UNIVERSITE DE DAKAR
DIPLOME D'ETUDES APPROFONDIES
CHIMIE ET BIOCHIMIE DES PRODUITS NATURELS
présenté à la Faculté des Sciences
par
Alioune DIEYE
Docteur en Pharmacie
Ancien Interne des Hôpitaux de Dakar
Attaché-Assistant de Biochimie Pharmaceutique
SUJET:
INTERET DE LA CHIMIOLUMINESCENCE DANS
VETUDEDE LA PHAGOCYTOSE
CHEZ L'AFRICAIN DE L'OUEST
présenté et soutenu publiquement le Il juillet 1986
devant la Commission d'Examen
Membres du Jury:
Président
:
M. J.M. KORNPROBST
Examinateurs
:
M.
J. ROFFI
.
M.
F. LEGAILLARD
M.
D. BA
M.
M. DIENG
M.
J.L. SARTHOU
Travail des Laboratoires de Biochimie Pharmaceutique
(Professeur F. LEGAILLARD)
Faculté de Médecine et de Pharmacie et d'Immunologie Cellulaire
(Docteur J.L. SARTHOU)
de l'Institut Pasteur de Dakar
"Prenez Intérêt, Je vous en conjure, à ces demeures sacrées que l'on désigne
de nom expressif de laboratoires. Demandez qu'on les multipl le et qu'on Jes
ouvre. Ce sont les temples de l'avenir, de la richesse et du bien-être.
C'est là que l 'humanité grandit, se fortifie et devient moi Ileure".
Louis PASTEUR.
"T~e entreprise technologique ne doit avoir qu'un seul sujet de préoccupatIon
l'Homme et sa destinée. Ne l'oubliez jamais, au milieu de vos diagrammes et de
vos équar tons".
Albert El NSTE 1N.
- LISTE
DES
ABREVIATIONS-
------------------------
CI.
C~1~rOLUMINESCENCE
Con A
CONcAr~AVAL 1NE A
GB
GLOBULES BLANCS.
GR
GLOBULES ROUGES
HMP
HEXOSES MONOPHOSPHATES
19
IMMUNOGLOBULINES
MIN
MINUTE
M
MI LLiONS
MPO
MYELOPEROXYDASE
NFS
NUMERATJ)()N FORMUL E SANGU )NE
ANION SUPEROXYDE
"OXYGENE SINGULET"
PBS
PHOSPHATE BUFFERED SALINE
PMA
PHORBOL MYRI STATE ACETATE
ROL
RADICAUX OXYGENES LIBRES
SEC
SECONDE
UI
MICROLITRE.
- SOM MAI R E -
INTRODUCTION
lERE PARTIE
ETUDE DE LA PHAGOCYTOSE
2EME PARTIE
TRAVAUX PERSONNELS
1) 1ntroduct 1on
2) ~~+6rlel
3) Méthodes-·
4) Résultats et commentaires
5) Dlscùsslons
6) Conclusions.
BIBL 1OGR/\\PH 1E.
- l NT R0 DUC T ION -
- 2' -
- 1 N T R 0 DUC T ION -
La phagocytose occupe une place Importante parmi les moyens qu'utilise
l'organisme pour se défendre contre les agressions extérieures. C'est un mécanls-
me non spécifique de défense qui fait intervenir de nombreuses cel Iules (macro-
phages, monocytes, polynucléaires neutrophl les et eosinophlles).
L'Importance de ce phénomène justifie son étude pour évaluer la capa-
cité d'un organisme à se débarrasser de substances étrangères. Il est établI
qu'au cours du processus. phagocytaire, des radicaux oxygénés libres (peroxyde
d'hydrogène, anion superoxyde, "oxygène singulet", radical hydroxyl) sont pro-
duits par le phagocyte. Ces radicaux oxygénés 1ibres (ROL) électroniquement
Instables émettent des photons à leur retour à un état stable. Cette réaction de
luminescence chimique est appelée chimioluminescence. Bien que faible au départ,
ce rayonnement lumineux peut être quantifié grâce à l 'util isatlon d'ampl Iflca-
teurs de photons comme le luminol.
Ainsi la technique de chimiolumlnescence peut être utll isée pour
évaluer la capacité de phagocytose d'un organisme dans des situations patholo-
glques où le système de défense non spécifique est sollicité.
Dans ce travail, préliminaire à une étude sur le rôle de la phagocy-
tose dans le paludisme, nous nous sommes fixé les objectifs suivants:
- présenter un bref rappel bIbi lographique sur la phagocytose,
- mettre au point la technique de chlmioluminescence (Iuminomètre'
automatique 1251) en précisant les différents paramètres,
- établ ir les valeurs de référence d'une population témoin d'Afrique
de l'Ouest, soumise aux mêmes pressions de l'environnement et de la
pathologie infectieuse: bactérienne, virale et parasitaire.
.J
- 2
lERE PARTIE: ETUDE DE LA PHAGOCYTOSE
- 3 _
La phagocytose est le processus par lequel des particules sont
ingérées par les globules blancs (polynucléaires neutrophiles et polynucléaires
éoslnophi tes) et par des phagocytes mononucléés (monocytes-macrophages). C'est
le plus grand mécanisme de défense uti 1isé par le système immunitaire pour pro-
téger l'organisme contre la plupart des particules et substances étrangères.
Selon la tai 1le da la particule à ingérer, on parle de :
- pinocytose (diamètre
<10 nm)
- phagocytose (diamètre >10 nm).
La phagocytose se déroule généralement en 3 phases
- adhésion
- ingestion
devenir de la particule ingérée.
1) L'adhésion (21,33, 34)
La cel Iule vient au contact de la particule à phagocyter.
L'adhésion comprend
1-1- b§_~bl~!~!~~!12~~
Il correspond à un déplacement du phagocyte en direction de sa proie.
Il Y a formation première d'une membrane hyaloplasmique dépourvue
d'organites qui adhère à un substrat et attire le reste de la cel Iule. Des fac-
teurs chimiotactiques présents dans 1iorganisme sous forme inactive peuvent être
activés pour favoriser le déplacement.
Des inhibiteurs du chimiotactismo agissent sur ces facteurs ou sur
le phagocyte lui-même.
-
4 -
C'est la reconnaissance de la particule avec neutral isation des
phénomènes de surface.
Les opsonines (21) sont de deux types:
- Opsonines thermostables: ce sont des immunoglobul ines spécifiques
(essentiellement isotypes IgG 1 et IgG 3).
L'activité opsonisante requiert le fragment F ab qui se fixe sur le
germe par son site anticorps et le fragment Fe qui se fixe sur la membrane du
phagocyte au niveau d'un récepteur spécifique.
- Opsonines thermolabi les: composant C
formé par activation du
3b
complément par la voie classique ou par la voie nlt8rne.
Les récepteurs membranaires du phagocyte (20, 23, 38) sont de deux
types
- un récepteur spécifique pour le C
: rôle dans l'attachement
3b
- un récepteur spécifique pour le fragment Fc des IgG : rôle dans
l 'attachemAnt et le déclenchement de l'ingestion.
2) L'ingestion (9, 21, 37, 41,42) 44, 50, 55)
Elle comprend:
Le contact de la particule à phagocyter entraîne l'agrégation des
glycoprotéines de la surface membranaire. Cette altération de la fluidité mem-
branaire, ainsi que les modifications ioniques seraient responsables de la
transmission du message.
La particule est alors entourée par des pseudopodes cytoplasmiques
et se retrouve finalement isolée dans une vacuole endocel lui aire ou phagosome.
- 5 -
Les agents contenus dans les lysosomes du phagocyte se déversent dans
la vacuole phagocytaire agissant ainsi sur la proie. Les granules se déplacent
et s'accolent sur les parois du phagosome pour former le phagolysosome. La rup-
ture de la membrane intermédiaire permet le passage du contenu des granulations
(Iysosyme, lactoferrine, enzymes hydrolytiques : cathepsines).
Cependant, il faut noter que les granulations peuvent aussi se
déverser à l'extérieur du phagocyte créant ainsi des altération tissulaires
ln vivo.
2-3- bê_2êS!§[lS191ê (2, 13, 15, 19, 21, 22, 25, 28, 30, 35, 36,
46, 47, 49, 53)
Dans le phagocyte activé, se produit une "explosion respiratoire"
30 à 60 secondes après l'attachement des particules à la membrane cellulaire.
L'''explosion'' se manifeste par une:
- augmentation de la consommation d'02
- formation d'anions superoxydes (02-)
- production de peroxyde d'hydrogène (H 202)
- stimulation de la vole des pentoses ou shunt des hexoses
monophosphates (HMP).
El le est due à l'activation d'un système enzymatique local isé dans
la membrane plasmique et internai isé lors de la phagocytose. Il s'agit de la
NADPH-oxydase qui agit en présence de FAD.
Cet enzyme catalyse la réduction de 1'°
en anion superoxyde (02-)
2
en prenant un électron au NADPH
2 0
+
NADPH
2
- 6 -
phagosome
bactérie
cytosol
glucose-6- P04
Figure 1.: ~tabolisme de l'oxygène dans les phagocytes
(d'après B. ROOS cité par B. DESCAMPS-LATSCHA (16) )
_ 7 _
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o
l
- 8 -
Ainsi
Tout l'oxygène consommé par le phagocyte à ce moment sert à
fabriquer des anions superoxydes (02-),
+
- L'accumulation de NADP
active la voie des pentoses pour assurer
la régénération du NADPH.
- L'eau oxygénée (H 0 ) provient de la dismutation spontanée, ou en
2 2
présence de superoxyde dismutaso (SOD) de 80 %des anions super-
oxydes :
àismutation
20-
+
2 H+ ----.;;..;..;;,;.;.;.;;.....,;;;.;...;....;;.;.---4~
0
+
7
2
2
- Les radicaux hydroxyls 1ibres (.OH) se forment par interaction de
l'anion superoxyde avec:
o - +
)
.OH
+
OH
(oxygène
2
singulet)
- L' "oxygène si ngu 1etH (1 02) se forme par :
. dismutation spontannée d'un anion superoxyde
20-
_ _ _ _ _ _ _...,) 1
+
0
+
2
2
0 - +
2
)
+
.OH
+
OH
• réaction d'un produit d'oxydation d'ions halogènures avec l'eau
oxygénée
- - - - - - - - - 7 ) 10
+
Cl
+ H 0
2
2
- Le système myé 1operoxydase (système ~1PO-Ha 1ogènure-H
cata
20
1 yse
2)
l'oxydation d'un ion halogénure (X
--------~) XO
+ H20
- 9 -
- Le phagocyte est protégê
des effets toxiques de H
par la
202
catalase et le glutathion réduit.
1
Les différents dérivés de l'oxygène ( 02' .OH, 02- et H 0
sont
2 2)
appelés Radicaux Oxygénés Libres (ROL). Ils jouent un rôle très important dans
le système bactéricide des phagocytes.
3) Devenir de la earticule ingérée (21, 42)
Une foie phagocytée, la particule évolue en fonction de sa nature.
3-1- Q19~~!1~!}
C'est le cas de la plupart des germes, cel Iules. L'ensemble des
systèmes bactéricides y participe.
La particule ne peut pas être digérée par le phagocyte. Cette
persistance est responsable de l 'établ issement d' infections latentes qui peuvent
se transformer en infections aigües (tuberculose, salmonellose, brucellose,
etc ••• ) •
La particule se multipl ie dans la cel Iule phagocytaire (mycobactéries,
Salmonella, virus, parasites etc ... ). La fusion phagosome-phagolysosome n'ayant
pas lieu, on comprend que l'action des enzymes Iysosomiales ne s le f f ectue pas.
4) Importance des Radicaux Oxygénés Libres (ROL) dans la phagocytose
infections bactériennes et paludIsme à Plasmodium falciparum
<2, 3,4, 8, 10, 11, 12, 13, 15, 19, 28,41, 46, 54)
L'effet bactéricide des ROL peut être illustré dans ces deux exempl es i
la granulomatose chronique et le déficit génétique en myéloperoxydase.
1
- 10 -
La granulomatose chronique est une affection héréditaire 1iée ê un déficit
génétique complet en NADPH oxydase. Ainsi, les cel Iules phagocytaires sont
Incapables de générer des ROL et ont un pouvoir bactéricide nul malgré une
capacité normale de phagocytose.
Les sujets qui en sont atteints ont une très grande sensibi 1ité
envers la plupart des germes. Ils meurent souvent d'infections dans les deux
premières années de la vie. Ceux qui survivent ont une existence souvent menacée.
Dans le déficit génétique en myéoloperoxydase, les cel Iules phago-
cytaires produisent des ROL de façon normale, mais el les ont un pouvoir bactéri-
cide atténué qui s'opère avec un certain temps de latence. Cependant, les sujets
atteints de ce déficit peuvent mener une vie normale et parviennent à guérir de
nombreuses infections bactériennes.
Pendant longtemps, on a cru que la lyse bactérienne était la seule
fonction des ROL. Or, tout un ensemble de travaux ont récemment montré que ces
molécules peuvent exercer leur effet toxique envers d'autres agents pathogènes
(parasites).
L'effet toxique des ROL
sur le Plasmodium falciparum a été l'objet
de nombreuses publ icatlons ces dernières années (2, 3, 8, 10, 11, 12, 13, 19,
41, 46, 49, 54). Ces différents travaux ont aidé à une mei 1leure compréhension
du rôle des ROL dans la destruction de Plasmodium falciparum. Ainsi, il est
reconnu que l'anion superoxyde (02-)' les radicaux hydroxyls (.OH), l'oxygène
singulet (102) et le peroxyde d'hydrogène (H 0
pouvaient tuer le parasite
2 2)
intraerythrocytaire du paludisme.
5) Technigues d'étude de la phagocytose (25, 31; 43, 52)
Ces techniques s'arPI iquent surtout aux polynucléaires neutrophiles.
1
- 11 -
- Technique de RE BUCK (in vivo)
On réal ise une fenêtre cutanée. Les cel Iules qui arrivent dans
l'exsudat sont prélevées. On mesure leur pourcentage et la rapidité d'arrivée.
- Techniques dérivées de la chambre de BOYDEN
Dans une chambre séparée en deux compartiments par une membrane de
pores cal ibrés, sont placés dans un compartiment les cel Iules et dans' 'autre
le sérum du malade activé par du zymosan par exemple. Après un certain laps de
temps, on décompte le nombre de cel Iules qui ont traversé le filtre.
- Techniques de mesure sous agarose
On perce des puits dans un gel d'egarose.
Dans certains, on y dispose des cel Iules tandis que d'autres adja-
cents aux premiers contiennont l 'attractant ou une substance inerte.
Après un certain laps de temps. la distance parcourue sous l'agarose
par les cel Iules vers les différentes substances est mesurée.
- Techniques de mesure en mi 1ieu 1iquide.
Sur une lame de verre, on place l 'attractant et à une certaine
distance de celui-ci, les cel Iules. La lame est recouverte d'une fine couche de
liquide. Le déplacement des cel Iules est estimé au microscope.
On peut mesurer :
- L'augmentation de la consommation en glucose
COZ marqué au 14C•
1
- - - - - - - - - - - - - - - - . -
- 12 -
5-3- I~~~~lg~~2_~!~Qlê~!_1~ê~!lyl!§_!~~~2~
- Test de destruction intrac~1 lui aire ou test au nitro bleu
tét razo 1i um (NBT>.
Le NBT jaune est réduit grâce à l'explosion respiratoire en un
complexe foncé (bleu de Formazan).
- Mesure de la consommation d'02 :
El le utl! ise l'électrode de Clark qui évalue la diminution de la
pression en oxygène dans le mi 1jeu.
- Dosage de la myéloperoxydase (MPO)
lise fait par spectrophotométrie après coloration à l 'orthu-
dianlsidlne.
- Bactéricide.
Comptage du nombre de microbes vivants après un temps de contact
entre les microbes, les cel Iules et le sérum du malade.
- Mesure de la chimioluminescence produite par les cellules phago-
cyta ires.
6) L'utll isation de la chimioluminescence pour l'étude de la phago-
cytose (6, 7, 14, 17, 18, 26, 27, 29, 31, 32, 39, 40, 48, 50)
Le phénomène de chimioluminescence découvert par ALLEN en 1972 (1)
repose sur la capacité des radicaux oxygénés 1ibras électroniquement instables
d'émettre de la lumière à leur retour à un état stable. Cette lumière peut être
uti lisée pour étudier la phagocytose. Cependant, son appl ication est très 1Imitée
car le signai émis est peu intense et il est nécessaire d'avoir un grand nombre
de cel Iules phagocytaires. Ensuite les instruments nécessùires coûtent très chers
(compteurs à scinti 1latlons S).
- 13 -
Ces inconvénients ont amené a se servir d'amplificateurs de
phot8ns tel que ie luminol (5 amino-2, 3-dihydro-1-4-phthalazinedione).
Le luminol permet
d'amplifier les photons émis par les ROL,
- d'augmenter la sensibilité de la technique,
de réduire le nombre de ph3gocytes req~is.
~
-
.~H
°2
1
L -°2
.+
)
+ N
+ Lumière
2
OH
OOH
tf 0
1
2
2
H2
.0.
NH2
Luminel
ROL
o{-aminophtalate
Fioure 3 : Oxvdation du Luminel par les ROL
Ainsi, la mesure de la chimioluminescence est très sensible
et peut être réalisée avec des micro-échantillons de sang total, procurant
ainsi un reflet très fidèle de l'activité métabolique oxydative des phago-
cytes. L1intensité est proportionnelle au taux de radicaux oxygénés libres
produits.
1
- 14 -
2EME PARTIE : TRAVAUX PERSONNELS
1
- 15 -
1- 1ntroduct i on
Dans ce travai 1 pré 1i mi nai re de mi se au poi nt d'une techn i que de
chimioluminescence adaptée à l'évaluation des ROL produits au cours de la phago-
cytose, nous étudierons successivement
1°) Les valeurs moyennes de référence du point de vue numération et
formu le sangul ne de 100 sujets en bonne sarrté apparente venus
faire un bi lan à l'Institut Pasteur de DAKAR.
2°) Les quatre stimulis uti 1isés dans le déclenchement de la phagocy-
tose in vitro.
Il s'agit de deux stimulis solubles
acétate de phorbol myristate (PMA)
concanavaline A
(conc A)
et de deux stimulis particulaires : zymosan opsonlsé et particules
de 1atex.
Cette comparaison nous permettra de faire un choix sur les stimul.
soluble et particulaire qui donnent la mei 1leure réponse en chimioluminescence.
3°) L'évaluation globale de la capecité de< phagocytose du sang total
comparativement
à cel le
des cel Iules phagocytaires isolées: cel Iules
mononucléées et polynucléaires.
4°) La cin8tique du pouvoir phagocytaire in vitro du sang total après
un prélèvement veineux.
Le but est de savoir à quel moment la réponse en chimioluminescence
est optimale et quel est le délai maximum pour effectuer la mesure après le
prélèvement sanguin.
1
-
16 -
2- Matérie 1s
2-1- Réact ifs
- Dextran T 500 (Sigma)
5 g
%dans du sérum physiologique
conservation
température ambiante.
- Histopaque R- 1077 (Sigma)
Fi co Il type F 400 = 5,7 g %
Azide de sodium
9 g %
Conservation à 4° C.
- Bleu Trypan 0,4 %(Glbco)
• Di lution de la solution mère au 1/2 pour avoir une solution à 0,2 %'
Puis préparer une solution contenant
4 parties de Bleu Trypan
0,2 %
partie
de NaCI
4,25 %'
Conservation; température ambiante.
- Solution de chlorure d'ammonium 0,87 %
· chlorure d'ammonium •.•.....••.•....
8,32 g/I
• bicarbonate de Na
0,84 g/I
• EDlA •••••••••••••••••••••••••••••••
0,0439/1.
On ut i 1i se de l'eau di st i liée.
Conservation: température ambiante.
- Luminol (5 amino-2, 3-dihydro-1-4-phthalazinedione) (Sigma).
Dissolution dans du DMSO à la concentration de 2 mg/ml.
2M
Cette so l ut lon-mèr-e de 2. 10-
est conservée à la température ambiante
4
dans un flaconnage opaque et di luée le jour du test à 2". 10-
dans du PBS.
1
- 17 -
- So1ut! on de HANKS (Pasteur Produet 1on) dépourvu de phéno1 rouge
(10 X) add 1t lonnée de 0,35 %-t de NaHC0 3·
- DMSO (Prolabo)
dlméthylsulfoxyde.
- Acétate de phorbol myristate
= PMA (Sigma).
12-0-tétradécanoyl-phorbol-13-acétate.
Le PMA est dissous dans du DMSO à la concentration ee 2 mg/ml et
stockée à 4° C.
La solution stock est di luée en mettant 50 ~I dans 10 ml de peso
- Tampon P8S (Phosphate 8uffered Saline)
Pasti 1les (Oxoid) de composition suivante
NaCI 0,14 M, KCI 2,7 ml, Na
12 mt/j, Kh
1,5 ml, CaCI
0,5 mM, IvlgC'2 0,49mM.
2HP02
2P04
2
1 pesti 1le permet de préparer 100 ml de tampon peso
- Concanavaline A (Con A) (Sigma)
Dissolution dans du P8S à la concent rat lon de 1 mg/ml.
- Particules de latex (0,8 ~m) (Difco).
6
El les sont utilisées à une suspension de 6.10
particules/ml.
- Zymosan A (S igma) •
Le zymosan est opsonisé par contact d'une suspension de 50 mg dans 3 ml
de sérum humain frais et 1 ml de peso
On fait une incubation de 30 mn à 37°C suivie d'une centrifugation
1500 t pendant 10 mn à la température ambiante.
Le surnageant Gst enlevé, le culot lavé avec 4 ml de solution saline,
puis recentrifug&. Le nouveau culot est mis en suspension dans du PBS à la concen-
tration de 12,5 mg/ml. Pour le test, on prend 200 UI de suspension.
-
18 -
- "GTL" «(;.rowth T lymphocytes) (Blosys )
Ce milieu de culture contient
• Transferrine : quantité non précisée par le fournisseur
Sérum-albumine
1 9/1
Rouge de phénol
15 mg/I
Hepes
5,9 9/1
3,02 g/I.
2-2- Suspensions cellulaires
- Sang total: recueilli par ponction veineuse au niveau du pli
du coude sur tube contenant comme anticoagulant de l'héparine 1ithium (tubes de
5 ml). Le sang provient de sujets
normaux
dont la numération donne un nombre
de globules blancs situé dans la 1imite normale (4 000 - 10 000).
Les sujets dont la formule sanguine est normale sont retenus.
La di lution finale du sang est 1/10.
- Cel Iules mononucléées du sang périphérique isolées sur gradient
Ficoll : de densité 1,077 (70 %de lymphocytes, 30 %de monocytes) selon la
technique de Boyüm (5).
7
Suspension: 10
cellules/ml dans du GTL.
_. Polynucléaires isolés après sédimentation du sang sur gradient
de Ficol 1, puis sur Dextran T 500. On obtient des polynucléaires d'une pureté de
l'ordre de 90 %.
6/ml
Suspension cellulaire
5.10
dans du GTL.
- 19 -
2.3.- ~Qeê[§111ê9§
- Luminomètre 1251 (LKB-WALLAC).
Le lumlnomètre 1251 est composé de 3 parties princd,pales :
- le passeur automatique et la chambre de mesure des échantll Ions
- le tableau de commande
- l 'ét~etronique et le microprocesseur.
Le passeur automatique Introduit les échantll Ions dans la chambre de
mesure où le rayonnement lumineux émis sera détecté (1).
Le photomultipl icateur (2) convertit la lumière en un signal électri-
que qui est alors ampl ifié par un préampl ificateur (3). Le gain du photomultlpl 1-
cateur est stabilisé automatiquement. Les impulsions lumineuses envoyées par une
diode luminescente sont détectées par le photomultipl Icateur et la valeur de la
haute tension est ajustée automatiquement de sorte que le gain reste constant.
Le signal analogique ampl ifié est converti en une Information numéri-
que par un convertisseur analogique
digital (4). Ce signal suit deux voies dans
le dispositif (5) l'un à travers un fi Itre (6) et l'autre directement vers le
circuit Intégrateur (12). La réponse du fi Itre dépend de la constante de temps
utilisée (7) réglable à partir du tableau de commande (8). La sortie par le
fi Itre est utilisée lorsque le mode continu (9), le mode pic (10) ou le mode
pourcentage (11) est choisi pour évaluer l'intensité lumineuse. Le mode Intégra-
teur (12) uti 1ise l'information digitale avant qu'el le ne soit passée à travers
le fi Itre.
Il existe trois modes de sortie
- l'unité d'affichage (13)
- l'imprimante (14)
- le traceur de courbe (15).
L'affichage et l'imprimante uti 1isent l'information digitale tandis que
le traceur de courbe nécessite une nouvel le conversion en un signal analogique.
- 20 -
GaIn
s tabil .
KEYBOARO SECTION
- - - Heasurement signal
-------- Control signal
-
-
-
Software/Hardware
Figure 4
SCHEMA DESCRIP'l'IFDU LUMINOMETRE 1251
1. Chambre de mesure
14.
Impr iman te
2. Photomultiplicateur
15. Tracéur de courbe
3. préamplificateur
4. Convertisseur analogique digital
5. Module informatique
6. Filtre
7. Temps de réponse
8. Tableau de commande
9. Mode continu
10. Mode pic
11. Mode pourcentage
12. Mode intégrateur
13. unité d'affichage
~,
-21-
distributeur de réactifs
i "
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ordinateur avec
écran
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imprimante
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~ ,';i!~ ii~:~
~
,,\\);f.J"~;": \\;;i"~~.;> /
'.0
Luminomètre
.: : ,;,t'
\\ ]
u
-
.,
- 22 -
-
Ordinateur
(Apple 1le)
- Imprimante
(FacJt 4510)
3- Méthodes
- Cel Jules mononucléées.
Sang total hépariné
Centrifugation
1
!t
~.....
PI asma!~
"-";"'Cu lot
éliminé --
+ 2 volumes de HANKS
1
\\. .../
Mélange culot + HANKS
1
- 23 -
Dans un tube conique de 50 ml
R
on ajoute 10 ml d'hlstopaque - 1077
1i Pipette
'C' -', ~~--_lh + 30 ml du mé1ange cu lot-HANKS
puis centrifugation
lbOO t pendant 30 mn
"1/
-i/HANKS
-==1-'~ Cel 1u1es mononuc1éées
--+----Hlstopaque - 1077
1
---J..._.Cu lot g/obu 1al re
" /
Les cel Iules mononucléées sont transférées dans un tube conique à
l'aide d'une pipette pasteur
HANKS
Ce Il u les
._---
3 lavages avec HANKS
3 centrifugations à 1200 t pendant 10 mn
mis en suspension
k:~Vansdu GTL
La numération des cel Iules mononucléées (lymphocytes + monocytes>
est effectuée en présence de bleu Trypan de façon ~ apprécier la viabil ité
des cellules.
- 24 -
- Polynucléaires
~jGR
'--~. + 30 m1 HANKS
1
,l mé1ange sang- HANKS
Dans 1 tube conique de 35 ml
L_
•
+ 3 ml
de Dextran T 500
I
1
+
10 ml mélange sang - HANKS
1
1
"-..J
----tes tubes sont mis à sédimenter 30 mn au BM à
+ 37°C dans une position Incl fnœ(45°C>'
Les surnageants sont remis dans d'autres tubes
coniques et centrifugés à 3000 t pendant 20 mn
On ajoute 30 ml de chlorure d'ammonium pour
lyser les GR. On laisse en contact à + 4°C
pendant 10 mn.
Centrifugation 3000 t pendant 20 min à + 4°C
- 2 lavages avec HANKS
HANKS
Culot cellulaire (polynucléaires) + GTL
Comptage du nombre de cellules en présence de bleu Trypan.
- 25 -
El le comprend 3 étapes principales
- La préparation des échantillons.
Dans une cuvette en polystyrène calibrée, ajouter
-4
~
200 ul luminol 2. 10
Mole
500 ul de PBS
100 ul de sang total, de cel Iules mononucléées
ou de polynucléaires selon le cas.
- La programmation de l'essai à 1 lordinateur :
L'ordinateur (Apple 1 le) permet à partir d'une disquette contenant le
programme de phagocytose de préciser les conditions dans lesquel les se fera la
lecture par le luminomètre, des écha~ti 1 Ions.
- Démarrage de l'essai : lecture des échanti 1 Ions.
Les échantil Ions placés dans le portoir rotatif du luminomètre sont
mmenés automatiquement dans la chambre de mesure. Dès que la cuvette est en po-
sitlon de lecture, le réactif déclenchant (PMA, Con AI Zymosan opsonisé, ou
particules de latex) est ajouté par un injecteur automatique selon la quantité
programmée. Les lectures sont effectuées automatiquement et périodiquement en
fonction du nombre de cycles et des intervaJ les de mesure préalablement programmés.
L'écran de l'ordinateur et l'imprimante qui sont couplés au lumino-
mètre affichent les résultats au fur et à mesure, ce qui permet d1apprécier
la clnéttque de la réaction.
REMARQUE: Toutes les opérations se déroulent à + 37°C grâce à un système de
thermostatisatlon de l 'apparei liage et les cuvettes sont agitées en continu
dans la chambre de mesure.
- 26 -
4- Résultats et commentaires
4-1- Y21~~r§_~2~~DD§§_2§_rQfQr~~fQ_2§_1~_D~~~rê!12D_f2r~~1§
§êŒ9!:!lD§_i~E~)
Nous avons étudié le nombre de GB de 100 NFS de sujets venus faire
un bilan de santé à l'Institut Pasteur de Dakar. Les résultats sont présentés
dans le tableau 1 et la figure 5.
Nombre de GB/500 JJL
Nombre de sujets
" " .c;: 4000
6
4000 - 5000
26
5000 - 6000
28
6000 - 7000
rs
7000 - SOOO
17
SooO - 9000
5
9000 - 10 000
2
> 10 000
3
Tableau 1
Répartition du nombre de GB chez les 100 sujets étudiés.
- 27 -
~
30 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
251-----1mm
-----1111
15
20 ...
10 .....- - - - 1
5
<4000
4000-
5000-
6000-
7000-
6000-
9000-
>10000
!=ïOOO
MOO
7000
ROOO
QOM
10000
•
Fi gure ?J: Di 5 tri buti on de 100 NFS
1
- 28 -
Selon le tableau l, la plupart des sujets (84) ont un nombre de
globules blancs situé entre 4000 - 8000.
Dans la pratique quotidienne, les valeurs de référence des GB sont
comprises entre 4000 et la 000.
Cela représente 91 %de sujets considérés
normaux (f ig. 5),
Dans notre étude sur la phagocytose, nous avons retenu uniquement
des sujets qui ont un nombre de GB compris entre 4000 et 8000 représentant 84 %
de la population venue faire un bi tan.
En outre, la détermination de la formule sanguine a permis d'écarter
les sujets présentant des anomal ies quai itatives et quantitatfves des différentes
populations leucocytaires.
4-2- gQœEêrêl§QD_9~§_glii~r~D!§_§!1~~11_iE~~~_gQD_~L_Eêr!lf~l§§_g~
!ê!~~L_~ïœ2§~D_9E§QDl§~)
Nous avons tout d'abord essayé de déterminer le nombre de particules
de latex qui donne la meilleure réponse en chimioluminescence.
El le a été faite aussi bien avec du sang total qu'avec des cel Iules
isolées (cel Iules mononucléées et polynucléaires>.
Les suspensions de latex suivantes ont été étudiées
- 60 mi Ilions de particules par ml
- 12 ml Il ions de particules par ml
6
li
"
"
-1,2M"
"
Il
1
- 29 -
- 0,6 millions de particules par ml.
La dilution fTnale du sang total = 1/10e.
Toutes les supenslons ont été testées avec 100 ul de sang total et
nous avons retenu les valeurs moyennes des 3 échantillons.
Ce test a pour but d'estimer l'influence du nombre de particules de
latex sur la réponse du sang total en chlmioluminescence.
Les résultats obtenus sont présentés dans les tableaux Il et les
figures 6 et 7.
Nombre de particules de
CL en MV
Temps en
latex (millions)
minutes
0,6
7,775
27,66
1,2
8,789
27
6
18,89
22,66
12
22,128
15,66
60
10,238
8
Tab 1eau 11
Maximum de chimioluminescence et temps d'appartion
du pic selon le nombre de particules de latex.
1
o
C"")
~-
1
Figure 6 : Influence du nombre de
i: -1
...
...
1
...
,
...
particules de latex sur
...
!
...
lachimioluminescence et le
+ +
...
...
1
+
temps d'apparition des pics
..,
..a -
mesurée sur trois
-
....
:1
::
échantillons
......
..
#
~ "*t.
1
+
'
....
..
....
'#
1
de sang total avec 5 suspen-
+
,..,
-
1
*' ,..,
l
""
'*"
sions .
:#;
.
...
+
:t:
N
-
+ .
~
latex 12 M pic = 19, 55 Mv-
...
""
+
latex
6 M pic = 17,22 Mv
+
,.,
...
...
'1
~ latex 60 M pic = 15,25 Mv
•
+
...
+
.,.
til
'1
-AI- latex 1, 2M
pic = 8,493 Mvco~-
+
..t
"'" .... "" * 1<
..'
C)
1
latex O,6M
pic = 7,481 Mv
....
'JI
0 0 0
0
...
+
."
o
0
l
H'
(:)
(.)
+
.,.
0
H'
a
+
+
0
....
~...
0
...
1
0
'l'
..
1
m
0
0
...
...
.,.
1
~ -
•
+
...
' S 0
+ ...
..
1
0
+
0.,.
+
.
...
... ...
0 . , .
a.,.
+ ... +
!
+
o ' ! o o
f
a a .....
1i. __ .,..,. ... .,..,.
.1
.. ,. a .,. .,.
.,. .,. .,.
,1
CJ
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-..
-
--
-
--
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-
-
-
-
-
-
-
="'"
li:~:
1
~I
CJ
N
.....
-o
U)
CJ
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-0
<'0
CJ
N
""
-4:'
-o
co
- - - - .... ç" C"l C"-I C"-I C"-I
1
......
(V)
Figure 7
Influence du nombre de
0 -
,..
('~
,..
i:
...
particules de latex sur la
...
*
....
chimioluminescence et le temps
+ +
,..
...
d'apparition des pics mesurée
+
- 0 - -
,+
sur 3 échantillons de sang
-
,..+
"#
.u.
" .'.#, #: ;l..
+
"'-
:+:
# # #
total avec 3 suspensions ..
'*"
*' ...,
+
,.
."
'* '*
lit
latex
12 M pic = 19,55 Mv
,..
,..
+
+ *'
6 M
('~
-.
,..
+
1atex
pic = 17,22 MV'" 1
""'
,..
1atex
60 M
~
pic = 15,25 Mv
...
,..
....
*'
+
,..
+
1
...
i-
co -
:+:
,..
""'
.. ..-
..
+
t·
,..
1
,
,..
..
..
.
t
..... -
.
,..
.. ... ...
,.. ,.. ,..
..
... + •
+
•
.... .. ...
t +
-
,.
01------------------
"-- -- -- -- -
-
_.- .~-
._.
- " '
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:r
.:0
c:e
I~"~
"-*"
-ù
I.J J
Cl
0
lN
.....
-0
CIO
.....
~~
--*"
'..0
r-.,t
C ~
...
"',i
..-. ..
1...., •
......
-,'
",
- 32 -
J
1<j
Cor1fitt~nta ires :
[
Les résultats obtenus montrent:
- Un excès (60 M de particules/ml) ou un défaut (0,6 M/ml)
ne donnent pas les mei 1leures réponses en CL (fig. 6 et 7).
- Le temps d'apparition des pics ne dépend pas du nombre de
particules de latex car la suspension à 6 M par ml a le temps
le plus court (fig. 6 et 7).
4-2-1-2- ~Y~f_l§2_fQl!~1§2_1§Ql~§§_is§11~1§2_~2~2~~~1§~~2'
Q21t~~sl~êlr§§)·
La réponse en chimioluminescence des cel Iules isolées a été étudiée
avec les mêmes concentrations de latex que le sang total
- 60 M particules/mi
- 12 M particules/mi
6 M particules/ml.
Les cellules mononucléées Ci les polynucléaires ont été uti 1 isés dans
du mi lieu GTL aux concentrations su iv:";-es
cel Iules mononucléées
1o"'1m1
6
polynucléaires
5.lO/ml.
Les cellules proviennent d'un même échantillon.
- 33 -
L.es résultats sont présentés dans le tableau 1r 1 et les figures
8 et 9.
!
! Nombre de parti-
Cl
en
MV
Tomps
en
minutes
! c Iles de latex
!
(mi l l lons )
r
.. ~
", .
!
Ce 11u 1es mo-
Polynuclé-
Ce 11u1es mo-! Polynuclé-
,
nonucléées
aires
nonucléées
aires
6
80,91
955~7
3
4
12
50,65
774,5
5
5.5
!
!
!
!
60
62,29
629~4
4
4
! !
!
!
Tableau III
Chimlomul inescence et temps d'apparition des pics en
fonction du nombre de particules de latex.
1
~
p>
o
--
Figure 8
Influence du nombre de
c
~ .....
particules de latex
sur la réponse en chimio-
luminescence des cellules
0 -
... ... ... ...
mononucléées isolées à
~
...
...
...
... ...
partir du sang total
...
...
d'un même sujet:
... ...
+
+ +
...
o
--
+
-Q
+
+
...
+
+
...
+
.... ..,
lit
latex
6 M pic = 80,91 Mv
1
+
.- ... +
...
..
,..
+
latex 12 M pic = 62,29 Mv
..
.. .+-..
'" '*
CI -
..
""
..
+
...
....
1
...
....
+
... ... ,.. ...
:#- latex 60 M pic = 50,65 Mv
..
+ *' ..
...
.. .. 'If'
...
•
"" :tt.:
+
:f.J;:
:#
+
... ...
.... *' #.
... + + + + + ... +
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,;.;.~
- - - - - - - - - _ . _ - - -
_... ::-
t··,
~::
C'~
110
....
-Q
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co
....
·n
aJ
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. .
o
~
. . .
l~""
....
....
...1.)
.
N
r<l
r<l
....
....
Ln
-0
t- •
<0
....-
~
U.l
CV)
Figure 9 : Influence du nombre de
8-
i:~
... ...
particules de latex sur
...
... ...
la réponse en chimiolumi-
...
... ...
nescence des polynucléairesg,
...
isolés à partir du sang
...
+
,..
+
+
+
total d'un sujet:
+
+
...
+
...
,..
+
+
+ *'
+
*'
+
g-
-
+
..
li!
1atex
6 M pic = 955,7 My
1
..
,..
... :+:
•
...
..
..
+ 1atex 12 M pic = 77 4 , 5 My -.0 1
*' -
... *'1
..
*'
... ,..+ *'... :+: ,..
""
..
+
'# latex 60 M pic = 629,4 MY
+
*'
+ + *' *'
1
*'
..
+ +
8 --
*'
~I
*'
+
"*" '*"
....
'*" ~~: .#0 '*". "" ..
'*"
'""' *'
+
""
1
0 -
•
lGl
+
+
......
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o
._. -- -
-- -
....
-~ - -'. ~- ~-
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c·....
a~
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-41.11
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..
1,,1
"
..
. . . .
,.
-0
•
• •
• • • •
Cl
•
.....
",,1
......~
, . ,
, ..)
..~
.. :r
ln
4'
,;
r :
r'~
...:i
Commentaires
D'après les résultats, la suspension de latex 6 M donne la mei 1leure
réponse en CL aussi bien avec les cel Iules mononucléées qu'avec les polynuclé-
aires (fig. 8 et 9).
Le but de l'étude était de déterminer le nombre de particule de latex
qui convient le mieux pour la suite de notre travail. Les résultats obtenus avec
le sang total suggèrent de prendre 12 M de particules/mi et ceux obtenus avec les
cellules isolées, 6 t-l de particules par ml. Compte tenu que d'une part ces deux
concentrations de particules donnent des rendements peu différents et que d'autre
part le latex est 1 réactif onéreux, nous avons décidé de continuer notre étude
avec la suspensicn ê 6 M de particules de latex/ml.
4-2-2- S!~g§_g§~_glff§r§Q!§_~!1~~11_lE~~~_gQQ
__~~_f~~Q~2Q_QQ~2Ql~~,
Qêr!ls~l§~_g§_lê!§~_§_~)
La comparaison des 4 stlmul i a été faite sur la échantil Ions de sang
tota 1.
Tous les échantillons ont été mesurés avec chaque stimuli pendant
30 cycles de 1 mn salt 30 déterminations.
Les résultats sont présentés dans la figure la.
Cette représentation graphique montre que pour trois des stimul i
(PMA, Con A, Zymosan opsonisé) le pic de chlmioluminescencc apparaît entre le
8e et la 14e minute alors que pour les particules de latex, le temps de latence
est plus long puisqu'il dépasse 22 minutes.
-
37 -
CL (Mu)
20
15
lateH 6 M
Con"
10
5
Zgmosan opsonlsé
TEMPS (min.)
o
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
Figure 10
Influence des stimuli sur la réponse en chimioluminescence
déterminée en utilisant la moyenne arithmétique des luminescences
et du-temps d'apparition des pics de 10 échantillons de sang total.
1
- 38 -
Commentaires
Afin de choisir les stimuli soluble et partlculaire, nous avons
réalisé une étude statistique des valeurs maximales de la chimiolumlnescenee
(CL max) et du temps d'apparition des pics (T max).
Il résulte de cette étude que:
- Le temps d'apparition des pics est Influencé de manière hautement
significative par la nature du stimuli. Au risque de 5 %, le seui 1 de slgnlflca-
tlvité déterminé
à l'aide du coefficient de Fischer est de 0 %.
- La différence entre la chimioluminescence maximale du PMA et cel le
de la Con A n'est pas significative car le seuil de significatlvité est de 15 %
au risque de 5 %admis. Cependant el le est hautement significative entre le latex
6 M et le zymosan opsonlsé k = 0 %.
Ainsi, notre choix s'est porté sur les particules de latex 6 M pour
les stimul i partlculaires et sur le PMA en raison de la meilleure réponse en
chlmiolumlnescence pour les stimuli solubles (fig. 10).
4-3- s~~1~~!12~_9!2Q~!§_2§_!~_~êe~~1!§_2§_Qb~9Q~~!22§_2~_§~~9_!Q!~!
~Q~Q~r~!1~§~§~!_ê_f§1!§_2§2_s§!1~1§2_Qb~gQ~~!~lr§2_12Q!§§~
(~§!1~!§2_m9~9~~f!§§§2_§!_Q9!~~~f!§êlr§2)
L'évaluation a porté sur les échantllJons suivants
- sang total
dilution finale 1/10
7
- cel Iules mononucléées : 10 / ml dans du GTL
6
- polynucléaires: 5.10 / ml dans du GTL.
1
- 39 -
Chaque échantl 1lo~
est mesuré avec le PBS pour déterminer la réponse
de base tn vitro sans stimulus exogène
ensuite avec le PMA et les particules
i
de latex à 6 Mimi.
L'objectif de cette comparaison est de connaître le comportement
en chlmloluminescence du sang total et des cellules phagocytaires isolées
d'une même personne.
Les résultats sont exprimés par les figures 11, 12, 13. Chaque
cyc 1e représente 36 secondes • Ex;emp 1G (:;/10 cye 1es correspondent à 360 secondes
c'est-à-dire 6 mn.
1
ln"
o
o
-
40 -
o
~
pic = 689,1 Mv
5
10
15
25
30
cycles
mv.
(b)
pic = 79,69 Mv
1
5
10
15
20
25
30
cvcles
mv
o
...
(a)
1
pic = 3,083 Mv
----------------
5
10
15
20
25
30
cycles
Fi gure 11
Courbes obtenues avec 1e PBS
( a) sang total
(b) cellules mononucléées
(c) polynucléaires.
11\\1
0
Q
- 41 -
0
~
( c)
p~c = 955,8 Mv
0
0
III
...
/
8
5
10
15
20
25
30
cycles
irrnv
i -
, 8
...
o
III
e
...
1
5
10
15
20
25
30
cycles
mv
e
...
(a)
pic = 3,2 Mv
------------
5
10
15
20
25
30
cycles
Figure 12 : Courbes obtenues avec PMA
(a) sang total
(b) cellules mononucléées
(c) polynucléaires
tl\\V
o
o
- 42 -
$
= 800,8 Mv
-
-
5
10
15
20
25
30
cvcle s
mv
(b)
pic = 96,47 Mv
1
5
10
15
20
25
30
cycles
mv
o
~
(a)
pic = 3,1 Mv
-.
-
5
10
1:5
20
25
30
cvcl es
Figure 13
courbes obtenues avec particules de latex 6 M/ml
(a) sang total
(b) cellules mononucléées
(c) polynucléaires.
1
- 43 -
Commentaires
Les résultats montrent que:
- L'allure des courbes obtenues avec les différents stimuli est la
même aussi bien avec le sang total qu'avec les cel Iules phagocytaires isolées.
- La réponse en intensité est beaucoup plus importante, elle varie
de 10, 100 et 1000 respectivement pour le sang total, les cel Iules mononucléées
et les polynucléaires.
- Le temps d'apparition des pics est plss court pour les cel Iules
Isolées que pour le sang total.
4-4- glŒ~!19~§_2~_Q2~~21r_Qbê9Qf~têlr§_lD_~!!r2_~~_§~~9_!2!~l
êQr§~_~D_Qr§l~~§~§D!_Y§lD§~~
Cette étude cinétique du sang total consiste à mesurer la CL à
différents interval les de temps:
immédiatement après le prélèvement
To + 0
- deux heures
"
"
To + 2
- 4 heures
11
11
To + 4
- 6 heures
"
"
To + 6
-24 heures
"
"
To + 24
La cinétique a été réal isée sur 12 échanti 1 Ions de sang total avec
comme stimulus soluble, le PMA et comme stimulus particulaire les particules de
latex 6 M.
Les résultats sont présentés dans les figures 14 et 15.
- 44 -
CL (Mu)
20
10
10+2
TO+4
15
10
5
TEMPS (min)
o
fi
9
12
15
18
21
24
27
30
Figure 14
évolution de la chimioluminescence par rapport au dél~i
entre le prélévement et la mesure avec PMA comme stimulus
observée sur 12 échantillons de sang total.
1
- 45 -
CL (Mu)
20
15
10
10+2
10+24
5
TEMPS (min)
o
fi
9
12
15
18
21
24
21
30
Figure 15
Evolution de la chimioluminescence par rapport au délai
entre le prélévement et la mesure avec particules de latex
6 Mcomme stimulus observée sur 12 échantillons de sang total.
,1
- 46 -
Commentaires
Il apparaît dans les figures 13 et 14 que:
- le temps d'apparItion des pics le plus court est obtenu avec To + 24.
- la luminescence Môxtmôlc ost ~ To + 4.
L'étude statistique effectuée sur la chimioluminescence maximale et
le temps d'apparition des pics pour les différents délais entre le prélèvement
et la mesure a permis de tleer un certain nombre d'enseignements.
Le délai entre le prélèvement et la mesure:
a) ne modifie pas de façon significative la valeur maximale de
la luminescence puisque au risque de 5 %, le seuil de significati-
vité est de 8 %' Cela montre que les échantll Ions peuvent attendre
24 heures sans que la différence entre les résultats ne soit
notable.
b) modifie de façon signIficative le temps d'apparition des pics
puisqu'avec un même risque de 5 %, le seui 1 est de 1,33 %pour
le stimulus PMA alors que pour les particules de latex, il est de
5 %donc moins sIgnificatif que dans le cas du PMA.
Il découle de cette étude cinétique que la valeur maximale de la
chimioluminescence ne varie pas de mani~re significative dans les 24 heures
qui suivent le prélèvement.
- 47 -
- DIS eus S ION S -
- 48 -
5- Discussions
la phagocytose est un puissant moyen de défense non spécifique de
l'organisme. Elle fait appel à de nombreuses cel Iules et se déroule selon un
processus complexe.
Pour l'étudier, nous avons~ au laboratoire d'Immunologie cellulaire
de l'Institut Pasteur de Dakar, utilisé le phénomène de chimloluminescence.
Un lumlnomètre automatique a permis de mesurer les photons émis lors de "Inter-
action des ROl avec le
luminol. l'Intensité lumineuse est proportionnelle à
la quantité de
ROl.
Durant la mise au point de la technique de chlmioluminescence, les
réactifs ont été testés pour déterminer la concentration standard.
Ainsi
le luminol, amplificateur de la réaction est uti 1isé à la
-4
concentration de 2. 10
moles.
le choix des stimul i a fait l'objet d'une attention partlcul ière.
Ils ont été comparés avec le tampon PBS, tampon servant à leur dilution. lien
est ressorti que chez certains sujets la réponse au PBS traduit une production
élevée de ROl en l'absence de stimulus exogène. Ceci pourrait être dû à la pré-
sence d'agents Infectieux fréquents en zone tropicale (parasites, virus, bacté-
ries), endogènes, qui jouent le rôle de stimul i.
la comparaison des stimul i entre eux selon les concentrations utilisées
a montré que
- PMA et Con A ne présentent pas une grande différence. le choix
de l'un ou l'autre dépendra de 1iexpérimentateur, cependant la
réponse en chlmioluminescence obtenue avec le PMA est plus régulière
pour un même échantil Ion.
- 49 -
Les particules de latex donnent une réponse meilleure que le
zymosan opsonisé mals le temps d'apparition du pic est beaucoup
plus court pour ce dernier.
La nature de l'échantillon à étudier chez les ujets normaux de
référence pose un certain nombre de problèmes.
En effet la conservation des polynucléaires reste toujours préoccupante, et
certaines populatIons présentent une diminution d'activité au bout de quelques
heures. La demi-vie biologique des polynucléaires neutrophi les marqués à la
thymidine tritlée est de 7,6 heures. Les cel Iules mononucléées, outre leur
demi-vie biologique (8,4 heures) ne sont pas considérées comme éléments jouant
un rôle très important dans la phagocytose.
Le sang total donne une réponse peu intense en chlmioluminescence
du fait de sa complexité qui ne facI 1ite pas le contact des stimul i avec les
cel Iules phagocytaires.
Des solutions à ces problèmes ont été proposées dans ce travail.
Ainsi, Il a été montré comme l'avait suggéré Mme DESCAMPS (16), que la réponse du
sang
total, malgré son Intensité assez faible était de même nature que cel les
des polynucléaires ou cel Iules mononucléées. Cela confirme l'intérêt du sang
total pour étudier la phagocytose en technique rapide.
Le sang total présente de nombreux avantages
- il n'y a pas de séparation préalable comme pour les polynucléaires
ou cel Iules mononucléées
la conservation est bonne, et la réponse stable.
Les polynucléaires:semblent être mieux conservés dans le sang
total dont la chimioluminescence maximale ne varie pas de manière
importante dans les 24 heures qui suivent 10 prélèvement.
- 50 -
Le temps d'apparition du pic beaucoup plus court peut être expliqué
par la disparition dans le temps de nombreux facteurs sanguins, ce qui facilite
le contact entre stimuli et cel Iules phagocytaires.
Les avantages cl-dessus peuvent nous conduire à utiliser le sang
total dans l'étude de la phagocytose dans des
situations pathologiques parti-
culières.
Des auteurs (16, 17) ont déjà appliqué cette méthode à la granuloma-
tose chronique, au déficit génétique en myélopéroxydase. Actuellement Il est
bien établ i que les ROL ont un effet toxique sur les parasites du paludisme.
C'est pourquoi de nombreuses équipes étudient le rôle exact des cel Iules phago-
cytaires dans l'Immunité non spécifique anti-parasltalre. lisera alors possible
de préciser grâce aux techniques de chlmloluminescence la quantité de ROL qui
pourrait provoquer des dommages sur les tissus du malade.
Cette production de ROL sera intéressante à étudier chez les sujets
lépreux car le mycobact~rium Zéprae a un développement Intracellulaire dans les
cel Iules de la 1ignée monocyte-macrophage. Cela pourra permettre de préciser les
raisons pour lesquel les le baci 1le de HANSEN se multipl le sans être détruit:
- Soit la phagocytose est trop élevée et les antigènes du bacll le
sont trop dégradés et mal présentés au système Immunitaire à média-
tion cellulaire d'où une mauvcise activation des lymphocytes.
- Soit la phagocytose est insuffisante par défaut d'aptitude des
cel Iules phagocytaires à la bactéricldle.
1
- 51 -
- CON C LUS ION S -
- 52 -
- CON C LUS ION S -
La défense non spécifique de l'organisme contre les infections
est assurée par la phagocytose. Les micro-organismes sont opsonisés par les
Immunoglobul ines, le complément et éventuellement la fibronectine avant d'être
Ingérés et tués par les phagocytes.
Dans ce travail préliminaire, nous avons mis au point la technique
de chimloluminescence (Iumlnomètre 1251 LKB) pour étudier ln vitro la phagocy-
tose. Les différents paramètres ont été analysés et optimisés. L'uti lisatlon du
sang total pour une évaluation r~plde de l'activité phagocytaire par le test
de chlmioluminescence est d'un grand intérêt d'autant plus que la chimlo!umlnes-
cence maximale ne varie pas au bout de 24 heures.
En zone tropicale, les affections parasitaires, bactériennes et
virales constituent un problème de santé publ ique. C'est pourquoi l'OMS a
classé le paludisme et la lèpre dans le programme spécial de recherche et de
lutte contre les maladies tropicales.
i
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- B 1 BLlO GRAPHI E -
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TABLES
DES
MATIERES-
Pages
1NT~DUCT ION
'
..
1ERE PART 1E : ETUDE DE LA PHAGOCyTOSE..... • • • . • . • • • • • • • . • • • • • • • • •
2
1- L'a dhés ion .. .. .. .. .. .. .. .... .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..
3
1-1- Le chi mlot act 1sme. • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • . • • •
3
1-2- L'opsonfsatton
3
2- L t Inqesf l on , .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ....
4
2-1- l' eng 1obement .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..
4
2-2- La dégranulation
4
2-3- La bactéricidfe
5
3- Devenir de la particule ingérée
9
3-1- DigestIon
9
3-2- Persistance
9
3-3- Ml1lltlpllcatlon •••••••••••••••••••••••••••••••••
9
4- Importance des radicaux oxygénés 1ibres (ROL)
dans la phagocytose:
infections bactériennes
et paludisme à Plasmodium falciparum
10
5- Techniques d'étude de la phagocytose ••.••••••••..••• 11
5-1- Techniques permettant de tester la
mobllltédescellules ••.••••••.•••••••••••••••• 11
5-2- Techniques permettant d'étudier l'Ingestion ••.•
ln
5-3- Techniques étudiant l'activité tueuse ••••••.••• 12
6- L'utilisation de la chlmioluminescence pour
l'étude de 1a phagocytose........................... 12
- 2 -
2EME PARTIE: TRAVAUX PERSONNELS •..•.....•.. , , .. , •. l'' •.... ..•.
1~~'
1- IntroductIon.......................................
15
2 - Maté rie 1. . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
16
2-1 - Ré act , f s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
16
2-2- Suspensions cellulaires
18
2-3- Apparei liage •..•.....••.••...........•.....•.•
18
3- Méthodes............................................ 22
3-1- SéparatIon des suspensions cellulaires •..•..••. 12
- Cel Iules mononuclééos .......•.......•......•• 22
- Polynucléaires ...•...........•..........•.•.
24
3-2- Mesure de la chimiolumlnescence .............••
25
4- Résultats et commentaires..........................
26
4-1- Valeurs moyennes de référence de la
j~
Numération Formule Sanguine (NFS) .....•...•...
26
4-2- Comparaison des différents stimuli (PMA. Con A, ,,"
particules de latex, zymosan opsonlsé) ........• 28
4-2-1·
Etude du nombre de particules de latex.28
4-2-1-1- Avec du sang tota 1 • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• 28
4-2-1-2- Avec des cel Iules isolées (cel Iules
mononucléées, polynucléaires) •..•••... 32
4-2-2- Etude des différents stimul i (PMA, Con A,
Zymosan opsonisé, particules de
1at ex 6 M).............................. 36
4-3- Evaluat'on globale de la capacité de phagocytose
du sang total comparativement à cel le des
ce Il u 1es phagocyta ires i sa 1ées.. .. .. .... .. .. .. .
38
- 3 -
4-4- CinétIque du pouvoir phagocytaire in vitro
du sang total après un prélèvement veineux ....
43
5- DiscussIons........................................
47
6- Concl usions.....
51
BIBLIOGRAPHIE •••••••••............•..•.•.....•..••.•.....•...•••
53
J