UNIVERSITE CHEIKH AN TA DIOP - DAKAR
FACULTE DE MEDECINE ET DE pIlARMACIE
ETUDE DE LA REPONSE LYMPHOCYTAIRE T ET DE
LA RESTRICTION GENETIQUE AUX ANTIGENES DE
MEROZOITES DE PLASMODIUM FALC/PARUM
EN ZONE D'HOLOENDEl\\lICITE PALUSTRE
POUR L'ENSF.IGNE<'.~E'lï ,:J'X:
':-,
C. A. M, L S. -
OU/',G!\\DOUuc;', 1
THESE
DOCTEUR ès
l'A""lll\\'ee .'19.MAI
' j f-"
~I'('lh'
.
, Enregistré sousn" #:0 -0, {. ~:iJ
Pour obtenir le grade de
SCIENCES'PHARMACEUTIQUES
(Diplôme d'ETAn
par Alioune OlEYE
Dale: 23 Avril J992 à 9 il
JURY:
Président
M.
Samba lllALLO
l"lembrcs : M.
Doudou UA
Mme Awa Marie COLIrSECK
.
M.
SouleJmalw l\\mOUp
,
Invités
M.
.Jean-Pierre IHGOUTTE
M.
.Jean-Louis SARTHOU

FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE
DOyEN...................................
M.René NDOYE
PREMIER
ASSESSEUR................
I\\t.Doudou BA
DEUXIEME
ASSESSEUR..............
M.Ibrahil118 l'.NJ)JA YE
CHEF
DES
SERVICES
ADMINISTRATIFS
M.Assane CISSE

A MES PARENTS
A MA FEMlIlE ET A MES ENFANTS

REMERCIEMENTS ET PROFONDE GRATITUDE
A MONSIEUR LE DOCTEUR .J l' DIGOUTTE
DIRECTEUR DE L'INSTITUT PASTEUR DE DAKAR
VOllS nous avez accepté au scin de l'institution que vous dirigcz.
Vous ne cessez de nous cncourager dans la poursuite de nos travaux.
Qu'il nous soit permis de vous exprimer notre respectueuse reconnaissance.
A MONSIEUR LE DOCTEUR .J L SAKIlIOU
CHEF DE L'UNITE D'IMMUNOLOGIE
DE L'INSTITUT PASTEUR DE DAKAR
Vous nous avez inspiré le sujet de ce travail.
Par vos conseils judicieux et constants, vous nous avez aidé à le réaliser.
Nous sommes particulièrement sensible aux nombreuses marques d'estime que vous ne cessez de nous
témoigner.
Veuillez accepter nos sentiments respectueux et nos sincères remerciements.
AU DR II G IIEIDRICH, MALARIA GROUPE, MpI MUNICH
1\\ TOUT LE PERSONNEL DE L'INSTITUT l'ASTEUR SPECIALEMENT CELUI DE
L'UNITE D'IMMUNOLOGIE ET DU SERVICE D'E1'IDEMIOLOGlE
Pour votre aide, votrc collaboration et surtout votre indéfectible amitié.
Que DIEU nous protège.
A TOUS LES HABITANTS DE DIELMO
A L'EQUIPE DE L'ORSrOM 'l'RA VAILLANT A DIELMO
AU PERSONNEL DU LABORATOIRE DE 1II0CIIIMIE PHARMACEUTIQUE DE LA
FACULTE IW l\\fEDECINE ET DE l'llARMAClE
A TOUTES LES PERSONNES QUI, DE l'RES OU DE LOIN,ONT CONTRIBUE A LA
REALiSATION DE CE 'l'RA VAIL.

A NOS MAITRES ET JUGES.
MONSIEUR LE plWFESSEUR SAMBA DIA LLO,
PRESIDENT DE JURY
C'est avec enthousiasme, que vous avez accepté de présider le jury de cette thèse.
Soyez assuré dc mon entière disponibilité.
MONSIEUR LE PROFESSEUR DOUDOU BA
Vous me lititcs un grand honneur en acceptant de juger ce travail, sans oublier vos judicieux
conseils que vous ne cessez de me prodiguer.
C'cst l'occasion de vous témoigner ma profonde reconnaissance.
MADAME LE PROFESSEUR AWA MARIE COLL-SECK
C'est un honneur et un plaisir pour moi de vous voir sièger dans ce jury.
Mes respectueux sentiments.
MONSIEUR LE PROFESSEUR SOULEYMANE MilOU!'
.Je suis très heurcux de vous compter parmi les membres de ce jury car vous représentez
be<lucoup de chose pour moi.Soyez assuré de ma sincère gratitude.

"Prenez intérêt, je vous en conjure, à ces demeures sacrées que l'on désigne du nom expressif de
laboratoires.Demandez qu'on les multiplie et qu'on les ouvre.Ce sont les temples de J'avenir,
de la richesse et du bien-être.C'est là que l'humanité grandit, se fortifie et devient meil/cure".
Louis l'ASTEUR
"Toute entreprise technologique ne doit avoir qu'un seul sujet de préoccupation: l'Homme et sa
destinée.Ne l'oubJiezjamais, au milieu de vos diagramIOes et de vos équations".
Albert EINSTEIN

Une partie de ce travail a fait l'objet de communications et de publications.
Communications:
I-DIEYE A., LAUNOIS P. ct SARTIIOU J.L. (1990)
Comparaison de différentes techniques de phénotypage HLA dans l'étude de la restriction génétique de la
réponse cellulaire T à P/aslIlodiuflIja/cipamm.
Colloque sur le paludisme au Sénégal .Perspectives de Recherche sur le vaccin antipaludique.Institut
Pasteur Paris, Paris les 12 et 13 Février.
2-DIEYE
A, LAUNOIS P , SARTIIOU J L (1990).
Phénotypagc HLA : Restriction génétique et Réponse cellulaire T aux antigènes de Pja/ciparum.
Comm.Jour.Dakaroise de Parasito.SOAP.Dakar 19 Juin.
3-DIEYE A, LAUNOIS l', SART/IOU J L(1990).
Perspectives de Recherches sur la vaccination antipaludique
Socicté Médicale d'Afrique Noirc dc Langue Francaise
Seance du lundi 10 Déccmbrc 1990
4-IlIEYE A, MIl.NIANt;, l'.LAUNOIS, C.ROGIER, J.f. 'fRAPE ct J.L. SARTIIOU (1991).
Réponsc cellulairc T aux antigènes de mérozoïles en 7.One holocndémique de transmission de paludisme.
Comm,Jour.Dakaroisc de Parasitologie, SOAP Dakar 27 Juin.
5-DŒYE A, DIOUF A, DlEYE Y, DIOUF B, CELLARD-PEYLE F, TROSSAERT M,
ROGIEH C, TRAPE J F, ET SARTIIOU J L (1991).
Réponse; cellulaire T in vitro aux antigèncs de mérozoïtes de Pja/ciparum en zone de transmission
continue du paludisme.
Societé l\\1édicale d'AfTique Noire de Langue Française, Séance du Lundi 2 Décembre 1991.
6-D!EVE A. et SARl1IOU J.L. (1991)
Phénctypage HLA et réponses cellulaires aux antigènes de mérozoïtes de P/asmodiumjalciparum..
Réunion des laboratoires du réseau international collaborant dans le projet paludisme,
5-6 Décembre, Institut Pastcur Paris.

Publications
l-DIEYE A., LAUNOIS P., SARTIIOU J.L. (l990)
Perspectives de RecherciJes sur la vaccination antipaludique
Dakar Médical, 35: 268-275.
2-DIEYE ALIOUNE (1991)
Paludisme, immunité et vaccins.
Dialogue et Evénement Médical (Sous presse).
3-DIEYE A, .SARTIIOU .J L, ROGIER C, TRArE J F, ct IIEIDRICII IIG (1991).
Réponse cellulaire T in vilro aux antigènes de mérozoïles en zone de transmission oontinue du paludisme.
Dakar Médical (sous presse).
4-DIEYE A, HEIDRICn II G , IWGIER C, TRAI'E J F, LAUNOIS l', IIOLDER A A,
and SARTIIOU J L(I992).
Lymphocyte response 10 rnerowite antigens frojhm PJalcipamm of donors from holoendemie area.
Parasito10rV Research (submited).

LISTE DES AIlREVIA l'JONS
Ac
Anticorps
CMH
Complexe Majeur d'Histocompatibilité
CO
Cluster of Differenciation
}.lg
microgramme
ml
millilitre
}.lI
microlitre
lFN-y
Interféron-gamma
IL
Interleukine
Ag
Antigène
Do
Densité optique
kDa
Kilodalton
MSP
Merowite Surface Protein
CSP
Circumsporowite Protein
lS
Indice de Stimulation
cpm
coups par minute
Pf
Plasmlxiiumjalcipanun
RES A
Ring Surface Erythrocyte Antigen
HLA
Human Leucocyte Antigen
PCR
Polymerase Chain Reaction
RFLP
Restriction Fragment Lengh Polymorphism
SVF
Sérum de Veau Foetal
SAB
Sérum Albumine Bovine
nm
nanomètre

SOMMAIRE
INTRODUCTION
IŒVUE GENERALE
Chapitre [ : Rappel sur le paludisme
Chapitre Il : Antigènes de Pja/dpwlIIn.
Chapitre lU: Réponse immunitaire anti-Pja/dparnm
ChapitrelV : Réponse cellulaire T aux antigènes de Pja/cipanun
Chapitre V : Système HLA et paludisme
TRAVAUX PERSONNELS
mRE l'ARTlE : MATERIELS ET METHODES
ChapiLre 1: Introduction
Chapitre 11: Description du site d'étude
Chapitre Hl: Analyse phénotypique des sous-populations lymphocytaires
Cha.pitre iV : Réponse cellulaire T aux antigènes de P.fa/ciparnl7l
Chapitre V: Identification des antigènes HLA ou typage dans le système HLA.
ChapitreVI: Réponse à médiation anticorps aux antigènes de Pja/dparnm
Chapitre VU: Analyse des antigènes de Pja/cipanun par Immunotransfert
2EME l'ARUE: RESULTATS
Chapitre 1: introduction
Chapitre II: Distribution phénotypique des sous-populations lymphocytaires
Chapitre Iii: Réponses cellulaires T aux antigènes de mérozoïtes
Chapitre IV: Réponses des sous-populations lymphocytaires aux antigènes de mérozoïtes.
Chapi!Te V: Antigènes du système HLA
Chapitre VI: Réponses anticorps
Chapitre VII: Analyse des antigènes de rnérowïles par Illlmunotransfen
Chapitre VlJ1: Réponses lymphocytaires et anticorps
Chapitre lX: Restriction génètique (HLA) et réponse anti-Pja/dparnm
Chapitre X: Elude longitudinale de la réponse cellulaire.

2
DISCUSSIONS
CONCLUSIONS
REFRENeES nlllLlOGRAl'llJQUES
l'LAN DETAILLE

INTRODUCTION

3
INTRODUCTION GENERALE
La mise au point de vaccin(s) antipaludique(s) efficace(s) est acctuellement considérée
comme une stratégie prioritaire d<ms la lutte contre le paludisme.
Cette mise au point dépend en grande partie des connaissances sur la relation hôte-
parasite en général, ct plus particulièrement les différents mécanismes immunitaires mis en place
par l'organisme lors de l'élaboration de la réponse antipalustre.
La répouse illlmunitaire est généralement ct artificiellement décomposée en réponses:
humorale (production d'anticorps) et cellulaire.
La production d'anticorps antipalustres par les individus ayant été en contact avec le
parasite n'est pas suffisante pour développer une immunité protectrice.Ce qui a aniené les
chercheurs à étudier la réponse cellulaire T.
Les connaissances acquises sur la caractérisation des antigènes selon les stades de
développement du parasite ont permis de cibler un certain nombre d'antigènes candidats à la
vaccination, parmi eux les antigènes de mérozoïtes.
Les mérozoïtes jO\\lent un rôle important dans le développement de la réponse
antipalustre car ils solll directement en contact avec le système immunitaire lors de leur libération
par éclatement des globules rouges parasités.
Ces considérations, entre autres, justifient l'importance accordée à l'étude des
antigènes de mérowïtes comme candidats potentiels dans la recherche d'un vaccin.
C'est pourquoi, nous avons entrepris l'évaluation de la réponse lymphocytaire in
l'irro en présence des antigènes de mérozoïtes chez des personnes vivant en zone d'holo-
endémicité p,llus\\re et ceci ell rapport avec le système HLA (Human Leucocyte Antigen).
Dans ce travail, nous ferons une revue générale portant sur la réponse cellulaire
antipaJustre avant d'exposer nos travaux personnels en deux parties: la première est une
présentation des méthodes utilisées et la seconde décrit les résultats obtenus suivie d'une
discussion et d'une conclusion générale.

REVUE GENERALE

4
Revuc générale
C/lapitrc 1
l{appel sur le paludisme
1) Importance dans le monde
2)Cycle de dcvcloppement de PJillciparom.
Chapitre 11
Antigènes de P.falcipamm.
1) Antigènes de sporowïtes
2) Antigènes de stades érythrocytaires
2-I-Merozoite Surface Protein 1
2-2-RESNPf [55
2-J-Glycoproteine 46
2-4- Proteines des rhoplnes
J) Antigènes de stades sexués
Chapitre III
Réponse immunitaire anti-P.falciparum
1) Mécanismes non spécifiques
2) Mécanismes spécifiques
2-I-Réponse anticorps
2-2-Réponse lymphocytaire
ClwpitrelV
Réponse cellulaire T aux antigènes de P.falciparum
J) Rappel sur les cellules impliquées dans la réponse T
2) Réponse cellulaire anti-P.falciparom
Chapitre V
Système HLA et paludisme
l) Rappel sur le système HLA
2) Réponse cellulaire et HLA

5
Chapitre X: Rappel sur le paludisme
1) lmporlance du paludisme dans le monde
Le paludisme reste la première maladie parasitaire dans le monde. Ce fléau touche 100
pays et près de la moitié de la population monJiaJe y est exposée (IOigure 1).Plus de cent millions
de cas de paludisme sont observés tous les ans ct l'on estime à un à deux millions le nombre de
décès, essentiellcment parmi Ics enfants 157).
Les Ille,ures de contrôle de la maladie reposent sur la tulle antivectorielle et sur
l'utilisation d'une chimioprophylaxie médicamenteuse.
La nécessilé de développer de nouveaux moyens de contrôle a conduit l'Organisation
Mondia1c de la Santé (OMS) à encourager les recherches portant sur un vaccin contre le
paludisme.Ce vaccin doit être erfieace, d'utilisation massive, et d'un coût en rapport avec la
situation socio-économique des utilisateurs potentiels, lesquels se trouvent dans leur majorité dans
les pays en voie Je développement.
La mise au point de vaccins suppose une bonne connaissance des antigènes eandidats
à 1,1 vaccination et Jes différents stades de développement du parasite qui les produit.
2) Cyde de déveluppement du parasite
L'infection palustTe est provoquée par des protozoaires du genre Plasmodium,
transmis à l'homme par une piqûre d'un moustique: l'anophèle femelle.
Les agents du paludisme humain appartiennent à quatre espèces: Plil.l'modium
.!iilciparwl/, P. vi vax, P.I/wlariae ct P.ol'a!<'.
L'cspèce la plus dangereuse, car responsable d'une mortalité elevée est Pjalciparum.
Son cycle de développement eomprenJ plusieurs phases (Figure 2) :
-la phase asexuée se d':'1'nule chez l'homme. Elle s'effectue successivement dans le foie (phase
exo-érytllrocytaire).
Les sporowïtes inoculés lors de la piqûre par un rnoustitjue infecté gagnent le foie et
pénètrent Jans les l:épatocyles. Par multiplication asexuée, ils évoluent en sehizontes. Ces
derniers, à maluril0, libèrent des milliers de méwzoïtes dans la circulation sanguine lors de
l'édatement des hépatocytes.

6
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8
Les mérozoïtes pénèllent à l'intérieur des hémalies dans lesquelles ils se transforment
suœessivemenl en stades annulaires "ring", en trophozoïtes et en schizonles.
Les schizonles mûrs libèrenl des mérozoïtes, qui à leur lour infeslent d'autres globules
rouges. Après plusieurs cycles, certains mérozoïtes vont se différencier en gamétocytes mâles et
femelles.
-la phase sexuée du cycle inlervient lorsque l'anophèle lors d'un repas de sang, ingère les
gamétocytes mâles et femelles, qui par reproduction sexuée donnent des ookinètes.
Ces derniers traversent la paroi stomacale du moustique, s'immobilisent sous la
membrane basale pour former des oocystes uninucléées, qui après maturation libèrent les
sporozoïtes qui gagneront les glandes salivaires. Lors d'un nouveau repas de sang, ces
sporozoïles sont innoculés à un nouvel individu, ainsi le cycle recommence.
Chaque phase du cycle comprend donc plusieurs stades. A chaque stade, des
antigènes différents sont exprimés.
Dans le chapitre suivant, les antigènes des différents stades seront décrits.

9
Chapitre 11 : Les antigènes de Plasmodium falciparum
Les recherches fondamentales ont permis d'aboutir au développement de techniques
permettant d'isoler et de caractériser de nombreuses protéines antigéniques de Pjalciparum.
Le développement en culture continue in vi/ru de Pjalciparwn réalisée par Trager et
Jensen 1781 a rendu possible la préparation de grandes quantités d'antigènes sans dépendre des
isolats, ni des malades ou des modèles expérimentaux.
La description détaillée des antigènes a été faite dans deux publications récentes 150,
89), c'est pourquoi nous nous limiterons aux principales protéines.
1) Antigènes des sporozoïtes
La Circumsporozoite Protein (CSP) est la protéine de surface du sporozoite. Il est
probablement l'antigène le plus étudié. Celte protéine qui joue un rôle dans l'invasion des
hépatocytes a un PM de 45 kDd et présente deux séquences répétitives de quatre acides aminés:
- (Asn-Ala-Asn-I'ro) 37 ou NANP 37
- (Asn- Val-Asn-Pro) 4 ou NVNP4
2) Antigènes des stades êrJthrocytaires asexués
Ils sont les plus nombreux. La plupart de ces antigènes ont été identifiés soit à
l'intérieur soit à la surface de schizontes mûrs et de mérozoïtes libres [53).
2-\\
Merowite Surface ]'rotein (MS]' 1)
II est le constituant majeur de l'extrait de mérozoïles que nous étudions el\\ réponses
immunes des individus vivant dans nne LOne de transmission continue du paludisme.
C'est une glycoprotéine de PM 185-190 kDa, polymorpl\\e. Elle est à l'origine des
protéines de 83, 42, 19 kDa. Les proteines 83 ct 42 kDa sont exprimées à la surface du mérowïte.
Sa structure complète a été déterminée par différents groupes [ID, 33, 38, 401. Le
fragment N-terminal cOlTespond à la molécule 83 kDa, et le fragment C-terminal à la molécule 42
kDa.

10
2-2 : Glycoprotéine de 46 kDa (MSP 2)
Elle a été caractérisée par 1521 à la surface de mérozoïles, C'est une protéine qui n'est
pas libérée à partir de la molécule 195 kDa, mais qui est synthétisée aux dernières phases du cycle
in traérythrocytaire.
2-3 :
Le Hing-stage Erythrocyte Surface Antigen (JU
lŒSA/Pfl55
C'est une protéine phosphorylée sur les restes tyrosine, de PM 155 kDa et pr<Jduite
dans les micronèmes des mérozoïtes. Une partie de cette moléeule s'insère dans la membrane
érylhrocytaire lors de l'invasion, l'autre partie est libérée dans le plasma. Elle représente deux
blocs de séquences répétitives immuno-dominantes 1161.
*B1oc N-terminal avec des répétitions imparfaites d'une séquence de II acides aminés,
*13loc C-terminal avec des répétitions de 8 acides aminés suivies de 40 répétitions de 4
acides aminés.
·\\:,;~'~;",,'Tt:·
.G~~
2-4 : Protéines issues
","~
d~~
..... r; ..e
rhoptçjes \\, .
.
':::;....-/.,
,
1
. .~
" \\'1'
1 .~, J
Les rhoptnes sont des organelles palr!J.s du. système ap~cal des mérozoïtes. Des
protéines de PM 140, 130, 105, 80 et 42 kDa ont
Xc,
élé
------~?!
èàractérisés.
':::~
'0<.-,
~~
"'" .'
(\\e«';-
"', :":':'~" '; -~.,/
3 ) Antigènes des stades sexués [8, 87].
Deux antigènes principaux: 230 kDa et 45/48 kDa identiliés grdce à la production
d'anticorps monoclonaux dirigés conlIe les gamètes, sont particulièrement immunogènes.
Ils sont localisés à la surface des gamètes, zygotes et ookinètes.
4) Les
principaux antigènes candidats à
la
vaccination
antipalustre.
La réponse immunitaire contre P.fa/ciparum dépend du stade de développement du
parasite. Comme il existe différents stades, plusieurs antigènes sont expérimentés dans le but
trouver un vaccin.
Nous nous limiterons à quelques antigènes.

11
4-1 : La circllmspuruwile prulein (CS!')
Elle a élé à la base de 2 lypes de vaccins recombinants lestés chez l'homme.
Le premier esl constitué de la séquence NANP répétée 37-41 fois recombinée avec 32
acides aminés du gène de résistance à la tétracycline 141.
Le deuxième comprend un peptide synthétique NA NP répété 3 fois conjugué à la
toxine tétanique 1361.
Les résultats des essais chez l'homme sont mitigés.
4-2 : I~s antigènes de méruzuïles
Les antigènes candidats sont nombreux. Un vaccin multivalent comprenant plusieurs
antigènes de différents stades a été developpé 161, 621.
Ce vaccin comprend 2 polymères synthétiques: la Spf(66) 30 et la Spf( JUS) 20.
Le polymère Spf(66) 3ü est préparé à partir de 3 peptides synthétiques différents: Spf
55 ; Spf 35.\\ el Spf 83. \\. Les polymères sont connectés par une répétition NANP. Son poids
moléculaire esl deI 50 kDa.
Le polymère Spf( 105) 20 contienl un peptide Spf 83.18, attaché à un autre peptide Pf
1551RESA par une une répétition NANP.Son poids moléculaire est de 150 kOa.
La IXIJymérisation de ces monomères est obtenue en induisanlla formation de ponts
disulfllres entre les cysleines par insufflation d'oxygène. Le polymère Spf(66) aété polymérisé 30
fois et le Spf( 105) 20 fois.
Ce vaccin est en cours d'évaluation dans certains pays d'Amérique laline donl, la
Colombie elle Brésil, sur une population de plus de 40.000 personnes 1631.
Les antigènes de Plalciparu17/ induisent des réponses immunologiques spécifiques et
non spécifiques qui sont examipées dans le chapitre suivant.

12
Chapitre lU : Réponse immunitaire anti-P.falciparum.
Notre organisme mobilise plusieurs systèmes de défense lors de l'infection palustre.
On distingue généralement des mécanismes spécifiques et non spécifiques.
1) Mécanismes 11011 spécifiques :
Un facteur de nature indéterminé retrouvé dans le sérum de certains sujets résidant en
zone d'hyperendémie a été décrit 141 1.
D'autres mécanismes tels que les cellules NK 1241 ; les radicaux oxygénés libres 1131
ou l'interféron y 1251 sont incriminés.
2) !VI écanismcs spéci/illuCS
2-1 : Immunité il médiation anticorps
Le transfert passif d'immunoglobulines de sujets immuns il des enfants infestés fait
décroître laparasitémie [141.
Il est constaté que pendant les 3 premiers mois de la vie, le nouveau-né est protégé par
les IgG de la mère qui passent par le placenta 132).
Plusieurs auteurs ont montré que les anticorps anti-P. falciparum peuvent avoir les
actions suivantes in virro :
- sur le mérozoïte : inhibition de la libération des mérozoïtes par le schizonte 1311, opsonisation
1451 ou agglutination des mérowïtes 180).
- sur le globule rouge infecté: inhibition du développement intraérythrocytaire du parasite 161J,
inhibition de j'attachement aux cellules de l'endothélium vasculaire [18, 831, opsonisation [9],
cytotoxicité dépendante d'anticorps à médiation cellulaire (AOCC) L83J.
Il faut noter qu'il n'existe pas toujours de corrélation entre l'activité des anticorps et le
développement parasitaire in vif/V 17, 261 ou la protection antipalustrel72l.
2-2 : Immunité il médiation cellulaire:
L'étude de l'immunité à médiation cellulaire dans le paludisme, entre autres l'étude de
la réponse cellulaire T aux antigènes des différents stades de développement du parasite constitue
un axe fondamental de recherche. L'étude des mécanismes qui inlerviennent dans le déroulement
de cette réponse constitue l'essentiel du chapitre suivant.

13
Chapitre IV : Réponse cellulaire T aux antigènes de
P.falciparum
Le développemcnt de la réponse cellulaire T fait intervenir de nombreuses cellules du
système immunitaire directement (interaction entre cellules) et/ou par l'intermédiaire de substances
secrétées (médiateurs).
1) Rappel sur les cellules impliquées 1.'1 les médialeurs.
L'immunité à médiation cellulaire s'applique aux réponses faisant intervenir des
lymphocytes. des cellules phagocytaires dans lesquelles les anticorps ne jouent qu'un rôle
accessoire. li est impossible cependant de considérer les réponses à médiation cellulaire et à
médiation humorale comme étant entièrement séparées. Les cellules sont nécessaires au
déclenchement des réponses anticorps.
La présentation de l'antigène au réc<"1Jteur de la cellule T se fait de manière spécifique.
Les cellules T auxiliaires et cytotoxiques ne lient pas l'antigène libre, elles ne reconnaissent
l'antigène qu'en association avec les produits du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH)
exprimés à la surface des cellules présentant l'antigène.
La technique des hybridomes, parallèlement à la cytométrie en flux qui permet de
séparer des cell ules selon leur taille et l'intensité de la fluorescence associée, ont révolutionné
j'étude de la fondion des différentes sous-populations lymphocytaires.
Les lymphocytes T provenant du sang périphérique présentent sur leurs membranes
différents marqueurs dont les principauxl5lj sont: CD3, CD4, C05, CD8 et C02.
On distingue deux types principaux de lymphocytes T d'après leurs fonctions
immunologiques et leurs marqueurs de surface:
- Jes cellules auxi] iaires T CD4 +
- les cellules cytotoxiques et suppressives T C08+.
Les lymphocytes 13 du sang périphérique portent plusieurs marqueurs dont les
principaux sont: C023 C021 CDl9, C020
Les cellules phagocytaires comprennent essentiellement les macrophages, les
monocytes et les polynucléaires. Leur origine est ccmmune dans la moelle osseuse, sous la forme
de cellules souchcs hématopoïétiques et des cellules souches myéloïdes ; ces dernières donnant
naissance en présence d'un médiateur, le "CoJony Stirnulating Factor" (CSF) à des colonies
mixtes de macrophages et de polynucléaires.

14
Les cellules K "Killer" el N K "Natural Killer" exercent des fonctions cytotoxiques et
n'ont apparemment aucun des marqueurs des cellules T ou B ; ce sont des cellules nulles.
Les réponses immunitaires sont la résultante d'interactions complexes entre plusieurs
types de cellules (lymphocytes T, lymplJocytes B, macrophages, polynucléaires, cellules
immatures etc. ..) qui communiquent entre-elles par l'intermédiaire de facteurs solubles appelés
"cytokines" qui sont c<lpables de se fixer sur des récepteurs membranaires spécifiques.
Une des principales caractéristiques de ces cytoki nes est leur double ubiquité:
- au nive<lu des cellulcs productrices, un même facteur peut-être produit par différents types de
œlJules;
- <lU niveau des cellulcs cibles, lin même facteur est responsable d'activités biologiques variées sur
des cellules différentes.
Les cytokines 13, 281 :
- sont des glycopmtéines de poids moléculaircs > 10 kDa
- possèdent un nombre variable de sites de glycosylation possibles et de ponts di sulfures ;
cependant, la présence des résidus sucrés ne semble pas utile pour l'expression de leur activité
biologique alors que les ponts disult"ures sont indispensables;
- plusieurs lymp'lokines peuvent être pro<luites par un même lymphocyte.
Les cytokines interviennent d.1I1S l'activation des cellules T, B et macrophages 133, 471.
Les cellules T au repos doivent interagir avec l'antigêne et les lymphokines avant de
proliférer. L'expansion clonale des cellules T dépend de la présence d'une cellule présentant
l'antigi:ne (CPAg). Ces dernières présentent l'antigène au récepteur de la cellule T cytotoxique ou
auxiliaire en association avec les antigènes de classes 1 ou II du Complexe Majeur
d'Histocompatibilité (CMH).
En général, les cellules auxiliaires (T CD4 +), répondent au double signal de l'antigène
associé aux lIlolécuies du CMH de classe II et l'interleukine 1 (ILl) produit par les CPAg en
proliférant et en produisant une variété de lymphokines agissant sur les cellules T surtout l'lU.
La réponse cellulaire IJ à un antigène est souvent séparée en 3 étapes: activatiun,
prolifération et différenciation. Au niveau des trois phases. dilerentes cytokines interviennent.
Dans la phase d'activatiun, l'iLl et le facteur nécrosant les tumeurs (TNF) sont
impliqués de même que j'IL.4 et le BCGF (H-Cell Growth Facteur) 12 kDa.
Dans la phase prclifératiun (divisiun), l'IL2, lIA, BCUF i2 kDa et l'interféron-
gamma (lNF-y ) sont nécessaires.
Dans 1.] pllaoc de différcnciatiou. IL2, HA, BCG!', INF-y, lUi SOllt impliquées.
l} est confirmé que les macrophages sont activés par l'IFN-y dans un premier temps

15
puis par les liposaccharides (LPS) des agents bactériens.
2) Réponse lymphocytaire T anti-P.falciparum
L'élude de la :('ponse Iympbocytaire T a été erfeetuéc sur de très nombreux antigènes
de stades différents de Pjà/cipamm.1I ne s'agit pas ici de répertorier tous les travaux, mais de
ciler ceux qui eonœrnent les antigènes les plus ciblés pour la vaccination antipalustre.
De nombreux travaux ont mis en évidence Je rôle important des Iympbocytes T non
seulement en tant que cellules auxiliaires pour les lymphocytes B dans la production d'anticorps,
mais surtout comme cellules dfectrices aussi bien les lymphocytes CD4 + que CD8+ 1301.
Des extraits de schizontes de Pja/cipal'llm peuvent induire in vitro une réponse
J'Imphoproliférative cbez des sujets adultes vivant dans des zones de paludisme endémique. Les
lymphocytes responsables sont surtout des T CD4 + car la déplétion en T CD8+ augmente plus de
7 fois la proli fération 155/. La production d'IFN-y a été augmentée chez les sujets développant une
rèponse élevée anx antigènes de Pjiliciparwn ct faible chez les mauvais répondeurs.
Dans une autre élude [69J, des facteurs irnmunosuppressifs dérivant de Pjalcipal'lllTl
qui empêchent le développement de la réponse Iymphoproliférative chez des sujets adultes immuns
ont été mis en évidence. Cet effet suppressif est partiellement abrogé par la déplétion en
lympbocytes CDS+ ; mais aussi la lymphoproliféralion et la production d'IFN-y sont augmentées.
D'autres travaux récents sont effectués avec des proteines antigéniques provenant des
différents stades du parasite.
L, protéine de surface de Pfalcipal1l111 (CSP) ainsi que les peptides synthétiques y
dérivant sont capables de faire proliférer les lymphocytes T aussi bien chez les sujets exposés au
paludisme que chez les non exposés 121. 931.
L'association de peptides synthétiques de la CSP et du RESAfPf 155 a donné une
réponse Iymphoproli férative ill vilro oulet une production d'IFNy ebez 66 % des donneurs
adultes teslés. Cependant il n y avait une corrélation que pour 30-35 % des sujets (791.
Les antigènes de mérozoÏles sous de nombreuses appelations différentes ont été lestés
en réponse l'lrnphoproliférative in l'ilro. Nous citerons quelques antigènes: gp 190 recombinante
[171; les rerAlmlJinanls et IJeptidcs synthétiques provenant de MSP 21751; les protéines de surface
du mérozoite MSPI et2114J.
L\\ plupart d'entre eux ont fait l'objet d'une évaluation en mne de paludisme saisonnier
ou endémique. Les réponses lymphocytaires varient d'un antigène à l'autre et sont surtout faibles
lorsqu'il s'agit de peptides synthétiques. Ce qui explique une interprétation difficile d'un antigène
à l'autre. Les isolats de Pfa/ciparuIII n'étant pas toujours les mêmes, cela entraîne une diversité
antigénique considérable.

16
Chapitre V : Système HLA et lllaiudisme
Le Complexe Majeur d'Histocompabilité (CMH) a été à l'origine identifié par ses
efrets dans le rejet de greffes. Mais il est maintenant reconnu que les protéines codées par cette
ré.gion sont impliquées dans de nombreux aspects de la reconnaissance immune, comme
J'interaction entre lymphocytes et cellules présentatrices d'antigènes, ou l'interaction entre
différentes cellules lyrnplloides.
1) Rappel sur le système IILA.
1-1 : Définitiun
Le Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH) est un groupe de loci étroitement
lié, présent sous une forme remarquablement similaire chez tous les mammifères et peut-être tous
les vertébrés' 18 !.
Le terme "histocompatibilité" l'ail référence au faü que la reconnaissance des molécules du CMH
par 1cs récepteurs des lymphocytes T (ct éventuellement par les cellules B) détemline la
compatibilité ou J'incompatibilité entre tissus.
Le terme "majeur" rappelle qu'il ex'lste de nombreux loci de compatibilité tissulaire,
nuis parmi eux Ics loci du CMH occupent une position particulière, au carrefour de l'ensemble des
phénomènes immul1ologiques.
Le terme "complexe" indique qu'il s'agit de plusieurs loci.
Chez l'homme, le CMH est appelé HLA (Human Leucocyte Antigen) puisque la
première description de ces antig(~nes a été faite sur des leucocytes en utilisant la technique de
leucoagglutination jJ<'U Jean Dausset en 1958.
1-2 : Structure
Le CMH humain est situé sur le chromosome 6 et subdivisé en deux classes de gènes
HLA. (1 et Il), assuciés aux gènes de composants du complément (classe Ill) et à certains gènes
d'enzymes (classe IV) 1201.
Les gènes de classe 1 comprennent les loci HLA-A, 13, C et ceux de classe Il comprennent les loci
HLA-DR, DQ et Dl'.
Les structures de classe 1et j[ sont représentées d.ans les figures 3 et 4.
Tous ces gènes HLA (classe 1 et classe Il) sont caractérisés par trois propriétés
majeures: le polymorphisme, la cooomimmee ct lellr étroite liaison.

17
NH,
FI~J:.1r"
3
Structuro
de.!!
antlg~ne,1 de
Flgure
4
Structure dei antlgenell de
clp,~.sf! 1
clauell
la classe (\\
es:
cem,losee d"un fraqment
Chaque chaine agI composée d"un 1ragment
Int'acy;ulJlasmiqu~, d"un lr<1gmonl Irilnsmcm.
InlracyloplnSmiQue, d'Un fragment Iransrnem·
'oranëllB el de Ire'13 domaines exlrél':clluhllJ€s
bfan;JJre et de ceu~ domaines exlracylOplas"
l'i1~lire chaine est CQn'3\\I\\'.lee do la p'.01icro~lo:
mll:~ues.
lJulil~e
(d'ilprès tléf. 3)

1-3 : l'oiymorphisme et désé4uilibre de liaisun
On dit qu'il y a déséquilibre de liaison entre 2 gènes lorsque la fréquence de leur
association est plus grande que ne le voudrait le hasard. Le deséquilibre de liaison est important
entre HLA-DR et HLA-DQ et faible cntre HLA-DR (ou DQ) et OP, cela suggère qu'il existe des
points de forte recombinaison appelés "points chauds".
La présence dans une population de deux ou plusicurs alléles, chacun à une fréquence
de 0,0 l ou plus, cst appelée polymorphisme génétique. En d'autres termes, un locus est considéré
comme polymorphique si la fréquence de son allèle le plus COITlmun est égale ou inférieure à 0,99.
La génération et le m,ünlien du polymorphisme sont localisés à des zones précises des
molécules du CMH (domaines N-terminaux). Le rôle biologique du polymorphisme pourrait être
de permettre l'association anligène-CMH. et de moduler le répertoire T des individus et donc de
l'espèce (411.
1-4 : Rôle l)ioiogillue [20J
1-4-1 : Distribution tissulaire
Les produits des gènes de cldsse 1 sont exprimés sur Ioules les cellules nucléées. Les
macrophages et lymphocytes en onlla plus forte concentration. Les globules rouges ne semblent
pas en avoir ~lJldis que leur présence sur les spermatozoïdes est controversée.
Les produits des génes de la classe Il ne sont exprimés que SUJ un petit nombre de cellules:
lymphocytes B. l1l<1cropllages ellcurs dérivés,lymphocytes T activés.
1-4-2 : Contrôle de la réponse immune
Les gènes de réponse immune sont en fait les gènes de classe Il puisque le répertoire
des cellules T dércnd de la composition en gènes de classe Il de l'individu.
Afin de répondre à un nombre maximum d'antigènes étrangers et de pouvoir mieux
préscnter çes antigènes, plusieurs types dc molécules de classe Il doivent être exprimés sur la
ccllule. Ainsi, la pr(,sence de plusieurs de ces molécules accroît les réponses de l'individu et le
polymorphisme {le ces molécules protège mieux l'espèce contre une épidémie. Cependant, plus
grand est le nombre de gènes de classe II exprimé, plus grande sera aussi la nOI1- réponse (le trou
dans le répertoire) pour une personne, ce qui paraît paradoxal.

19
La question est de savoir si cette non réponse est due à une mauvaise présentatiun par
ic macrophage uu au contraire, à une mauvaise réception du lymphocyte T par manque de clones
ayant le récepteur recunnaissant la combinaisnn antigène + mulécules de classe Il autulogues. Les
2 méA:anismes pourraient exister 1201.
1-4-3 : HLA et maladies 1291
Les maladies associécs au HLA affectent seulement certains systèmes de l'organisme
tels que:
- la squelette (spondylarthrite ankylosante, syndrome de Reiter, pülyarthrite rhumatoïde), le
système neuromuscuiaire (sclérose en plaqucs, myasthénie), le système endocrinien (diabète
juvénile, insul ina-dépendant, insu rrïsance surrénalienne).
- ct le système gastrointestinal (maladie cocliaque, hépatite chronique).
La plupart ou presque toutes ces pathologies sont de nature immunologique. Dans quelques cas,
l'association est si forte qu'elle peut faire évoquer un diagnustie. Ainsi par exemple,
la spondylarthrite ankylU.'>ante est associée à l'antigène B27 avec un coefficient de risque de 87.
Plus de 90 % des patients soulTnull de maladie coéliaque sont DR] ou DR7 ou DR3 et DR7.
2) Paludisme ct HLA
Le rôle du HLA dans la réponse cellulaire aux antigènes de Pjàlciparnm a fait l'objet
ces dernières années de beaucoup d'efforts.
Le plOblème est posé dans une perspective de vaccination. En effet. la répüuse
immunitaire du on des antigènes candidats à une vaccination contre le paludisme ne serait-elle pas
restreinte par un ou plusieurs antigènes HLA ?
Celle question est d'autant plus fondamentale que celle restriction voudrait dire qu'une
partie des personœs vaccinées ne püurra pas développer une réponse immunitaire adéquate [2,
761·
Nous allons essayer de traiter la question nwJgré le nombre limité de publications
par~les sur ce sujet.

20
2-1 : Paludisme et llLA classe 1
L'association de paludisme avec antigènes HLA-A, B et C, a fait l'objet de travaux
récents.
Dans une étude colombienne 1671 faite sur une population noire ( 98 sujets, 52
contrôles J d'origine ouest-africaine vivant dans une zone d'endémie, il a été montré que seule
HLA-C est associée significativement au paludisme à Pjalciparum. HLA-B ne présente aucune
association significative.
Plus proche de nous en Gambie, j'association antigène de classe 1et susceptibilité au
paludisme a été roc herchée [371. Les antigènes HLA-A24 et HLA-BI4 ont été surtout retrouvés
dans les cas de paludisme sévère; HLA-A24 n'étant associé qu'à ce dernier.
La fréquence de l'antigène HLA-BW53 est significativement abaissée dans les cas de
paludisme sévère et ceci quelle que soit la mét.hOdè 'de tYPi!ge HLA utilisée (sérologie ou
Polymerase Chain Reaction: PCR J.
~l%/~ -"\\~.
~.. (~) 'ij
2-2 : Paludisme et IILA classe Ii ,i /
,~
".
L'association entre paludisme et un a:li~~'ÔR ou DQ a été surtout recherchée
dans la mesure ou les antigènes de classe il sont d'une manière générale impliqués dans la réponse
cellulaire aux antigènes de parasites.
Une étude australienne 1731 portant sur les MSA 1 et 2 a montré chez 29 mélanésiens
adultes immuns que l'antigène HLA-DRW52 avait une fréquence élevée tandis que celle de
DRW53 était basse.
D'autres auteurs 159, 65, 841 ont montré l'existence de clones de cellules T
spt:'Cifiques des antigènes de Pjalciparum dont la prolifération est restreinte par un antigène DR
particulier.
Troye-Blomberg 1801 a pu montrer chez 87 adultes libériens et 46 gambiens par typage
HLA RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism J que la réponse Tet B à l'antigène Pf
155/RESA était fréquement associée à l'antigène HLA-DRW 18.
Une autre étude, toujours en Gambie, réalisée 1211 chez JO adultes vivant en zone
d'endémie palustre, a permis de voir une association nette entre une prolifération positive aux
IX-'Ptides de la CSP (Circumsporozoïte Protein J et l'antigène HLA-DRW 13; c'est le contraire pour
HLA-DQW3.
Réœmment, Hill 1371 a trouvé toujours par typage RFLP que l'haplotype HLA-DRW
l3.02-DQW2 est moins fréquent dans les cas de paludisme avec anémie sévère, tandis que
l'haplotype DR7-DQW2 était plus fréquent.

l'RAV AUX PERSONNELS

IERE PARTIE: MATERIELS ET METHODES

21
JERE PARTIE: MATERIELS ET METIIOUES
Chapitre 1 :
Introduction
Chapitre Il :
Description du site d'étude
Chapitre III
Analyse phénotypique des sous-populations
lymphocytaires
Chapitre IV : Réponse cellulaire T aux antigènes de P. faLciparum
1) Introduction
2) Matériels et métJlOdes
2-1 : Réactifs
2-2 : Méthodes
2-2-1 : Obtention d'antigènes de mérowites
2-2-2 : Populations cellulaires testées
2-2-3: Test de prolifération cellulaire
Chapitre V : Phénotypage dcs antigènes HLA ou typage dans le système I1LA.
1) Introduction
2) Matériels et métJlodes
2-1 : Matériels
2-2 : Méthodes:
2-2-1 : MétJlode classique
2-2-2: Méthode avec fluorescence
Cflilpitre VI : Réponsc ù médiation anticorps aux antigènes de P.falciparum
1) Introduction
2) Titrage immunoenzymatique des Ig tolales (1gG etlgM )
Chapitre VII : Analyse des antigènes de P.f par Imll1unntransfert
1) Introduction
2) Matériels et Méthodes
2-1 : Matériels
2-2 : Méthodes
2-2-1 : Electrotransfert.
2-2-) : Immunodétection des antigènes transférés.

22
Chapitre 1
Introduction
La réponse cellulaire T aux antigènes de mérozoïtes de Pjalciparum est évaluée en
zone d'eudémie palustre. Le choix de cette zone découle des conditions épidémiologiques
favorables et l'établissement d'une station de recherche permettant un suivi longitudinal.
Ces avantages permettent d'étudier les mécanismes d'acquisition de l'immunité et à la
différence des enquêtes transversales, la plupart des paramètres épidémiologiques sont suivis dans
le temps.
Le traitement des prélèvements biologiques se fait sans nécessité de congélation-
décongélation, cc qui évite l'altération fonctionnelle des cellules, et plus particulièrement les
lymphocytes.
Ces conditiolls sont particulièrement avantageuses, si l'on sait que la plupart des
tmvaux sur celle question ont été effectués sur des lymphocytes ayant été congelés au préalable.

23
Chapitre II : Description du village de Dielmo
1) Choix du sile
Le village de Dielmo a été retenu après plusieurs pré-enquêtes effectuées dans
différents villages des régions de Kaolack et de Fatick par les équipes du SelVice d'Epidémiologie
de l'Institut Pasteur ct de l'Unité de Paludologie de l'üRSTüM.
Ce choix est du à la forte endémicité palustre du site.
Une enquête socio-démographique a permis de connaître le recencement de la
population, l'étude de sa stabilité, l'histoire génésique des femmes, l'étude des recours au système
de santé, la scolarisation, les sources de revenus et la structure sociale du village.
2) Site de l'étude
2-1 : Caractères géo..dimaliques
Le village est situé à 270 km au sud-est de Dakar, dans la région de Fatick, à 15 km du
nord de la Gambie (figure 5).
Le climat et la végétation sont de type soudanéen. Les précipitations annuelles
moyennes s'élèvent à 900 mm d'cau et se répartissent de juin à octobre.
En 1990, les hauteurs d'cau ont été respectivement 49 mm en juin, 83 mm en juillet,
329 mm en août, 116 mm en septembre et 26 mm en octobre.
La température annuelle moyenne est de 26,5°C. Les températures minimales
moyennes mensuelles varient de 18°C à 25°C (minimum: décembre - avril). Les températures
maximales moyennes mcns\\lcHes varient de 32°C à 36°C (maximum: octobre-décembre).
2-2 : Populalion
Le village a été fondé en 1914 par 3 familles sérères originaires des iles du delta du
Saloum.
Au 1er janvier 1990, la population comprenait 250 habitants (sex ratio HlF : 0,98 )
dont 47 % d'enfants de moins de 15 ans.
Le viHage de Dielmo proprement dit comptait 195 habitants et le hameau de Santhie
Mouride situé à 300 m,55 habitants.
C'est une population vivant d'activités essentiellement agricoles.
La répartition ethnique est la suivante: Sérère 78%, Mandingue 13% et divers 9 %.

24
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Carte du Sénégal
* Variation mensuellc dc la dcnsilé \\'cetoriellc
Diclmo, Avril 1'1'10 - I\\lai 1991.
Prcmièrc pluic : 16 juin / Dcrnière pluie: 6 octobre.
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Figure 6
Densité vectorielle
*
Da~nées aimablement communiquées par Dr. C. ROGIER.

25
Les villageois sont de religion musulmane, et les langues les plus parlées sont le sérère (97 %), le
ouolof (68 %) et le mandingue (25 %).
Le village n'avait pas de case de santé, et le dispensaire le plus proche est à
Toubakouta distant de 12 km.
2-3 : L'endémicité palustre
Le paludisme y est holoendémique et sa transmission est perenne en raison de la
permanence des gîtes larvaires d'Anopheles gambiae S1 et d'A,jùne.\\lus .
Au 1er Juin 1990,l'îndicc plas modique toutes espèces confondues était de 83 % pour
les moins de 15 ans et de 28 % pour les adultes.
La densité vectorielle ainsi que le nombre de piqûres par personne et par nuit est
variable (ligure 6).
2-4 : Prélèvements biologiques
Les prélèvements arrivent de Dielmo dans un conditionnement adéquat c'est-à-dire une
glacière contenant des conservateurs de froid de façon que les prélèvements soient placés à une
température comprise entre 20-24°C. L'ensemble est acheminé jusqu'à Dakar par une voiture
climatisée où les échantillons sont traités dès leur arrivée. Il faut noter que les conditions ci-dessus
ont été retenues après un essai qui a determiné qu'il n'y avait pas de modifications significatives
des différentes constantes sanguines.
Nous avons utilisé le sang total pour le typage HLA, les cellules mononucléées pour
les tests de prolifération cellulaire, les sérums et plasmas pour les tests immunoenzymatiques et
d'immunotransfert.
Le nombre de sujets étudié est de :
- 116 pour 1étude de la réponse cellulaire T aux antigènes de lllérowites et de la réponse anticorps
- 6ü en Immunotransfert
- 104 en typage HLA .
Sur chaque prélèvement ont été effectués la recherche de parasites par goutte épaisse,
une numération formule sanguine ainsi que d'autres paramètres qui n'entrent pas dans le cadre de
notre travail.

26
Chapitre lU : Analyse phénotypique des sous-
populations lymphocytaires
La distribution phénotypique des sous-populations lymphocytaires a été analysée par
cytométrie de /lux laser, en immuno/luorescence directe avec double marquage simultané grâce à
des anticorps monoclonaux couplés à la l1uoresceine et à la phycoérythrine.
Les anlicorps monoclonaux (Couller, lmmunolech ou Oako) ont été utilisés sur sang
total avec l'appareil Q-PrepR permettant la lyse des globules rouges et la tixation des lymphocytes
par le formaldéh yde.
Les poucentages des différenles sous-populations sont déterminés par comptage de
10.000 cellules avec le cytofluoromètre de /lux à laser Argon EPICS PROFILER (Couller).
Le tableau 1résume les différenls anticorps monoclOllaux teslés.
Tableau l : Anticorps monoclonaux testés.
Classes de différenciation
Dénominations
Sous-populations
(CD)
lymphocytaires étudiées
Anti-CD2/ anti-CD2ü
l' II-FITC/B4-PE(lmmunotech)
l'lB
Anti-eD4/ anti-eD8
l'4-FlTC!T8-RD 1(Coulter)
1'4 auxiliaires!T8 suppresseurs
cytoloxiques
Anti-CD4/anti-4B4
T4-FlTC/4B4-RD 1(Coulter)
Anti-CD4/anti-eD45RO
T4-FITC/CD45RG-PE(Coul+0ak0)
1'4 inductrices de l'activation
Anti-eD4/anti-eD45RA
T4-FlTC/CD45-RDI(Couller)
1'4 inductrices de la suppression
Anti-Récepteur ylb
l'CR yb-FnC (1' Cel! Sciences)
Cellules T portant le récepteur )Q
Anti-Vy9
l'CR Vy9-FITC (T Cell SCiences)
Sous-populations de cellules ylb

27
Chapitre IV : Réponse lymphocytaire Taux
antigènes de P.Jalciparum in vitro.
1) !J1troductioll
L'élude de la réponse cellulaire Test éffcctuée in vitro par des tests de prolifération
lymphocytaire en présence d'aJltigènes de mérozoïtes ue PJàlcipamm (souche FCB 1) qui ont été
préparés à l'Institut Max-Planck de Munich (Or H G Heidrich) .
2) Matériels et Méthodes [34, 49J.
2-1 : Matériels et réactifs
Les milieux ue cul turc ainsi que tous les autres réactifs nécessaires peuvent être trouvés dans les
références 134, 49, 52].
- Billes magnétiques recouvertes d'anticorps anti-C02, anti-C08 et ami-COl9 (FlobioR) et
(Oynabeads, Biosys).
- Aimant- Concentratcur de particules MPC 6 (Biosys)
- Tuberculine purifiée (PPO) (Stalens SeruminstitutR, Copenhague, Danemark).
2- 2 : Méthodes
2-2-1 : Obtention d'antigènes de mérowites
2-2-1-1 : SYJ1Çhronisation de la culture de P. jùlciparlU7l [471.
La culture de P../àlciparlllll se déroule dans des plaques de culture de contenance de
15 ml.
Les parasites sont cultivés dans des globules A+ en présence RPMI tampon
additionné de 10 % de sérum humain. Les plaques sont incubées à 37° C dans une cloche à bougie.
Pour obtcnir uniquement des formes âgées du parasite, il est nécéssaire de faire une
synchronisation de la culture en utilisant dc la gélatine Ouide modifiée (PlasmageIR) 160,661.
Les suspensions globulaires réunies sont centrifugées à 2000 tours/mn pendant 10
mn. Le surnageartt éliminé, le culot obtenu est mesuré et additionné d'un volume de milieu de
cuiturc préalablement inçubé à 37 oC calculé comme suit:

28
Volume du culot x 100
=
ml
15 (volume en ml que contient une plaque de culture)
Les culots sont resuspcndus et centrifugés à 950 t 1 mn pendant 4 mn dans des tubes
coniques de 50 m!.
Le surnageant est éliminé puis un volume de milieu de culture égal à celui du culot
multiplié par 0,6 puis par 4 est ajouté. Une quantité de Plasmagel égale à ce dernier volume est
additionnée. Le tube cst agité par retournement et le culot globulaire sédimente à 37° C pendant 30
mn exactement
Le surnageant (Plasmagel + mérozoïtes) est prélevé; un frottis y est effectué pour
déterminer la parasitémie. Il doit y avoir au moins 80 % de parasites avec une bonne
synchronisation.
Le culot globulaire peut être remis en culture pour une nouvelle expérimentation.
Après centrifugation du surnageant pendant 10 mn à 2000 t Imn, le culot est mesuré et
le surnageant éliminé Le culot est repiqué dans du milieu complet pour avoir une hématocrite ne
dépassan t pas 0,25 %.
Le milieu de culture est changé 6h après, la première récolte de mérozoïtes ayant lieu
4h après le changement de milieu.
2-2-1-2: Récolte des mérozoïtes 134, 541.
Les plaques de culture sont réunies dans des tubes coniques de 50 ml et centrifugées à
900 Vmn pendant 4 mn .Un frottis est effectué au préalable pour contrôler la libération des
mérozoites. Le surnageant contenant les mérowites est récupéré et recentrifugé à 1000 t Imn
pendant 6 mn. Il est récupéré dans des tubes de 50 ml contenant chacun 1 ml de trasylol. Les
culots de centrifugation sont réunis dans un récipient stérile et incubés à + 37°C. Le nombre de
plaques de culture à repiquer est déterminé, les culots dilués dans du milieu complet et remis en
culîure.L·heure de la prochaine récolte est fixée à ce moment
Chaque lot de 50 ml de surnageant est filtré successivement avec 2 filtres (3 um puis
1,211m).Un filtre est utilisé pour 50 m!.

29
Le filtrat est centrifugé à 5000 t Imn penl1ant 10 mn dans des tubes en plastique de 50 ml.
Puis le culot est lavé J fois avec la solution de lavage dans des tubes Eppendorf (centrifugeuse
Microfuge; 2 mn).La conservation des mérozoïtes se fait à - 200 e jusqu'au moment de l'extraction
des antigènes.
En général 3 récoltes sont effectuées à partir d'une synchronisation.
2-2-1-3: Extraction des antigènes
Les tubes Eppendorf contenant les mérozoïtes sont incubés dans un bain de glace
pendant 10 mn.
150 }lI de la solution d'extraction sont ajoutés dans les tubes de la première récolte,
100 ~d dans ceux de la deuxième et 50 ou 25 }lI dans ceux de la 3ème récolte.
Les culots sont resuspendus avec une seringue de 1 ml adaptée d'une aiguille dont le
bont a été coupé et arrondi.lIs sont ensuite récuperés , les tubes rincés avec 100 }lI de solution
d'extraction et les liquides de lavageajoutés dans les culots destinés à une centrifugation de 10000 t
Imn pendant 10 mn avec une centrifugeuse (Eppendorf) à + 4°C (chambre froide).
Les surnageants Uaunâtre) sont prélevés et réunis dans un tube Eppendorf. 200 }lI de
solution d'extraction sont ajoutés dans les culots de centrifugation; aprèes resuspension, une
deuxième centrifugation de 10000 t/mn pendant JO mn est effectuée.
Le surnageant est prélevé puis centrifugé une 3ème fois et récupéré.Le culot est
constitué de pigments.
Les surnageants sont ultraceutrifugés 40000 t/mn pendantlh puis récupérés.
Le culot restant est composé de lipides Uaunâtre), de pigments et des membranes.
2-2-1-4 : Détermination de la concentration proteique de l'extrait
anligènique
L'extrait antigénique est dénaturé à 60°C dans du Tampon de Laemli 2 x .
5 !JI d'extrait sont ensuite déposés sur du papier acétate de cellulose en même temps que 5 }lI de
plusieurs concentrations en!1g de sérum albumine bovine (SAil): 25; 20; 15 ; 10; 5; 2,5 ; 1 ;
2,5 ; 0,5.
Les dépôts sont colorés avcc de l'amidoschwarlz pendant 10 mn. La décoloration est
réalisée avec un mélange d'acide acétique 1 méUlarloi.
La coloration de l'extrait est comparée avec celles de la SAB.

30
2-2-2: Electrophorèse en gel de polyacrylamide (PAGE-SOS)
Les plaques sont préparées et enduites de graisse sur les bords intérieurs avant le
montage.
Le SOS 0,1 % (2 ml) est additionné avec une pipetle dans le dispositif pour gradient et
relié aux plaques jusqu'au nive,lU requis puis le gel à 5 % est ajouté. Le tuyau reliant le dispositif
aux plaques est fermé.
Le gel à 20 % est préparé dans un récipient (bouteille) qui est relié au dispositif pour
gradient et situé en hauteur.
Mettre en marche. L'agitateur est mis en marche et la cassette se remplit jusqu'au niveau
désiré.
Le gel se polymérise au bout d'une heure.
Le SOS 0,1 % est enlevé et le gel supérieur ajouté à l'aide d'une pipette.La
polymérisation dure 30 mn.
Les plaques sont gardées à + 4°C après avoir été enveloppées sur du papier mouillé et
du plastiq ue alimentaire pour empêcher une contamination externe.
Les antigènes dénaturés à 60°C dans du tampon Laemli 4x sont déposés après le
mmltage de la plaque sur la cuve contenant le tampon de migration.
L'absence de bulles d'air sous la cassette est vérifiée.
Un courant de 100 volts est appliqué et la migration dure toute toute la nuit à +4°C
(chambre froide).J...e gel est enlevé quand la migration est suffisante.
Une coloration du gel au Coomassie est faite. Une photographie est effectuée pour
monlrer les différentes fractions anligèniques contenues dans j'exlrait de mérowïtes.
2-2-3 : Populations cellulaires testées.
L'étude de la rélxlI1se cellulaire T aux
antigènes de Pjàlciparum s'effectue sur
plusieW's types de populations cellulaires.
Il s'agit des cellules mononucléées, des lymphocytes T et des lymphocytes T deplétés
en cellules COS+ .
2-2-3-1: Cellules mononuc1éés
Les cellules mononuc1éées sont isolées à partir du sang périphérique hépariné en
gradient de densité 1,077.
Le sang total est dilué au 1/2 dans du RPMI tampon. 12 ml de Ficoll sont introduits
dans un tube conique de 50 ml. 22 ml de sang dilué sont déposés doucement sur le Ficoll puis le

31
tube conique est centrifugé à 1900 t /mn pendant 20 mn à 25° C. A la tin de la centrifugation' la
couche de cellules mono nucléées située à l'interface est récupérée et lavée 3 fois avec du RPMI
tampon; les cellules sont comptées et divisées en 3 parties:
-- une partie est réservée au test de Iymphoprolifération
-- une autre à la séparation des sous-populations lymphocytaires T,
--la demière à la préparation des cellules présentant l'antigène (monocytes).
2-2-3-2: Sous-populations Iympllocytaires T
Les cellules mononucJéées dans 0,5 ml de RPMI-tampon-Sérum de Veau Foetal
(SVP) 5 % sont déposées dans une colonne contenant de la laine de nylon et incubées à 37 oC dans
une étuve à CO pendant au moins 1 h .Cette colonne est constituée par une séringue de 2 ml
2
remplie de laine jusqu'au trait 1. lavée au préalable avec 2 fois lU ml de PBS hépès ensuite 2 fois
lU ml de RPMI tampon-SVF 5 % puis incubée pendant 3ü-40 mn à 37 oc.
La colonne est lavée 2 fois avec 10 ml de RPMI-SVF 5 % puis 2 fois avec 10 ml
RPMI-SVF lU %. Le liquide de lavage contenant les cellules '1' et une contamination de monocytes
est recueilli dans un tube conique de 50 ml.
Il est distibué dans des boites de Pétri qui sont incubées à 37° C dans une étuve à CÛ2
pendant 30 mn. Les monocytes adhèrent sur le plastique tandis que les lymphocytes T restent en
suspension dans le milieu. Une partie des cellules T récupérées est utilisée pour le test de
prolifération cellulaire, l'autre pour la séparation des lymphocytes T CD4+ par sélection négative.
Pour celà, on ajoute des billes magnétiques anti-CD8 selon le nombre de cellules: 20 III pour 1()6
cellules.Ainsi on recueille les lymphocytes qui ne sont pas fixés par les billes, c'est-à-dire les
cellules CD4+ en utilisant un concentrateur de particules.
2-2-2-3: Les cellules présentant l'antigène (monocytes)
Les cellules Illononucléées sont mises en contact avec la quantité necéssaire (20 III
pour J06 cellules) de billes anti-CD2 et anti-CDI9, ct incubées à + 4 oC pendant3ü-4U mn.
On efJl.'Ctue une agitation Ires douce toutes les 10 mn.
Les cellules (monocytes) sont récupérées comme indiqué ci-dessus et comptées avant
d'être incubées avec les antigènes: extrait de mérozoïtes à la température ambiante jusqu'au
moment de l'utilisation.

32
2-2-4 : Test de prolifération cellulaire in vi/ra
La mise en culture des différentes populations cellulaires s'effectue selon deux
moclalilés.
Les cellules mononucléées (monocytes, lymphocytes) sont mises en présence d'extrait
de mérowïtes (10 fIg/ml) et incubées clans une étuve à 37°C contenant 5 % CO:!.
Les sous-populations lymphocylaires (lymphocytes T, T CD4+) sont mIses en
présence de cellules présentant l'antigène (monocytes) et d'extrait de mérowïtes.
Les plaques sont ensuite placées dans une étuve à 37°C contenant 5 % Coz. La
thymidine tritiée ajoutée après 6 jours de culture est incorporée clans l'ADN des cellules en
prolifération, permettant ainsi de mesurer la radioactivité en coups par minute (cpm) au moyen
d'un compteur bêta à scintillation (Rack bêla, LKB).
2-2-5 : Dosage de l'interféron-y (Kit ELISA N° produit: DO 3 M, Holland
biotechnology, Leiden)
L' IFN-y produit par les lymphocytes T activés par les antigènes de mérozoïtes sont
dosés il1 vi/ra à partir de surnageant d'une culture de 6 jours.
Le dosage consiste à fixer un anticorps monoclonal de souris anti-lFN-y humain sur
une phase solide (microplaques) avant d'y ajouter le surnageant de culture contenant l'lFN-y.
Après fIxation de ce dernier, un complexe comprenant un deuxième monoclonal de souris
biotinylé et la stréptavidine conjuguée à la phosphalase alcaline sont ajoutés. Si il Ya présence
d'IFN-y dans le milieu de culture, le complexe est lié à la phase solide. L'adjonction d'un substrat
pernlet le développement d'une coloration proportionnelle à la quantité d'lFN-y.

33
Chapitre V . Typage dans le système HLA.
l) Introduction
L'identification des antigènes du système HLA est réalisée par la méthode sérologique
utilisant les plaques Térasaki chez 104 personnes.
2) Matériels ct méthodes
2-1
Matériels
2-1-[ : Réactifs
-RPMI tampon: 1 1
-RPMI lampon+sérum de veau foetal (SVF) 10 % ou 5 %
-Tampon Phosphate (PHS) + Hepes
-Eosine à ['eau 5 %
-GlutaraJdéhyde 25 % dilué à 0,5 % dans du PBS (SigmaR)
-Ficoll (Histopaque -1077)
-ACD-A 10 %
-PHS 0,01 M pH 7,4 -Citrate de Na 0,6 %
-Tris-Ca++ 0,2 M :
Trisma base (Sigma) (2,43 g)
CaC!" (l0 mg)
Eau distiUC'C (1 ()() ml)

34
Ajuster pH il 7,4 avec HCI
-Acridine Orange (Sigma) / Bromure d'Ethidium (Sigma) (AO/EB) :
Bromure d'Ethidium : 50 mg
Acridine Orange: 15 mg
Dissoudre dans 1 ml d'ethanol 95 %
Ajouter 49 ml de PBS .Aliqonts de 1 ml
-Solution Stock: Aliquots à -20°C à l'abri de la lumière
-Solntion de travail: dilution stock (1 ml) au [IlOème à+4°C maximum 1 mois
-EDTA 5 % en solution finale dans AO/EH
-Billes immunomagnétiques Dynal anti-classe 1 (anti-CD8) et allti-classe JI (dirigés contre un
épi tope de la chaine monommphique); billes DynatechR anti -eD4, anti-eD8 et anti-CDI9-
-Sérillgues Hamilton de 2 et 5 III
-laine de Nylon (Type 200 L Du PontR )
-Séringues et Aiguilles de différentes tailles
-Aimant pour séparation magnétique: Dynal MPC-6
2-1-2: Plaques HLA
-Plaques Térasaki commercialisées par One LambdaR :
Les plaques sont fixées avec des antisérums dirigés contre les antigènes HLA les plus
fréquemment retrouvés dans la population noire:
-HLA -ABC Black (72) Weil Tray (BL 72)
-HLA -DRW (DR -60 )
Les plaques ABC contiennenl :
-19 antigènes pour le locus A
-38 antigènes pour le lc'l:us B
-7 antigènes pour le locus C
Ces antigènes app.uticnncnt à la classe 1

35
Les plaques DR contiennent:
-15 antigènes pour le locus DR
- 6 antigènes pour le locus 00
Complément de lapin pour la classe 1et pour la classe Il
2-2 : Méthodes :
Le typage HLA s'éffectue sur les cellules mononucléées ou les lymphocytes T pour les
antigènes des locus A, B et C et sur les lymphocytes B pour ceux des locus DR et 00.
Deux méthodes ouI été utilisées:
- la méthode classique du National Institut of Health (NIH, Bethesda),qui utilise un colorant
d'exclusion,
- et celle utilisant la fluorescence des cellules marquées par des fluorochromes [85, 86J.
La nomenclature des antigènes HLA est celle adoptée par l'OMS [90].
2-2-1 : Méthode classique
2-2-1-1 : Séparation des cellules
Les cellules mononucléées sont séparées du sang total par gradient de densité (Ficoll)
Les lymphocytes T et B sont obtenus après incubation dans une seringue de 2 ml contenant du
nylon et filtration.
Après lavage de la colonne pour enlever les lymphocytes B, l'emboût de la seringue
est utilisé pour presser le nylon permettant ainsi de libérer les cellules B qui y sont fIxées. Cette
étape est éffectu:,~ JO fois avec du RPMI-SVF 10 %, les lymphocytes sont lavés et resuspendus
dans du RPMI tampon pour être prêts à l'emploi.
2-2-1-2 : Uti!isation de billes magnétiques
Les cellules mononucléées sont d'abord incubées à +37°C pendant 30 mn pour
éiiminer les monocytes adhérant sur le plastique et divisées en 2 parties: dans l'une, des billes
auti-CD4 et anti-{:D8 sont ajoutées et (bllS l'autre des anti-{:D4 et anti-{:DI9.
2-2-1-3: Micl1llymphocytotoxicité complément dépendante
Les cellules mises en contact avec l'antisérum sout lysées par perforation de la
membrane lorsqu'il y a activation du système complémentaire par le complexe Ag-Ac formé. Un

36
colorant d'exclusion permet de visualiser les cellules tuées.
2 III de suspension (1000-2000 cellules) sont mis en contact avec les antisérums
contenus dans la plaque HLA pendant 30 mn. 5 III de complément ABC ou DR,DQ sont incubés
pendant Ih pour HLA-ABC et pendant 2h pour HLA-DRfDQ. 5 III d'fusine à 5 % sonÎajoutés
pour colorer les cellules mortes qui seront fixées par JO III de glutaraldéhyde à 0,5 %. Le
pourcentage de cellules mortes est estimé à l'aide d'un microscope inversé.
2-2-2: Méthode avec fluorescence
2-2-2-1 : Séparation des cellules à partir du sang total
5 ml de sang sont prélevés sur une solution ACD--A 10 %ou héparine. Le sang est mis
dans de la glace pendant 15 mn.
100 !JI de billes Dynabeads auti-HLA classe Il ou anti-HLA classe 1 (anti-CD8) sont
ajoutés et le tube est agité délicatement pendant 5 mn. 5 ml de PBS citrate de sodium à 0,6 % som
ajoutés. Le tube est placé dans l'appareil Dynal MPC 6 pendant 3 mn. La totalité du sang est
aspirée en prenant garde de ne pas toucher la paroi au contact de l'aimant sur laquelle les cellules
sont fL'l:éeS ainsi que de ne pas tourner le tube sur lui-même. Le tube est retiré de l'appareil et mis
dans la glace. 5 ml de PBS cilrate de sodium 0,6 % sont additionnés La manipulation précédente
est répétée J fois. 5ml de PBS (sans citrate) sont versés dans le tube et les opérations précédentes
sont répétées 4 fois. Après la dernière aspiration du liquide de lavage, le tube est enlevé de
+
l'appareil. 100 !JI de solution tampon Tris Ca2
contenant 10 % de SVF décomplémenté est
ajouté. Le tube est gardé à + 4°C en attendant la distribution des cellules dans la plaque Térasaki.
2-2-2-2 : Microlymphocytotoxicité :
2 III de suspension de cellules som déposés dans chaque puits d'une plaque Térasaki
rapidement et en rechargeant 2 ou 3 fois la seringue de façon à éviter la sédimentation rapide des
billes et une répartition inégale dans les puits. L'incubation dure 20 à 30 mn à +22°C,
5 III de complémeut de lapin sont ajoutés et les plaques sont incubées pendant 2(}-30
mn à + 22°C.
2 III de solution de AO/EB contenant 5 % d'EDTA en solution finale sont additionnés.
suivi d'une incubation de 10-15 mn.
La lecture se fait au microscope inversé à l1uorescence, objectif 10. Elle peut-être
di fférée de 24 heures en conservant la plaque à +4oC à l'obscurité.
Les cellules vivantes présentent une l1uorescence verte, les cellules mortes une
fluorescence rouge.

37
Chapitre VI : Réponse anticorps aux antigènes de
Plasmodium fulcipurum
1) Introduction
Les plasmas des sujets sont titrés en immunoglobulines (lgG et IgM) par la méthode
ELISA qui consiste en une réaction Ag-Ac révélée par un substrat chromogène conjugué à une
enzyme.L'objectjf est d'apprécier la réponse anticorps en relation avec l'immunité et les antigènes
du système HLA.
2)
Titrage
immunoenzymatique
des
Immunoglobulines (lgG + IgM)
2-1 : Matériels :
-PBS pH 7,4
-PBS-Tween 20 0,05 %
-PBS-Tween 20-BSA, 1 %
-O-Tolidine (SigmaR) :
Dissoudre 5 mg de O-T dans 0,25 ml de N, N-diméthylformarrude (Sigma).
Ajouter 30 ml de tampon citrate pH 4-5 et 121.il de péroxyde d'hydrogène à 30 %
-H S0 4N
2
4
-Fab'2 anti-Fc des IgG et IgM humaines conjugués à la péroxydase (CappeIR)
-Plaqlles de microtitration (immlllon M.129B)
-Lecteur EUSA : Titertek Multiskan MCC/344
2-2 : Méthodes
Les plaques sont fixées pendant une nuit à +4°C avec une solution de 5 ~g/ml
d'antigènes de mérozoïtes dans du pBS à raison de 100 ~l par puits.
Trois lavages de 5mn avec du PBS-Tween sont effectués. 100 ~I de sérum ou plasma
dilués au 1/400 dans du pBS-Twccn BSA 1 % sont ajoutés, et les plaques incubées à +37°C
pendant 1 h.
Après 3 lavages de 5mn, 100 ~l de conjugué dilué dans du PBS-Tween-BSA 1 %
118.000, pour F(ab')2 anli-Fc IgG ct 1/4000, pour F(ab')2 anti-Fc IgM. Après une incubation de 1
li à 3TC, les plaques sont lavées 3 fois avec du PBS-Tween 20, avant que 100 III de substrat o-T
ne soient additionnés. Une incubation de 30 mn à l'obscurité et à la température ambiante permet
le développement d'une coloration jaune. La réaction est arrêtée avec 50 III de HzS0 4N. La
4
densité optique est mesurée à 450 nm avec un photomètre Titertek-Multiskan.

38
Chapitre VU: Analyse des antigènes de Plasmodium
Jalcipamm par immullotrallsfert :
1) Introduction
60 sérums ont été utilisés pour l'analyse des antigènes de Pjalciparum. Il s'agit de 30 sujets
développant unc réponse cellulaire l'élevée et 30 autres répondant faiblement.
2) Matériels et méthodes
2-1 : Matériels
-Cuve d'electrotransfert modèle semi-sec (Biolyon)
-Générateur de tension stabilisée de 12 ou 24 V (Biolyon)
-Nitrocellulose BA 85, référel1ce 4()l180 (Schleicher & Schull)
-Papier Whatman sans liant, rélérence 50 211 (Biol yon)
-Solutions Tampon:
T. anodique
T. cathodique
Tris
base
.
3,03 g
3,03 g
Glycine
..
14,4 g
14,4 g
MéthanOl
.
200 ml
SOS
.
1 g
Eau distillée qsp
.
1 litre
1 litre
-T13S pH 7,5 :
Tris
base
..
2,42 g
NaCI.
..
8g
Dissoudre dans 800 ml d'cau distillée
Ajuster le pH avec HCI, SN et compléter à un litre.

39
-TBS-T ween 0,1 %
TBS
.
999 ml
Tween
20
..
Iml
-TBS-Tween 0,1 % - lail écrémé.15 % =solution de blocage
Lait écrémé en poudre
.
15 g
TBS-Tween
0,1
%
.
qsp 100 ml
Fillrer.
-Fragment Fc d'Immunoglobulines de chèvre anti-lgG humaines conjugué à la Phosphatlse
Alcaline (Capr·~l. OrganonR).)
-Tampon Diéthanolamine pH 9,5 :
Diéthanolamine
.
l,OS g
Chlorure de Magnésium lJexahydraté
.
100 mg
Dissoudre dans 90 ml d'eau distillée
Ajuster le pH avec HCI5N et compléter à 100 ml.
-Substrats: BCIP (5-Bromo-4 ehloro-3-indolylphosphale) et NBT ("Nitro Blue Tetrazolium").
-Solution de Révélation: 1 goutte de BClr + 1 goutte N BT dans 10 ml de Tp diélhanolamine.
-Pla(jues de polystyrène à 20 puits.
2-2
Méthodes
2-2-1 : E1ec!Totransfert
Sous l'effet du champ électrique, les protéines chargées négativement dans le gel,
migrent vers le côté anodique où est placée une membrane absorbante qui les retienl
6 découpages de papi cr Whatman et un de nitrocellulose sont préparés selon les
dimensions du gel. Il faut utiliser des gants de polyvinyle pour éviter le contlct avec la
nitrocellulose elle dépôt de lipoprotéines des doigts.
3 découpages de papier Whatman en plus de celui de la nilrocellulose sont placés dans
le tampon afJodiquc et les !Tois autres dans le tampon cathodique.

40
Le montage est effectué tout en évitant toute présence de bulles d'air entre les
différentes couches et de sorte que le gel déborde légèrement.
Une tension stabilisée de 24 volts est appliquée et le nombre suffisant de masselottes
est placé en tenant compte de la progression limite de l'aiguille de l'ampère-mètre ainsi que la
résistance du gel.
Le courant est arrêté après 3 heures. Le"sandwich" est sorti, les électrodes sont
aussitôt essuyées à l'eau distillée.
La nitrocellulose est récupérée puis, découpée en piste de largeur choisie placée
directement dans du TBS-Tween 0,1 %, pH 7,5.
2-2-2 : Imll1unodétection des antigènes transférés:
Les antigènes adsorbés par la nitrocellulose sont reconnus par les anticorps sériques
éventuels sur lesquels vient se fix.er une anti-globuline humaine conjuguée à la phosphatase
alcaline.
La révélation se fait par un substrat chromogène de l'enzyme.
Les pistes sont incui:h.~s avec la solution de blocage pendant 1 h. DeUx. rincages sont
éffeetués avec le TBS-Tween avant les 3 lavages de 5 mn. Les dilutions de sérum au 1/500ème
sont ajoutées et l'incubation dure 1 11 de temps. Le rincage est répété comme précédemment, suivi
de lavage. Le conjugué Fe anti-IgG humaines dilué au l/5000ème est ajouté pendant 1 h, rinçage
et lavage sont répétés.
La révélation se fait avec la solution de Révélation.

2EME PARTIE: RESULTATS

41
2EME PARTIE: RESULTATS
Chapitre 1:
Analyse statistique des résultats
Chapitre Il : Dislrihution phénotypique des sous-populations lymphocytaires
Chapitre III :Réponses celluhlires T aux antigènes de mérozoïtes
1) Introduction
2) Paramètres choisis pour évaluer la réponse lymphocytaire
3) Sujets Bons Répondeurs "BR" ct Mauvais Répondeurs "MR"
4) Influence de l'âge sur les Bons ou Mauvais Répondeurs
5) Influence du sexc
6) Nombre moyen d'accès palustres en fonction des BR ou MR
7) Influence de la présence et du nombre de parasites
(l'faicipamlll) dans le sang
Chapitre IV : Réponses des sous-populations lymphocytaires aux antigènes de
mérozoïtes.
1) ln troduction
2) Résultats
Chapitre V : Anti~ènes du système IILA
1) ln troduction
2) Les antigènes de classe 1 (HLA-A, B, C)
3) Les antigènes de classe Il (HLA-DR, DQ)

42
Chapitre VI
Héponses anticorps
l) ln troduction
2) Titre anticorps moyen
3) Inllucnce de l'âge sur la réponse anticorps
4) Influence du sexe
5) Titre anticorps et nombre moyen d'accès palustres
6) Inlluence de la présence ou l'absence de parasites
Chapitre VII
Analyse des antigènes de rnérozoïles par Irnrnunotransfert
1) Introduction
2) Résultats
Chapitre VIII
Réponses IJlllphocytaires et anticorps
1) Introduction
2) Résultats
Chapitre IX
Hestriction génétique (lILA) et réponse anti-P.falciparum
1) Introduction
2) Antigènes HLA associés à la réponse cellulaire aux antigènes de
mérozoilcs
3) Antigènes HLA associés à la réponse anticorps
4) HLA et accès palustres
Chapitre X
Etude longitudinale de la réponse cellulaire.
1) Introduction
2) Résultats

43
Chapitre! : Analyse statistique des résultats
L'ensemble des données ont été introduites dans le logiciel 4ème Dimension adapté au
MacintoshR puis exportés dans un programme statistique.
Les tests statistiques suivants ont été utilisés: le test ( de Student non apparié;
l'analyse de variance (Anova), le test X2 de Pearson et la table de contingence. Chaque lest est cité
à l'endroit où il est choisi.
Le programme statistique statView TM5l2+ (Abacus concepts, Inc.,CaIabas, CA.) est
lltlisé pour l'analyse des données. Les valeurs de probabilité inférieure à 0,05 sont considérées
comme significatives.

44
Chapitre II : Distribution phénotypique des sous-
populations lymphocytaires
La répartition phénotypique des sous-populations lymphocytaires pour les anticorps
monoclonaux étudiés est présentée dans le tableau Il.
Celte distribution est généralement retrouvée chez les sujets apparamment en bonne
santé.
Tahleau 1r : Analyse phénolypiquL' I~ IIlph(){'.\\ taire dl''! illdh-idus (6-70 ilIlS)
rirant l'II zone d'holol'Ildélllicilé palustre (II :;:, 50)
5965/~1
2S":O/pl
47,.1 %
415/~1
14,7 %
2292J~1
80,7 %
(± 1258)
(± 757)
(± 6.9)
(± 160)
(± 4.2)
(± 741)
(± 5,))
CD4 t
R:ltÎo CD.J/CD8
CD~+ C029+
I! 19htl
42.8 %
550/~1
19.3 %
2,3
567/~1
d7.? % des CD-l+
601/~1
49.9 % des CD.J+
(± 262)
(± 5.5)
(± 174)
(± 3.·1)
(± 0.51
(± 133)
(± 7.6)
(± 197)
(± 10.5)

45
Chapitre lU : Réponses lymphocytaires Taux
antigènesde mérozoïtes
1) Introduction
Les antigènes de mérozoïtes ont élé testés en réponse lymphocytaire in vitro chez 114
sujets vivant à Dielmo. Les différents fragments antigèniques contenus dans l'extrait de mérozoïtes
sont présentés sur la photographie du gel (figure 7). Les bandes sont très nombreuses, mais les
plus interéssantes sont la 83,42,36, et les fractions inférieures à 30 kDa .
2) Réponse lymphocytaire
2-1 : Paramètres chuisis pour évaluer la réponse
Pour quantifier la réponse lymphocytaire, deux paramètres sont utilisés: l'Indice de
Stimulation (IS) et le Ô cpm.
L'indice de stimulation est le rapport du nombre de coups par minute (cpm) des puits
contenant l'antigène à tester sur le nombre de cpm des puits sans antigène.
cpm (antigènes)
IS = - - - - - - - - - -
cpm contrôle sans antigène
Le Ô cpm est la différence entre le nombre de cpm des puits avec antigènes et celui des
puits sans antigènes (contrôle).
La réponse lymphocytaire est d'habitude évaluée par un de ces paramètres. Mais pour
avoir une population homogène, ne contenant pas de valeurs trop dispersées selon que l'on utilise
J'lS ou Je Ô cpm, nOlis avons effectué trois types de regression entre l'IS et le Ô cpm (figures 8,
9, 10).
Ainsi il n'a été conservé que les valeurs pour lesquelles les résidus de la regression
IS/ô cpm sont inclus dans un intervalle de confiance à 85 % autour de leur moyenne (Tableau lll).

46
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68
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E5!l'
-
,
',~,
~ - 43
\\<.0
30
\\<.0
25
kD
-
-
~
- 21
\\<.0
",
ff/liZP
-
17,8 '\\<.O
C!lSlIl'
- 14,3 \\<.0
1
2
3
4
5
6
Fig. 7 - Séparations
des
Fractions protéiques
de l'extra i t
antigénique
de
mérozo'tes.

47
y
= 1.543. + 4.887, R·.quarad: ,45
1 2
1 0
0
Cl(,
00
i:'
8
0
III
E
;:;:
0
0
a.
6
U
Fig. 8
0
><
4
Intervalle de
+
confiance à 95'1
:s
2
(n = 114)
0 --0'-"-'-'000 . ··_--····--_··--·-00-
·2
·2
. 1
0
2
3
4
5
6
In(x) 01 ISlnero
y
= 1.224> + 5.738, R·.qu"rad: .565
12
0
1 0
db
00
Fig. 9
0
8
0
ti;
Intervalle de
E
;:;:
confiance à 90%
a.
6
u
(n = 104)
0><
4
+
~
2
0 "--'0 ..................... .........................-
......._... __......_-
·2
. 2
. 1
0
2
3
4
5
6
ln (x) 01 ISmero
y
= 1.275.
+
5.723,
R·.qu"red:
.594
o
1 0
Cl(,
cE3~O~
Fig. 10 :
o
8
o
.t§> ocB
o
Qi
Intervalle de
E
;:;:
o 0
confiance à 85%
a.
6
U
(n = 99)
o
><
4
+
2
0 . - -
.
..................................................__. _ - - - - - - - - - +
. 2+-~-.,--~-1-_-,.-_-r-_--,-~--,-~---r-~-+
·2
·1
Ü
2
3
4
5
6
In(x) 01 ISmero

48
2-2 ; Sujets Bons Répondeurs "BR" et 1\\lauvais Répondeurs "MR"
Selon la réponse obtenue, deux groupes de Répondeurs ont été distingués.
Les sujets développant une réponse lymphocytaire élevée sont appelés Bons
Répondeurs (BR) et ceux présentant une réponse faible, Mauvais RépomJeurs (MR).
Le tableau [V présente les critères de choix des BR et MR.
La réponse lymphocytaire varie significativement entre les deux groupes avec un
intervalle de confiance de 95 % (Test de Fisher ).
Le phénotype des lymphocytes qui prolifèrent a été déterminé. Il s'agit de cellules y;Ô+
Vy9+ qui au jour Jo représentaient en moyenne 2 % chez tous les sujets mais après 6 jours de
culture en présence des antigènes de mérozoïtes se retrouvent à 54 % cirez les BR et 3 % chez les
MR.
Les paJamètres suivants sont étudiés en fonction des groupes de répondeurs. Il s'agit
de l'âge, du sexe, du nombre moyen d'accès palustres et de l'influence de la présence de paJasites.
2-3 ; Inrluence de l'âge sur les Bons on Mauvais Répondeurs.
La moyenne d'âge des sujets étudiés est de 18,9 ± 1,6 (1,5 - 84,S).
La répaJtition des classes d'âge en fonction de [a réponse lymphocytaire est présentée
dans la tableau V.
lin y a aucune association signifieative entre un groupe de répondeurs et une classe
d'âge donnée ( Test X2 ; P > 0,05).
Toutefois, la réponse lymphocytaire est signifieativement associée à l'âge (p = 0,00(1)
si l'on ne tient pas compte des groupes de réJXlndeurs. Elle augmente avec l'âge.
2-4 ; Innuence du ~xe :
La réponse aux antigènes de mérozoïtes n'est pas influeneée PaJ le sexe des donneurs
(tableau VI).
2-5 : Nomhre moyen d'accès paluslres en fonction des UR et MR
Le nombre moyen d'accès palustres des sujets étudiés a été noté sur une période de
122 jours. Le nombre moyen d'accès n'est pas lié aux BR ni aux MR ( Test X2 ; P =0,1).
Le nombre moyen d'accès vaJie significativement en fonction de l'âge toutes classes
confondues (p = 0,000 1). La comparaison des différentes classes donne une différence
significative au risquc de 5 % entre les classes 0-9 ans et 10-19 ans et ~ 20 ans. Par contre, il n'y
a aucune différence entre 10-19 ans et ~ 20 ans (Anova).

49
2-6 : Innuence de la présence et du nomhre de parasites (P.fa/ciparum)
dans le sang.
Le tableau VII présente les BR et MR en fonction de la présence ou l'absence de
parasites.
L'influence de la présence ou l'abscence de P.falciparwn dans le sang au moment du
prélèvement a été analysée par le test X2.
I! n ya pas de liaison entre:
- les BR et les sujets non parasités (p = 0,9 )
- les BR et les sujets parasités
(p = 1)
- les MR et les sujets non parasités (p = 1 )
- les MR et les sujets parasités
(p = 0,4 ).
Un y a pas de différence significative entre BR et MR chez les sujets parasités (p =
0,9). Cependant le nombre de trophozoïtes par III de sang est significaùvement associé au groupe
de MR (p = O,UOOl) mais ce n'est pas le cas avec les BR (p = 0,2).
Tableau III
Nomhre de sujets en fonction de l'intervalle de conlïance
Moyenne (X)
Nombre de sujets
Intervalle de confiance (IC %)
-1,960 ~ X ~ 1,960
114
95
-1,645 ~ X ~ 1,645
104
90
-1,44 ~ X ~ 1,44
99
85

50
Tableau IV
Réponses I)'mpho<:ytaircs T in l'ilro aux antigènes de mérozuïtes ;
nombre dc Bons et l\\'lam'ais Répondeurs en fonction des Indices de Stimulation et
des !'J. cpm.
UR·
l\\lR
(n=53)
(n=46)
**\\5
19±3 (4,26-151)
2,06 ± 0,12 (0,3 - 4,19)
!'J.cpm
13481 ± 1373 (2460-50694)
710 ± 93 (0 - 2193)
Pourcentage
53,5
46,5
Age moyen±ET
25,4 ± 2,6
11,5±1,3
* la différence entre BR et MR est significative à 95 % (Test de Fisher).
** écart-lype.
Tableau
V
Réponse
lymphocytaire
T
in
l'ilro
aux
antigènes
de
mérozuïtes.l'ourcentagc dcs BR ou l\\lR cn fonction de l'âge.
0-9 ans
10-19 ans
;:>: 20 ans
Total
*MR
54
27
19
100
BR
19
26
55
100
* Il n'y a pas d'association significative entre BR ou MR et une classe d'âge donnée (Test X2,
p > 0,05).

51
Tableau V1
Répartition en pourcentage des BR et MR selon le sexe
*Masculin
Féminin
(n=45)
(n=54)
BR
56
52
MR
44
48
*11 n y a pas de différence significative entre les hommes et les femmes (Anova ; p =0,7)
Tableau VII : Nombre de UR, MR et présence ou absence de parasites
BR
1\\1R
Parasi tes (-)
32
11
Parasi les (+)
21
32

52
3) Production d'interféron-y in vitro
L' IFN-y a été dosé chez 29 Bons Répondeurs et 27 Mauvais Répondeurs après 6 jours de
culture des lymhocytes en présence d'antigènes de mérowïles (tableau VIII).
La secrétion d'interféron y est significativement plus élevée chez les BR que chez les MR (Anova,
p = 0,00 1).
6 BR sur 29 et 23 MR sur 27 ne produisent pas des taux d'interféron-y détectables dans les
surnageants de culture.
Tableau VIII: Taux d'I.FN y des BR et MR
BR
MR
(n=29)
(n=27)
"Moy ±Er. (pglml)
100,58 ±28,6
0,63 ± 0,312
*La différence est signilïcative enlre les BR elles MR.(Anova, p = 0,001)

53
Chapitre IV : Réponses des sous-populations lympho-
cytaires aux antigènes de mérozoïtes.
1) Introduction
La réponse lymphocytaire T in vitro à des antigènes est le plus souvent étudiée à partir
de cellules mononucléées du sang périphérique. Ce choix présente de très nombreux avantages
entre autres, le fait que ces cellules sont composées de tous les éléments nécessaires à la réponse
lymphocytaire.
L'intensité de la réponse en coups par minute n'est pas la même selon que l'on teste
des cellules mononucléécs,des lymphocytes T ou des lymphocytes T déplétés en cellules CDS+
Que signifie un nombre de cpm élevé du point de vue fonctionnel?
Ainsi nous avons voulu comparer la réponse de ces différentes populations cellulaires
en présence d'antigènes de mérozoïtes.
2) Résultats
Les résultats sont présentés dans le tableau IX.
L'analyse de variance (Anova) ne montre qu'une seule différence significative entre les
cellules mononucléées et les lymphocytes T déplétés en cellules CD8+.
Tableau
IX : Comparaison de la moyenne des indices de stimulation des
réponses lymphocytaires in vitro aux antigènes de mérozoïtes chez 13 sujets.
*Cellules mononucléées
Lymphocytes T
Lymphocytes T déplétés en
cellules CD8+
Moy.± $ET
5,3 ± 1,4
28,9 ± 7,1
36,6 ± 16,1
* Différence significative au risque de 5 % entre la moyenne des IS des cellules
mononuclœes et des lymphocytes T déplétés en cellules CD8+.
$ Ecart-type

54
chap.itre V
Antigènes du Complexe Majeur
d'Histm:ump~!tj,IJHHéchez l'homme (HLA)
1) Int roollctioll
Les antigènes du système H LA (Hulllan Leucocyte Antigen) de classe 1 et Il ont été
déterminés chez 104 habitants il. Didll1o.
Cetle étude a pour but:
- de connaître la distribution des antigènes HLA dans une population vivant en zone
d'cndémic palustre,
- d'étudier l'existence d'une association entre ces antigèncs et l'immunité à médiation
cellulaire cl/ou humorale anti-PlüJFnodiwll jalciparwn.
2) Antigènes HLA de classe J (HLA-A, 8, C)
Le tableau X rrésente l'cnsemble des spécificités HLA rencontrées dans la population
de Dielmo.
Les antigènes détcrminés par Illicrolymphocytotoxicité dépendante du complément et
leur fréquence sont présentés dans les tableaux XI ct XII.
Le tableau XI résume les spœifieités HLA classe 1.
Les antigènes HLA-A les plus représeutés sont: A2, AW33, A 30, AW68 et A23. Il
n'a pas été retrouvé l'antigène A25, et les antigènes IILA-AW66, A32 sont très rarcs.
us antigèm:s HLA-13 les pins représentés sont: BW53, B35, BW58, 818 et 88.
Les antigènes HLA-BW71, 13W78, 13W48, 8W60, BW55, BW56, 839, BW77,
13W62, B45 et BW67 n'ont pas été retrouvés.
Les antigènes HLA-ilW~2, il44, il13, BW75, BW50, B27, B37, BW47 sont très
rares.
Les antigènes HLA-C les plus fréquents sont: CW4, CW6, CW7 et CW3. l.~s
antigènes CW 1, CW8 et CW II sont retrouvés rarement

Tableau X : Spécificités HLA retrouvées chez les habitants de Dielmo
HLA

A
8
c
DR
Da
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
4200
A2
B2l,BW53
DRl,DRWI1(5),DR7,DRW52
DQWI,DQW3
4202
A2
B51
CW4,6
DR3.DRW 13(6),DRW52
DQWI,DQW3
4203
A2An
B51
DR9,DRW53
DQW3
4204
A23
B35
CW2,CW6
DRW52
DQWI
4212
AW36
B35
DR9.DRWI3,DRW52,DRW53
DQW 1,DQW2,DQW3
4213
A30
BW53
CW6
DR9,DRWI3,DRW52,DRW53
DQWl,DQW2
4214
A23
B8,B44
CW2,CW4,6
DRWII(5).DRW52
DQW2,DQW3
<.n
or.
4215
BW4,BI7
CW7
DR 7,DR9,DRW8,DRW53
4217
Al
BW58
CW3
DRWII(5).DRW52
DQWI,DQW3
4219
A29
BW58
CW7
DRWI1.DRWI4,DRW52
DQW3
4233
BW58.BW4
CW2
DRW 11(5),DRW52,DR W53
DQWI,DQW3
4224
AIAIO
B8
CW3
DR9.DRW6,DRW52,DRW53
DQW3
4226
A2.A24
BW53,BW59
CW4,6
DR3.DR9,DR W52.DR W53
DQW2
4227
AW33AW68
B18,BW64,B35
CW8
'ND
ND
4234
A30_>\\W68
BW58
CW2
ND
ND
4236
ND
ND
ND
DRWll(5).DRW52
DQWI,DQW3
4238
AIO
BW53
CW4
DR9.DRWII.DRW52.DRW53
DQW2,DQW3
4250
A2
BW4
ND
ND
4251
AIO
BW59
CW4,6
DRI,DR9,DRWI4(6),DRW52,DRW53
DQWl,DQW2.DQW4
4363
A26.A30,AW69
B38,BW47,BW57,BW63
ND
ND

Tableau : X (suite)
4364
Ali ,A23,A26,A31,AW36,AW69
B 18,B44,B49,BW57.BW63,BW75
4378
A31
B7,BI8
DRWII(5),DRWI4(6),DRW52
DQW3
4379
AW33,W30,AW68
B35
CW7,CW8
DRWI5(2)DRW52
DQWI
4381
AIO
B8
CW3
DR3DR9,DRW52
DQW3
4397
AW69,A31
BW58
CW8
DRWI4(6)DRW52
DQW1.DQW3
4401
A2,A23
BW53
CW2,CW4,6
DR9,DRW52,DRW53
DQW2
4404
AW69
BW53
CW4,6
DR4DRW 14(6)DRW52
DQW1.DQW4
4408
A2,A26
BW58,B18
CW7
DRWlO,DRWI4(6),DRW52
DQWl
4409
A23,A26,All.AW68,AW74
88,B49
CW3,CW7,CW8
DR4DRWll(5),DRW8,DRWI4(6)DRW52
DQW3
4410
A2
835
CW2,CW7
DRWI7(3),DRW 14(6)DRW52
DQWl
4411
AJO
BW53,835
CW4,CW8
DR9,DRW53
DQW2
4412
AW33,AW68,A30
BW53,835,837
CW2,CW4
DR9,DRW 14(6)DRW52
DQW2.DQW3
'"'"
4414
A2,AW33,A W68,A31
B8,BW57
CW3,CW7
DRW11(5),DR7,DRW52DRW53
DQW2.DQW3
4415
AW33,A26,AW36,AW68,A32,A29
8W58
CW3,CW4,CW8
DRWIl(5),DR9,DRW52.DRW53
DQWl.DQW2
4416
A23
BW53,B7,835
CW4,6.7
DR9,DRWI4(6)DRW52,DRW53
DQW2.DQW3
4417
AI,AW74
B7,B17
CW3,CW7
DR4.DRWll(5),DRW8.DRWI3(6),DRW52
4418
A2
CW2
DRW 17(3),DRWI4(6),DRW52
DQWI
4419
A2
B35
CW4,CW6
DRW 18(3).DRWI4(6).DRW52
DQW2.DQW4
4420
A23,A26,A W33,AW68.A30
88
CW2,CW3
DRW 18(3).DRW 14(6),DRW52
DQW1,DQW3DQW4
4421
A30,AW68
BW53.B35
CW4.6
DR W 11(5),DR9.DRW52DRW53
DQW2.DQW3
4422
AW33,AW69
BW53.8W65.B 18,B27
CW4,CW8
DRW 16(2),DRW 18(3)DRW 14(6)DRW52
DQW1DQW3DQW4
4425
AW34,AW68,A29,A31
BW42,B35,B38,B 18
CW4
DR9,DRWI8(3),DRWI4(6),DRW52DRW53
DQW2
4426
Al,A29
88
CW7
DR4,DRWIl (5)DRWI5(2)DRW53
DQW1.DQW3
4210
AlO
B13,BW54
CW I,CW7,CW 11
DR4,DRWIJ(5)DRWI7(3)DRW52
DQW3
4428
A l,AW68,A31
BW53.B8.BW64.B '8.B35
CW4
DRWI4(6)DRW52
DQW3'

Tableau X : (suite )
4240
A3,AlO
B7
CW7
DRWl4(6),DRW52
DQW1,DQW3
4431
AIOAW68
BW53,B8,B35
CW3,CW4,6
DR9,DRW52,DRW53
DQW2,DQW3
4230
A2
B49,BW53
CW4,6
DRW 14(6),DRW52
DQWl,DQW3
4433
A2,A1O
8W53
CW7
DR4,DRW 11(5),DRW14(6),DRW52
DQW3
4434
AW33
8W57.BW65
CW3,CW8
DRW11(5),DRW52
DQWl
4246
AW68
B49
DR9,DRW52
DQW3
4263
A30
8W6
DR 1,DRW11(5),DRW52
DQWI,DQW3
4260
A2A30
BW6
DRW52
DQW2.DQW3
4241
AW33
88,BW53
CW3,CW5
DR9,DRW52
DQW3
4237
Al
B8,835
CW4
DRWl4(6),DRW52
DQW1,DQW3
4248
A2A23
B51
DRWI4(6),DRW52
DQWl,DQW3
U".
....
4245
A2,A3!
BW53
DRWI4(6),DRW52
DQWI,DQW3
4278
AW33,AW34,A30
B35,BW64,8W41
DR9,DRW14(6),DRW52.DRW53
DQW2,DQW3
4448
AW33.AW34,AW68
B35.B38
CW7
DR9,DRWI4(6),DRW52.DRW53
DQWl
4279
A2
B18.BW50
CW2,CW4,CW6
DRW 15(2).DRW 17(3),DRW53
DQW2.DQW3
4451
A2,A31.AW66
B18.8W53
CW2.CW4,CW6
DRW 17(3),DRWl4(6),DRW52
DQW!.DQW2
4452
AI0AW33
835.BW4l
CW4
DRW11(5),DR9.DRW13(6).DRW52,DRW53
DQW2,DQW3
4453
A2,A3!.AW33.AW69
835,BW64.8W58(5Y)
CW4
DRW 15(2),DRW 17(3),DRW53
DQW2,DQW3
4454
A2AW33
8W54,8W58.B35
CW3,CW4
DRWl1(5),DR4,DRW8,DRW 14(6),DRW52
DQWI,DQW3
4455
A2,AW33
B35,BW58
CW3,CW4
DRW 11(5),DRWI4(6),DRW52
DQWl,DQW2
4244
A2A30
8W53,BW65
CW4,CW6,CW8
DRW 11(5),DRW 13(6),DRW52
DQW3
4284
AD
87
CW2,CW7
DR3,DR4,DRW52
DQWI
4243
A2
B35,I3W53
CW4
DR7,DRW53
DQW2
4222
Al,A30
B49,8W53
CW4,CW6.CW7
DRW15(2),DRW 11(5),DR4,DRW 13(6)
DQWI,DQW3

Tableau X: suite
4275
Al.
8W53
CW4
DR7,DRW53
DQW2
4280
AlOA30
835,8W65
CW4,CW8
DRWll(5),DRW52
DQW3
4270
Al.4,A30,AW33
835,8W53
CW4,CW6
DR9,DRWll(5),DRW52,DRW53
DQW2,DQW3
4465
AIOAW33
8W58(SY),B35
CW4
DR4,DRW52
DQW3
4265
AW33
851,858
CW3,CW8
DRW8,DRW 11(5),DRWI4{6),DRW52
DQWl,DQW3
4361
Al.A30,AW68
B 18,835,8W53
CW4
DRW 13(6),DRW52
DQW3
4369
AW68
835,8W65
CW6
DRWI8(3),DRW52
DQW1,DQW4
4365
AW33A31,AW36,AW68
8W58,8W65
CW3,CW8
DR9,DRWI4(6),DRW52
DQWl,DQW2
4471
A2.A23
835
CW4
DRI,DRWI7(3),DRW52
DQWI,DQW2
4398
Al
8W4
DRWl4(6),DRW52
DQWI,DQW3
4377
A23
8W58(y)
CW4
DRW52
DQWI,DQW3
'"
cc
4387
Al.A23
8W63,849
-
DRWI4(6),DRW52
DQWl,DQW3
4255
AIOA30
8W53
CW4
DRW52
DQWI,DQW3
4371
8W42,BW53
CW4,CW5
DRW8,DRW 14(6),DRW52
DQWI,DQW3
4482
A31AW33
8W65,8W58
CW8
DR7,DRWI4(6),DRW52
DQWI,DQW2
4389
Al.3A26.AW36
8W65
CW8
DRI,DR9,DRW53
DQWI
4380
AW68
8W65
DRWI4(6),DRW52
DQWI
4393
A2A30
8W53
DRW 18(6),DR9.DRW52
DQWI,DQW3
4395
A3A30
835.8W57
CW3.CW6
DR4,DRW53
DQWI,DQW3
4402
Al.
8W6
DR9,DRWI4(6),DRW52.DRW53
DQWI,DQW2
4489
AW68
8W22,835
CW6
DRW52
DQWI
4367
A30
818,835
CW4,CW5
DRW 17(3),DRW52
DQWl,DQW2
4405
Al..A23
835
CW2.CW7
DRW 17(3),DRWI3(6),DRW52
DQWI,DQW2
4406
AI
835,849
CW6,CW7
DR~,DR9.DRW J5.DRW53
DQWI,DQW2,DQW3

Tableau X: suite et fin
4258
AW33
BW53
CW6
DRW8.DRW52
4229
BW53
CW6
DR7.DRW8.DRW52.DRW53
DQWI.DQW2
4267
A2,A24.All
B8,BW53.BW59
CW3,CW6
DRWII,DR9,DRW52
DQW4
4368
A30
BW53
CW3
DRl,DRW52
DQWI,DQW3
4363
AW34
BW58
CW7
ND
ND
4372
AW33
B38.BW58
DRW52
DQW3
4376
AW33
B51
CW4
DR7,DRW52,DRW53
DQWl,DQW3
4257
AW69
BW52,BW58
DR4,DRW52,DRW53
DQWI,DQW3
42~2
A23AW33
BW52,BW63,B35
CW6,CW7
DR9.DRW52
DQW2
4259
AIIAW33
B18,BW58
DRW52
DQWI,DQW3
4385
A30
BW58
DRW52
DQWI
'"
4261
A2
B18.BW53
CW2
DRW 17(3),DRW14(6),DRW52
DQWl
'"
4221
A31
B35
DR9.DRW52
DQW3
4288
AIAW33
Bl8
CW2
DRWll(5).DRW52
DQW3
4269
A30
BW52,BW58
DRWI5(2).DRW52
DQWl,DQW3
4396
A2AW74
BW53
CW2
DRWI 7(3),DR WI4(6).DR W52
DQWI
4220
Bl7
CW5.CW7
DRWl8,DR9,DRW52
DQW3
4264
ND
ND
ND
DRW8.DRWI4,DRW52
DQW3
4388
ND
ND
ND
DRl,DR7
DQWl
4370
AW68
BI8,BW53
DRW52
DQWl
• ND: Non Determiné.

6U
Tableau XI: Fréquence des anligènes lILA-A, n, C chez 10~ hahilanls de
Dielmo
Locus
Anligène
Nomhre
PourCenlal!e
AI
Il
10,5
AW36
4
3,8
A2
31
29,8
A3
2
1,9
A23
14
13,4
A24
3
2,8
A26
7
6,7
AW34
2
1,9
IlLA·A
AW66
0,9
AW33
24
23
Ail
4
3,8
AWG8
16
15,3
AW69
7
6,7
A29
3
2,8
A30
21
20,1
A31
10
9,6
A32
0,9
AW74
3
2,8
U51
5
4,8
OW52
3
2,8
13W53
32
30,7
8W58
3
2,8
137
5
4,8
I3W42
0,9
138
9
8,6
I3W59
3
2,8
044
1
0,9

61
Tahleau XI : suile
IILA-Il
1313
0,9
13W64
4
3,8
DW65
8
7,6
OW63
4
3,8
IJW75
0,9
U38
2
1,9
IJW57
5
4,8
13W5B
1(;
15,3
IJ 18
14
13.4
l14'i
7
67
lJW50
0,9
U'yV54
2
1,9
U27
0,9
1335
28
26,9
1337
0,9
BW47
0,9
BW41
2
1,9
CWI
0,9
C\\V2
14
13,4
CW3
17
16J
CW4
35
33,6
IlLA-C
CW5
4
3,8
CW6
23
22,1
CW7
19
18,2
CWB
0,9
CVlII
0,9

62
3) Antigènes HLA de classe Il (HLA-DR, DQ)
Le tableau XlI résume la distribution des locus DR et DQ dans la population de
Dielmo.
Les antigènes HLA-DR les plus représentés sont: DRW52, DRW14 (6), DRW53,
DRW Il (5), DR9 et DR4.
Seul l'antigène HLA-DRW 12(5) n'a pas été retrouvé avec le panel que nous avons
utilisé.
Les antigènes HLA-DRW 10, DRW 16 (2) sont très rares.
Les antigènes HLA-DQ les plus fréquents sont: DQW3 et DQWI. Seul l'antigène
DQW4 n'est pas retrouvé fréquement.
4) COlIJparaison de lu fréquence des antigènes IILA-A,n, C
retrouvés à Dielillo et en Gambie
Le village de Dielmo (Sénégal) a une composition ethnique différente de la population
gambienne sur laquelle une étude du système HLA a été effectuée.
Nous avons voulu savoir si la distribution des antigènes HLA était similaire dans les
deux études bien que les populations sont ethniquement différentes.
La répartition ethnique de Dielmo est la suivante: sérère 78 %, Mandingue 13 % et
divers 9 % et celle des travaux de Hilll37J est de: Mandingue 42 %, Jola 14 %, Wolof 14 % et
Peulh 12 %.
Le tableau XIII résume les fréquences obtenues dans les 2 études pour les mêmes
antigènes et par la même méthode sérologique.

63
Tableau XII
Fréquence des antigènes IILA-DR, DQ chez 104 habitants de !),' .!.L
Locus
Antigène
Nombre
Pourcentage
DRI
7
6,7
DR4
12
Il ,5
DR7
8
7,6
DRW8
9
8,6
DR9
28
26,9
DRWIO
0,9
DRW 11(5)
27
25,9
IILA-DR
DRW 13(6)
7
6.7
DRW 14(6)
35
33,6
DRW 15(2)
7
6,7
DRWI6(2)
0,9
DRWI7(3)
Il
10,5
DRWI8(3)
6
5,7
DRW52
86
82,6
DRW53
29
27,8
DQWI
58
55,7
IILA-DQ
DQW2
3D
28,8
DQW3
61
58.6
DQW4
7
6.7

64
Tableau XIII:
Fréquence des antigènes IILi\\-i\\, n. C chez des habiL .,
·1'.
Ilielmo (Sénégal). Comparaison awc les résultats trouvés en Gambie (:'.'11.
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Locus
i\\ntigène
l'réquence
Dielmo
Gamhie
(n=104)
(n=112)
"._-
AI
10.5
15.2
A2
29.8
28.6
A3
1.9
6.3
A23
13,4
23.1
A24
2,8
0
A26
6.7
Il.6
II Li\\-i\\
A29
2,8
2.7
A30
20.1
27.7
A31
9.6
0,9
A32
0.9
8.9
AW33
23
25,9
AW34
1,9
2,7
AW36
3,8
0,9
B7
4.8
15,2
B8
8.6
16.1
Bl3
0.9
0
BI8
13,4
5.4
B27
0,9
2,7
B35
26,9
28.6
B37
0,9
2,7
lILi\\-1l
8W41
1,9
L8
8W42
0,9
6,3
844
0,9
3.6
B49
6.7
9.8
BW50
0,9
4.5
851
4.8
3,6
BW52
2.8
0
BW53
30,7
25
CWI
0,9
5,4
CW2
13,4
2' ,4
CW3
16,3
29.5
IILi\\-C
CW4
33,6
29,5
CW5
3,8
5,4
CW6
22,1
14,3
CW7
18,2
17
CW8
0,9
3,6

65
Chapitre VI :
Réponses anticorps (lgG et IgM) aux
antigènes de mérozoïtes.
1) Introduction
La réponse anticorps IgG et IgM aux antigènes de mérozoïtes a été évaluée
parallèlement à la réponse lymphocytaire.
Les paramètres suivants ont été étudiés: le sexe, l'âge, le nombre moyen d'accès
palustres pendant la période de suivi, l'influence de la réponse par la présence ou non de parasites.
2) Titre anticorps moyen
Le titre anticorps a été déterminé en mesurant la production d'immunoglobulines G et
M par les lymphocytes B matures.
Nous avons d'abord mesuré le titre moyen des IgG et IgM anti-Pjalciparum de sujets
vivant en zone de paludisme saisonnier âgés de plus de 20 ans. Le titre IgG est de 0,22 ± 0,001 et
celui des IgM 0,003 ± 0,00 1.
3) Influence de l'âge sur la réponse anticorps
La réponse anticorps IgG et IgM varie significativement (Anova ; p = 0,0001) en
fonction de j'âge et toutes classes d'âge confondues.
Elle augmente au fur et à mesure que l'âge croît (tableau XIV).
4) Influence du sexe
Le sexe ratio F/H est de 1,2.
La réponse anticorps IgG et IgM (tableau XV) ne varie pas en fonction du sexe
(Anova ; p > 0,4).

66
Tahleau XIV
Tilre anlicorps moyen (IgG el IgM) exprimé en densité optique
(DO) chez 116 sujels vivanls à Dielmo.
Classe d'âge
Moy.DO IgG ± $ET
Moy.DO IgM ± ET
*0-9 ans
1,302 ± 0,131
0,09 ± 0,025
(n = 39)
*10-19 ans
1,724±O,122
0,319 ± 0,042
(n = 33)
*;:>: 20 ans
2,104 ± 0,081
0,747 ± 0,104
(n=44)
$ET : écart-type
*U:i différence est significative à 95 % entre toules les classes d'âge (Anova).
5) Titre anticorps et nombre mu)'en d'accès palustres
Il n'existe aucune corrélation enlre le taux d'anticorps IgG el IgM des sujets elle
nombre moyen des accès pendant la période de suivi longitudinal> 122 j.(R2 = 0,08).
6) Titre Ac et présence ou ahsence de parasites.
Les résultais sont présentés dans le tableau XVI.
La présence ou l'absence de parasites dans le sang au moment du prélèvemenl n'a
aucune influence sur le taux IgG (test Student ; p = 0,1). Cependant la présence de parasites
dimunie significativement le litre IgM (test t p =0,(02) pour toutes classes d'âge confondues,
mais ce n'est pas le cas entre classes d'âge. Le nombre de trophozoïtesllli n'influence pas la
réponse anticorps chez les sujets parasi tés.

67
Tableau XV
Titrc anticorps moycn de 116 sujets habitants à Dielmo en
fonction dc leur sexe.
Groupe
Moy.DO IgG ± $Er
Moy. DO IgM ± ET
*Homme
1,795 ± 0,108
0,403 ± 0,074
(n = 52)
Femme
1,67 ± 0,094
0,405 ± 0.066
(11=64)
$Er: écart-type
* 11 n ya pas de différence significative entre homme et femme (Test de Student ; p > 0,05).
Tableau XVI : Titrc anticorps moyen en fonction des sujets porteurs ou non
dc parasitcs.
Moy. DO IgG ± *Er
Moy.DO IgM ± ET
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - _...-----
$Parasites (-)
1,86 ± 0,096
0,568 ± 0,086
(n = 54)
Parasites (+)
1,658 ± 0,102
0,27 ± 0,049
(n = 59)
*Er=écarHype
$ Il Ya une différence significative du titre 19M entre les sujets portant des p'u;,.", c:l ,-~li);.
qui n'en portent pas (Test de Student ; p =0,(02).

68
Chapitre VII : Analyse des antigènes de mérozoïtes par
Immunotransfert.
l) Introduction
30 sérums de sujets développant une réponse lymphocytaire T élevée in vitro aux
antigènes de mérozoïtes (BR) et3ü autres répondant faiblement (MR) ont été testés pour savoir
quelles sont les fractions antigéniques reconnues par les sérums des individus testés. Il faut noter
que seuls les anticorps IgG ont été révélés.
2) Résultats
Globalement, il Y a une différence d'intensité et de nombre de bandes reconnues par
les sérums des BR (figure Il). Il n'y a pas de reconnaissance non spécifique de bandes. Nous
avons utilisé comme contrôle un mélange de sérums de sujets européens n'ayant jamais été en
zone d'endémie palustre.
)] semble que les BR reconnaissent les fractions antigèniques de haut poids
moléculaire apparent et les MR les fractions de PM intermédiaire.Ces résullals seront analysés plus
finement en utilisant des techniques d'iodination des mérozoïles et d'immunoprécipilation p2f les
sérums des donneurs testés.
Certains MR (N° 4227, 4228, 4371, 4372, et 4378) reconnaissent peu de fractions
antigéniques, il s'agit surtout d'enfants à bas âge.

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70
Chapitre VIII: Réponses lymphocytaires et anticorps
1) Introduction
La réponse anticorps (IgG et IgM) aux antigènes de mérozoïtes a été corrélée à la
réponse T dans le but de savoir qui des sujets Bons Répondeurs ou Mauvais Répondeurs en
réponse lymphocytaire développent des titres anticorps élevés.
2) Résultats
La relation entre BR ou MR en réponse lymphocytaire T in vitro et la réponse
anticorps a été analysée par le test X2.
La réponse anticorps est significativement liée au groupe de répondeurs aussi bien
pour les IgG (p =0,(03) que les IgM (p =0,000\\) sans distinction entre BR ou MR.
Les BR sont liés au titre IgM de manière significative (p = 0,000\\) mais ne le sont pas
pour les IgG (p = 0,06).
Les MR sont significativement associés aux IgG (p = 0,(08) et aux IgM (p = 0,0001).
Ces résultats montrent que les titres élevés ou faibles d'anticorps sont associés
indifféremment aux BR ou aux MR.
Ce qui signi fie que les réponses lymphocytaires T et la production d'anticorps
spécifiques ne sont pas toujours superposables.

II
Chapitre IX : Restriction génétique et réponse anti-
P·falciparum
]) Introduction
L'élude de la restriction génélique de la réponse immune anti-Pjalciparwn a pris ces
dernières années une très grande importance.
L'échec de nombreuses lentatives de vaccinalion contre Pjalciparum a amené les
chercheurs à se poser la queslion fondamentale concemanlla capacité à développer une réponse
immunitaire efficace et le terrain génétique. En d'autres termes, existe t-il une association entre le
complexe majeur d'histocompatibilité CMH) et la réponse aux antigènes de Pjalcipanl17l.
Dans celte optique, nous avons étudié la restriction des réponses cellulaires et
anticorps aux antigènes de mérowïtes. Il s'agit de voir quels sont les antigènes HLA les plus
fréquemment associés avec une réponse faible ou élevée.
2) Antigènes HLA assocIes à la réponse lymphocytaire in
vitro aux antigènes de mérozoïtes.
Une association significative crest de Student ; p < 0,02) a été observée entre les
sujets développant une réponse cellulaire élevée et les antigènes HLA-A23, B51, DR\\. Celte
association est indépendante du groupe d'âge des sujets étudiés.
En considérant les deux groupes BR et MR, seuls les antigènes HLA B51 et HLA-
DR 1 sont significativement associés au groupe de BR (Test de Student p < 0,05).
Les tableaux XVI et XVII présentent les fréquences des antigènes de classe 1 et Il par
rapport aux BR et MR.

72
Tableau XVI: Pourcentages des antigènes IlLA-A, n, C chez les BR et MR aux
antigènes de mérozoïtes de P. fa/cipantm
Locus
Antigène
$IlR
+l\\lR
(n=53)
(n=46)
AI
7,5
13
A2
211
24
A23
1 1
7
A26
6
HLA-A
A \\\\'33
17
°
24
AW611
13
1 1
AW69
4
4
A30
19
17
A31
6
1 1
*H51
Il
BW53
23
°
37
B7
4
7
BII
Il
4
HLA-B
BW59
6
(1
BW6 ..
6
0
nW65
Il
9
Inv 511
13
20
Bill
12
13
IH9
4
7
1135
23
15
CW2
15
9
CW3
13
1 5
IILA-C
CW4
28
28
CW6
17
1 9
CW7
1 3
19
*1' < 0,05 (Xl)
$BR= Bons Répondeurs
+MR= Mauvais Répondeurs

73
Tahleau XVII: Pourcental(es des lIntil(ènes IILA-DR, DQ chez les DR et I\\IR aux
antigènes de mérozoïtes de P. falcipamm :
Locus
Antigène
BR
MR
(n=53)
(n=46)
*()IU
1 1
o
DR4
1 1
6
DR7
6
9
J)RWK
4
13
DR9
24
24
DRWII (5)
24
26
DRWI3 (6)
2
1 1
IlLA DR
DRW 14 (6)
26
35
DRWI5 (2)
7
6
DRWl7 (3)
1 1
6
DRWlK (3)
2
6
DRW52
73
76
DRW53
30
22
DQ\\\\'l
49
52
HLA-DQ
DQW2
24
26
DQW3
56
52
DQ\\\\'4
6
2
*1'=0,05
(X 2 )
$HR=BIlIIS Répondeurs
+I\\IR= Mauvais Répondeurs

74
3) Antigènes HLA ussociés il lu réponse unticorps.
Une association significative crest de Student) a été observée entre la réponse
anticorps IgG et les antigènes HLA suivants: A2 (p =O,OS), DR 1 (p =0,01), DR WS2
(p = O,OS).Par contre, seul l'antigène BSI s'est trouvé associé à la réponse IgM (p = 0,(01).
4) HLA et accès palustres.
Un certain nombre d'antigènes HLA se présentent comme associés en première
analyse au nombre moyen d'accès palustres enregistrés dans la population d'étude pendant la
période de suivi. Il s'agit de A23, BW64, CW3; DR2.
Cette liaison a été étudiée en fonction de l'âge des sujets et seul l'antigène HLA-CW3
est significativement associé à l'absence d'accès palustres en dehors du facteur âge. Mais ce
résultat reste limité vu le nombre de sujets et ne signifie pas que ces personnes n'ont jamais fait
d'accès palustres ou n'en feront pas dans l'avenir.

75
Chapitre IX : Etude longitudinale de la réponse
cellulaire.
1) Introduction
La réponse lymphocytaire l' in l'irro a été mesurée trois fois pendant un temps de
suivi allant de juin 1991 à Mars 1992. L'objectif visé est de savoir si la réponse 1ymphocytaire à
un même antigène variait significativement d'un prélèvement à un autre.
2) Résullals
Celle étude a consisté à tester en réponse lymphocytaire aux antigènes de mérozoiles
un certain nombre de personnes vivant à Dielmo. Certains sont considérés comme Bons
Répondeurs et d'autres comme Mauvais Répondeurs.
Il a été remarqué qu'au temps Tl, l'indice de stimulation est plus élevé qu'aux autres
temps .Cela est du aux valeurs élevées observées chez certains sujets mais statistiquement il n y a
aucune différence avec les autres temps de prélèvements.
Les réponses ont été évaluées par l'IS et le Il cpm.
Les résultats sont présentés dans le tableau XViiI.
Tableau XVIII: Suivi longitudinal de la réponse Iymphoqlaire aux antigènes
de mérozuïtes de 21 sujets de Uielmo. Les prélèvements se
sont <fhoulés cn 3 temps (TI ; T2 ; 1'3) espacés de 5 mois
entre Tl et 1'2 puis de 3 mois entre 1'2 et 1'3.
Indice de Stimulation
Il cpm
Tl
TI
TI
TI
TI
TI
(n=21)
(n=21 )
(n= 19)
(n=21)
(n=21)
(n= 19)
*moyenne
12,9
2,3
2,3
3569
4198
4483
± écart-type
06,3
0,4
0,5
1375
1303
1881
*11 n y a aucune différence significative au risque de 5 % (Anova) entre les Indices de
Stimulation d'une part et entre les tl.cpm d'autre part.

DISCUSSIONS

76
DISCUSSIONS
Dans celte étul!e, nous avons analysé les réponses immunitaires (l'immunité à
médiation cellulaire) d'un certain nombre de sujets vivant dans une zone de transmission continùe
de paludisme, Dielmo.
Ce village présente des conditions écologiques favorables au développement des gîtes
larvaires de moustiques. La mise en place d'une station de recherche sur le paludisme et le suivi
permaneIll des populations ont permis de recueillir des données épidémiologiques fondamentales
aux études de laboratoire.
La réponse Iympllocytaire T in vitro a été mesurée en présence d'extrait de
mérozoiles. Cet extrait contient les antigènes majeurs situés à la surface du mérowite 134, 39, 491.
Il s'agit l!cs polypeptil!es 83, 42, 36 kDa. Des fragments mineurs s'y trouvent aussi: 31, 28, et
16 kDa.
Nos résultats montrent que tous les sujets ne développent pas une Iymphoprolifération
in vitro. Celte dépression de la réponse ou celte absence de réponse a été attribuée à des
phénomènes d'imlllunosuppression 1691 ou d'inhibition médiée par les lymphocytes T CD8+ chez
les sujets répondant faiblement. La déplétion en CD8+ restaure partiellement la réponse
lymphocytaire 1551.
Dans une récente élUde, il a été montré que l!es sujets n'ayant jamais été exposés au
préalable au paludisme pouvaient développer une réponse lymphocytaire élevée invitTO en
présence de la CSP recombinante. Les lymphocytes T responsables de celte prolifération ont le
phénotype CD3+, CD4+, et le recepteur af) (l'cR af).lIs sont capables de produire J'IFN-y et
l'lL6 192]. Cela suggère que des lymphocytes T mémoires spécifiques sont présents chez des
individus qui ne sont pas en contact avec Pflllcipanun .
Une élevation des lymphocytes l'double négati fs CD4- CD8- portant le récepteur yAi
(30 % des cellules T ; taux nonnal < 5 %) a été trouvée dans le laboratoire (Dr J L Sarthou) chez
des sujets n'ayant jamais été exposés au paludisme et qui font un accès palustre pour la première
fois. L'analyse cytolllétrique de ces lymphocytes montre qu'ils possédent le phénotype Vy9+.
Leur rôle éventuel dans l'immunité antipal ustre reste à élucider.
Les mécauismes crfecteurs de la réponse lymphocytaire T incluent aussi bien la
destruction des parasites par l'activité cytotoxique que J'inhibition de la croissance de
Pltwnodiumfllldpamm par la secrétion de l'interféron y 182). La plupart de cellules impliquées
dans la secrétion d'IFN-y et la prol!uction d'lU sont de phénotype CD4+ 1791. L'IFN-y constitue
la principale cytokine décrite comme impliquée directement ou indirectement dans le processus de

77
contrôle des rarasites de stades sanguins asexués in vira 1351. Cependant les rôles précis de
l'intcrféron gamma dans les mécanismes de défense de l'hôte méritent d'être mieux défmis.
La réponse lymphocytaire T antipalustre n'est pa~ toujours corrélée à la production de
d'lFN-y .C'est pourquoi certains auleurs 1791 pensent que la prolifération cellulaire T in vitro est
incomr1ète pour mesurer la réponse T et donner une signification fOllctionnelle.
De nombreuses études de la réponse lymphocytaire Ten zone d'endémie palustre (II,
17,68, 73J ont été effectuées avec des protéines recombinantes et des peptides synthétiques. Il est
connu que les antigènes natifs et les peptides synthétiques ne sont pas présentés au recepteur T de
la même manière. Les antigènes natifs sont d'abord phagocytés puis digérés avant d'être exprimés
à la surface des macrophages. Une présentation inadéquate peut être responsable d'une mauvaise
réponse lymphocytaire T
Les réponses obtenues sont beaucoup plus élevées avec les extraits antigéniques
qu'avec les recombinants ou les peptides.
En analysant la réponse anticorps des Mauvais Répondeurs, nous avons observé
qu'elle n'était pas di fférente de celle des Bons Répondeurs aussi bien en IgG et qu'en IgM. Cela
prouve qu'in vivo, il y a eu coopération entre lymphocytes T auxiliaires et lymphocytes B. Cette
absence de corrélation entre les deux types de réponse a été souvent retrouvée en zone d'endémie
où les taux d'anticorps anti-P.falcipamm sont élevés.
Des expériences récentes 17, 22) confirment le rôle effecteur des IgG qui en présence
de macrophages inhibent fortement la croissanl:C des parasites in vitro.
Cette inhibition est donc dépendante tant des cellules que des anticorps (AOCI ). S'il
s'avère que les anticorps cytophiles jouent un rôle important dans les mécanismes de protection,
d'importantes conséquences sur la définition d'un vaccin vont en dé<:ouler car les antigènes cibles
situés à la surface du mérozoïte, seule forme libre du parasite au stade sanguin ,doivent être
accessibles aux anticorps.
La présence ou l'absence de P.falciparum dans le sang au moment du prélèvement
n'influence pas le développement de la réponse lymphocytaire car nous avons trouvé aussi bien
chez les BR que chez les MR des parasites même si les sujets parasités sont plus nombreux chez
les MR. Cependant le nombre de trophozoïtes par III de sang est plus élevé chez les MR. Mais
nous ne connaissons pas la valeur seuil à partir de laquelle il ya suppression de la réponse T i/l
vitro Dans une étude à Madagascar, il a été constaté que la réponse Iymphoproliférative in vitro à

7B
des peptides de RESNPfJ 55 diminuait après clairance des parasites par traitement oral de quinine
base. Ce résultat est-il la conséquence d'une anergie des lymphocytes par J'utilisation d'un
médicament antimalarique (Ill ou la présence de mécanismes suppressifs après traitement 1551.
Il a été postulé que les maladies infectieuses exercent une pression significative sur le
développement et le maintien du polymorphisme du système HLA. Il a été aussi suggéré que les
maladies parasitaires comme le paludisme maintiennent sélectivement certaines fréquences
géniques dans les zones d'endémie 1711. Plusieurs trdvaux portant sur des antigènes différents de
Pll1smodiumfalciparum 121,59,65,801 onl noté une association positive ou négative entre les
réponses lymphoprolifératives et la possession d'un antigène HLA déterminé.
Dans ce travail, nous avons pu montrer une association positive et significative entre
une réponse élevée (BR) et la présence des antigèncs HLA-B51 et HLA-DR 1. Cela signifie t-il que
tous les sujets porteurs de ces deux antigènes développeront automatiquement une réponse
lymphocytaire élevée in vi/ru en présence d'antigènes de mérozoites ? Il est à l'heure actuelle
difficile de répondre par l'affirmative. Il faudra multiplier les études longitudinales dans les zones
de paludisme endémique pour mieux cerner la question.
Des essais de vaccination avec la protéine synthétique SPf 66 chez des volontaires ont
montré que 73,3 % des sujets développant une réponse humorale faible portaient l'antigène DRW4
et 42 % l'antigène DQW6 [561.
Les antigènes HLA associés à la réponse lymphocytaire sont différents selon les
antigènes de Plalciparum testés et restent limités à deux ou trois.
Il a été démontré dans une étude en Gambie que les sujets porteurs de l'antigène HLA-
BW53 et de l'haplotypc DRB 1* 1302-OOB 1*0501 bénéficiaient d'une protection contre les formes
sévères du paludisme [371. Nous avons observé que les 10 personnes porteuses de l'antigène
HLA-CW3 n'ont fait aucun accès palustre pendant la période de suivi. Ce résultat mérite d'être
confirmé sur un plus grand nombre de sujets présentant cet antigène. De plus, une étude est en
cours à Dakar pour établir le phénotype HLA des sujets hospitalisés pour accès pernicieux, dans le
but de mettre en évidence une éventuelle susceptibilité génétiquement déterminée chez l'homme.
Les épitopes T et il rccounus changent-ils fréquemment pour un même antigène? Des
études longitudinales de J982 à 1989 sur les fréquences des épilopes polymorphiques des
antigènes de surface du mérozoïte ont montré que seuls deux changements significatifs ont été
enregistrés dans le domaine répétitif et dans Je domaine 4 de l'antigène MSPI( 14).

CONCLUSION

79
CONCLUSION
La nllse au point d'un vaccin efficace contre le paludisme dans les zones de
transmission continue constitue un point fort dans la stratégie d'éradication de ce fléau.
L'étude que nous avons réalisée dans le village de Dielmo a permis de mieux connaître
la réponse lymphocytnire d'une population soumise à une infestntion palustre toute l'année (donc
ayant acquis un certain degré d'immunité) et de voir si celle réponse est génétiquement restreinte
par le système HLA.
C'est ainsi que nous avons montré que les individus testés in vitro en réponse à des
antigènes de mérozoïtes pouvaient être classés en deux groupes selon la Iymphoprolifération. Les
Bons Répondeurs ont représentés 53 % et les Mauvais Répondeus 47 %.
Chez les Bons Répondeurs, ce sont les cellules T portant le récepteur ,/0 .' iè
phénotype Vy 9 qui prolifèrent in vilra. De plus, cette expansion est associée à la libération in
vitro d'une cytokine: l'interféron y qui possède une activité antiparasitnire. Les tnux d'anticorps
IgG etlgM spécifiques ne diffèrent pas significativement entre les deux groupes. Ainsi, il n'y a
aucune corrélation entre les réponses Iymphocytnires T et la concentration en anticofps
spécifiques. Cependant, les IgG sériques des Bons Répondeurs reconnaissent très intensémri11 les
fractions antigéniques de hauts poids moléculaires apparents.
Deux antigènes HLA-B51 et HLA-DRI sont trouvés significativement associés au
groupe de Bons Répondeurs tnndis que tous les sujets porleurs de HLA-CW3 n'ont pas fail
d'accès palustres durant la période de suivi.
Les antigènes étudiés étant des protéines natives, nous allons testé des fraclions
antigéniques purifiées (83, 42, 36, 19 kDa), des protéines recombinantes et des peptides
synthétiques de Ja protéine de surface du mérozoïte (MS!'I) qui est considérée à l'heure actu:-!k
comme un bon candidat à la vaccination antipalustre.

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Annexe 1: Liste complète des spédficités HLA reconnues (23.)
A
B
C
D
DR
Dl'
Al
135
CWI
DWI
DRI
DQWI
1)1'1'.'1
Al
I37
CW2
DW2
DR2
DQW3
npW2
A3
138
CW3
BW3
DRJ
DQW3
!WVI]
A9
BI2
CW4
OW4
DR4
DQW4
rll:W-l
AIO
BI3
CW5
DW5
DRS
DQW5(WI)
nr'''V5
Ali
1314
CW6
DW6
DRW6
DQW6(WI)
L)P\\V6
AWl9
BI5
CW7
DW7
DR7
DQW7(W3)
Al3(9)
BI6
CW8
DW8
DRW8
DQW8(W3)
Al4(9)
Bl7
CW9(W3)
DW9
DR9
DQW9(W3)
A25(10)
Bi8
CWJO(W3)
DWIO
DRWIO
A26(10)
B21
CWII
DWII(W7)
DRWll(5)
A28
BW22
DWI2
DRW12(5)
Al9(WI9)
B27
DWI3
DRW13(W6)
A30(W19)
I335
DWI4
DRWI4(W6)
A31(W19)
B37
DWI5
DRWI5(2)
A32(WI9)
BJ8(16)
DWIG
DRWI6(2)
AW33(W19)
I339(16)
DWI7(W7)
DRWI7(3)
AW34(10)
B40
DWI8(W6)
DRWI8(3)
AW36
BW41
DW19(6)
AW43
BW42
DW20
DRW52
AW66(IO)
B44(12)
OW21
AW68(28)
B45(12)
0W22
ORW53
AW69(28)
BW46
OW23
AW74(WI9)
BW47
DW24
BW48
DW25
B49(21)
DW26
BW50(21)
1351(5)
BW52(5)
13W53
BW54(W22)
BW55(W22)
BW56(W22)

BW57( 17)
BW58(l7)
BW59
DW60(40)
BW61(40)
BW62(IS)
f.lW63(lS)
f.lW64(l4)
f.lW65(l4)
f.lW67
BW70
BW71(W70)
BW72(W70)
BW7S(JS)
BW76(IS)
13W77(lS)
BW4
f.lW6

Annexe II :Suivi longitudinal de la réponse cellulaire aux antigènes de mérozoïtes
Indice de stimulation
Do cpm
Donneurs
1er test
2ème test
3ème test
1er test
2ème test
3ème test
4204
127
7
9
8599
16758
10171
4210
58
1
2
4647
238
6167
4212
2
1
1
260
1
171
4213
2
1
1
315
1
1101
4219
3
1
1
323
1278
200
4223
6
6
8
2263
3912
32619
4226
4
1
1
1663
1
339
4227
1
1
1
1
1
13
4236
2
7
2
257
11592
8141
4238
2
1
2
248
1425
1061
4275
4
2
4
1108
12625
17058
4371
3
1
2
1788
1
884
4377
23
2
NU
28579
5455
ND
4380
2
2
2
250
1794
4954
4381
8
4
1
4009
1802
1
4404
2
"l
~
1
8582
17112
1
4406
3
1
1
2575
1
158
4414
15
5
ND
4702
12609
ND
4420
2
1
1
4322
136
14
4451
1
1
1
220
1
982
4473
2
2
3
248
1425
1156
Moy.+ST
12+6,3
:: .3±0,4
2,3±0,5
3:'(]S'±1375
4198±1303
4483±1881

PLAN DETAILLE
INTRODUCTION..........................................................
3
HEVUE GENERALE
Chapitre
1
I{appel
sur
le
paludisme
.
5
1) Importance dans le monde................................................
5
2) Cycle de développement de P.falciparum..............................
5
Chapitre Il : /\\nlil:ènes de P.[alcipal"um........................................
9
1)
Antigènes de sporozoïtes
..
9
2) Antigènes de stades érythrocytaires
..
.9
2·1 : Merozoite Surface Prolein 1
..
9
2-2
Glycoproteine 46
..
10
2- 3
: RESAIPf
155
..
10
2-4 : Proteines des rhoptries
.
10
3) Antigènes de stades sexués
.
10
4) Les principaux antigènes candida15 à la vaccination anlipaluslre ..
10
4-1
Ul Circumsporozoite protein
..
II
4-2 : Les antigènes de mérozoïles
,"'
.
11
• f R' '.-"
'"",-
Chapil.re III : Réponse immunilaire anrr.pjar;;p~rtim:..\\
..
12
O ( r
\\.
.
~.
1
(
]) Mécanismes non spécifiqucs
}
~
:.........
12
.~.
. . .
\\-:: \\.
/
2)
Me~anlsmes speclflques..
,.,...................................
12
2 1
1
.. ,
'd"
V", ---------- .'
12
-
:
mmunlte a me latlon antlc.?rp~:.":.,,.~.::
.
J
. "
'd"
II 1"'----
12
2-2:
mmunlte a me latIon ce u aire
..
Chapitre IV : Réponse cellulaire T aux antigènes de P.falcipul"um....
13
1) Rappel sur les cellules impliquées dans la réponse L...............
13
2) Réponse lymphocytaire T anti-P.falcipamm...................................
15
Chapitre
V
:
Système
IlL/\\
el
paludisme................................
16
1) Rappel sur le système HLi\\................................................
16
2)
Paludisme et HLA.................................................
19

TRAVAUX PERSONNELS
lERE PARTIE: I\\IATERŒLS ET METIIODES
Chapitre
1
Introduction
..
22
Chapitre
II
Description
du
site
d'étude
.
23
1)
Choix
du
sitc.................................................................
23
2)
Silc
de
l'éludc................................................................
23
2-1 : Caractères géo-climaliques......................................
23
2-2
:
Populalion.........................................................
23
2-3
L'endémicilé paluslre............................................
25
2-4 : Prélèvcments biologiques.......................................
25
Chapitre III:
Analyse phénotypique des sous-populations
lymphocytaires
.
26
' "
'----------
Chapitre IV
Réponse cellulaire T aux antigènes de P. !a/ciparum
27
1)
Introduction
.
27
2)
Malériels el
méthodes
.
27
~
..
~"t\\i~;',
2-\\
:
Reacttfs
;._.;:~:
;.·
..
27
2-2
:
Méthodes
J::~:-:.C.-:~·>.::-\\
.
27
. J~!
.
~
.\\ ~~
_
2-2-1 : ObtentlOn, d antlg~~s-delmerozOltes
.
27
2-2-1-1 : S~~ht~~(jon de la ~ù}ture de
PIafcipal\\~n~ ~..I./:!
.
27
2 -2-1-2 : Réd'jl!!:;,d.es~'êlozoiles
..
28
2- 2-1-3_/ Extraction des anligènes
.
29
2- 2-1-4 : Détermination de la concentTation
proléique de l'extrail anligènique
..
29
2 -2-1-5 : Eleclmphorèse en gel de polyacrylamide
30
2-2-2 : Populalions cellulaires lestées
.
30
2-2-2-1 : Cellules mononucféées
.
30
2-2-2-2 : Sous-populalions lymphocytaires T
..
31
2- 2-2-3 : Cellules présellLanll'antigène (monocyles)
31
2-2-3 : Test de proliféralion cellulaire
..
32
2-2-4 : Dosage de l'JFN-y........................
..
32

Chapitre V : Typage dans le système I1LA.....................
33.
J)
Introduçtion...............................................................
33
2) Matériels et méthodes....................................................
33
2-1
: Malériels.......................................................
33
2-1-1
: j{éaclifs................................................
33
2-1-2 : Plaques HLA..........................................
34
2-2
: Méthodes
35
2-2-[ : Méthode classique..................................
35
2-2-1-) : Séparation des cellules..................
35
2-2- 1-2: MicrolYl11phocytoloxicité complément
dépendante...........................................
35
2-2-2 : Méthode avec fluorescence.......................
36
2-2-2-1 : Séparation des cellules à partir du sang total
36
2-2-2-2 : Microlymphocytoloxieilé.......................
36
ChapitreVJ : Ré[Jonse anticorps aux antigènes de P.falciparum
37
1)
Introduction.............................................................
37
2) Titrage immunoenzYl11atique des Ig totales (IgG et IgM ).........
37
2- J
Matériels.......................................................
37
2-2
: Méthodes.......................................................
37
Chapitre VII
Analyse des antigènes de 1'.1' par JlI1l\\1unotransfert
38
l)
Inlroduetion............................................................
38
2) Matériels el Méthodes.................................................
38
2-1
: Matériels.....................................................
38
2-2
:
Méthodes....................................................
39
2-2-1 : Eleetrotransfert...................................
39
2-2-2: Iml11unodétection des antigènes transférés....
40
2EME PARTIE: RESULTATS
Chapitre 1 : Analyse statistique des résultats
.
43
Chapitre JI :
Distribution phénotypique des sous·populations
lymphocytaires
.
44

Chapitre III : Répouses cellulaires T aux antigènes de lIlérozoïtes
45
1)
Introduction..............................................................
45
2)
Réponse
lymphocytaire..................................................
45
2-1 : Paramètrcs choisis poUl évaluer la réponse lymphocytaire
45
2-2: Sujcts Bons Répondeurs (BR) et Mauvais Répondeurs (MR)
48
2-3 : Influence de l'âge sur les Bons ou Mauvais Répondeurs......
48
2-4 : Influence du sexe....................................................
48
2-5 : Nombre moyen d'accès palustres en fonction des BR ou MR
48
2-6: Influence de la présence el du nombre de parasites
..
(P.j(tlcif'lIrllln) dans le sang......................................
49
3)
Production
d'lfN-y
52
Chapitre IV:
[{éponses dl'S sous-populations lymphocytaires aux
antigènes
de
méroloïtes..................................
53
1)
Introduction...........
53
2)
Résultats......................................................................
53
Chapitre V : Antigènes du système IILA
54
1)
Intro<luction.......................................................
54
2) Les antigènes de classe 1 (t'[LA-A, B, C)................................
54
3) Les antigènes de classe [[ (HLA-DR, DQ)...............................
62
4) Comparaison dl' la fréquence des antigènes HIA-A, B, et C..........
62
Chapitre
VI
Réponses
anticorps
.
65
1)
[ntroduction.................................................................
65
2) Titre anticorps moyen
65
3) Influence de l'fige sur la réponse anticorps
65
4)
Influence
du
sexe...........................................................
65
5) Titre anticorps et nomlJre moyen d'accès palustres.....................
66
6) Influence de la présence ou l'absence de parasites......................
66
Chapitre VII:
AualY'se des antigènes de méro].(Jïtes par
Imlllllnotrausfert....................................
68
1)
[ntroduction................................................................
68
2)
Résllitats....................................................................
68

Chapitre VUI : Réponses Iymphuc)'taires et anlicorps
.
70
1)
Introduction
.
70
2)
Résultats
.
70
Chapitre IX
Restriction génètique (IILA) et répunse anti-
P·flJ/ciparllm
.
71
1)
Inlroduction...............................................................
71
2) Antigènes HLA associés à la réponse cellulaire aux antigènes de
mérozoïtes.......
71
3) Anligènes HLA associés à la réponse anticorps......................
74
4) HLA et accès paluslres..................................................
74
Chapitre X : Etude longitudinale de la réponse cellulaire...........
75
1)
Introduction..............................................................
75
2)
Résultats..................................................................
75
DIS C U S S ION S
,
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76
CON C LUS ION. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .
79
REFERENCES
BIBLIOGRA PIIIQ UES
.
80
ANNEXES 1 ET Il

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VU
VU
LE l'RESIDENT DU .JURY
LE DOYEN
VU ET PERl\\US D'IMPRIMER
LE RECTEUR DE L'UNIVERSITE
CHEIKH ANTA DIOP-DAKAR
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