biliaire (Kuhnert et aZ~ 1976 ; Buhler et aZ~ 1977). Cette
accumulation n'augmente que faiblement après une exposition de quel-
ques jours à une dose dix mille fois plus forte. L'équilibre est
atteint dès le premier jour et les concentrations tissulaires sont
alors de 1,1 (pour la vésicule biliaire) à 8,5 (pour le plasma) fois
pl us
fortes. A quelques exceptions près (re in, ra te, 0 s operculaire
et branchie) elles ne dépassent pas celle du milieu ambiant.
Il semble que chez de jeunes Truites ce pouvoir de concentration soit
plus important que chez des animaux adultes. Les mortalités apparais-
sent aussi beaucoup plus tôt (Tong et aZ~ 1974).
Le chrome absorbé aurait, au niveau cellulaire, une réparti-
tion souvent plus importante dans la fraction nucléaire, mais il est
aussi présent dans les fractions mitochondriales et microsomiales
(Buhler et aZ~
1977). Toutefois, Kuhnert et al
(1976) n'ont pu mettre
en évidence d'action du Cr+ 6 sur les enzymes qui s'y trouvent.
1
82
Le chrome qui s'accumule dans l'intestin des Truites intoxi-
quées et qui provient en majeure partie d'échange avec le sang (Knoll
et Fromm, 1960) peut être à l'origine de l'inhibition de la phospha-
tase alcaline. Toutefois, celle-ci peut être causée également par le
chrome contenu dans la lumière de l'intestin qui est apporté par
l'eau de boisson. C'est ce qui a été montré récemment par Bussière
chez la Truite où la présence de chrome introduit par des cathéters
dans la lumière provoque de façon presque instantanée une diminution
d'activité de la phosphatase alcaline. Par ailleurs, Bussière (1984)
a montré que ce chrome était peu absorbé par l'intestin de ce Poisson.
Cette action du chrome intraluminal prendrait toute son importance
chez le Loup, Poisson marin qui boit beaucoup plus que la Truite.
Le mécanisme de cette inhibition n'est pas encore connu.
Nous savons toutefois que le Cr+ 6 est capable de se lier aux protéi-
nes après transformation en Cr+ 3 (Gray et Sterling, 1950 ; Grogan et
Oppenheimer, 1955). Cette réaction pourrait se dérouler au niveau
intestinal notamment,comme le suggèrent certains auteurs (Stokes et
Fromm, 1965 ; Kuhnert et aZ~ 1976).
U
.
d
+6
,
h
l
T
.
ne autre actIon
u Cr
rapportee c ez
a
rUIte concerne
l'inhibition des ATPases Na+K+ dépendantes branchiales, intestinales
et surtout reinales (Kuhnert ~t aZ~ 1976 ; Buhler llt aZ~ 1977). Nous
ne l'avons pas retrouvée ni dans la branchie, ni dans l'intestin.
Chez le Loup où cette activité est plus commodément mesurable, nous
avons constaté qu'elle était même légèrement stimulée par le bichro-
mate de potassium. L'origine de ces divergences n'est pas encore
connue. Elle pourrait être recherchée dans la dose des produits ou
dans la durée d'intoxication. Kuhnert (1976))Buhler (1977) et leurs
6
collaborateurs utilisent des concentrations de Cr+
plus faibles et
des durées d'exposition plus courtes que les nôtres (2,5 p.p.m de
+6
Cr
pendant 48 heures).
Ces travaux ont démontré par ailleurs l'inocuité du chlorhy-
drate d'aniline au niveau intestinal. Cette molécule, particulière-
ment dangereuse, est connue pour agir au niveau sanguin essentielle-
ment par combinaison avec l'hémoglobine (Von Oettingen, 1941 ;
Dutkiewicz, 1962 ; Latarjet et Roche, 1969). Cette absence d'effets
83
sur l'enzymologie intestinale a d'ailleurs été confirmée chez la
Truite par Bussière (1984) en perfusant l'intestin des Poissons par
des solutions même fortement concentrées (100 fois la CL 50 - 24 h).
84
CON CLUS ION S
Nous avons étudié la toxicité aiguë de trois produits
chimiques: le bichromate de potassium, le chlorhydrate d'ani-
line et l'acide trichloracétique sur deux espèces de Poissons
d'eau douce (Bpachydanio pePio et SaLmo gaipdnePii) et une espèce de
Poisson marin {Dicentmpchus Labroa:r:}.
Le Loup est une espèce souvent plus sensible à ces
produits que la Truitelle et le Poisson zèbre d'après les ré-
sultats des tests de CL 50 - 24 h tels que nous les avons pra-
tiqués.
Chez ces Poissons d'eau douce, la toxicité de l'acide
trichloracétique provient de la baisse du pH de l'eau qu'il
produit. Cet effet pH se caractérise par le fait qu'il obéit à
la loi du "tout ou rien".
Nous avons ensuite recherché les effets de ces produits
sur des activités enzymatiques intestinales et branchiales du
Loup et de la Truite après trois semaines et deux semaines
d'exposition à des doses égales au 1/10e de la CL 50 - 24 h
pour les deux premiers produits; pour l'acide trichloracétique,
nous avons choisi le 1/10e de la concentration qui amène le pH
de l'eau de ville ou d'eau de mer à 3,5.
85
Dans Z'intestin
La phosphatase alcaline est:
· inhibée chez la Truite par le bichromate de potassium
et le chlorhydrate d'aniline.
· inhibée chez le Loup par le bichromate de potassium
La maltase est:
• inhibée chez la Truite par le bichromate de potassium
et le chlorhydrate d'aniline.
La leucine aminopeptidase est
• inhibée chez la Truite par le bichromate de potassium
et le chlorhydrate d'aniline.
2
Les ATPases totales et Mg + ne varient pas de manière statis-
tiquement significative chez les poissons.
Les ATPases Na+K+ dépendantes sont stimulées chez le Loup
par le bichromate de potassium et l'acide trichloracétique.
Dans Za branchie
2
Les ATPases totales et Mg + dépendantes ne varient pas d'une
manière statistiquement significative chez les poissons intoxi-
qués.
Les ATPases Na+K+ dépendantes sont inhibées chez les Loups
traités au chlorhydrate d'aniline.
86
Chez la Truite ces modifications s'accompagnent d'une
hyperglycémie et d'une augmentation des transaminases plas-
matiques, caractéristiques des états de stress. En outre,
le bichromate de potassium entraîne un arrêt de la prise
alimentaire chez cette espèce.
Chez le Loup, le traitement à l'acide trichloracéti-
que et au chlorhydrate d'aniline ralentit l'appétit des pois-
sons.
Ces résultats considérés dans leur ensemble, montrent
les difficultés et les possibilités de progrès dans l'appli-
cation des méthodes actuellement utilisées pour déterminer la
toxicité d'une substance vis-à-vis du Poisson.
Ainsi, pour une même molécule, la dose nocive peut
varier selon l'espèce et aussi selon certains paramètres ex-
périmentaux tels que le pH du milieu aqueux ou la température.
D'autre part, la mise en oeuvre de tests sublétaux per-
met d'envisager une économie de vies animales, la détection
d'effets préjudiciables peu spectaculaires, ainsi que la pré-
diction de perturbations physio-pathologiques à plus ou moins
long terme.
87
ANNEXES
88
ANNEXE 1
Composition de l'eau de ville.
Examen physique.
Turbidité (en gouttes de mastic)
3
Résistivité électrique (en ohms/cm - 1 a 20°C)
1 700
pH a 20°C :
7,6
Couleur, odeur :
incolore, inodore
Examen chimique.
O2 cédé par Mn04K(mil. alcalin) en mg/l
0,5
Dureté totale (D° français) :
36
ITitre alcalimétrique complet
25,0
Ammoniaque en mg/l NH~ :
o
IN·
.
/ 1 -
,tr,tes en mg
N0
:
o
1
2
_
Nitrates en mg/l N0
o
3 :
1
_
Chlorures en mg/l Cl :
21
--
\\
Sulfates en mg/l S04 :
70
~er en mg/l Fe :
o
89
ANNEXE 2
Méthodes de dosage utilisées pour contrôler les paramètres
physico-chimiques des milieux.
le) Dosage de l'oxygène dissous par la méthode de Winkler.
Ce dosage est effectué régulièrement dans les bacs de stockage ainsi
qu'au cours des tests sur l'eau des bacs d'expérience en début et en fin de test.
Principe :
L'oxygène dissous dans l'eau se combine avec 1 'hydroxyde de manganèse,
avec formation d'un précipité d'hydroxyde manganique. En milieu acide, cet hy-
droxyde donne un sel manganique en libérant l'iode de l'iodure de potassium
selon la réaction :
2 Mn(OH)3
(2) 2 Mn(OH)3 + 2 KI
+ 3 H2S04
2 MnS04 + K2S04 + 6H20 + 12
L'iode libéré est dosé par une solution de thiosulfate N/80, ce qui permet de
déduire la quantité d'oxygène dissous dans l'eau (1 molécule d'iode correspond
â 1/2 molécule d'oxygène).
Réactifs :
- Solution de chlorure de manganèse 30 p. 100 :
Dissoudre 30 g de chlorure de manganèse pur et anhydre (exempt de fer
ou de nitrites) dans de l'eau désionisée bouillie et ajuster â 100 ml.
- Réactif de Winkler
solution de potasse iodurée.
KOH en pastilles
50 g
Iodure de potassium
15 g
Eau désionisée bouillie q.s.p.
100 ml
- Acide sulfurique : (66~B de préférence)
- Solution de thiosulfate NIlO
S203Na2' 5 H20
25 g
eau dés ionisée bouillie q.s.p.
1000 ml
- Solution de thiosulfate N/80 :
Solution de thiosulfate NIlO
25 ml
Eau désionisée bouillie q.s.p.
200 ml
90
- Empois d'amidon
Amidon
0,5 g
Eau désionisée
10 ml
Eau désionisée â 80°c
50 ml
N.B. Le titre de la solution de thioslJ1fate N/80 est vérifié â l'aide d'une
solution d'iodate de potassium équivalente d'une solution d'iode exactement N/80.
Protocole expérimental :
On prélève l'eau â analyser sans créer de barbottage d'air dans un fla-
con muni d'un bouchon rodé, dont la capacité, une fois bouché,a été déterminée
par pesée. On ajoute sans tarder, â l'aide d'une pipette â deux traits
- 1 ml de solution de chlorure de manganèse,
- 1 ml de réactif de Winkler.
L'extrémité inférieure de la pipette doit presque toucher le fond du
flacon que l'on referme soigneusement sans former de bulle d'air â l'intérieur.
On agite alors par retournement, avant de laisser sédimenter le précipité 10
â 15 mn. On ajoute alors 1 ml d'acide sulfurique et l'on rebouche â nouveau sans
former de bulle d'air avant de secouer énergétiquement le flacon, jusqu'â disso-
lution complète du précipité.
Le contenu total du flacon est versé dans un Er1enmeyer (on rince les
parois
du flacon avec un peu d'eau désionisée) et on verse la solution de thio-
sulfate N/80 jusqu'â ce que la coloration jaune pâlisse. On ajoute alors 2 â 3
gouttes d'empois d'amidon. Le dosage est terminé lorsque la coloration bleue
apparue est décolorée complètement.
Résultats:
Les formules citées plus haut montrent que lors du dosage, 1 molécule de
thiosulfate correspond â une demi-molécule d'iode (3) qui elle-même correspond
â 1/4 de molécule d'oxygène (1).
Donc 1000 ml de solution de thioslJ1fate N correspondent â 8 g d'oxygène,
et 1000 ml de solution N/80 correspondent â 0,1 g d'oxygène. 0'00 1 ml de solution
de thiosulfate N/80 correspond â 0,1 mg d1oxygène.
La prise d'essai représente un volume V du flacon moins les 2 ml de réactif
utilisé pour former le précipité: (V-2)ml.
S'il faut n ml de thiosu1fate N/80 pour doser l'oxygène dissous dans (V-2)ml d'eau
â analyser (soit 0,1 x n mg d'oxygène), la concentration d'oxygène dissous en
mgllitre sera :
1
91
0.1 x n x 1000
mg dl 02 11itre.
V - 2
Si le titre de la solution de thiosu1fate n'est pas exactement N/80
mais t. la quantité d'oxygène contenue dans la prise d'essai (V - 2) ml sera
n x t x 8
et e, mg dl02 litre. nous aurons
n x t x 8 x 1000
V - 2
2°) Dosage des chlorures par la méthode de Mohr.
Ils sont dosés par une solution de nitrate dlargent en présence de
chromate de potassium (indicateur coloré). Le chromate d'argent qui apparaft en
fin de réaction donne â la solution initialement jaune une teinte orangée.
Protocole expérimental :
100 ml d'eau â analyser filtrée sont introduits dans un Er1enmeyer.
auxquels ont été ajoutées 2 â 3 gouttes diacide nitrique pur. une pincée de car-
bonate de calcium et 8 gouttes dlune solution â 10 %de chromate de potassium.
Nous faisons couler â 11 aide dlune burette graduée une solution NIlO de
nitrate dlargent jusqulau virage rouge de la solution â titrer.
Résultats :
Soit V le volume de nitrate dlargent NIlO nécessaire pour une prise
dlessai de 100 ml, la teneur en chlore est de :
V x 10 x 3.55 mg de C1- par litre dleau.
soit
V x 10 x 5.85 mg de NaC1 par litre dleau.
3°) Dosages des composés azotés.
La molécule non dissociée dlammoniaque ou NH3 est extrêmement toxique
pour le Poisson. 100 fois plus toxique que la forme dissociée NH~ (Terver. 1980).
Le pourcentage non dissocié est fonction de la température et du pH. Par exemple
au pH 7.5, le pourcentage de dissociation slexprime comme suit
(Roberts. 1979).
92
En pisciculture les seuils recommandés. comme pour le recyclage d'une
eau sont les suivants
ammoniac
NH
0.75 mg/l
Truitelles
3
al1ll1Onium
NH+
0.75 mg/l
Truitelles
4
nitrites
N°ï
0.1 mg/l
N03 (nitrates) non toxiques.
Dans nos expériences nous avons dosé l'ammoniac et les nitrites a
l'aide d'un "kit aquapharma".
4°) Mesure du pH.
Le pH des bacs d'élevage est mesuré quoditiennement de même que celui
des récipients expérimentaux avec un pH-mètre de marque "Tacussel".
5°) Mesure de la température.
Le Poisson est dépourvu de mécanisme de thermo-régulation. La température
ambiante régit donc son activité vitale (échanges respiratoires. digestion •.• )
ainsi que la vitesse de pénétration et de métabolisation des toxiques.
Elle est contrOlée tous les jours avec un thermomètre classique et au
besoin ajustée a l'aide d'un thermostat.
.~ .
PRODUIT TESTE :
DUREE D'EXPOSITION:
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droite â vue
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106
ANNEXE 16 (cf. Tableau 12)
Valeurs des rapports
intestino-somatiques
(RIS)
des Truites des différents lots
,
RIS
x 100
Lot traité au bi-
Lot traité au
Lot traité a l'a-
Lot témoin
Lot a jeun
chroma te de po-
chlorhydrate dIa-
cide trichloracé-
tassium(50,9 ppm)
niline (6 ppm)
tique (110 ppm)
0,825
0,614
0,506
0,475
0,934
1,303
0,579
0,571
0,601
0,934
0,733
0,420
0,581
0,541
1,064
0,790
0,429
0,458
0,450
1,148
1,036
0,494
1,194
1,188
1,347
0,603
0,695
1,245
0,448
0,796
0,653
0,535
0,479
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-
-
-
-
-
X = 0,991
X = 0,511
X = 0,685
X = 0,516
X = 1,057
Sm = 0,098
Sm = 0,024
Sm = 0,094
Sm = 0,034
Sm = 0,050
107
ANNEXE 17 (cf. Tableau 13)
Activité de la phosphatase alcaline intestinale chez les
Truites intoxiquées par le bichromate de potassium, le chlo-
rhydrate d'aniline, l'acide trichloracétique, a jeun et
nourries
llmoles
p-nitrophénol/g protéines/minute
Lot traité au bi-
Lot traité au
Lot traité a l'a-
Lot témoin
Lot a jeun
chromate de potas-
chlorhydrate dIa-
cide trichloracé-
sium (50,9 ppm)
niline (6 ppm)
tique (1l0 ppm)
,
69,38
20,72
4,68
16,44
54,04
46,60
17,70
7,69
18,28
60,23
38,40
15,44
7,87
15,22
56,92
47,58
16,93
11 ,35
17,60
34,26
58,15
16,70
18,78
64,70
62,42
8,47
7,89
89,58
22,51
2,74
62,61
14,27
l
1
15,61
i
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1
20,89
i
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i
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10,32
~---------------- ------------------- ------------------- ------------------_.-------------------
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lx
-
-
-
-
= 59,34
X = 16,32
X = 8,71
X = 16,88
X = 54,03
1
ISm = 5,63
Sm =
1,29
Sm = 1,96
sm =
0,670
Sm =
5,25
1
1
1
1
1
1
i!
1
1
J
1
!1
1j
1
108
ANNEXE 18 (cf. Tableau 14)
Activité de la maltase intestinale ches les Truites intoxi-
quées par le bichromate de potassium, le chlorhydrate d'a-
niline, l'acide trichloracétique, â jeun et nourries
~gramme de glucose/g
protéines/minute
Lot traité au bi-
Lot traité au
Lot traité â l'a-
Lot témoin
Lot â jeun
chromate de potas-
chlorhydrate d'a-
cide trichloracé-
sium (50,9 ppm)
niline (6 ppm)
tique (110 ppm)
65,56
26,81
9,6
30,02
61,88
53,30
35,97
10,02
42,30
79,48
53,46
26,35
9,34
33,87
70,92
92,56
38,29
24,58
37,26
72,64
34,00
24,57
42,16
53,12
93,16
38,77
17,70
113,07
37,13
1,86
63,40
40,16
42,39
-----------------~---------------------------------------
------------------- -------------------
K =
71,06
X = 34,49
X = 16,46
X = 35,86
X = 67,60
Sm = 9,26
Sm =
2,23
Sm =
5,07
Sm =
2,60
Sm =
4,58
109
ANNEXE 19 (cf. Tableau 15)
Activité de la leucine aminopeptidase intestinale chez les
Truites intoxiquées par le bichromate de potassium, le
chlorhydrate d'aniline, l'acide trichloracétique, a jeun et
nourries
~moles de B naphtylamine libéré/g protéines/minute
Lot traité au
Lot traité au
Lot traité a l'aci-
Lot témoin
Lot à jeun
bichromate de po-
chlorhydrate d' ani- de trichloracétique
tassium (50,9 ppm)
line (6 ppm)
(110 ppm)
109,7
84,36
47,7
50,56
137,6
131,6
76,00
97,4
60,33
153,1
130,0
65,16
46,34
55,77
107,5
128,1
64,08
112,0
86,15
105,2
175,2
37,28
120,2
107,1
111,6
75,70
63,80
139,0
64,52
92,0
107,3
64,00
69,27
._---------------~-------------------~-------------------
------------------- -------------------
:
= 129,1
X = 66,82
X = 82,81
X = 63,20
X = 122,00
im =
7,77
Sm = 4,27
Sm = 11,42
Sm =
7,90
Sm =
9,83
110
ANNEXE 20 (cf. Tableau 16)
Activités ATPasiques totales dépendantes de l'intestin des
Truites intoxiquées par le bichromate de potassium, le
chlorhydrate d'aniline, l'acide trichloracétique, a jeun et
1
nourries
~moles de phosphore/g protéines/minute
Lot traité au bi-
Lot traité au
Lot traité a l'a-
Lot témoin
Lot a jeun
chromate de potas-
chlorhydrate d'a-
cide trichloracê-
sium (50,9 ppm)
niline {6 ppm}
tique (110 ppm)
58,57
20,33
23,41
23,65
30,07
25,96
25,22
29,17
33,13
8,25
12,15
22,52
28,73
30,26
17,99
8,94
12,61
8,00
25,47
23,78
21,16
19,11
31,43
20,83
14,51
18,49
20,80
12,82
25,53
12,07
24,0
31,50
31,66
---------------- ~------------------- ------------------- ------------------- -------------------
-
-
-
-
-
(
= 22,27
X = 22,99
X = 21,94
X = 28,12
X = 20,18
im =
5,61
Sm =
2,07
Sm =
3,39
Sm =
2,17
Sm =
3,59
,
111
ANNEXE 21 (cf. Tableau 16)
2
Activités ATPasiques Mg + dépendantes de l'intestin des
Truites intoxiquées par le bichromate de potassium, le
chlorhydrate d1aniline, l'acide trichloracétique, â jeun
et nourries
llmoles de phosphore/g protéines/minute
Lot traité au bi-
Lot traité au
Lot traité â lla-
Lot témoin
Lot â jeun
chromate de potas-
chlorhydrate d'a-
cide trichloracé-
sium (50,9 ppm)
ni li ne (6 ppm)
ti que (110 ppm)
30,59
19,42
19,58
16,66
29,13
21,28
24,03
15,81
23,62
7,20
13,79
20,47
18,10
20,43
16,54
11,17
11,43
7,57
18,45
19,85
24,07
18,50
22,33
18,49
13,51
18,49
16,36
II,99
23,34
6,94
20,56
21,33
20,44
,---------------- ------------------- ------------------- ------------------- -------------------
-
-
-
-
-
X = 18,38
X = 19,72
X = 15,24
X = 19,79
X = 18,24
Sm = 2,43
Sm = 1,22
Sm =
2,21
Sm =
1,49
Sm =
3,50
112
ANNEXE 22 (cf. Tableau 17)
Activitês ATPasiques Na+K+ dêpendantes de l'intestin des
Truites intoxiquêes par le bichromate de potassium, le
chlorhydrate d'aniline, l'acide trichloracêtique, â jeun
et nourries
,
llmoles de phosphore/g protêines/minute
Lot traitê au bi-
Lot traitê au
Lot traitê â l'a-
Lot témoin
Lot â jeun
chromate de potas-
chlorhydrate d'a-
cide trichloracê-
sium (50,9 ppm)
niline (6 ppm)
tique (110 ppm)
27,98
0,91
3,83
6,99
0,94
4,68
1,19
13,36
9,56
1,05
0,00
2,05
10,63
9,83
1,45
0,00
1,18
1,43
7,02
3,93
0,00
0,61
9,10
2,34
1,00
0,00
4,44
0,83
2,19
5,13
3,51
10,17
11,22
.----------------~------------------- ~------------------- ------------------- ------------------_.
-
-
-
-
-
X = 4,75
X = 3,28
X = 6,84
X = 8,35
X = 1,94
Sm = 3,37
Sm = 1,78
Sm = 1,61
Sm = 0,77
Sm = 0,55
113
ANNEXE 23 (cf. Tableau 18)
Activités ATPasiques totales dépendantes de la branchie des
Truites intoxiquées par le bichromate de potassium, le
chlorhydrate d'aniline, l'acide trichloracétique, a jeun et
nourries
llmoles de phosphore/g protéines/minute
,
Lot traité au bi-
Lot traité au
Lot traité a l'a-
Lot témoin
Lot a jeun
chromate de potas-
chlorhydrate d'a-
cide trichloracé-
sium (50,9 ppm)
niline (6 ppm)
ti que (110 ppm)
92,79
76,84
91,69
35,64
101,92
92,79
82,46
50,87
87,13
64,34
70,34
100,00
84,52
61,38
22,87
57,56
73,29
76,64
50,55
38,99
63,20
50,75
60,53
69,86
119,27
80,38
43,27
82,27
88,33
73,58
82,64
88,33
71,66
90,37
---------------- ~------------------- ------------------- ------------------- -------------------
-
-
-
-
-
X = 81,28
X = 80,30
X = 68,72
X = 58,67
X = 59,59
Sm =
7,08
Sm =
3,16
Sm =
6,72
Sm = 10,85
Sm = 13,58
114
ANNEXE 24 (cf. Tableau 18)
2
Activités ATPasiques Mg + dépendantes de la branchie des
Truites intoxiquées par le bichromate de potassium, le
chlorhydrate d1aniline, llacide trichloracétique, â jeun
et nourries
~moles de phosphore/g protéines/minute
Lot traité au bi-
Lot traité au
Lot traité â lla-
Lot témoin
Lot â jeun
chromate de potas-
chlorhydrate dIa-
cide trichloracé-
sium (50,9 ppm)
ni li ne (6 ppm)
tique (110 ppm)
73,59
78,82
79,71
33,54
92,97
83,17
80,80
47,91
80,88
63,49
59,74
80,72
81,98
58,20
23,35
57,00
69,87
63,08
45,46
37,77
59,78
49,00
61,41
61,74
100,00
69,74
46,28
83,08
83,27
64,96
71,02
73,40
._---------------~------------------- ------------------- ------------------- -------------------
X = 73,42
X = 73,20
X = 63,61
X =
52,72
X = 55,86
Sm = 5,24
Sm = 3,90
Sm =
5,23
Sm =
8,04
Sm = 11 ,94
115
ANNEXE 25 (cf. Tableau 19)
Activités ATPasiques Na+K+ dépendantes des branchies des
truites intoxiquées par le bichromate de potassium, le
chlorhydrate d'aniline, l'acide trichloracétique, a jeun
et nourries
llmoles de phosphore/g protéines/minutes
Lot traité au bi-
Lot traité au
Lot traité a l'a-
Lot témoin
Lot a jeun
chromate de potas-
chlorhydrate d'ani- cide trichloracé-
sium (50,9 ppm)
line (6 ppm)
tique ( 110 ppm)
19,20
0
11,98
2,10
8,95
9,62
1,66
2,96
6,25
0,85
10,6
19,28
2,54
3,18
0
0,56
3,42
13,56
5,09
1,22
3,42
1,75
0
8,12
19,27
10,64
0
0
5,06
8,62
0,64
16,97
----------------- ------------------- ------------------- ------------------- -------------------
-
-
-
-
-
(
= 7,91
X = 7,34
X = 5,66
X = 4,15
X = 3,82
im = 2,85
Sm = 2,61
Sm = 2,13
Sm = 0,93
Sm = 1,93
,
1
1
i
1
i
1
121
ANNEXE 31 (cf. Tableau 24)
Activité maltasique dans l'intestin des Loups sous l'effet
du jeûne et des différents produits chimiques
~gramme de glucose/ g protéines/minute
Lot traité au bi-
Lot traité au
Lot traité â l'a-
Lot témoin
Lot â jeun
chromate de potas-
chlorhydrate d'a-
cide trichloracé-
sium (14,2 ppm)
niline (5,8 ppm)
tique (60 ppm)
59,71
66,28
91,81
52,01
108,56
67,22
67,84
63,46
71,32
83,01
75,46
86,57
55,73
82,01
54,90
56,74
62,41
58,40
76,82
64,30
86,23
82,91
40,75
59,37
45,37
55,87
51,24
53,00
53,77
38,19
77,75
50,01
45,19
74,09
64,05
69,92
124,01
92,25
47,48
48,01
59,78
39,16
34,34
92,25
79,74
61,61
102,92
62,27
71 ,42
----------------- ~------------------- ------------------_. ------------------- -------------------
-
-
-
-
-
X = 67,02
X = 75,33
X = 59,72
X = 68,05
X = 65,12
Sm =
3,21
Sm =
8,23
Sm =
6,13
Sm =
4,56
Sm = 7,39
,
,
--~-
122
ANNEXE 32 (cf. Tableau 25)
Activité de la leucine aminopeptidase dans l'intestin des
Loups sous l'effet du jeûne et des produits chimiques
~moles de a naphtylamine libéré/g protéines/minute
Lot traité au bi-
Lot traité au
Lot traité â lla-
Lot témoin
Lot â jeun
chromate de potas-
chlorhydrate dIa-
cide trichloracé-
sium (14,2 ppm)
niline (5,8 ppm)
tique (60 ppm)
25,97
27,65
38,88
24,17
22,44
23,51
21,69
29,37
19,18
24,84
22,82
14,91
21,58
22,43
18,64
23,97
24,50
23,83
21,90
19,82
24,94
16,16
20,68
26,42
23,49
30,35
23,78
33,07
25,83
16,40
22,98
16,35
25,53
22,33
16,89
28,78
18,51
27,38
27,10
20,69
13,85
14,45
19,02
19,46
21,03
20,74
23,82
22,75
----------------- ~------------------- ------------------- ------------------- -------------------
-
-
-
-
-
X = 23,81
X = 19,87
X = 26,31
X = 23,15
X = 20,40
Sm =
1,42
Sm =
1,42
Sm =
1,92
Sm =
0,86
Sm =
1,07
123
ANNEXE 33 (cf. Tableau 26)
Activité des ATPases totales dépendantes dans l'intestin
des Loups sous l'effet du jeOne et des différents produits
chimiques
~moles de phosphore/g
protéines/minute
Lot traité au bi-
Lot traité au
Lot traité a l'a-
Lot témoin
Lot a jeun
chromate de potas-
chlorhydrate d'a-
cide trichloracé-
sium (14,2 ppm)
niline (5,8 ppm)
tique (60 ppm)
47,05
38,25
64,01
55,05
90,88
40,81
50,78
76,37
36,42
71,91
52,94
68,67
34,45
52,41
44,86
41,60
59,37
43,67
50,85
42,92
61,96
60,16
31,50
56,95
36,55
50,13
50,35
47,06
39,18
44,63
33,71
83,96
41,97
37,73
28,28
46,36
36,50
36,79
39,03
32,22
26,40
117,65
46,66
35,87
36,61
50,55
35,84
40,60
----------------- ~------------------- ------------------- ------------------- -------------------
-
-
-
-
-
X = 45,15
X = 62,85
X = 45,83
X = 44,40
X = 47,65
Sm = 3,19
Sm =
8,41
Sm =
4,47
Sm =
2,64
Sm =
6,82
124
ANNEXE 34 (cf. Tableau 26)
2
Activité
des ATPases Mg + dépendantes dans l'intestin des
Loups sous l'effet du jeOne et des différents produits
chimiques
~moles de phosphore/g protéines/minute
Lot traité au bi-
Lot traité au
Lot traité a l'a-
Lot témoin
Lot a jeun
chromate de potas-
chlorhydrate d'a-
cide trichloracé-
sium (14,2 ppm)
niline (5,8 ppm)
tique (60 ppm)
25,77
26,29
41,23
34,68
46,40
29,03
42,59
47,70
27,32
43,89
35,85
45,49
23,63
32,10
31,55
25,03
43,81
23,39
35,36
24,81
46,91
37,84
12,75
35,07
18,41
33,04
16,15
25,84
25,14
26,80
27,01
56,07
22,34
25,68
9,31
36,60
19,47
8,65
27,07
12,67
15,41
86,99
28,36
25,82
9,82
24,15
9,36
27,87
----------------- ------------------- ------------------_. ------------------- -------------------
-
-
-
-
-
X = 29,88
X = 41,63
X = 24,30
X = 29,61
X = 24,85
Sm =
2,73
Sm =
7,14
Sm =
4,01
Sm =
1,33
Sm =
4,81
-
- _ ..._-.--
125
ANNEXE 35 (cf. Tableau 27)
Activité des ATPases Na+K+ dépendantes dans l'intestin des
Loups sous l'effet du jeOne et de différents produits chi-
miques
~moles de phosphore/g protéines/minute
Lot traité au bi-
Lot traité au
Lot traité a l'a-
Lot témoin
Lot a jeun
chromate de potas- chlorhydrate d'a-
cide trichloracé-
sium (14,2 ppm)
niline (5,8 ppm)
tique (60 ppm)
21,28
Il,96
22,78
20,37
44,48
11,78
8,19
28,67
9,10
28,02
17,09
23,18
10,82
20,31
13,31
16,57
15,56
20,28
15,49
18,11
15,05
22,32
18,75
21,88
18,14
17 ,09
34,20
21,22
14,04
17,83
6,7
27,89
19,63
12,05
18,97
9,76
17,05
28,14
Il,96
19,55
10,99
30,66
18,30
10,05
26,79
26,4
26,48
12,73
----------------- ------------------- ------------------- ------------------- -------------------
-
-
-
-
-
X = 15,27
X = 21,22
X = 21,50
X = 14,79
X = 22,80
Sm = 1,83
Sm =
2,91
Sm =
1,69
Sm =
1,69
Sm = 3,11
126
ANNEXE 36 (cf. Tableau 28)
Influence des produits chimiques ~t+du jeûne sur le pourcen-
tage de l'activité des ATPases Na K dépendantes par rapport
a celle des ATPases totales de l'intestin des Loups sous
l'effet du jeûne et des produits chimiques
ATPases Na"K t- dépendantes x 100
ATPases totales
Lot traité au bi-
Lot traité au
Lot'traité a l'a-
Lot témoin
Lot a jeun
chromate de potas-
chlorhydrate d'a-
cide trichloracé-
sium (14,2 ppm)
niline (5,8 ppm)
tique (60 ppm)
45,22
31,26
35,58
37,00
48,94
28,86
16,12
37,54
24,98
38,96
32,28
33,75
31,40
38,75
29,67
39,83
26,20
46,43
30,46
42,19
[
24,28
37,10
59,52
38,41
49,63
34,09
67,92
45,09
35,83
39,95
19,87
33,21
46,77
31,91
67,07
21,05
46,71
76,48
30,64
60,67
41,62
26,06
39,21
28,01
73,17
52,22
73,88
31,35
-----------------~-------------------~-------------------
---------------------------------------
X = 33,93
X = 35,37
X = 49,19
X = 32,73
X = 48,69
Sm = 3,40
Sm =
4,93
Sm =
4,97
Sm =
1,45
Sm =
5,19
127
ANNEXE 37 (cf. Tableau 29)
Activité des ATPases totales dépendantes branchiales des
Loups sous 11effet du jeQne et des différents produits chi-
miques
~moles de phosphore/g
protéines/minute
Lot traité au bi-
Lot traité au
Lot traité à lla-
Lot témoin
Lot a jeun
chromate de potas-
chlorhydrate dIa-
cide trichloracê-
sium (14,2 ppm)
nil1ne (5,8 ppm)
tique (60 ppm)
46,01
71 ,89
64,96
90,55
77,32
57,58
59,85
97,64
51,67
66,39
53,82
4·1,28
72,62
49,13
41,63
52,19
72,30
52,34
75,82
50,02
61,50
65,82
92,07
51,32
63,32
70,02
38,04
54,49
43,72
54,82
83,80
43,23
47,52
35,32
46,02
34,19
36,98
20,73
48,08
64,44
76,18
48,12
61,91
78,67
----------------- ------------------- ------------------- ~------------------- ~-------------------
-
-
-
-
-
X = 59,47
X = 53,05
X = 61,15
X = 56,39
X = 60,29
Sm =
5,13
Sm =
4,82
Sm =
3,17
Sm =
5,71
Sm =
4,37
128
ANNEXE 38 (cf. Tableau 29)
Activité des ATPases Ml+ dépendantes branchiales des Loups
sous l'effet du jeûne et des différents produits chimiques
l.Imoles de phosphore/g
rotéines/minute
P
Lot traité au bi-
Lot traité au
Lot traité a l'a-
Lot témoin
Lot a jeun
chromate de potas-
chlorhydrate dIa-
cide trichloracê-
sium (14,2 ppm)
niline (5,8 ppm)
tique (60 ppm)
42,17
59,23
41,69
51,36
54,21
41,46
35,45
79,59
47,01
36,17
27,72
35,78
49,26
35,22
32,38
33,58
51,10
33,16
60,97
29,86
43,36
49,13
58,77
31,87
49,69
33,64
33,90
33,76
32,08
38,04
32,91
35,20
29,90
21,77
30,16
13,04
34,03
13,15
44,36
40,23
40,02
48,48
36,93
52,28
53,13
----------------- -------------------- ------------------- -------------______0 -------------------
-
-
-
-
-
X = 34,21
X = 42,47
X = 41,80
X = 41,88
X = 40,42
Sm = 3,17
Sm = 3,17
Sm = 6,34
Sm = 4,14
Sm = 4,82
129
ANNEXE 40 (cf. Tableau 31)
Pourcentage de l'activité des ATPases Na+K+ dépendantes par
rapport a celle des ATPases totales dans la branchie des
Loups sous 11effet du jeûne et des produits chimiques
ATPases Na'" Kt'dépendantes x 100
ATPases totales
Lot traité au bi-
Lot traité au
Lot traité a l'a-
Lot témoin
Lot a jeun
chromate de potas-
chlorhydrate d'a-
cide trichloracé-
sium (14,2 ppm)
niline (5,8 ppm)
tique (60 ppm)
8,34
17 ,61
35,81
43,27
29,88
27,99
40,76
18,48
0,90
45,51
48,49
13,32
32,16
28,31
22,21
35,65
29,32
36,65
19,58
40,30
29,49
25,35
36,67
37,90
21,52
51,94
10,88
38,04
26,62
30,60
60,73
18,56
37,07
38,36
34,46
61,86
7,97
36,56
4,23
37,59
47,45
0
23,14
15,55
32,46
---------------_. -------------------- ------------------- ------------------- -------------------
-
-
-
-
-
X = 41,32
X = 18,20
X = 32,73
X = 23,86
X = 32,72
Sm = 5,81
Sm = 4,08
Sm = 2,35
Sm =
5,02
Sm = 2,63
130
ANNEXE 39 (cf. Tableau 30)
Activité des ATPases Na+K+ dépendantes de la branchie des
Loups sous l'effet du jeOne et de différents produits chi-
miques
~moles de phosphore/g
protéines/minute
Lot traité au bi-
Lot trai té au
Lot traité a l'a-
Lot témoin
Lot a jeun
chromate de potas-
chlorhydrate dIa-
cide trichloracé-
sium (14,2 ppm)
nflfne (5,8 ppm)
tique (60 ppm)
21,28
II,96
22,78
20,37
44,48
II,78
8,19
28,67
9,1
28,02
16,57
23,18
10,82
20,31
13,31
15,05
15,56
20,28
15,49
18,11
17 ,09
22,32
18,75
21,88
18,14
6,70
34,20
21,22
14,04
17 ,83
9,76
27,89
19,63
12,05
18,97
10,99
17 ,05
28,14
Il,96
19,55
26,40
30,66
18,30
10,05
26,79
26,48
12,73
----------------- ~------------------- ------------------- ------------------- -------------------
-
-
-
-
-
X = 15,27
X = 21,22
X = 21,50
X = 14,79
X = 22,80
Sm = 1,83
Sm = 2,91
Sm = 1,69
Sm = 1,44
Sm = 3,11
131
ANNEXE 41 (cf. Tableau 32)
Effet du jeûne et des différents produits chimiques sur la
glycémie du Loup
~g glucose/ml de plasma
Lot traité au bi-
Lot traité au
Lot traité a l'a-
Lot témoin
Lot a jeun
chromate de potas-
chlorhydrate d'a-
cide trichloracé-
sium (14,2 ppm)
niline (5,8 ppm)
tique (60 ppm)
335
125
90
250
440
320
206
190
270
360
390
230
250
260
215
275
160
335
265
165
380
160
385
230
220
335
70
70
325
180
360
85
30
335
240
295
130
365
205
350
335
185
.---------------- ------------------- -------------------- -------------------- -------------------
-
-
-
-
-
X = 337,20
X = 145,75
X = 192,85
X = 282,00
X = 263,57
Sm = 11,19
Sm = 19,47
Sm = 51,77
Sm =
17,76
Sm = 37,28
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danio rerio (Hamilton Buahanan)~ Teleostei~ Cyprinidae).
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Qualité de l'eau. Détermination de la toxicité aiguë létale
de substances vis-~-vis d'un poisson d'eau douce (Braahy-
danio rerio (Hamilton Buahanan)~ Teleo8tei~ Cyprinidae).
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RESUME
Recherches concernant 1'écotoxicitê aiguë et subchronique de trois substances chi-
miques de référence (bichromate de potassium, chlorhydrate d'aniline et l'acide trichlo-
racétique) pour diverses espèces de Poissons: 3rachydanio rePio Hamilton-Buchanan, Di-
.'entrarchU8 :::.brax Linné et Sa~mo gairdnePii Ri chardson.
Paoa N'Diaye
Thèse de 3ème cycle d'Ecologie.
Soutenue le 12 septembre 1984 à 9 heures à Marseille devant li commission d'Examen
MM. G. Pérès
Président
G. Bogé
J. Giudicelli
} Examinateurs
N. Vicente
~ous avons étudié la toxicité de trois produits chimiques, le bichromate de potas-
sium, le chlorhydrate d'aniline et l'acide trichloracétique vis-à-vis de deux espèces
de Poissons d'eau douce (3r·1_'h!:fè.ani~ reric et o::.:mo ;;airdney>1~i) et une espèce marine
(~i~entrarchus '::.brax).
La toxicité aiguë (mesurée par la CL50-24h) après 24 h est variable en fonction
des espèces de Poissons. Elle est souvent plus grande chez le Loup que chez les espèces
d'eau douce, mais la température des essais était aussi plus importante. Chez les Pois-
sons d'eau douce, la toxicité de l'acide trichloracétique résulte de la baisse du pH
que ce produit entraîne.
Nous avons ensuite étudié la toxicité chronique de ces produits sur l'enzymologie
intestinale et branchiale de la Truite et du Loup. Les effets les plus significatifs
ont été obtenus avec le bichromate de potassium.Chez la Truite ce produit inhibe la plu-
part des enzymes de la bordure en brosse intestinale (phosphatase alcaline, maltase et
leucine aminopeptidase). Cette inhibition paraît être la conséquence d'une action du
produit sur la prise alimentaire. Le chlorhydrate d'aniline a des effets voisins, mais
de moins grande amplitude. Chez le loup la phosphatase alcaline es~ inhibée de façon
spécifique par le bichromate de potassium alors que les ATPases Na K intestinales sont
stimulées par le bichromate de potassium et l'acide trichloracétique. Dans la branchie,
ces enzymes sont inhibées à la suite du traitement au chlorhydrate d'aniline.
La mise en oeuvre de (es tests sublétaux permet d'envisager une économie de vies
animales, la détection d'effets préjudiciables peu spectaculaires ainsi que la prédiction
de perturbations physio-pathologiques à plus ou moins long terme.