N°
d'ordre: '12l
U.E.R de Biochimie et Biologie Cellulaire
Biologie et physiologie V6gétal••
option: Amélioration des plante.
THi3SE
de Doctorat de JI Cyele
présentée à l'UNIVERSITE DE BORDEAUX Il
par
TATE KENE GASSAMA
Etude des potentlallt~s or8anosènes chez l'Hybride
Pinus "riglda &: taeda" (Mill.) en culture "in 'Vitro".
CONSEIL AFRICAIN ET MAlGACHil
1.POUR l'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR
C. ~',M. E. S. -
OUAGADOUGOU
- - -
. Arnv~e ·:2·4· MAlJB95 ..... 1
EnregJstr~=o"~~_nofi. 0 .0.1.8 .4. "
~"19~,.
1
soutènhe devant le Jury:~1
M. J. BERNET
Président
M. A. DAVID
Examinateur
M. A. LAMANT
Examinateur
1984
Réalisée a:
Université de Bordeaux 1
laboratoire de Biologie et Physiologie Végétales
Avenue des Facultés 33405 TALENCE
fJo1eil-

---

REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier tout particulièrement :
Monsieur David, Docteur ès-sciences, qui a accepté de
m'accueillir au sein de son équipe. Je lui serai toujours
redevable du temps et de l'attention qu'il a consacrés,
avec beaucoup de générosité,
à mon travail.
- Monsieur Bernet, Professeur à l'Université de Bordeaux II,
à qui je voue une immense reconnaissance.
Il m'a soutenue
dans des moments difficiles et i l m'a permis de terminer
cette thèse.
- Monsieur Lamant, Professeur à l'Université de Bordeaux l,
qui m'a accueilli dans son laboratoire.
Je voudrais exprimer ma gratitude à Monsieur Franclet,
Ingénieur agronome, Monsieur Boulay, chercheur, ainsi
qu'à toute l'équipe du laboratoire de physiologie de
l'AFOCEL à Nangis de l'intérêt qu'ils ont accordé à mon
travail.
-
Je remercie en particulier Mademoiselle Poissonnier à
Nangis et Monsieur Chaperon, Directeur Régional de
l'AFOCEL pour le Sud-Ouest, qui m'ont envoyé tout le
matériel nécessaire à cette étude.
Enfin,
je n'oublierai pas toute l'équipe du laboratoire
de biologie et de physiologie végétales, qui, grâce aux
rapports amicaux entretenus, m'a permis de mener à bien
cette étude.

---

INTRODUCTION GENERALE
PAGE
SYSTEMATIQUE ET ECOLOGIE DU PINUS RIGIDA, DU PINUS
TAEDA ET DE L'HYBRIDE RIGIDA X TAEDA
5
PARTICULARITES MORPHOLOGIQUES
10
INTERET ECONOMIQUE DE L'HYBRIDE PINUS RIGIDA X'TAEDA
12
1° PARTIE: POTENTIALITES ORGANOGENES
D'EXPLANTATS PRELEVES SUR DES SUJETS JUVENILES
INTRODUCTION
16
HISTORIQUE
18
1)
DE-DIFFERENCIATION
20
L I )
21
1. 2)
28
1. 3)
s feuillées
29
II) OBTENTION DE SUJETS APRES DE-DIFFERENCIATION
CELLULAIRE.
34
II.1) Cas du Pinus taeda
34
II.2) Cas de l'hybride rigida x taeda.
36

---

PAGE
MATERIELS ET METHODES
37
1) DESCRIPTION DU PROTOCOLE GENERAL
38
I.A) Obtention de matériel végétal aseptique
38
I.B) Explantats
40
1. C) Culture
42
I.CI) Induction du bourgeonnement axillaire
42
I.C2) Allongement des bourgeons induits
47
I.C3) Enracinement des tigelles
48
I.D) Conditions physiques
48
II) EXPRESSION DES RESULTATS
51
RESULTATS EXPERIMENTAUX
52
CHAPITRE l
: ORGANISATION DES BOURGEONS AXILLAIRES
53
A -
INFLUENCE DU STADE DE DEVELOPPEMENT DE L'EXPLAN-
TAT SUR LA REPONSE CAULOGENE.
55
B -
INFLUENCE DE LA DUREE D'ACTION DU COMPLEXE HOR-
MONAL COMBINEE AVEC DIFFERENTES SOLUTIONS MINE-
RALES.
60
C -
INFLUENCE DE LA CONCENTRATION DU COMPLEXE HORMO-
72
NAL.
D -
INFLUENCE DU SACCHAROSE SOR L'INDUCTION
80
E - FORMATION DE BOURGEONS AXILLAIRES CHEZ PINUS TAEDA82
CHAPITRE II : FORMATION DE POUSSES FEUILLES AXILLAIRES84
A -
INFLUENCE DE DIVERSES DILUTIONS D'UNE SOLUTION
DE BASE.
84
B - ASPECT QUALITATIF ET QUAh~ITATIF DU MILIEU DE
BASE.
86
C -
INFLUENCE DE LA CYTOKINlNE SUR L'ALLONGEMENT
91

---

PAGE
o - EFFET DU MILIEU D'ALLONGEMENT SUR DES EXPLAN-
TATS PRIMAIRES
95
E - ALLONGEMENT DES BOURGEONS FORMES CHEZ PINUS
TAEDA.
98
CHAPITRE III - RHIZOGENESE
l()O
A -
INFLUENCE DU MILIEU DE BASE ET DE LA DOSE
HORMONALE
100
B - CAS D'ENRACINEMENTS SPONTANES
103
11° PARTIE - TECHNIQUES DE RAJEUNISSEMENT
106
A -
INTRODUCTION
107
B - METHODES ET RESULTATS EXPERIMENTAUX
119
BI - PRE-TRAITEMENT DU MATERIEL VEGETAL
120
BI.I -
Greffages en cascade
121
BI.2 -
Tailles et pulvérisations de cytokinine
125
B2 - CULTURE "IN VITRO"
126
CONCLUSION GENERALE
129
BIBLIOGRAPHIE
135

---

2
La multiplication végétative est un mode de reproduc-
tion asexué qui intervient fréquemment dans les conditions na-
turelles ; elle permet de coloniser ainsi un habitat qui est
favorable. Ce mode de multiplication s'accompagne d'une conser-
vation du potentiel héréditaire. Il est considéré comme un
"retour en arrière" de l'expression du programme héréditaire.
Les forestiers, pour arriver au même résultat, ont
utilisé des méthodes artificielles telles que le bouturage et
le greffage ; ils ont ainsi pu propager des génotypes intéres-
sants pour leurs qualités technologiques et pour leurs aptitu-
des à prospérer dans des conditions spéciales.
L'amélioration des arbres forestiers, basée sur la
sélection et le croisement d'individus, permet déjà des gains
appréciables. Seule la multiplication végétative donne la pos-
sibilité de propager des sujets exceptionnels issus de pollini-

---

1-----------------------7..'iiiltiiil'lililHlIIIIltllll!1II'.-II··iln__•••••••••••••
4
1
1
- d'une part l'étude des aptitudes organogènes de
1
l'explantat prélevé sur des sujets âgés de 3 se-
maines.
1
- d'autre part, une expérimentation portant sur les
possibilités de "rajeunir" par le greffage en
1
cascade.
1
Avant d'aborder la présentation de nos résultats
expérimentaux, nous indiquerons les particularités concernant
1
les espèces qui ont fait l'objet de notre étude.
1

---

1
1
5
1
1
SYSTEMATIQUE ET ECOLOGIE DU Pinus rigida/
1
DU Pinus taeda ET DE L'HYBRIDE P.rigida x taeda
r
1
A - Pinus rigida
r
Cette espèce appartient à la famille des pins que
les américains appellent
npitch pin". Dans son aire naturel-
le,en Pennsylvaniè, i l peut atteindre 30 m de haut dans la
partie Sud, alors que dans la partie Nord, i l conserve un
port arbustif. Son tronc est sinueux, les branches étalées
espacées peu fortes;
l'écorce est fissurée en larges plaques
de teinte brun rouge orangé.
Très souvent apparaissent à partir du sol, sur les
branches basses et sur le tronc, des touffes de rameaux courts.
Ces touffes peuvent, selon les sujets, être très épaisses ou
très abondantes et former alors des anneaux de feuillage autour
du tronc, ce qui permet d'ailleurs de reconnaitre l'espèce
avec certitude.
Parfaitement adaptée aux froids hivernaux, cette es-
pèce occupe des sols pauvres, secs et rocailleux, et certains
écotypes sont réputés croitre sur des sols acides lourds et
souvent inondés en hiver.

---

CARTE N° 1
Aire naturelle du pin Il l'encens (Pinus taeda)
40°
35°
70°
(j\\
Caroline du Sud
Miles
25°
o
100
200
300
400
1 1 1 1 l , 1 1 l , I , ! 1 1 1 1
90°
85°
15°
25°

---

•
8
1
1
1
Cependant sa croissance lente, sa forme défectueuse
et son bois de qualité moindre, l'ont fait éliminer de nom-
1
breux essais bien qu'étant parfaitement rustique.
1
Une enquê~e de l'Afocel a permis de vérifier cette
résistance de l'espèce rigida qui prospère convenablement,
1
aussi bien en Sologne que dans les Landes ou au Pays Basque.
1
B - Pinus taeda
1
Ce pin appelé aussi pin à encens en raison de la
1
forte odeur de thérébentine répandue à la rupture de ses
aiguilles appartient au groupe des "Southern Pines" du Sud
Est des U.S.A. Ce groupe comprend notamment des espèces à
1
3 aiguilles
(P.paZustris~ P. Taeda ) et des espèces à 2 ou
3 aiguilles
(P.
caribaea~ P.eahinata). Le bois produit est
1
dur
("hard pine")
et d'excellente qualité.
1
L'arbre peut atteindre 30 m de haut,
le fftt est
plus ou moins droit selon la rapidité de croissance.
L'espèce croit assez rapidement dans le Sud des
U.S.A. du New Jersey au Texas. Sur de faibles hauteurs
(400 m), i l préfère les sols assez humides ainsi qu'une
forte chaleur estivale. Il est sensible à l'état juvénile
aux hivers rigoureux.

---

---------_.
1
--~-~ ~~~
- 9
1
1
Cette espèce possède des exigences très précises,
1
cependant elle a l'~yantage de présenter une grande variabi-
lité génétique dans son aire naturelle.
1
C -
Pinu8 rigida x taeda
1
En Californie et'en Illinois, cet hybride pousse
plus vite et a une meilleure forme que P. rigida ; si dans
le New Jersey il dépasse P. Taeda, ce n'est pas le cas dans
le Maryland.
En 1953, Hyun impressionné par les performances de
cet hybride en Californie, mit sur pied un programme d'hybri-
dation de grande envergure en Corée du Sud. 62.285 sacs fu-
rent pollinisés et donnèrent 1.800.000 graines fertiles de
cet hybride. Le programme se poursuit en s'amplifiant.
Les premiers essais de croissance en Corée montrent
que l'hybride a une croissance supérieure à celle du rigida
et inférieure à celle du taeda.
L'intérêt que représente cette espèce pour la Corée
du Sud se justifie ainsi : P.
taeda,
espèce sensible au froid
ne peut se développer que dans des zones cOtières à climat
très doux. L'hybride sera alors probablement assez rustique
pour être utilisé dans la région où on plante actuellement
du pin rigida dont la qualité est relativement inférieure.

---

1
10
1
1
1
PARTICULARITES MORPHOLOGIQUES
1
1
1
Chez Pinus taeda, P. rigida, P. eZZiotri, P. pa-
Zustris,
la croissance fait intervenir l'élongation de plus
!
d'un bourgeon terminal par pousse chaque année.
1
Le nombre de bourgeons terminaux débourrant suc-
cessivement au cours d'une seule et même saison de végéta-
tion peut atteindre sept. Néanmoins, la plupart des pousses
individuelles ne montrent pas plus de 2 ou 3 vagues succes-
sives de croissance.
Chez ces espèces, alors que l'entre-noeud du pre-
mier bourgeon est entrain de s'allonger en début de saison,
le méristème apical s'active et initie des primordia qui
évoluent en feuilles et axe d'un nouveau bourgeon terminal.
Ce bourgeon se forme rapidement et souvent s'al-
longe aussitOt pour former une seconde pousse au cours de
la même saison végétative. Plus tard, sur chaque branche,
de nouveaux bourgeons peuvent être formés et évoluer tou-
jours au cours de la même saison.

---

1
mz
1
11
1
1
Un des éléments importants pour la multiplication
1
végétative est le rejet à partir de souche. En effet, sur
les espèces de Pin actuellement étudiées en France, le Pin
maritime notamment, l'exploitation du bois exige une coupe
1
rase, un déssouchage puis une nouvelle plantation. Or le
Pinus rigida et dans une moindre mesure le Pinus ta~da pré-
1
sentent la particularité de rejeter après une coupe rase.
1
Divers auteurs ont tenté d'expliquer ce phénomène.
1
Le phénomène de rejet observé sur ces espèces à
r
la suite d'un incendie ou d'une mutilation a été très tôt
attribué à la présence de bourgeons adventifs. Mais, de
nombreux auteurs pensent que cette hypothèse est totalement
erronée.
Ils ont constaté la présence, au-dessus des coty-
lédons de bourgeons axillaires. Et, ils pensent que ce sont
ces bourgeons qui donneraient naissance à des rejets à la
base du tissu et au niveau du collet.
Selon Little et
Somes
(1960) Pinus taeda ne reje-
terait pas après passage d'un incendie, car selon lui, les
bourgeons étant situés au-dessus du sol, ils sont facilement
détruits. Cependant, i l a constaté que des pieds de P.
taeda
âgés de 7 à 8 ans, réagissaient souvent après la taille.
Il pense que les rejets proviennent de bourgeons
ou de méristèmes situés à l'aisselle des aiguilles premières
des brachyblastes, des petites branches développées à partir
de sites axillaires et occasionnellement de bourgeons nodaux.

---

1
r
12
1
r
INTERET ECONOMIQUE DE L'HYBRIDE P.rigida x P.Taeda
[
1
Nous avons vu que le pin rigida est une espèce
très rustique, bien adaptée à des conditions extrêmes, mais
son bois est de qualité médiocre et sa forme est défectueuse.
Pinus taeda, bien qU'il possède des exigences éco-
logiques assez particulières, produit un bois d'excellente
qualité.
De plus, ces deux espèces ont l'avantage de donner
des rejets après une taille sévère ou même après passage d'un
incendie.
L'intérêt de croiser ces deux espèces à aires na-
turelles voisines, apparaît évident dans la mesure où cela
permettrait d'obtenir des individus très performants sur le
plan de la croissance et de la rectitude et, de plus très
bien adaptés à des conditions extérieures défavorables.
Bien qu'à notre connaissance, l'aptitude à la com-
binaison et l'héritabilité de ces caractères n'aient pas
fait l'objet d'études
suivies,
les sélectionneurs espèrent
obtenir un gain génétique appréciable en croisant ces deux
espèces.

---

13
En dehors du gain attendu concernant la rusticité
la rectitude et la qualité du bois, il existe deux avantages
et non des moindres qui témoignent en fav~ur de ce plan de
sélection. D'une part, l'intérêt qu'offre l'hybridation in-
terspécifique est qu'elle permet de produire un effet de
vigueur hybride chez les individus issus du croisement. La
création de ces variétés hybrides pourra alors se justifier
si ces dernières sont supérieures au mell1eur des deux parents.
D'autre part, un niveau d'hétérozygotie plus éle-
vé aura pour conséquence d'augmenter la variabilité génétique
en laissant ainsi le champ libre à l'investigation.
Les hybrides servant au reboisement des sols
marginaux pourront être utilisés en menuiserie, caisserie,
ainsi qu'en industrie de pâte à papier.
La facilité qu'ont ces espèces de se propager dans
leur habitat naturel, apporte un élément prometteur dans la
sélection d'individus les plus performants.
De nombreux essais sur l'hybride Rigida x taeda ont
été effectués aux U.S.A. ainsi qu'en Corée où ils donnent
d'excellents résultats. De très vastes programmes d'améliora-
tion, sélection et multiplication végétative de cette espèce
y ont été déjà entrepris.

---

1
14
1
1
1
Des essais d'introduction en France par l'AFOCEL
1
dans le but de trouver une espèce de substitution au pin
maritime, n'ont pas donné de résultats spectaculaires.
1
Des mesures de croissance en hauteur de l'hybride
1
comparées à celles du Pin rigida sont résumées dans le ta-
bleau suivant :
1
Essai de Vacquey
(Sud-Ouest)
1
r
Espèce
Effectif
Hl'80
SHT
ru
Plus grand
(an)
(cm)
78-80
plant
80
(an)
(an)
1
p.Pigida
595
134
33
76
240
!
P.Pigida
306
144
42
86
252
x taeda
[
1
Essai de Cercoux
(Sud-Ouest)
Espèce
Effectif
Hl'
80
SHT
ru
Plus grand
78-80
plant
80
(an)
(an)
(an)
(an)
P.Pigida
162
139
35
91
225
P.Pigida
80
157
59
105
277
x taeda

---

1
1
15
1
r
1°
PARTIE
r
[
POTENTIALITES ORGANOGENES D'EXPLANTS
PRELEVES SUR DES SUJETS JUVENILES

---

1
16
1
1
INTRODUCTION
1
1
Les techniques in vitro visent à régénérer une
1
plante entière en prélevant diverses parties de la plante-mère.
Ces méthodes qui incluent la culture d'organes, de tissus,
1
de cellules isolées, de protoplastes, ont conduit pour un
certain nombre d'espèces à la régénération d'individus plus
1
ou moins "identiques" au sujet de départ et surtout indemnes
de toute contamination.
1
Elles ont d'autre ~,permis d'élargir les connais-
1
sances sur les phénomènes de morphogénèse, bien qu'une grande
part demeure encore inexpliquée.
1
1
Le nombre important d'espèces forestières actuelle-
ment propagées par cette méthode témoigne de l'interêt tant
sur le plan scientifique que sur le plan commercial qu'on lui
1
accorde.
1
L'étude que nous sommes chargés de mener est basée
1
essentiellement sur la multiplication végétative "in vitro"
d'hybrides rigida (MiLL.) x taeda.
1
1
1
1
1

---

p_._·IIiiI··iliIl7.Sz.·'ZII·iII7tlllill'IIT•••.,.·.r••••lIliW'.rlli·.n1i...s.~·.rliliitill·siilit••lIÎtlli~;.fslllil]'IIIIl·lIîIrt.'I?m.lwl·liiiI-r
17
1
r
[
L'intérêt que les chercheurs portent à cette espèce
se retrouve dans la place qui lui est accordée dans les sché-
mas d'amélioration et dans les programmes de reboisement aux
U.S.A., en C0rée du Sud et depuis quelques temps en France.
Tout d'abord, nous essaierons de situer notre étude
dans le cadre des connaissances acquises dans le domaine de
la multiplication, conforme in vitro de génotypes sélection-
nés (gymnospermes). La présentation des espèces, leur écolo-
gie, ainsi que certains de leurs caractères morphologiques,
seront abordés.
Puis, nous nous attacherons à définir et à assurer
les conditions nécessaires à la production illimitée de plants
conformes, par induction du bourgeonnement axillaire sur des
semis, allongement des bourgeons ainsi produits et enracinement.
Nous aborderons une étude comparative entre P.taeda
et l'hybride en fonction des spécificités de conditions de cul-
ture.
Dans l'optique d'une meilleure compréhension des
mécanismes fondamentaux qui contrôlent la différenciation et
la morphogénèse de cet hybride, et pour que la méthode puisse
être applicable de manière quasi industrielle, nous aurions
aimé pouvoir compléter notre étude par des observations histo-
logiques et cytologiques.
Nous espérons que des recherches ultérieures pour-
ront être menées dans ce sens pour que la méthode soit assu-
rément rentable.

---

r---------------------
1
18
1
1
!
HIS TOR l QUE
[
Le nombre important de travaux effectués sur les
gymnospermes dont plus de la moitié concerne le genre Pinus,
témoigne de l'intérêt que ce genre représente dans les pro-
grammes de reboisement et dans les schémas d'amélioration
génétique.
Or, les conifères sont des espèces adaptées depuis
très longtemps à des conditions de sécheresse extrême
(épi-
derme épais et très cuticulisé, un hypoderme souvent fibreux
et sclérifié, un rapport surface foliaire sur volume très
faible). Cette spécialisation très poussée vers la xéromorphie
a amené de nombreux auteurs à penser que ce sont des espèces
très récalcitrantes et très peu adaptées à la culture
in vitro.
C'est ce qui explique, en partie, que si peu de tra-
vaux aient été réalisés sur les gymnospermes par rapport aux
angiospermes. Les difficultés rencontrées
ont découragé plus
d'un chercheur.

---

1
19
1
1
1
Une très bonne connaissance au préalable de la mor-
1
phologie, de l'anatomie ainsi que de la physiologie de ces
espèces, s'avère nécessaire pour mener à bien un programme de
1
micro-propagation. Car cela permettrait de choisir de façon
très précise les organes les plus aptes et possédant les po-
tentialités organogènes recquises.
1
1
La plupart des auteurs travaillant sur les Pinacées
utilisent généralement les organes juvéniles (embryons, coty-
1
lédons, hypocotyles). L'extension des méthodes de micro-propa-
gation à des sujets plus âgés sélectionnés sur la base de leurs
1
phénotypes, est souvent très difficile en raison de l'absence
presque totale de réponse
organogène •
1
La plupart des techniques utilisées repose sur l'ap-
1
plication de régulateurs de croissance
(auxines, cytokinines,
gibberelline)
à action morphogène.
1
n'autres substances organiques de natures diverses,
1
sont utilisées bien que leurs modes d'action soient ignorés et
leurs effets très controversés - c'est le cas notamment de
1
l'acide abscissique, de l'acide tri-iodo benzolque
(TIBA), de
l'éthylène et des dérivés phénoliques.
1
1
Classiquement,
le schéma de la micro-propagation est
composé de 4 phases distinctes, chaque étape devant être explo-
rée systématiquement pour en rechercher les besoins spécifiques
1
1
1
•

---

20
et les conditions optimales. On distingue principalement:
la phase d'induction du bourgeonnement qui s'éta-
blit grâce à un apport de doses élevées de cyto-
kinine additionnées ou non d'auxine.
-
la phase d'allongement des bourgeons qui se fait
sur des milieux souvent dépourvus de régulateurs
de croissance exogènes et additionnés de charbon
actif.
-
la phase d'enracinement des pousses sous l'action
principale des auxines.
-
le sevrage et la transplantation sur sol.
Le matériel végétal utilisé est de nature diverse
-
cotylédons, apex de germination, fragments d'hypo-
colytes, aiguilles, bourgeons végétatifs dormants.
I)OBTENTION DE SUJETS SANS DE-DIFFERENCIATION CELLULAIRE
Il existe souvent à l'aisselle des feuilles,
des jeunes
cotyledons et au niveau des apex, des ilOts de cellules à l'état
méristématique qui,
sous l'action organogène de la cytokinine,
peuvent évoluer en bourgeons.

---

1
21
1
1
1
Contrairement au bourgeonnement adventif où on passe
1
par une étape de de-différenciation cellulaire, le bourgonne~
ment axillaire se base sur l'utilisation de cellules pré-déter-
[
minées génétiquement et qui, stimulées, évoluent dans le sens
qui leur était dévolu au départ.
1
Cette méthode permet d'obtenir des "copies conformes"
du matériel de base sans aucune altération du génome.
l-a)
Influence du milieu de base et de la concen-
tration hormonale.
David et Isemulali
(1978)
induisent la formation de
bourgeons axillaires à l'aisselle des cotyledons et de feuilles
juvéniles de Pinus pinaster. L'effet combiné d'une cytokinine
S
la 6 benzyl-aminopurine (6 BAP)
à 2.10- M, ainsi que d'une auxi-
ne, l'acide naphtalène acétique
(ANA)
à S.lO-sM pendant IS jours,
permet un taux de bourgeonnement optimal.
Boulay et Franclet (1976,
1977)
travaillant sur des
bourgeons dormants de Pseudotsuga menziesii, induisent un bour-
geonnement axillaire avec de l'acide 2.4. dichloro-phenoxyacé-
tique
(2.4 D)
à lO-6 M•

---

22
Des apex entiers, des brachyblastes et des bourgeons
dormants de Pinus nigra ont pu ~tre cultivês par Jelaska et al.
1
(198l) sur un milieu Murashige et Skoog diluê de moitié, con-
1
tenant de la BAP (l mg/l) et de l'ANA.
l
Kubler (1982) sur Pinus caribaea var.Hondurensis a
!
montré que la BAP (5 mg/l) appliquée pendant une vingtaine de
jours au moins sur des apex de germination, donne de meilleurs
résultats si elle est associée à une forte teneur en sucre
1
(50 g/l). Ce même auteur sur Arancaria stimule des bourgeons
axillaires situés sur des rameaux âgés de 5 à 8 ans en l'ab-
1
sence de toute substance hormonale. Cette caulogénèse sponta-
née serait dQe à la suppression de la dominance apicale, ce
1
qui permettrait le développement des bourgeons axillaires.
Cependant, en présence de BAP, il observe une réduction du
1
nombre de tigelles émises par le rameau, mais en contrepartie
la BAP provoque la différenciation de bourgeons axillaires de
1
2ème ordre sur les tigelles.
1
John et Murray (198l) travaillant sur des rameaux
d'Epicea de Sitka, induisent le dêveloppement de bourgeons axil-
1
laires sur un milieu dépourvu de régulateurs de croissance. Ils
ont montré que la culture de la partie apicale de la pousse pro-
1
duit plus de bourgeons (4 à 5) après 63 jours de culture par rap-
port aux parties basale et intermédiaire.
1
1
1
1
1

---

1
23
1
1
1
Mapes et Young
(1981)
constatent que le simple fait.
de couper les cotylédons à 5 mm du noeud cotyledonnaire, aug-
1
mente le nombre de bourgeons produits par expIant. Ceci serait,
selon ces auteurs, une conséquence d'un prélèvement plus impor-
1
tant de régulateurs de croissance et de métabolites pour com-
penser l'apport nutritif des cotyledons.
1
Cornu
(communication personnelle)
obtient un bour-
1
geonnement axillaire sur des pousses nouvellement formées de
Larix euroZepis en les cultivant sur un milieu composé des élé-
1
ments minéraux de Murashige et Skoog additionné de BAP et d'ANA
à 1 mg/!.
1
Une morphogénèse induite a été possible sur des pous-
1
ses d'Abies baZsamea (Bonga 1977) après différents temps de
trempage dans des solutions d'acide N Di methyl -
amino-succi-
1
niamique ou d'acide 1 Phenyl -
3 - Methyl Pyrozolone.
Il sem-
blerait que le trempage permettrait d'éliminer certaines subs-
1
tances inhibitrices.
1
David et al
(1979), en cultivant le brachyblaste por-
teur d'une paire d'aiguilles de Pinus pinas ter pendant la à 30
jours sur un milieu contenant notamment de la BAP
(la-SM) et
1
de l'ANA (2,5.
la-SM), provoquent l'organisation d'un bourgeon
au sommet du "rameau court". La pousse feuillée ainsi produite,
1
pourra être à son tour soumise à un nouveau traitement inducteur
du bourgeonnement axillaire.

---

24
Rancillac
(1979,1981) montre l'effet stimulant de
la solution minérale de Murashige et Skoog sur l'organisation
des jeunes semis de Pinu8 pinas ter.
De toutes les cytokinines testées chez les gymnos-
permes, i l semble que la BAP soit la plus efficace. Elle est
souvent associée à une auxine l'ANA, qui bien qu'étant arti-
ficielle, a l'avantage de se dégrader moins vite que les au-
xines naturelles.
Ces hormones sont incorporées dans le milieu de
culture à des doses variant de 10- 5 à 5.10- 5 M pour la BAP
et de l'ordre de 10- 8 M pour l'ANA.
Les durées d'induction variables
(3 à 45 jours)
sont souvent fonction de la concentration hormonale choisie
Concernant les milieux de base, peu d'études précises ont été
menées sur l'influence spécifique des ions ou de leurs concen-
trations sur le bourgeonnement.
De nombreuses solutions minérales ont été testées.
Nous ne citerons pour mémoire que les plus connues : celles de
Murashige et Skoog
(PinuB pinaster
Larix x
euroZepis
Abies
3
3
bassamea
Pseudotsuga menziesii) de Margara, Cheng, Reilly-
3
Washer, Gresshoff - Doy ; Schenk et Hildebrandt, etc . . .

---

1
25
1
1
1
Ces milieux sont le plus souvent très différents par
1
leurs compositions en éléments minéraux et par leurs concentra-
tions ioniques. Cependant, i l ressort de certains travaux qu'une
forte teneur en ion potassium stimule l'organogénêse, que des
1
milieux contenant de fortes teneurs en phosphate et de faibles
teneurs en nitrate d'ammonium peuvent induire une caulogénèse.
1
Rancillac
(1971)
sur le pin maritime a constaté qu'un
1
milieu très riche en éléments minéraux
(Murashige et Skoog par
exemple)
favoriserait l'obtention de bourgeons.
De nombreux auteurs ont souvent mis l'accent sur la
concentration totale en sels minéraux qui semble déterminante
pour l'induction du bourgeonnement. C'est le cas, notamment,
chez Pinus taeda où un optimum de bourgeons est obtenu après
culture sur un milieu dilué de moitié.
Mais, d'un autre cOté, Reilly et Brown (1976)
ont
montré que la nature du milieu n'était pas déterminante dans
la réponse caulogène des embryons de Pinus radiaia.
David et Faye
(1979)
constatent le rOle primordial
de l'ion ammonium qui stimule considérablement l'organogénèse
en augmentant le nombre de divisions cellulaires, et qui agit
donc de façon synergique avec la cytokinine.

---

26
Par contre, le développement des bourgeons axillaires
situés sur des rameaux de Douglas n'intervient qu'en l'absence
de nitrate d'ammonium.
Kubler
(1982)
sur Pinus oaribaea a montré que le
bourgeonnement axillaire est optimal si les explants sont cul-
tivés sur un milieu pauvre en ammonium et riche en potassium.
I-b) Effet des conditions physiques
Dans la culture de tissus de gymnospermes, la tempé-
rature, photo-période, intensité et qualité lumineuses sont des
facteurs importants dans l'induction et l'allongement des bour-
geons.
Cependant, i l faut noter que ces facteurs sont rare-
ment limitants et c'est ce qui explique que très peu d'études
précises aient été faites en culture de tissus.
Les températures utilisées sont variables de 18 à
25°C en fonction de l'espêce, puisque la
température
de cul-
ture est déterminée à partir de celle de la plante dans son
habitat naturel.

---

27
La lumière continue aussi bien que la photopêriode
sont appliquêes, cependant l'organogénèse in vitro peut être
stimulêe par une alternance efficace des cycles jour/nuit dont
l'optimum estrêalisê pour une photopêriode de 16 h/8 h.
Les intensités lumineuses varient de 800 ~ 10.000Iux.
La lumière fluorescente
(type Crolux ou TL 33) com-
binêe ou non à la lumière incandescente est la source de lu-
mière la plus utilisée pour la culture du tissu.
Seibert
(1975)
a montré que les longueurs d'onde
proches de l'U.V. et du bleu et loin du rouge,
sont les plus
efficaces pour stimuler la caulogênèse. Par contre, l'enraci-
nement est nettement stimulé par la lumière rouge.
Evers
(1981)
avec le Douglas stimule la croissance
en augmentant l'intensité lumineuse.
Mapes et al.
(1981)
constatent des signes de chloro-
se sur des explantats de Douglas exposês à de très fortes in-
tensités lumineuses
(50
E/m2/sec).

---

•
28
1
1
Certaines cultures nêcessitent un passage à l'obscu-
ritê en prêsence de charbon actif pour éliminer certaines subs-
1
tances de nature polyphenolique toxiques pour les plantes.
(Misson et al., 1982).
1
1
Les bourgeons ax~llaires induits sur un milieu très
1
riche en éléments minéraux et hormones vont être transférés
sur d'autres milieux pour favoriser leur allongement.
1
Ces milieux d'allongement sont le plus souvent plus
pauvres en éléments minéraux et dépourvus de substances hormo-
nales. L'addition de charbon actif améliore de façon souvent
spectaculaire les rêsultats.
Kubler
(1982)sur Pinus caribaea,
a constaté que la
dilution du milieu était défavorable à l'allongement des
pousses.
Sur le Sequoia Sempervirens,
Boulay (1979)utilise
le milieu Murashige et Skoog dilué de moitié. L'addition de
charbon actif entraîne un gain de croissance de l'ordre de 2
fois et demi par rapport au têmoin sans charbon. De même,
les différences de rêactivité des tigelles en subculture sont
considêrables. Quand i l passe d'une dilution de 1/2 à des di-
lutions de 1/~ et 1/4, il observe des gains en hauteur compa-
rables mais aussi des signes de carence apparaissent sur les
feuillages.

---

29
Sur le Douglas,
le milieu de base qui stimule
l'allongement est pn milieu dépourvu d'ion NH +, additionné
4
de charbon actif
(0,5 %)
et dépourvu d'hormone. L'addition
d'AIB
(1mg/l)
amène un gain de croissance notamment lorsque
l'age du pied-mère est supérieur à 2 ans.
(Boulay,
1979).
Sur
(le pin maritime), David et'al
(1989)utilisent
un milieu Margara modifié sans hormones et additionné de
charbon actif
(2%)
Les pousses sont mises à allonger sous une
photopériode 16 H/8 H et une température de 20 à 25°C.
Le rôle du charbon actif sur l'allongement des
pousses est toujours imprécis. On pense qu'il pourrait agir
soit en apportant dans le milieu de culture des polyamines,
soit en absorbant des toxines excrétées par les explants
(composés phénoliques). Mais quel que soit son rôle dans le
métabolisme,
son efficacité demeure incontestée.
Davic et David
(1977)
en cultivant des pousses
feuillées issues du développement de bourgeons axillaires en
7
présence d'AIB
(10-
M), de vitamines et d'acides aminés,
constatent l'enracinement de quelques pousses.

---

30
Chalupa et Sommer (1975)
respectivement sur Picea abies
et Pseudotsuga menziesii observent quelques rares cas d'enracine-
ment en présence d'ANA ou d'AIB.
Boulay et Franclet (1977) constatent avec des bourgeons
dormants issus de plants de Douglas d'âges différents
(6 mois, 2
ans et 4 ans), que les taux de rhizogénèse sont optimaux quand :
-
les teneurs en éléments minéraux sont diluées de
moitié ou du tiers par rapport au milieu de base
utilisé pour la croissance des pousses.
-
l'AIA, 10 à 20 mg/l, est incorporé au milieu.
-
les pousses sont prélevées sur des rejets âgés de
moins de 2 ans.
Utilisant des tiges épicotylées, ils observent que
l'auxine n'est pas indispensable à l'enracinement.
Bornman et Jansen
(1981)
induisent une rhizogénèse sur
des pousses issues de "rameaux courts" de
Pinus syZvestY'is en
présence de coumarine
(10 ~M) •

---

1
sn?'?
m
3
-;asM
1
31
r
1
Mapes et Young (1981)
enracinent des tiges feuillées
de Douglas issues de bourgeons axillaires. Ils constatent que
les explants ayant une taille inférieure à 3 cm, forment un vo-
lumineux cal dépourvu de méristèmes racinaires.
Les meilleurs taux d'enracinement sont obtenus sur un
milieu riche en éléments minéraux, contenant 0,1 mg/l d'ANA et
0,1 mg/l d'Isopentenyl adenine
(2 -ip).
Toribio et pardos sur Pinus sylvestris notent l'effet
stimulant de la diminution de la teneur du milieu en sucre
(1 %).
sur la rhizogénèse. Ils atteignent 50 % d'enracinement en l'ab-
sence de toute substance hormonale.
Sur des pousses feuillées de Pinus pinaster
David et
al
(1977)
observent qu'une plus grande rhizogénèse est obtenue
après un trempage de 24 h dans une solution d'AIB suivi de la
culture sur un milieu aéré et stérile constitué d'un mélange
perlite-tourbe.
Ils obtiennent 80 % d'enracinement sur des pous-
ses axillaires provenant de jeunes semis et seulement 50 % sur
des pousses issues de brachyblastes prelevés sur des arbres de
2 à 3 ans.
Boulay (1979), dans le cas oü les explants sont préle-
vés sur des sujets âgés de moins de 4 ans, obtient l'enracine-
ment des pousses de Pseudotsuga menziesii.

---

T
32
1
1
1
Chalupa
(1977)
enracine de jeunes tiges provenant de
1
bourgeons dormants de ficéa abies prélevés sur des arbres de
moins de 2 ans.
1
1
Rancillac et Al
(1979,1981)
constatent qu'une dose
de 10- 6 M d'ANA appliquée à des pousses de Pinus pinas ter induit
la formation de nombreuses racines adventives. Mais ce phénomène
1
s'accompagne le plus souvent d'une callogénèse importante pouvant
gêner l'établissement de connections vasculaires entre système
1
racina ire et tige.
1
Par contre, des doses d'ANA plus faibles de l'ordre de
7
10- M permettent la formation de racines plus fines ayant une
1
croissance normale pratiquement sans formation de cal.
1
Ils constatent de même, qu'un abaissement de la tempé-
1
rature de 25 à 20°C ainsi qu'une diminution de la teneur en élé-
ments minéraux et en sucre, favorisent l'enracinement.
1
Ainsi, on constate que les tests d'enracinement chez
1
les Gymnospermes ne sont pas toujours couronnés de succès. Les
cellules de la base de la tigelle devront passer par une phase
de dé-différenciation et de re-organisation sous l'action prin-
cipale des auxines. On comprend aisément que l'aptitude à l'en-
racinement soit fortement influencée par l'age du matériel sur
lequel l'explantat a été prélevé.

---

•
33
1
1
Actuellement, les conditions de la rhizogénêse "in
1
vitro" ne sont pas totalement éclaircies et des travaux sont
encore nécessaires pour que la production de plantes entières
1
soit un processus parfaitement reproductible.
1
Pour le moment,
les facteurs favorisant la rhizogénèse
notamment l'abaissement de la température, la diminution de
1
la teneur en éléments minéraux, la nature et le mode d'emploi
des auxines ou des dérivés phénoliques, demeurent empiriques.
1
1
De rares cas d'enracinement spontané ont été signalés
par quelques chercheurs mais ils ne dépassent guère 1 %.
(Réf.)
1
Certains auteurs se sont ainsi tournés vers l'enracine-
r
ment en conditions non stériles sur des substrats três variés
et plus aérés que la gelose. Ces substrats ont l'avantage
d'être moins onéreux, plus pratiques, et peuvent être utilisés
r
dans des conditions physiques parfaitement contrôlées.
1
Chalupa (1977)
a provoqué l'enracinement de pousses
t
de Picéa abies et de Pseudotsuga menziesii en les cultivant
sur de la perlite. La base des tiges est préalablement enfoncée
dans une poudre contenant de l'ANA
(500 mg/l) de l'acide
nicotinique
(500 mg/l) et de la thiamine
(10 mg/l). Les
explants sont pulvérisés deux fois par jour par une solution
nutritive et placés dans une atmosphère à humidité saturée.

---

35
Cependant, les bourgeons induits par la Zeatine évoluent
en pousses plus vigoureuses.
Sur les sections d'hypocotyles et des fragments de tiges,
l'induction est possible mais le pourcentage de bourgeonnement est
beaucoup plus faible.
Ils ont montré qu'il existe une corrélation positive
entre le pourcentage de bourgeons induits et le rapport cytoki-
nine
(auxine). De très fortes doses d'auxine inhibent l'induc-
tion, alors qu'à très faible concentration, l'auxine agit en
synergie avec la cytokinine. L'élongation des bourgeons est
meilleure sur un milieu dépourvu de substances hormonales et
la croissance est stimulée par la dilution de 1/2 des éléments
minéraux ainsi que l'addition de charbon actif
(1 %). Une très
forte intensité lumineuse
(9000 lux) est un des facteurs néces-
saires à une bonne croissance des pousses.
Concernant l'induction de la rhizogénèse, ils notent
que le pourcentage optimal de primordia racinaires est obtenu
quand les pousses sont cultivées sur le milieu de base contenant
de la BAP
(0,01 à 0,1 mg/l)
et de l'auxine ANA (0,1 mg/l).
Ils
ont ainsi montré l'effet stimulant de la cytokinine sur la rhizo-
génèse quand elle est associée à l'ANA. La croissance ultérieure
des primordia racinaires se fait sur le milieu de base dilué de
moitié et dépourvu de substances hormonales.

---

1
36
r
r
Prélevés sur des arbres de 5 ans,
80 % des explantats
1
constitués par le rameau court et les aiguilles, ont donné
naissance à des pousses feuillées en présence de fortes doses
!
de Zeatine. Si les prélèvements sont réalisés sur des explants
in vitro âgés de 8 mois, tous les explants réagissent positive-
ment.
r
II.b)
Cas de l'hybride Pinus rigida x taeda
(Hyun et
al.
1982).
Des cotyledons excisés à partir de l'embryon et
cultivés sur un milieu GresshoffDoy contenant de la BAP
(1
mg/l) produisent dans le meilleur des cas 50 bourgeons par
embryon avec un taux de bourgeonnement qui varie entre 67 et
100 %.
L'allongement de ces bourgeons se fait sur le
milieu de base dilué de moitié, dépourvu de substances hormonales
et additionné de charbon actif
(1 %).
Lorsque l'allongement
est suffisant,
la partie supérieure de la pousse est mise à
enraciner, afin de conduire à la régénération d'un sujet;
la partie inférieure est soumise à un nouveau traitement
caulogène afin de permettre le clonage du sujet d'origine.
La rhizogénèse optimale
(80 %)
est induite sur
milieu GresshoffDoy, contenant 0,01 mg/l de BAP et 0,1 mg/l
d'ANA. Les racines produites sont épaisses et ramifiées.

---

37
MATERIELS
ET
METHODES

---

38
I) DESCRIPTION DU PROTOCOLE GENERAL
La méthode que nous allons développer ci-après
consiste à définir les modalités' du clonage des sujets
juvéniles par induction du bourgeonnement axillaire.
Nous nous sommes essentielle~ent inspirés du
protocole expérimental utilisé par David et Al (1977/78)
sur le pin maritime. La démarche suivie est identique,
c'est dans le cadre de la recherche des conditions spé-
cifiques de culture de l'espèce étudiée, que nous avons
été amenés ~ introduire des variantes. Le protocole est
le suivant
- obtention de sujets aseptiques
- induction du bourgeonnement à partir de cellules
méristématiques
pré-existants à l'aisselle des
cotylédons.
allongement des bourgeons ainsi obtenus
- enracinement des tigelles.
I-A - OBTENTION DE MATERIEL VEGETAL ASEPTIQUE
I-A.l) Q~!g!~~_g~2_g~~!~~2
l
Les différents lots de graines utilisées provien-
nent en majorité de pollinisation naturelle sur les hybrides.
1
1
1

---

39
Rigida x taed~ Un lot (81628) est issu de pollinisation
contrôlée et les individus sont des hybrides F1. Ces lots
proviennent soit des USA soit de Corée du Sud. Les graines
de Pinus Taeda ont été recoltées sur des arbres sélection-
nés en France.
Tout le matériel a été fourni par l'AFOCEL.
I.A.2) ~§~E~!~_9~~_9E~!~~§
Les graines sont d'abord rincées à l'eau distil-
lée pour éliminer les fongicides puis les graines vivantes
sont sélectionnées par la méthode de flottaison.
Une prem1ere stérilisation dans l'eau oxygénée
(30 %) additionnée de deux gouttes de tween pendant 15 mn,
est suivie de 4 rinçages à l'eau distillée stérile.
Les graines sont ré-hydratées par un séjour de
24 h dans de l'eau distillée. Une seconde stérilisation est
réalisée dans les mêmes conditions mais d'une durée de 5 m,.
Elle est également suivie de plusieurs rinçages à l'eau dis-
tillée stérile.

---

40
Les graines sont placées dans des germoirs conte-
nant une couche de coton imbibée d'eau distillée stérile.
puis scellés
au parafilm. La germination s'effectue en sal-
le de culture en présence d'une thermopériode de 25/22°C et
une photopériode de 16 h de lumière tamisée suivie de 8 h
d'obscurité. Celle-ci survient au bout de 5 à 10 jours chez
Pinus rigida x taeda avec un pourcentage variant autour de
90 % (Tableau nOl ), l'aseptie n'affectant pas le pouvoir
germitatif.
Par contre, chez le Pinus Taeda, le pouvoir germi-
tatif est beaucoup plus faible et fortement diminué sous
l'effet de l'aseptie (35 % de graines germées après 4 semaines
de culture). D'autre part, on note un taux d'infection très
élevé (tableau nOl ).
[
l
I.B - EXPLANTATS
Les explantats sont constitués par le segment api-
1
cal (5 mm) de l'hypocotyle portant les cotyledons étalés et
[
la touffe d'euphylles plus ou moins développée.
1
Les prélèvements sont effectués sur des semis âgés
de 4 â 5 semaines. Le segment d'hypocotyle est enfoncé dans
(
le milieu de culture jusqu'au niveau du noeud cotyledonnaire.
1
[
1

---

-
TABLEAU N°l
-
INFLUENCE DE L'ASEPTIE SUR LE POUVOIR GERMINATIF
GERMINATION
1° Semaine
2° Semaine
3° Semaine
4° Semaine
% Infection
~vec aseptie
o %
7 %
22 %
35 %
52 %
fil
tll
:::l"tl
~ QI
.,.1
tll
Po<f-! Sans aseptie
5 %
20,7 %
62 %
-
.c=-
o-
tll
"tl
.,.1
Avec aseptie
71 %
88 %
-
-
o %
bO
.,.1
tll
~"tl
al
fil
tll
:::lf-!
~
.,.1
>< Sans aseptie
50 %
62,5 %
87,5 %
-
Po<

---

42
I.C - CULTURE DES EXPLANTS
MILIEUX DE BASE
Les quatre milieux utilisés sont : Margara
(N30K
modifié), Quoirin-Lepoivre, Murashige-Skoog, et Wolter-Skoog
(tableau nO
).
- ~E§~~ (N30K modifié) :
C'est le milieu mis au point par Margara pour la
multiplication végétative de la betterave
(Beta vulgaris)
en 1977. La dénomination N30K indique la composition en azote
qui est de 30 m.e.g/l et celle du potassium qui est de
15 m.e.g/l.
- MURASHIGE-SKOOG :
---------------
Il a été mis au point en 1962 pour la culture de
cals de tabac. C'est un milieu très concentré en ions NH4+
et N03- ainsi qu'en K+. Il semble que sa teneur en ions dé-
passe l'optimum. C'est ce qui explique qu'il soit souvent
utilisé dilué de moitié.
Le souci d'adapter plus étroitement la composition
de la solution minérale de base au genre Prunus, a poussé

---

------------------------------------------------
'mBLmU
2 - CDMPOSITION DE DIVERSES EOLUITONS MINERALES
Macro-éléments
MARCARA
Qu)IRIN
MURASUJGE
W:::>LTER
WffiGARA
QOOIRIN
MURASLUGE
l'l>LTER
LEI?OIVRE
SK()(X;
SKCX:X:;
LEPOIVRE
SKCX:X:;
SKCX)G
rrg/l
ng/l
m::r/l
rrg/l
rrM
mM
mM
l'lftI
NH
N0
4
480
400
1650
3
50
5,6
5,0
20,6
0,6
m0
1515
1800
1900
170
15
17,8
18,8
3
1,68
KH
P0
-
2
4
2700
170
-
-
19 8
1,2
-
L
I<cl
-
-
-
140
-
-
-
1,8
Ca (ID3)2 4~0
354
200
-
425
1,2
0,85
-
2,6
ca cl
-
-
440
-
-
-
2
3,0
-
ca (H2PO (2, H20
126
-
-
-
0,5
-
-
-
Mg 50 ,7H O
246,3
3600
370
764
1
14,6
1,5
3,1
4
2
-
-
~
Na H2 P04 ~O
-
-
-
35
-
-
-
0,22
,
w
Na
00
10 H 0
-
-
-
425
-
-
-
2
4
3,0
,
2
Micro-élâtents
Na
EOrA
37,30
37,30
37,30
7,45
100
100
100
2
100
FeOO4, 7 ~ 0
27,80
27,80
27,80
27,80
100
100
100
100
Nicl ,6 H 0
-
-
-
-
-
-
-
-
2
2
Cocl2,6 ~. 0
0,025
0,025
0,025
-
0,1
0,1
0,1
-
Al cl
-
-
-
-
-
-
-
-
3
CuS04,5 ~ 0
0,025
0,025
0,025
-
0,1
0,1
0,1
-
NatD4,2 H2 0
0,25
0,25
0,25
-
1,0
1,0
1,0
-
K l
0,83
0,83
0,83
1,6
5
5
5
9,6
Zn 50 ,7 H 0
8,6
8,6
8,6
3,2
30
30
30
13
4
2
Mn oo4,H2 0
22,3
22,3
22,3
9
100
100
100
41
H
6,2
6,2
6,2
3,2
100
100
100
52
3 OO3
-
--

---

45
Quoirin et Lepoivre, en 1977, à mettre au point un milieu
minéral différent de celui de Murashige-Skoog. Ce milieu
contient notamment moins d'azote, plus de potassium, de
magnésium et de phosphate.
- WOLTER-SKOOG :
C'est le milieu utilisé par Hyun et al (1982)
pour induire un bourgeonnement adventif sur cotyledons de
Pinus _rigida x taeda. Ces auteurs, ayant obtenu sur ce mi-
lieu un taux de bourgeonnement optimum, nous avons voulu le
tester pour l'induction du bourgeonnement axillaire chez la
même espèce.
Les micro-éléments de Murashige-Skoog ont été
utilisés pour les solutions de Margara, Murashige-Skoog,
Quoirin-Lepoivre.
Les vitamines, Myo-inositol, Thiamine et Pyrido-
xine sont incorporées au milieu de culture avant auto-clavage
et associéesau sucre et aux substances de croissance (Tab. 4).
- SUCRE
Le saccharose est utilisé comme source de carbone
et d'énergie. Différentes concentrations ont été testées sur
l'intensité du bourgeonnement axillaire.

---

TABLEAU N°
4
-
COMPOSITION DESDIVËRSES SOLUT:fON!>
-
....
-
-
-
-
NUTRITIVES EN ADDITIFS ORGANIQUES
Eléments
mg/l
).IM/l
Pyridoxine
0,4
1,96
Thiamine
0,4
1,2
Myo-inositol
100
500
ANA
0,0036
0,018
0,036
0,072
0,01
0,05
0,1
0,2
BAP
2,25
4,5
Il,25
22,5
10
20
50
100
l:.
0\\
Saccharose
20.10 3
30.10 3
40.10 3
50.10 3
Gelose
80.10 3

---

47
-
SUBSTANCES DE CROISSANCE ET DUREE D'APPLICATION
La Benzyladénine
(BA)
et l'acide naphtalène-acétique
(ANA)
sont incorporés au milieu de culture avant stérilisation.
Différents rapports BA/ANA sont étudiés pour déterminer leur
influence sur la capacité organogène des explantats. Les du-
rées d'induction varient de 3 à 21 jours.
- MILIEUX DE BASE
Les différents milieux utilisés en induction sont
additionnés de charbon actif
(2 %). Ce dernier est stérilisé
indépendamment des autres éléments. Le mélange réalisé sous
hotte à flux laminaire, est réparti dans des tubes puis re-
froidi brutalement dans de la glace afin d'éviter la sédi-
mentation du charbon actif.
La concentration en sucre est ramenée à 20 g/l.
Pour déterminer les conditions optimales d'allongement des
bourgeons acillaires, on a testé l'influence des divers
milieux de base cités précédemment et de leur dilution.
- SUBSTANCES DE CROISSANCE
Nous avons étudié l'effet de l'action combinée
du charbon actif
(stimulateur de l'élongation) et de la BA
(favorable à l'organisation des meristèmes axillaires).

---

48
- MILIEUX DE BASE
Deux milieux ont été utilisés
(tableau nO 5).
- Le milieu Risser-White
(1964) modif1~ par Sommer et
al
(1975)
dont la concentration ionique totale est plus fai-
ble que celle des milieux favorables à l'induction du bour-
geonnement axillaire.
- Le milieu Margara dilué de moitié.
-
SUBSTANCES DE CROISSANCE
L'ANA additionné ou non à la BA, a été appliquée
à des concentrations
(tableau nO 6)
et des durées variables
de 5 à 45 jours pour induire une rhizogénèse adventive.
Le développement et l'élongation des méristèmes
racinaires s'effectuent sur un milieu dépourvu de substances
de croissance.
I.D - CONDITIONS PHYSIQUES
- Induction du bourgeonnement axillaire: cette pre-
mière phase s'effectue dans une enceinte climatisée à lumière
continue (4000 lux)
et à température constante
(30°C).

---

49
TABLEAU N° 5 - COMPOSITION DU MILIEU D1ENRACINEMENT
(Macro-êlêments)
ELEMENTS
R-W
MARGARA/2
Macro-êléments
mg/l
mM/l
mg/l
mM/l
NH
N0
-
-
4
3
240
2,8
KN03
80
0,8
757,5
7,5
Ca Cl2
-
-
-
-
Mg S04,7 H20
740
3
123,15
0,5
Ca (N03)2,4 H 0
300
1,3
2
177
0,6
K cl
65
0,9
-
-
Na H
P0 ,H O
165
1,4
-
2
4
2
-
Na
O
450
1,4
-
2 S04 10,H2
-
Ca (H 2 P04 )2,H2O
-
-
63
0,25
COMPOSITION IONIQUE ( mM)
IONS
R-W
MARGARA/2
°
2,8
3,4
Il,8
1,7
7,5
3
0,5
1,3
1
0,9
4,5
0,5
0,5
[cl Totale ionique 16,2
24,6

---

TABLEAU N° 6 -
COMPOSITION ORGANIQUE ET HORMONALE DES DIVERSES SOLUTIONS
NUTRITIVES UTILISEES POUR L'ENRACINEMENT EN ADDITIFS ORGANIQUES
ELEMENTS
R-W
MARGARA /2
mg/1
)lM/1
mg/1
)lM/1
Ac.nicotinique
1
8
1
8
Pyridoxine
1
4,9
1
4,9
Thiamine
1
3
1
3
G1utamine
146
1000
146
1000
Myo-inosito1
10
50
10
50
Sucre
10
29,5
10
29,5
\\J1
o
~gar
8.10 3
8.10 3
/ANA
0,2
0,55
0,1
0,2
0,3
0,27
0,55
0,83
BAP
0
0
0,01
-
0,01
4.10- 8
4.10- 8

---

51
- Elongation de la pousse feuillée:
elle est réalisée
en salle de culture, en présence d'une photopériode de 16 h
suivie de 8 h d'obscurité. Deux thermopériodes ont été utili-
sées
25°C ou 30°C pendant la phase lumineuse et 20°C ou
25°C pendant la phase obscure.
- Enracinement:
les pousses à enraciner sont soumises
à une photopériode de 16 h et 8 h d'obscurité correspondant
respectivement à 25°C et 20°C.
II) EXPRESSION DES RESULTATS
Ils sont exprimés sous forme de tableaux, histo-
grammes et courbes représentant :
-
les pourcentages d'explants réactivés.
-
le nombe moyen de bourgeons ou de racines par
explantat.
-
la longueur moyenne des pousses et des bourgeons.
A chaque valeur moyenne seront associées les valeurs
extrêmes
(minima et naxima) et les écarts types.

---

52
RESULTATS EXPERIMENTAUX
-----------------------
Nos travaux sont regroupés sous la forme de trois
chapitres concernant successivement :
· L'organisation des bourgeons axillaires
· La formation des pousses feuillées
· La rhizogénèse.
Ces recherches ont été effectuées essentiellement
avec le P.rigida x taeda.
Cependant, des résultats ayant
été obtenus dans les deux premiers thèmes avec le P.
taeda,
ils seront présentés dans les chapitres correspondants.

---

53
CHAPITRE I
- ORGANISATION DES BOURGEONS AXILLAIRES
CHEZ P.rigida x taeda
Un grand nombre d'observations tendent à montrer
que les organes jeunes en début de croissance ont une apti-
tude plus grande au bourgeonnement "in vitro". Les travaux
effectués sur le pin maritime ont montré que c'est à la base
des cotyledons âgés de 3 semaines à 1 mois que l'aptitude
call10gène est la plus élevée.
Dans ce chapitre, nous essaierons de définir la
ou les conditions optimales de caulogénèse, aboutissant à la
formation d'une quantité maximale de bourgeons axillaires.
Nous avons traité différents points :
· influence de la durée d'action du complexe hormo-
nal combinée avec différents milieux
(solutions
minérales) •
• influence de la concentration du complexe hormonal.
• influence de la nutrition carbonée
• influence du stade de développement de l'explantat
primaire.
Tous les résultats sont exprimés en termes de pour-
centages d'explantats ayant réagi ainsi que d'intensité du
bourgonnement.

---

54
Ex.pe.aJ}:ta.t pJtimabte. ptr.é!e.vé. 21 j oWû>
ap'tè6 .ta geltmi..YllLttol1 a..6eptique
(le. :tIl.ait de JtepèJl.e me6LVz.e. 2 cml

---

5<1
Expe.aJl-ta.t pJttnla..Ute pftéievé 21 jouM
apftèJ.l ia gewn.a.tion ev.,epti..que
lie :tAa-U de ftepèfte me!.>Hlte 2 c.m)

---

55
A -
INFLUENCE DU STADE DE DEVELOPPEMENT
DE L'EXPLANTAT SUR LA REPONSE CAULOGENE
Dans une expérience préliminaire nous avons cons-
taté que si les germinations sur lesquelles étaient préle-
vés les explantats étaient trop peu développées (importance
de la pousse épicotylée) les traitement inducteurs de la
caulogénèse entraînaient des malformations et une réponse
anarchique. Ceci pourrait traduire une hypersensibilité
vis-à-vis des inductions habituellement utilisées. Nous
avons alors recherché le stade de différenciation de l'ex-
plantat qui permette une meilleure réactivité dans le cadre
d'une reproduction conforme des genotypes utilisés.
Ainsi, nous avons été amenés à étudier l'influence
de la taille de l'explantat primaire (touffe épicotylaire)
sur l'induction du bourgeonnement axillaire.
Nous avons distingué 3 types d'explantats
- explantats dont la longueur moyenne est de 0,3 cm
- explantats dont la longueur moyenne est de 0,7 cm.
- apex de germination ayant subi une pré-culture
d'une durée de 15 jours sur un milieu contenant
du charbon actif ( 2 %) et dépourvu de substan-
ces hormonales. Au moment où les explantats ont
été soumis au traitement inducteur, leur taille
était de 1,5 cm en moyenne.

---

56
Les explantats sont soumis à une induction caulo-
-5
-8
gène (BA
2.10
M, ANA : 5.10
M) sur le milieu Quoirin-Le-
poivre pendant 8 jours.
Chaque condition est représentée par une série de"
12 explantats. Les résultats sont déterminés au bout de 3 mois
de culture sur milieu d'allongement (tableau nO 7
).
Nous constatons que le nombre de bourgeons produits
augmente
dès que la taille de la tige épicotylée dépasse
0,5 cm. Pour des explantats de 0,3 cm de longueur, le nombre
moyen de bourgeons formés par explantats est de 10,6 ; pour
des explantats de taille supérieure le nombre moyen de bour-
geons est de 16,4.
TABLEAU N° 7 - INFLUENCE DU STADE DE DEVELOPPEMENT DE L'EX-
PLANTAT SUR LA FORMATION DE BOURGEONS AXILLAI-
RES.
(Résultats enregistrés après 3 mois de
culture)
lDngueur noyenne
de l' explantat
0,3 an
0,7 an
1,5 an
caractères
observés
% bourgeormement
100
100
100
Nb.de bourgeons
5 -
10,6 - 20
6 - 16,4 - 36
12 - 16,4 - 34
- -
IDngueur des
2,75 ±
1,23
3,11
± 1,17
2,15
± 0,78
lx>urgeons (an)

---

57
Sur les apex de germination n'ayant pas subi une
pré-culture, les bourgeons se développeent individuellement
en pousses feuillées à partir de l'aisselle des cotyledons.
Par contre, sur les explantats ayant subi une
pré-culture, les pousses axillaires sont de petite taille
très souvent agglutinées les unes contre les autres, et
présentent de nombreuses ramifications secondaires. De plus,
à l'aisselle des euphylles, sur toute la longueur de la tige
principale, apparaissent des brachyblastes.
Ainsi l'allongement de la tige avant le traitement
inducteur, a eu pour effet d'augmenter le nombre de sites
méristématiques sur la pousse principale. La stimulation de
ces méristèmes se traduit par le développement d'un très
grand nombre de bourgeons axillaires qui, sans doute, par
un effet de masse, ont une croissance plus faible.
Donc, par rapport à des explantats dont la longueur
moyenne de la pousse apicale est de 0,7 cm, la pré-culture
ne présente pas d'avantages. Ainsi, une longueur totale de
l'explantat comprise entre 0,5 cm et 1 cm correspond au
stade optimal de dévelopepemnt de l'explantat permettant une
multiplication efficace du génotype de départ.

---

58
B -
INFLUENCE DU TEMPS D'INDUCTION
ET DU MILIEU DE BASE
Nous avons utilisé des milieux de composition miné-
rale et organique déjà connue et testée pour d'autres espèces
de gymnospermes et d'angiospermes. Ces milieux sont aussi dif-
férents que possible les uns des autres, ce qui nous permet de
mieux apprécier les différences dans les réponses organogènes.
Cependant, i l faut noter que ces milieux ne diffè-
rent que par leur composition minérale, les vitamines, le
sucre et la gelose étant maintenus constants.
Dans cette expérience les concpntrations en BAP et
-5
-8
ANA sont respectivement de 2.10
M et 5.10
M.
Au bout d'une période d'induction de 3, 8,
15 et
21 jours, les explantats sont repiqués sur le milieu précédent
additionné de charbon actif
(2 %) et dépourvu d'auxine. Ce
substrat permettra l'allongement des bourgeons formés.
Au bout d'un mois de culture dans ces conditions, les
bourgeons sont bien visibles, mais l'estimation de leur nombre
est encore difficile, ce qui rend impossible, à ce stade, l'ap-
préciation de l'effet du milieu de culture.

---

59
La décapitation, supprimant l'effet de la dominance
apicale, permet un bon développement des bourgeons axillaires.
Un mois après cette opération, les bourgeons sont
suffisamment allongés pour être isolés et comptés. Les résul~
tats sont ainsi enregistrés 2 mois après les traitements d'in-
duction.
Le schéma que nous avons adopté est indiqué dans
le tableau 8.
Tableau 8 - Protocole expérimental
(BA
5.10 -8M)
Milieu
Murashige
WOlter
Minéral
Quoirin
Margara
Skoog
Skoog
Durées
Lepoivre
d'induc-
tion
3 jours
12 expl.
12 expl.
12 expl.
12 expl.
8 jours
Il
Il
Il
Il
15 jours
Il
Il
Il
Il
21 jours
Il
Il
"
"

---

60
Un essai préliminaire avec une induction de 30 jours
ayant entrainé un blocage de la totalité des bourgeons formés,
nous avons jugé que cette période constituait la limite supé-
rieure du traitement.
Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau
9 et la figure 1.
"B-l
~Ilfh~~I.!s.~_<!~_!.é!_<!~lZ.~~_<!~ ê!s.t.!.<2.Il_<!\\!_~Q.ITI.J2.lfê..}ffê..
hormonal.
--------
Nous étudierons l'influence des différentes durées
5
a
d'action du complexe BA 2.10- M - ANA 5.10- M en fonction de
la composition du milieu de base.
-
Sur Quoirin - Lepoivre : dans tous les cas, 3 jours, a jours,
15 jours et 21
jours, on obtient toujours 100 % de taux de
bourgeonnement. L'optimum du nombre moyen de bourgeons par
explantat est obtenu après 3 jours d'induction
(14). La cau-
logénèse est très importante et généralement les bourgeons
axillaires se développent
simultanément avec la pousse
principale.
-
Sur Margara : après 3 jours d'induction, seuls 50 % des ex-
plantats réagissent. Cependant, le pourcentage d'explantats
répondant positivement croît avec l'augmentation de la durée
d'application du complexe hormonal. Par contre, au niveau du
nombre de bourgeons formés par explantat, la moyenne varie
autour de 5 bourgeons mais elle n'est pas influencée par la
durée d'action de la BA et de l'ANA.

---

61
NOMBRE DE BOURGEONS PRODUITS PAR EXPLANTAT SUIVANT
LE TYPE DE MILIEU UTILISE ET LA DUREE D'INDUCTION
Tableau nO 9
%
%
%
Nanbre de
Total de
Induction
d'expIant
lx>urgeons/
lx>urgeons
Infectés
Nécros
5
étant le
explantats
produits
BA :
2.10- M
siège d' 1
ANA:
5.10- 8M
OOurgeont
3 j
0
0
100
5 - 14 - 37
124
8j
-
-
100
1 - 6,5 - 9
39
J
Quoirin
15 j
-
-
100
3 - 7,2 -18
36
Lep:>ivre
21 j
-
-
100
2 - 3,5 - 6
21
3 j
8
0
50
o - 4,8 -10
44
8 j
-
-
67
1 - 5,6 -12
28
Margara
15 j
-
-
100
1 - 2,8 - 6
14
-
21 j
8
-
100
4 - 5,2 - 7
26
-
3 j
0
33 %
17
o - 4,5 -13
32
Murash4e
8 j
-
-
100
1 - 2,7 - 4
16
-
Skoog
15 j
-
-
100
1 - 2,2 - 5
13
-
21 j
-
-
100
2 - 4
- 9
24
-
3 j
0
0
~
0-1
- 8
11
-
8 j
8
0
8
o - 0,90- 4
8
\\'bIter
Skoog
15 j
0
0
25
o - 1,2 - 2
12
-
21 j
0
0
58
0-2
- 5
20
-

---

62
- Muraffidge -
Skoog : Après 3 jours d'induction, nous n'obte-
nons que 17 % de réactivité. A partir de 8 jours, le taux
de bourgeonnement atteint 100 %. Le nombre moyen de bour-
geons varie de 2
à 4,
en fonction de la durée du traite-
ment.
- Wolter -
Skoog : le taux de bourgeonnement augmente sensi-
blement avec l'augmentation de la durée d'action du complexe
hormonal.
Il est de 0 % à 3 jours, i l croit régulièrement
jusqu'à 58 % pour 21 jours d'induction. Cependant, le nombre
moyen de bourgeons demeure très faible quelle que soit la
durée d'action(l bourgeon axillaire/explantat) .
L'analyse globale de ces résultats nous permet de
noter que
s u r I e milieu Quoirin - Lepoivre, une induc-
tion de 3 jours suffit pour stimuler la formation et pour dé-
clencher le processus de développement des bourgeons axillaires.
Lorsque cette durée augmente, on assiste à une diminution du
nombre de bourgeons élaborés par l'explantat.
Par contre,
sur le milieu Wolter -
Skoog, les explants
réagissent plus difficilement et plus lentement, car pour que
58 % des explants produisent
en moyenne
1 bourgeon/expIant,
i l est nécessaire d'appliquer le traitement inducteur pendant
un miminum de 21 jours.

---

63
Pour ce qui est des milieux Margara et Murashige et
Skoog, nous n'avons pas observé ce type de relation évolutive
avec le temps.
Il semble que la durée d'induction ne soit pas déter-
mina~te dans l'intensité de la réponse caulogène
En effet, que cela soit à 3 jours ou à 21 jours
d'induction, on observe les mêmes moyennes de bourgeons produits
par explantats, ceci bien que les pourcentages soient totalement
différents.
La conclusion que nous avons tirée de cette expérimen-
tation, est qu'il existe une étroite relation entre la durée
d'action et le milieu de base pour une concentration hormonale
définie. Bn fait,
si on doit établir un classement des diverses
durées d'induction,
l'idéal serait qu'elle soit la plus courte
possible. Mais ce sera seulement au vu des résultats sur la
comparaison des milieux de base et des concentrations du com-
plexe hormonal qu'on pourra établir un classement efficace.
La composition des quatre milieux de base est définie
dans le chapitre Matériels et Méthodes.

---

64
... -.. .
..
. ..
.
. .
"~.,
5-
~
S
•
lII • • '
•
•
•••.• ,
j
- ......."T"T'I'~mn
~
'-
C"-
.....

---

65
L'observation du tableau 9 et de la figure 1 montre
que
-
le milieu défini par Quoirin - Lepoivre donne
les meilleurs résultats. Pour cette condition, un
optimum de 14 bourgeons par explantat est obtenu
et dans le meilleur des cas un maximum de 37 bour-
geons.
Très souvent ils se développent simultanément et
ont un très bel aspect. La dominance apicale n'est
pas marquée.
- Le milieu Margara donne d'assez bons résultats
avec une moyenne de 5,6 bourgeons et un maximum de
12 bourgeons. Sur ce milieu, la dominance apicale
est très apparente. Les bourgeons sont souvent
inhibés et après ablation de l'apex principal, un
ou deux bourgeons prennent le relais au détriment
des autres bourgeons axillaires.

---

66
- Sur Murashige - Skoog, l'optimum est d~ 4,6 bour-
geons/explantat, avec un maximum de 13 bourgeons.
Cependant, il faut souligner que les explantats
sont très souvent nécrosés, jaunâtres et les
euphylles vrillées et très épaisses révèlent un
effet défavorable du milieu de base.
- Le milieu défini par Wolter - Skoog et utilisé
pour le bourgeonnement adventif de Pin~B rigida
x taeda par Ryun, ne donne pas de bons résultats.
La moyenne du nombre de bourgeons par cxplantat
est voisine de 1. De plus, les explants montrent
des signes de carence minérale. La présence de
tâches rouges sur l'épicotyle, le faible dévelop-
pement des e-phylles et l'aspect rabougri des
pousses, en sont les témoins. Sur certains explants
les bourgeons formés se nécrosent au bout de 3 se-
maines.
Le classement que nous pouvons effectuer à l'issue de
cette expérience, est celui qui place en tête le milieu Q-L
suivi de celui de Margara puis M-S enfin le milieu W-S.
Puisque nous avons utilisé des milieux qui diffèrent
autant par leur composition minérale que par leur concentration
ionique totale, nous avons essayé d'analyser ces résultats en
portant notre attention sur la comparaison des
[g ioniques to-

---

67
l
.
.
K+
2+
-
+
N + /
-
(
l
ta es malS aussl en
, Mg
, N0 , NH
et
H
N0
tab eau
3
4
4
3
9)
éléments qui jouent un rôle fondamental dans le métabolisme
cellulaire.
Nous constatons que le milieu Q-L est très riche en
potassium Magnésium et nitrate et par contre peu concentré en
ion Ammonium. Or on connait le rôle principal joué par les
ions K+ dans la synthèse des protéines ou dans la photosynthèse.
Selon certains auteurs l'ion K+ interviendrait dans les méca-
nismes de la perméabilité membrannaire en acidifiant les parois
(pompe K+ /H+) .11 pourrait ainsi augmenter leur plasticité,
créant des conditions favorables à l'accroissement en volume
de la cellule.
De plus, les mitoses exigent du K+ pour Je dé~ouler
normalement. Le magnésium occupe une grande place puisqu'il
intervient dans les réactions enzymatiques.

---

68
Tableau 10 -
Concentrations ioniques de guelques éléments
minéraux majeurs.
IONS
MARGARA
Q-L
M-S
W-S
K+
15
37,6
20
3,5
2+
Mg
1
14,6
1,5
3,1
-
N 03
23,6
23,6
39,4
7,48
NH~
5,6
5
20,6
0,6
NH~/ N03
0,23
0,21
1,9
0,08
ionique
[cJ Totale
49,2
120,1
92
28,4

---

69
Bien que n'ayant effectué aucune étude systématique
sur l'influence de tel ou tel ion sur la réponse organogène
des explantats, nous pouvons penser que la présence du K+ et
2
du Mg + en quantité importante dans la solution Q-L pourrait
être le facteur déterminant dans la caulogénèse optimale ob-
servée avec cette solution.
De nombreux auteurs ont montré sur certaines
espèces qùe la concentration en K+ est directement corré-
lée avec le niveau d'activitp. des tissus. Nous avons donc
pensé que une forte èose de K+ appliquée au niveau des zones à
forte activité mitolique (par exemple au niveau des méris-
tèmes axillaires) pourrait agir en synergie avec la cytoki-
nine exogène fournie par le milieu de base et déclencherait
ainsi un processus de multiplication intense.
Le milieu Margara est moins riche que le milieu Q-L en
+
1.'1
1
2+
NH+
1
K,
est p us pauvre en Mg
et en
4 ' par contre i
contient beaucoup de nitrate. C'est un milieu qui nous semble
globalement assez équilibré et qui permettrait un bon déve-
loppement de la plantule.
Si on observe le milieu défini par Murashige-Skoog,
on remarque que c'est un milieu fortement azoté avec des te-
neurs élevées en ions N03- et NH4+. Or on connait l'influence
d'un excès d'ion NH: particulièrement néfaste sur la caulogé-
nèse. Nous pensons que la fréquence élevée de nécroses des

---

70
explants ainsi que l'aspect vrillé et le jaunissement des
euphylles pourrait être attribué à la teneur excessive dans
le milieu de culture en cet ion.
Le milieu Wolter-Skoog est quantitativement très
pauvre en éléments minéraux. Il semble que cela soit la rai-
son pour laquelle un très faible nombre de bourgeons a été
obtenu et que bon nombre d'entre eux se soient nécrosés par
la suite.
CONCLUSION
De cette expérience, nous déduisons deux types de
réponse des explantats vis-à-vis des solutions minérales et
des durées d'induction.
-
une réponse de saturation : une très faible durée
d'induction sur un milieu très riche en K et en Mg
suffit à déclencher le processus d'organogénèse.
Pour des durées d'induction plus longues, le nombre
de bourgeons décroit progressivement (Q-L).
- une réponse d'accumulation: sur un milieu globa-
lement très pauvre en éléments minéraux,
la durée
d'induction nécessaire pour l'initiation des bour-
geons s'allonge, mais la réponse demeure limitée en
intensité
(W-S). Une teneur excessive en azote est
néfaste
(M-S).

---

71
A partir de ces constatations, nous sommes en droit
de nous demander si les explants réagissent de façon qualita-
tive (c'est-à-dire en fonction de la présence d'une quantité
seuil d'ions spécifiques) ou bien de façon quantitative rela-
tive à la concentration ionique globale.
nous pensons d'une part que la présence d'ions K+
en grande quantité dans le milieu, interviendrait
au niveau des mécanismes de perméabilité mernbra-
naire pour faciliter l'accès de la cytokinine
exogène au métabolisme cellulaire.
-
d'autre part, la formation des méristèmes cauli-
naires nécessite une stimulation importante du
métabolisme de l'explantat. Il aurait par consé-
quent besoin d'une quantité élevée de substances
minérales.

---

72
C -
INFLUENCE DE LA CONCENTRATION
DU COMPLEXE HORMONAL
Nous avons essayé de définir les concentrations opti-
males de cytokinine et d'auxine pour le bourgeonnement axillaire.
Les équilibres BA/ANA ont été appliqués pendant 3 cm, 8 jours.
Leu~s
5
8
valeurs étaient les suivantes: 10- /10-
-
2.10- 5/5.10- 8 .
5
5.10- /10- 7
et 10- 4/2.10- 7
BAP
10- 5
2.10- 5
5.10- 5
10- 4
(M)
ANA
10-8
8
5.10-
10 -"7
2.10- 7
3 jours
12 expl.
12 expl.
12 expl.
12 expl.
8 jours
"
"
"
"
Les résultats ont été consignés dans le tableau Il.
-
3 jours d'induction:
On observe une tendance assez régulière à une augmen-
tation du pourcentage d'explants ayant réagi lorsque l'équilibre
hormonal augmente :
-5
-8
- BAP/ANA = 10
/10
: le pourcentage total d'ex-
plants ayant donné naissance à des bourgeons est
très faible
(33 %). Seulement 16 % de ces bourgeons
s'allongent normalement. Mais la PQusse apicale
s'allonge de façon remarquable.

---

~
Traitement
Nombre
tl:l
% total de
% de bour-
% de bour-
Nombre
Coefficient
t"1
Inducteur
d'explants
bourgeons
geons en
gegns blo-
de bourgeons
de variation
tt:l
>
axillaires
allongement
ques
axillaires
( % )
c
par explantat
z0
~
~
BA
10- 5 M
12
33
16
0
1 -
3,25- 8
55
1
ANA
10-8 M
t"1 H
0
Z
G) '""J
tt:l t"1
2.10- 5 M
Z C
12
58
42
0
3 --
7,2 -16
47
tt:l tt:l
8
Z
5.10-
M
-
.
()
3J
tt:l
0
-5
î
tt:l
.5.10
M
12
83
42
25
1 -
/4,9 -
9
50
5;:
10- 7 M
0
-...J
W
0
rn
10- 4 M
tt:l
12
100
50
25
1 -
9,2 -35
100
7
::r::
2.10-
M
0
~
0
10- 5 M
z
12
75
67
0
1 -
6,8 -15
61
>
10- 8 M
t"1
tt:l
5
rn
2.10-
M
c
::u
12
67
42
0
o -
5,82-15
100
5.10- 8 M
5;:
8J
5
5.10-
M
~
10- 7 M
12
100
42
58
4 -
10,42-23
61
>t1
0
Z
4
10-
M
rn
tt:l
12
2.10- 7M
100
0
100
1 -
10,5 -14
75
()
>
c
Il

---

•
- 74
1
r
-5
-8
- BAP/ANA = 2.10
15.10
:
le taux de bourgeonne-
ment augmente (58 %) ainsi que celui des bour-
r
geons allongés (42 %). La pousse apicale se déve-
loppe de façon satisfaisante.
On note que dans ces deux premières conditiohs, au-
cun bourgeon ne semble bl?qué.
-5
-7
-4
-7
- BAP IANA = 5.10
110
et 10
12.10
, on observe
un accroissement du taux de bourgeonnement qui
atteint 100 % alors que corrélativement, l~ nombre
de bourgeons bloqués augmente.
Le nombre moyen de bourgeons obtenus est très impor-
tant, mais ces bourgeons s'allongent très difficilement et,
dans de nombreux cas, restent inhibés au cours des 45 premiers
jours sur milieu d'allongement. Par la suite, ils se dévelop-
pent très faiblement.
L'évolution
du
nombre
de
bourgeons· par explan-
tat
présente
une allure ascendante avec l'augmentation de la
dose hormonale. Mais il faut cependant remarquer la forte hété-
rogénéité des résultats, les explants, genotypiquement très dif-
férents, réagissent toujours de façon variée.

---

75
-
8 jours d'induction
Le taux de bourgeonnement est plus élevé, i l varie
de 70 à 100 %. De plus, le nombre de bourgeons produits est
plus important.
-5
-8
-
10
/10
: 75 % des explantats ont réagi dont 67 %
présentent de beaux bourgeons t~8S bien allongés.
-5
-8
é
.
-
2.10
/5.10
: 67 % ont r ag1, le taux de bour-
geons en allongement est de 42 %. Dans ce cas, si
les explants ne bourgeonnent pas intensément, on
constate en contrepartie un bon développement de
l'apex principal et des bourgeons axillaires.
-5
-7
-
5.10
/10
: le taux de bourgeonnement atteint
100 % alors que celui des bourg~ons bloqués est
de 53 %.
10 -4/ 2 . 10-7 : tous les explante sont induits mais
tous demeurent bloqués. Sur certains, des néofor-
mations de type adventives sur les enphylles et
sur la tige sont observées.
Mais, ces explantats inhibés, lorsqu'ils sont trans-
plantés sur un milieu neuf, vont progressiv~ment reprendre leur
développement.

---

76
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-
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0.
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k-

---

77
C'est seulement après 3 mois de culture sur un milieu
contenant du charbon que les bourgeons axillaires et adventifs
commencent â se développer. Dans ce cas,
leur nombre est très
important.
En observant les histogrammes représentées sur la
Figure 2, on constate une analogie dans les réponses à 3 jours
et à 8 jours. Tout se passe comme si les valeurs obtenues sont
la résultante d'un effet multiplicatif entre la concentration
hormonale et la durée.
Par exemple, une concentration de 10-SM appliquée
pendant 8 jours
(8 unités)
donne les mêmes résultats qu'une dose
S
de 2.10- M appliquée pendant 3 jours
(6 unités).
-S
De même, on peut rapprocher 5.10
pendant 3 jours
5
(15 unités)
et 2.10- M pendant 8 jours
(16 unités)
-4
De même pour 10
M pendant 3 jours
(30 unités) et
5
5.10-
pendant 8 jours
(40 unités).
Ainsi,
les explantats paraissent sensibles un effet
dose.

---

78
OOSE HORMONALE ET INTENSlTE VE LA REPC~4Sr.
CAUlOGfNESE
APRES 35 JOURS VE CULTURE
-5
BA : 70
n
8
ANA: 10-
AI
.6U!l. Q- L pe.ndant 8 jOll.!l.lJ
Su<

---

79
CONCLUSION
D'après les résultats de cette expérience, on a pu
dissocier deux groupes, représentant
deux types de comporte-
ment vis-à-vis de la BA :
-
le 1er groupe est celui où la teneur en BA varie
-5
-5
de 10
à 2.10
M : les explantats réagissent
faiblement à la stimulation mais les bourgeons
formés s'allongent rapidement pour donner de
belles pousses.
-
le second groupe: les teneurs de 5.10- 5 à
-4
10
M donc très fortes : 100 % des explantats
réagissent mais la plupart demeurent bloqués.
La levée de l'inhibition se fait de façon très
tardive.
Mais cette expérience, destinée à définir la valeur
optimale de la balance hormonale pour l'espêce PinuB rigida
x taeda, ne nous satisfait pas totalement. En effet, pour des
objectifs d'un programme de micro-propagation, i l est néces-
saire d'allier une rapidité de réponse à une intensité optima-
le du bourgeonnement. Nous espérons que des travaux ultérieurs
vont permettre de définir les conditions adéquates permettant
à la fois une caulogénèse intense ainsi qu'un rapide et bon
développement des bourgeons.

---

-5
BA
2.10
Id
.6 U!l.. Q.. L
-8
ANA
5. 10
1\\
pe.ndan.t :t/l..ofA j 0 U!l...6

---

80
D -
INFLUENCE DU SACCHAROSE SUR L'INDUCTION
Nous avons testê avec le milieu optimal d'induc-
S
tion du bourgeonnement axillaire (Q-L
BA 2.10- M et ANA
8
S.10- M) l'influence de diverses quantitês de saccharose
pendant· 8 jours sur l'intensité du bourgeonnement : nous
avons utilisê les doses suivantes : 20 g/l : 30 g/l :
40 g/l : 50 g/l.
Les explantats sont par la suite transplantés
sur le même milieu de base contenant de la BA (2.10- 5M),
du charbon actif ( 2 %) et une quantité de sucre unique
20 g/l.
Les résultats de cette expêrience sont consignês
sur le tableau n012.
TABLEAU N°12 -
INFLUENCE DE LA CONCENTRATION DE SUCRE SUR
LA CAULOGENESE.
Sucre
Nanbre
de
IDngueur noyenne
des l:x:>urgeons
g/l
l:x:>urgeons
(an)
20
3
-
9,6
- 18
1,84
±
0,44
30
1 -
8,3
- 17
2,1
±
0,66
40
4
- 9,9 - 14
2,25
±
0,80
50
3
- 10,3 - 21
2,55
±
1,01

---

> 1
81"
D'après ces résultats, il n'apparait pas de dif-
férence significative dans le nombre moyen de bourgeons pro-
duits par explantat pour les quatre concentrations concer-
nées. Par contre, dans l'allongement des bourgeons formés,
on note une augmentation quand la teneur en sucre du milieu
d'induction s'accroit.
A partir de ces constatations, nous pouvons dire
que le saccharose utilisé essentiellement comme source
d'énergie, n'intervient pas dans le processus d'organogênèse
2
qui demeure principalement sous contrOle ionique (K+,Mg +)
et hormonal (BAP).
Par contre, une augmentation de la teneur en sucre
du milieu permettra un
meilleur fonctionnement des pousses
méristèmes se traduisant par la croissance de la pousse
feuillée.

---

FORMATION DE BOURGEONS AXILLAIRES CHEZ P. TAEDA
Nous inspirant des résultats obtenus avec l'hybride
rigida x
taeda, nous avons étudié la réponse d'explantats de
P.
taeda à l'application d'un traitement inducteur du bourgeon-
nement axillaire.
Nous avons utilisé la solution minérale optimale
5
a
pour l'hybride
(Q-I) additionnée de BAP 2.10-
M ; ANA S.10- M.
Une induction préliminaire d'une durée de a jours n'ayant pas
été suffisante pour induire une caulogénèse chez P. taeda , nous
avons maintenu les explantats en présence du complexe hormonal,
pendant 20 jours. Les hybrides utilisés comme témoin ont subi
un traitement identique.
Au bout de trois mois sur le milieu d'allongement,
la réponse des explantats a été estimée sous forme du nombre
de bourgeons axillaires formés. Les résultats sont regroupés
sur le tableau n013.
TABLEAU N° 13 -
REPONSE DU P.taeda et du P rigida x taeda
A LA STIMULATION CAULOGENE.
Espèce
Nombre
Explants
Nombre de
d'explantats
siège d'un
bourgeons
bourgeonnement
P.
taeda
9
100 %
1 - 4,71 - lC
P.
l'igida" ..
3C
x taeda
9
100 %
3 -16,9
-

---

83
20 jours d'induction permettent à tous les explan-
tats de manifester une caulogénèse. Mais l'intensité de la
réponse est plus importante chez l'hybride avec une moyenne
de 17 bourgeons axillaires par explantat, alors que 5 en
moyenne sont obtenus chez P.
taeda.
Si pour l'hybride, une induction de 3 jours est
optimale pour stimuler la caulogénèse, pour le P.
t~eda, une
durée de 20 jours demeure nécessaire.
Ces résultats révèlent une aptitude moins importante
à l'organogénèse chez P.
Taeda.
Cette sensibilité à l'induction caulogénè~e consta-
tée chez l'hybride peut être rattachée à un héritag~ maternel
transmis par l'espèce Pinus rigida qui possède une grande fa-
cilité à se propager végétativement (rejets et pous~es épicor-
miques) •

---

84
CHAPITRE II - FORMATION DE POUSSES FEUILLEES AXILLAIRES
Ayant d€termin€
les meilleures conditions pour
l'induction du bourgeonnement axillaire, nous allons essa-
yer de pr€ciser
la composition min€rale
optimale du milieu
d'allongement de la pousse feuill€e
ainsi que le rôle de la
cytokinine.
A
INFLUENCE DE DIVERSES DILUTIONS D'UNE SOLUTION DE BASE
De nombreux auteurs ayant constat€
l'effet favora-
ble d'une faible teneur du milieu en éléments minéraux, nous
avons voulu vérifier ces affirmations avec l'hybride Rigida
x taeda.
S
Après une induction de 3 jours
(BA 2.10- M, ANA
S.10-8M) sur le milieu Q-L, les explantats sont plac€s
sur
le milieu Margara. Les €léments
minéraux macro et micro-€l€-
ments ont €t€
dilu€s
de 1/2, du 1/10° et du 1/50°, donnant
les concentrations ioniques globales respectives de 24,6 mM
4,92 mM : 0,98 mM.
Le milieu Margara normal a €t€
utilisé
comme milieu témoin
(concentration ionique 49,2 mM).
Les ré-
sultats sont représent€spar
les courbes d'allongement de
l'axe €picotyl€
(fig. 3 ).
On remarque que les explantats placés sur le milieu
dilu€
de moitié s'allongent beaucoup plus que dans les autres
cas. La dominance apicale est très importante et les bourgeons
form€s
sont totalement inhibés.
Seul le milieu Margara normal
permet un développement relativement satisfaisant des bourgeons
axillaires et de l'apex.

---

85
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---

86
Les explantats, placés sur les milieux dilués au
1/10° et au 1/50° ont un allongement très faible, presque
nul.
Sur ces milieux, nous avons constaté un arrêt de crois-
sance des bourgeons axillaires formés qui demeurent à l'état
d'ébauches. Par la suite ces ébauches se nécrosent. Ce type
de comportement est à rapprocher de celui observé en présence
du milieu Wolter-Skoog qui, comme on le sait, est un milieu
très pauvre en ions.
Il semblerait, au vu de ces résultats, que la con-
centration ionique totale influe énormément sur le devenir de
l'explantat. En effet, i l apparalt nettement une compétition
entre l'axe épicotylé et les bourgeons axillaires pour la nu-
trition minérale. Cette compétition est défavorable aux bour-
geons axillaires qui ont du mal à se développer dès que la
dose minérale totale devient insuffisante.
Cependant, la survie des explantats même en présence
d'une solution diluée au 1/50° témoigne d'une bonne capacité
de résistance à un déficit nutritif de l'hybride Rigida x taeda
faculté qui est peut-être due à la grande rusticité de l'espèce
mère Pinus rigida,
B -
ASPECT QUALITATIF ET QUANTITATIF DU MILIEU DE BASE
Les effets sur l'allongement des solutions minérales
de Margara, Quoirin-Lepoivre, Murashige-Skoog et Wolter-Skoog,
ont été comparés, les pousses étant au préalable soumises à
5
B
un traitement d'induction de 3 jours
(BA 2.10- M, ANA 5.10- M).
Les résultats sont exprimés en termes d'allongement en fonction
du milieu et présentés sur la figure
4 . Ils représentent le

---

B7
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• •
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7
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---

88
nombre moyen de bourgeons axillaires par explantat en fonc-
tion de la solution minérale (fig •.4A), la longueur moyenne
des pousses axillaires trois mois après le traitement induc-
teur, dont 1 mois après ablation de l'apex (fig.
4B) et la
longueur moyenne des pousses épicotylées (fig.
4C) au moment
de leur ablation soit après deux mois de culture.
8.1.- Allongement de la pousse apicale
Le milieu Margara est le plus favorable à l'élon-
gation de la tige épicotylée. Concernant les 3 solutions mi-
nérales, les résultats ne présentent pas de différence signi-
ficative
(fig.
4C).
B.2.- Allongement des bourgeons axillaires
Après ablation de l'apex au bout de deux mois de
culture, les bourgeons axillaires s'allongent de façon plus
active. Les explantats ont été soumis à un traitement d'in-
duction du bourgeonnement axillaire d'une durée de 3 jours.
Les résultats sont consignés sur la fig. ~B).
On note tout d'abord une différence de comporte-
ment des bourgeons axillaires par rapport aux tiges
épicotylées. Si ces dernières sont stimulées par la
présence des éléments minéraux de Margara, les pre-
mières par contre s'allongent mieux sur le milieu
Quoirin-Lepoivre.

---

89
Si onc~e les histogrammes de fréquence du
nombre de bourgeons produits par explantat (fig.4A)
avec ceux représentant la longueur moyenne des
bourgeons axillaires sur chacun des milieux utili-
sés (fig. 4B), on remarque une certaine analogie
dans les réponses.
Il appara1t donc que le milieu le plus favorable
à l'induction du bourgeonnement est celui qui stimule le plus
l'élongation des bourgeons formés.
Il semblerait que les deux étapes de notre étude
induction et allongement, étapes que nous avons dissociées
pour des raisons pratiques, ne soient qu'une seule et unique
séquence que nous pourrions nommer activation des méristèmes.
L'ensemble minéral qui stimule l'organisation du
bourgeon est le même que celui qui permet son fonctionnement.
On en revient ainsi aux questions que nous nous
sommes déjà posées sur l'influence qualitative et quantitative
des ions.
Concernant la dominance apicale, nous avons fait
la liaison suivante :

---

90
-
bon développement des axes épicotylés ++ Margara
dominance apicale importante
(allongement moindre
des bourgeons) •
- bon développement des bourgeons ++ Quoirin-Lepoivre
dominance apicale peu marquée.
On peut alors se demander quel est le facteur qui,
dans le milieu Margara provoque
le développement des axes
épicotylés au détriment de celui des bourgeons axillaires ?
La présence de K, ayant probablement pour consé-
quence d'augmenter la quantité de cytokininè qui stimule-
rait le bourgeonnement,
la diminution de sa teneur jouerait
sur la balance auxine /
cytokinine, en faveur de l'auxine et
permettrait l'installation d'une dominance apicale. Cettehypo-
thèse de l'existence d'un lien entre la teneur en K du milieu
et donc des tissus,et la balance hormonale endog~ne aUKine/
cytokinine, nous permet d'interpréter la réponse des explan-
tats sur le milieu Margara.
Sur le milieu Quoirin-Lepoivre, la forte teneur en
K entra1nerait, toujours selon la même hypothèse, un déplace-
ment de la balance hormonale en faveur de la cytokinine. Il
en découlerait alors une stimulation plus importante des bour-
geons axillaires avec une dérive à leur profit des éléments
nutritifs et au détriment de l'axe épicotylé.

---

.91
C -
INFLUENCE DE LA CYTOKININE SUR L'ALLONGEMENT
D'après les travaux effectués sur le pin maritime
par Davil et al, i l semblerait que l'incorporation dans le
milieu d'allongement du charbon et de la cytokinine
(BA),
aurait pour conséquence de permettre un allongement plus
homogène de l'ensemble des bourgeons, en évitant l'instaura-
tion d'un effet de dominance de la part de l'un d'entre eux.
Or, de nombreux auteurs ont signalé l'effet néfaste
de la présence de substances hormonales dans le milieu d'élon-
gation.
Compte-tenu de ces observations contradictoires,
nous avons étudié l'effet de la BA en présence de charbon
actif dans le milieu d'allongement. Deux conditions ont été
créées :
Induction
Allongement
Quoirin - Lepoivre
BA
+ charbon 2 %
8 jours ~
Margara + BA(2.10-5M)
ANA
~argara + charbon 2 %
....

---

92
Les résultats sont rassemblés dans le tableau no\\4
et représentés sur la fig.
5. Ils ont été enregistrés après
45 jours de culture.
Il n'apparait pas de différence significative entre
les deux milieux utilisés en ce qui concerne l'allongement des
axes épicotylés (Tab.15)Par contre, la présence de cytokinine dans lE
milieu d'allongement a pour effet de prolonger l'effet du trai-
tement inducteur du bourgeonnement axillaire (tableau 14).
TABLEAU 14. INFLUENCE DE LA CYTOKININE EN PRESENCE
DE CHARBON ACTIF
Nombre
Nanbre de
Narbre total
d'explantat
lx.mrgeons
cr
de lxmrgeons
axillaires
fonnés
Charl:on +
12
1 -
7 -
12
± 3,74
68
PA
-
Charl:on
12
1 - 2,9 -
9
± 2,5
26
sans PA
- -
En effet, on note qu'en présence de cytokinine dans
le milieu d'allongement, les explantats produisent en moyenne
7 bourgeons axillaires alors qu'en son absence cette valeur
tombe à 3. Ainsi, la présence de charbon actif ne s'oppose pas
à
l'action caulogène de la cytokinine.
On note ainsi une différence de comportement avec
le pin maritime.

---

93
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C
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\\
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\\
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o
.,.
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1
,
!
1
,
.rfO 1
,
~
,
1
,
-
...,
...,---=---~

---

TABLEAU N° 15
CYTOKININE ET ALLONGEMENT DE L'AXE EPICOTYLE
Nanbre de jours
2 jours
16 jours
23 jours
30 jours
37 jours
45 jours
TRAITEMENT
X
(]
X
(]
X
(]
X
(]
X
(]
X
(]
MARG.1\\RA + CHAROON (2 %) +
BA. (2.10-5M)
0,76
0,31
1,36
0,56
1,78
0,70
2,58
0,73
3,04
0,92
3,33
0,96
\\0
MARG\\RA + CHAROCN (2 %)
0,85
0,27
1,62
0,78
1,91
0,88
2,69
1,08
3,04
0,92
3,31
1,11
~
1

---

95
D) EFFET DU MILIEU D'ALLONGEMENT SUR DES
EXPLANTATS PRIMAIRES
Dans l'expérience précédente,
nous avions remarqué
que si l'addition de BA au milieu d'allongement ne modifiait
pas la croissance des pousses feuillées,
elle stimulait par
contre la formation de bourgeons axillaires.
Mais, ces explantats avaient subi une induction pré-
-5
-8
alable de 8 jours
(BAP : 2.10
M, ANA 5.10
M).
Nous avons estimé qu'il serait intéressant de savoir
si la production de bourgeons plus importante était une consé-
quence d'un effet cœmùatif
entre la phase d'induction et la
présence de BA incorporée dans le milieu d'allongement, ou bien
si le milieu d'allongement à lui seul était capable d'induire
l'apparition de bourgeons axillaires.
Nous avons donc placé des explantats primaires
(apex
+ cotyledons + fragment d'axe hypocotylé) prélevés sur des
semis âgés d'l mois, directement sur deux milieux d'allongement
l'un conteœmt de la BA, l'autre en étant dépourvu.
Les résultats
sont les suivants:
(cf. Tableau nO le.

---

p
. . . . . . IZ'p-
, te
'(
-96
TABLEAU N°
16 -
REPONSE DES EXPLANTATS CULTIVES SUR MILIEU
D'ALLONGErmNT SANS APPLICATION PREALABLE DE
TRAITEMENT CAULOGENE
caractères
Caulogénèse
Ebaucnes
Caulogénèse
L<ngueur noy.
observés
Œ!tte
caulogènes
absente
des axes épi-
ootylés (an)
%
%
%
Conditioos
de culture
Charron + BA.
55
34
11
4,17
Charron sans
34
44
22
4,58
m
Nous pouvons dégager de l'observation du tableau,
les remarques suivantes :
1)
Les bourgeons peuvent appara1tre sur les explan-
tats sans que ces derniers aient subi un traite-
ment caulogène préalable.
2) Sur un milieu totalement dépourvu de BA, un nombre
appréciable d'explants peut initier des bourgeons
qui évoluent normalement en pousses feuillées.

---

97
3) L'apport de BA dans le milieu de culture en
présence de charbon actif a pour-conséquence
de stimuler la caulogénèse en augmentant le
pourcentage d'explants réactifs mais n'influ-
ence pas l'élongation.
4) Le nombre de bourgeons axillaires par explantat
demeure très faible.
Bien que l'intensité de la réponse caulogène soit
très faible par rapport à ce que l'on obtient après passage
par une phase d'induction, ce phénomène mérite d'être souli-
gné. En effet, le pin maritime qui est notre référence, ne
présente pas ce type de comportement ; avec cette espèce le
passage par une phase inductive est absolument nécessaire.
Ceci témoigne des aptitudes caulogènes de cette
espèce qui sont à rapprocher de sa capacité à rejeter à partir
de souche.

---

98
Allongement des bourgeons formés chez le P.
taeda
Après une induction de 20 jours sur Q-l,
les
explantats primaires de l'hybride et du P.taeda , sont pla-
5
cés sur le milieu Margara additionné de BAP 2.10- M et de
charbon actif 2 %.
Les allongements moyens des axes épicotylés et des
bourgeons axillaires sont présentés dans le tableau n017.
'Xab1.17 - Croissance des 2 espèces sur milieu d'allongement
Allongement de l'axe épicotylé et des bourgeons axillaires en
fonction de l'espèce. (cm)
Nombre
Longueur moy.
Longueur moyenne
Espèce
d'explantats de l'axe épi co-
des bourgeons (cm)
tylé.
(ap.3mois
ap.4 mois de cul-
de culture)
ture)
P.
taeda
9
3,52 ± 1,42
1,85
±
0,64
P.
rigida
9
6,15 ± 0,99
4,61
±
2,54
x
taeda

---

r
99
Il apparait sur ce tableau que l'hybride manifeste
une plus grande vigueur. En effet, chez ce dernier la crois-
sance est deux fois plus intense que chez le P.taeda.
Nous avons constaté également un comportement dif-
férent des explantats de P. taeda
vis-à-vis des conditions
de culture. En effet, chez cette espèce,
les bourgeons axil-
laires sont gros et visibles dès la sortie de la phase d'in-
duction. Généralement ils se développent difficilement. Cer-
tains n'évoluent jamais en pousse porteuse d'euphylles, ils
demeurent à l'état de bourgeons ~dormants" même après une
ablation de l'apex. Par contre, chez l'hybride, les bourgeons
sont très petits et presque invisibles. Leur développement
en pousse feuillée se fait assez rapidement, i l est accéléré
par la levée de l'inhibition dUe à la dominance apicale.
Dans les conditions de culture favorables à la mul-
tiplication de l'hybride, l'espèce P.
taeda réagit différem-
ment. A la lumière de ces résultats, i l semblerait que cette
espèce soit moins apte à la propagation végétative in vitro.

---

1
100
f
CHAPITRE III - RHIZOGENESE
A -
Influence du milieu et de la dose hormonale
Dans les chapitres précédents, nous avons défini
les conditions optimales de production
de pousses feuillées.
La
régénération
de plantes entières nécessite
la néo-formation d'un système racinaire fonctionnel, c'est-
à-dire capable d'absorber, de transformer et de transmettre
ce qui libèrerait l'explantat des contraintes artificielles
auxquelles i l est soumis.
Une revue de la littérature traitant de la rhizogé-
nèse chez les gymnospermes,
nous révèle le caractère plus ou
moins empirique des méthodes utilisées
(abaissement de la
température, réduction du sucre et des éléments minéraux, uti-
lisation de diverses substances de nature hormonale). Tout se
passe comme si on essayait de mettre l'explantat dans des con-
ditions de sous-nutrition, l'addition d'hormones devant favo-
riser l'expression de la rhizogénèse.
La plupart des auteurs travaillant sur les gymnosper-
mes enracinent les tigelles en conditions naturelles ou arti-
ficielles en présence de substances de nature auxinique. Mais,
les travaux effectués par Hyun et al
(1982 ) Mott et al
(1978)
respectivement sur P.rigida x
taeda et P.
Taeda ont montré l'ef-
fet stimulant de l'adjonction de BA à effet essentiellement
caulogène, sur l'induction de la rhizogénèse. Ainsi Mott et al
-9
-4
utilisent le complexe BA (4.5.10
M et ANA 5,5.10
M).

---

1
101
t
i
Ceci vient corroborer la théorie de Skoog et Miller
selon laquelle la balance hormonale cytokinine/auxine serait
le facteur déterminant dans l'évolution morphogénétique d'un
expIant.
Il existe de nombreux cas où la BA a été utilisée
en combinaison avec une auxine pour enraciner des tigelles.
(Picêa gZanca,
Pinus radiata,
Pinus syZvestris).
(Campbell et
Duzzau (1976)
i
Reilly et Washer (1977)
; Bornrnan et Jansen(19&
Nous nous sommes d'abord inspirés de la méthode
mise au point sur le pin maritime pour effectuer un premier
test d'enracinement. Puis, nous avons tenté de mettre au point
une expérience mieux adaptée aux conditions spécifiques de
culture de l'espèce étudiée.
Les pousses à enraciner avaient une longueur de
3 cm environ. Les résutlats sont présentés sur le tableau
nO lB .

---

102
TABLEAU N°lS - INFLUENCE DU MILIEU ET DE LA DOSE HORMONALE
SUR L'ENRACINEMENT.
Critères
Durée
Nbre
Expl.
Expl.
Expl.
Nb. nnyen
observés
d'indue-
tDtal
verts.
nécrosés
enraci-
de racines
tion rhi- d'explant
nés.
par explant
Traiternents
zogèœ
%
%
%
mg/l
ANA 0,1
45 j
17
29
23
47
1 - 3,1 - 7
m 0,01
N
.........
~ ANA 0,2
10 j
20
30
45
25
1 - 5,4 -11
~
m 0
t'
p::;
~ ANA 0,3
5 j
23
22
65
13
1-
4,5 -S
m 0,01
~
ANA 0,2
1
15 j
12
-
-
25
2 - 5,3 -10
BA
0
p::;
Une prem1ere constatation s'impose: les conditions
opt1ffiales d'enracinement du pin maritime (milieu R-W
ANA 0,2mg/l)
ne correspondent pas aux besoins de l'hybride Rigida x taeda.
Le pourcentage d'enracinement faible
(25 %) en témoigne.
Sur le milieu Margara dilué de moitié, le nombre d'ex-
plantats enracinéss'accrolt quand:
- d'une part, la durée d'induction augmente,
- d'autre part, la concentration en ANA diminue.

---

RJUzogénè.6e adventive ~WL
l'axe ép"<'cotlji.é
ANA = 0, 2 m[J/ i
PouMe etllz.aul1ée ap'l.r~
c.aUogénè-~e
ANA = 0,2 mgfi.
"'--._........
~
- .~-,,-
~-
" ......
\\~
, ..
.fl.

---

103
Cette expérimentation ne permet pas de mettre en
évidence le rOle éventuel de la cytokinine.
On constate aussi que le nombre d'explants nécrosés
s'accroît quand la concentration en auxine exogène augmente.
Si l'on s'en tient à l'effet de la concentration en auxine et
de sa durée d'application, i l est possible de noter un effet
dose sur la rhizogénèse. Cependant, cet effet dose ne peut être
rapproché des résultats concernant la survie, ce qui démontre
une fois de plus les limites d'utilisation de ce paramètre pour
interprêter le comportement des explantats.
Ainsi, dans l'état actuel de notre expérimentation,
nous pouvons dire que l'application pendant 45 jours du comple-
xe hormonal constitué de l'ANA 0,1 mg/l et BA 0,01 mg/l permet
d'obtenir le meilleur enracinement.
B - Cas d'enracinements spontanés
Tout au long de notre expérimentation, nous avons pu
constater un phénomène assez inhabituel. Nous avons remarqué
que certaines pousses constituant l
à 6 % des effectifs, pla-
cées sur un milieu d'allongement contenant du charbon.actif
(2 %), et dépourvu d'auxine, forment des racines longues, et
fines, directement sur la tige épicotylée ou sur l'hypo~oty­
le et donc sans callogénèse. Ces racines s'allongent très
bien dans le milieu de culture.

---

~'."':.'.1~:,.
- ~~;.~"'.).f'~.-,"'.:.-:
R!I.luzogét1ùe. ~porz.ta.née. ~aJ1~ ca.tiogéllê~e
~~ un 6~agme.nt d'épico~ljie.

---

104
Nous avons observé ces enracinements spontanés
dans les cas suivants :
-
le milieu contient du charbon actif.
le milieu a été appauvri en éléments minéraux
soit par dilution
(1/10° et 1/50°)
soit à la
suite d'un séjour prolongé de l'explantat sur
le milieu de base.
Il est probable que le séjour prolongé sur un mi-
lieu appauvri en éléments minéraux, ait eu pour conséquence
de déclencher une réaction de survie de l'explantat, qui en
formant un système racinaire sera capable de prospecter un
volume plus important de substrat g6losé.
Concernant le charbon actif,
son influence sur la
rhizogénèse est très controversée. Selon certains auteurs,
i l la stimulerait
(Fridborget al, 1978, Wang et Huang, 1976),
selon d'autres
(Rosati et al,
1980) sa présence réduirait la
capacité rhizogène. Cependant, le charbon agirait en éliminant
les toxines présentes dans l'ag~ (Kolenbach, Wesnicke, 1978)
ainsi que les substances phénoliques excrétées par l'explantat
en culture
(Fridborg et Eriksson, 1979).
La possibilité qu'un des effets stimulateurs sur
l'enracinement soit lié à ses propriétés analogues à celles
du sol
(barrière contre la lumière, capacité d'échanges io-
niques), ne devrait pas être écartée (Proskaner et Berman,
1970).

---

D'autre part,
i l est tout aussi possible que
l'existence d'un niveau d'auxine endogène élevé, facilite
l'expression de la rhizogénèse spontanée.

---

106
2° PARTIE
TECHNIQUES DE "RAJEUNISSEMENT"

---

107
INTRODUCTION
Pour améliorer les arbres forestiers,
i l s'est
avéré nécessaire de développer des méthodes de multipli-
cation végétative d'arbres adultes ayant déjà atteint un
certain développement et ayant ainsi exprimé un phénotype
.. remarquable" .
L'avantage de cette méthode est qu'elle permet un
gain rapide par multiplication à l'infini des clones identi-
ques au donneur. Notons que ce type de production se base
sur le principe que les caractères intéressants observés sur
le pied-mère sont transmis aux ramets.
Or,
la plupart des conifères présente encore des
difficultés pour leur propagation végétative. En fait la
culture "in vitro"
ne présente pas toujours de réels avan-
tages par rapport aux méthodes traditionnelles de bouturage
ou de greffage, car la plante a déjà perdu une grande partie
de ses capacités organogènes in vitro,
à un age où les bou-
tures peuvent encore s'enraciner.
Dès lors,
i l sera nécessaire de tenir compte du
degré de juvénilité ou de maturation de la plante-mère.

---

· 108
Chez la plupart des espèces forestières,
i l n'existe
pas de limite franche entre la phase juvénile et la phase adul-
te.
On trouve souvent sur le même pied, des parties plus
ou moins juvéniles que d'autres. La localisation de ces zones
immatures devient alors un préalable indispensable à une micro-
propagation efficace. Outre le choix judicieux des explantats,
la mise au point de traitements de "préconditionnement" s'avère
indispensable si l'on veut tirer un profit maximum de multipli-
cation in vitro de sujets adultes sélectionnés.

---

109
HISTORIQUE
A) DEFINITION DE LA JUVENILITE
Le déroulement du cycle vital d'une plante est
jalonné d'étapes correspondant à l'acquisition progressive
de nouvelles caractéristiques morphologiques et physiolo-
giques qui diffèrent de manière imperceptible de celles
qui les précèdent.
Ainsi, le développement apparaît comme une accu-
mulation d'évènements mineurs.
Cependant, i l arrive qu'on passe brutalement d'un
état à un autre tout à fait différent avec peu ou pas du
tout de stades intermédiaires.
L'évolution de ces différentes caractéristiques
morphologiques et physiologiques et leur expression quanti-
tative ne se font pas de manière synchrone et coordonnée.
Dans ce cas, quels sont les critères sur lesquels
on peut valablement se baser pour définir la juvénilité ?

---

110
La difficulté de défnir des critères fiables de
juvénilitêainsi que le particularisme de chaque espèce
qui interdit toute généralisation, ont amené de nombreuses
controverses chez les chercheurs.
Mais on peut remarquer que parmi les caractères
généralement retenus, on retrouve :
l'absence de floraison avec l'opposition vege-
tatif '#- génératif. Mais il ne faut pas oublier
que la floraison d'une plante est souvent tri-
butaire des conditions d'environnement.
-
des caractères morphologiques résultant de la
structure et du comportement de l'apex
(phylo-
taxie, forme de la feuille, pigmentation, pu-
bescence, etc . . . ).
des caractères physiologiques
(mode de croissan-
ce, capacité à produire des racines et des bour-
geons adventifs) .
-
des caractères biochimiques
(peroxydases, protéi-
nes)
(Moncousin,
1982 ; Aghion 1978) et des élé-
ments minéraux tels que le potassium et le cal-
cium (HelIer, 1977).

---

111
D'une façon générale, on peut cependant définir
la sénescence comme l'augmentation de la probabilité d'inac-
tivation avec l'age chronologique. La sénescence se manifes-
te habituellement par un cortège caractéristique d'altéra-
tions structurales et fonctionnelles précédant l'inactivation
elle-même
(Vandenhaute et Delcour, 1982).
B - LES DIFFERENTES FORMES DE VIEILLISSEMENT
Les auteurs ont été amenés à considérer différents
types de vieillissement
(Fortanier et Jonkers, 1976 i
Franclet 1979).
La plante subit de façon inexorable un programme
pré-établi qui la conduit progressivement vers
la senescence. Le seul facteur pris comme réfé-
rence du vieillissement est l'âge de la plante
alors qu'on sait que les facteurs environnemen-
taux peuvent modifier les séquences du déroule-
ment de la vie de l'arbre.
Il est d'ordre nutrionnel qualitatif ou quanti ta-
ti~ ou consécutif à des modifications des balances
hormonales ou à des partages inégaux d'assimilats.

---

Il correspond à un système complexe de corréla-
tions internes entre les différents organes qui
s'exercent à courte ou longue distance.
Il serait
lié au degré de maturation des m~ristèmes.
C -
IMPORTANCE DU SYSTEME RACINAlRE
En dehors de l'utilisation de la capacité rhizo-
gène comme critère de rajeunissement,
le système racinaire
présente une importance décisive dans le déterminisme du
vieillissement.
Les racines sont considérées comme le pOle primor-
dial de la juvénilité. En effet, les méristèmes prélevés
(Bonga, Boulay, 1979 ; Franclet 1979) dans la zone proche du
système racinaire, présentent une capacité de multiplication
végétative et une croissance de type juvénile pendant un temps
assez long. Généralement, i l est admis que moins la distance
entre le méristème apical et la base du tronc est grande et
plus le méristème est juvénile.
Ceci se traduit par le fait que les rameaux préle-
vés sur les branches basses s'enracinent plus facilement que
ceux prélevés sur les parties hautes de l'arbre.

---

113
Cette différence d'activité pourrait être liée à
trois facteurs
:
- une meilleure nutrition minérale et organique et
un me~lleur apport en eau (Borchert, 1976).
L'arbre
qui s'accroit en hauteur se complexifie.
Les voies empruntées pour le transport interne
deviennent de plus en plus longues et de moins
en moins simples.
Il s'établit un déséquilibre
entre système racina ire et système aérien qui
s'accentue d'autant plus que les branches sont
proches de la cime. Il en résulte une diminution
de l'apport en eau et en éléments minéraux qui
limite la croissance.
-
les parties basales sont considérées sur le plan
ontogénétique comme les plus juvéniles. Ce sont
des régions où le type de fonctionnement de l'in-
formation héréditaire est conservé proche du type
juvénile (Borchert, 1976 ; Kozlowski, 1971). Sou-
vent i l subsiste dans ces zones, des méristèmes
latents apparus précocement au début de la vie
de l'arbre qui n'ayant pratiquement pas subi de
division cellulaires, n'ont donc pas évolué
(ex
rejets de souche d'Eucalyptus, drageons et rejets
de Pinus rigida
(Chaperon,
1979»).

---

114
- un système de corrélations favorables : l'activit~
efficace du système racinaire dependrait de là pro-
duction de gibberellines ou de substances qui lui
sont proches
(Warcing et Frydman,
1976 ;
Zirnrnerman,
1972 ; Borchert, 1942 ; Rogler et Hackett, 1975).
Elle pûunait
aussi dépendre de l'action des cytoki-
nines qui sont considérées comme des hormones anti-
sénescence. On suppose que la régulation du vieil-
lissement des feuilles d'une plante pourrait être
li~e à la production de cytokinine par la pointe
des racines. Ces cytokinines ralentiraient le
vieillissement par leur "pouvoir attractif" vis-à-
vis des métabolites et par leur "pouvoir protecteur"
qui se manifeste par la stimulation des synthèses
protéiques et par le ralentissement de leur dégra-
dation
(Chaussat, Courduroux, 1980).
On comprend aisément que dans la mesure où de telles
causes intrinsèques
(génétique et physiologique)
et extrinsè-
ques
(environnement) agissent conjointement et contribuent à
l'apparition du phénomène global de vieillissement,
leur mode
d'action en soit peu défini et leur déterminisme fondamental
demeuré obscur.
D - LES TECHNIQUES DE RAJEUNISSEMENT
Pour multiplier des individus intéressants mais qui,
le plus souvent ont perdu une grande partie de leurs aptitudes
organogènes, les forestiers ont du faire appel à des techniques
de manipulation "in vivo" et "in vitpo" des ortets.

---

115
a) Les mêthodes de rajeunissement "in vivo"
-
la réactivation des méristèmes axillaires par
des tailles intensives
(Franclet, 1966) et systématiques
(Chaperon et Quillet, 1977 ; Francl~t 1977).
-
la stimulation des méristèmes apicaux par gref-
fages répêtés et rapprochês
(Doorenbos, 1953 ; Franclet,1977)
sur des porte-greffes juvêniles ; par bouturages en cascades
(Kleinschmidt et Schmidt, 1977 ; de la Goublaye
1980) ou par
marcottage aêrien
(Franclet, 1979).
-
la stimulation puis l'utilisation de rejets de
souches
(Franclet, 1979) ou de drageons
(ibidem).
-
la modification de l'environnement des ortets
(volume du conteneur, nature du substrat, nutrition minérale
et température racinaire)
(Franclet, 1979).
-
la pulvérisation de BAP : Masalewski et Hackett
(1979) réussisent à induire des pousses épicormiques juvéni-
les parfaitement bouturables. Des résultats analogues ont
été obtenus sur le pin et le Douglas à l'AFOCEL.

---

116
b) Le rajeunissement "in vitro"
Les techniques de manipulation "in vitro" par les
possibilités qu'elles offrent, d'une part d'utiliser des mé-
ristèmes de taille infiniment réduite et libérés des corré-
lations inhibitrices, d'autre part de permettre un meilleur
contrôle de l'environnement physique et nutritionnel des
explantats, a permis d'induire des modifications morphologi-
ques ou physiologiques caractéristiques d'un "rajeunissement",
-
Sur Pinus pinaster, l'utilisation de techniques
"in vivo" (bouturage, hyperfertilisation, taille
estivale des pousses en élongation)
suivies de
traitements "in vitro"
(culture de brachyblastes
6
sur milieu minéral additionné de BAP 5.10- M et
-8
d'ANA 2,5.10
Mf
allongement des pousses sur mi-
lieu contenant du charbon actif)
ont permis d'en-
raciner 90 % des explantats
(Franclet, David et
Boulay, 1980). Les plantules obœnues ont manifes-
té provisoirement une morphologie juvénile.
-
Sur Sequoiadendron giganteum var.pendutum la cul-
ture. "in vi tro" a permis une restauration du port
:orthotrope
une meilleure aptitude au bouturage
ainsi que l'acquisition d'une vigueur juvénile
(Franclet, 1981).

---

117
- Sur Sequoia sempervirens de la Goublaye
(1980)
a pu constater la réacquisition des caractères
précédemment cités après quatre cycles de pas-
sages en "in vitro"
La plupart des espèces tempérées sont soumises à
une multitude d'effets cycliques au cours de leur dévelop-
pement (dormance, multiplication, élongation) avec pour
conséquence
une variation de la reponse physiologique en
fonction de la période. Ainsi,
le choix de l'époque de pré-
lèvement des explantats est déterminant dans le succès d'une
propagation végétative d'arbres adultes.
-
BOnga
(1977)
sur Abies baLsamea utilise des
bourgeons encore dormants prélevés sur des arbres de 15 à
20 ans,
juste avant le débourrement printanier. Cette pério-
de correspond à une courte phase pendant laquelle les méris-
tèmes latéraux viennent d'être formés au sein du bourgeon
terminal.
-
Avec Larix x euroLepis
(Cornu),
le matériel le
plus apte au bourgeonnement est celui prélevé juste après le
débourrement.
-
Selon de la Goublaye (1981)
la dormance des bour-
geons même incomplète chez le Sequoia sempervirens,
inhibe
totalement ou partiellement les capacités rhizogènes.

---

118
- La r~activation des bourgeons axillaires sur I~
Douglas est d'autant plus importante que:
a)
le pied-mère est jeune
b)
l ' ~poque de pr~lèvement est proche de la dat t·
de d~bourrement
1 f
c)
enfin que ces bourgeons sont si tués à proxirl. 1
.
du bourgeon terminal
(Boulay, 1979)
-
Boulay, Melin et Lafray
(1974) en cultivant d' ·
bourgeons de Pseudotsuga mensiesii prélevés sur des sujet·
juvéniles ou des arbres adultes constatent que la conserVff
tion à basse temp~rature (OOC) pendant plusieurs mois, st'
mule la caulogénèse.

---

119
METHODES ET RESULTATS EXPERIMENTAUX

---

120
B.I PRE-TRAITEMENT DU MATERIEL VEGETAL
Une revue de la littérature traitant les problèmes
du rajeunissement montre qu'une des conditions importantes
de la réussite de la réversion de phase est la préparation
du pied-mère.
L'ensemble des manipulations qui touchent autant
les facteurs physiques, chimiques que physiologiques ont
pour but d'améliorer la réactivité des explantats à intro-
duire
in vitro .
Les diverses manipulations sont
-
la taille,
-
les greffages répétés sur sujets juvéniles
-
l'optimisation des conditions d'environnement
-
les pulvérisations de cytokinine.
Cette série de manipulations de l'ortet ne prend
son importance que dans la mesure où elles permettent d'ob-
tenir des explants physiologiquement aptes à une introduc-
tion
in vitro • Une seconde phase consistera à multiplier
ce matériel et à lui faire réacquérir certains caractères
perdus au cours de son évolution ontogénétique sur le don-
neur.

---

121
La culture "in vitr'o" nous permetrra ainsi d'uti-
liser des explantats miniaturisés à l'extrême et contenant
un minimum de cellules méristématiques ayant conservé un
Il souvenir"
de leur évolution antérieure.
Bl.l- Greffages en cascades
c'est le greffage réitéré d'un apex sénile sur
des porte-greffes juvéniles. En utilisant un matériel !gé,
le greffage tente de provoquer un retour partiel à l'état
juvénile par :
- le rapprochement du système aérien (apex sénile)
d'un système racinaire vigoureux afin de béné-
ficier de l'apport nutritif et hormonal.
- la libération du greffon des corrélations inhi-
bitrices auxquelles il était soumis sur l'arbre
adulte et leur remplacement par des corrélations
de type juvéniles plus favorables.
la répétition des blessures sur l'apex, qui
aurait un effet bénéfique sur la reprise de
croissance des méristèmes.
1
1

---

122
Le matériel a été soumis à un forçage. Nous avons
insisté sur l'environnement physique et nutritionnel des
greffes car de nombreuses expériences ont montré qU'ils cons-
tituent un facteur important de réussite du rajeunissement.
les porte-greffes possèdent un système racinaire
enveloppé dans une motte melfert additionnée
d'engrais retard pour stimuler le développement
des racines.
les pieds greffés sont placés dans un environne-
ment permettant de chauffer les racines pendant
l'hiver. La température de l'enceinte climatisée
est maintenue à 25°C le jour et 20°C la nuit.
La lumière est permanente. L'humidité de l'air
varie autour de 70 %.
L'application régulière de fongicides (Benlate)
garantit l'état sanitaire des sujets.
- Matériel de base
Le matériel provenait d'hybrides pigida x taeda
(Fl).âgés d'une cinquantaine d'années; ils ont été créés
par l'Institut de Génétique Forestière en Californie.
Les rameaux qui nous ont été fournis ont subi
tout d'abord une greffe de mobilisation sur Pinus pigida.
C'est sur ces sujets qu'ont été prélevés les greffons uti-
lisés pour notre travail.

---

123
Les porte-greffes sont des semis âgés d'un an et
1/2 de différentes espèces: Pinus,pigida,
Pinus taeda,
Pinus sylvestpis.
L'hybride pigida x taeda ne présentant
pas d'incompatibilité de grefface avec ces espèces de
Pins, la seule condition pour la réussite du greffage est
la juvénilité du porte-greffe ainsi que l'existence d'un
système racinaire bien dév~loppé.
Les greffes sont pour la plupart en fente termi-
nale et occasionnellement en fente latérale.
Les greffons utilisés sont constitués de l'extré-
mité apicale d'une tige portant 4 à 5 aiguilles et le bour-
geon terminal. Nous avons ainsi utilisé des bourgeons dor-
mants isolés de la tige et des aiguilles.
Les greffons utilisés ont une largeur de 4 à 5 cm
dans le cas des apex et d'environ 1 cm pour les bourgeons
terminaux. L'utilisation d'un greffon miniaturisé doit être
un des facteurs de réussite du rajeunissement.
- Résultats
---------
Le taux de reprise des greffons est de 30 %, indü-
féremment de l'importance du greffon; il est apprécié au
bout de 3 semaines après l'opération de greffage et corres-
pond à la formation d'un bourrelet de cicatrisation.

---

124
Par la suite les aiguilles existantes s'allongent.
Au bout de 2 mois, le bourgeon terminal débourre et les ai-
guilles nouvellement formées se développent. Des greffons
sont ensuite prélevés sur les pousses qui se sont ainsi dé-
veloppées, afin de réaliser une deuxième génération de gref-
fage.
La détermination d'un critère de juvénilité est
relativement difficile dans la mesure où les seuls caractè-
res observables sont des caractères de morphologie foliaire,
de croissance en longueur et de durée de dormance.
Concernant le problème de la plagiotropie observée
chez d'autres espèces comme le Douglas, le Sequoia,
à la
deuxième génération de greffage, tous les greffons avaient
réacquis une croissance orthotrope.
Nous nous sommes ainsi basés sur les caractères
morphologiques décrits pour apprécier l'effet du greffage
sur le degré de juvénilité. Nous avons constaté que sur les
greffes de mobilisation et les greffes de première généra-
tion,
les aiguilles étaient de couleur vert foncé,
très
sclérifiées. Sur les greffes de 2ème génération, les feuil-
les sont vert clair, et très tendres
(peu de sclérification).

---

125
Nous avons noté également une réduction de I~
taille du bourgeon terminal
tl
qui, de 2 à 3 cm s'est pl Il'Jr "-
sivement réduit à une longueur inférieure à 1 cm.
.
.
1· tJour-
Dans le cas de certa1nes greffes d1rectes (~
geons apicaux, nous avons pu observer un débour'remen~ ,d"-
coce au bout de 5 semaines.
L'aspect des aiguilles, le port orthotrope ,,1 f/td
f (~r­
que la diminution de la période de dormance du bourge-- 11f '
minal, consti tuent autant de prémices d' une réversioTI '/1' r fi
un type de comportement juvénile.
Nous avons voulu combiner l'effet de la taï, ,~~
i
avec celui de la cytokinine pour induire le développe~"" fl .
t~/I.~
de méristèmes axillaires en attente et qui seraient d
~
ontogénétique moins élevé que l'âge chronologique de Jk
plante.
Sur des greffes de 1ère génération, nous aV~/-~
suppr1me la partie apicale. Nous les avons soumises â /~~
pulvérisations hebdomadaires de BAP (50 mg/l) pendant ~/.-l.!-
semaines. Le matériel a été maintenu dans une encein~
~
matisée.

---

126
Au bout de 3 semaines de pulvérisations, les
pieds-mères réagissent de façon très vigoureuse.
Nous avons constaté d'abord un gonflement à la
base des aiguilles, puis le développement des bourgeons
brachyblastiques en pousses feuillées d'aspect juvénile.
A la base des verticilles, les méristèmes axil-
laires donnent naissance à de nombreuses pousses.
Sur la presque totalité de la longueur de la tige
principale, et sur les tiges axillaires, les méristèmes
quiescents réagissent.
Cette réaction vigoureuse des pieds-mères à la
taille et à la stimulation hormonale, ainsi que l'aspect
juvénile des pousses qui sont formées, constituent une
étape prometteuse dans le processus de rajeunissement.
B 2
CULTURE "IN VITRO"
Notre propos est de montrer que si la culture
"in vitro" est le moyen le plus efficace pour rajeunir un
méristème sénile, il est nécessaire d'oeuvrer sur un maté-
riel ayant déjà subi de nombreuses manipulations"in vivo i ,.

---

127
Nous avons donc essayé d'introduire .des aiguilles
possédant à leur sommet un bourgeon brachyblastique, afin
d'induire le développement d'une pousse feuillée.
Ces aiguilles ont été prélevées sur des pieds-mères
greffés de 2ème génération ou de 1ère génération après déca-
pitation et pulvérisation à la BAP.
Nous nous sommes essentiellement heurtés à trois
obstacles
- l'aseptie des brachyblastes : malgré les traite-
ments fongicides permanents "in situ" avant le
prélèvement des explantats, et malgré l'applica-
tion de produits désinfectants (chlorure mercu-
rifique) avant la mise en tube des brachyblastes,
80 % du matériel s'infectait après 15 jours de
culture.
la nécrose des brachyblastes : parmi les explan-
tats indemnes, de forts pourcentages de nécroses
étaient observés.
- l'absence quasi totale de réactivité: des bra-
chyblastes soumis au traitement inducteur (BAP
1,5 mg/l, ANA : 0,01 mg/l) se gonflent à leur
base. Dans certains cas, un bourgeon apparatt
entre les deux aiguilles mais au bout de quel-
ques jours son développement est stoppé. Il
n'évoluera jamais en pousse feuillée.

---

128
Nous avons essayé diverses techniques pour surmon-
ter ces obstacles :
-
stimulation de la réactivité des explantats par
des pré-traitements
(froid et obscurité - cultu-
re sur milieu contenant du charbon actif)
avant
la phase d'induction, ou par une modification
des balances hormonales et par l'essai de divers
milieux de base.
-
augmentation des pourcentages d'explants asepti-
ques
(incorporation de bactéricides et d'anti-
fongicides dans le milieu de culture).
L'ensemble de ces manipulations n'ont pas pu abou-
tir à la production de pousses feuillées.

---

129
\\
CONCLUSION GENERALE
Effectuêe dans le cadre d'une multiplication
conforme de gênotypes sêlectionnês juvêniles, notre étude
a permis de mettre au point une technique de culture
"in vit:r>o" de l'hybride Pinus :r>igida x taeda. -EIle a aussi
mis en êvidence les spécificitês de l'hybride dans ses
besoins nutritifs.
Certaines rêponses permettent d'ouvrir un champ
nouveau à la comprêhension du phênomène morphogênêtique
qui interviennent au cours des diffêrentes phases de la
culture "in vi t:r>o".
000
Lors de cette première phase de rêactivation
des meristèmes axillaires qui comprend l'unduction du
bourgeonnement suivie de l'êlongation en pousses feuillêes,
nous avons pu constater l'efficacitê de la solution miné-
rale dêfinie par Quoirin-Lepoivre.

---

130
Les besoins en macro-éléments sont tributaires
aussi bien de la concentration ionique globale que de la
teneur en ions spécifiques.
Parmi les différents ions qui composent les
solutions minérales utilisées, nous avons discriminé des
ions majeurs. Parmi ceux-ci les ions potassium et Magné-
sium sont connus pour leur influence sur la synthèse pro-
téique, les réactions enzymatiques ainsi que sur l'activité
mitotique.
Ces ions pourraient jouer un rôle prépondérant
sur l'activité des méristèmes caulinaires car par-delà leur
influence propre sur le niveau d'activité des tissus, ils
peuvent agir sur la perméabilité membranaire pour faciliter
l'accès de la cytokinine exogène aux sites d'action spéci-
fiques.
Notre expérimentation vient confirmer la consta-
tation de divers auteurs concernant l'effet néfaste d'une
forte teneur en ions amnonium (NH4+) dans le milieu de cul-
ture.
Une des caractéristiques importantes de l'hybride
rigida x taeda est son extrême sensibilité à la stimulation
hormonale. Alors que les autres espèces du genre Pinus né-
cessitent une induction minimale de 15 jours, l'optimum de
caulogénèse est obtenu après 3 jours d'induction chez l'hy-
bride.

---

131
D'autre part, les explantats sont capables de
former des ébauches de pousses feuillées sans passage
préalable par une phase d'induction et sur un milieu to-
talement dépourvu de phytohormones.
La concentration maximale de BA 10-4M constitue
le seuil à partir duquel on observe l'apparition de struc-
tures de type adventives.
L'optimum de la concentration en BA est difficile
à déterminer car nous avons observé deux types de réponses :
-s
-s
-
à faibles doses
(10
M à 2.10
M)
les explantats
réagissent faiblement à la stimulation hormonale
mais les bourgeons s'allongent très rapidement.
-
à fortes doses
(S. la-SM à 10-4M) une réponse
intense s'accompagne de l'inhibition des bour-
geons formés.
La levée de cette inhibition se
fera de façon plus tardive.
Les explantats paraissent sensibles à un effet de
dose car les valeurs obtenues
(en nombre moyen de bourgeons
par explantat) semblent résulter d'un effet mutiplicatif en-
tre la concentration cytokinique et la durée d'induction.
La présence de cellules méristématiques en attente
sur toute la longueur de la pousse feuillée révèle l'extra-

---

132
ordinaire aptitude de l'hybride à la multiplication végétative.
Ces points méristématiques, soumis à une induction caulogène,
ont pu donner naissance à de très nombreux bourgeons axillai-
res qui formèrent un manchon presque continu autour de la
tige. Sur une pousse feuillée divisée en différents segments,
nous avons constaté que chaque partie réagit vigoureusement
à la stimulation hormonale.
Ces types de comportement différencient l'hybride
du pin maritime, espèce pour laquelle seule la partie basale
de l'apex est inductible.
Si dans de nombreux cas, des auteurs ont mentionné
l'effet particulièrement favorable de la dilution du milieu
de base sur l'élongation des bourgeons, sur l'espécé étudiée,
nous avons remarqué l'existence d'une compétition entre bour-
geons axillaires et apex. Dès que la concentration ionique
globale diminue, seul le bourgeon principal continue normale-
ment son développement. Le prélèvement des éléments nutritifs
se fait au détriment des bourgeons axillaires.
L'addition de BA dans le milieu d'allongement' a
pour effet de stimuler le bourgeonnement et ainsi, deprolon-
ger l'effet du traitement inducteur caulogène.
L'espèce Pinus taeda, placée dans les conditions
de culture de l'hybride rigida x taeda, a révélé une aptitude
moins grande à la propagation "in vitro". Les deux espèces
ne présentant pas les mêmes exigences, la recherche des be-
soins spécifiques dans le cadre d'une multiplication confor-
me chez Pinus taeda, pourra être une voie à explorer.

---

133
Au cours de la dernière phase aboutissant à la
formation de racines adventives, nous avions constatê que
l'hybride rêagissait favorablement à une faible dose hor-
monale (ANA 0,1 mg/l - BA 0,01 mg/l - pendant 45 jours).
Ce traitement nous a permis d'obtenir un taux d'enracine-
ment optimal de 47 %. L'influence de l'auxine, en présence
de cytokinine, sur la rhizogénèse reste une voie à êtudier
en dêtail afin d'optimiser les résultats.
Les nombreux cas d'enracinement spontané consta-
tés sur le milieu d'allongement appauvri en éléments ~iné­
raux et contenant du charbon actif, nous ont révélé une
importante aptitude de l'espèce êtudiée. Le charbon actif
par son pouvoir d'êlimination de divers composês organi-
ques et par la modificêtion des capacitês d'êchanges du
substrat qu'il provoque, associé à une teneur en auxine
endogène élevêe, sont probablement responsables de ce phé-
nomène.
Ainsi, nos travaux conduisent à la mise au point
d'un processus de micro-propagation de sujets juvêniles
(1 mois) de l'hybride rigida x taeda.
D'autre part, ils font apparaître l'importance de
la nutrition minérale et en particulier de certains ions
comme le potassium ou le magnésium sur la pénétration dans
les cellules de la cytokinine exogène.
Cette voie nous parait importante à étudier notüm-
ment en vue de comprendre le mêcanisme et d'optimiser l'in-
tensitê de la rêponse caulogène.

---

134
Si la micropropagation de sujets juvéniles présente
un intérêt certain pour la multiplication de plants issus
d'une pollinisation contrôlée, cette technique de propagation
ne trouvera sa pleine application que lorsqu'on sera capable
de l'appliquer à des arbres matures sélectionnés; on sait
cependant que les aptitudes organogènes décroissent avec
l'age. Les recherches réalisées dans divers pays portent no-
tamment sur des manipulations devant conduire à une intensi-
fication de la réponse organogène des explantats en culture
"i n vi t T'O " •
La combinaison de différentes techniques de pré-
conditionnement du pied-mère, greffages en cascades de ra-
mets agés sur de jeunes semis vigoureux, taille, pulvérisa-
tion à la BA, nous a permis de constater un début de réver-
sion vers une forme plus juvénile.
Bien que de l'avis de certains auteurs, l'effet
réjuvénilisant obtenu par greffage soit assez habile, nous
pensons que ces résulats constituent une étape prometteuse
et un pas important dans le processus de lire juvénation ".
Nous pouvons ainsi envisager qu'une multiplication
en masse de matériel adulte sélectionné de Pinus T'igida x
taeda,
sera possible da~s un proche avenir.
1
1
1

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135
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