UNIVERSITKLOUIS PASTEUR
présentée à
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l'UER des Sciences Pharmaceutiques
.'~:
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pour obtenir le grade de
DOCTEUR D'ETAT ES SCIENCES PHARMACEUTIQUES
par
Papa Amadou DIOP
MISE AU POINT DES METIIODES DE DOSAGE DES VITAMINES
HYDROSOLUBLES DANS LES ALIMENTS PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE
LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE
Application à la détermination de la composition vitaminique des aliments consommés en
Afrique de l'Ouest
....
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Soutenue le 25 septembre 1987 devant la Commission d'Examen :
MM.
P. LAUGEL
Président
D.BA
C. HASSELMANN
Examinateurs
A. ROUGEREAU
Mme
C. SOULES
ri

TABLE.
D~S MATIERES
Introduction
Première partie : Etude de la vitamine C .
3
Chapitre 1 : Structures et propriérés physicochimiques
5
de la vitamine C .
1. Structure des molécules à activité antiscorbutique.
5
A. L'acide L-ascorbique
5
B. L'acide déhydro L-ascorbique
5
C. Isomères et produits d'oxydation de l'acide
6
L-ascorbique et déhydro L-ascorbique
D. Dérivés de l'acide L-ascorbique
6
II. Propriétés physicochimiques des acides L-ascorbique
12
et déhydro L-ascorbique •
Chapitre 2 : Dosage de la vitamine C dans les aliments.
12
1. Les méthodes de dosage
de la vitamine
C -
13
Rappels bibliographiques.
A. Dosages directs de la vitamine C
..
13
B. Dosage de la vitamine C après l'avoir ·iaolé
15
de son substrat
II. Choix des méthodes de dosage de la v i t ami.neE soumises
19
à l'étude comparative.
III. Etude comparative des méthodes de dosage de la vitamine C.
22
A. Première analyse circulaire. Comparaison des méthodes
22
titrimétrique , colorimétrique et de la chromatographie
en phase liquide haute performance sur échangeurs
d'anions faibles.
B. Problème de la réduction de l'acide déhydro L-ascorbique
26
par la DL-homocystèine et ses conséquences en
chromatographie en phase liquide haute performance.
C. Problème posé par l'instabilité du temps de rétention
29
de l'acide L-ascorbique en présence de DL-homocystéine.
D. Deuxième analyse circulaire. Etude comparée des méthodes
30
CEE, fluorométrique et de la chromatographie en phase
liquide haute performance par appariement d'ions.
E. Etude de la reproductibilité de la méthode de dosage de
33
la vitamine C par chromatographie en phase liquide haute
pe~formance (paires d'ions) dans le cas d'un aliment
riche en acide déhydro L-ascorbique.
Comparaison avec la méthode fluorométrique.
F. Etude critique des autres méthodes de dosage de la
38
vitamine C totale par chromatographie en phase liquide
haute performance.
.
IV. Résumé et conclusion.
38

Deuxième partie : Etude
des vitamines du groupe B •
40
Introduction .
40
Chapitre 1 : Structures et propriétés physicochimiques des
42
vitamines BI, B2, B3 et B6.
1. Structures et nomenclatures.
42
II. Propriétés physicochimiques des vitamines BI,B2, B3 et B6.
44
A. Stabilité
46
B. Propriétés spectrales
46
Chapitre 2 : Séparation et dosage simultanés des vitamines B
53
(BI, B2, B3 et B6) par chromatographie en phase
liquide haute performance.
1. Séparation par chromatographie en phase liquide haute
53
performance des solutions étalons de ·vitamines du groupe B.
II. Application de la technique de séparation multiple des
56
vitamines du groupe B aux aliments • Ses limites.
Chapitre 3 : Le dosage des vitamines BI et B2 dans les aliments.
58
Mise au point d'une méthode par chromatographie en
phase liquide haute performance.
1. Dérivation précolonAe ou postcolonne pour le dosage de la
59
thiamine.
II. Mise au point d'une méthode d'extraction des vitamines BI
60
et B2 dans les aliments.
III. Choix des conditions chromatographiques
Système de
68
détection ; phases stationnaire et mobile.
Chapitre 4 : Le dosage de la vitamine B3 dans les aliments.
75
Mise au point d'une méthode par chromatographie en
phase liquide haute performance.
1. Mise au point d'une wéthoè2 ~'extraction de la vitamine B3
77
(acide nicotinique et nicotinamide) dans les aliments.
II. Choix des conditions chromatographiques : système de
82
détection, phases stationnaire et mobile.
Chapitre 5 : Le dosage de la vitamine B6 dans les aliments
93
Mise au point d'une méthode par chromatographie en
phase liquide haute performance.
1. Mise au point d'une méthode d'extraction de la vitamine B6
94
dans les aliments.
II. Choix des conditions chromatographiques : système de
IJ2
détection, phase stationnaire, phase mobile.

Troisième partie
Composition v i.t anîi ni que des al iments africains.
119
Couverture des besoins vitaminiques.
Introduction
119
Chapitre
Présentation des aliments.
121
Chapitre 2
Vitamine C et alimentation 1es h a b i t a n t s de
128
l'Afrique de l'Ouest.
1. Teneurs en vitamine C des aliments originaires de
128
l'Afrique de l'Ouest.
II. Besoins quantitatifs en vitamine C pour l'organisme.
131
Apports conseillés.
A. Les besoins
131
B. Réserves en vitamine C de l'organisme
133
C. Apports quotidiens conseillés
134
III. Couverture d~s besoins en vitamine C par l'alimentation
136
chez le Sénégalais.
Chapitre 3 : Vitamines B (BI, B2, B3 et B6) et alimentation
138
des habitants de l'Afrique de l'Ouest.
1. Les teneurs en vitamines B (BI, B2, B3 et B6) des aliments
138
originaires de l'Afrique de l'Ouest.
II. Besoins quantitatifs en vitamin~B.
Apports conseillés.
149
III. Satisfaction des apports recommandés en vitamines
153
BI, B2, B3 et B6.
RESUME ET CONCLUSION
157
Annexe 1
Réactifs et matériels.
r
Annexe 2
Description des différentes méthodes de dosage des
V
vitamines hydrosolubles .
Annexe 3
Noms et numéros correspondants des .Laboratoires ayant
xxx
participé
aux différentes analyses interlaboratoires.
Références

-
1 -
INTRODUCTION
L'intérêt que portent les pays développés aux problèmes alimentaires en
Afrique se manifeste essentiellement lorsque,
pour des raisons climatiques
particulièrement défavorables ou à 1a suite de troubles politiques importants,
se développe,
souvent dans des régions
très localisées,
une épidémie de
fami ne.
Les moyens d'information moderne déplacés sur place ébranlent la bonne
conscience des populations des pays nantis et repus à l'aide d'images souvent
difficilement supportables. A la suite de quoi un élan de solidarité, canalisé
par des organismes nationaux ou internationaux, pas toujours désintéressés,
se
développe,
permettant avec.un retard.plus ou moins important,
de corriger ce
grave déséquilibre alimentaire. Lorsque tout rentre dans l'ordre habituel, les
moyens
d'information
se retirent et
laissent
le
pays
avec
ses carences
alimentaires chroniques,
moins spectaculaires, mais néanmoins dramatiques car
elles sont un frein efficace à tout développement économique.
Bien sûr,
il existe dans de nombreux pays d'Afrique des équipes de
recherches qui,
grâce principalement à l'Organisation Mondiale de la Santé
(OMS) et à l'Organisation pour l'Alimentation et l'Agriculture (FAO),
et en
.collaboration avec certains laboratoires des pays développés,
comme c'est le
cas au Sénégal entre l'ORANA et l'Institut de Nutrition de Tours,
effectuent
des recherches originales dans le domaine de la nutrition africaine.
Mais les
moyens
financiers
mis
à
la
disposition
de telles
initiatives
restent
dérisoires si on les compare aux sommes importantes qu'engloutissent les pays
développés pour résoudre les problèmes que pose la suralimentation. Il suffit,
pour s'en persuader, de parcourir la littérature scientifique dans ce domaine.
Des études séri euses de nutriti on ne peuvent être menées à bi en que si
les al iments consommés sont
parfaitement connus du point de vue de leur
composition chimique.
Or dans ce domaine également,
il est· aisé de constater
que les
aliments africains n'ont fait
l'objet que d'un nombre extrêmement
restreint d'études analytiques,
si
l'on excepte celles réalisées sur des
aliments entrés dans l'alimentation des habitants des pays développés.
Devant cette situation peu satisfaisante,
nous avons souhaité apporter
notre
modeste
contribution
à
une
meilleure
connaissance
des
aliments
africains.
Modeste
parce que nous nous
sommes
limités à une
région de
l'Afrique,
l'Afrique de l'Ouest, et à une famille de composés chimiques très
particulière, les vitamines hydrosolubles.

-
2 -
Cette étude,
en grande partie analytique,
a débuté début 1981 à la
Faculté de Médecine et de Pharmacie de Dakar (Sénégal) et s'est poursuivie à
partir de 1984 dans
le Laboratoire
Interrégional
de la
Direction de la
Consommation et de la Répression des Fraudes de Strasbourg.
Nous avons ainsi
cherché à mettre au poi nt des méthodes ana1yti ques modernes (surtout par
chromatographie en phase liquide haute performance) pour la détermination de
ces
vitamines,
en remplacement
des anciennes méthodes
microbio1ogiques,
photométriques ou f1uorométriques,
souvent complexes,
difficiles à mettre en
oeuvre et de spécifité incertaine.
La première partie de notre travail a été
consacrée à la vitamine C,
la deuxième partie aux vitamines du groupe B
(B1,B2,B3
et
B6).
Ce
travail
s.'est
harmonieusement
intégré
dans
le
fonctionnement de la Commission Générale d'Unification des Méthodes d'Analyse
(Commission des Produits Diététiques ~t de Régime) qui,
depuis fin 1983 a mis
à son programme d'activité la rédaction des méthodes officielles d'analyse des
vitamines dans les aliments diététiques. Notre rôle, dans cette association, a
été de proposer des méthodes de dosage originales,
de les soumettre,
lors
d'analyses circulaires,
à la critique des différents laboratoires participant
aux travaux de cette commission
(dont le
nôtre),
et
éventuellement d'y
apporter les modifications nécessaires.
Cela explique que nous avons été
amenés à faire figurer dans ce travail, et en accord avec Madame la Présidente
de la Commission Générale d'Unification des Méthodes d'Analyse,
un certain
nombre de résultats obtenus au cours des analyses circulaires,
puisque ces
résultats représentaient un contrôle des travaux que nous avions effectués.
Ayant ainsi à notre disposition un ensemble de méthodes analytiques
modernes,
sensibles et spécifiques,
nous avons appliqué celles-ci,
dans la
3ème partie de notre travail,
à l'étude de la composition vitaminique d'un
grand nombre d'aliments consommés au Sénégal :
des céréales,
des tubercules,
des légumineuses et de très nombreux fruits (29 au total). Les fruits nous ont
parti cu1i èrement i ntéres sês parce qu' ils
con st i tuent prat i quement 1es seu1s
aliments consommés crus en Afrique et peuvent ainsi représenter une excellente
source de vitamines hydrosolubles,
bien supérieure à celle fournie par les
autres aliments qui,
comme c'est en général le cas dans la cuisine africaine,
\\(
subissent une cuisson trés prolongée..

1ère PARTIE
ETUDE DE LA VITAMINE C

-
3 -
La découverte de la vitamine C au début du XXe siècle est liée à l'étude
d'une maladie connue, elle, depuis l'antiquité: le scorbut. Cette maladie qui
est presque
toujours mortelle se manifeste es senti e llement par une fati gue
générale,
des douleurs aux jambes,
des hématomes au niveau des cuisses,
des
hémorragies intestinales et occulaires et une perte des dents.
En hiver,
durant tout le Moyen Age, le scorbut' était endémique.
On trouve des traces
de son existence dans l'Ancien Testament.
La
première description de cette maladie a été faite par le Sire de Joinville
dans son récit de la croisade de Saint-Louis en Egypte au XIIIe siècle.
L'évolution des connaissances concernant la prévention et le traitement
du scorbut fut liée à l'essor de la navigation à partir du XVIe siècle et au
probl ème posé
par
l'al i mentati on des équi pages des grands
bateaux.
C'est
ainsi que le capitaine Jacques Car-t i er,
au cours d'un voyage à Terre Neuve en
1535,
parvint à enrayer une épidémie de scorbut en nourrissant son équipage
avec une décoction d'aiguilles de pins. Dans certains écrits des XVIe et XVIIe
siècles,
le scorbut était considéré comme une maladie vénérienne rapportée et
transmise par
les marins.
Ce n'est qu'au milieu du XVIIIe siècle que le
docteur James Lind publia un traité qui décrivit le scorbut comme une maladie
diététique due à une déficience en légumes frais.
Fort de cette publication,
le capitaine Cook maintint la santé de son équipage,
pendant son long périple
autour du monde de 1772 à 1775,
en ajoutant dans les rations alimentaires des
légumes et du jus de citron.
En dépit des progrès réalisés dans la lutte contre le scorbut,
cette
maladie a encore sévi durant la guerre de sécession américaine et au cours de
la première guerre mondiale.
L'histoire moderne de la recherche sur le scorbut,
qui conduisit à la
découverte du facteur antiscorbutique,
a commencé en 1918 avec les travaux de
HARDEM et ZILVA (1918) et ZILVA et WELLS (1919).
Ces auteurs ont trouvé dans
le
jus
de citron
une substance
acti ve contre
le
scorbut
et
ont
décrit
certaines de ses
propriétés physiques et chimiques.
En 1927,
TILLMANS a
expliqué les observations faites
par ZILVA
et a confirmé les
propriétés
réductrices de la substance.
Ce facteur antiscorbutique a été isolé pour la
première fois par SVIRBELY et SZENT-GYORGYI (1932a).
Ces auteurs ont extrait
du
cortex
surrénal
un
composé
cristallin
fortement
réducteur
qu'ils
caractéri sèrent comme étant un aci de hexuroni que de formule bruteC
La
6H806.
même année,
SVIRBELY et SZENT-GYORGYI (1932b) firent la relation entre le
composé ainsi
isolé et le facteur réducteur de ZILVA.
Ils confirmèrent son
activité
antiscorbutique.
REICHSTEIN et al
(1933) réalisèrent
la synthèse
complète du facteur réducteur de ZILVA ; la même année HOWART et SZENT-GYORGYI
proposèrent de l'appeler acide ascorbique.

-
4 -
Il
a été montré par la
suite que l'action antiscorbutique dans les
aliments était due exclusivement à la forme L de l'acide ascorbique,
ainsi
qu 1 à sa
forme
oxydée,
l' aci de déhydro
L-ascorbi que (PROCHAZLA,
1965) .
L1ensemb1e de ces deux substances constitue la vitamine C.
C'est certainement la vitamine dont le nom,
largement utilisé dans les
campagnes publicitaires pour les frltits, est le mieux connu
du public. On lui
attribue de nombreuses vertus thérapeutiques,
notamment en cas de grippe,
de
fatigue;
ce st la raison pour l aquel le on la retrouve dans de nombreuses
spécialités pharmaceutiques.
Pourtant,
en dépit de cette célébrité,
ses
propri étés ph armaco loqi ques restent très controversées et l' esti mati on des
besoins
journaliers
de
l'organisme
humain
est
imprécise
et
varie
considérablement dun pays à l'autre.
Par ailleurs,
les méthodes de dosage
dans les aliments manquent,
pour la plupart,
de spécificité ou ne dosent que
l t aci de L-ascorbique.
Or aucune étude nutritionnelle sérieuse ne peut être
entreprise sans
avoir à sa disposition des méthodes analytiques correctes.
Clest
la
raison
pour
laquelle,
après
avoir
succintement
rappelé
les
principales propriétés de la vitamine C (chapitre 1) nous avons procédé,
dans
le chapitre 2,
à une vaste étude comparative des méthodes de dosage de la
vitamine C dans les aliments.
La méthode qui finalement nous a paru la plus
satisfaisante a été utilisée pour procéder au dosage de la vitamine C dans les
aliments
(essentiellement
dans les
fruits
de
cueillette)
originaires
de
11Afrique de l'Ouest (3ème Partie).

-
5 -
.: CHAPITRE 1
STRUCTURES ET PROPRIETES
PHYSICOCHIMIQlIES DE LA VITAMINE C
1. ·STRUCTURES·DES·MOLECULES A ACTIVITE ANTISCORBUTIQUE
A•. L~acide.L~ascor.bique·
Dans
les
aliments
frais,
l'activité
vitaminique
C
est
essentiellement due à l'acide L-ascorbique (figure 1).
Figur.e.l
Formule développée de l'acide L-ascorbique.
L'acide
L-ascorbique
est
quelquefois
appelé
acide
L-
xyloascorbique car il peut être synthétisé à partir du xylose.
Sa formule
développée correspond à l'acide y lactone L-thréohexo-2 énonique.
Ces trois
appellations sont
reconnues depuis
1965
par
la
Conmission
de
Nomenclature
Biochimique.
La dénomination
acide L-ascorbique est de très
loin
la plus
utilisée.
B.L· acide déhydro L-ascorbigue
Lors du stockage des aliments. ou au cours de leur transformation,
l'acide L-ascorbique peut s·oxyder partiellement en acide déhydro L-ascorbique
(figure 2).
Cette molécule possède une activité vitaminique identique à celle
de l'acide L-ascorbique.

-
6 -
Figure 2 : Formule développée de l'acide déhydro L-ascorbique.
Des
études
récentes
aux
rayons
X ont
montré
qu'à
l'état
cristallin, l'acide déhydro L-ascorbi.que était un dimère. Dans l'eau ce dimère
s'hydrolyse en un monomère qui est l'hémiacéta1 (MESHAL et HASSAN,
1982).
Le
cyc1e de l' hémi acéta1 peut Si ouvri r pour restituer 1e grou pement di céto en
positions 2 et 3.
C.lsomères et produits d'oxydation de l'acide L-ascorbique
Dans
l'espoir
de trouver
des
substances
ayant
une
activité
vitaminique supérieure à celle de l t actde L-ascorbique',
un certain nombre
d'isomères ont été synthétisés (figure 3).
D'une façon générale, ces isomères
qui n'existent pas à l'état naturel,
sont dépourvus d'activité vitaminique, à
11exception
de
11acide
D-isoascorbique
qui
possède une
légère
activité
antiscorbutique (2,5 à 5 % de celle de l'acide L-ascorbique). Dans l'industrie
alimentaire,
il n'est pas utilisé pour son activité vitaminique mais comne
antioxydant (cet additif nlest pas autorisé en France).
Les formes oxydées de
ces isomères n'ont pas d'activité vitaminique.
D.Dérivés de l'acide L-ascorbique
A partir de l'acide L-ascorbique,
on a essayé de préparer des
dérivés en incorporant dans
la mo lêcul e certains groupements quipourraient
augmenter l'activité vitaminique.
Comme le montre le tableau 1, les résultats
sont décevants.

-
7 -
HO
0
H~-(')=o
Acide D-ascorbique
Acide D-xyloascorbique
HOHj! ~O
Acide 'tlactone ü-t hrëo hex-z
+-
Acide L-isoascorbiqUe
Acide L-arabo asco rbi que
Ac i d e ~ Iactone L-érythl"'ohex-2
énorr[que
HO
Acide 0 -i soa scotbique
.
. . , . . . .
1
0
H-C-(-) 0
'Acld'e,é r ythorbique
Acide D-araboascorbique
HOH2c1 --)=(
Acide "t lactone D-érythrohex-2
HO
0
ënon ique
Figure 3
Structures des isomères de l'acide L-ascorbique (les
dénominations
soulignées
sont
les
plus
couramment
ut il i sées).
Nous constatons en définitive qu'aucune substance synthétique ne
possède une activité aussi importante que les composés (acidesL-ascorbique et
déhydro L-ascorbique) que l'on trouve naturellement dans les aliments.
C'est
la raison pour laquelle la suite de notre étude sera consacrée exclusivement â
ces deux molécules.

-
8 -
Tableau l
Activité vitaminique des dérivés préparés à
partir de l~acide L-ascorbique (JAFFE, 1984).
Activité vitaminique mesurée
Dérivés
par rapport à celle de l'acide
L-ascorbique pris comme
référence
Acide désoxy-6 L-ascorbique
0,33
Acide méthoxy~3 L-ascorbique
0,04
Acide amino-2 désoxY-2
0,02
L-ascorbique
Acides heptano L-ascorbiques
0,005 à 0,025
II. PROPRIETES PHYSICOCHIMIQUES DES ACIDES L-ASCORBIQUE ET
DEHYDROL-ASCORBIQUE
Les pri nci pales propri étés physiques des acides L-ascorbi que et
déhydro L-ascorbique sont résumées dans le tableau 2.
Du fait de la présence dans sa structure chimique d'une double
liaison conjuguée,
l'acide L-ascorbique absorbe dans le proche ultraviolet, à
une longueur dlonde maximale de 245 nm en mil i eu aci de (pH 2,5) et de 265 nm
en solution neutre (pH 7) (voir spectres, figure 4).
Les coefficients d'extinction moléculaire (E) calculés à partir de
différentes solutions d'acide L-ascorbique sont : ~45 = 6200 à pH 2,5 ete:265
= 14500 à pH 7,0.
On observe donc,
lors d'une augmentation du pH de la
solution, à la fois un effet hyperchrQme et un effet bathochrome.
L' aci de déhydro L-ascorbi que par contre,
n'absorbe que dans le
domaine ultraviolet lointain (À <2l5nm).
Aucun de ces composés nlest fluorescent.
L'acide L-ascorbique est un réducteur.
Par oxydation il conduit à
l'acide déhydro L-ascorbique qui s'hydrolyse irréversiblement en acide dioxo-
2,3 L-gulonique puis en acides L-thréonique et oxalique (figure 5).

-
9 -
Tableau 2
Propriétés physiques des acides L-ascorbique et
déhydro L-ascorbique.
Propriétés physiques
Acide L-ascorbique
Ac ide d,éhydro
L-ascorbique
Formule brute
C
C
6Ha06
6H606
Aspect
cri s taux blancs
cristaux blancs
Poids moléculaire
176,13
174,11
Point de fusion
190°-192° C avec
225° C avec décomposi-
décomposition
tion
Pouvoir rotatoire
[a]25+ 20,5 à 21,5
[a]20+ 56 ( C = l dans
( C = l dans l'eau)
1" eau)
[a]23+ 4a ( C = l
dans le méthanol)
Solubilité
333g/1 d'eau
Très soluble dans l'eau
50g/1 de propylène
glycol
33g/1 d'éthanol 95°
20g/1 d'éthanol absolu
10g/1 de glycérol USP
Insoluble dans: éther
Insoluble dans: éther
éthylique, chloroforme, éthylique, chloroforme,
éther de pétrole, huile éther de pétrole.
et solvants huileux.
Le couple acide L-ascorbique / acide déhydro L-ascorbique a un
potentiel d'oxydoréduction de
+ 0,166V à pH4
+ 0,127V à pHS

-
10 -
( 1)
Absorbance
Absorbance
i
i
--,
-/-- -+--
-- - .... _. .'- ._. 1- -
i
4- 0,03
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. :
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32 )
250
250
40 i
longueu~ d'onde,
b)
Figure
4
Spectres
d'absorption
ultraviolets
de
l'acide
L-
ascorbique
(a)
à
pH
7
(1)
et
à
pH
2,5
(2)
et
de
l'acide
déhydro
L-
ascorbique
(b).

-
Il
-
)
Acide L-ascorbique
Acide déhydro L-ascorbique
COOH
~=O
t=O
fOOH
1
H-C-OH
H-C-oH
1
COOH
HO-b-H
~<--
HO-C-H
,
~
1
COOH
CHpH
tH 20H
Acide oxalique
Acide L-thréonique
Acide dioxo-2,3 L-gulonique
Figure 5
Structures chimiques de quelques métabolites de l'acide
L-ascorbi que
L'acide L-ascorbique est stable en solution aqueuse acide
(pH 2
à 5).
Il se dégrade très rapidement en milieu légèrement alcalin,
(OTANI,
1964) •
L'acide L-ascorbique a des propriétés comp1exantes vis à vis d'un
certain nombre d'ions métalliques (mercure, cuivre, cadmium, chrome).

-
12 -
CHAPITRE 2
DOSAGE DE LA VITAMINE C DANS LES ALIMENTS
La vitamine C est
le .plus
souvent
présente dans
les
aliments
analysés en quantités appréciables
(supérieures à lmg %)
de ce fait
la
sensibilité n'est généralement pas
le critère qui
entre en ligne de compte
dans le choix d'une méthode de dosage.
Dans de nombreuses méthodes (les plus simples et les plus rapides)
on procède
à un dosage titrimétri que,
photométri que ou fl uorométri que de
l'acide L-ascorbique directement après l'avoir extrait de l'aliment à l'aide
d'une solution acide.
Dans ce cas,
c'est la spécifité de la méthode qui doit
retenir
toute
l'attention
de
l'analyste.
Cela est
particulièrement
vrai
lorsque la méthode utilise les propriétés réductrices de ce composé car la
présence dans l'échantillon d'autres substances réductrices peut conduire à
des résultats totalement erronés.
La spécifité de ces méthodes peut-étre améliorée en introduisant
entre
l'extracti on
et
le
dosage
une
étape
de
purification
réal isée
général ement
par
une
techni que
chromatographi que.
Mai s
cela
a
pour
conséquence,
bi en entendu,
de comp li quer l a méthode et d'en augmenter la
durée.
Par ailleurs,
nous avons vu dans le premier chapitre que si dans
les
aliments frais
la vitamine
C est exclusivement
sous forme
d'acide L-
ascorbique,
dans les aliments préparés industriellement ou stockés, elle peut
également se trouver sous une forme oxydée de méme activé vitaminique, l'acide
déhydro L- ascorbique.
L'appréciation vitaminique d'un aliment implique donc
le dosage séparé ou simultané,
avec une bonne spécifi cité,de deux composés de
nature chimique différente.
Le dosage de l a vi tami ne C dans un aliment ni est donc
pas
une
opération
analytique
simple.
Et
c'est
la
raison
pour
laquelle,
si
de
nombreuses méthodes de dosage de l'acide L-ascorbique ont été publiées à ce
jour,
il y en a très peu qui permet~ent un dosage plus ou moins satisfaisant
de la vitamine C totale.

-
13 -
1. LES METHODES DE QOSAGE DE LA VITAMINE C
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
A. Dosages directs de la vitamine C.
1. Les méthodes titrimétriques
Les
méthodes
titrimétriques
sont
basées
sur
les
propriétés
réductrices de l'acide L-ascorbique ..
Le réactif de titrage le plus utilisé est le dichloro-2,6 phénol
indophénol (TILLMANS,
1932). Cette méthode avec détection potentiométrique du
point
d'équivalence est
la
méthode
officielle
de dosage de
l'acide
L-
ascorbique dans les aliments de l'Association of Official Analytical Chemists
(AOAC,
1984).
Bien qu'elle soit sujette à de nombreuses interférences,
elle
est encore largement utilisée (STEELE et al,
1976;
BUNTON et al,
1979;
TONELLI et al,
1980
BOHRER et al,
1984).
D' autres réacti fs ont été
proposés mais ne présentent pas une meilleure spécificité que le dichloro-
2, 6phéno l i ndophéno l :
l' iode (RAO et PRASAD,
1976 et SHUKLA et CLAUSEN,
1977),
le dihaloiodate de potassium (MURALIKRISHNA et al,
1979 et SKURIDIN,
1980),
le nitrate ou sulfate de cuivre (SHAHINE,
1980), le nitrate double de
cérium et d'amnonium (VERMA et al,
1980), le chloranile (VERMA et al, 1984) et
les sels de thallium (VERMA et al, 1983).
Les méthodes titrimétriques ont par ailleurs le gros inconvénient
de ne permettre que le dosage de l'acide L-ascorbique.
Un dosage de la
vitamine C totale implique donc la réduction préalable de l'acide déhydro L-
ascorbique en acide L-ascorbique.
2. Les méthodes photométriques
Le réactif le plus fréquemnent utilisé est un sel de tétrazolium
qui,
en présence d' aci de L-ascorbi que,
donne un composé qui absorbe dans le
domaine visible à une longueur d'onde maximale de 578 nm (LEHNARD,
1978;
VASILEVA et NEICHEVA,
1979; DENEKE et al, 1978 ; BEUTLER et BEISTINGL, 1980 ;
LIST et KNECHTEL,
1980;
KELLY et LATZKO, 1980 ; HENNIGER, 1981 ; ARAKAWA et
al,
1981a et TONO et FUJITA,
1981 et 1985). D'autres
réactifs ont également
été proposés:
la N-bromosuccinill1ide (LEHNARD,
1981),
le complexe Cu (11)- '

-
14 -
biquino1ine-2,2' (ARAKAWA et al,
1981b),
le mo1ybdate d'ammonium (BAJAJ et
KAUR,
1981) et la diméthoxyqui.none-4,4' (HAMANN,
1976 et KAMANGAR et al,
1977 r,
Une méthode cinétique a été étudiée par HIROMI et al (1977), OBATA
et al (1979), HIROMI et al (1980) et OBATA et TOKUYAMA (1982). Ces auteurs ont
montré qu'en présence d'un excès diacide L-ascorbique, la constante de vitesse
apparente de la réaction de réduction du dich1oro-2,6 phénol indophénol était
proportionnelle à la concentration en acide L-ascorbique.
On
retrouve
pour
1es
méthodes
photométri ques
1es
mêmes
inconvénients
que
pour
les
méthodes
titrimétriques
une
spécificité
incertaine et l'impossibilité de deser
simplement
la
vitamine C totale.
BOEHRINGER A.G. (1980) a cependant commercialisé une méthode (utilisant le sel
de tétrazo1ium) dans laquelle l'acide déhydro L-ascorbique,
dans une étape
,
.
préliminaire,
. est
réduit
en acide
L-ascorbique
par
la
DL-homocystéine,
permettant ainsi un dosage global de la vitamine C.
3. Les méthodes électrochimiques
L' aci de L-ascorbi que peut être dosé
par polarographie (STEELE et
al,
1976;
SONTAG et KAINTZ,
1978; BRANCA, 1980 ; GERHARDT et WINDMUELLER,
1981).
Cette méthode qui ne permet pas de doser la vitamine C totale est par
ailleurs sujette à de nombreuses interférences.
~
La méthode
ampérométrique consiste
à
mesurer à l'aide d'une
électrode de Clark
(électrode spécifique
à oxygène)
la diminution de la
concentration
en
oxygène
dans
la
solution
à
analyser
au
cours
de la
transformation de l'acide L-ascorbique
en acide déhydro
L-ascorbique par
1'ascorbate oxyd ase.
L'ascorbate oxyd ase i mmobi1 i sée est montée di rectement
sur l'électrode de Clark (POSADA et MACHOLAN,
1979;
MATSUMOTO et al, 1981 ;
LECHIEN et al, 1982 ; LAU et al, 1985 ; ESAKA et al, 1985). Cette méthode, qui
comne
la
précédente
ne dose
que
l'acide L-ascorbique a une
spécificité
incertaine.
C'est ainsi que MATSUMOTO et al (1981) ont obtenu des résultats
supérieurs à ceux donnés par la méthode titrimétrique au dichloro-2,6 phénol
indophénol.
4. Les méthodes f1uorométriques
Elles consistent, après oxydation de l'acide L-ascorbique en acide
déhydro L-ascorbique,
à transformer ce dernier en un produit fluorescent par
l'intermédiaire de
l'orthophény1ènediamine.
Si TONO
et
FUJITA
(1982)
ont

-
15 -
utilisé l 'ascorbate oxydase comme réactif d'oxydation,
la plupart des auteurs
utilisent le charbon actif,
préconisé pourla première fois par DEUTSCH et
WEEKS (1965) (ROY et al,1976;
EGBERG,
1977;
DUNMIRE et al, 1979, DEVRIES,
1983 et VISSER,
1984).
Cette méthode qui peut-être partiellement automatisée
(DEVRIES, 1983) est tr~s sensible et possède une assez bonne spécificité.
La
méthode
à
11 orthophényl ènedi ami ne
a
été
retenue
par
l'Association Française de Normalisation (AFNOR,
1980) pour le dosage de la
\\
vitamine C dans les jus
de fruits
et
légumes
et constitue
la méthode
officielle de
llAOAC
(1984)
pour le
dosage de la
vitamine C dans les
préparations vitaminées.
B. Dosage de la vitamine C après l'avoir isolée de son substrat.
1. Utilisation de llisotachophorèse
Elle a permis dlisoler et de doser l'acide L-ascorbique dans les
jus d'orange et les yaourts au citron (BALDESTEN et al,
1978),
dans les
concentrés de citron (RUBACH et BREYER,
1980) et dans les tomates (TSUDA et
FUKUDA, 1986). Cette technique de séparation est assez rapide (dix minutes) et
son taux de recouvrement est satisfaisant (97 %).
Cependant llacide déhydro
L-ascorbique non chargé ne se déplacera
pas sous
l'influence d'un
champ
électrique.
Il est donc nécessaire de le réduire au préalable en acide L-
ascorbique si lion veut réaliser un dosage global de la vitamine C.
2. Utilisation de la chromatographie en phase gazeuse
La chromatographie en phase gazeuse est certai nement une méthode
de séparation très efficace.
Malheureusement l'acide L-ascorbique est détruit
avant dlêtre vapori sé .
Il
est donc nécessai re dans un premi er temps de
préparer un dérivé volatil.
MANSO (1980) a eu recours à la silylation de
11 aci de L-ascorbi que préal ab l ement oxydé en aci de déhydro L-ascorbi que.
Ce
dérivé est isolé sur une colonne de type silicone et détecté par ionisation de
flamme.
Cette technique a donné de bons résultats pour le dosage de la
vitamine C totale dans la farine de blé,
mais l'auteur,
étant donné la
complexité de la méthode,
lui
préfère la chromatographie en phase liquide
haute performance.

-
16 -
3. Utilisation de la chromatographie en couches minces
C'est une technique qui permet le dosage de la vitamine C totale.
Elle a été préconisée par la Communauté Economique Européenne pour le dosage
de la vitamine C .dans les aliments pour animaux
(CEE,
1981).
L'acide L-
ascorbique est oxydé par l'iode efl acide déhydro L-ascorbique.
Ce dernier
réagit avec la dinitro-2,4 phénylhydrazine pour donner une bis dinitro-2,4
phényl hydrazone qui est i sol ée par chromatograph ie en couches minces sur gel
de silice, puis solubilisée en milieu acétique. Ce composé coloré est dosé par
absorption à 500 nm.
C'est la même méthode qui a permis à JERUMANIS et CLERK
(1977) de déterminer la vitamine C dans la bière. MATTHIESSEN (1978), HOPPE et
al (1979) et MANSO (1980) ont préféré utiliser la densitométrie pour doser la
bis dinitro-2,4 phénylhydrazone isolée par chromatographie en couches minces.
\\
4. Utilisation de la chromatographie sur gel
(Méthode de Bourgeois)
L'acide L-ascorbique est extrait de l'échantillon par une solution
diacide métaphosphorique.
Cet extrait est déposé sur une colonne de Séphadex
anionique, ce qui a pour effet de fixer l'acide L-ascorbique sur le gel. Après
lavage à l'eau,
l'acide L-ascorbique est oxydé en acide déhydro L-ascorbique
par une solution de parabenzoquinone, qui servira également à éluer le composé
formé.
L'éluat
obtenu
est
traité
par
une
solution
de
nitro-4
phénylènediamine-l,2.
La colorat t on
jaune
donnée
par cette
réaction est
mesurée colorimétriquement à 375 nm (BOURGEOIS et MAINGY, 1975).
Cette techni que permet aussi
le dosage de l' aci de déhydro L-
ascorbique initialement contenu dans l'échantillon en réduisant préalablement
ce composé en acide L-ascorbique par action du dimercapto-2,3 propanol-le
5. Utilisation de la chromatographie en
phase liquide haute performance
Parmi les différentes méthodes permettant d'isoler la vitamine C
de son substrat,
c'est la chromatographie en phase liquide haute performance
qui,
de très loin, a fait l 'objet du plus grand nombre de publications depuis
une dizaine d'années. Malheureusement les auteurs se sont souvent contentés de
doser uniquement l'acide L-ascorbique.
PACHLA et KISSINGER (1976),
CARR et
NEFF (1980), GRUN et LOEWUS (1983),
FLORIDI et al (1982), ASHOOR et al (1984),
RIZZOLO et
al (1984)
et VEAZEY
et
NIEMAN
(1980) ont
utilisé
une
phase

-
17 -
stationnaire échangeuse d'anions. forts. SOOD et al (1976), RUECKEMANN (l980a),
AUGUSTIN et al (1981),
COUSTARD et SUDRAUD (1981),
MODELINA et FLINKS (1982)
et LAM et
al (1984) ont eu recours à la chromatographie par appariement
d'ions.
La chromatographie sur support greffé en
phase inverse (RUECKEMANN,
1980b;
SHAW et WILSON, 1982 ; WATA~A, 1982) ainsi que la chromatographie sur
échangeurs d'anions faibles (CARNEVALE,
1980;
LOOKHART et al,1982) ont été
aussi utilisées.
Cette dernière méthode a également été préconisée pour
séparer
l'acide L-ascorbique de son isomère optique,
l'acide D-ascorbique (ARCHER,
1980 ; BUI NGUYEN, 1980 ; ARAKAWA et al, 1980b ; GEIGERT et al, 1981 et OTSUKA
et al, 1981).
Si la séparation de l'acide L-ascorbique et de l'acide déhydro L-
ascorbique ne pose pas de problème particulier,
le dosage de l'acide déhydro
L-ascorbique est beaucoup plus délicat et les travaux au cours desquels ce
problème fut abordé sont en nombre beaucoup plus restreint (Tableau 3).
L'acide
L-ascorbique
est
généralement
détecté
par
absorption
ultraviolette ou par réaction électrochimique; or ces deux modes de détection
ne sont pas utilisables pour l'acide déhydro L-ascorbique qui n'absorbe que
dans le domaine ultraviolet lointain (À <215 nm) et qui n'est pas réducteur,
d'où la difficulté de doser simultanément ces deux composés.
Trois solutions
sont possibles:
- procéder à une réduction préalable de l'acide déhydro L-
ascorbique en acide L-ascorbique (DENNISON et al,
1981; DONNER
et HICKS, 1981).
- utiliser un détecteur ultraviolet à À< 215 nm (FINLAY et DUANG,
1981 ;
ROSE et NAHRWOLD,
1981; WlMALASIRI et WILLS, 1983 ;
BIANCHI et ROSE, 1985).
- transformer l'acide déhydro L-ascorbique en un dérivé
fluorescent avant l'élution (KEATING et HADDAD, 1982 ; HADDAD et
LAU, 1984 ; SPEEK et al, 1984 ; KNEIFFEL et SOMMER, 1985), ou
après l'élution (VANDERSLICE et HIGGS, 1984 ; KACEM et al, 1986)
Les avantages et les
inconvénients de ces différentes méthodes
seront précisés dans le paragraphe III-F.
1

-
19 -
II. CHOIX DES METHODES DE DOSAGE DE LA VITAMINE C SOUMISES A
L'ETUDE COMPARATIVE
A l a suite de cette étude bi bli ographi que,
il
nous
a fallu
procéder, parmi les nombreuses méthodes proposées, au choix de celles que nous
souhaitions comparer.
Nous nous sommes bien entendu limités aux méthodes qui,
telles
qu'elles sont décrites dans la littérature,
permettent de doser la vitamine C
totale.
Parmi ces méthodes nous avons finalement choisi celles qui ont été
proposées comme méthodes officielles ou qui depuis leur publication,
ont été
les plus fréquemment utilisées. Ce sont la méthode colorimétrique au sel de
tétrazolium telle qu'elle est proposée par BOEHRINGER (1980),
la méthode à la
di nitro-2, 4 phényl hydrazine après i sol ement par chromatographie sur couches
minces
(CEE,
1981),
la méthode fluorométrique
à
l'orthophénylênediamine
(AFNOR,
1984)
et la
méthode par chromatographie en phase liquide haute
performance avec réduction préalable de l'acide déhydro L-ascorbique en acide
L-ascorbique par la DL-homocystéine.
Nous
avons
utilisé deux techniques
chromatographiques mises au point dans notre
laboratoire.
Il
s'agit des
méthodes par chromatographie en phase liquide haute performance sur échangeurs
d'anions faibles et par appariement d'ions (celles-ci sont décrites en détail
par ailleurs,
voir annexe 2).
Elles permettent de doser la vitamine C totale
si l'on réduit au préalable l'acide déhydro L-ascorbique en acide L-ascorbique
par la DL- homocystéine (HUGUES,
1956).
Après séparation par chromatographie
sur échangeurs d'anions faibles,
l'acide L-ascorbique peut être détecté par
absorption ultraviolette à 254 nm (longueur d'onde maximale d'absorption de
l'acide L-ascorbique
en
solution dans la
phase mobile utilisée)
ou
par
électrochimie, tandis que par chromatographie en phase liquide par appariement
d'ions seule l'absorption ultraviolette à 265 nm (longueur d'onde maximale
d'absorption de l'acide
L-ascorbique
en solution
dans la deuxième
phase
mobile) permet de détecter l'acide L-ascorbique (la présence du contre-ion qui
est également oxydable ne permet pas de réaliser une détection électrochimique
de
l'acide
L-ascorbique).
Les
deux
techniques
ont
la
même
limite
de
détection:
0,1 mg %et le taux de recouvrement varie suivant l'aliment de 99
à 101%.
Des exemples de chromatogrammes obtenus avec chacune de ces méthodes
sont représentés figure 6.
A cette liste,
nous avons ajouté
l a méthode titri métri que au
dich1oro-2,6phéno1indophéno1 (ZONNEVELD,
1963), bien que celle-ci ne permette

-
20 -
.,:'
que le dosage de l vactde l-ascorMque.
Mais c'est une méthode encor.e trés
utf l i sêe et il nous a sembl~ ,intéressant de comparer les résultats" qu'elle
donne à ceux obtenus
avec les autres méthodes (du moins lorsque celles-ci
permettent un dosage séparé des ac;des l-ascorbique et déhydro l-ascorbique) •
.
'.,(1
A)
l
<--")\\ "
l~:nt: ';1:)"'\\"''-
(
Temps
en minutes
)
0
2
4
6
8
B)
o
4
8
12
(Temps
en minutes
Figure 6A
Isolement de l'acide L-ascorbique par chromatographie
sur échangeuse d'anions faibles (A) .et par appariement
d'ions (B). (détecteur SPECTRA PHYSICS SP 8400)

2 1
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.
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330
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9.5
1
L-
de
l'acide
frUits~
tridimentionnelles
Représentations
0 a n s différents
25 J.
aSCOrbique
voir
tableau
990J
(Teneurs
WATERS
(détecteur

-
22
-
III. ETUDE COMPARATIVE DES METHODES DE DOSAGE DE LA VITAMINE C
A. Première analyse ciréu1aire. Comparaison des méthodes
titrimétrique,co1orimétrique et de la chromatographie en
phase liquide haute performance sur échangeurs d'anions
fai bles.
Nous avons analysé trois aliments différents: un jus d'orange, un
petit pot de pomme-framboise pour enfants et une tablette de cynorrhodon.
Les
résultats que nous avons obtenus pour le dosage de la vitamine C totale et de
l'acide L-ascorbique seul sont comparés avec ceux obtenus dans les huit autres
laboratoires (voir liste en annexe 3) qui ont accepté de participer à cette
analyse circulaire (Tableau 4).
La méthode co1orimétrique (BOEHRINGER,
1980) ne présente pas les
avantages habituels (simplicité et rapidité) de ce genre de technique.
Les
résultats obtenus pour le dosage de l'acide L-ascorbique sont en général
nettement plus faibles (sauf pour le jus d'orange) que ceux donnés par les
autres méthodes et leur dispersion est grande (Tableau 4a). En ce qui concerne
le dosage de la vitamine C totale (Tableau 4b) des résultats aberrants ont été
obtenus par la plupart des laboratoires (y compris le nôtre) (la teneur en
vitamine Cserait plus faible que celle en acide L-ascorbique).
Il semble donc
que cette méthode n'est pas actue 11 ement au point et nous avons déci dé de ne
pas poursuivre son étude.
Les résultats obtenus par la méthode titrimétrique pour le dosage
de l'acide L-ascorbique (Tableau 4a) sont très reproductibles d'un laboratoire
à
l'autre.
L'utilisation d'un
potentiomètre ou le passage préalable de
l'échantillon sur une cartouche Sep Pak C 18 permet l'appréciation correcte du
point d'équivalence lorsqu'on a affaire à des aliments colorés en rose,
comme
c'est
le
cas
pour
le
petit
pot
pomme-framboise
(en effet,
au
point
d'équivalence,
la solution à titrer vire au rose).
Cependant, les résultats,
en particulier pour les petits pots et le jus d'orange,
sont systématiquement
plus élevés que ceux obtenus par chromatographie en phase liquide.
Cela
s'explique certainement par la spécifité insuffisante de cette méthode qui
assimile à de l'acide L-ascorbique toute autre substance réductrice.
Nous
pensions
que
la
chromatographie
en phase liquide haute
performance s'imposerait d'emblée comme la méthode la plus satisfaisante.
Les
premiers résultats obtenus n'ont pas toujours confirmé cette impression.
Pour

Tableau 4 A : Détermination de la teneur en acide L-ascorbique dans trois aliments
diététiques (les valeurs indiquées pour chaque laboratoire représentent
la moyenne de trois mesures: la présence d'un point d'interrogation
signifie que le résultat obtenu est aberrant; un simple trait que la mesure
nia pas été faite).
x (1) : valeur moyenne interlaboratoire.
5 (2) : écart type interlaboratoire.
~ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ;c (1) 5(2)
Méthodes
Jus d10range (en mg / 100 ml)
.
IV
Titrimétrie
37,6
38,0
36,9
35,2
36,1
35,6
37,5
36,0
- .
36,6
1,0
W
CLHP
35,0
34,1
37,0
30,0
36,0
-
-
-
-
34,4
2,7
Colorimétrie
29,3
29,7
31,1
51,5
31,0
-
?
41,0
29,0
34,7
8,5
Petits pots pomme-framboise (mg / 100g)
Titrimétrie
39,6
39,3
38,1
?
41,9
39,2
37,8
40,0
-
39,4
1,4
CLHP
35,5
-
31,9
28,5
38,5
-
-
-
-
33,6
4,3
Colorimétrie
21,6
33,0
31,7
28,0
20,9
-
?
31,5
-
27,8
5,3
Tablettes de cynorrhodon (mg / 100g)
Titrimétrie
1128
1187
1195
1173
1092
1149
-
1146
-
1153
36
CLHP
1101
-
1130
1143
1068
-
-
-
-
1111
34
Colorimétrie
740
946
1061
1043
1016
-
?
936
1044
969
112

Tableau 4 B : Détermination de la teneur en vitamine C totale dans trois aliments
diététiques (les valeurs indiquées pour chaque laboratoire représentent
la moyenne de
trois mesures; la présence d'un point d'interrogation
signifie que le résultat obtenu est aberrant, un simple trait que la
mesure n'a pas été faite).
x (1) : valeur moyenne interlaboratoire
S (2) : écart type, interlaboratoire
~ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ; (1) s(2)
Méthodes
Jus d'orange (en mg / 100 ml)
CLHP
35,4
48,4
36,7
49,0
36,0
-
-
-
-
41,1
. 6,9
N
~
Colorimétrie
17,7
?
-
38,8
21,3
-
?
;
-
31,0
?
-
Petits pots pomme-framboise (mg / 100g)
CL HP
35,0
-
36,7
43,5
39,5
-
-
-
-
38,7
3,7
Colorimétrie
34,4
?
-
21,0
21,0
-
?
-
-
?
-
Tablettes de cynorrhodon (mg / 100g)
CLHP
1318
-
1180
1240
1079
-
-
-
-
1204
100
Colorimétrie
?
?
-
1153
1029
-
?
-
-
?
-

---------'---_._"_.,_.,
-
2 5 -
ce qui est du dosage de l'acide L-ascorbique,
on a noté une dispersion assez
importante des valeurs obtenues.
Cependant la corrélation des résultats entre
les différents laboratoires reste acceptable.
Par contre nous avons éprouvé quelques difficultés à doser l'acide
déhydro L-ascorbique par la méthode de DENNISON et al (1981).
Après plusieurs
tentatives de séparation,
nous avons en effet constaté qu'après réduction de
l'acide déhydro L-ascorbique par la DL-homocystéine,
le temps de rétention de
l'acide L-ascorbique n'était pas reproductible et que le pic obtenu pouvait
dans certains cas se superposer partiellement à celui de la DL-homocystéine en
excès (figure 7)
2
A
1
J\\J\\
.
1
2
B
1
.
.
1
o
4
6
8
~Temps en minutes~
Figure 7
Séparation de l'acide L-ascorbique (~)(obtenu par
réduction de l'acide déhydro L-ascorbique) et de
1a DL-homocystéi ne~) par chromatographie sur échangeurs
d'anions faibles (A et B représentent deux enregis-
trements réalisés successivement dans les mêmes
conditions opératoires).
Par
ailleurs
en
réalisant
des
essais
de
réduction
sur
des
solutions
témoins d'acide
déhydro L-ascorbique,
nous
avons
obtenu.
des
rendements plus faibles que ceux indiqués par DENNISON et al (1981)
(50 %
environ au lieu de 97 %).

-
26
-
Cela explique vraisemblablement les variations très importantes
d'un laboratoire à
l'autre que nous avons notées dans la détermination de la
teneur en acide déhydro L-ascorbi que,
et donc dan s ce11 e de l a teneur en
vitamine C totale.
Ces observations ont été confirmées ensuite par les autres
laboratoires.
Nous avons donc pensé qu'il était nécessaire avant de poursuivre
notre travail,
d'étudier plus sérieusement d'une part le problème de la
réduction de l'acide déhydro L-ascorbique par la Ol-homocystéine, d'autre part
le problème posé par l'instabilité du
temps de rétention
de l'acide L-
ascorbique en présence de üt-hoaocysté tne ,
B. Problème de la réduction de l'acide déhydro l-ascorbique par la
DL-homocystéineet ses conséquences en chromatographie en phase
liquide haute performance.
Dans le tableau 5,
nous avons indiqué le protocole analytique
suivi au cours de cette étude.
Tableau 5
Mode opératoire pour la détermination du rendement de
réduction de l'acide déhydro L-ascorbique en acide L-
ascorbique par la Dl-homocystéine.
Bl anc
Témoin
Dosage
Acide métaphosphorique Q,4 %
Acide l-ascorbique 100 ~M
Aci de déhydro L-ascorbi que l 00 ~M
Dl-homocystéine (1,0;2,0 et 5,0 g/l)
Phosphate bipotassique 45 % qsp
Eau ,di sti 11 ée qsp
Nous
avons
utilisé
des
solutions
de
DL-homocystéine
aux
concentrations respectives de 1,0
2,0 et 5,0 g/l pour calculer le rendement
de la réduction conformément à la méthode de HUGUES (1956) et reprise par
DENNISON et al (1981).
Dans chacune des solutions l'acide L-ascorbique est

l'
-
27
-
dosé par chromatographie en phase liquide haute performance. Nous avons obtenu
des rendements de réduction
de 70.
72 et 70 %.
Cette expérience a également
été réalisée
par cinq autres laboratoires
les
résultats obtenus sont
indiqués dans le tableau 6.
On note une dispersion assez grande des taux de
.
réduction d'un laboratoire à l'autre.
Mais ceux-ci, pratiquement indépendants
de la concentration en DL-homocystéine, restent nettement inférieurs à 100 %.
Tableau 6 : Rendement de la réduction de l lacide déhydro L-
ascorbique par la DL-homocystéine.
(~ = valeur m~yenne interlaboratoire)
Rendement de la réduction %
DL-homocystéine
Laboratoires
(g/1 )
-----------------------------------------
l
2
3
4
5
9
x
1,0
70
-
50
52
73
43
58
2.0
72
-
45
54
77
51
60
5,0
70
62
45
64
79
-
64
Afin de faire abstraction des éventuelles fluctuations introduites
par la séparati on chromatographi que lors du dosage.
nous avons procédé au
dosage direct de l lacid~ L-ascorbique par mesure de l labsorption ultraviolette
à 265 nm,
la teneur en DL-homocystéine étant de 1,6 g/l. Pour notre part nous
avons trouvé un rendement de 60 %. Dans les autres laboratoires ce rendement a
été de 49 %,
46 %.
55 % et 42 %,. soit un rendement moyen de 50 %.
Les
résultats obtenus sont moins dispersés mais confirment que le rendement de
réduction est de l'ordre de 50 % et non voisin de 100 % conme indiqué par
DENNISON et al (1981).

-
28
-
Pour essayer de trouver une explication à ce résultat surprenant,
nous avons tout d'abord vérffié que les conditions expérimentales choisies
(pH?
et
concentration
en
DL-homocystéine
1,6
g/l)
étaient
les
plus
satisfaisantes.
Cela est clairement vérifié en consultant les deux diagrammes
de la figure 8. Le rendement de réduction passe en effet par un maximum à pH?
.
En ce qui concerne la teneur en DL-homocystéine,
la valeur conduisant à un
rendement optimal semble bien se situer entre 1,5 et 2,0 g/l (figure 8).
E.
'-;'
"'-
..

S -=..
F.:
E
t··j
D
S
6
A
E
t·1
E
t·..J
.
c::-
~
-:»
•=:J
T
•...
.' .
cs: ~:::~ E- 1.
1..1.
:1.:3
2.5
HOt·10C 'TI~=; TE l NE .=-~ ....., l
6
2
B
S
9
P
E
N
c-
t:,
D
-:»
E
r-t
E
N
r:::-
-;»
3
T
.,'
...•
c.-> ~1
6 . E1
6.E.
7.:=:
7 . 9

c::
r=-H
I~. "_"
Figure 8 :
Variation-du rendement de la
réduction de l'acide
déhydro L-ascorbique par la DL-homocystéine en fonction du pH(A) et
de la
concentration
en DL-homocystéine (B).

-
29 -
Nous avons
ensuite envisagé
la
possibilité que
la
pureté
de
l'acide déhydro L-ascorbique utilisé cornne référence ne soit pas de 100 %.
Pour écarter cette hypothèse
nous avons procédé dans un premier temps à
l'oxydation par le charbon actif d'une solution d'acide L-ascorbique 0, l mM
(On sait que le charbon actif oxyde. l'acide L-ascorbique en acide déhydro L-
ascorbi que avec un rendement de 100 % (DEUTSH et WEEKS,
1965) ).
Nous avons
effectivement obtenu une disparition complète de l'absorbance à 254 nm.
Nous
avons ensuite procédé à la réduction de cette solution contenant exclusivement
de l'acide déhydro L-ascorbique par la DL-homocystéine.
Nous n'avons retrouvé
que la moitié de l'acide L-ascorbique de départ,
ce qui semble confirmer que
le taux de réduction se situe bien aux alentours de 50 %.
D'autres
réactifs
de
réduction
ont
été
proposés
conme
le
dithiothréitol (BEUTLER et BEISTINGL,
1982), le mercapto-2 éthanol (RUBACH et
BEVER,
1980) ou le dimercapto-2,3 propanol-l (BRUBACHER et al, 1985). En nous
plaçant dans les mêmes conditions expérimentales que celles utilisées par
BEUTLER et BEISTINGL (1982),
nous avons obtenu un rendement de réduction
de
48 %.
Ces auteurs
n'ont pas précisé leur
taux de réduction.
Avec les
mercaptans (cosme le mercapto-2 éth ano l ),
l es rendements obtenus sont encore
plus faibles.
Nous n'avons donc pas trouvé de solution satisfaisante au problème
de la réduction de l'acide déhydro L-ascorbique.
Ceci est évidemment un
inconvénient de la technique chromatographique proposée.
Avant tout dosage il
apparaît en effet indispensable de déterminer le rendement exact de réduction
de l'acide déhydro L-ascorbique par la DL-homocystéine,
surtout si l'aliment
contient des quantités appréciables de ce composé.
C. Problème posé par l'instabilité du temps de rétention de
l'acide L-ascorbique en présence de DL-homocystéine.
Ce problème a été résolu de façon satisfaisante en réalisant une
chromatographie en phase liquide haute performance par appariement d'ions,
le
contre-ion utilisé étant le bromure de cêty'l t r imêthyl anmontum.
L'élution de
l'acide L-ascorbique est moins
rapide,
mais
le
temps
de
rétention
est
parfaitement reproductible dans le temps (figure 9).
C'est la raison pour
laquelle,
dans la suite de notre étude,
lorsqu'il s'agira de la vitamine C
totale, nous utiliserons toujours la chromatographie par appariement d'ions.

-
30 -
( 1 )
,
o
250
500
750
(Temps
en s~conrl~~
Figure 9
Séparation de l'acide L-ascorbique (2) et de la DL-
homocystéine en excès (1) par chromatographie en phase
liquide par appariement d'ions.
D. Deuxième analyse circulaire.
Etude comparée des méthodes CEE, fluorométrique et de la
chromatographie en phase liquide par appariement d'ions.
Nous avons choisi d'étudier trois aliments contenant des quantités
très différentes de vitamine C : une tablette de cynorrhodon, un jus de raisin
et une farine infantile.
Nous avons comparé nos propres résultats avec ceux
des six autres laboratoires qui ont participé à cette étude (Tableau 7).
La méthode préconi sée par la Communauté Economique Européenne a
donné
pour
la
tablette de cynorrhodon et
pour
la farine
infantile
des
résultats nettement plus élevés que ceux obtenus par les deux autres méthodes.
On constate de plus une très grande dispersion des résultats lorsqu'il s'agit
de doser
de faibles
quantités
de vitamine
(cas
des farines
infantiles)
imputable vraisemblablement à la grande complexité de la méthode.
Sa durée
excessive
(près de deux jours)
est un
inconvénient majeur,
excluant
la
possibilité de faire de grandes séries~de dosage.

Tableau 7 : Détermination de la teneur en vitamine C de trois aliments diététiques
(les valeurs indiquées pour chaque laboratoire représentent la moyenne
de trois mesures).
x(1): valeur moyenne interlaboratoire
~ (2): écart type interlaboratoire
~ 1 2 3 4 5 6 7 x(1) S(2)
Méthodes
Tablettes de cynorrhodon (mg / 100g)
CLHP
1135
1040
1086
-
973
-
-
1058
55
Fluorométrie
1087
-
-
1125
-
1043
1020
1068
47
CEE
1364
1200
1385
1330
-
1096
-
1275
. 124
\\,W
Jus de raisin (mg / 100 ml)
CLHP
27,8
24,3
25,4
-
21,8
-
-
24,8
2,5
Fl uorométri e
27,0
-
-
22,5
24,2
20,5
-
23,5
2,7
CEE
26,3
26,4
-
19,5
-
24,0
-
24,0
3,2
Farine infantile (mg / 100g)
CLHP
10,2
10,0
11 ,4
-
-
-
-
10,5
0,3
Fluorométrie
11,0
-
-
13,1
-
12,0
9,2
11 ,3
1,3
CEE
32,0
26,0
23,5
12,5
-
11,4
-
21,1
8,9

-
32 -
La chromatographie en phase li quide et la f luoromêtr t e ont donné
des résultats très comparables ~t satisfaisants, aussi bien en ce qui concerne
les valeurs moyennes interlaboratoires qu'en ce qui concerne la dispersion de
ces val eurs.
Pour confirmer ce résultat,
nous avons réal isé dans notre
laboratoire une étude statistique plus complète portant sur 15 analyses de
vitamine C dans un jus de rats tns-Flableau 8).
Les résultats obtenus pour
chacune des deux méthodes sont statistiquement identiques.
Tableau 8 : Teneurs en vitamine C totale du jus de raisins
déterminées par CLHP et fluorométrie (sur 15 mesures).
Teneurs exprimées en mg pour 100 ml de jus de fruits.
(x valeur moyenne, 5 écart type expérimental, CV %
coefficient de variation).
Mesures
CLHP
Fluorométrie
l
27,5
27,2
2
27,7
27,2
3
27,5
28,0
4
27,8
27,6
5
27,9
27,6
6
27,5
27,4
7
27,6
27,5
8
27,8
27,7
9
27,6
27,8
10
27, l
27,8
11
28,0
27,8
12
27,5
27,6
13
28,0
27,5
14
27,5
27,5
15
27,3
27,8
-
x
27,6
27,6
....
s
0,3
0,4
CV %
l , l
l ,4

-
33 -
Les aliments étudiés au cours de cette deuxième analyse circulaire
avaient cependant 1'inconvénien~ de ne contenir que des quantités très faibles
d'acide déhydro L-ascorbique.
Eu égard aux problèmes soulevés lors de la
première analyse circulaire pour le dosage de cette molécule,
il nous a paru
souhaitab 1e
de
tester
1a
reproduct i bil ité
des
résu 1tats
obtenus
par
chromatographie en phase liquide haute performance sur un aliment riche en
acide déhydro L-ascorbique.
E. Etude de la reproductibilité de la méthode de dosage de la
vitamine C par chromatographie en phase liquide haute
performance (paire d'ions) dans le cas d'un aliment riche en
acide déhydro L-ascorbique.
Comparaison avec la méthode f1uorométrique.
Nous avons étudié comme aliment le détar (Detarium senega1ensis),
un fruit originaire de l'Afrique de l'Ouest,
très riche en vitamine C. Ce1ui-
ci a été stocké pendant quelques jours afin qu'une partie de l'acide L-
ascorbique se transforme en acide déhydro L-ascorbique.
f
Le rendement de 1a réduction de l' aci de déhydro L-ascorbi que par
la DL-homocystéine mesuré préalablement est de 55 %.
Dix mesures succesives
ont été effectuées,
d'une
part par chromatographie en phase liquide par
appariement d'ions, d'autre part par f1uorométrie (Tableau 9).
La dispersion des résultats obtenus par chromatographie en phase
liquide haute performance est faible,
aussi bien pour le dosage de l'acide L-
ascorbi que que pour celui
de 1a vitami ne C totale.
Les teneurs en aci de
déhydro L-ascorbique (obtenues par différence) sont aussi très reproductibles
d'une mesure à l'autre.
La méthode chromatographique à la DL-homocystéine se
révèle donc (en dépit des inconvénients mentionnés ci-dessus paragraphe
B)
une excellente méthode de dosage de l'acide déhydro L-ascorbique.

-
34
-
Tableau 9
Teneur en vitamine C (en mg pour 100 g de fruit) du
détar déterminée par CLHP et f1uorométrie.
La teneur en acide déhydro L-ascorbique est
déterminée par HPLC après réduction par la DL-
homocystéine.
(x valeur
moyenne ~ 5 écart type expérimental~ CV %
f
coefficient de variation).
CLHP
Fluorométrie
Mesures
- . . . .
Acide L-
Acide déhydro VitamineC
Vitamine C
,
. . .
.ascorbique . L.,.ascorbique
totale
totale
1
237,2
49,7
286,9
275,4
2
233,0
50,7
283,7
275, 1
3
235, 1
46,3
281,4
274,2
4
234,6
51 , 1
285,7
274,2
5
245 ~ 7
48,5
294~2
274,7
6
242 ~ 1
47,6
289,7
274,7
7
233,8
50,5
284~3
274,7
8
239,1
50~ 1
289~2
215,4
9
238~ 6
51 , 1
289~7
274~4
10
240~9
48,2
289,1
275,4
------------- ----------------------------------- -------------
-x
238~0
49~4
287~4
274,8
...s
4~6
-
3~8
0~5
CV %
1~ 9
1~ 3
0~2

-
35 -
La
valeur
moyenne
des
teneurs
en
vitamine
C obtenue
par
fluorométrie
est
statistiqu~ment
différente
de
celle
obtenue
par
chromatographie en phase 1iqui de haute performance,
contrai rement à ce que
nous avons observé lors de notre étude sur le jus de raisinS. Le fait que les
résultats
obtenus
soient
systématiquement
plus
faibles
par
la
méthode
fluorométrique
peut
s'expliquer ·par
la
présence
éventuelle
d'impuretés
inhibitrices de fluorescence dans l'échantillon à analyser
(hypothèse qui
n'est pas à écarter puisque le dosage fluorométrique s'effectue sans isoler la
substance à doser de son substrat).
L'écart entre les deux moyennes restant
cependant faible «5 % ) est à tout à fait acceptable.
F. -Etude-critiquedes-autres.méthodesdedosage de la vitamine C
totale-par-chromatographieen phaseliguidehaute performance.
Des tec hniques chromatograph i ques di ff érentes de ce11 e que nous
avons
adoptée ont
été
utilisées pour le dosage simultané de l'acide L-
ascorbique et de
llaçide déhydro L-ascorbique. Les plus intéressantes ont été
publiées récemment et de ce fait n'ont pas été étudiées de façon approfondie
au cours de ce travail.
Nous les avons résumées brièvement dans ce paragraphe
en indiquant,
pour chacune d'entre elles,
les raisons pour lesquelles il ne
nous a pas paru souhaitable de les retenir.
l • Détection directe des acides L-ascorbique et déhydro
L~ascorbiquepar absorption ultraviolette.
Certai ns auteurs ont pensé pouvoi r détecter di rectement l' aci de
déhydro
L-ascorbique
après
l'avoir
séparé
par
chromatographie- en
phase
liquide,
en utilisant un détecteur ultraviolet placé à une longueur d'onde
inférieure à 220 nm, c'est à dire dans la zone spectrale où ce composé absorbe
légèrement.
A priori la sensibilité ne doit pas ètre excellente. La limite de
détection indiquée par ROSE et NAHRWOLD (1981) est de 50 mg/100ml (à À=210nm).
BIANCHI et ROSE (1985) ont adapté cette technique en utilisant un marquage
radioactif au carbone 14 de l'acide déhydro L-ascorbique pour améliorer sa
détection
(détection
radiochimique).
Ce
système
donne
une
meilleure
sensibilité comparée à celui qui utilise l'absorption ultraviolette,
mais les
auteurs n'indiquent pas la limite de détection.
Au cours
de notre
propre travail,
en util i sant un détecteur
Spectra Physics SP 8440 placé à la longueur d'onde de 220 nm,
nous avons
obtenu une limite de détection de 10 mg/100 ml,
certes meilleure que celle de
ROSE et NAHRWOLD ma i s néanmoi ns i nsuffi sante
car l es doses d' aci de déhydro

-
36
-
L-ascorbique
habituellement
présentes
dans
les
aliments
sont
souvent
inférieures â cette valeur.
Des limites de détection beaucoup plus basses ont
cependant
pu
être
attei ntes
en
uti lisant
des
détecteurs
ultravi 01 ets
spécialement conçus pour les lectures à longueur donde courte.
FINLAY et
DUANG (1981) ne précisent pas cette limite de détection,
mais indiquent avoir
trouvé dans un jus d'oranges des quenti tê s dl acide déhydro L-ascorbique aussi
faibles que 2,5 mg/100ml.
La séparation des acides L-ascorbique et déhydro L-
ascorbique n'est cependant pas parfaite.
WIMALASIRI et WILLS (1983) ont par
contre réalisé une séparation tout à fait satisfaisante des deux composés sur
colonne ~ Bondapak
carbohydrate
et
atteint
une
limite de détection
de
l mg/100 ml (à À = 214 nm) ,
Cependant lorsqu'un tel système est utilisé,
non
plus avec des étalons,
mais avec des échantillons réels,
le problème des
interférences se pose avec acuité.
En effet,
la plupart des constituants de
l'échantillon,
mais aussi
les impuretés éventuellement présentes dans les
réactifs et les solvants absorbent à une longueur dtonde inférieure à 220 nm
et peuvent donner des pics interférant.
avec celui de l'acide déhydro L-
ascorbique.
FINLAY et DUANG (1981) nlont présenté aucun enregistrement obtenu
à partir d'un échantillon réel. WIMALASIRI et WILLS (1983).ont montré à l laide
d'un échantillon de chou de Bruxelles qu'on pouvait obtenir un isolement
satisfaisant
de
ltacide
déhydro
L-ascorbique
à
condition
de
filtrer
ltéchantil10n
sur
une cartouche
de Sep
Pak
C 18
(opération
d'ailleurs
indispensable quelque soit le système de détection choisi).
Il est cependant
vraisemblable
que
pour
beaucoup
d'autres
échantillons,
cette
simple
purification risque de se révéler insuffisante.
2. Dérivationprécolonne de l'acide déhydro L-ascorbique.
KEATING
et
HADDAD
(1982)
ont
proposé
de
séparer
par
chromatographie en phase liquide haute performance par paires d'ions 11 acide
L-ascorbique et l'acide déhydro L-ascorbique,
ce dernier étant préalablement
transformé en produit fluorescent par l 'orthophénylènediamine.
Avec la phase
stationnaire utilisée ( ~ Bondapak C 18) les auteurs n'ont pas pu obtenir un
temps de
rétention stable pour l'acide L-ascorbique.
Des résultats plus
satisfaisants quant â la stabilité du temps de rétention ont été obtenus
par
chromatographie en phase inverse sur ~ Bondapak
CN
(HADDAD et LAU, 1984). La
méthode proposée présente cependant de nombreux inconvénients reconnus par les
auteurs eux mêmes: élution trop rapide du dérivé fluorescent, nombreuses
interférences qui ne permettent pas d' uti liser un détecteur par fl uorescence

-
37 -
(d'où obligation d'utiliser un détecteur ultraviolet beaucoup moins sensible)
et nécessité de changer de longueur d'onde
de détection
au cours
de la
chromatograph i e.
Nous
avons
par
ailleurs
montré
que
le
traitement
par
l'orthophény1ènediamine provoquait une transformation partielle de 11acide L-
ascorbique
en acide déhydro L-ascorbique
cette méthode risque donc de
conduire,
dans les cas limités où elle est applicable, à une surestimation de
la teneur en acide déhydro L-ascorbique.
Un autre réactif,
la quinoxa1ine,
a été utilisé par KNEIFFEL et
SOMMER (1985) pour le dosage de l'acide déhydro L-ascorbique dans les boissons
lactées.
Dans les conditions chromatographiques utilisées,
on constate comme
précédemment une é1ution beaucoup trop rapide du dérivé fluorescent formé,
ce
qui
augmente
considérablement
le
nombre
d'interférences.
Cette
méthode
nécessite par ailleurs l'utilisation de deux détecteurs différents.
3. Dérivation post colonne de l'acidedéhydro L-ascorbique.
Une méthode três sédui sante a été proposée par VANDERSLICE et
HIGGS
(1984)
et
consiste
en
une
dérivation
post
colonne des acides
L-
ascorbique
et
déhydro
L-ascorbique
séparés
préalablement sur
une colonne
échangeuse d'anions.
L'acide L-ascorbique oxydé
par une solution de chlorure
mercurique,
et
l'acide déhydro L-ascorbique sont
rendus fluorescents
par
action de l'orthophény1ènediamine.
Cette méthode est très sensible et plus
spécifique que celle de WIMALASIRI
et HIGGS,
mais onéreuse et complexe
puisqu'elle nécessite deux réactions post colonne successives.
Par ailleurs
les temps de rétention sont relativement importants (plus de 20 minutes),
ce
qui limite le nombre d'analyses que l'on peut réaliser quotidiennement.
Une vari ante de cette méthode a été proposée par KACEM et al
(1986):
l'acide L-ascorbique est dosé
par absorption ultraviolette à 254 nm
et l'acide déhydro L-ascorbique par fluorescence après dérivation post colonne
par l 'orthophény1ènediamine ;
dans ce cas
l'é1ution est
plus rapide
et
l'analyse
ne
nécessite
qu'une
seule
réaction
post
colonne mais
il
faut
disposer de deux systèmes de détection (par fluorescence et par absorption UV)
en série.
En définitive,
ces méthodes par dérivation post colonne nous
semblent beaucoup plus satisfaisantes sur le plan analytique que les méthodes
par détection
directe
ou
par dérivation
pré colonne.
Elles
présentent
cependant un certain nombre d'inconvénients: la durée excessive des analyses,
la complexité de la mise en oeuvre et le coût de l'appareillage.

-
38 -
IV.RESUME ET CONCLUSION
Au cours de notre travai l quatre méthodes de dosage de l a vitamine C
totale dans les aliments - celles qui sont les plus couramment utilisées - ont
été testées :
l a méthode photométri que au sel de tétrazo li um proposée par
BOEHRINGER~ la méthode photométrique à la dinitro-2~4 phénylhydrazine (méthode
officielle CEE
pour le
dosage de la
vitamine C dans
les
aliments
pour
an'imaux ) ,
la méthode fluorométrique à l'orthophénylènediamine (méthode AFNOR
pour le dosage de la vitamine C dan~ les jus de fruits et de légumes) et la
chromatographie
en
phase
liquide
haute
performance
avec
détection
électrochimi que;~ photométri que.
La
méthode
titrimétri que
cl assique
au
dichloro-2~6
phénol indophénol ne figure pas dans cette liste puisqu'elle ne
permet que le dosage de l'acide L-ascorbique.
Nous
avons
rapi dement
é li mi nés
l es
méthodes
photométri ques
qui
condui sent à des rêsul tats ~
soit aberrants (cas de l a méthode proposée par
BOEHRINGER)~ soit nettement supérieurs aux valeurs normales (cas de la méthode
officielle
CEE
qui
par
ailleurs
s'est
révélée
terriblement
longue
et
complexe).
La méthode fluorométrique est une méthode déjà ancienne~
qui~ à priori~
a deux inconvénients.
En premier lieu~ elle ne permet pas un dosage séparé de
l'acide L-ascorbique et de l'acide déhydro L-ascorbique ; mais si l'intérêt du
dosage est la détermination de l 'activité vitaminique C de l'échantillon~ cela
ne géne nullement puisque ,
fort heureusement ,
les deux composés ont la même
activité
vitaminique.
En
second
lieu~
elle
peut
être
sujette
à
des
interférences
si
la
fluorescence
parasite
due
à
la
présence
dans
-l'échantillon de composés naturellement fluorescents peut être corrigée par
'l'établissement d'échantillons blancs (on peut en effet empêcher sélectivement
la réaction de l'acide déhydro L-ascorbique avec l'orthophénylènediamine par
addition d'acide borique) les éventuels effets du milieu environnant sur la
fluorescence du produit à doser (effet d'écran~
inhibition de fluorescence
etc .. ) peuvent dans certai ns cas entr-aîner des erreurs de mesure.
Le fait
dl avoir obtenu lors de la comparaison de cette méthode avec la méthode par
chromatographie en phase liquide haute performance (qui possède une excellente
spécifité)
des résultats
très
comparables~
quel
que
soit
l'échantillon
analysé~ semble indiquer une très faible influence du milieu environnant sur
l a mesure.

-
39 -
Cette méthode
fluorométrique
a des
avantages
manipulations
très
simples,
appareillage à la portée de tous les laboratoires,
possibilité de
faire des dosages en séries en automatisant la méthode.
Mais nous pensons
néanmoins accorder notre préférence à une des méthodes par chromatographie en
phase liquide haute performance,
plus satisfaisantes dans la mesure où la
substance à doser est isolée de son substrat.
Nous avons choisi
la méthode
chromatographique par appariement d'ions avec réduction préalable de l'acide
déhydro L-ascorbique en acide L-ascorbique par la DL-homocystéine.
C'est une
méthode
simple
et
tout
à fait
satisfaisante
lorsqu'il
slagit
de
doser
exclusivement l'acide L-ascorbique.
Elle est évidemment moins simple si lion
souhaite doser séparément les deux formes de la vitamine C puisque dans ce cas
il
est
nécessaire de faire deux injections successives,
même si
l'on ne
souhaite doser que la vitamine C totale.
Nous avons par ailleurs rencontré de
grosses difficultés dans l'application de la technique de réduction par la
DL-homocystéine.
Le rendement de cette réduction est nettement inférieur à
100 %.
Il a donc été nécessai re dl i ntrodui re un coeffi ci ent correcti f afi n
dl apprécier
la
teneur
en
acide
déhydro
L-ascorbique.
Cette
méthode
chromatographique nous semble cependant supérieure à celles utilisant, soit une
détect i on di recte de l' aci de déhydro L-ascorbi que à courte longueur d'onde,
soit une technique par dérivation précolonne.
Seule la méthode préconisée par
VANDERSLICE et al (l984), par dérivation postcolonne, nous paraît meilleure du
point de vue analytique:
elle présente cependant les inconvénients d'être
complexe à mettre en oeuvre,
fort onéreuse,
longue (20 minutes d'élution) et
inapplicable à des dosages en séries.
Au vu de ces travaux,
et plus particulièrement des problèmes que nous
avons rencontrés pour la réduction de l'acide déhydro L-ascorbique par la DL-
homocystéine,
la Commission des Produits Diététiques et de Régime a préféré
chpisir
comme méthode
officielle
de dosage de la
vitamine C la méthode
f luoromêt r i que pl utôt que l a méthode chromatographi que à la DL-homocystéine.
Cette derni ère méthode, avec l es
aménagements que nous lui avons apportés,
donne cependant des résultats tout à fait satisfaisants.
Et c'est la raison
pour laquelle nous l'avons utilisée pour toutes les analyses de vitamine C
réalisées dans la 3ème partie de ce travail.

2èœ PARTIE
ETUDE DES VITAMINES DU GROUPE B
\\

-
40 -
INTRODUCTION
Le concept de vi tami ne provient des études menées dès 1e début du XXe
siècle sur le facteur antibéribérique. A l'époque, le béribéri, maladie qui se
manifeste
essentiellement
par
des
troubles
neurologiques
(polynévrite),
sévissait dans plusieurs régions du monde, en particulier en Asie où le régime
alimentaire
était essentiellement à base de riz
poli.
C'est
au médecin
militaire allemand EIJKMAN basé à JAVA et à son successeur GRIJNS que l'on
doit la première découverte en 1900 d'une polynévrite
chez la poule nourrie
exclusivement de riz poli. Cette maladie ressemblait au béribéri de l'homme et
pouvait être guérie si on remplaçait le riz poli par du son de riz.
GRIJNS
alla plus
loin dans ses recherches
en extrayant
un facteur
nutritionnel
hydrosoluble contenu dans le son de riz.
Il obtint seulement un extrait actif
mais non le facteur purifié.
Il a fallu attendre dix années pour que FUNK, en
1911, obtienne la substance cristallisée contenue dans le son de riz. Celle-ci
possédait une fonction amine et FUNK l'appela vitamine ou amine essentielle à
la
vie.
Ce nom
devait
par
la
suite
désigner
l'ensemble
des facteurs
nutritionnels essentiels à la vie et existant à l'état de traces.
La synthèse
de cette première vitamine fut
réalisée par WILLIAMS et
al
en 1936 qui
montrèrent que le produit de synthèse avait une activité équivalente à celle
du produit naturel. Ils proposèrent de l'appeler thiamine.
En 1937 commençait
alors sa synthèse industrielle par de grandes firmes chimiques (MERCK et Co
(USA) et HOFFMANN La ROCHE (SUISSE)).
La même année, son activité biologique
comme coenzyme dans le métabolisme des hydrates de carbone,et particulièrement
du pyruvate,fut prouvée (Mc GOWAN et PETERS,
1937). LOHMAN et SCHUSTER (1937)
montrèrent que la forme active de la thiamine en temps que coenzyme est le
pyrophosphate de thiamine.
Parallèlement à ces travaux sur le béribéri,
se développaient d'autres
recherches
sur
la
pellagre,
maladie qui se caractérise par
des lésions
cutanées
(dermatose)
et
des
troubles
digestifs
(diarrhée)
et
nerveux
(démence) d'où le nom de syndrome des trois D qui permet son diagnostic. C'est
ainsi que tour à tour,
les vitamines 82, 83 et 86 furent considérées comme le
facteur nécessaire à la prévention de la pellagre.
Le vrai
facteur fut
identifié comme étant l'acide nicotinique par trois groupes de chercheurs
(FOUTS et al,
1937;
SMITH et al, 1937 et SPIES et al, 1938). ELVEHJEM et al
(1937)
montrèrent
avec
succès
que
la
nicotinamide
(amide
de
l'acide
nicotinique) était aussi active contre la pellagre du chien,
maladie alors
appelée "langue noire du chien". Ces deux composés furent appelés vitamine B3.

-
4 1 -
\\
La vitami ne B2 avait été confondue primitivement avec les autres
vitami nes du
groupe B e l l e en fut
progress i vement séparée grâce à de
nombreux travaux.
Elle fut identifiée entre 1930 et 1935 en méme temps par
GYORGI et plusieurs autres chercheurs comme étant un facteur de croissance.
Un autre facteur présent dans l'aliment et capable de guérir la
pellagre du rat fut découvert par GYORGI en 1934.
Il l'appela vitamine B6.
Elle n'avait cependant aucune action sur la pellagre de 1 'homme. Les signes de
déficience se manifestent chez l'homme princi pa1ement par une
anémie,
des
troubles digestifs et une dépression nerveuse suivie de convulsions.
Cette
vitamine B6 correspondait à la structure du pyridoxo1 et c'est seulement en
1945 que SNELL montra l'existence de·deux autres formes de la vitamine B6 : le
pyridoxa1 et la pyridoxamine.
Toutes ces vitamines (B1,
B2,
B3 et B6) ont été synthétisées dans la
méme période,entre
1934 et 1939.
La synthése de la riboflavine fut réalisée
en 1934 par KUHN, celle de l'acide nicotinique par WARBURG en 1937 et celle du
pyridoxo1 par HARRIS et FULKERS en 1939.
On peut
donc considérer ces vitamines comme un groupe de substances
organiques présentes en très faibles quantités dans les aliments naturels et
essentielles au fonctionnement normal du métabolisme.
Leur absence dans le
régime alimentaire provoque des maladies par déficience.
Cette présence à
l'état de traces
laisse
supposer que la détermination
analytique de ces
substances ne sera pas aisée.
La deuxième partie de ce travail sera consacrée
à la mise au point de méthodes de dosage par chromatographie en phase liquide
haute performance,
suffi samment sensi b1es et spécifi ques pour permettre une
détermination satisfaisante de l'ensemble de ces vitamines dans les aliments.
Lors de notre travail expérimental ces deux aspects de la méthode analytique -
extraction et séparation chromatographique - ont été étudiés en parallèle; la
mise .au point d'une technique d'extraction implique en effet l'utilisation
d'une méthode deséparation et
de dosage
(afin d'apprécier
la qualité
de
l'extraction)
alors
que
le
choix
d'une
technique
chromatographique
est
di rectement 1i ée à 1a nature des produits à séparer et dépend donc de la
technique d'extraction.
Afin de réaliser un exposé relativement clair de nos
résultats, nous avons cependant choi~i de traiter séparément ces deux aspects.
Ce 1a présente évi demment quel ques i nconvénients pui sque nous serons amenés à
présenter dans le premier paragraphe consacré aux techniques d'extraction des
chromatogrammes réalisés dans des conditions qui ne seront justifiées que dans
le deuxième paragraphe.

-
42
-
~ CHAPITRE 1
STRUCTURES ET PROPRIETES PHYSICOCHIHIQUES
DES VITAMINES 81, 82, 83 et 86
r
1. STRUCTURES ET NOMENCLATURES
l.L a vi tami ne 81.
La vitamine 81 sous sa forme cristalline est le chlorhydrate de
diméthyl-2,5 amino-4 pyrimidine-méthyl-4'hydroxyéthyl-5 1 thiazo1e-l',3 1 •
Elle
est
f rêquenment
appelée
thiamine.
D'autres
dénominations
sont
parfois
util isées :
oryzamine,
toruline,
polyneuramine,
vitamine F ou vitamine
antibéribérique (figure la).
Figure la : Formule développée de la vitamine 81.
Dans les plantes,
la thiamine est en grande partie sous forme
libre et se localise essentiellement dans les germes et le scutellum (GU8LER,
1984).
Dans les tissus animaux,
la % seulement de la thiamine est sous forme
libre,
le reste étant sous forme de phosphates (80 % de diphosphates, la % de
triphosphates).
Aussi bien chez les. plantes que chez les animaux,
une partie
importante de cette vitamine est liée aux protéines.

-
43
-
2. La vitamine B2.
La vi tami ne B2 est la diméthyl-7,8 1'D ribity1-10 isoa11oxazine.
Elle est trés couranvnent appelée riboflavine.
D'autres noms lui sont donnés
comme
-----
vitamine
G,
ovof1avine,
lactoflavine,
1yochrome,
urof1avine
ou
hépatof1avine (figure 11).
f
Figure .11 : Formule développée de la vitamine 82.
Dans les aliments la vitamine
B2
se rencontre
sous
trois
formes:
riboflavine libre,
riboflavine 5'monophosphate (FMN) et flavine
adénine dinuc1éotide (FAD).
Chez les mammifères elle est sous forme de FAD et
de FMN.
mais aussi sous forme de riboflavine libre au niveau des yeux et dans
les urines (COOPERMAN et LOPEZ, 1984).
3. La vitamine B3.
La vitamine B3 est formée de l'acide nicotinique et de son amide.
la nicotinamide. Ces deux composés ont la même activité vitaminique.
L'acide nicotinique est l'acide pyridine-3 carboxylique (ou acide
pyridine- B carboxylique).
Il est encore appelé vitamine pp ou facteur pp
(prévention de la pellagre).
vitamine antipellagre ou niacine
(figure 12)
Figure 12
Formules développées de l'acide nicotinique (1) et de
la nicotinamide (2)

-
44 -
Dans les tissus animaux et végétaux, la vitamine B3 est so~s forme
libre (aci~e nicotinique ou nicotinamide) ou sous forme biologiquement active
(nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) et nicotinamide adénine dinucléotide
phosphate (NADP) ) (HANKES, 1984).
4. La vitamine B6.
f
Les trois formes naturelles de la vitamine B6 sont le pyridoxol
(ou pyridoxine),
le pyridoxal
et la
pyridoxamine (figure 13),
ces trois
composés ont la même activité vitaminiqu~ (RABINOWITZ et SNELL, 1949).
Figure 13
Formules développéesdu pyridoxol (1), du pyridoxal (2)
et de la pyridoxamine (3).
Le
pyridoxal
et
la
pyridoxamine sont
capables
de fixer
une
molécule de phosphate au niveau de leur groupement -CH
en position 5,
ces
20H
deux formes phosphorylées se retrouvent dans les produits naturels.
Dans les
aliments la vitamine B6 est principalement liée aux protéines.
II. PROPRIETES PHYSICOCHIMIQUES Bl,
B2, B3 et B6.
Les
principales
propriétés
physiques
de ces
vitamines
sont
résumées dans le tableau 10.
Ces
vitami nes sont
appelées vitami nes hydrosol ubl es du fait de
leur grande solubilité dans l'eau, terme peut-être impropre en ce qui concerne
la riboflavine dont la solubilité dans l'eau est faible. Seule la nicotinamide
est soluble
dans certains
solvants organiques
(éther éthylique,
acétone,
benzène et chloroforme).

Tableau 10 : Propriétés physiques des vitamines 81, 82, 83 et 86
83
86
81
82
-
Chlorhydrate
Riboflavine
Acide
Chlorhydrate
Chlorhydrate Pich1orhydra te
de thiamine
nicotinique
Nicotinamide
de
de
de
pyri doxo1
pyri doxa 1
pyridoxamine
Formul e brute C12H16N40S,HCl Cl] H20 N4 06
C6 H5 N 02
C6 H6 N2 0
C8H11N03,HC1
C8H9N03,HC1
C8H12N02, 2H Cl
Aspect
Aiguilles
poudre
poudre
poudre
poudre
aiguilles
aiguilles
plates 1égère- cri sta11 i ne
cristalline
cristalline
faiblement
blanches
blanches
ment jaunes
jaune orange blanche
blanche
jaunâtre
Poids
337,27
376,37
123,11
122,12
205,64
203,63
259,1
moléculaire
.
Point
J::-
248 0 C
278 0 C
236 0 C
1280 C
1600 C
' 1650 C
226 0 C
\\J1
de fusion
avec
avec
décomposition
avec
avec
décomposition décomposition
à 205 0 C
décomposition décomposition
Sol ubil i té
1000g/1 d'eau 0,33g/1 d'eau
16g/1 d'eau
1000g/1 d'eau
222g/1 d'eau
500g/1 d'eau
500g/1 d'eau
55g/1 de
plus soluble
so1ub 1e dans
666g/1
11g/1
17g/1
6,5g/1
glycéro1
dans les
le propylène
d'éthanol
d'éthanol
d'éthanol
d'éthanol
10g/1
solutions de
glycol
100g/1 de
à 95 0
à 95 0
à 95 0
d 1éthano1 à
Na Clou dans
glycéro1
soluble dans
95°
l' éthano1
soluble dans
'leprofy1ène
3g/1 d' étharo
l'éther
glyco
absolu
éthYlique et
le chloroforme
1

-
46
-
A. Stabi 1ité
Les vitami nes hydroso 1ub1es,
en dehor s de 1a vitami ne B3,
sont
très sensibles à 11action de la lumière.
Cette sensibilité est plus forte en
milieu
alcalin,
surtout
pour la 'riboflavine qui
est alors
transformée en
1umichrome
(dimét9Y1-7,8
alloxazine)
ou en 1umif1avine
(triméthyl-7,8,
10
isoa 11 oxazine).
La chaleur sèche n'a pas d'effet sur ces vitamines, mais celles-ci
deviennent instables en milieu humide lorsque la température est élevée,
à
l vexceptf on de
la riboflavine
qui est
remarquablement stable
à
la chaleur
humide.
Dans de telles conditions, et en présence d'oxygène ou d1oxydants, la
thiamine peut étre transformée en sulfate ou disu1fate tout en conservant son
activité
vitaminique.
Si
le
milieu
est
alcalin
1 1acide
nicotinique
est
décarboxy1é par la chaleur.
La thiamine en solution alcaline est convertie en thiochrome qui a
une fluorescence bleue caractéristique;
cette conversion a pour conséquence
une perte irréversible de l t act ivt tê vitaminique.
Elle donne des réactions
colorées avec de nombreux réactifs tels que l'acide diazosulfamilique et la
formaldéhyde
(coloration rose),
la
diazoparaacétophénone
(coloration rouge
pourpre)
ou 1 1iodate double
de potassium et
de
bismuth
(coloration
rouge
orangé avec précipitation).
La riboflavine,
en
présence de dithionate de
sodium, donne un composé coloré qui est la dihydroribof1avine. La nicotinamide
traitée par des bases ou acides est convertie en acide nicotinique. Ce dernier
est capable de réagir avec certains métaux comme l'aluminium,
le calcium,
le
cuivre ou le sodium pour donner des sels.
B. Propriétés spectrales
Les spectres d1absorption dans
le domaine visible-ultraviolet de
l'ensemble des vitamines étudiées sont reproduits dans
la
figure 14.
Ces
molécules
ont des
coefficients d'extinction
moléculaire maxima
qui
varient
très peu
avec
le
pH de
la so l ut î on ,
On observe cependant un léger effet
hyperchrome
dans
le
cas de
la thiamine
lorsque le
pH augmente.
Un effet
bathochrome assez
marqué
a
été
observé
dans
ces
conditions
pour
l'acide
nicotinique,le pyridoxo1, le pyridoxa1 et la pyridoxamine (voir tableau 11).

-
47
-
Seules les vitamines B2 et B6 sont naturellement f luorescentes
(voir figure 15).
Les l onqueurs d'onde maximales d'émission de fluorescence
sont indiquées dans le tableau 12.
Celles-ci sont indépendantes du pH de la
solution.
Si on donne arbitrairement la valeur 1.00 au rendement quantique de
fluorescence de la riboflavine. éelui-ci sera de 0.23 pour la pyridoxamine. de
0.18 pour le pyridoxol et de 0.14 pour le pyridoxal.
Tableau 11
Longueurs d'ondes maximales d'absorption (À max)
en nm et coefficients d'extinction moléculaire (~max)
des vitamines hydrosolubles à différents pH.
Vitamine
pH 2.5
pH7
Thiamine
À max
240
265
232
e· max
7800
7800
10.300
Riboflavine
À max
445
445
visible
€. max
5.800
6.200
UV
À max
265
265
e max .....
32.000
34.400
Acide
À max
262
262
nicotinique
6 max
3.500
3.300
Nicotinamide À max
262
262
E. max
2.800
3.000
Pyridoxol
À max
288
320
t max
8.000
7.000
Pyridoxa1
À max
288
316
e. max
9.200
9.000
Pyridoxamine
À max
294
326
E max
8.000
8.000

Absorbance
0, 1
Ab s o r b a n c .
0,08
1
;
-
~
,
1
1
Thiamine
1i
,
Rib 0 fla v in e
1
i
., .
'.' .. )
,
0,03
1
co
-cr
·1
1
.
!
1\\')
.~....'.
0,02
"1
1
1
,
1
i
,
i
1
1
1
" .'
\\.'.1
1-
0,01
-'1
i
1
,
.1
1
- :1
!

1
i
!
1
1
1
1
.
1
1
!
,
I.:

300
300
400
400
(longu€ur
Id'onde
500
en nm)
600
1
Figure
14
Spectres d'absorption ultraviolets des vitamines du groupe
B.

i
T""
49 -
Absorbanrc
1
0,03,
0,03
Pyridoxamine
Pyridoxal
0,02:
0,02
1
,
,
1
1
1
,
1
1
l
,
1
~',
r .
D,OI
1
!
!
!
1
1
.~
i
1
i
1
1
!
1
1
l
1 '
i
!
j
;"'''.....
,
t :
' "
t
1
1
t
1
i '
i
j
~ .;
1
240
1
300
1
400
200
4;00 1
Actde nico~inique
1
i
1
1
i
1
Oi
1
0,03
OJ
:j. ... t .
1
:
.
.
l
Nidotinamide
!Py r Ild o x o l
l
,
,
; 1
'
;
1
1j,l
0,02
o,o~
., 0,j02"
1
0,0 l'
0, O.]
0,;01 _
1
1
260
320
260
300
300
400
(longueur.
d'oride
en nm)
Figure
14
(suite)

:IAX :
30,0
-
51
-
Excitation:
305 nro
PYRIDOXAMINE
longueur
d'onde
360
400
460
en nro
MAX:
20,0
Excitation
305 nll'
PYRIDOXAL
340
L~ 00
460
longueur
d'ondes
en nro
MAX:
25,0
PYRIDOXOL
Excitation
300 n~
3'20
400
460 longueur
d'onde
en nro
Figure
15
(suite)

-
52 -
Tableau 12
Longueurs d'ondes maximales d'excitation et d'émission
de fluorescence des vitamines B2 et B6.
Vitami ne
Longueur d'onde
Longueur d'onde
.... ·d'excitation (en nm)
d'émission (en nm)
Ri bofl avi ne
425
520
Pyri doxol
290
395
Pyridoxal
290
380
Pyri doxami ne
290
390

-
53 -
CHAPITRE 2
SEPARATION ET DOSAGE SIMULTANES DES VITAMINES 8 (81, 82, 83 et 86)
PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE.
Avant l' apparit ion rel at i vement récente de l a chromatographi e en
phase liquide haute performance,
le dosage des vitamines du groupe B dans les
aliments était une entreprise difficile,
longue et aléatoire.
Les méthodes
utilisées
colorimétriques,
fluorométriques
ou
microbiologiques
se
caractéri sent toute par \\ une spécifi ci té i ncertai ne et par une très grande
complexité. Il suffit pour s'en persuader de consulter la dernière édition des
méthodes
d'analyses
de
l'AOAC
(1984)
qui
préconise
encore
des
dosages
fluorométriques pour la thiamine (après transformation en thiochrome) et pour
la riboflavine,
un dosage colorimétrique pour la vitamine B3 et un dosage
microbiologique pour la vitamine B6.
Dès la fin des années 70,
l'utilisation de la chromatographie en
phase liquide haute performance a laissé
présager une
simplification des
méthodes
de dosage des vitamines
du
groupe B (tout en améliorant
leur
spécificité) et, pourquoi pas, ,la possibilité de doser simultanément plusieurs
vitamines,
~n dépit du fait que ces molécules aient des structures chimiques
très différentes.
Ce chapitre rappelle les premiers travaux que nous avons effectués
sur ce sujet â la Faculté de Médecine 'et de Pharmacie de Dakar,
en 1981. Dans
le premier paragraphe,
nous avons résumé les pri nci paux résultats obtenus
concernant la séparation d'échantillons témoins de vitamines du groupe B par
différentes techniques chromatographiques en phase liquide haute performance.
Dans le deuxième et dernier paragraphe nous discuterons de l'intérèt et des
limites
des
techniques
de
séparations
multiples
lorsque
celles-ci
sont
appliquées à l'analyse des aliments.
1. SEPARATION PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE DES SOLUT!ONS ETALONS DE VITAMINES DU GROUPE B.
Cinq vitamines ont été étudiées:
la thiamine,
la riboflavine,
l'acide nicotinique, la nicotinamide et le pyridoxol. Nous avons essayé de les
séparer successivement par chromatographie d'adsorption,
par chromatographie
sur échangeurs de cations,
par chromatographie sur supports greffés en phase

-
54
-
inverse et enfin par chromatographie d'appariement d'ions.
Nous avons choisi
comne système de détection, . un détecteur
par absorption
ultraviolette à
254 nm.
C'est en effet le seul système permettant de détecter l'ensemble des
vitamines étudié~s.
Les phases stationnaires utilisées,
ainsi que les phases
mobiles pour
lesquelles nous
avons obtenu la meilleure séparation,
sont
indiquées dans le tableau 13. Nous y avons également fait figurer les temps de
rétention correspondants pour chaque vitamine.
Il apparaît clairement à la lecture de ce tableau que la seule
technique
réalisant
la
séparation
des cinq
vitamines
étudiées
est
la
chromatographie par appariement d' ions.
C'est en effet 1a seule techni que qui
permette l
lut tcn de la thiamine:
Le temps de rétention de cette dernière
v ê
molécule peut
être
allongé
en augmentant
la
proportion
d'acide heptane-
sulfonique par rapport à celle del'acide
pentamesulfonique dans la phase
mobile
(temps
de rétention de
15,5 minutes
en
absence d'acide pentane-
sulfonique).
Le chromatogramme obtenu par cette technique (en utilisant les
conditions expérimentales indiquées dans le
tableau 13) est donné dans la
figure 16.
( 1 )
,
( 2 )
( 5 )

Il
(Temps
en minutes)
la
5
a
Figure 16
Séparation simultanée de l'acide nicotinique (1), de
la nicotinamide (2), de la riboflavine (3), du
pyridoxo1 (4) et de la thiamine (5) par chromatographie
d'appariement d'ions.

Tableau 13 : Caractéristiques chromatographiques des méthodes utilisées
pour la séparation des vitamines du groupe B
"
Chromatographie en phase
Phase
Phase
vitamines é1uées et
liquide haute performance
stationnaire
mobile
temps de rétention
~ Porasi 1 (10 ~ )
méthano1-dich1oro-
Acide nicotinique 2~0 mn
d'adsorption
(1= 30 cmt ~ 3t9 mm)
méthane (10 : 90 v/v)
Nicotinamide
4t5 mn
Riboflavine
8 tO mn
~ Bondapa k ex /
phosphate molilO-
Acide nicotinique 2,0 mn
sur échangeurs
corasil (10 u ) *
potassique 0,05 M
Nicotinamide
3t5 mrr
VI
VI
de cations
(1 = 61 cm, ~ 2 mm)
Riboflavine
7,5 mn
Pyridoxo 1
11,0 mn
~ Bondapak e 18 (10 ~ )
eau-méthanol
Acide nicotinique 2tO mn
sur support greffé
(1 = 30 cm, ~ 3t9 mm)
(75 : 25 v/v)
Nicotinamide
2,7 mn
en phase inverse
Pyridoxo1
4,0 mn
Riboflavine
8 t5 mn
~ Bondapa k e 18 (10 ~ )
eau-méthanol
Acide nicotinique 2,0 mn
par appariement
(1 = 30 cmt ~ 3t9 mm)
(75 : 25 v/v)
Nicotinamide
2,5 mn
d'; on s
+ acides pentane et
Pyridoxo1
4tO mn
heptane su1foniques
Riboflavine
6t7 mn
(50 : 50 v/v) 0,005 M
Thiamine
10,0 mn
* Phase stationnaire à supports pelliculaires qui nlest plus fabriquée actuellement.

-
56 -
1I. APPLICATION DE LA TECHNIQUE DE SEPARATION MULTIPLE DES.
VITAMINES DU GROUPE 8 AUX ALIMENTS. SES LIMITES.
L'idéal serait bien sûr de pouvoir séparer et doser en une seule
opération
analytique
l'ensemble
des
vitamines
8 d'un
aliment.
Peut-on
l'envisager à la suite de ce travail préliminaire?
Il faudrait pour cela
pouvoir répondre oui aux trois questions suivantes:
1) Est-il possible d'envisager d'utiliser une même technique
d'extraction pour l'ensemble des vitamines à partir
d'échantillons alimentaires?
2) Est-il possible de séparer correctement,
en une seule
opération chromatographique,
l'ensemble des vitamines du
groupe 8, pas seulement lorsqu'on a affaire à un mélange de
vitamines étalons,
mais aussi lorsque ce mélange a été
extrait d'un aliment?
3) Est-il possible de n'utiliser qu'un seul système détecteur
pour doser l'ensemble des vitamines et, si oui, ce détecteur
est-il suffisamment sensible?
En
ce
qui
concerne
la
technique
d'extraction,
on
peut
raisonnablement
envisager -une
technique
identique
pour
l'ensemble
des
vitamines du groupe S,
comportant une hydrolyse acide des protéines suivie
d'une
hydrolyse enzymatique
destinée,
d'une
part à
hydrolyser
l'amidon,
,
d' aut re part à rompre les lia i sons phosph ates des vitami nes,
ceci
étant
généralement
réalisé
par
une' enzyme
amylasique
possédant
également une
activité phosphatasique.
Mais il est évident que cette technique générale
d'extraction sera certainement souvent plus complexe que celle qu'on serait
amené à utiliser pour le dosage d'une seule de ces vitamines.
Au cours de ce travail préliminaire,
nous n'avons séparé que cinq
des principales vitamines du groupe S.
Il manquait en particulier à notre
liste le pyridoxal et la pyridoxamine.
L'addition de ces deux composés ne
devrait pas poser de problèmes analytiques insurmontables,
du moins lorsqu'on
a affaire à un mélange de vitamines étalons.
La séparation risque de devenir
beaucoup plus complexe lorsqu'on travaille sur des échantillons alimentaires.
En effet,
il n'est pas possible d'obtenir des extraits parfaitement purifiés
et les risques d'interférences croissent très rapidement avec le nombre de
vitamines à séparer.
Sans vouloir anticiper sur la suite de notre travail, il

-
57 -
suffit de se référer au chapitre 5 consacré au dosage des différentes formes
de
la
vitamine
86 pour
le constater.
Conme les
substances succeptibles
d'interférer peuvent varier d'un aliment à l'autre,
il
semble donc très
présomptueux de vouloir mettre au point des conditions chromatographiques
permettant de séparer toutes
les vitamines du groupe 8 quelle que soit la
nature de l'aliment étudié.
Le choix du système de détection pose également un problème.
Le
seul
qui
soit
d'utilisation
générale
est
le
détecteur
à
absorption
ultraviolette

254 nm) ,
Or,
malheureusement,
il
ne présente pas une
sensibilité suffisante pour doser les faibles quantités de vitamines 81 et 86
contenues dans les aliments.
Il ne peut être utilisé que pour le dosage de la
vitamine 83 et à T'extrêne
rigueur pour celui
de
la vitamine
82.
Pour
améliorer
la
sensibilité de la
méthode
il
est nécessaire
d'utiliser
un
détecteur par fluorescence.
Cela est possible pour la vitamine 86 et pour la
vitamine 81 (à condition de la transformer préal ablement en thiochrome).
La
vitamine 83 par contre,
ne fluoresce pas.
Pour réaliser une séparation
multiple,
il
apparaît donc nécessaire d'utiliser plusieurs détecteurs en
séries et de changer les longueurs d'onde de travail au cours de l'élution, ce
qui complique considérablement la méthode.
En conclusion,
la séparation et le dosage simultanés de plusieurs
vitamines par chromatographie en phase liquide haute performance nous semble
trop complexes et difficilement envisageables dans les aliments.
Il faudrait
peut-être faire une exception pour les aliments contenant un nombre restreint
de vitamines
mais en quantités' importantes,
conme c'est
le cas pour les
aliments
enrichis
en vitamines.
Les
seuls
auteurs
ayant
proposés
des
séparations multiples ont d'ailleurs travaillé sur ce type d'aliments:
TOMA
et TA8EKHIA (1979) ont dosé la thiamine,
la riboflavine et la niacine dans du
riz et des aliments à base de riz enrichis; WEHLING et WETZEL (1984) ont pour
leur part dosé la thiamine,
la riboflavine et le pyridoxol dans des céréales
enrichies.
Ayant partiellement abandonné cette voie,
nous avons cherché à
mettre
au point
des méthodes
de dosage pour chaque vitamine
(thiamine,
riboflavine,
les deux formes de la .vitamine 83 et les trois formes de la
vitamine 86),
mais en essayant de faire en sorte que ces techniques aient le
plus de points communs possible,
du moins lorsque cela ne nuit pas à la
qualité du dosage.
. /
/
/

-
58 -
CHAPITRE 3
LE DOSAGE DES VITAMINES 81 ET 82 DANS LES ALIMENTS.
MISE AU POINT D'UNE METHODE PAR CHROMATOGRAPHIE
EN PHASE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE.
Les méthodes officielles AOAC (1984) de dosage des vitamines Bl et
82 dans les aliments sont des méthodes fluorométriques.
La riboflavine est
naturellement fluorescente;
la thiamine par contre,
doit être préalablement
transformée en thiochrome fluorescent par action du ferrocyanure de potassium.
Ces méthodes sont encore très souvent utilisées aussi bien en ce qui concerne
la riboflavine (RASHID et POTTS,
1980; RETTENMAIER et VUILLEUMIER, 1983) que
la thiamine (RIBBRON et al,
1977; GREGORY et KIRK, 1979 ; RETTENMAIER et al,
1979;
KARL8ERG et THELANDER,
1980;
RYAN et INGLE,
1980; SOLIMAN, 1981).
Elles sont cependant complexes à mettre en oeuvre, nécessitent de fastidieuses
étapes de purification et exigent la réalisation d'un dosage à blanc, sans que
pour cela leur spécificité soit garantie.
Des méthodes photométriques ont été proposées pour le dosage de la
thiamine (KURZAWA et CIECHOWSKI, 1980 ; SANE et al, 1985) et de la riboflavine
(PICKOVA,
1977
JACOBSON et al,
1977;
EGBERG,
1979).
Elles n'apportent
cependant aucun progrês par rapport aux méthodes fluorométriques et ont dans
tous les cas une sensibilité plus faible.
La chromatographie en phase gazeuse a été proposée pour le dosage
de la thiamine par divers auteurs (SEIFERT et MILLER,
1973;
ECHOLS et al,
1980, 1982, 1986 ; VELISEK et al, 1986). Cette molécule qui nlest pas volatile
est préalablement transformée en (hydroxyéthyl-2' )-5-méthylthiazole-4. VELISEK
et al (1986),
en utilisant un détecteur à photométrie de flamme,
ont obtenu
une limite de détection de 0,1
j.lg/ml,
comparable à celle obtenue par la
méthode fluorométrique au thiochrome. La méthode, en dépit des simplifications
apportées par ces auteurs,
reste longue et complexe.
Par ailleurs,
il nlest
pas envisageable de doser la riboflavine par une méthode analogue.
Depui s une di zai ne dl années,
l a chromatographie en phase li quide
ha~te performance est de très loin la méthode la plus utilisée pour le dosage
des vitamines Bl et 82 dans les aliments. Certains auteurs llont utilisée soit
pour le dosage de la thiamine (KIMURA et al,
1980;
PANIJPAN et al,
1982;
OHTA et al,
1984;
AYr et al, 1985 ; BOTTICHER et BOTTICHER, 1986) soit pour
le dosage de la riboflavine (RICHA~ON et al,
1978;
NIELSEN et al,
1983;

-
S9 -
ASHOOR et al,
1983 et 1985 ; WATADA et TRAN, 1985 ; STANCHER et ZONTA,.1986 ;
TOYOSAK I et al, 1986;
RIBAROVA .et~a l,
1987).
Mai s à notre avi s ,
son grand
intérêt est de permettre un dosage simultané de ces deux vitamines
(ou du
moins d'utiliser les mêmes conditions chromatographiques pour ce dosage). Dans
les premiers articles publiés,
la détection des deux vitamines se faisait par
absorption ultraviolette (TOMA et TABEKHIA,
1979;
KAMMAN et al, 1980). Cela
était possible car
les
auteurs
travaillaient
sur des aliments
fortement
enrichis en vitamines.
Pour un aliment non (ou faiblement) supplémenté,
ce
mode de détection n'est pas assez sensible. Seul un détecteur par fluorescence
permet d'obtenir une sensibilité suffisante.
Cela ne pose aucun problème pour
la riboflavine qui est naturellement fluorescente.
C'est par contre moins
simple en ce qui concerne la thiamine (non fluorescente) qu'il est nécessaire
d'oxyder par le ferrocyanure de potassium pour la rendre fluorescente sous
forme
de thiochrome.
Deux solutions ont été
utilisées:
une détection
précolonne (ANG et MOSELEY,
1980;
SKURRAY,
1981;
FELLMANN et al,
1982;
AUGUSTIN et al,
1984; FINGLAS et FAULKS, 1984) ou une détection post colonne
(HURST et al,
1983
MAURO et WETZEL,
1984
WEHLING et WETZEL,
1984;
WIMALASIRI et WILLS, 1985).
Dans le
premier paragraphe de ce chapitre,
nous expliquerons
pourquoi nous avons choisi la première solution. Dans les paragraphes suivants
nous exposerons les diverses étapes qui nous ont permis finalement de proposer
une méthode originale pour le dosage des deux vitamines.
I. DERIVATION PRECOLONNE OU POST COLONNE POUR LE DOSAGE DE LA
THIAMINE?
La dérivation post colonne apparaît,
dans son principe du moins,
plus satisfaisante
que la
dérivation précolonne
:
elle permet en
effet
d'envisager une technique d'extraction et une séparation chromatographique
identiques pour les deux
vitamines,
ce qui n'est pas possible avec une
dérivation précolonne. Dans ce dernier cas, il est nécessaire d'introduire une
étape supplémentaire correspondant à l'oxydation de la thiamine en thiochrome
et,
de ce fait,
le dosage des deux vitamines peut s'effectuer dans les mêmes
conditions chromatographiques, mais pas simultanément.
Un certain nombre d'inconvénients de la dérivation post colonne
ont
cependant
été mis
en évidence
lors
de
la
réalisation
pratique
de
l'analyse.

-
60 -
En premier lieu,
le
problème de la détection:
les longueurs
d'onde d'excitation et d'émissi.on "ne sont évidemment pas les mèmes pour la
thiamine et pour la riboflavine;
il est donc nécessaire de les changer au
cours de l'é1ution, ce qui ne va pas sans poser quelques problèmes techniques.
En ce qui concerne le choix des conditions chromatographiques,
il
est
relativement
restreint
car -nous
avons
montré
précédemment
(voir
chapitre 2,
2ème partie)
qu'il était absolument nécessaire d'utiliser une
technique par appariement d'ions pour éluer la thiamine.
Ce n'est pas le cas
pour la dérivation précolonne puisque le thiochrome n'est pas une molécule
ionisée. De plus l'utilisation de la technique par appariement d'ions exige un
temps très long pour équilibrer les colonnes,
préjudiciable à la rapidité de
l'analyse.
L'utilisation de la dérivation postcolonne a d'autres conséquences
néfastes.
On observe tout d'abord une augmentation du temps de rétention des
vitamines et un élargissement des pics;
ensuite une perte de sensibilité due
à l' i ntroducti on
dans 1a phase mobile d'un excès
de réactif
oxydant
qui
apporte une faible émission parasite de fluorescence.
Enfin, il faut signaler
la grande complexité (réglage de la réaction post colonne) et le coût élevé
(utilisation d'une deuxième pompe)
de la méthode.
Les avantages de la dérivation post colonne ne nous ont pas semblé
suffisants pour contrebalancer ses divers inconvénients.
Et,
en définitive,
nous avons préféré avoir recours à la méthode par dérivation préco10nne,
plus
simple à mettre en oeuvre, moins coûteuse et de meilleure sensibilité.
II. MISE AU POINT D'UNE METHODE D'EXTRACTION DES VITAMINES B1 ET
B2DANS LES ALIMENTS.
Comme nous l'avons indiqué précédemment (voir page42)la thiamine
et la riboflavine sont essentiellement dans les aliments sous forme libre et
sous forme de phosphates,
presque toujours liées aux protéines.
Une bonne
technique d'extraction doit permettre de rendre entièrement libres ces deux
vitamines avant la séparation chromatographique.
La plupart des aliments ne
contiennent que de faibles quantités. de vitamines et ne constituent donc' pas
un substrat idéal pour étudier la validité d'une technique d'extraction. C'est
la raison pour laquelle nous avons choisi comme aliment d'étude la levure,
un
aliment diététique qui a la particularité de contenir des quantités élevées de
vitamines B1et B2, à la fois sous forme libre et sous forme liée.
Nous
avons
choisi
dans
un
premier
temps,
comme
technique
d'extraction,
la
technique
AOAC
(1984).
Elle
comprend
une
hydrolyse
chlorhydrique
(par HCl
O,lN au bain
marie
100°
C)
afin
d'hydrolyser
les

-
61
-
protéines et de rompre les liaisons protéines-vitamines,
puis une hydrolyse
enzymatique (50 mg de B amylase. (Merck) pour une prise d'essai de 5g) dont le
rôle essentiel est,
non pas tant d'hydrolyser l'amidon, mais surtout, grâce à
la présence d'impuretés à activité phosphatasique,
de rompre les liaisons
phosphates des vitamines.
la thiamine est alors oxydée en thiochrome par le
ferrocyanure de potassium.
Nous avons ensuite légèrement modifié la méthode
AOAC pour l'adapter à la séparation chromatographique ultérieure :au lieu
d'extraire
le
thiochrome
formé
par
l'isobutano1,
nous
avons
purifié.
l'échanti 110n obtenu par passage sur une cartouche Sep Pak C 18
après un
lavage par l'acétate de sodium 0,05 M destiné en particulier à éliminer le
gros excès
de réactif oxydant,
le
thiochrome est élué
par un mélange
méthanol-eau (70 : 30 v/v). Nous avons bien entendu vérifié que ce passage sur
Sep Pak n'entrainait aucune perte en thiochrome.
la méthode d'extraction
ainsi
proposée a fait
l'objet d'une
première analyse
circulaire en collaboration avec six autres laboratoires
(tableau 14), (les conditions chromatographiques utilisées sont indiquées dans
le paragraphe III, page 71).
Tableau 14 : Détermination de la teneur en vitamines Bl et B2
(en mg %) dans la levure (hydrolyse enzymatique par
la B amylase) par chromatographie en phase liquide.
x : valeur moyenne interlaboratoire
s : écart type interlaboratoire
CV % : coefficient de variation
- ...
laboratoi re
l
2
3
4
5
6
7
x
s
CV %
Vitami ne Bl
1,37 1,45 1,60 3,844,54 1,85 2,58
2,46 1,27
52
Vitamine 82
a,96 l, 07 2,90 2, 95 1, 30 2, 85 3, 60 2, 10 1,02
49
les
résultats
obtenus
d'un
laboratoire
à
l'autre
sont
très
variables et
ne nous
ont pas donné satisfaction.
Nous avons alors émis
l'hypothèse que la quantité de phosphatase dans la B amylase devait être
variable selon le lot d'enzyme utilisé et de toute façon insuffisante pour

·~
-
62
-
rompre
l'ensemble
des liaisons
phosphates.
En
effet nous aVon~. notê
la
présence dans le chromatoqraeme- obtenu pour la riboflavine d'un petit pic de
phosphate de riboflavine
(figure
17),
indice d'une action
phosphatasique
incomplète.
Nous
avons donc
rêalisé
une
seconde
analyse
circulaire
en
préconisant l'utilisation de 500 mg de takadiastase (SERVA), à la place des 50
mg de B amylase.
Le takadiastase contient en effet beaucoup plus d'impuretés
que la B amylase.
Les résultats obtenus indiqués dans le tableau 15 ne sont
pas mei 11 eurs.
.
'-D
(2)
(Temps
en minutes)
o
2
4
Figure 17
Chromatogramme montrant le pic de riboflavine (2) et
de phosphate de riboflavine(l) restant après action de
la B amylase sur la levure.
Il semble donc qu'individuellement utilisées,
ces enzymes ont une
action phosphatasique insuffisante pour libérer l'ensemble des vitamines Bl et
B2.
Dans un premier temps nous avons diminué le poids de la prise d'essai (de
5 à 19) et augmenté la quantité de B ama1yse sans pour autant parvenir à une
hydrolyse complète du phosphate de riboflavine.
Dans un deuxième temps,
les
essais ont été plus concluants en'~ombinant l'action de la takadiastase et de
la B amylase.
Avec 500 mg de takadiastase et 50 mg de B amylase,
nous avons
obtenu une
déphosphory1ation
complète
de
la
riboflavine
et
une quantité
maximale de thiamine libre.
Un dépassement de ces quantités n'entraine pas
d'augmentation de la quantité de thiamine retrouvée. On peut donc affirmer que
la thiamine et la riboflavine ont été entièrement libérées par ce traitement
enzymatique combiné.

-
63 -
Tableau 15
Déterminat40n de la teneur en thiamine et en
riboflavine (en mg %) dans la levure (hydrolyse par
la takadiastase) par chromatographie en phase
liquide.
(x valeur moyenne interlaboratoire, s écart type
interlaboratoire, CV %coefficient de variation).
Laboratoi re
l
2
3
4
5
6
7
x
A
s
CV %
Vitami ne Bl
4, 12 4,62
-
3,79 l,52 0,87 4,30
3,20 1,'58
49
Vitamine B2
l,59 2,83
- 2,71 0,96 3,20 2,52 2,30 0,85
37
Une
troisième
analyse
circulaire,
tenant
compte
de
ces
observati ons,
a été organisée.
Nous avons
proposé aux
six laboratoires
partici pant à cette analyse quatre protocoles différents pour l'hydrolyse
enzymatique
1.500 mg de takadiastase plus 50 mg de B amylase
2. 500 mg de takadiastase (dosage de la thiamine) ou 50 mg de
B amylase (dosage de la riboflavine)
3.
20 mg de phosphatase acide
4. aucune enzyme
Le protocole 2 correspond sensiblement aux .conditions préconlsees
par l'AOAC.
Nous avons préféré utiliser la B amylase pour le dosage de la
riboflavine car cette enzyme nous a paru plus efficace que la takadiastase
dans ce cas.
Le protocole 3 a été envisagé car il nous a paru logique, s'il ne
s'agit que de rompre des liaisons phosphates,
d'utiliser l'enzyme prévue pour
cela plutôt que d'avoir recours aux impuretés d'une amylase.
Le protocole 4 a été proposé afin d'apprécier la proportion de
forme libre par rapport à la quantité totale de vitamine.

-
64
-
Les résultats obtenus sont indiqués dans les tableaux 16 A et
16 B.
Tableau ·16A
Détermination de la thiamine (en mg %) contenue
dans la levure par chromatographie en phase liquide
haute performance.
(x,
valeur moyenne inter1aboratoire t s écart type
inter1aboratoire t CV % coefficient de variation).
Laboratoi re
1
2
3
4
5
6
7
1\\
x
s
CV %
Enzyme uti 1isée
sans enzyme
1t31 1t86 1t 79 1t31 1t88 2tOO 2t50 1t 81 ü, 41
23
Phosphatase acide
1t42 2t38 2t38 2t04 2t33 3tOO 2t21
2t24 Ot 44 20
Takadiastase
1t76 1t93 3t38 2t88 3t54 4tOO 2t90 z. 91 o, 77
27
Takadi astase
3t01 3t83 4t42 2t97 3t78 4tOO 3tBO 3t54 Ot 39 11
p1usB amylase.
Tableau 16 B
Détermination de la riboflavine (en mg %) contenue
dans la levure par chromatographie en phase
liquide haute performance.
A
(x valeur moyenne inter1aboratoire
S
t
écart type
inter1aboratoire t CV % coefficient de variation).
Laboratoire
1
2
3
4
5
6
7
-
1\\
x
s
CV %
Enzyme ut il i sée
sans enzyme
Ot8l lt88 2t45 1t07 1t06 Ot70 1t09 1t25 Ot 6O 48
Ph osph ata se aci de 3t33 3t38 2t86 3t92 3t96 3t70 3t76 3t50 Ot 39
11
B amylase
s, 02
- 3t59 4t04 3t98 3t60 3t99 3t70 Ot49 14
Takadiastase
3t80 3t74 4t68 3t92 4t02 3t85 3t97 4tOO o, 32
8
plus B amylase

-
65 -
D'une façon générale., ~ussi bien pour le dosage de la thiamine que
pour celui de la riboflavine,
l'utilisation du mélange B amy1ase-takadiastase
a conduit à des résultats très satisfaisants.
Les coefficients de variation
inter1aboratoires sont tout à fait acceptables.
Si on étudie de plus près le tableau 16 A consacré à la thiamine,
on constate que certai ns 1aboratoi res ont obtenu avec 1a takadi astase seu1e
des résultats analogues à ceux obtenus avec le mélange d'enzymes alors que
pour d'autres 1aboratoi res 1es écarts sont très importants.
Comne l' acti on
enzymatique souhaitée résulte de la présence d'impuretés dans la takadiastase,
ces
écarts
s'expliquent
vraisemblablement
par
le
fait
que
les
enzymes
utilisées appartiennent à des lots de fabrication différents. Plus surprenants
ont été les résultats obtenus avec la 'phosphatase acide: apparemment l'action
de cette enzyme est pratiquement nulle puisque la concentration en thiamine
obtenue dans ce cas (2,24 mg %) est proche de la concentration en thiamine
sous forme libre (1,81 mg %).
Nous avions pourtant vérifié au préalable que
cette enzyme hydrolysait à 100 % les phosphate et diphosphate de thiamine.
Il
est donc vraisemblable que cette vitamine dans les levures, et sans doute dans
d'autres aliments,
nlest pas exclusivement liée à des groupements phosphates
et que la présence d'autres impuretés dans la takadiastase
(ou dans
la B
amylase) est nécessaire pour la libérer entièrement.
En ce qui concerne
la riboflavine,
les résultats obtenus en
utilisant le mélange takadiastase-B amylase sont légèrement supérieurs à ceux
obtenus avec la B amylase ou avec la phosphatase acide,
mais les écarts sont
beaucoup moins importants que pour la thiamine.
La vitamine
B2 est donc
principalement liée à des groupements phosphates,
contrairement à ce que nous
avons observé pour la vitamine B1.
Para11 èl ement
à
11 étude
réal i sée
sur
la
levure,
nous
avons
également étudié trois aliments diététiques (une farine,
des biscuits et un
petit pot pour enfant) à teneurs garanties
en vitamines
Bl
et
B2.
Les
résultats obtenus sont indiqués dans les tableaux 17 et
18.
On constate
i mnêdt atement que quelque soit le protocole choisi,
·1 es résu 1tats obtenus,
aussi
bien pour la vitamine Bl que, pour la vitamine B2,
sont identiques.
L'explication est simple:
ces aliments sont complémentés en vitamines, comme
le
veut
la
législation
française,
de façon à
remplacer
les
vitamines
nature 11 es détruites lors du traitement i ndustri el.
Cette destructi on doit
être très importante et les vitamines que l'on dose ne sont pratiquement que
des vitamines ajoutées, donc sous forme libre. L'hydrolyse enzymatique dans le
cas de ces aliments est donc tout à fait inutile.

-
66 -
Dans le cas des aliments non comp1émentés età teneur faible en
vitamines (cas le plus général),. i'l n'est cependant pas nécessaire d'utiliser
des quantités d'enzymes aussi importantes que pour les aliments très riches en
vitamines B1 et B2 (cas de la levure).
Pour tous les aliments que nous avons
analysés dans la troisième
partie de ce travail,
nous avons obtenu des
résultats identiques quel que soit le système enzymatique choisi (mélange
takadiastase-B amylase (500 mg - 50 mg)),
takadiastase seule (500 mg) ou B
amylase seule (50 mg).
Il nous semble cependant préférable de conseiller aux
utilisateurs de la technique le mélange takadiastase-B amylase,
le seul à
donner des résultats satisfaisants quelle que soit la nature de l'aliment.
Tableau1?
Détermination de la thiamine contenue dans trois
aliments diététiques infantiles: une farine, des
biscuits et un petit pot Jambon-Poulet
(x
valeur moyenne inter1aboratoire, s écart type
interlaboratoire, CV %coefficient de variation).
~
-
l
2
3
4
5
6
7
x
"s
CV %
. . . .
. . . . . . . . . .
Petit pot Jambon~Poulet
sans enzyme
0,54
-
°,51 0, 35 0,45 - - 0,46 0,09 20
Phosphatase acide
0,39
- 0,54 0,40 0,43
-
-
0,44 0,07
16
Takadi astase
0,44
- 0,46 0,38 0,45
-
-
0,43 0,04
9
Takadi astase
0,47
- 0,46 0,41 0, 43
-
-
0,44 0,03
7
plus B amy l ase
Biscuit
sans enzyme
0,69 0,73 0,72 0,56 0,48
- 0,64 0,64 0,10 16
Phosphatase acide
0,65 0,86 0,66 0,56 0,66
- 0,57 0,66 0, 10 15
Takadi astase
0,68 0,79 0,74 0,54 0,67
-
0,75
0,69 0,09
13
Tak adiasta se
0,63 0,72 0,61 0,59 0,64
-
0,66
0,64 0,05
8
plus B amy l ase
Farine
sans enzyme
0,79 0,74 0,80 0,75 0,71
- 0,84 0,79 0,06
8
Phosphatase acide
0,79 0,89 1,02 0,76 0,77
-
0,76
0,83 0, 11
13
Takadiastase
0,85 0,84 0,83 0,70 0,81
-
0,75
0,80 0,06
8
Takadiastase
0,87 0,85 0,84 0,73 0,81
-
0,81
0,84 0,08
10
plus B amyl ase

-
67
-
Tableau 18
Déterminat'on de la riboflavine (vitamine B2)
contenue dans trois aliments diététiques infantiles:
une farine, un biscuit et un petit pot Jambon-Poulet
(x
valeur moyenne inter1aboratoire, s écart type
inter1aboratoire, CV % coefficient de variation).
~
-
..
1
2
3
4
5
6
7
x
s
CV %
Enzyme
....
Petit pot Jambon-Poulet
sans enzyme
0,72
- 0,74 0,70
-
- 0,85 0,75 0,07
9
Phosphatase acide
0,83
- 0,90 0,89
-
- 0,90 0,88 0,04
5
B amylase
0,85
- 0,88 0,86
-
- 0,94 0,88 0,04
5
Takadiastase
0,91
- 0,86 0,89 0,78
- 0,92 0,87 0,05
4
plus B amy 1ase
Biscuit
sans enzyme
0,100,130,140,14
- 0,16 0,14 0,13 0,02 15
Phosphatase acide
0,11 0,16 0,15 0,15
- 0,160,14 0, 14 0,02
14
B amylase
0,13 0,16 0,17 0,17
- 0,20 0,16 0,16 0,02 13
Takadiastase
0,13 0,16 0,17 0,16 0,16 0,18 0,18
0,16 0,02
12
plus B amylase
Farine
sans enzyme
0,17 0,12 0,22 0,22 0,24
- 0,27 0,21 0,05 24
Ph osph ata se acide
0,25 0,10 0,27 0,23 0,24
- 0,30 0,25 0,04
16
B amylase
0,24 0,18 0,25 0,26 0,26
- '0,30 0,25 0,04 16
Takadi astase
0,22 0,21 0
0,25 0,29
- 0,30 0,26 0,04
16
3 2 6
plus B amylase

-
68 -
III. Choix des conditions chromatographiques : système de "
détection; phases stationnaire et mobile.'
Nous
avons bien
entendu
utilisé
un
système de détection
par
f1uorométrie car les coefficients d'extinction moléculaire de la riboflavine
et surtout de la thiamine (tableau Jl) ne sont pas assez élevés pour permettre
de détecter ces molécules
avec une
sensibilité suffisante par absorption
ultraviolette.
Le spectre d'absorption de la riboflavine présente deux maxima, à
445 nm et à 265 nm
(figure 14).
Nous avons choisi comme longueur d'onde
d'excitation
445
nm.
Cela
permet
en
effet
de
diminuer
les
risques
d'interférences puisque beaucoup moins de molécules absorbent à 445 nm qu'à
265 nm. La mesure d'émission de fluorescence a été réalisée à 520 nm, longueur
d'onde maximale d'émission.
La thiamine est transformée par oxydation en thiochrome,
molécule
non ioni que dont
1a structure est donnée dans 1a fi gure 18.
Le spectre
d'absorption ultraviolet de cette molécule présente un maximum d'absorption à
366 nm (voir figure 19).
Figure 18 : Formule développée du thiochrome
Le thiochrome présente une fluorescence bleue caractéristique dont
l'intensité maximale d'émission correspond à une longueur d'onde de 435 nm
(excitation à 370 nm) (voir spectre d'émission de fluorescence figure 20).
Ce
maximum d'émission est indépendant du pH.
Nous avons donc choisi pour la
détection par fluorescence du thiochrome une longueur d'onde d'émission de
435 nm.

-
-
-
--------~
Absorbance
-
69 -
0,03
0,02
0.,01
~ongueur
d'onde
300
400
500
en nm)
Figure 19
Spectre d'absorption dans le domaine visible-
ultraviolet du thiochrome.
Remarque:
Si l'on ne souhaite que doser la riboflavine,
il n'est pas
nécessaire de se préoccuper de séparer le thiochrome et la riboflavine puisque
à 445
nm (longueur
d'onde d'excitation
de la
riboflavine)
le
thiochrome
n'absorbe pas. Par contre lors du dosage de la thiamine, cette séparation doit
être réalisêe car même si la riboflavine n'émet pas de fluorescence à 435 nm
(longueur d'onde d'émission du thiochrome) elle est capable à cette longueur
d'onde de réabsorber une partie de la fluorescence émise par le thiochrome.
Le choix de la phase stationnaire ne nous a pas posé de problème
particulier.
Etant donné la nature chimique des -composés à éluer,
nous avons
choisi
une phase stationnaire
sur
supports
greffés .en
phase inverse
de
granulométrie 10 pm (~ Bondapak C 18).
Ce type de phase stationnaire a été
utilisé par la plupart des auteurs' .ayant choisi
la dérivation précolonne
(SKURRAY,
1981;
FELLMAN et al,
1982;
AUGUSTIN, 1984 ; FINGLAS et FAULKS,
1984),
à l'exception toutefois de ANG et KlSELEY (1980) qui ont préféré une
phase stationnaire adsorbante (silice).

-
70 -
MAX
100
THIOCHROME
Excitation
370 nm
380
440
500
560
(longueur
d'onde
en nm)
Figure.20 : Spectre d'émission de fluorescence du thiochrome
Plus important et plus délicat a été le choix de la phase mobile.
SKURRAY (1981) a utilisé un tampon acétate 0,2 Mcontenant de l'acide heptane
sulfonique 0,005 M.
On peut se poser la question de l'utilité du contre ion,
étant donné que le thiochrome n'est pas ionisé.
Par ailleurs la conèentration
en acétate de sodium nous a paru excessivement élevée.
FELLMAN et al (1982)
ont eu recours à un mélange méthanol 37 % - tampon phosphate 0,01 M (pH 7).
L'élution de la riboflavine est trop rapide et la qualité de la séparation
médiocre.
Par la suite,
AUGUSTIN (1984) a proposé comme phase mobile un
mélange
eau-méthanol
(80
20
v/v)
additionné
de
phosphate
de
tétrabutylammonium 0,005 M,
ce
contre-ion
ayant
seulement
pour fonction
d'éliminer certains produits interférants. En utilisant une phase stationnaire
de granulométrie 5 pm (Ultraspher OD·S),
la séparation est satisfaisante mais
les
temps de rétention sont élevés
(11
minutes
pour le thiochrome
et 18
minutes pour la riboflavine).
FINGLAS et FAULKS (1984) avec une phase mobile
voisine (eau-méthanol 70:
30 v/v) et une phase stationnaire de granulométrie
10 J.lm (J.l Bondapak C 18) éluent le thiochrome et la riboflavine respectivement

-
7 1 -
en 5 et 10 minutes.
Le temps de rétention de la riboflavine nous semble
inutilement élevé. Par ailleurs êes auteurs n'ont testé leur technique que sur
un seul type d'aliment, la pomme de terre, ce qui nous parait insuffisant.
Pour notre part nous avons choi si comme base de 1a phase mobi le
une solution d'acétate de sodium D,OS M (donc beaucoup plus diluée que celle
utilisée par SKURRAY (1981)) dont' le pH a été ajusté à 4,5.
Afin de diminuer
le temps de rétention (trop élevé) du thiochrome et de la riboflavine dans de
telles conditions et plutôt que d'augmenter la concentration en acétate de
sodium,
nous avons ajouté à cette phase mobil e des quantités croi ssantes de
méthanol.
La qualité de la séparation et les temps de rétention nous ont paru
sati sfai sants
pour
une
composition
méthanol-acétate
de
sodium
D,OS
M
(40:
60 v/v).
Les chromatogranvnes obtenus dans ces conditions sont donnés
dans la figure 21.
Nous avons comparé les spectres d'émission de fluorescence
du
thiochrome en solution dans les diverses
phases mobiles proposées et
observé que
le meilleur
rendement quantique
de fluorescence était obtenu
lorsque le thiochrome était en solution dans la phase que nous avons proposée.
Cette phase mobile permet donc d'obtenir une meilleure sensibilité.
'.0
; .1
v.
1]\\
.
'.il
V
( 1 )
( 2 )
"U
(Temps
en
:
---~- . - > - - - -
• 1
o
2
4
6
0
2
t.
6
S
Fi gure 21
Elution d~ thiochrome (1) et de la riboflavine (2) par
chromatographie en phase liquide haute performance
(~ Bondapak C 18 ; méthanol-acétate de sodium D,OS M
pH 4,5 (40 : 60 v/v) avec détection fluorométrique.

72 .,.
Ces conditions
chromatographiques sont celles qui ont
servi
à
l'appréciation de la qualité de l'extraction des vitamines B1 et B2 dans les
.
,
aliments.
Elles ont été utilisées dans les différentes analyses circulaires
(voir paragraphe II).
La limite de détection pour la riboflavine de la méthode ainsi
mise au point est de 0,001 mg %.
Ce)le de la thiamine est de 0,01 mg %. Cette
derni ère
peut être abai ssée,
si
cela est nécessai re,
en effectuant une
dilution moindre de l'échantillon après passage sur la cartouche Sep Pak C 18.
Le taux
de recouvrement
varie suivant
l'aliment de 97 à
102 % pour la
riboflavine et de 97 à 100 % pour la thiamine.
Les quelques exemples de séparation chromatographique donnés dans
la figure 22 (A et B) démontrent la qualité de ces méthodes analytiques, aussi
bien pour le dosage de la thiamine que pour celui de la riboflavine.
Leur description complète est donnée en annexe 2.
Elles seront
publiées prochainement au Journal Officiel de la République Française comne
méthodes officielles pour le dosage des vitamines B1 et B2 dans les aliments
diététiques et de régime.

.
-
73 -
If)
r-,
l"')
.
ln
( J )
(2 )
o
6
o
2
4
6
o
2
4
6
(Temps en minutes)
M
M
(4)
( 5 )
( 6 )
o
2
4
6
o
2
4
5
o
2
4
6
Figure 22 A
Do~age de la thiamine dans divers aliments africains
par la méthode chromatographique mise au point dans
ce chapitre. Quelques exemples: Arachide (1 l,
Haricot (niébé) (2), Souchet comestible (3), Petit
mil (4). Tamarin (5) et Pain de singe (6).
(Teneurs: voir tableau 30)

-
74
-
l
.
l
1,0
( 1 )
. j
.

.
o
2
4
6
o
2
4
6
o
2
4
6
(Temps
en minutes)
!
Ci)
-M
~
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l
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I·D
..,.
o
2
4
6
o
2
4
6
o
2
4
6
Figure 22 B
Dosage de la riboflavine dans divers aliments
africains par
la méthode chromatographique mise
au
point dans ce chapitre. Quelques exemples : Arachide
(1),
Haricot
(ntëbë ) (2),
Souchet comestible (3),
Petit mil (4), Tamarin (5) et Pain de singe (6).
(Teneurs: voir tableau 31)

-
75 -
CHAPITRE 4
LE DOSAGE DE LA VITAMINE 83 DANS LES ALIMENTS
MISE AU POINT D'UNE METHODE PAR CHROMATOGRAPHIE
EN PHASE LIQUI~E HAUTE PERFORMANCE
La détermination de la vitamine 83 dans les aliments implique le
dosage de l 'acide nicotinique et de la nicotinamide,
ces deux composés ayant
une
activité
vitaminique
équivalente.
Il
est
possible
de
les
doser
simultanément par une méthode microbiologique.
TRUGO et al (1985) ont utilisé
un bacille,
le Lactobacillus plantarum qui a besoin de vitamine 83 pour se
multiplier.
L'introduction de l'échantillon à analyser dans le milieu de
culture entraine l'apparition d'un
trouble
proportionnel
à la teneur en
vitamine 83;
ce trouble est mesuré par néphélométrie.
Cette méthode a été
récemment améliorée par EINARSSON et al
(1986) qui ont remplacé le dosage
néphélométrique par la mesure des modifications de la conductance électrique
dues à la croissance bactérienne;
la durée de l'analyse a été ramenée,
dans
le meilleur des cas, à six heures.
Une autre technique, qui permet le dosage de la vitamine 83 totale
(acide nicotinique
et
nicotinamide)
dans les
aliments,
est
la méthode
colorimétrique qui constitue la méthode officielle AOAC (1984).
Son principe
est basé sur la propriété qu'à le bromure de cyanogène de couper le noyau
pyridine commun aux deux composés de la vitamine B3.
Une fois ouvertes,
ces
molécules de pyridine peuvent réagir avec l 'acide sulfanilique pour former des
composés colorés en jaune.
L'absorbance mesurée à 470 nm est directement
proportionnelle à la quantité de vitamine B3 contenue dans l'échantillon.
Cette méthode peut être automati sée.
Ell e a été uti l i sée par ROY et MERTEN
(1983) et par HOLZ (1984) pour déterminer la quantité de vitamine B3 totale,
respectivement dans les oeufs,
le pain et les céréales. La méthode officielle
AOAC,
telle qu'elle est décrite, a été jugée en partie dangereuse par HOON et
al (1986) à cause de la manipulation directe de bromure de cyanogène.
Ces
auteurs ont proposé un apport endogène de chl orure de cyanogène (qui possède
la même action que le bromure de cyanogène) par synthèse in situ à partir de
chloramine T et de cyanure de potassium.
Les résultats ainsi obtenus sont en
bonne corrélation avec ceux de la méthode officielle AOAC,
avec un taux de
recouvrement de 101 % et un coefficient de variation de 2,9 %.
Cependant,
de
par son principe mëme,
cette méthode colorimétrique nest pas spécifique et

-
76
-
est sujette à des interférences car est assimilée à de la vitamine 83 toute
substance possédant un noyau py.ri di ne.
Il en résulte en généra1 des teneurs
trop élevées de vitamine 83 dans les aliments.
La chromatographie en phase liquide haute performance est la seule
méthode qui a permis d'isoler les constituants de la vitamine 83 avant de les
doser;
de ce fait elle a une plus-grande spécificité et permet de connaître
sous quelle forme la
vitamine 83 est présente
dans l'échantillon
(acide
nicotinique.
nicotinamide ou les deux).
Il faut cependant remarquer que les
auteurs qui ont travaillé sur ce sujet se sont généralement contentés d'isoler
l'acide nicotinique.
la nicotinamide (éventuellement présente dans l'aliment)
étant au préalable transformée en acide nicotinique par action du permanganate
de potassium. KRAL (1983) préconise. pour des échantillons complexes, d'isoler
l'acide nicotinique sur une co1onne.échangeuse d'anions faibles
(Nuc1éosil
NH2) avant de le détecter par ampérométrie avec une électrode stationnaire à
goutte de mercure. Cette technique nécessite au préalable un enrichissement de
l'échantillon en acide nicotinique par passage sur échangeur de cations car le
seuil de détection est seulement de 40 ng.TYLER et SHRAGO (1980) et TRUGO et
al (1985) ont isolé et dosé l'acide nicotinique sur une phase stationnaire en
phase inverse et par appariement d'ions,
en utilisant une détection par
absorption ultraviolette

254
nm).
Les
contre-ions utilisés
sont très
voisins
phosphate de tétrabuty1ammonium
(TYLER
et
SHRAGO.
1980)
ou
hydroxytétrabuty1ammonium (TRUGO et al, 1985). TYLER et SHRAGO (1980) ont dosé
la vitamine B3 totale dans les céréales après avoir transformé la nicotinamide
en acide nicotinique par le permanganate de potassium tandis que TRUGO et al
(1985) ont déterminé la teneur en acide nicotinique dans le café instantané
sans se préoccuper de l'éventuelle présence de nicotinamide.
DEVRIES (1980) a montré qu'il était possible de séparer l'acide
nicotinique et la nicotinamide en utilisant la chromatographie par appariement
d'ions; malheureusement cet auteur n'a donné aucun exemple d'applications aux
aliments. En définitive seuls VAN NIEKERK et al (1980) ont proposé une méthode
chromatographique permettant de séparer et de doser l'acide nicotinique et la
nicotinamide dans les aliments.
Ils ont pour cela mis en série deux colonnes
chromatographiques : l'une contenant ~n échangeur d'anions faibles. l'autre un
support greffé en phase inverse.
Le principal inconvénient de cette méthode
est la durée excessive de la séparation chromatographique (de l'ordre de 40
mi nutes ).
La séparation chromatographique de l'acide nicotinique et de la
nicotinamide
contenus
dans
les
aliments
n'est
donc
pas
une
opération
chromatographique simple à réaliser.
En dépit de cela.
la chromatographie en

-
77 -
phase liquide haute performanc~ semble être,
parmi
toutes les techniques
utilisées,
celle qui possède la meilleure spécificité.
C'est la raison pour
laquelle nous avons choisi de l 'étudier.
1. MISE AU POINT D'UNE METHODE D'EXTRACTION DE LA VITAMINE B3
(ACIDE NICOTINIQUE ET NICOTINAMIDE) DANS LES ALIMENTS.
L'obtention d'acide
nicotinique et de nicotinamide
sous forme
libre exige d'une part l'extraction de ces deux composés de l'aliment, d'autre
part la destructi on des structures chimi ques dans lesquelles est incl use la
nicotinamide,
à
savoir la
nicotinamide
adénine dinucléotide (NAD) et
la
nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP).
Dans la méthode AOAC
(1984),
il
est préconisé une hydrolyse
alcaline (utilisation d'hydroxyde de calcium).
Ce procédé a été utilisé par
TYLER et SHRAGO (1980).
Ces auteurs ont cependant rencontré de gros problèmes
d'interférences lors de l'isolement chromatographique. Ils ont da, après avoir
transformé la nicotinamide en acide nicotinique, purifier l'extrait obtenu par
passage sur une colonne échangeuse d'anions. Ces deux dernières opérations ont
donc pour conséquences de ne permettre qu'un dosage global de la vitamine B3
et d'augmenter la complexité et la durée de l'analyse.
ROY et MERTEN (1983) ont proposé de remplacer l 'hydrolyse alcaline
de la méthode AOAC par un traitement par le mélange acide chlorhydrique-urée,
ce traitement ayant pour but à la fois
de libérer
les
vitamines
et de
transformer la nicotinamide en acide nicotinique.
Nous avons testé cette
méthode
d'extraction
sur deux
aliments:
l'arachide et
le
mais.
Les
chromatogrammes
obtenus sont
indiqués dans la figure 23.
Le pic
de la
nicotinamide est facile à mettre en évidence,
bien que dans les conditions
chromatographiques
utilisées
l'isolement
de cette
molécule
ne
soit
pas
sat isfai sant.
On constate par ai 11 eurs l'absence d'un pic correspondant à
l'acide nicotinique.
Cela semble donc indiquer que la transformation de la
nicotinamide,
forme sous laquelle la vitamine B3 se -trouvent dans ces deux
aliments (voir page~~), en acide nicotinique ne s'est pas produite. Devant les
résultats négatifs obtenus nous avons abandonné ce réactif.

-
78
-
'J.'
r'-
(··l
----+ Acide nicotinique
a)
b)
(lI
c'
( .
-~
- )
l--
---L
----JL.-
----'--
_
o
250
500
750
o
250
500
750
( Te mp s e n
sec 0 n.d es)
Figure 23
Dosage de la vitamine B3 extraite par le système
urée-acide chlorhydrique à partir de llarachide (a) et
du mais (b). par chromatographie en phase liquide dans
les conditions suivantes:
phase stationnaire : ~ Bondapak C 18
phase mobile: méthanol-(acétate de Na 0,05 M pH 4,5 +
bromure de cétyltriméthylammonium
-3
)
0,5. la
M (50 : 50 v/v).
détection UV à 260 nm.

-
79
-
La méthode d'extraction~extrêmement simple,
utilisée par TRUGO et
al (1985) (une simple dilution suivie d'une purification sur Sep Pak C 18), a
l'inconvénient de n'être utilisable que pour l'aliment étudié par ces auteurs,
le café soluble.
Elle suppose en effet que la vitamine 83 est exclusivement
sous forme d'acide nicotinique
- Mus avons en effet montré qu'une grande
quantité
de
nicotinamide
est
retenue
sur
la
cartouche-et
que
l'acide
nicotinique est sous forme libre,
ce qui semble être le cas à la suite des
traitements
technologiques
subis
par
cet
aliment.
Une
telle
méthode ne
présente cependant aucun intérêt dans le cas général.
La méthode d'extraction préconisée par VAN NIEKERK
(1980) pour
l'analyse de la vitamine 83 dans les céréales nous a paru beaucoup plus
intéressante.
Elle consiste en une hydrolyse de l'échantillon
par l'acide
sulfurique 0, l M à l'autoclave pendant une heure à 120°,
afin de rompre les
liaisons vitamines-protéines, suivie d'une hydrolyse enzymatique utilisant une
suspension de clarase à 45° C pendant 3 heures, dont le rôle est de libérer la
nicotinamide du NAD et du NADP.
Ces auteurs ont étudié neuf aliments et
comparé cette
technique
d'extraction
à
celle
utilisant
l'hydroxyde
de
calcium.
Les résultats obtenus prouvent que l'extraction par hydrolyses acide
et enzymatique
est plus
satisfaisante
que l 'hydrolyse
alcaline
lorsqu'on
util i se comme méthode de dosage 1a chromatographie en phase li qui de haute
performance. Les interférences sont beaucoup moins nombreuses.
La méthode d'extraction de VAN NIEKERK (1980) ressemble en fait
beaucoup à
la
méthode
d'extraction
que
nous
avons
préconisée
pour
la
-riboflavine et la thiamine.
Il
nous a donc paru intéressant de voir dans
quelle mesure cette
dernière méthode pouvait
également
s'appliquer
à
la
vitamine 83.
La différence entre les deux méthodes se situe au niveau de
l'hydrolyse acide.
Nous avons utilisé une hydrolyse chlorhydrique au bain
d'eau
à
100° C, VAN
NIEKERK
et
al
utilisant
une hydrolyse
sulfurique à
l'autoclave.
Nous avons bien entendu vérifié que les deux hydrolyses acides
donnaient des résultats analogues.
Cela en fait n'est pas tout à fait vrai.
Nous
avons
en
effet
constaté
que
le
traitement
acide
à
l'autoclave
transformait une partie de la nicotinamide en acide nicotinique (voir figure
24),
alors que cela ne se produit pas pendant un traitement au bain d'eau à
100° C.
C'est évidemment un inconvénient de la méthode de VAN NIEKERK et al,
mineur dans la mesure où les deux formes de la vitamine 83 ont
la même
activité vitaminique.
Nous avons bien
entendu vérifié,
et cela est plus
important,
que les deux traitements proposés,
donnaient en définitive des
résultats identiques en ce qui concerne la teneur globale en vitamine 83 dans
les aliments.

- 80
( 1 )
( 2 )
( 2 )
( J )
•.-i
-i
':f-
t·"1
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1 1
i
1
j
Î
o
250
500
o
250
500
(Temps en secondes)
Figure.24
Chromatogrammes d'une solution étalon de nicotinamide
(2) après traitement par l'acide sulfurique 0, l M (a)
et l'acide chlorhydrique 0,1 N (b) à l'autoclave.
(1) Acide nicotinique
(conditions chromatographiques : voir figure 23)
l'hydrolyse
acide
seule
ne peut
pas libérer
la
nicotinamide
contenue dans les NAD et
NADP.
Il
est nécessaire d'avoir recours
à une
hydrolyse enzymatique.
VAN NIEKERK et al (1980) ont utilisé la clarase.
Pour
notre part nous avons eu recours soit à la takadiastase,
soit à la fi amylase.
l'importance de cette hydrolyse enzymatique est clairement mise en évidence
dans la figure 25 :
nous avons
dosé la nicotinami,de dans l'arachide avec
(chromatogramme
a)
et
sans
(chromatogramme
b) hydrolyse
enzymatique.
On
constate
immédiatement
que
dans
cet
aliment
la
nicotinamide
est
essentiellement sous forme de NAD et de NADP.
le remplacement de la takadiastase par la B amylase ne change en
aucune façon l es résultats obtenus.
Une seule différence:
en présence de B
amyl ase,
les extraits obtenus après hydrolyse peuvent
tre facil ement fi ltrés
ê
sur papier plissé alors qu'en présence de takadiastase il est nécessaire de
centrifuger.

-
8 J -
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..1.-
,
_
o
250
500
250
500
750
Figure 25
Dosage de la nicotinamide extraite de l'arachide par
hydrolyse acide (a) (HCl 0,1 N au bain d'eau
à
100° C pendant 30 minutes) et par hydrolyse acide
suivie d'~ hydrolyse enzymatique (b) (par la
takadiastase à 37° C pendant une nuit).
les conditions chromatographiques sont les suivantes
phase stationnaire: lichrospher R P 18(5 ~m).
phase mobile: méthanol-(acétate de Na 0,05 M pH 4,5 +
acide heptane sulfonique 0,5. 10- 3 M)
(la : 90 v/v).
En vue d'harmoniser la méthode d'extraction que nous proposons
pour la vitamine 83 avec celle préconisée pour les vitamines 81 et 82,
nous
avons réalisé l'hydrolyse enzymatique à 37° C pendant une nuit.
Les résultats
obtenus dans ces candi t ions
sont
absolument analogues à ceux obtenus
par
hydrolyse à 4SoC pendant 3 heures (conditions utilisées par VAN NIEKERK et al
(1980)).
En définitive nous avons montré, et c'~st le point essentiel de ce
paragraphe, qu'il est possible d'utiliser une même technique d'extraction pour
le dosage des vitamines 81,
82 et 83.
On obtient aussi bien pour l'acide
nicotinique que pour le nicotinamide un taux de recouvrement qui varie de 98 à
100 % en fonction des aliments.

-
82 -
II. CHOIX DES CONDITIONS CHROMATOGRAPHIQUES
SYSTEME DE
DETECTION, ~~ STATIONNAIRE ET MOBILE .
.
L'acide nicotinique et.la nicotinamide sont des composés qui ne
fl uorescent pas.
Par ai 11 eurs il s ne donnent pas de déri vés fl uorescents à
partir de réactions chimiques connues et,
de ce fait, un système de détection
par fluorescence n'est pas utilisable.
Le détecteur électrochimique utilisé
par KRAL
(1983) pour doser l'acide nicotinique présente deux inconvénients
majeurs:
son seuil de détection est relativement élevé (40 ng) et il ne
permet pas de détecter la nicotinamide.
Nous avons alors choisi pour la suite
de
notre
travail
d'utiliser
un
système
de
détection
par
absorption
ultraviolette.
La longueur d'onde maximale d'absorption est de 262 nm aussi
bien pour l'acide nicotinique que pour la nicotinamide ; elle reste'invariable
quel que soit le pH de la solution.
La sensibilité d'un tel détecteur n'est
pas excellente car les
coefficients d'extinction
moléculaire de ces
deux
composés sont relativement faiples (voir tableau 12).
La limite de détection,
aussi bien pour l'acide nicotinique que pour la nicotinamide,
est de l'ordre
de 0,2 mg %.
Mais ceci ne constitue pas vraiment un inconvénient car dans les
aliments où elle existe,
la vitamine B3 s'y trouve en général en quantités
importantes.
Si on se réfère aux chromatogramnes donnés dans le chapitre 2
(2ème partie) lors de l'étude sur la séparation multiple des vitamines,
on
constate que dans les conditions chromatographiques utilisées, la nicotinamide
et l'acide nicotinique sont généralement élués plus rapidement que les autres
vitami nes.
Il est évi dent que s i l ' on a aff ai re,
non plus à des vitami nes
étalons,
mais à des vitamines extraites des aliments,
une telle rapidité
d'élution est à proscrire car on risque à coup sûr de les éluer au milieu d'un
grand nombre d'impuretés.
Il est donc nécessaire,
et cela n'est pas gênant
puisque nous n'avons plus comne objectif de séparer simultanément un grand
nombre de vitami nes,
de modifi er les conditi ons chromatographi ques - phase
stationnaire et surtout phase mobile - afin de retarder notablement l'élution
de la nicotinamide et de l'acide nicotinique.
Nous
avons
tout
d'abord
choisi
comne' phase
stationnaire
un
échangeur de cation (Lichrosorb CX-W 10 ~m,
1: 30 cm, ~ 4 mm) et comne phase
mobile un tampon phosphate monopotassique O,OS M pH 4,S.
La séparation est
bonne (figure 26) mais les temps de rétention,
respectivement de 2,SO et 4,7S
minutes pour l'acide nicotinique et la nicotinamide,sont relativement faibles.
Si on applique ces conditions chromatographiques à l'analyse de la vitamine B3

-
83 -
contenue dans un extrait de céréale,
on se trouve en présence de plusieurs
pics
interférant
avec
ceux
des
vitamines,
rendant
ainsi
tout
dosage
impossible.
Ceci a été observé quelque soit l'aliment étudié.
Un exemple de
chromatograrrme obtenu à part ir du mi 1 est représenté dans la figure 27.
Nous
avons donc
abandonné
cette
phase
stationnaire
car
il
ne semblait
guère
possible,
en modifiant la phase mobile,
d'augmenter notablement les temps de
rétention.
( 1)
(2)
...,..
C(,
0:--4
(,-, co
-:-!
0))
~,
~

---.._~--
250
(Temps
en
secondes)
o
250
Figure 26
Chromatogrammes obtenus à partir d'une solution
d'acide nicotinique (1) et de nicotinamide (2).-
Phase stationnaire: LichrosQrb CX-W (lO~m)
Phase mobile: phosphate monopotassique O,05M (pH 4,5)
Nous
avons
alors
remp l acê
la
phase
échangeuse
de
cations
précédente par une phase stati onnai re sur support greffé en phase inverse.
L'utilisation d'une telle colonne lors de l'étude de la séparation multiple
des vitamines (chapitre 2,
2ème partie) entrai ne une élution trop rapide de
l'acide nicotinique et de la nicotinamide (respectivement 2,0 et 2,70 minutes
lorsque la phase mobile est un mélange eau-méthanol (75:
25 v/v) et de ce
fait ne peut être recommandée lorsqu'on travaille avec des échantillons réels.

-
84
-
[1 nous a semblé nécessaire de retarder la sortie de l'acide nicotinique ou de
la nicotinamide.
pour les isoler des impuretés, en utilisant une phase mobile
contenant un contre-ion.
La plupart des auteurs qui ont travaillé avec cette
phase stationnaire ont d'ailleurs eu recours à ce procédé (DEVRIES et al,
1980;
TYLER et SHRAGO,
1980; TRUGO et al, 1985). Malheureusement. il n'est
pas possible de retarder l'élution de ces deux composés avec le même contre-
ion.
En effet un contre-i on chargé négati vement retarde 1a sortie de 1a
nicotinamide alors qu'un contre-ion chargé positivement va retarder l'é1ution
de l'acide nicotinique.
L'utilisation
du
bromure
de
céty1triméthy1ammonium
sera
donc
particulièrement recommandée lorsqu'on cherche à isoler l'acide nicotinique.
Nous avons utilisé comne phase mobile le mélange méthanol-acétate de podium
0.05 Mà pH 4,5 contenant le bromure de cétyltriméthylalTlTlonium 0,5 • 10-3M. La
séparation et les temps de rétention dépendent de la proportion' en méthanol
dans la phase mobile (voir tableau 19).
( 2 )
IJ:I
..
, (Temps
en
secondes)
' - = = - - - - - - - 6 - - - - - " - - - - - - - -
o
250
500
Figure 27
Chromatogramme obtenu à partir d'un extrait de céréale
(mi 1)
Conditions chromatographiques
voir figure 26.

\\
-
85
-
\\
Tableau·19
Temps de rétention de l'acide nicotinique et de la
nicotinamide en fonction de la proportion de méthanol
dans la phase mobile.
* SCTA = bromure de cétyltriméthylammonium.
Méthanol-(acétate de sodium 0,05 M (pH 4,5)
+ SCTA* 0,5. 10-3 M) (v/v)
10:90
20:80
30:70 .40: 60
50:50
60:40
70:30
Temps de rétention
(minutes)
30
23,3
18,5
14,8
8,8
5,0
4,0
acide
.nicotinique . . . .
Temps de rétention
(minutes)
5,0
5,0
4,7
4,5
4,5
3,75
2,5
nicotinamide
Nous avons représenté à titre d'exemple dans la figure 28,
les
chromatogrammes obtenus avec 30 % et 50 % de méthanol.
A notre avis la phase
mobile avec
50 % de méthanol. est la
plus
satisfaisante.
En effet si
la
proportion en méthanol est inférieure à 50 %,
le pic obtenu pour l'acide
nicotinique est asymétrique.
Si
la
proportion en méthanol
dépasse
50 %,
l'élution devient alors trop rapide.
Nous avons indiqué dans la figure 29, les
chromatogrammes obtenus à partir de divers aliments africains avec une telle
phase mobile. L'isolement de l'acide nicotinique est tout à fait satisfaisant.
Par contre,
comne nous le prévoyions,
la nicotinamide,
qui est éluée assez
rapidement,
ne peut être séparée des impuretés.
Ces conclusions sont en fait
valables pour tous les aliments que nous avons étudiés. La chromatographie par
appariement d'ions utilisant comme contre-ion un cation ne peut donc être
utilisée que pour le dosage de l'acide nicotinique.

-
86 -
( J )
J
(
1 )
1
1
1
i
( 2 )
1
1
a)
b )
1
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\\
J
.
1
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.\\L_
i
Î\\
o
250
500
750
1000
0
250
500
750
(Temps
en secondes)
Figure 28
Séparation de solution étalon contenant de l'acide
nicotinique (2) et de la nicotinamide (1) sur une
colonne IJ Bondapak C 18 avec comme phase mobile :
a) (Acétate de sodium 0,05 MpH 4,5 + bromùre de
céty1triméthylammonium 0,5.10- 3) - méthanol
(60: 40 v/v)
b) Même élu an t (50 : 50 v/ v)
Si
l'on veut retarder
l'é1ution de
la nicotinamide,
il
faut
remplacer le contre-ion précédent par un contre-ion chargé négativement.
Nous
avons choisi
l'acide heptanesu1fonique.
Dans un premier temps,
nous avons
utilisé comme phase mobile l'acétate de sodium 0,05 M (pH 4,5) et avons obtenu
une bonne séparation des deux formes de la vitamine B3 à partir de solutions
é t al 0 ns (fig ure 30).

-
87
-
Souchet
j
Goyave ..
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o
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0
250
500
750
(Temps
en secondes)
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fi
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Landolphia
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---I
_
o
250
500
750
o
'75:)
500
750
(Temps
en
secondes}
Figure 29 : Analyse de la vitamine B3 dans 'divers aliments
africains
dans
les
conditions
chromatographiques
suivantes
phase stationnaire : ~ Bondapak C 18
phase mobile: méthanol (acétate de sodium 0,05 M
pH 4,5
+ bromure de cétyltriméthylammonium
3M)
0,5.1O-
(50: 50 v/v))
(Teneurs
voir tableaux 32 et 36)

-
88 -
;.
..,
J
.G')
Î~~
Il j
(Temps
en secondes)
o
250
500
Figure 30
Séparation de l'acide nicotinique (l) et de la
nicotinamide (2) dans les conditions
chromatographiques suivantes :
phase stationnaire : ~ Bondapak C 18
phase mobile : acétate de sodium 0,05 M (pH 4,5) +
acide heptanesulfonique O,5.10- 3M.
Si
à
la
place
de solutions
étalons,
on
utilise
un
extrait
d'aliment (par exemple arachide),
les résultats ne sont pas satisfaisants.
COlT111e prévu l'acide nicotinique ne peut ëtre détect~;
la nicotinamide est
bien mise en évidence mais au milieu d'un
très grand nombre d'impuretés
(figure 31).

i
to
-
89 -
1
1
1
l
'"
,1
1:
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
,
1
1 \\
(Temps
en
seconde
250
500
750
Fi gure 31
Dosage de la nicotinamide extraite de l'arachide.
Conditions chromatographiques : voir figure 30.
Il
est
donc
nécessaire
d'améliorer
la
résolution de la
phase
stationnaire en diminuant sa granulométrie.
Nous avons donc remplacé la phase
~ Bondapak C 18 (la ~m) par u~e phase Lichrospher RP 18 (5 ~m). Avec une telle
phase stationnaire, pour éviter d'avoir des temps de rétention trop élevés, il
est absolument nécessaire d'incorporer dans la phase mobile du méthanol (ou de
l'acétonitrile).
En utilisant un mélange la:
90 ·(v/v) méthanol-(acétate de
sodium D,OS M pH 4,5 + acide heptanesulfonique O,5.10- 3M),
nous avons séparé
correctement l'acide nicotinique et la nicotinamide (figure 32).
La durée de
l'analyse est d'environ la minutes et
les pics obtenus présentent une très
bonne
symétrie.
Nous
avons
appliqué
ces
nouvelles
conditions

- 90 -
chromatographiques
à
la
détermination
de la
vitamine
B3 dans
l'arachide
..
(figure 33).
L'acide nicot tntqqe ,
qui est élué rapidement,
ne peut être
détecté;
par contre le pic' de la nicotinamide n'est pas affecté par les
interférences
et permet un
dosage correct de ce conoosé.
Des rësu l tats
analogues ont été obtenus pour tous les aliments étudiés.
D'autres exemples
sont donnés dans la figure 33.
( 1 )
\\~~---- (~emps en secondes)
o
500
750
Figure 32
Séparation.de l'acide nicotinique (1) et de la
nicotinamide.
Phase stationnaire
Lichrospher RP 18 (5 ~m)
Phase mobile: méthano1-(acétate de sodium 0,05 M
(pH 4,5)
+ acide heptanesu1fonique)(10 : 90 v/v)

-
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(a)
(b)
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250
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750
0
250
500
750
(Temps
en secondes)
1
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o
250
500
750
o
250
500
750
(Temps
en
secondes)
(a) Manioc
(b) Haricot
( c) Sorgho blanc
(d ) Petit mil
(e ) Arachide

- - - - - - - - - - -
-
-
-
-
92 -
(e)
!
.1
l
i
.J
,,:"0'
1
(Temps en secondes)
o
250
500
750
1000
Figure 33
Séparation chromatographique de la nicotinamide
extraite de divers aliments africains.
(Conditions chromatographiques : voir figure 32).
En définitive,
par chromatographie par appariement d'ions,
nous
avons toujours obtenu une bonne séparati on de 11 acide ni coti nique et de la
nicotinamide.
Cependant il est très difficile de doser simultanément les deux
formes de la vitamine 83 contenues dans nos échantillons,
vu la complexité de
ces
derniers.
Il
est
nécessaire
d'utiliser
des
conditions
opératoires
légèrement différentes
pour doser
l'acide nicotinique (en utilisant comme
contre -ion un cation) et la nicotinamide (en utilisant conrne contre-ion un
an i on) .
Ces deux méthodes ainsi mises au point sont décrites en détail
dans l'annexe 2.

-
93 -
CHAPITRE 5
LE DOSAGE DE LA VITAMINE 86 DANS LES ALIMENTS
MISE AU POINT D1UNE METHODE PAR CHROMATOGRAPHIE
EN PHASE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE
Le dosage de la vitamine 86 dans les aliments par des méthodes
chimiques est une entreprise difficile et,
si l'on exclut les publications
récentes consacrées à la chromatographie en phase li quide haute performance,
bien peu
de travaux y ont
été consacrés,
ce .qui
explique généralement
l'absence de la vitamine 86 dans les tables de composition des aliments.
Citons
une
méthode
photométrique
(MARZO,
1981
analyse
des
huiles
diététiques),
une
méthode
fluorométrique
qui
consiste
tout
~'abord à
transformer le pyridoxol et la pyridoxamine en pyridoxal puis à oxyder celui-
ci en acide pyridoxique fluorescent (GREGORY et KIRK,
1977;
FIEDLEROVA et
DAVIDEK,
1978) et une méthode par chromatographie en phase gazeuse (PATZER et
HILKER,
1977) impliquant une transformation préalable des trois formes de la
vitamine
86
en
hémi acétal
qui
réagit
ensuite
avec
le
N-
méthylbisfluoroacétamide pour donner un dérivé volatil.
Ces méthodes sont peu
sensibles et peu spécifiques (cas de la méthode photométrique) ou extrêmement
complexes (cas de la méthode fluorométrique et de la chromatographie en phase
gazeuse), et ne peuvent étre recommandées.
A l'heure
actuelle,
seules deux méthodes
sont
habituellement
utilisées
la méthode microbiologique et la chromatographie en phase liquide
haute performance.
La méthode microbiologique est la méthode officielle de llAOAC
(1984).
Elle utilise une levure, Saccharomyces uvarum, qui a la particularité
de ne se développer qu 1 en présence de vitami ne 86.
Le trouble du mi lieu de
culture,
proportionnel
à
la
quantité
de
vitamine
86
contenue
dans
l'échantillon
est
mesuré
par
turbidimétrie.
GUILARTE
(1973)
a
proposé
d'améliorer la sensibilité de la méthode en introduisant dans le milieu de
culture du carbone radioactif (14C) ~t un lyophilisat de Klaechera brevis,
la
quantité
de
vitami ne
86
contenu
dans
11 échanti 11 on
étant
di rectement
proportionnelle à la quantité de gaz carbonique radioactif dégagé dans le
milieu de culture.
La méthode microbiologique,
qui dose globalement la
vitamine 86,
et non chacune de ses formes,
est fort complexe à réaliser.
De
plus sa spécificité a été mise en doute (GREGORY, 1980).

-
94
-
Il n'est donc pas étonnant que depui s une di zai ne d'années
la
chromatographie en phase l i quf de haute performance se soit considérablement
développée. Les problèmes analytiques se sont cependant révélés plus complexes
à
résoudre
que
pour
les
vitamines
81
et
82 puisqu'il
était
absolument
nécessaire de séparer les trois formes de la vitamine 86 avant de les doser,
celles-ci n'ayant ni le même coeffic~ent d'extinction moléculaire,
ni le même
rendement quantique de fluorescence
(voir chapitre l,
2ème partie).
Les
premiers travaux ont été réalisés par YASUMOTO et al
(1975) et WONG (1978).
Ces auteurs ont utilisé une colonne échangeuse de cations et un détecteur par
absorption ultraviolette. Ce mode de détection s'est révélé très peu sensible,
et par la suite,
tous les auteurs qui ont travaillé sur ce sujet ont utilisé
un détecteur par fluorescence.
Ils ont eu recours soit à une chromatographie
sur support greffé en phase inverse (GREGORY et KIRK,
1977;
GREGORY, 1980 ;
LIM et al,
1980;
80GNAR,
1985), soit à une chromatographie par appariement
d'ions (MORRISON et DRISKELL,
1985).
Certains auteurs ont souhaité pouvoir
séparer,
non seulement
les
trois
formes
libres,
mais aussi
les formes
phosphates.
Cela est possible à condition que l'hydrolyse acide que subit
l'échantillon dans un premier temps soit relativement douce (afin de ne pas
hydrolyser
les
liaisons
phosphates).
Il
faut
alors remplacer
l'hydrolyse
chlorhydrique ou sulfurique généralement utilisée par une hydrolyse à l'acide
sulfosalicylique (VANDERSLICE et al, 1980). Les meilleures séparations ont été
obtenues par chromatographie sur échangeurs d'anions (VANDERSLICE et al, 1979,
1980,
1984)
et
par
chromatographie
par
appariement
d'ions
(GREGORY
et
FELDSTEIN,
1985).
Cette séparation multiple,
très complexe du point de vue
analytique, trouve son application essentielle dans les études de métabolisme.
Dans le cadre de notre travai l,
elle ne présente pas d' intérêt.
Nous nous
sommes limités pour notre part,
au problème de la séparation et du dosage des
trois formes libres par chromatographie en phase liquide haute performance. Ou
fait de la faible
teneur des
aliments en vitamine 86,
de la sensibilité
moyenne de la détection par fluorescence et de la présence dans l'échantillon
de nombreuses substances
interférentes,
ce
problème n'est
pas
simple
à
résoudre lorsqu'on étudie des aliments très
variés et non complémentés en
vitamines.
I. MISE AU POINT D'UNE METHODE D'EXTRACTION DE LA VITAMINE 86 DANS
LES ALIMENTS
Comme nous l'avons vu dans le premier chapitre,
la vitamine 86
présente dans les aliments naturels est essentiellement liée aux protéines.

-
95 -
Elle peut
également exister
sous forme de phosphates de pyridoxal et de
pyridoxamine.
~
Pour extraire
la totalité de la
vitamine 86 contenue dans les
aliments,
80GNAR (1985) a décrit une hydrolyse acide qui permet à la fois de
rompre
les
liaisons
avec
les
protéines
et
de
libérer
les
groupements
phosphates.
L'échantillon est ~xtrait par
l'acide sulfurique 0.1
M par
autoc1avage à 1200 C pendant 30 minutes. Nous avons utilisé cette méthode pour
extraire
la
vitamine
86 contenue
dans un
aliment
diététique pour petit
déjeuner (à base de céréales).
Nous avons pu apprécier l'efficacité de la
méthode en analysant l'extrait obtenu par chromatographie en phase liquide
haute
performance
par
appariement
d'ions
(le
choix
des
conditions
chromatographiques
sera
justifié
dans
le
paragraphe
suivant).
Le
chromatogramme obtenu est représenté dans la figure 34.
( 1)
( 2 )
(3)
l
~ro-
r-
I~)
(l)-Pyridoxamine
'T
:::::,~
':1
r"-
,-.;--.
oJ
Cr)
'T
.::":. i"-,
(2)-Pyridoxal
~
1=1
(3)-Pyridoxol
(Temps en
o
250
500
750
secondes)
Figure 34
Analyse de la vitamine 86 contenue dans un aliment
diététique pour petit déjeuner (hydrolyse par l'acide
sulfurique 0,1 Mà 120 0 C à l'autoclave pendant 30
minutes).
Phase stationnaire: Lichrospher R P 18 (5 ~m)
Phase mobile
mélange (4,5 : 95,5(v/v)) acétonitrile-
phosphate de potassium 0,05 Mà pH 2,5
contenant de l'acide heptanesulfonique
-3
0,5.10
M.
Nous avons vérifié qu'effectivement ce traitement acide permettait
d'obtenir une rupture complète des liaisons phosphates dans les phosphates de
pyridoxal et de pyridoxamine. Cette hydrolyse. relativement énergique. risque

-
96 -
cependant de produire dans le milieu
réactionnel de nombreuses substances
interférantes lorsqu'on a affaire à des aliments relativement complexes. C'est
ce que nous avons observé Iors' de l'analyse de graines d'arachides (figure
35). Dans ce cas l'interprétation du chromatogramme est impossible.
(l)-Pyridoxamine
(2)
(3)
(2)Pyridoxal
l
(3)-Pyridoxol
I~I
(r)
o
250
500
750
1000
(Temps
en secondes)
Figure 35 : Analyse de la vitamine 86 contenue dans un extrait
d'arachide (hydrolyse sulfurique 0,1 M, 1200 C à
l'autoclave pendant 30 minutes). Conditions
chromatographiques voir figure 34.
Une purification par passage sur Sep Pak C 18,
en dehors du fait
qu'elle complique la méthode,
n'est pas envisageable car le pyridoxal et le
pyridoxol sont en partie retenus sur cette cartouche (30% du pyridoxal et plus
de 50 % du pyridoxol).
La pyridoxamine,
par contre,
ne semble pas être
retenue, du moins à des concentrations inférieures à 100 mg/le (Réf. figure 36).
Nous avons essayé de remplacer l'acide sulfurique 0, l M par de
l'acide chlorhydrique 0,1 N. Ce dernier a une activité phosphatasique nulle si
on travaille au bain d'eau à 100 0 C pendant 30 minutes.
Celle-ci devient plus
importante à
l'autoclave à
120 0
pendant 30 minutes,
mais
reste de loin
inférieure à celle de l'acide sulfurique (environ 67 % des formes phosphates
sont hydrolysées).

-
97 - -
.,
' ..l
pl
1
" (1
1
i
!Cl)
Cl)
1
,
1
(l)-Pyridoxamine
"
1!
l2)-Pyridoxal
! i
; 1
(T',
(3)-Pyridoxol
1'1
1
r- _
Il
.
r.,
• 1
, 1
a)
b)
1 1
~
( )
i l A(2) (3)
f
1
ri
1 l
'
(3)
J
,
o
4
8
12
o
4
12
(Temps
en minutes
Figure 36
Chromatogrammes représentant la séparation des trois
formes de la vitamine 86 sans (a) et avec (b) passage
sur une cartouche Sep Pak C 18. Conditions
chromatographiques voir figure 34.
L'hydrolyse
enzymatique
est
un
autre moyen
pour
libérer
les
diverses formes de la vitamine 66 de leurs groupements phosphates. MORRISON et
DRISKELL (1985) préconisent l'action de la phosphatase acide pour extraire la
vitamine 66 contenue dans le lait.
Nous avons étudié l'action de cette enzyme
sur
une solution
étalon
de
phosphate
de pyridoxal
et
avons obtenu
une
hydrolyse complète.
Cependant il est difficile de prouver que cette hydrolyse
permet de rompre les liaisons de la vitamine 86 avec -les protéines.
Un dosage
de la teneur en vitamine 66 contenue dans un aliment diététique pour petit
déjeuner a donné à peu pr ê s le même résultat en utilisant conme méthode
d'extraction l'hydrolyse à l'acide sulfurique 0,1 M à l'autoclave à 1200 C
pendant 30 minutes (0,48 mg % de pyridoxol) ou l'hydrolyse enzymatique à la
phosphatase acide à 37 0 C pendant une nuit (0,53 mg % de pyridoxol).
Les deux
chromatogrammes obtenus
sont
représentés
dans les
figures
34
et
37.
Ce
résultat presque identique s'explique sans doute par la faible proportion de

-
98 -
vitamines liées aux protéines.
Il semble cependant préférable.
dans le cas
général, avant de procéder à l't}ydrolyse enzymatique de réaliser unehydro lyse
à l'acide chlorhydrique dans' un bain d'eau,
afin de s'assurer de la rupture
des liaisons vitamines - protéines.
(l)Pyridoxamine
(2)Pyridoxal
(3)Pyridoxol
,
.l--_ _----:---'-
~ l _
_
(Temps
en secondes
o
250
500
750
Figure 37
Analyse de la vitamine B6 contenue dans un aliment
diététique pour petit déjeuner (la vitamine B6 est
extraite par hydrolyse enzymatique à la phosphatase
acide à 37° C pendant une nuit à l'étuve).
Conditions chromatographiques : voir figure 34.
( 3 )
(l)-Pyridoxamine
(2)-Pyridoxal
;
(3)-Pyridoxol
r.J')
\\
o
250
500
750
1000
(Temps
en
secondes)
Figure 38
Analyse de la vitamine B6 contenue dans un extrait
d'arachide. La vitamine B6 est extraite par hydrolyse
enzymatyque à la phosphatase acide à 37° C pendant une
nuit à l'étuve.
Conditions chromatographiques
voir figure 34.

-
99 -
Nous
avons
utilisé
l'hydrolyse
enzymatique
pour extraire
la
vitamine 86 des graines d'arachi~e.~ Le chromatogramme obtenu (figure 38), qui
est plus satisfaisant que celui obtenu après hydrolyse sulfurique (figure 351,
est interprétable et montre la présence des trois formes de vitamine 86 dans
l' arachi de.
Nous avons ensuite comp) été cette étude en essayant de voir s' i l
était possible de substituer â l'action de la phosphatase acide (relativement
chère) celle d'autres enzymes comme le B amylase ou la takadiastase.
Nous
avons choisi cOl1111e substrat l'arachide qui contient les trois formes de la
vitamine 86. Nous donnons dans le tableau 20 les quantités de pyridoxamine, de
pyridoxal et de pyridoxol obtenues après hydrolyse par les différents systèmes
enzymati ques.
Tableau 20
Teneurs en vitamine 86 de l'arachide après extraction
par les différents systèmes enzymatiques.
Vitamine
Pyri doxami ne
Pyri doxal
Pyridoxol
Enzyme
Phosphatase acide
0,05
0,67
0,09
(20 mg)
B amylase (50 mg)
0,05
0,33
-
Takadiastase
0,05
0,44
-
(50 mg)
Takadi astase
0,05
0,51
0,06
(500 mg) plus
B amylase (50 mg)
Les chromatogrammes correspondants sont représentés dans la figure
39.
Les quantités de vitamine 86 obtenues sont plus importantes
avec le
phosphatase acide.
Par ailleurs,
il apparaît,
avec le takadiastase et la B
amylase des impuretés qui
gênent
considérablement
lors
de la séparation
chromatographique.

100 -
( 1 )
(2)
(3)
( a )
a
250
500
750
,)000
(Temps en secondes.
(b)
\\
['-
co
[- Ji
"T
1
l
a
250
500
750
1000
1250
(Temps
en secondes)

-
101
-
Finalement,
nous avons recomnandé pour extraire la totalité de la
vitamine 86 de faire une hydroly~e à l'acide chlorhydrique 0,1 N au bain marie
à 100° C pendant 30 mtnut es
(opération facultative) suivie d'une hydrolyse
enzymatique à la phosphatase acide à l'étuve à 37 0 C pendant une nuit.
Cette
extraction est complétée par une précipitation des protéines par action de
l'acide trichloroacétique à 50 % pendant 5 minute~ au bain d'eau à
1000 C.
.
(c)
( ) )
(".~
(2)
(3)
r-:
-M (0
q(ü
': -,j C".~
~
L - . L - -_ _
-&.I_ _~
.~_~__ (T e mp sen sec 0 Do de
o
250
500
750
1000
Figure 39
Analyse de la vitamine 86 contenue dans un extrait
d'arachide. La vitamine 86 est extraite par hydrolyse
enzymatiquè à 37° C pendant. une nuit avec
a) takadiastase (500 mg)
b) B amylase (50 mg)
c) takadiastase + B amylase (500 mg : 50 mg)
Conditions chromatographiques : voir figure 34.

-
102 -
II. CHOIX DES CONDITIONS CHROMATOGRAPHIQUES : SYSTEME DE
DETECTION, PHASE. Sli\\TIONNAIRE, PHASE MOBILE.
Les
trois
composés
chimiques
constituant
la
vitamine
B6
(pyridoxamine, pyridoxal, pyridoxol) sont fluorescents (voir spectre pageSI ).
C'est donc
fort
logiquement
que ~e
système de détection utilisé est un
détecteur
par fluorescence
(beaucoup
plus
sensible
qu'un
détecteur
par
absorption
ultraviolette).
Il
faut
cependant
noter
que
les
rendements
quantiques de fluorescence de ces trois composés sont différents les uns des
autres et relativement faibles si on les compare,
par exemple,
à celui de la
riboflavine (voir page4}).De ce fait les limites de détection que l'on obtient
à l'aide de ce détecteur
ne sont
pas
excellentes
(0,01
mg
% pour
la
pyridoxamine,
0,02 mg % pour la pyridoxal et 0,04 mg
% pour le pyridoxol
alors qu'elle est de l'ordre de 0,001
mg % pour la riboflavine).
C'est
néanmoins à l 'heure actuelle le système de détection le plus satisfaisant.
Les longueurs d'onde maximales d'absorption et d'émission de la
pyridoxamine, du pyridoxal et du pyridoxol ne varient pratiquement pas avec le
pH et sont très proches les unes des autres : respectivement 293 nm, 288 nm et
290 nm pour l'absorption;
390 nm,
380 nm et 395 nm pour l'émission.
Il est
donc
possible
de conserver
les
mémes
longueurs
d'onde
d'excitation
et
d'émission
lors
de la
détection
de
ces
trois
composés,
sans
perdre
véritablement en sensibilité.
Pour notre part nous avons choisi 290 nm comme
longueur d'onde d'excitation et 395 nm comme longueur d'onde d'émission.
Le
choix de cette dernière longueur d'onde tient au fait que le pyridoxol est le
composé qui a le plus faible rendement quantique de fluorescence.
Nous
avons
tout
d'abord
utilisé
la
chromatographie en phase
liquide sur échangeurs de cations pour séparer les trois formes de la vitamine
B6 contenues dans les aliments en les é1uant avec un tampon phosphate de
potassium 0,05 M (pH 2,5).
En effet tous les auteurs qui ont travaillé avec
cette phase stationnaire,
ont utilisé ce tampon comme phase mobile (WILLIAMS
et al,
1973;
YASUMOTO et al,
1975;
WaNG,
1978).
La séparation de la
pyridoxamine,
du pyridoxa1 et du pyridoxol est satisfaisante et la durée de
l'analyse ne dépasse pas 10 minutes .(figure 40).
Pour apprécier l t ef f tcac i tê
d'une telle phase stationnaire,
nous avons analysé un extrait obtenu à partir
de graines de haricots.
Le chromatogramme (figure 41) révèle de nombreuses
interférences dues aux impuretés
que contiennent
la plupart des produits
naturels et qui sont é1uées en mème temps que les vitamines.

-
103 -
(2)
'"
...r-,.11-'
( J )
",1
("'1
.
v
( 3 )
v
'\\1.
co
..11
(Temps
e~ illinutes)
o
4
8
12
Figure 40
Séparation du pyridoxal (1) du pyridoxol (2) et de la
pyridoxamine
(3)sur
une
colonne
Lichrospher
CX-W
(la ~m, 250 x 4 mm) avec comme phase mobile le
tampon phosphate de potassium 0,05 M (pH 4,5).
Un
tel
système
chromatographique
présente
une
résolution
insuffisante
pour
permettre
d'isoler
correctement
les constituants
de la
vitamine B6 des impuretés.
Par ailleurs,
la phase mobile ne peut pas être
considérablement modifiée afin d'éviter les interférences.
Finalement,
nous
.
n'avons
pas
retenus
la
chromatographie
sur
échangeurs
de
cations
qui,
d'ailleurs n'a plus été utilisée depuis 1978.
Nous
avons
ensuite
utilisé une phase stationnaire sur support
greffé en phase inverse pour séparer
la pyridoxamine,
le pyridoxal
et le
pyridoxol.
Comme phase stationnaire nous avons utilisé une colonne p Bondapak
C 18 (la pm de granulométrie, 250 mm de long, 4 mm de diamètre) et conrne phase

-
J 04
-
mobile un tampon phosphate monopotassique 0,05 M à pH 2,5.
Cette dernière
phase a déjà été préconisée par. GREGORY et KIRK (1978) et par GREGORY (1980)
pour doser les formes libres de la vitamine 86 dans les céréales supp1émentees
pour pet it déjeuner airrsi
que par LIM et al
(1980)
pour l'analyse de cette
vitamine dans le lait.
Nous avons obtenu,
avec des solutions étalons,
une
bonne séparation de la pyridoxamine,
du pyridoxal et du pyridoxol dont les
temps de rétention sont res pect i vement de 5,16 mi n,
7,35 mi n et de 9,35 mi n
(figure 42).
Ces temps de rétention sont très voisins de ceux obtenus par LIM
et al
(4 min pour le pyridoxamine,
7 min pour le pyridoxal et 9 min pour le
pyri doxo l )
cependant
l es
di fférents
pi cs
obtenus
sont
larges
et
asymétriques.
Nous
avons
alors,
comne
GREGORY et
al
(1981),
ajouté de
l' acétonitri le à la phase mobi le précédente pour améliorer
la symétrie des
pics
tout
en
conservant
une
bonne
séparation.
Les
différents
temps
de
rétention obtenus en fonction de la concentration en acétonitrile
dans la
phase mobile sont indiqués dans le tableau 21.
Des chromatograomes obtenus
avec
des
phases mobi l es
à
teneurs
vari abl es
en
acétonitrile
à
partir
de
solutions étalons, sont représentés dans la figure 43 •
. ( 1 )
\\L(2)
1
Ir)
,:;:,
1. ln
r.,
( 3 )
r-,
1[)
(Te,ups
en
mi n u t a
4
8
12
16
Fi gure 41
Analyse de la vitamine 86 contenue dans le haricot
(niébé).
Conditions chromatographiques
voir figure 40

-
105 -
Tableau 21
Temps de rétention obtenus avec différentes
concentr~tions d'acétonitrile dans la phase mobile.
Temps de rétention (en minutes)
% de phosphate
.
% d'acétonitrile
monopotassique
0,05 M pH 2,5
Pyri doxami ne
Pyridoxal
Pyri doxol
"
10
90
2,90
3,74
3,94
5
95
3, 14
4,84
5,56
2
98
3,25
5,93
7,23
1
99
3,21
6,50
8,23
0
100
5,16
7,35
9,35
Les mei11 eures
séparat i ons ont été obtenues
avec
1e phosphate
monopotassique 0,05 MpH 2,5 contenant
% d'acétonitri1e.
( J )
(Temps
en
secondes)
o
250
500
750
Figure 42 : Séparation de la pyridoxamine (1). du pyridoxa1 (2) et
du pyridoxo1 (3) sur une phase stationnaire ~ Bondapak
C 18 (phase mobile: tampon phosphate
monopotassique 0.05 Mà pH 2.5).

- 106 -
"1"
t:l)
'"
"
( 2 )
H
7
'1
.):( 3 )
( 2 )
Il
( 1 )
'( 3)
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"1"
Il
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'Jl
ln
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-~
"
.1
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.
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1
1
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1
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,
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I
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~Temps en minutes)
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( 1 )
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1
1
~
1
,
,
1
\\
1
a
L-. _ _ _ _ _.
~
8
a
4
3
Figure 43
Chromatogrammes obtenus avec un mélange étalon de
pyridoxamine (1), pyridoxal (2) et pyridoxol (3) après
séparation sur une colonne ~ Bondapak C 18 avec comme
phase mobile
le tampon phosphate monopotassique
U,05
M à
pH 2,5 contenant de l'acétonitrile à 10 %
( a ). 5 % (b ), 2 '7, (c ) et l 't' (d l .

-
107 -
Nous avons testé cet éluant pour le dosage de la vitamine 86 dans
l'arachide et
les
haricots
(ntêbë l.
Les deux chromatogrammes
représentés
figure 44 montrent que.
du fait de la présence de très nombreuses impuretés.
une estimation de la teneur en vitamine 86 est tout à fait impossible.
( J)
( 2 )
( 3 )
( 2 )
~ U1
( 3 )
I~ (T~
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.
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M
l
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a.
t\\I.
1()
~
"-
a~
lS)
N
-,
4
8
12
o
4
8
12
(Temps
en minutes)
Figure 44
Chromatogrammes obtenus à partir d'un extrait de
haricot (a) et d'arachide (b)
(Conditions chromatographiques
voir figure 43 d).
pyridoxamine (1)
pyridoxal (2)
pyri doxo l (3)
BOGNAR (1985) a préconisé comme phase mobile une solution d'acide
sulfurique 0,08 N pour séparer les trois constituants de la vitamine B6,
mais
cette
so lut i on
très
aci de
(pH 'r. 1)
altère
l es
phases
greffées
qui
ne
supportent que des éluants dont le pH est compris entre 2 et 8,
et n'est donc
pas à conseiller.
1lest diffici le avec un tel système chromatographique de séparer
les vitamines et les impuretés.
Tous les auteurs qui ont utilisé cette phase
stationnaire ont
travaillé sur des aliments supplémentés qui contiennent en

· -
1
1
f
-. 10 ~ - B6
. • .
genera
une seu e
orme dl' v i t am ine
. en quent r t
lmportante. Ces conditions
è
chromatographiques
deviennent
inutilisables
lorsqu'on
travaille
sur
des
aliments non supplémentés contenant les trois formes.
,;,
Il f dut J 101', avo i r
recour-s à la chromatographie par appariement
d'ions qui permet de faire varier les temps de rétention dans une trés large
mesure.
Nous avons
utilisé comme
contre-ion
l'acide heptanesulfonique.
L'efficacité du contre-ion étant fonction du pH de la phase mobile, nous avons
essayé de séparer la pyridoxamine,
le pyridoxal et le pyridoxol en les éluant
avec
le mélange (tampon phosphate monopotassique 0,05
M +
acide heptane
sulfonique 0,001 M)- méthanol (95:
5 v/v), le pH du tampon étant ajusté soit
à 2,5,
soit à 4,5.
Les deux chromatogrammes obtenus sont satisfaisants du
point de vue de la séparation des trois formes de la vitamine B6 (figures 45
et 46).
Cependant avec le mélange à pH 4,5,
les pics obtenus sont élargis et
la ligne de base n'est pas stable.
Avec le mélange à pH 2,5, les pics obtenus
sont plus fins et symétriques.
Nous avons alors ut t l tsë le mélange à pH 2,5
qui a donné des pics symétriques pour séparer les différentes formes de la
vitamine B6 à partir d'une farine infantile supplémentée. Il persiste toujours
des problèmes d'interférences (figure 47).
( 3)
(Temps
en
.n i n u t e s )
o
4
8
12
16
Figure 45
Séparation ~e la pyridoxamine (1), du pyridoxal (2) et
du pyridoxol (3) par chromatographie d'appariement
d'ions utilisant comme phase mobile le mélange (5 : 95
(v/v)) méthanol - (phosphate monopotassique 0,05 M
3
pH 4,5 + acide heptanesulfonique 10-
M).
Phase stationnaire : ~ Bondapak C 18 (~m).

109 -
(3)
"
.,'')
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-t'.
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1.
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1

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J!
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Il

1
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:Il '
-----...Jj 1
(Temps
en minutes)
o
a
12
Figure 46
Séparation de la pyridoxamine .Cl), du pyridoxa1 (2) et
du pyridoxo1 (3).
Phase stationnaire : ~ Bondapak C 18
Phase mobile: (5 : 95 (v/v»
méthanol - (phosphate
monopotasique 0,05 M pH 2,5 + acide
heptanesu1fonique 10- 3 M).
MORRISON et
DRISKELL (1985)
qui
ont uti1 isé le même contre-ion
~
dans
une phase mobile à gradient de méthanol ont également obtenu des pics
interférants lors du dosage de la vitamine B6 dans le lait.
Nous
avons
pensé
qu1en
remplaçant
le
méthanol
par
une
concentration
appropriée d1acétonitrile
(l
X),
nous
pourrions
résoudre
le
problème des
interférences.
La séparation ainsi
obtenue est bonne et même
meilleure que celle obtenue avec 5 % de méthanol (fi qure 48);
cependant son
utilisation
lors
de
la
sëpar at ton
d vun
extrait
de
levure
n'est
pas
satisfaisante (figure 49).

-
1 JO -
,,-,
r.,
( 3 )
( 1 )( 2),
1
.l \\I~'Jl
(1",
1
r-,
V
t.(1
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Q
• r'_ t-:
If)

t(l
.
1
J-r1
: ,1..1 1l
1

1
(Temps en minutes)
o
Figure 47
Analyse de la vitamine 86 contenue dans une farine
infantile complémentée. (Conditions
chromatographiques : voir figure 46) •
.......
(\\J
.
t._
.....
( 1 )
( 2 )
("'1
( 3 )
.
N
1
~
I{)
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1
a.
1
~
\\
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CI
\\
~
L
(Temps
en minutes
o
4
12
16
1
Figure 48
Séparation de la pyridoxamine (1), du pyridoxal (2) et
du pyridoxol (3) avec comme phase mobile: (phosphate
monopotassique 0,05 M pH 2,5 + acide heptane
sulfonique 10-3 M) - acétonitrile (99 : lv/v).
Phase stationnaire : ~ Bondapak C 18 (la ~m)

) )
-
(Temps en
. 1
5,00
750
secondes)
Figure 49
Analyse de la vitamine 86 contenue dans un extrait de
levure.
(Conditions chromatographiques
voir figure 48).
Si
on travaille sans
acétonitrile,
les pics sont défonnés et
l 1 analyse considérablement prolongée (figure 50).
\\0,05
( 1 )
( 2 )
(Temps en minutes
' ....
, - -_ _~
- - i_ _~
- .,
L

____Jl___ _
o
8
16
24
Figure 50
Séparation de la pyridoxamine (1), du pyridoxal (2)
et du pyridoxo1 (3).
Phase stationnaire : ~ Bondapak C 18 (10 ~m).
Phase mobile: tampon phosphate monopotassique 0,05 M
3
pH 2,5 + acide heptanesu1fonique 10-
M

-
1 12 -
Au contraire l'augmentation de la concentration en acétonitrile a
pour conséquence la diminution du" temps d~analyset
mais la séparation devient
moins satisfaisante. Si on utilise dans la phase mobile 2 % d'acétonitrile (au
lieu de l %)t
la séparation du pyridoxal
et de la pyridoxamine devient
mauvaise
(figure
51).
La
meilleure
séparation
par chromatographie
par
appariement d'ions a été obtenue avec" le mélange (1 : 99 (v/v)) acétonitrile -
phosphate monopotassique Ot05 MpH 2t5 contenant de l'acide heptane sulfonique
10-3 M.
Cependant la
sélectivité est insuffisante lors du dosage de la
vitamine 86 dans les aliments.
ro
~.
r··-
(1)
(3)
cr,
(2)
~
T-I
•.t)
~
If)
.
00
(Temps
en minutes)
,0
'8
Figure 51
Séparation de la pyridoxamine (1), du pyridoxal (2) et
du pyridoxol (3).
Phase stationnaire : ~ Bondapak C 18 (la ~m)
Phase mobile: acétonitrile - (p~osphate
monopotassique Ot05 M (pH 2,5) +
acide heptanesulfonique 10-3 M)
(2 : 98 vIv ) .

-
113-
Nous avons analysé deux autres aliments (haricots et arachides).
Les
séparations
obtenues
présentent
les
mémes
inconvénients
que
lors
de
l'analyse chromatographique de l'extrait de levure.
Ces
interférences
persistant
quelle
que soit
la
phase
mobile
utilisée,
il
est alors
nécessaire de choisir des phases stationnaires de
faible granulométrie qui sont plus efficaces.
Nous avons travaillé avec deux
colonnes de 5 J.lm de granulométrie (au lieu de 10 J.lm conme précédemment),
de
4 nm de diamètre mais qui diffèrent par leurs longueurs (12,5 cm la colonne
Novapak C 18 et 25 cm la colonne Lichrospher RP 18).
En travaillant avec la
colonne Novapak C 18,
nous avons dans un premier temps essayé d'éluer le
pyridoxal,
le pyridoxol et la pyridoxamine en absence d'acétonitrile dans la
phase mobile (figure 52). La durée de l'analyse est supérieure à 24 minutes .
.
r~
( 1)
.
v
(".J
~~'----....--.--_--J1j
1
1
8
1
J 6
24
(Temps
en
minutes)
Fi gure 52 : Séparat i on de la pyri doxami ne (1), du pyri doxa l (2) et
du pyridoxol
(3) sur une colonne Novapak C 18.
La phase mobile est le tampon
3
phosphate 0,05 M (pH 2,5) + acide heptane sulfonique 10-
M.
Nous avons ut il isé ce système pour l'analyse de la vitami ne B6
contenue dans un extrait de haricots (figure 53).

-
1 14 -
( 1 )
ÜJ
1.(1
1':::1
.
r-,.
r-, ((1
( 2 )
-r
V.
r-,
.
If")
If)
If)
.
• -4
.-1
4
8
12
16
20
20
(Temps
en minute
Fi gure 53 : Analyse de la vitamine 86 dans un extrait de haricots.
phase stationnaire : Novapak C 18 (5 ~m)
:
phase mobile: phosphate monopotassique D,OS M
(pH 2,5) + acide heptane sulfonique 10-3 M.
Les interférences
sont moins importantes car la résolution est
meilleure avec cette phase stationnaire.
Le chromatogramme montre que dans le
haricot nous nlavons que du pyridoxal. Cependant il est souhaitable de réduire
la durée de l'analyse qui est à la limite de l'acceptable (24 minutes).
Pour
cela nous avons ajouté 1% d'acétonitrile à la phase mobile précédente.
Le
chromatogramme obtenu (figure 54) à partir des solutions étalons montre une
bonne séparati on des troi s connosês avec une durée dl analyse i nféri eure à 15
minutes.
Avec ce méme système chromatographique nous avons réalisé à partir
d'un extrait d'arachide une analyse tout à fait satisfaisante (figure 55).
La faible granulométrie (5 ~m) des colonnes a permis de résoudre
le problème des interférences.
Cependant une phase stationnaire qui a les
caractéristiques du Novapak C 18 (S ~m, l = 125 mm, ~ 4 mm) a une durée de vie
relativement courte.

363
1
-
1 15
-
( 1 )
( 2 )
( 3 )
l'-
0)
en
1'-
.•J:•
..,-l.
(Temps
en secondes
400
~oo
Figure 54 :
Séparation de la pyridoxamine Cl),
du pyridoxa1 (2),
et du pyridoxo1 (3) sur une phase stationnaire Novapak C 18.
La phase mobile
est
le mélange
(1
99 (v/v))
acétonitri1e -
(phosphate monopotassique
0,005 MpH 2,5 + acide heptane su1fonique 10-3 M).
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(Temps
en
1
1

o
4
8
12
16
minutes)
Figure 55
Analyse de la vitamine 86 dans un extrait d'arachide
(Conditions chromatographiques : voir figure 54).

-i
-
1 16 -
La colonne Lichrospher RP 18 (5 pm,
l = 25U mm,
rJ 4 fI11l' a une
durée de vie plus grande et permet d'obtenir des résultats comparables à ceux
obtenus avec la colonne Novapak C 18, à condition d'augmenter la proportion en
acétonitrile et de diminuer celle en contre-ion.
Ainsi nous avons obtenu une
séparation ~ trois composés sur cette colonne en utilisant comme phase mobile
le mélange acétonitrile (3 et 4 %tl-phosphate monopotassique D,OS M pH 2,5 +
3
acide heptane sulfonique 0,5.10-
M (figure 56).
( 1)
( 1 )
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'T
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1
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1
~ \\\\
1
1
0"
200
600
800
J~OO
Figure 56
Sêpar at tonue la pyrf dox em i.re (l), du pyridoxal (2) et
du pyridoxol (3) sur une colonne Lichrospher
RP 18 (5 ~m, l = 250 mm, ~ 4mm). Les phases mobiles
utilisées
sont
le mélange (phosphate monopotassique
3
0,05 M pH 2,5 + acide heptane sulfonique 0,5 10-
M)
avec 3 % d'acétonitrile (al ou 4 % d'acétonitri1e (b).

-
1 17 -
Nous avons ainsi dosé dans ces conditions la teneur en vitamine B6
dans un certain nombre d'aliments (figure 57).
La séparation est bonne et la
résolution permet un dosag~ d~~ différentes formes de la vitamine B6.
(2)
1".î.1
':1:'
b )
'7
(1)
(2)
a)
( 3 )
( 1 )
1
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l
io
i)j
((1
co
uo.
~
,
1
l
L
1
o,--------''=-::----..L::--::-----"'-::---
o
250
500 '
750
250
500
750
(Temps
en
secondes)
c)
( 1 )
(2)
C··J
'r'I
(,-,
~
-.;-1
C'i
1
o
250
500
750
o
2~0
500
750
(Temps
en
secondes)
Figure 57
Dosage des trois constituants de la vitamine B6
pyridoxamine (l), pyridoxal (2), pyridoxol (3)
contenus dans l'arachide (a), le manioc (b l , le
souchet (c ) et le haricot (d ),
(Conditions chromatographiques
voir figure 56b).
(Teneurs
:
voir
tableau
33)

-
118 -
En définitive,
la pyridoxamine,
le pyridoxal et le pyridoxol ne
sont bien séparés que sur une phase stationnaire greffée en phase inverse de
faible granulométrie (S ~m).
La phase mobile est un mélange acétonitrile -
phosphate monopotassique O,OS M (pH'2,S)avec comme contre-ion l'acide heptane
sulfonique. La quantité d'acétonitrile peut varier de l à 4 % en fonction de
la longueur de la colonne.
L'analyse de la vitamine 86 dans les aliments se déroule donc en
deux étapes: tout d'abord l lextraction des trois formes de la vitamine 86 par
une hydrolyse
enzymatique'utilisant
la
phosphatase
acide,
éventuellement
prêcêdée par une hydrolyse
chlorhydrique au bain deau à 100° C,
puis la
séparation et
le dosage par chromatographie d'appariement d'ions
à
l'aide
d'une phase stationnaire greffée en phase inverse de faible granulométrie
(S ~m),
d'une phase mobile constituée d'un mélange acétonitrile - phosphate
monopotas si que
0, OS
(pH
2, S)
contenant
de
11 aci de
heptane
sul foni que
3
O,OSxlO.-
M et d'une détection par fluorescence.
Le taux de recouvrement
de cette méthode varie de 94 à 97 %
suivant la nature des aliments.
Sa description est donnée dans l 1 annexe 2.

3ème PARTIE
COMPOSITION VITAMINIQUE DES ALIMENTS AFRICAINS
COUVERTURE DES BESOINS VITAMINIQUES

-
1 19 -
INTRODUCTION
Les vitami nes ,
qui sont i nd'ÏS pensab l es au foncti onnenement normal du
métabolisme humain, doivent être fournies à l'organisme par l'alimentation. En
ce qui concerne les vitamines hydrosolubles (l'objet de notre travail) cet
apport doit être régulier puisque l'organisme humain ne peut les stocker.
Un
déficit prolongé dans le r~gime alimentaire entraîne des maladies de carence
dont nous avons rappelé les principaux signes cliniques au début de chacune
des deux premières parties de ce travail.
Dans les pays développés,
dont les habitants bénéficient d'un régime
alimentaire varié et surabondant,
ces maladies de carence ont disparu.
Des
états marginaux de carence peuvent être observés chez des personnes ayant
suivi un régime alimentaire aberrant ou se trouvant dans un état physiologique
particulier
(vieillards,
femmes
enceintes
ou allaitantes,
etc ... ).
La
consommati on
importante
de
vitamines
sous
forme
de
médicaments
faite
actue 11 ement
par l es habitants de ces
pays n'a cependant lep l us souvent
aucune justification médicale.
Elle est plus le résultat d'une mode venue des
USA.
La situation n'est évidemment pas du tout la même dans les pays du Tiers
Monde
dans
lesquels
une
grande
partie
des
habitants
souffrent
de façon
chronique de malnutrition.
De nombreuses maladies de carence subsistent dans
ces
pays.
Des études nutritionnelles réalisées dans les années 1970 par
l'ORANA (Office de Recherches sur l'Alimentation et la Nutrition Africaine) au
Sénégal ,
pays qui pourtant ne fi gure pas parmi ce qu1 on appelle pudiquement
les
PMA
(pays les
moins
avancés),
montrent
par
exemple que le
taux de
couverture en vitamines Bl et B2 des Sénégal ai s est tout à fait i nsuffi sant
(des cas de béri béri
ont même été observés).
Bien entendu ces études
ne
peuvent être que très approximatives.
Elles supposent tout d'abord que les
besoins journaliers de l'organisme en vitamines soient bien définis,
ce qui
n'est pas toujours le cas.
Elles exigent ensuite que soit connue avec une
bonne approximation la composition vitaminique des aliments.
Dans ce domaine
il y a beaucoup de lacunes en ce qui concerne les aliments africains;
aucune
étude par exemple de la teneur en vitamine B6 des aliments n'a jamais été
effectuée.
Enfin elles nécessitent de connaître les effets de la cuisson sur
la composition vitaminique des aliments,
la connaissance de la teneur en
vitamines d'un aliment cru n'ayant pas d'intérêt si
celui-ci ne peut être
consommé que cuit.
En réalisant ce travail,
nous n'avions comme ambition que de

~
120 -
fournir au nutritionniste des dQnnées lui permettant de réaliser avec plus de
rigueur des enquétes nutritionnelles absolument indispensables dans les pays
du Tiers Monde. Et puis il nous a paru intéressant de mettre éventuellement en
évidence, parmi les aliments étudiés,
ceux dont la consommation pourrait étre
encouragée en vue de lutter contre les carences vitaminiques.

-
121
-
ÇHAPITRE 1
PRESENTATION OES ALIMENTS ETUOIES
Pour des raisons de transport -
il Y a 5 000 km entre Dakar et
Strasbourg
-
il
ne nous
a pas
été
possible d'analyser tous
les aliments
consomnés usuellement
ou occasionnellement
par les Sénégalais.
Nous
nous
somnes limités à ceux qui constituent la base de l'alimentation, à l'exc1usion
de la viande et du poisson.
Nous avons cependant porté une attention toute
particulière aux fruits car ce sont pratiquement les seuls aliments consommés
crus,
et de ce fait ils peuvent constituer une source importante de vitamines
dans
l'alimentation
africaine.
Dans
les
aliments
cuits,
les
pertes
vitaminiques sont
très importantes car,
si
pour des
raisons sanitaires
la
cuisson prolongée des aliments est une habitude culinaire pleinement justifiée
en Afrique,
elle nlest guère favorable au maintien de la qualité vitaminique
des aliments.
Au total nous avons étudié 29 fruits,
5 céréales, 4 tubercules, 2
légumineuses et 1 légume.
La liste de ces aliments est donné dans le tableau
22.
pour chacun d'eux, nous avons indiqué à côté de son nom français, son nom
latin,
son nom anglais ainsi que sa dénomination en Wolof (langue la plus
utilisée au Sénégal).
Au Sénégal,
les variations de la pluviométrie,
l'adaptation aux
sols et les choix humains entrainent une différenciation régionale dans
la
répartition des céréales cultivées (voir figure 58 b). Les terres sablonneuses
et sab10-argi1euses qui s'étendent sur la grande partie du pays et recouvrent
notamment l'espace compris entre le delta du fleuve Sénégal et la frontière de
la Gambie, sont par excellence le domaine des petits mils. La variété de petit
mil appelée souna a un
cycle végétatif plus court que celui de la variété
sanio.
De ce fait,
depuis 1976,
elle constitue la presque totalité des
récoltes en petit mil.
Ce petit mil constitue la culture vivrière du bassin
arachidier.
A côté des énormes exploitations d'arachide (culture de rente), il
existe de petites parcelles de petit mil (culture vivrière).
Au nord du pays,
la brièveté de la saison des pluies rend
les
cultures sous pluies très aléatoires.
La vallée du fleuve Sénégal est pour
l'essentiel le domaine du sorgho et du fonio.
En effet, à la fin de la saison
des pluies (à partir de
novembre), les eaux du fleuve se retirent et libèrent
des terres argileuses gorgées d'eau où sera cultivé le sorgho. Il s'agit d'une
culture de décrue.

-
122 -
Tab1eau·22
Liste des aliments étudiés
Nom frança i s .
Nom·1 at in
Nom anglais
Nom Wolof
FRUITS
Cerise du Sénégal
A1phania senega1ensis
Soapberry
Khewer
Cerise verte
Phy11 antus aci dus
Cerise
Citron vert
Citrus aurentifo1ia
Lime
Limon
Corossol
Annona muricata
Soursop
Corossol
Dankh
Detarium microcarpum
Sweet dattock
Dankh
Datte du désert
Balanites aegyptiaca
Desert date
Soumpe
Détar
Detarium senega1ensis . Senega1 dattock
Ditakh
Goyave
Ps idium goyava
Guava
Gouyab
Grenade
Puni ca granatum
Pomegranate
Grenade
Jujube
Zizyphus mauritania
Jujube
Sidème
Landolphia
Landolphia heude10tii
Gumwine guinea
To1e
Mandarine
Citrus reticu1ata
Mandarin
Mandari ne
Mangue
Manguifera indica
Mango
Mango
Orange douce
Citrus sinensis
Orange
Orange
Pain de singe
Adansonia digitata
Monkey bread
Boule
Palmier doum
Hyphaenia thebaïca
Egyptian doum pa1m
Doum
Pamplemousse
Citrus aurentium
Grapefruit
Pamplemousse
Papaye
Carica papaya
Papaya
Papayo
Parinaire
Parinari exce1sa
Parinarium
Namptan
Poire du Sénégal
Cordy1a pinnata
Bushmango
Dimb
Pomme cajou
Anacardium occidentale Cashew
Darkassé
Pomme du cayor
Parinari macrophyl1a
Gingerbread p1um
Néou
Prune noire
Vitex doniana
B1ackp1um
Lung
Ronier
Boressus f1abe11ifer
Pa1myra pa1m
Koni
Saba
Saba senega1ensis
Gumwine
Made
Taba
Cola cordifo1ia
Taba
Taba
Tamarin
Tamarindus indica
Tamarind
Dakhar
Tamarin blanc
Dia1ium guineensis
Ve1vet tamarind
Solome
Termina1ia
Termina1ia catappa
Indi an fruit
Guerté toubab

-
J 23
-
. . . . . . .
CEREALES
Fonio
Digitaria exi le
Fonio
Fonio
Maïs
Zea rnays
Maize
Mbokh
Mil
Pennisetum gambiense
Millet
Souna
Riz
Oryza sativa
Rice
Tièpe
Sorqho .
Sorghum vulgare
.Sorghum
Bassi
TUBERCULES·
Diabéré
Alocassa macorrhiza
Diabéré
Mani oc
Manihot esculenta
Cassava
Ni ambi
Patate douce
Hypomea batatas
Sweet potato
Patasse
·Souchet ·comestible· Cyperus esculentus
N'dir
LEGUMINEUSES
Arachi de
Arachis hypogea
Peanut
Guerté
Haricot
Vigna.sinensis.
Cowpea·
Niébé
... LEGUME .
Chou pommé
Brassica olearacea
Cabbage
Chou
Au sud, la région de Ziguinchor est le domaine traditionnel du riz
bien qu'on en produise aussi
aujourd'hui dans le delta du Sénégal (Richard
Tol l l .
L'importance du riz dans la région de Ziguinchor (Casamance) croit
d'est en ouest,
en mème temps qu'y diminue la place du mil.
La riziculture
repose sur des techniques très anciennes dedessalement des sols,
de repiquage
et d'aménagement de casiers.
C'est dans cette région aussi qu'a commencé la production de maïs
comme aliment de soudure.
Celle-ci a également très vite progressé dans la
région de Kaolack.
Parmi les autres cultures vivrières,
la plus importante est le
.
.
niébé (haricot) qui est souvent cultivé en association avec le mil.
Le manioc
s'est spontanément répandu,
depuis la dernière guerre,
surtout dans les
régions
arachidières où
sa
production contribue à
pallier
le
recul
des
cultures vivrières.
Le diabéré et le souchet comestible sont essentiellement
produits dans la
région
de Tambacounda.
Le
souchet comestible
est
une
tubercule qui pousse pendant la saison des pluies
on peut également la
trouver dans les régions de Kaolack et de Diourbel.

-
124
-
La répartition des arbres fruitiers dans le territoire suit d'une
part les groupements de végétation qui varient du nord au sud,
d'autre part
l'implantation
de
vergers
dans
les
zones

il
existe
des conditions
hydrologiques particulières (voir figure 58 a).
Du nord au sud on a quatre
domaines de végétation: sahélien, soudanien, soudano-guinéen et sub-guinéen.
Le domaine sahélien est pratiquement dépourvu d'arbres fruitiers à
l'exception de jujubiers et de dattiers du désert.
On y trouve aussi quelques
baobabs,
arbres qui fournissent le pain de singe
et qui se répandent de plus
en plus dans le domaine soudanien et soudano-guinéen. Le domaine soudanien est
plus riche en arbres fruitiers.
Ceux-ci y poussent spontanément:
manguiers,
tamariniers,
poiriers du Sénégal,
pommiers du Cayor et pommiers cajou. Seuls
les pommiers cajou font l'objet de culture dans la région de Kaolack pour la
production d'huile à partir de son noyau. Les arbres fruitiers qui fournissent
le saba,
le taba,
le landolfia et le tamarin blanc ne poussent que dans le
domaine soudano-guinéen et sub-guinéen. Le domaine sub-guinéen, qui est limité
à la basse Casamance, produit en plus les parinaires et les mangues.
La culture d'arbres fruitiers se fait essentiellement dans des
vergers qui sont principalement localisés dans les dépressions interdunaires
des Niayes (région de Dakar) et dans la
basse Casamance.
On y produit :
oranges,
mandari nes,
citrons,
papayes,
mangues,
corossols,
grenades et
goyaves. Cette production est destinée pour l'essentiel aux différents marchés
de la
capitale (Dakar).
Par ailleurs,
vers ces marchés vont converger les
productions de la basse Casamance et des domaines soudanais et soudano-guinéen
au détri ment des habitants de ces régions,
mai s surtout des habitants du
domaine sahélien (extrême nord).
Tous les fruits sont consorrmés crus,
ainsi qu'une tubercule,
le
souchet comestible.
Les autres aliments sont consommés cuits.
Afin d'étudier
la stabilité à la chaleur des vitamines contenues dans ces aliments,
nous
avons
procédé à
leur
cuisson
en suivant
scrupuleusement
les
habitudes
sénégalaises. Trois modes de cuisson ont été utilisés.
Le plus complexe concerne les cérêa les (mi l ,
sorgho et fon i 0) et comporte
quatre phases
- pilage au mortier et vannage pour éliminer le son,
- granulation de la farine obtenue à l'aide d'une faible quantité
d'eau,
- première cuisson à la vapeur d'eau (durée environ une à deux
heures selon les quantitês) permettant d'obtenir une masse
compacte de la farine granulée,

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Figure 58
Rêpartition de culturescêrêaliêres (b) et domaines de
1a vëqétat ion ( arbr es fruit i ers) (a) au Sénégal.

-
126 -
è
- deuxième cuisson à- la vapeur d'eau de la farine granulée
précédemment cuite après l'avoir humectée d'eau et obtention du
couscous qui est la forme consommée.
Le deuxième mode de cuisson concerne la farine de mais (grains de
maïs entiers écrasés au broyeur-mixeur),
le riz,
les tubercules (diabéré,
patate douce,
mani oc),
une 1égumi neuse (hari cots) et un 1égume (chou).
Il
consiste à cuire ces aliments dans l'eau bouillante pendant des durées pouvant
varier d'une
demi-heure (pour
la patate douce) à deux heures
(pour les
haricots).
Le dernier mode de cuisson est spécifique aux graines d'arachides.
Les graines sont grillées au bain de sable à des températures très élevées (en
général supérieures à 100 0 C).
Les graines grillées peuvent être consommées
directement après enlèvement de la peau,
ou bien transformées en p~te qui est
utilisée en cuisine traditionnelle pour la préparation des sauces.
Mais pour
des raisons
pratiques,
nous
n'avons
analysé
que les graines d'arachides
gri 11 ées.
Ces aliments constituent la base des trois repas quotidiens de la
plupart des Sénégalais,
même si
les habitudes alimentaires du milieu rural
sont différentes de celles des milieux urbain et sub-urbain. Le petit déjeuner
est à base de bouillie de milou de maïs dans la campagne alors qu'en ville il
est à base de pain de blé et de lait (ou d'infusion de Kinké1iba). Le déjeuner
en campagne varie selon les saisons
:
à la saison des pluies,
il
est
essentiellement constitué de lait caillé et de bouillie de mil.
Dans les
régions qui n'ont pas d'élevage,
le lait caillé est remplacé par un macéré de
pains de singe ou de tamarins.
Pendant la saison sèche,
l'alimentation est
surtout constituée de riz,
de haricots secs, de manioc et de poissons secs ou
fumés,
(ou de viande).
Les villages du nord (delta du fleuve) consomment des
légumes frais pendant toutes les saisons.
En milieu urbain,
le déjeuner est
presque toujours constitué de riz,
de légumes,
de manioc,
de poisson ou de
viande.
Le couscous de mil est la base du dîner,
aussi bien en ville qu'à la
campagne.
Il peut être accompagné d'une sauce à la pâte d'arachide contenant
des haricots,
du manioc, de la viande. En ville cependant, le couscous de mil
est le plus souvent remplacé par le riz,
parfois par la pomme de terre ou des
produits importés (pâtes, haricots blancs, petits pois, etc ... ).
Le dessert ne faisant pas partie des habitudes alimentaires des
Sénégalais,
les fruits sont essentiellement consommés entre les repas,
et
surtout en campagne.
En ville,
les fruits tropicaux ne sont pratiquement
consommés que par les enfants, à l'exception des mangues et des agrumes.

-
127
-
Pour analyser tous ces èa1iments,
nous nous sommes approvlslonnés
sur les marchés de Dakar (Sénégal).
Les fruits étaient tous à maturité (du
moi ns ce que l'on consomme frai s ) .
Il s ont été transportés 1e jour même par
avion dans notre laboratoire à Strasbourg.
Les méthodes d'analyse qui ont été
utilisées sont celles que nous avons mises au point dans les deux premières
parties de ce travail et qui sont décrites dans l'annexe 2.
Pour le dosage de
la vitamine C,
nous avons utilisé la méthode par chromatographie en phase
liquide haute performance par appariement d1ions (page
). En ce qui concerne
le dosage de la vitamine B6,
nous avons utilisé la méthode d'extraction par
hydrolyse enzymatique (phosphatase acide).
Les teneurs en vitamines données dans les différents tableaux des
chapitres suivants correspondent à la valeur moyenne d'au moins trois mesures
réalisées sur
trois échantillons
différents.
L'analyse de la ,teneur en
vitamine C des fruits a été réalisée deux années de suite.
Dans ce cas,
si
d'importantes fluctuations ont été observées,
nous avons indiqué les valeurs
extrêmes plutôt que les valeurs moyennes.

-
128 -
CHAPITRE 2
VITAMINE C ET ALIMENTATION DES HABITANTS DE LIAFRIQUE DE L10UEST
1. TENEURS EN VITAMINE C DES ALIMENTS ORIGINAIRES DE L'AFRIQUE
l'OUEST.
Les teneurs en vi tami nes C des al i ments que nous avons étudi és
sont indiqués dans les tableaux 23 et 25.
Le tableau 23 concerne les
aliments
qui,
à l'exception d'une
tubercul e,
le souchet comesti ble,
sont consonmés cuits.
Nous avons donc
précisé dans ce cas la teneur en vitamine C avant et après cuisson,
ainsi que
le taux de dégradation de cette vitamine au cours de la cuisson.
Les céréales
et les Iëçumtneuses ne contiennent pratiquement pas de vitamine C,
méme à
l'état cru.
Parmi les tubercules,
seul
le manioc frais
en contient des
quantités
appréciables
(45 mg
%).
Cette
vitamine est
cependant
presque
entièrement détruite lors de la cuisson.
Les légumes frai s sont rel ati vement ri ches en vi tami nes C.
Nous
n'avons étudié que le chou ponrné dont la teneur est de 48 mg %.
Un travail
plus complet sur ce type d'aliment a été réalisé,
avant 1970,
à l'ORANA de
Dakar.
A titre d'information,
nous donnons dans le tableau 24 les valeurs
figurant dans la table ORANA.
Malheureusement,
conme nous l'avons constaté
avec le chou ponmé ,
le mode de cuisson adopté par les Sénégalais pour les
légumes entraine une disparition presque complète de cette vitamine.
Il faut
par ailleurs noté que les légumes les plus riches en vitamines C (piment rouge
et poivron rouge) ne sont pas consommés en quantités importantes.
Il est donc
vraisemblable que les légumes
ne contribuent que très peu à l'apport en
vitamine C .dans l'alimentation africaine.
Les fruits
par contre,
qui sont consonmês crus,
représentent
certainement
une source importante
de vitamine
C.
D'après
nos résultats
(tableau 25),
onze des vingt neuf f~uits étudiés ont une teneur en vitamine C
supérieure à 20 mg %. Cette teneur excède mème 100 mg %pour le pain de singe,
la pomne cajou et
la goyave.
Pour ledétar,
cette teneur peut
dépasser
1000 mg s.

-
129 -
Tableau 23
Teneur
en vitamine C des céréales, tubercules,
légumineuses et légumes, avant et après cuisson
(ld = limite de détection (elle est 0,1 mg X)
Teneur en vitamine C
Aliment
(mg X)
Dégradation
(en X)
Cru
Cuit
Céréales
Fonio
<ld
-
-
Maïs
<ld
-
-
Mi 1
0,4
<ld
-
Riz (Casamance)
<ld
-
-
Riz (R ic hard To11 )
.(1d
-
-
Sorgho (blanc)
<ld
-
-
Sorgho (rouge)
<ld
-
-
Tubercules
Diabéré
0,6
<ld
-
Mani oc (frai s l
45
7
85
Mani oc (séché)
0,7
< 1d
-
Patate douce
<ld
-
-
Souchet comestible
1d
-
-
Légumineuses
Arachide
..<,1 d
-
-
Haricot
0,3
<ld
-
Légume
Chou pommé
48
8
84

-
130 -
Tableau 24
Teneur en ~itamine C de quelques légumes crus (source
table ORANA)
.
Aliment
Teneur en vitamine C
(en mg %)
Aubergine
10
Carotte
6
Courge
6
Chou pommé
49
Oseille de Guinée
72
Gombo
10
Haricot vert
47
Navet
75
Pi ment rouge
150
Poireau
8
Poivron rouge
125
Tomate cerise
50
Nos résultats sont cependant très souvent nettement inférieurs à
ceux
donnés
dans
la
table
FAO/ORANA
(1970),
seul
ouvrage
de
référence
suffisamment complet dans ce domaine.
Nous n'avons des résultats concordants
que pour la goyave,
la mandarine,
l'orange,
le pain de singe et la papaye.
Bien entendu les teneurs en vitamine Cd' un fruit peuvent étre sujettes à
d'assez
larges
fluctuations
pour
de
multiples
raisons
(climatiques,
culturales,
variétales,
etc ... ).
Nous avons pu nous en rendre compte en
effectuant deux séries d'analyse,
deux années de suite.
Mais le fait que nos
valeurs
soient
presque
systématiquement
inférieures
(et
parfois très
nettement) à celles données dans la table FAO doit vraisemblablement trouver
son explication au niveau des techniques
d'analyse utilisées.
Les teneurs
fi gurant dans 1a table FAO/ORANA ont été établi es bi en avant 1970,
c'est à
dire à une époque où la seule méthode d'analyse couramment pratiquée était la
méthode titrimétrique au dich1oro-2,6
phéno1indophéno1.
Nous
avons montré
(voir 1ère partie) que l'utilisation de cette méthode pouvait conduire à une
surestimation de la teneur en vitamine C.
Nous avons effectivement trouvé, en
utilisant la méthode titrimétrique, des teneurs en vitamine C de 232 mg % dans

-
131
-
le pain de singe et de 25 mg %. dans le saba,
nettement supérieures à celles
que nous avons obtenues en utilisant la chromatographie en phase liquide haute
performance. Cette dernière méthode possède une bien meilleure spécificité. Il
est donc vraisemblable que nos résultats soient plus proches de la réalité que
ceux indiqués dans la table FAO/ORANA.
Un nombre restreint de travaux a été
consacré aux fruits originaires de l'Afrique de l'Ouest.
Citons tout de méme
ceux relativement anciens de AUFFRET et TANGUY (1948) sur le détar (teneur en
vi"tamine C:
2000 mg %) et ceux plus récents réalisés (à l'aide de méthodes
colorimétriques) au Nigéria sur quelques fruits (goyave, mangue, papaye, pomme
cajou,
orange) par MUDAMBI et RAJAGOPAL (1977),
ACHINEWHU (1983),
KESHINRO
(1985) et OKIEIMEN et al (1985) et qui de ce fait n'ont qu'un intérét réduit.
Méme si l es val eurs que nous avons obtenues ne sont pas aussi
élevées que celles données dans la table FAO/ORANA,
il n'en demeure pas moins
que les fruits originaires du Sénégal sont nettement plus riches en vitamine C
que les fruits des régions tempérées (voir tableau 26) et devraient constituer
dans l'alimentation du Sénégalais un apport essentiel en vitamine C.
II. BESOINS QUANTITATIFS EN VITAMINE C POUR L'ORGANISME - APPORTS
CONSEI LLES.
A. Les besoi ns
La
notion
de
rôle
antiscorbutique
a
conduit
à
essayer
de
déterminer l'apport quotidien de vitamine C nécessaire et suffisant pour
éviter
l' apparit i on
des
premi ers
symptômes
cl i ni ques.
Le
pri nci pe de
l'expérimentation est simple:
soumettre des volontaires sains à un reqrme
alimentaire exempt de vitamine C et attendre les manifestations objectives de
carence.
C'est la définition méme du concept de vitamine.
Parmi toutes les
expériences sur le sujet,
il faut retenir le travail de KREBS en 1953 resté
célèbre sous le nom d"'expérimentation de Sheffield".
Celui-ci a consisté à
administrer
à
des
sujets
sains
des
reglmes
alimentaires
contenant
respectivement 0,
10 et 70 mg de vitamine C par jour.
Seuls les sujets du
premier groupe (0 mg par jour) montrèrent des symptômes de carence dont les
premiers signes apparurent au bout de 6 semaines.
De cette étude,
on tira la
conclusion que l'ingestion de 10 mg de vitamine C par jour est
la dose
minimale qui protège contre l'apparition des signes de carence.
Toutefois,
pour disposer d'une marge de sécurité,
on proposa de fixer à 30 mg par jour,
la dose qui correspond aux besoins quotidiens.

-
132 -
Tableau 25
Teneur en vitamine C des fruits (pulpe) récoltés au
Sénéga1
1d = 1i mite de détect ion (0, 1 mg %)
Fruit
Teneur en vitamine C
Val eurs
(en mg %)
table FAO/ORANA
Cerise du Sénégal
34
68
Cerise verte
<ld
Citron vert (jus)
24 - 35
42
Corossol
11 - 20
42
Dankh
0-4
32
Datte du désert
0-8
35
Détar
520 - 1180
1290
Goyave
155
152
Grenade (jus)
0-3
Jujube
3 - 10
24
landolphia
2
12
Mandarine
11 - 45
28
Mangue (mure)
22 - 45
42
Mangue (verte)
81
45
~.
Orange douce (jus)
35 - 77
46
Pain de singe
156 - 173
169
Palmier doum
1
Pamplemousse (jus)
34
44
Papaye
79
52
Parinaire
<ld
31
Poire du Sénégal
14
74
Pomme cajou
150
252
Pomme du Cayor
<Jd
95
Prune noire
zld
9
Ronier
3
5
Saba
7 - 11
48
Taba
<ld
Tamarin
o - l
11
Tamarin blanc
<ld
Termina1ia
<:.1 d

-
133 -
Tableau 26
Teneur en vitamine C (en mg %) des fruits des régions
tempérées.
.
Fruit
Teneur moyenne en
vitamine C (en mg %)
Grosei 11 e noire
200
Cassis
140
Fraise
60
Grosei 11 e rouge
30
Framboise
25
Mûres
20
Melon
12
Cerise
8
Abricot
7
Pêche
7
Porrme
6
Poire
4
Rai sin
4
Prune
4
Figue
2

B. RéservesenvitamineCde l'organisme
Les réserves de l 1 adu He
sai n en vitami ne C sont importantes,
environ 1500 mg (BAKER et al,
1969). Quand on supprime totalement les apports
extérieurs,
la consorrmation par l'organisme étant de l'ordre de 10 mg par
jour,
les premiers signes de carence apparaissent quand la réserve totale
tombe au dessous de 300 mg,
c'est à dire au bout de 3 à 4 mois.
En fait le
manque d'apport
extérieur n'étant
jamais
total,
on observe
des signes
cliniques de carence que dans des conditions exceptionnelles, notamment celles
qui ont servi à la description du scorbut.

-
134
-
L'intérêt de ces réserves se mani feste dans des cas très fréquents
où il existe une augmentation ponctuelle des besoins, à l'occasion par exemple
d'une
maladie
infectieuse,
d'un
traumatisme
ou
d'une
intervention
chirurgicale.
Si
l vêvènenent
survient
dans un
organisme
en
bon
état
métabolique,
le capital en acide L-ascorbique permet de satisfaire pendant la
période difficile une consommation normale et même accrue en vitamine C.
Le
pool profond de vitamine C alimente le pool métabolique et le maintient à un
niveau normal.
En fait les réserves de vitamine C paraissent suffisantes pour
faire face à un accroissement accidentel
de la consommation,
même si les
apports extérieurs sont au même moment diminués ou supprtmes,
mais peut-être
n'est il pas sans conséquence pour l' organi sme d'être obli gé de puiser dans
ses réserves profondes.
C.Apportsquotidiens conseillés
Les apports quotidiens conseillés doivent à la fois satisfaire les
besoins (30 mg par jour pour l'adulte et 60 mg par jour pour la femme enceinte
ou allaitante) et participer au maintien de la réserve en vitamine C de
l'organisme.
Dans différents pays ces chiffres ont été revus à plusieurs
reprises.
En 1981,
le CNERNA (Centre National de Coordination des Etudes et
Recherches sur la Nutrition et l'Alimentation) conseilla pour les Français les
apports en vitamine C indiqués ci-dessous (tableau 27).
Tableau 27 : Apports quotidiens en vitamine C conseillés par le
CNERNA en 1981.
Tranches d'âges
Apport quotidien
Enfants de l à 3 ans
35 mg
Enfants de plus de 4 ans
35 mg
Adolescents de 13 à 19 ans
40 à 60 mg
Hommes et femmes adultes
60 à 100 mg
Sujets à risques
120 mg

-
135
-
Ces
chiffres
nettement
plus
élevés
que
ceux
résultant
des
experlences de KREBS permettent d'avoir une très grande marge de sécurité.
Le
chiffre le plus élevé (120 mg) concerne les sujets à risque c'est à dire des
personnes dont l'état physiologique est plus délicat (personnes âgées) ou a
subi des agressions (cas des cancére~x, alcooliques, fumeurs etc ... ).
Les valeurs conseillées en France sont assez différentes de celles
conseillées dans d'autres pays (voir Recommended Dai1y A110wances for Vitamins
(1983) cité par MACHLIN dans "The Handbook of Vitamins", 1984). Il est à noter
qu'aucun pays africain,
hormis l'Afrique du Sud, n'a fixé de dose journalière
recommandée.
L'ORANA (Dakar) a cependant estimé les besoins en vitamine C des
habitants de l'Afrique de l'Ouest (voir tableau 28).
Tableau 28
Besoins journaliers en vitamine C estimés par
l'ORANA (Dakar).
Enfants de 0 à
1 an
10 mg
Enfants de 2 à
6 ans
15 mg
Enfants de 7 à 10 ans
20 mg
Adolescents de 11 à 14 ans
30 mg
Adolescents de 14 à 19 ans
30 mg
Hommes et femmes adultes
20 mg
Femmes enceintes ou a11aitantes
40 mg
On constate immédiatement une grande différence entre les chiffres
proposés d'une part par le CNERNA et d'autre part par 1'ORANA. Par ailleurs le
FAO/OMS recommande 30 mg chez l'adulte comme apport quotidien.

-
136 -
Ces écarts prouvent qûe l'estimation des besoins quotidiens de
vitamine C nlest pas toujours facile.
Tous les pays sont, cependant dl accord
pour fixer à 15 mg la valeur minimale par jour chez l'adulte.
Cette quantité
doit être fournie exclusivement par les aliments et non par les réserves de
llorganisme.
III. COUVERTURE DES BESOINS EN VITAMINE C PAR LIALIMENTATION CHEZ
LES SENEGALAI S.
A la suite d'une étude nutritionnelle rêalisêe par 110RANA,
il
semble que le taux de satisfaction des apports recommandés en vitamine C'est
tout à fait convenable au Sénégal.
Dlaprès le rapport publié en 19~0, ce taux
varie de 138 % (la valeur la plus faible, dans la région de Louga) à 280 % (la
valeur la
plus élevée dans la région de Diourbel).
Ce rapport
indique
également les apports des divers aliments pour la couverture des besoins en
vitamine C.
Les
résultats
donnés dans
le
tableau
29
sont
extrêmement
surprenants.
Tableau 29
Apports des divers aliments au besoin en vitamine C
(source ORANA).
Aliment
Apport (en %)
Dakar
Louga
Tambacounda
Légumes
69
86
50
Tubercules
17
12
-
Fruits
-
9
43
Autres
14
3
7

-
J 37
-
On note 11 importance des légumes dans li apport en vi tamine C,
quelle que soit la région concernée.
Or,
à la lecture du rapport,
il semble
que la dégradation de la vitamine C dans les légumes lors de la cuisson,
qui
est extrêmement importante, nia pas été prise en compte. Tenir compte de cette
dégradation reviendrait à réduire' considérablement l t impor-tence des légumes
dans cet apport.
Surprenante également la part prise par les tubercules. Nous
avons en effet montré qu 1 après l a cui sson ,
l a teneur en vi tamine C des
tubercules est parfaitement négligeable.
Surprenant enfin,
le faible apport
attri bué aux fruits alors que ces al iments contiennent souvent des quantités
très élevées de vitamine C.
A notre avis,
si effectivement les besoins en vitamine C sont
largement
couverts
par
l'alimentation
chez
le
Sénégalais,
ce
sont
certai nenent les frui ts qui couvrent une très grande parti e de ces ,besoi ns. Il
est en effet possible pour le Sénégalais de consommer durant toute l 1 année des
fruits ri ches en vitamine C.
Le pai n de si nge (fruit du baobab) qui est
récolté entre octobre et décembre, à cause de sa forte acidité et de sa faible
teneur en eau,
peut être conservé plusieurs mois sans perdre sa vitamine C
(CARR,
1955,
1958) et peut être trouvé sur les marchés durant toute l 1 année.
La goyave,
la papaye et le citron vert,
qui sont produits dans les jardins,.
peuvent également être consommés toute llannée.
Les autres fruits riches en
vitamine C ne sont disponibles que quelques mois par an,
mais leurs périodes
de récolte sont espacées dans le temps:
dloctobre à décembre pour le détar,
de décembre à février pour la mandarine, de décembre à mai pour l lorange et le
pamplemousse, d'avril à septembre pour la mangue et la cerise du Sénégal et de
juin à octobre pour la pomme cajou.
En se référant
au
tableau
25,
on
constate que
les
besoins
journaliers en vitamine C sont couverts,
entre autres, par la consommation de
25 g de pain de singe. Or le baobab est un arbre fort répandu au Sénégal et le
prix du pain de singe n'est que de l FF (50 F CFA) le kg.
La couverture des besoins en vitamine C de la
population ne
devrait
poser aucun
problème.
Pourtant,
il
semble que dans la
région
Sahé li enne,
on ai t observé des carences en vitami ne C,
sans doute dues à
l'absence dlarbres fruitiers dans cette région,
mais aussi à un défaut dans
les échanges entre régions.
Il est vrai que les Sénégalais ne sont pas de
grands amateurs de fruits,
et préfèrent quand ils en ont les moyens,
acheter
des oranges du Maroc et des pommes Golden.

-
138
-
CiiAPITRE 3
VITAMINES 8 (81, 82, 83 et 86) ET ALIMENTATION:
DES HA8ITANTS DE L'AFRIQUE DE L'OUEST.
1. LES TENEURSEN·VITAMINES B(Bl, B2, B3 et B6) DES ALIMENTS
ORIGINAIREs OEL'AFRIQUE DE L'OUEST.
Les résultats obtenus sant donnés dans les tableau~ 30 à 37.
Les
tableaux 30 à 33 concernent les aliments (céréales,
légumineuses, tubercules,
légumes) que lion
consomme
cuits.
Une
exception
cependant,
le
souchet
comestible qui est consommé cru.
Dans chacun de ces tableaux,
nous avons
indiqué les teneurs en vitamines avant et après cuisson et préciser le taux de
dégradation de celles-ci après ,cuisson.
Les tableaux 34 à 37 sont consacrés
aux fruits
(que lion consomme crus).
En dehors des valeurs que nous avons
trouvés,
nous y avons également fait figurer,
à titre de comparaison,
les
valeurs données dans la table FAO/ORANA (1970).
On
considère
généralement
que
l'apport
en
vitamines
B dans
l'alimentation est essentiellement dû aux céréales et aux légumineuses.
En
ce
qui
concerne
la
vitamine
Bl,
les
céréales
crues
en
contiennent des quantités appréciables (tableau 30),
généralement supérieures
à 0,20 mg X,
à l'exception du riz de Casamance,
fortement blanchi qui n'en
contient plus que 0,03 mg X. Malheureusement, les procédés de cuisson utilisés
par les Sénégalais en détruisent généralement plus de 80 X.
De ce fait,
les
céréales cuites ne constituent plus un apport important en vitamine Bl.
Les légumineuses
crues,
en particulier l'arachide,
sont très
ri ches en vitami ne Bl.
Le taux de dégradati on à l a cui sson est l à encore
voisin de 80 X.
En dépit de celà,
les légumineuses constituent une source
intéressante de vitamine Bl.
Les tubercules crus,
en particulier le manioc et la patate douce,
contiennent peu de vitamine
Bl.
L'apport
des tubercules
cuits en cette
-
,
vitamine est donc tout à fait négligeable,
même s'il semble que dans ce type
d'aliment la vitamine Bl soit plus stable à la cuisson que dans les céréales
et les l égumi neuses.
Il faut cependant f ai re une excepti on pour le souchet
comesti bl e,
un
tubercule un peu méconnu
que l'on consomme cru
et qui est
fort riche en vitamine Bl (0,53 mg X).
La teneur en vitami ne Bl des légumes,
surtout après l a cui sson,
est peu importante.

-
139 -
La vitamine 82 (tabl~au 31) résiste beaucoup plus à la cuisson que
la vitamine 81.
Cependant,
comme les teneurs en vitamine B2 dans les divers
aliments étudiés ne dépassent guère 0,10 mg % lorsqu'ils sont crus,
les
teneurs dans les aliments cuits sont toujours très faibles.
C'est l'arachide
gri llée qui en contient le plus avec 0,08 mg %.
Le souchet comestible, à

l'état cru, en contient 0,11 mg %.
Tableau 30
Teneur en vitamine B1 des céréales, tubercules,
..
légumineuses et légumes, avant et après cuisson.
(ld = limite de détection (0,01 mg %))
Teneur en vitamine 81
Dégradation
Aliment
en mg %
(en %)
cru
1
cuit
Céréales
Fonio
0,19
1
0,02
89
Maïs
0,21
1
0,06
71
Mil
0,38
1
0,05
87
Riz (Casamance)
1
0,03
<ld
100
Riz (Richard To11)
0,17
1
0,03
88
Sorgho (blanc)
0,22
1
0,04
82
,
Sorgho (rouge)
0,22
0,03
84
Tubercules
Diabéré
0, 11
1
0,03
73
Manioc (frais)
0,07
1
0,03
59
Patate douce
0,04
1
0,02
50
1
Souchet comestible
0,53
consommé cru
-
1
1
Légumineuses
1
Arachide
1, 03
0,20
81
r
Haricot (niébé)
0,48
0,10
79
Légume
Chou ponrné
0,08
1
0,02
75
1
1
--

-
140
-
'"
Tableau 31
Teneur en vitamine 82 des céréales, tubercules et .
légumes, avant et après cuisson .
.
Aliment
Teneur en vitamine 82
Dégradati on
.mg%
(en %)
cru
~ cuit
. Céréales .
Fonio
0,05
1
0, Ol
80
Maïs
0,05
1 0,02
60
Mil
0,14
1
0,04
71
Riz (Casamance)
0,02
0,01 •
1
50
Riz (Richard tol l )
0,03
0,01
67
r
Sorgho (blanc)
0,05
0,02
60
1
. Sorgho . (rouge)
0,07
1
0,02
71
Tubercules ..
Diabéré
0,02
1 0,02
Mani oc (frais)
0,03
1
0,03
°
Patate douce
0,03
1
0,02
°
33
1
Souchet comestible
0,11
consommé cru
-
Légumineuses
Arachide
0, 11
1
0,08
27
.Haricot (rriêbê l .
0,09
1
0,04
56
Légume
Chou pommé
0,06
1
0,03
50
1
J
La vitamine
83 (tableau
32) est
exclu~ivement sous forme
de
nicotinamide dans les céréales et les légumineuses. Dans les tubercules et les
légumes, on peut la trouver à la fois sous forme de nicotinamide et sous forme
diacide nicotinique.
Lors de la cuisson, la dégradation de cette v~tamine est
très importante,
surtout dans 1es céréal es.
Ce11 es-ci
di sparait presque
entièrement dans le fonio, le maïs et le riz. Les quantités retrouvées dans le
mil et le sorgho sont généralement inférieures à celles que l'on retrouve dans

-
14 1 -
Tableau 32
Teneur en vitamine 83 des céréales, tubercules;
1égumi~e~es et légume, avant et après cuisson.
(ld = limite de détection (0,2 mg %))
.
Teneur en vitamine 83 (mg %)
Dégradation
cru
cuit
au cours de
Aliment
Acide ÎNicoti ITotal Acide 'Nicoti ;Total
la cuisson
.
t· 1
. d 1
.
.,
. d
mco l, nam e
rncot lin ami e
(% )
.
1
.
1
..
.,.nl quel
1
-nl que1
1
,
.Cêrêal es
l
Fonio
-
3,36 1 3,36
1
-
0, 11 10,11
97
1
Maïs
-
1,04 1 1,04
1
-
<ld 1 <ld
100
Mil
1
-
4,88 1 4,88
-
1 1,70 Il ,70
65
Riz (Casamance)
-
1 0,46 1 0,46
-
1 <ld 1 <.ld
100
Riz (R ic hard T0 11 )
-
1 0,64 1 0,64
-
<ld
1
1 <.ld
100
Sorgho (blanc)
-
1 4,61 1 4,61
-
l ,9 1 1,9
59
1
Sorgho (rouge)
-
1
3,34 1 3,34
-
1,0 Il,0
67,0
1
Tubercules
1
1
Diabéré
1
-
112,05 ,12,05
-
3,62 1 3,62
70
Manioc (frais)
0,40 1 6,09 1 6,49
-
1
2,8112,81
57
Patate douce
4,40 , 6, 19 110 , 59
-
1
1,85 1 1,85
83
Souchet comestible
-
1 4,76
1
4,76
1consommé cru
-
Légumineuses
1
Arachide
1
1
1
-
, 18, 32 118, 32
-
2,44
2,44
87
(niébé)
1
1
Haricot
-
112,81 112,81
-
5,43 1 5,43
58
Légume
Chou pommé
1
1,43 1 3,71 1
1
1 5, 14
-
1,21 1 1,21
77
1
1
1
1
1

-
142 -
les autres aliments.
Le' haricot '«niébé) semble une bonne source de vitamine
83 (5,43 mg) ainsi que deux tubercules relativement peu connus:
le diabéré
(3,62 mg %) et le souchet comestible cru (4,76 mg X).
La vitamine B6 est présente dans ces aliments essentiellement sous
forme
de
pyridoxal,
quelquefois'
sous
forme
de
pyri doxami ne
(souchet
comestible,
arachide,
haricot)
et de pyridoxol
(manioc,
patate douce,
arachide) (tableau 33).
Dans les
aliments crus,
on en trouve surtout dans l'arachide
(l,05 mg X),
les haricots (0,65 mg %) et le mil (0,65 mg %) mais également
dans le souchet comestible (0,38 mg %) et la patate douce (0,14 mg X).
La destruction de la vitamine B6 à la cuisson est extrêmement
importante. Dans les céréales cuites, sa teneur devient négligeable, sauf dans
,
le mil
(0,07 mg X).
Seule
l'arachide est,
en définitive,
une source
intéressante de vitamine B6 (0,43 mg X).
On peut par ailleurs noter que dans
cet aliment,
cette vitamine
est relativement
stable à
la cuisson
(la
dégradation n'est que de 59 X).
A la
suite
de
cette
étude
sur
lés
céréales,
tubercules,
légumineuses et légume,
il apparaît que les céréales cuites,
contrairement à
ce que l'on croit d' habitude,
ne constituent pas une source importante de
vitamines B. Et, parmi toutes les céréales étudiées, c'est certainement le riz
qui est la céréale la moins intéressante.
Pourtant les Sénégalais consomment
de plus en plus de riz et parallèlement délaissent le mil qui,
d'après nos
résultats est la céréale qui apporte le plus de vitamines B.
Les légumineuses
en particulier l'arachide,
sont les aliments qui,
à l'état cuit, contiennent
le plus de vitamines B. Il ne faut pas non plus oublier les fortes teneurs du
souchet comestible à l'état cru (0,53 mg % de vitamine Bl,
0,11 mg % de
vitamine B2, 4,76 mg %de vitamine B3 et 0,38 mg %de vitamine B6).
Lorsqu'on parle de vitamines et de fruits, on pense immédiatemment
à
la vitami ne c.
C'est certai nement
l a vi tamine présente en plus grande
quantité dans les fruits. Mais les teneurs en vitamines B des fruits sont loin
d'être négligeables (voir tableaux 34à 37). Et du fait que ces aliments soient
consommés crus, leur apport vitaminique B dans l'alimentation peut se comparer
à celui des céréales et des légumineyses à l'état cuit,
même s'il faut bien
admettre que dans les menus sénégalais les fruits n'occupent, malheureusement,
qu'une place très secondaire.

Tableau 33 : Teneur en vitamine B6 des céréales. tubercules, légumineuses et
légume , avant et après cuisson.
«ld = inférieur à la limite de détection qui est de 0,02 mg X)
Teneur en vitamine B6 (mg X)
Aliment
Cru
Cuit
Dégradation (X)
Pyrido- Pyridoxal pyridoxol
Total
Pyrido- Pyridoxa1 Pyridoxol
Total
xamine
xamine
Céréales
Fonio
-
0,08
-
0,08
-
-
-
<ld
100
Maïs
-
0,03
-
0,03
-
-
-
<ld
100
Mil
0,01
0,64
-
0,65
-
0,07
-
0,07
89
Riz (Casamance)
--
-
0,06
-
0,06
-
-
-
<ld
100
Riz (Richard Toll)
-
0,03
-
0,03
-
-
-
<ld
100
Sorgho (blanc)
-
0,02
-
0,02
-
-
-
<ld
100
Sorgho (rouge)
-
0,10
-
0,10
-
0,02
-
0,02
80.

~
w
Tubercules
Diabéré
.
-
-
-
<ld
-
-
-
<ld
-
Manioc (frais)
-
0,05
0,06
0,11
-
-
0,01
0,01
91
Patate douce
-
0,02
0,12
0,14
-
0,02
0,02
0,Q4
72
Souchet comestible
0,38
-
-
0,38
consonmé cru
-
.
Légumineuses
Arachide
_.
0,07
0,78
0,2
1,05
0,43
-
0,43
59
Haricot (niébé)
0.10
0,55
-
0,65
-
0,02
-
0,02
97
Légume
Chou pommé
-
0,04
-
0,04
-
-
-
<ld
100

-
144
-
Tableau 34
Teneur ·en vitamine Bl des fruits (pulpes) récoltés au
Sénégal
«dl = inférieur à la limite de détection qui est de
0,01 mg %)
Fruits
~eneur en vitamine Bl
Valeurs indiquées dans
(mg %)
la table FAO/ORANA
Cerise du Sénégal
<dl
0,02
Cerise verte
0,09
Citron vert (jus)
<dl
0,03
Corossol
0,08
0, 11
Dankh
<dl
0,03
Datte du désert
0, 15
0,20
Détar
0,04
0, 14
Goyave
0,07
0,06
Grenade (jus)
0,06
Jujube
<dl
0,03
Landolphia
0,04
0,04
Mandarine (jus)
0, la
0,08
Mangue
0, 01
0,03
Orange douce (jus)
0, 13
0,02
Pain de singe
0,11
0,38
Palmier doum
<dl
0,05
Pamplemousse (jus)
0,05
0,05
Papaye
0,06
0, 03
Parinaire
<dl
Poi re du Sénégal
0,02
Pomme cajou
0,01
0,03
Pomme du Cayor
0,03
Prune noire
0,02
Ronier
<dl
0,04
Saba
0,20
0,15
Taba
<dl
Tamari n
0,40 (frais)
0,18 (sec)
Tamarin (blanc)
<dl
Termina1ia
<dl

-
145 -
Tableau 35
Teneur en~vitamine 82 des fruits (pulpe) récoltés au
t"
Sénégal
(<(dl = inférieure à la limide de détection qui est
de 0,001 mg %).
Fruits
Teneur en vitamine 82
Valeurs indiquées dans
(mg %)
la table FAO/ORANA
Cerise du Sénégal
0,07
-
Cerise verte
0,05
-
.
Citron vert (jus)
<dl
0,02
Corossol
0,04
0,10
Dankh
0,06
-
Datte du désert
0,07
0,11
Détar
0,06
0,05
Goyave
0,04
0,04
Grenade (jus)
0,02
-
Jujube
0,03
0,02
Landol ph ia
0,04
0,03
Mandarine (jus)
0,04
0,05
Mangue
0,05
0,05
Orange (jus)
0,03
0,03
Pain de singe
0,06
0,06
Palmier doum
0,02
0, 10
Pamplemousse (jus)
0,02
0,03
Papaye
0,04
0,03
Parinaire
<dl
-
Poi re du Sénégal
-
-
Porrrne caj ou
0,02
0,24
Porrrne du Cayor
-
0,08
Prune noire
-
-
Ronier
0,01
0,02
Saba
0,02
0,03
Taba
0,05
-
Tamarin
0,05
0,09
Tamarin blanc
0,04
-
Terminalia
0,06
-

-
146 -
Tableau 36
Teneur.en'"vitamine 83 des fruits (pulpe) récoltés au
Sénégal
( <dl = inférieure à la limite de détection qui est
de 0,2 mg %).
Frui ts
Teneur en vitamine 83
Valeurs indiquées dans
(exclusivement acide
la table FAO/ORANA
nicotiniQue) mg %
Cerise du Sénégal
<dl
,
-
Cerise verte
3,24
-
Citron vert
<dl
0,3
Corossol
<dl
1,4
Dankh
<dl
-
Datte du désert
0,40
l ,7
Détar
0,50
0,6
Goyave
B,40
l ,3
Grenade
<dl
-
Jujube
<dl
2, l
Landolphia
7,00
O,B
Mandarine
<dl
0,2
Mangue
l,3O
0,4
Orange
5,00
0,2
Pain de singe
0,50
2, l
Palmier doum
15,70
3,4
Pamplemousse
2,90
0,2
Papaye
6, 10
0,4
Parinaire
l,9O
-
Poire du Sénégal
-
O,B
POl11T1e cajou
3,5B
0,3
POl11T1e du Cayor
-
0,7
Prune noire
-
-
Ronier
0,52
0,3
Saba
0,53
0,5
Taba
5,BO
-
Tamarin
0,43
0,6
Tamarin blanc
<dl
-
Terminalia
2,30
-

J-----------------
-
J 47
-
Tableau 37
Teneur en vitamine 86 des fruits (pulpe) récoltés au
Sénégal 1
(<:dl = inférieure à la limite de détection qui est
de,
O,01m~ % pour la pyridoxamine, a,at -mg % pour
le pyridoxal et 0,04 mg % pour le pyridoxol).
Fruits
Teneur en vitamine 86 (mg %)
Pyri doxami ne pyri doxal
Pyridoxol
Total
. ,
Cerise du Sénégal
-
-
-
<dl
Cerise verte
-
0,02
-
0,02
Citron vert (jus)
-
0,05
-
0,05
Corossol
0,02
-
-
0,02
Dankh
-
0,03
-
0,03
Datte du désert
-
0,30
-
0,30
Détar
-
-
-
.qll
Goyave
-
-
-
<dl
Grenade (jus)
-
-
-
<,dl
Jujube
-
0, 10
-
0, 10
Landolphia
-
0,06
-
0,06
Mandari ne (jus)
0,03
0,08
-
0, 11
Mangue
-
0,03
-
0,03
Orange (jus)
0,02
0,04
-
0,06
Pain de singe
-
0,02
-
0,02
Pa l mi er doum
-
-
-
<dl
Pamplemousse (jus)
0,06
-
-
0,06
Papaye
-
0,02
-
0,02
Parinaire
-
-
-
<dl
Poi re du Sénégal
-
-
-
-
POl1ll1e cajou
-
-
-
<.01
POl1ll1e du Cayor
-
-
-
-
Prune noire
-
-
-
-
Ronier
0,04
-
-
0,04
'
Saba
-
0,02
-
0,02
Taba
-
0,06
-
0,06
Tamari n
0,08
-
-
0,08
Tamarin blanc
0,02
-
-
0,02
Terminalia
-
0,02
-
0,02

-
148 -
Les teneurs en vitamine Bl que nous avons trouvées dans les fruits
sont en général plus faibles que celles indiquées dans la table FAO/ORANA.
L'écart
le
plus
marquant concerne le
pain de singe
(0,11
mg
% contre
0,38 mg %).
Ces écarts sont sans- doute imputables aux méthodes d'analyse
choisies.
Nous ne connaissons pas la méthode utilisée lors de l'établissement
de la
table FAO/ORANA,
mais nous pouvons supposer que c'est la méthode
fluorométrique au thiochrome. Or cette méthode, nous l'avons montré lors de la
mise au point de la méthode officielle de dosage de la vitamine Bl dans les
produits diététiques,
n'est pas parfaitement spécifique et conduit souvent à
une
surestimation
des teneurs
en vitamine
Bl.
Ces
différences
peuvent
également être dues à l'origine des fruits (variété, mode cultural, climat •. ).
Il est peut être important de noter que nous retrouvons parmi les
fruits riches en vitamine Bl (teneur supérieure à 0,10 mg %) la plupart de
ceux déjà cités dans la table FAO/ORANA : tamarin: 0,40 mg % (FAO : 0,18 mg %
(à l'état sec)) ;
saba
0,20 mg % (FAO:
0,15 mg %);
datte du désert:
0,15 mg % (FAO : 0,14 mg %) ; pain de singe: 0,11 mg % (FAO : 0,38 mg %).
Les teneurs en vitamine B2 des fruits étudiés sont relativement
faibles
elles ne dépassent pas 0.07 mg % (valeur maximale trouvée dans la
datte du désert et dans la cerise du Sénégal).
Les valeurs que nous avons
trouvées
sont
souvent en bon
accord avec celles
données
dans la
table
FAO/ORANA,
quelquefois plus basses (cas du corossol,
du palmier doum et
surtout de la pomme cajou).
Les résu1tats que nous avons trouvés concernant 1a vitami ne B3
nous ont plutôt surpris.
Ils sont en effet totalement différents de ceux
publiés dans la table FAO/ORANA.
Dans l'ensemble.
nos valeurs sont beaucoup
plus élevées.
D'après le tableau FAO,
seul le palmier doum a une teneur en
vitamine 83 supérieure à 3 mg % (3,4 mg %).
D'après nos résultats,
8 fruits
dépassent cette valeur (cerise verte,
pomme cajou,
orange,
taba,
papaye,
landolphia,
goyave et palmier doum,
ce dernier culminant à 15.70 mg %).
Ces
écarts s'expliquent vraisemblablement.
d'une part par l'origine des fruits,
d'autre part par les méthodes d'analyses utilisées.
Dans les fruits.
la vitamine 86 est essentiellement sous forme de
pyridoxa1.
On la trouve également parfois sous forme de pyridoxamine.
Dans
l'ensemble les fruits
sont
relativement pauvres en vitamine 86.
Il Y a
cependant quelques exceptions:
la datte du désert (0,30 mg %),
le jujube
(0,10 mg %). la mandarine (0.11 mg %) et le tamarin (0,08 mg %).
En définitive les
teneurs en vitamines B des fruits
sont loin
d'être négligeables.
Elles sont souvent supérieures à celles que l'on peut
retrouver dans les céréales et les légumes cuits. Certains fruits apparaissent

-
149 -
particulièrement intéressants comme'par exemple la datte du désert (0,15 mg %
de vitamine B1,
0,30 mg % de vitamine B6),
le tamarin (0,40 mg %de vitamine
B1),
le saba (0,20 mg % de vitamine B1),
le palmier doum (15,70 mg % de
vitamine B3) et peuvent contribuer
de façon
substantielle à l'apport en
vitamines B.
Il faudrait
cependant
que le Sénégalais change un peu ses
habitudes
alimentaires et
ne considère
plus les fruits locaux conme des
aliments réservés exclusivement aux jeunes enfants.
II. BESOINS QUANTITATIFS EN VITAMINES B - APPORTS CONSEILLES
Pour l'estimation des besoins en vitamine B1,
de très nombreuses
études ont été faites (déficience provoquée et surveillance de la nutrition).
Sur la
base de ces observations
il
apparaît
que
les
doses quotidiennes
requises sont surtout fonction de la ration calorique ingérée et sont d'autant
plus élevées que cette ration contient d'avantage d'hydrates de carbone.
Pour
la plupart des personnes,
le besoin minimum est fixé à 0,5 mg pour 1000
calories.
Il ne doit jamais être inférieur à 1 mg chez l'adulte même si la
ration contient moins de 2000 calories.
Cet apport en thiamine doit étre
augmenté en cas de prédomi nance des hydrates de carbone dans
1a rati on
alimentaire.
Il doit également être augmenté pendant le travail physique,
la
grossesse, la lactation et en cas de maladie infectieuse.
La capacité de stocker
la
thiamine
par l'organisme est très
limitée.
Il est donc nécessaire dans certains cas de compenser,
par une
augmentation de l'apport,
l'élimination de la vitamine B1 dans la sueur ou
dans l'urine.
Les apports quotidiens conseillés vont de 0,4 mg jusqu'à 2 mg et
varient en fonction des pays
(voir Recommended Dai1y Allowances de 1983,
citées par MACHLIN,
1984).
En France les apports conseillés sont légèrement
supérieurs à ceux conseillés par la FAO/OMS (voir tableau 38).
Les apports consei 11 és en France sont du même ordre de grandeur
que ceux des autres pays européens.
Les
besoins
en
riboflavine
de l'organisme,
évalués
à partir
d'études expérimentales chez 1ladu1t~ et l'enfant sont définis conme étant la
valeur minimale qui empêche l'apparition de signes cliniques de carence et
donne une excrétion urinaire normale.
Le minimum requis dépend de la ration
alimentaire
; il est évalué à 0,5 mg pour 1000 calories pour un adulte et 0,6
mg pour 1000 calories pour un enfant (MACHLIN,
1984).
La valeur minimale de
riboflavine nécessaire à un adulte est estimé en moyenne à 1,7 mg / jour
(valeur calculée d'après le chiffre de 0,6 mg / 1000 calories).
Les femmes

-
150 -
enceintes
ont
besoin
de
plus. de
riboflavine
et
nécessitent
un
apport
supplémentaire de 0,3 mg par jour. Nous donnons dans le tableau 39 les apports
con sei 11 ês pour l a vi tami ne B2 par l' ORANA pour 11 Afri que,
par la FAO/OMS et
par 1e CNERNA .
Tableau 38
Apports journaliers en vitamine Bl estimés par le
FAO/OMS, le CNERNA et 1IORANA.
Personnes par
Besoins en vitamine Apports quotidiens Apports quotidiens
tranches d'âge
B1 en Afrique de
consei 11 és par
conseillés par le
110uest (ORANA)
FAO/OMS (mg/j)
. CNERilA (mg/ jour)
(mg/jour)
Enfants o - 1 an
0,4
0,7
0,4
Enfants 2 -
6 ans
0,6
Enfants ·7, .. 10 ,ans
,0,8·
Adolescents 11-14
l , l
l ,5
l ,3
, .Ado1escents 15 ..19.
1,4
Hommes et
femmes .adul tes
1,2
l ,5
l ,3
Femues enceintes
ou allaitantes
l ,4
l ,8
1,4
Il a été mi s en évi dence des réserves de vitami ne B2,
en très
faibles quantités,
dans le foie, la rate, le rein et le muscle cardiaque. Ces
réserves
restent
longtemps
stables,
même
en cas 'de carence
sévère
et
prolongée.
Les besoins en vitamine 83 de l'organisme sont estimés à partir du
taux de niacine libre.
On les exprime en équivalents-niacine.
Chez l'adulte,
ces besoins sont de l'ordre de 15 à 20 mg par jour,
soit environ 6,5 mg pour
1000 calories,
sans être jamais inférieurs à 13 mg par jour.
Ils sont très
augmentés pendant l a péri ode de l' ado l escence et chez les f'enmes pendant la

-
151
-
grossesse et la lactation.
Ces besoins sont satisfaits par la vitamine B3
contenue dans la ration alimentaire, mais aussi en très grande partie (environ
65 %) par la transformation dans l'organisme du L-trytophane fourni par les
protéines alimentaires en acide nicotinique. En effet, d'après les expériences
.
de KREHL en 1946,
50 mg de L-trytophane seraient équivalents à
l mg de
niacine.
Tableau 39
Apports journaliers en vitamine B2 estimés par
l'ORANA, la FAO/OMS et 1eCNERNA.
Personnes par
Besoins quotidiens Apports conseillés
Apports conseillés
tranches d'âges
ORANA (en mg/ j)
par OMS/FAO (mg/j) par le CNERNA (mg/j)
Enfants 0- l an
0,6
0,4
0,8
Enfants 2- 6 ans
0,9
Enfants 7-10 .ans·
l ,2
Adolescents 11-14
l ,6
Adolescents 15... 19
2, l
l ,7
1,8
HOlTITIes et
femmes adul tes .
·1 ,8
l ,7
1,8
FelTlTIes enceintes
ou a11 ai tantes
2, l
2,0
l ,8
Dans l'organisme il n'existe pas de réserve en vitamine B3.
Il
faut cependant tenir compte de la contribution du L-trytophane dans l'apport
en niacine.
Cette contribution peut être calculée pour une ration alimentaire
type d'une région bien déterminée.
Une des méthodes de détermination suppose
que la totalité des protéines renferme l % de L-trytophane et que 60 mg de L-
trytophane (d'après HANKES) (1984) peuvent fournir l mg d'équivalents-niacine.

-
152 -
"
Il n'est donc pas surprenant que les apports quotidiens conseillés
en vitamine B3 varient selon les régions et les habitudes alimentaires.
Nous
donnons dans le
tab l eau 40 l es
apports consei 11 ês en vitami ne B3 par
la
FAO/OMS, par l'ORANA et par le CNERNA.
Tableau·40
Apports journaliers en vitamine B3 estimés par
l'ORANA, le FAO/OMS et le CNERNA.
Personnes par
Besoins quotidiens Apports quotidiens
Apports quotidiens
tranches d'âge
de vitamine B3
conseillés par
conseillés parle
ORANA (mg/jour)
OMS/FAO (mg/jour)
CNERNA (mg/jour)
Enfants 0- l an
4
6,6
9
Enfants 2- 6 ans
6
Enfants 7""10 ans
8
Adolescents 11-14
11
21 , l
18
·Adolescents 15.,.19
14
Hommes et
femmes adultes
12
21 , l
18
Femme enceinte
11
23,8
20
Femme allaitante
50
23,8
20
D'une façon générale,
l es apports consei 11 és aussi bi en par le
FAO/OMS que par l a France,
sont supéri eurs aux besoi ns estimés par l' ORANA
pour l'Afrique sont relativement modestes à l'excepti.on de celui de la femme
allaitante qui est de 50 mg par jour.
Les besoins en vitamine B6 augmentent avec les régimes riches en
protéines.
L'estimation de ces besoins n'est pas actuellement résolue et de
nombreuses
études
lui
sont
consacrées.
On
n'a
pas
défi ni
d' unité
internationale pour la vitamine B6 et de ce fait les besoins sont exprimés en
unité de poids de chlorhydrate de pyridoxol en sachant qu'l mg de ce composé

-
153
-
correspond à 0,82 mg de pyridoxol,
à 0,82 mg de pyridoxamine et à 0,81 mg de
pyridoxal.
Dans les tables des "Recomrnended Daily Allowances" publiées aux
Etats-Unis,
les besoins quotidiens sont estimés,
pour un adulte exerçant une
activité moyenne,
à 2,0 mg calculés sur la base d'une ration alimentaire de
2600 à 2900 calories comportant 60 à'65 grammes de protéines.
Les apports quotidiens conseillés,
comrne les besoins,
sont très
diffici l es à fi xer car ils dépendent auss i de l a teneur en protéi nes de la
ration alimentaire.
La FAO,
l'OMS et l'ORANA nont pas conseillé de valeur
pour la vitamine 86.
LINKSWILER (1978) a proposé un apport quotidien de 1,5 à 2 mg de
vitamine 86 chez un adulte qui consomrne en moyenne 100 à 150 g de protéines et
à 1,5 mg si la consomrnation est inférieure à 100 g de protéines par jour. Afin
d'éviter la
difficulté qui consiste d'abord
à déterminer
la quantité de
prot ines dans la ration journalière avant d'estimer les apports,
certains
é
auteurs proposent des valeurs de vitamines 86 selon les tranches d'âges. Ainsi
entre 18 et 25 ans,
DRISKELL et al (1976) proposent un apport quotidien de
2,14 mg chez l'homrne et 1,26 mg chez la femrne.
CHISLEY et DRISKELL (1979)
proposent entre 19 et 59 ans,
1,83 mg pour l'homrne et 1,46 mg pour la f'emne ,
Quant à HAMPTON et al (1977),
ils consei 11 ent un apport journal i er de 1,46 mg
chez l' homrne et 1,06 mg chez l a femme et
l es personnes agées de plus de
60 ans.
En France,
ces apports quotidiens conseillés sont de 0,80 mg chez le
nourisson,
de 2,2 mg pour l'adulte et de 2,5 mg chez la femrne enceinte.
Certai ns pays n'ont pas pub lié d'apports quot i diens pour la vitami ne 86 et
pour les autres les écarts sont assez grands.
III. SATISFACTION DES APPORTS RECOMMANDES EN VITAMINES81, 82,
B3
ET 86 DANS L'ALIMENTATION SENEGALAISE.
Le rapport présenté par l 'ORANA en 1980 sur l'état nutritionnel de
la population du Sahel,
fait apparaître un grand déficit en vitamine 82 dans
l'alimentation des Sénégalais, quelle que soit leur région d'origine (moins de
50 % en moyenne de satisfaction des apports conseillés).
Le déficit en
vitamine 81 semble globalement moins important;
il est cependant très net
dans la région de Dakar (77 % de satisfaction des apports conseillés). Le taux
de satisfaction des apports conseillés en vitamine 83,
quant à lui,
est
toujours supérieur à 100 %. Celui de la vitamine 86 n'a pas été étudié.
Les chiffres donnés peuvent être critiqués.
En effet,
comrne nous
l'avons déjà signalé pour la vitamine C (voir page 137)ils ont été établis à

-
154
-
partir de table de composition d'aliments indiquant les teneurs en vitamines
des aliments à l'état frais ét à l'état sec,
très rarement à l'état cuit.
Si
l'on tient compte des pertes importantes en vitamines du groupe B que nous
avons observées lors de la cuisson des aliments (de l'ordre de 80 X),
il est
certain que les taux de satisfacFion réels doivent être plus faibles que ceux
qui ont été publiés dans ce rapport.
s
A titre d'information,
nous reproduisons dans le tableau 41 les
apports des divers aliments aux besoins en vitamines B1 et 82 tels qu'ils sont
donnés dans le rapport de l'ORANA.
Si l'on tient compte de la réserve faite
ci-dessus concernant les aliments cuits, les apports réels des divers aliments
ne sont sans doute pas exactement ceux donnés dans ce rapport.
Tableau 41
Apport des divers aliments aux besoins en vitamines
Bl et B2 de la population du Sénégal (Source ORANA).
Région
Tambacounda
Louga
Dakar
(Kedou "91u)
Aliments
B1
82
B1
B2
B1
B2
(en
%)
(en X)
(en
%)
Riz
-
-
22
8,5
32
12,0
Mil
33
23,5
30,5
18,5
8,5
-
Maïs
11
-
-
-
-
-
Blé
-
-
9,5
-
21,5
5
Légumineuses
36
16,5
21
-
-
-
Légumes
-
36;5
-
13,5
15,5
23
Poissons
-
-
-
16,0
11 ,5
17
Viandes
-
-
-
12,5
-
16
Lait
-
-
-
14,5
-
-
Autres
20
23,5
17
16,5
11
27
Le déficit
en vitamine
Bl
dans l'alimentation
est
cependant
évident puisque des cas de béribéri ont été observés au Sénégal.
Dans la
région de Dakar,
le déficit en vitamine Bl n'est pas surprenant car c'est
surtout dans les zones urbanisées que les Sénégalais utilisent comme céréale
de base le
riz
à
la
place
du
mi 1.
Ce
changement
dans
les
habitudes

-
155
-
alimentaires se traduit effectivement par une diminution notable des apports
en vitamines du groupe B (voir tableaux 30.
31.
32 et 33).
Il constitue une
double hérésie.
non
seulement
nutritionnelle mais
également économique.
puisque
le
Sénégal
ne
peut
produire
qu'une
très
faible
partie
de sa
consommation de riz.
Le déficit en vitamine B2 est prévisible du fait de la faible
teneur en cette vi tami ne dans tous 1es al i ments que nous avons étudi és et de
la consommation extrêmement limitée de produits laitiers par les Sénégalais.
Le fait que les tubercules (manioc.
patate douce) ne sont pas
mentionnés dans le tableau 41 n'a rien de surprenant.
Leur consommation n'est
pas très
importante et
1eurs teneurs en vitami nes B1
et B2 prati quement
négligeables (voir tableau 30 et 31).
La liste des aliments que nous avons étudiés n'est pas suffisament
comp1ète
pour
nous
permettre
de
mi eux
appréci er
1es
di vers
apports
alimentaires en vitamines du groupe 8.
Il manque en effet à notre liste la
viande.
le poisson,
les produits laitiers,
certains légumes et le pain.
Ce
dernier aliment à base de blé est très consommé en milieu urbain (même si le
blé est entièrement importé).
Les résultats que nous avons obtenus nous permettent de faire un
certain nombre de commentaires.
En
ce
qui
concerne
la
vitamine
81,
il
apparaît
que
les
légumineuses,
en dépit de pertes importantes à la cuisson,
constituent une
source indispensable en cette vitamine (ce qui ne semble pas être le cas des
céréales et surtout du riz).
Si l'arachide occupe déjà une place privilégiée
dans l'alimentation sénégalaise. il conviendrait sans doute d'encourager, afin
de diversifier l'alimentation.
la consommation des haricots (ntêbé ) ,
Les
fruits ne constituent pas une catégorie d'aliments pris en compte dans les
apports en vitamine B1.
Cependant des fruits comme le tamarin, le saba (made)
ou la datte du désert.
disponibles sur les marchés de Dakar à l'état frais de
juin à novembre et à l'état séché (pour le tamarin et la datte du désert)
durant toute l'année.
sont fort riches en vitamine Bl.
Il convient également
de ne pas oublier le souchet comestible.
cette tubercule que l'on consomme
crue. disponible une grande partie de.1 'année et dont 100 g apportent 44 % des
besoins journaliers.
Il apparaît donc que le déficit en vitamine Bl noté dans
la ration alimentaire du Sénégalais pourrait sans aucun doute être corrigé en
modifiant
très
légèrement ses
habitudes
culinaires
:
une
cuisson moins
prolongée
des
aliments.
une
réhabilitation
du
mil.
une
plus
grande
diversification de l'alimentation.
avec en particulier une consommation plus
importante de produits frais (comme les fruits).

-
156 -
La vitamine 82 pose un problème plus difficile à résoudre.
Nous
avons montré (voir tableaux 30 à 37) que dans les aliments étudiés (céréales,
légumineuses,
légume,
tubercules et fruits),
la vitamine 82 était toujours
présente,
mais en faibles quantités.
Ce déficit en fait ne pourrait être
compensé que par une augmentation i,mportante de la consonmati on des produits
laitiers,
négligeable
actuellement.
Il
est
vrai
que
pour des raisons
économiques la consommation de lait frais n'est pas envisageable dans tout le
pays.
Des efforts sont faits actuellement pour développer la production de
lait
caillé dont il
faudrait
aussi
encourager
la
consommation
par
les
Sénégalais.
L'apport en vitamine 83 dans l'alimentation sénégalaise semble
tout à fait satisfaisant.
Cette vitamine est relativement abondante dans les
tubercules et les légumineuses, même à l'état cuit. Dlaprès nos résultats, une
consommation trè$ modérée de fruits locaux serait largement suffisante à elle
seule pour couvrir les besoins.
En effet la consommation de 100 g de palmier
doum couvre 130 % des besoi ns en vitami ne 83,
alors que 1a consommati on de
100 g de goyave permet de couvrir 70 % de ces besoins.
Aucune étude nia jusqulà présent été entreprise sur le problème
nutritionnel posé par la vitamine 86.
Nous nous contenterons donc simplement
de rappeler que l'arachide peut apporter des quantités appréciables de cette
vitamine,
que parmi les céréales,
c'est encore une fois le mil qui est la
meilleure source (le riz en contient très peu par contre) et que les aliments
peu consonmés comme 1a datte du désert et 1e souchet comestib1e peuvent
contribuer de façon notable à la satisfaction des besoins en vitamine 86.

-
157 -
RESUME ET CONCLUSION
Le but de ce travail,
commencé dans le Laboratoire de Chimie Analytique
de la Faculté de Médecine et Pharmacie de Dakar (Sénégal) était de réaliser
une étude relativement complète de la composition en vitamines hydrosolubles
des aliments consommés en Afrique de l'Ouest et plus particulièrement au
Sénégal.
Il
semble
en
effet
exister
un
fort
déficit
en
vitamines
(essentiellement en vitamine Bl et en vitamine B2) dans la ration alimentaire
des habitants de ces régions.
Nous souhaitions donc d'une part apporter au
nutritionniste des données analytiques indispensables afin de lui
permettre
d'apprécier correctement les apports alimentaires en vitamines,
d'autre part
proposer
d'éventuelles
solutions
pour
remédier
à
cette
malnutrition
vitaminique.
Tout l'intérêt de cette étude résidait dans la qualité analytique des
résultats obtenus.
Or nous nous sommes
rapidement
rendus
compte que les
méthodes classiques de dosage des vitamines hydrosolubles (par titrimétrie,
photométrie,
fluorométrie ou microbiologie) étaient en général d'une grande
complexité
et
présentaient
souvent
une
sensibilité
insuffisante
ou
une
spécificité incertaine.
C'est la raison pour laquelle nous avons décidé dans
un premier temps de développer pour chaque vitamine une méthode de dosage
originale utilisant la chromatographie en phase liquide haute performance afin
de garantir la spécificité de nos résultats.
La mise au point de ces méthodes
a finalement occupé la plus grande partie du temps que nous avons consacrée à
notre thèse et a eu pour conséquence de nous f ai re veni r en France afi n de
pouvoir disposer d'un appareillage qui n'était malheureusement pas disponible
au Sénégal.
La première vitamine étudiée a été la vitamine C (acides L-ascorbique et
déhydro L-ascorbique).
Nous
avons
proposé
pour
le dosage
de l'acide
L-
ascorbique (dans le cas des aliments frais qui
ne contiennent
pas d'acide
déhydro L-ascorbique) deux méthodes chromatographiques,
l'une sur échangeurs
d'anions faibles,
l'autre par appariement d'ions.
La détection de l'acide L-
ascorbique se fait par UV à 265 nm.
Si l'on souhaite doser la vitamine C
totale (cas des aliments stockés ou ayant subi une transformation industrielle
et contenant donc de l'acide déhydro L-ascorbique),
la méthode est plus
complexe:
comme l'acide déhydro L-ascorbique n'absorbe pas dans le domaine
ultraviolet,
il
est
nécessaire
de 1.. réduire au préalable
en
acide
L-
,
ascorbique par la DL-homocystéine.
Ce procédé préconisé par DENNISON et al
(1981) ne nous a pas donné entière satisfaction puisque nous avons montré que
le
rendement de cette
réduction
n'était que de 50 % et qu'il
était donc

-
158 -
nécessaire d'introduire un coeffjcient de correction.
Par ailleurs nous avons
observé
qu'en
présence
de
OL-homocystéine,
seule
l'utilisation
de
la
chromatographie
par
appariement d'ions
permettait d'obtenir
un
temps
de
rétention
reproductible
pour
l'acide
L-ascorbique
et
devait
donc
être
recommandée pour le dosage de la vitamine C totale.
Cette méthode,
dont le
taux de recouvrement est voisin de 100 % et dont la limite de détection est de
0,1 mg %,
a été comparée lors d'analyses interlaboratoires réalisées dans le
cadre des activités de la Commission des Produits Diététiques et de Régime
(Direction de la Consommation), aux autres méthodes classiques de dosage de la
vitamine C. Seule la méthode fluorométrique à l 'orthophénylènediamine a permis
d'obtenir des résultats aussi satisfaisants.
Lorsque nous avons commencé .1 'étude des vitamines du groupe B (Bl ,
B2,
B3 et B6), nous avons tout d'abord pensé proposer une méthode unique de dosage
pour l'ensemble des vitamines.
Si cela est envisageable lorsqu'on utilise des
solutions étalons,
cela ne l'est plus lorsqu'on a affaire à des échantillons
réels.
Nous avons rapidement admis qu'il était plus raisonnable de mettre au
point
des méthodes de dosage différentes pour chaque vitamine,
tout en
essayant dans la mesure du possible,
d'utiliser des méthodes d'extraction ou
des conditions chromatographiques identiques pour certaines vitamines.
Pour ce qui est des vitamines Bl (thiamine),
B2 (riboflavine) et B3
(acide nicotinique et nicotinamide),
nous avons pu proposer la même technique
d'extraction:
une hydrolyse chlorhydrique afin de libérer les vitamines de
leurs liaisons avec les protéines et une hydrolyse enzymatique par un mélange
B amylase -takadiastase destinée plus particulièrement à rompre les liaisons
phosphates-vitamines.
La vitamine Bl doit en plus être oxydée en thiochrome
pour pouvoir
par la
suite être
détectée
par
fluorescence.
L'hydrolyse
enzymatique préconisée ci-dessus n'a pu être utilisée pour l'extraction de la
vitamine B6.
Elle ne permet pas en effet de rompre l'ensemble des liaisons
phosphates et introduit dans le milieu réactionnel de nombreuses impuretés qui
perturbent ensuite la difficile séparation chromatographique des trois formes
(pyridoxol,
pyridoxal et pyridoxamine)
sous lesquelles peut se trouver la,
vitamine B6.
L'utilisation d'une phosphatase acide nous a permis d'obtenir de
bien meilleurs résultats (cette enzyme s'était révélée par contre beaucoup
moins efficace que le mélange takadiastase- B amylase pour l'extraction des
vitamines Bl et 82).

-
159 -
Pour ce qui est de l'isolement chromatographique des vitamines,
nous
avons,
dans tous les cas,
eu recours à des phases stationnaires sur supports
greffés en phase inverse.
Pour les vitamines Bl et B2,
nous avons choisi une
phase stationnaire classique de granulométrie 10 ~m
et une même phase mobile
constituée d'un mélange de méthanol et d'acétate de sodium (à pH 4,5).
Quelle
que soit la nature des aliments analysés,
nous avons toujours obtenu dans ces
conditions un excellent isolement de ces vitamines.
Les vitamines 83 et B6
nous ont posé des problèmes analytiques plus complexes à résoudre. La présence
dans l es chromatogrammes de nombreuses substances i nterférantes nous a conduit
à utiliser pour l'isolement de ces vitamines, une phase stationnaire de faible
granulométrie (5 ~m) afin d'obtenir une résolution suffisante. Néanmoins, même
avec une telle phase stationnaire,
il ne nous a pas été possible de doser
simultanément les
deux formes
(acide
nicotinique et
nicotinamide)
de
la
vitamine
B3.
Nous
avons
utilisé
dans
les
deux
méthodes
proposées
la
chromatographie par appariement d'ions.
Nous avons ajouté à la phase mobile
(méthanol-acétate de sodium à pH 4,5) un anion heptanesulfonate pour le dosage
de la nicotinamide,
un anion cétyltriméthylammonium pour le dosage de l'acide
nicotinique.
Le fait d'avoir à doser séparément l'acide nicotinique et la
nicotinamide n'est
pas toujours
un inconvénient
car dans
la plupart des
aliments,
la vitamine B3 n'est pas présente simultanément sous ses deux
formes.
En ce qui concerne la vitamine B6,
il a été possible d'isoler les
trois formes -pyridoxamine,
pyridoxal,
pyridoxol - en une seule opération
chromatographique et avec une résolution suffisante.
La phase mobile est un
mélange acétonitrile-phosphate monopotassique (pH 2,5) contenant de l'acide
heptanesulfonique.
Pour toutes les vitamines,
à l'exception de la vitamine B3,
nous avons
utilisé un système de détection par fluorescence.
Il permet d'obtenir pour le
dosage de la vitamine B2,
une limite de détection extrêmement basse,
de
l'ordre de 0,001 mg %.
Cette limite de détection est un peu plus élevée pour
la vitamine Bl (sous forme de thiochrome) (0,01 mg %) et pour les différentes
formes de la vitamine B6 (0,01 mg % pour le pyridoxamine, 0,02 mg % pour le
pyridoxal et 0,04 mg % pour le pyridoxol).
COlTIne la nicotinamide et l'acide
nicotinique ne fluorescent pas,
seul un détecteur par absorption UV peut être
utilisé.
De ce fait la limite de détection de ces composés qui ont un
coefficient d'extinction moléculaire relativement bas,
n'est pas excellente
(0,2 mg X).
Cela ne constitue pas un inconvénient majeur car les teneurs en
vitamine B3 des aliments sont en général très élevées.

-
160 -
Le
taux
de
recouvrement
des
différentes
méthodes
que
nous
avons
proposées pour le dosage des vitamines du groupe B varie de 95 à 100 % suivant
la nature des aliments étudiés.
Ayant ainsi à notre dtspost tf on un ensemble de méthodes de dosage des
vitamines Bl, B2, 83 et 86, simples, spécifiques et de bonne sensibilité, nous
avons procédé à l'analyse d'un
certain
nombre d'aliments originaires
du
Sénégal.
Pour des raisons pratiques
liées à l'éloignement des lieux de
prélèvement et d'analyse,
nous nous somnes limités à l'étude de 29 fruits,
5 céréales (riz,
mais,
mil,
sorgho,
fonio),
4 tubercules (manioc,
patate
douce,
diabéré,
souchet comestible),
2 légumineuses (haricot (ntêbê ) et
arachide) et 1 légume (chou pomnë l ,
ces aliments à l'exception des fruits
constituant la base de l'alimentation .d'origine végétale du Sénégalais.
En ce
qui concerne les aliments consomnés cuits,
nous avons bien entendu procédé à
une analyse vitaminique avant et après cuisson,
en respectant scrupuleusement
les méthodes de préparation des aliments en usage au Sénégal.
Nous avons
observé que la cuisson des aliments, toujours très longue,
provoquait des
pertes vitaminiques extrémement importantes (de l'ordre de 80 % en moyenne).
Les céréales,
qui,
à l'exception du riz blanchi,
contiennent des quantités
appréciables de vitamines B à l'état cru,
perdent pratiquement toutes leurs
vitamines à la cuisson. Seul le mil conserve des quantités non négligeables de
vitamines B.
Les légumineuses,
en dépit de pertes vitaminiques également
importantes à la cuisson, constituent néanmoins la source la plus intéressante
en vitamine
Bl,
B2
et B6.
L'apport
vitaminique B des
tubercules
est
pratiquement négligeable.
Il faut
cependant faire
une exception pour un
tubercule peu connu, le souchet comestible, qui consommé cru peut apporter des
quantités
importantes
de
vitamine
Bl
(0,50
mg
%)
et
de
vitamine
B6
(0,38 mg %).
Le déficit important observé dans la ration alimentaire du Sénégalais en
vitamines Bl,
62 et même en vitamine C dans certaines régions le long du
fleuve
Sénégal (l a vitami ne B6 nia pas été étudi êe)
ne résul te pas d' une
sous-alimentation mais d'une malnutrition. Et l'évolution actuelle n'est guère
favorable
puisque les
Sénêgalais
remplacent
de plus
en
plus
dans leur
alimentation le mil par le riz blanchi et le pain blanc. C'est évidemment très
déforable sur le plan vitaminique,
mais également catastrophique sur le plan
économique puisque le Sénégal
ne produit qu'une très faible partie de sa
consommation de riz et que le blé ne pousse pas sur son sol.

-
J 6 J
-
Les éventuelles
solutions à ces
carences
vitaminiques
sont
surtout
diététiques.
Il faudrait d'abord pouvoir réaliser à l'intérieur du Sénégal un
meilleur
échange
des
productions
alimentaires
afin
de
diversifier
l'alimentation des habitants.
Il est anormal qu'il y ait pléthore de fruits à
Dakar et qu'il y ait des carences e~ vitamine C le long du fleuve Sénégal.
Il
faudrait à nouveau favoriser la consommation du mil et réduire celle du riz et
du pain blanc,
mais cela semble impossible à l'heure actuelle:
des essais
d'introduction sur le marché d'un pain contenant 25 % de mil (donc de couleur
légèrement grise) se sont soldés par un échec complet.
Il faudrait essayer de
modifier les habitudes culinaires de la ménagère sénégalaise,
en particulier
en ce qui concerne les modes de cuisson,
mais cela semble difficile à court,
et même à moyen terme. La cuisson "nouvelle cuisine" ne correspond pas au goût
des Sénégalais.
Il faudrait également encourager la consommation des produits
laitiers,
afin d'apporter au Sénégalais les quantités nécessaires de vitamine
82 qu 1 il ne peut pas trouver,
nous l'avons montré,
dans 1e reste de son
alimentation d'origine végétale. Or, actuellement, le Sénégalais consomme très
peu de produits laitiers.
Il reste aussi à conseiller la consommation des
fruits au Sénégalais.
Or, les fruits récoltés au Sénégal ne sont pratiquement
consommés que par les
enfants.
Ces fruits,
qui sont les seuls aliments
consommés
crus,
constituent pourtant
une
source importante de vitamines
hydrosolubles. Source de vitamine C bien entendu, puisqu'une dizaine de fruits
très courants ont une teneur en
vitamine C supérieure à 20 mg %,
mais
également de vitamine 81 (dans le tamarin,
le saba,
la datte du désert),
de
vitamine 83 (en quantités extrêmement élevées dans une dizaine de fruits) et
en vitamine
B6 (dans la datte du désert).
Il
peut d'ailleurs
paraître
surprenant à une époque où de nombreux pays afri cai ns cherchent,
pour des
raisons à la fois politiques et économiques,
à réduire leurs importations de
médicaments
et
d'aliments,
que
l'on
continue
à
importer
en quantités
importantes des fruits et des médicaments à base de vitamine C,
âlors que la
consommation de 100 g de détar équivaut à la prise de 2 comprimés de vitamine
C dosés à 500 mg.
De même le pain de singe (fruit du baobab) qui est
disponible dans tout le pays, est capable à lui seul de couvrir les besoins en
vitamine C des Sénégalais.
l}
- - - - - - - - - - - - - - -

ANNEXE l

1 i
$.mt.
l
REACTIFS ET MATERIELS
r. Réactifs
Les solvants utilisés pour la chromatographie en phase liquide haute
performance sont des produits MERCK :
-méthanol pour chromatographie (Lichroso1v) : les pourcentages
de
transmission sont garantis pour la détection en ultraviolet
(20 %à 210 nm, 80 % à 235 nm et 98 % à partir de 260 nm).
-acétonitri1e pour chromatographie (Lichroso1v) : les pourcentages
de transmission sont garantis pour la détection en ultraviolet
(90 % à 205 nm, et 98 % à partir de 225 nm).
Les enzymes utilisées sont les suivantes
- la takadiastase (origine: Aspergillus oryzae) (SERVA) qui
représente plus de trente fonctions enzymatiques différentes. Elle
titre entre autres: 20 U/ mg de~-amy1ase et 31 U/ mg de
B
amy1 ase.
- la B amylase (origine: orge) (MERCK) - Elle titre 50 U/ mg et
possède comme acti vités étrangères une foncti on 0( amy1 asi que et
phosphatasique acide.
- la phosphatase acide (origine: pomme de terre) (SERVA). Elle titre
50 U/ mg.
Tous les autres réactifs sont des produits MERCK pour analyses ou
PRO LABO R.P. à l'exception de :
Acide déhydro L-ascorbique (CARL-ROTH)
Chlorhydrate de pyridoxa1 (FLUKA)
Dich10rhydrate de pyridoxamine (SERVA)
Polyamide (WOELM PHARMA)

I I
Il. Matériels
A.Matérielcourant de laboratoire dont
pH-mètre METROHM
Agitateur magnétique chauffant M211 MOZAT
Etuve MEMMERT
B.Matérielutilisépour le tracé de spectres d'absorption
ultraviolets·et d'émissionde fluorescence
Spectrophotomètre UV-visible .Techtron 534 VARIAN
Spectrophotomètre Cary 219 VARIAN
Spectrofluorimètre MPF 66 PERKIN ELMER couplé à un ordinateur 7500
Professional Computer PERKIN ELMER
C.Matériel utilisé pour le dosage fluorométrique de la vitamine
C.
Mélangeur de tubes à hémolyse CEN Co-Instrument b.v.
Spectrofluorimètre JOBIN YVON 3C et 3D
D. Matériel utilisé pour le dosage titrimétrique de l'acide
L-ascorbi que.
Memotitrator DL 40 METTLER
Imprimante GA 40 METTLER
Electrode de platine combinée pour titrage rédox DM 140 METTLER
E. Matériel utilisé pour le dosage de la vitamine C par
chromatographie sur couches minces (méthode CEE).
Appareil de dépôts pour chromatographie sur couches minces LINOMAT
III CAMAG
Plaques de chromatographie Kieselgel GO 20 x 20 MERCK

I I I
F. Matériel utilisé en chromatographie en phase liquide haute
performance.
1) Pompes et i nj ecteu rs.

Modèle 6000 A WATERS
Modèle 55
WATERS
LMC Système
MERCK
LC-5A
SHIMADZU
SP-8700
SPECTRA PHYSICS
2) Systèmes de détection
Détection par absorption ultraviolette
Détecteur UV modèle 440 WATERS
Détecteur spectrophotométrique UV SPD-6A SHIMADZU
Détection par absorption ultraviolet-visible:
Détecteur SP 8400 UV/Vis SPECTRA PHYSICS
Détecteur à photodiode WATERS 990 couplé à un microordinateur
APC II I-NEC.
Détection par émission fluorescence
Spectrofluoromètre JOBIN 3C et 3D
Détection électrochimique
Polarographe TACUSSEL avec un système à trois électrodes
-électrode de travail en carbone vitreux
-électrode de référence Ag C1 2/Ag
-électrode auxilliaire (ou contre électrode) en platine
3) Systèmes d'intégration e~ d'enregistrement.
ENICA 10 et 21 DELSI
Intégrateur SP 4100 SPECTRA PHYSICS
I~R-18 INTERSMAT
OMNI-Scribe TM HOUSTON INSTRUMENT

IV
4) Système de filtratio~ et de purification.
Membrane de cellulose régénérée et d'acétate de cellulose
(0,2 et 0,4 ~) MILLIPOR~
Cartouche Sep Pak C 18 MILLIPORE
Système de filtration D 3400 type 16.316 SARTORIUS

ANNEXE 2

v
DOSAGE DE LA VITAMINE Bl (THIAMINE) DANS LES ALIMENTS PAR
CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE
1. Définition et domaine dlapplication
La teneur en vitamine Bl (thiamine) dans les aliments est le résultat
obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après.
2. Principe
Extraction de la thiamine par hydrolyses acide et enzymatique. Puis
oxydation de la thiamine en thiochrome par le ferricyanure de potassium.
Dosage du thiochrome par fluorométrie après isolement de ce composé par
chromatographie liquide haute performance en phase inverse.
3. Réactifs
Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée est
de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.
3.1
Solution environ 0,1 Mdiacide chlorhydrique
3.2
Solution 2,5 Md'acétate de sodium
3.3
B amylase
3.4
Takadiastase
3.5
Solution à l p. cent (rn/v) de ferricyanure de potassium (se
conserve une semaine à + 4° Cl.
3.6
solution à 15 p. cent (rn/v) d'hydroxyde de sodium
3.7
Solution oxydante (préparer extemporanément) : ajouter l ml de la
solution de ferricyanure de potassium (3.5) à 24 ml de la solution
d'hydroxyde de sodium (3.6)(ces proportions peuvent être
éventuellement modifiées si nécessaire).
3.8
Méthanol (qualité pour ch~omatographie)
3.9
Solution 0,05 Md'acétate de sodium
3.10 Phase mobile: mélange 30/70 (v/v) de méthanol (3.8) et d'acétate
de sodium (3.9) ajusté à pH 4,5
3.11 Solution éluante : mélange 70/30 (v/v) de méthanol (3.8) et d'eau
3.12 Chlorhydrate de thiamine (vitamine Bl)
3.13 Solution étalon-mère de vitamine Bl (lmg/ml). Peser exactement

VI
environ 50 mg de vitamine Bl (3.12) dans un bécher et ajouter 40 ml
d'eau. Transvaser dans une fiole jaugée de 50 ml et ajuster avec de
l'eau.
4. Appare i 11 age
Matériel de laboratoire et notamment
4.1 Mixeur-broyeur
4.2 Bain d'eau
4.3 pH-mètre
4.4 Etuve à 37° C
4.5 Cartouche Sep Pak C 18 ou équivalent
4.6 Membrane dlacétate de cellulose 0,2
m
4.7 Appareil de chromatographie liquide haute performance avec détection
par fluorométrie
4.8 Colonne contenant une phase inverse greffée de type octadécylsilane
(longueur 30 cm et diamètre intérieur 4 mm)
5. Mode opératoire
5.1 Préparation de l'échantillon pour essai
Homogénéiser l'échantillon après l'avoir broyé finement et
rapidement (si nécessaire). Peser exactement environ Mg de cet
échantillon dans un erlenmeyer de 250 ml (M de l'ordre de 5g pour
un échantillon contenant approximativement 0,8 mg % de vitamine Bl).
Ajouter 65 ml de la solution diacide chlorhydrique (3.1) et mettre
au bain d'eau à 100° C pendant 30 minutes. Refroidir et ajuster à
pH 4,5 par addition d'acétate de sodium (3.2)". Ajouter ensuite 50 mg
de B amylase et 500 mg de takadiatase avec un peu d'eau. Agiter.
Mettre à l'étuve à 37° C p~ndant une nuit. ~ransvaser
quantitativement dans une fiole jaugée de 125 ml et ajuster avec de
l'eau. Filtrer le surnageant.
Mettre 1 ml du filtrat obtenu dans un bécher de 15 ml. Ajouter 3 ml
de la solution oxydante (3.7). Agiter puis laisser au repos une
minute exactement. Faire passer cette solution ainsi que les eaux

VII
de lavage sur une cartouche Sep Pak C 18 (conditionnée par passage
de 2 ml de méthanol (3.8) et 5 ml d'eau). laver la cartouche avec 2
fois 5 ml d'acétate de sodium (3.9) puis éluer avec 8 ml de la
solution (3.11). Compléter à 10 ml avec cette méme solution et
filtrer sur membrane d'acétate de cellulose (solution échantillon à
injecter dans le chromatographe).
5.2 Préparation des étalons
Faire une dilution au 1/500ème avec de l'eau de la solution étalon-
mère (3.13). Prélever exactement 0,1 ; 0,3 et 0,5 ml de la solution
obtenue et les introduire dans les béchers de 15 ml. Ajouter dans
chaque bécher 3 ml de la solution oxydante (3.7). Agiter puis
laisser au repos une minute exactement. Faire passer ces solutions
ainsi que leurs eaux de lavage sur des cartouches Sep Pak C 18
conditionnées.
laver les cartouches avec 2 fois 5 ml d'acétate de sodium (3.9) puis
éluer avec 8 ml de la solution (3.11). Compléter à 10 ml avec cette
méme solution et filtrer chaque solution étalon sur membrane
d'acétate de cellulose (solutions étalons à injecter dans le
chromatographe contenant respectivement 0,02 ; 0,06 et 0,10
g de
vitamine Bl par ml).
5.3 Conditions chromatographiques
Débit de la phase mobile:
ml/mn
Détection par fluorescence
longueur d'onde d'excitation 366 nm
longueur d'onde d'émission 435 nm.
Volume injecté: 20 ~l

VIII
6. Expression des résultats.
6. l Mode de calcul et formule
Soit x la quantité de vitamine Bl (exprimée en ~g) contenue dans lml
de la solution injectée dans le chromatographe (valeur obtenue à
l'aide de la courbe d'étalonnage).
La teneur en vitamine Bl (chlorhydrate de thiamine) de l'échantillon
à analyser (exprimée en mg/100g) est donnée par la relation:
125 . x
M
6.2 Répétabilité
La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées
simultanément ou successivement par le même analyste ne doit pas excéder 0,03
mg % lorsque la teneur en vitamine Bl de l léchantillon à analyser est voisine
de 0,60 mg %. Pour des aliments trés riches en vitamine Bl (teneur voisine de
4 mg %) cette différence peut atteindre 0,15 mg %.

IX
DOSAGE DE LA VITAMINE B2 (RIBOFLAYINE) DANS LES ALIMENTS PAR CHROMATOGRAPHIE
EN PHASE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE
1. Définition et domaine d'application
La teneur en vitamine B2 (riboflavine) dans les aliments est le
résultat obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après.
2. Principe
Extraction de la riboflavine par hydrolyses acide et enzymatique et
dosage de ce composé par f1uorométrie après isolement par
chromatographie liquide haute performance en phase inverse.
3. Réactifs
Les réactifs doivent ètre de qualité analytique. L'eau utilisée est
de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.
3.1
Solution environ 0,1 Md'acide chlorhydrique
3.2
Solution 2,5 Md'acétate de sodium
3.3
B Amylase
3.4
Takadiastase
3.5
Méthanol (qualité pour chromatographie)
3.6
Solution 0,05 Md'acétate de sodium (pH 4,5)
3.7
Phase mobile: mélange 30/70 (v/v) de méthanol (3.5) et d'acétate
de sodium (3.6) (ces proportions peuvent ètre éventuellement
modifiées si nécessaire).
3.8
Vitamine B2 (riboflavine)
3.9
Solution 0,02 Md'acide acétique
3.10 Solution étalon-mère de vitamine B2 (0,1 mg/ml). Peser exactement
environ 50 mg de riboflavine dans un er1enmeyer de 500 ml. Ajouter
400 ml d'acide acétique 0,02 M (3.9). Agiter à l'aide d'un
agitateur magnétique chauffant jusqu'à diss61ution de la vitamine
B2 (environ 1 heure). Refroidir la solution et amener le pH à 4,5
avec la solution d'acétate de sodium (3.2). Transvaser dans une
fiole jaugée de 500 ml et ajuster avec de l'eau.

x
4. Appareillage
Matériel courant de laboratoire et notamment
4.1 Mixeur-broyeur
4.2 Bain d'eau
4.3 pH-mètre
4.4 Etuve à 37° C
4.5 Agitateur magnétique chauffant
4.6 Membrane d'acétate de cellulose 0,2 ~m
4.7 Appareil de chromatographie liquide haute performance avec détection
par f1uorométrie
4.8 Colonne contenant une phase inverse greffée de type octadécy1si1ane
(longueur 30 cm et diamètre intérieur 4 mm).
5. Mode opératoire
5.1 Préparation de l'échantillon pour essai.
Homogénéiser l'échantillon après l'avoir broyé finement et
rapidement (si nécessaire). Peser exactement environ Mg
d'échantillon dans un er1enmeyer de 250 ml (M de l'ordre de 5g pour
un échantillon contenant approximativement 0,8 mg %de vitamine B2).
Ajouter 65 ml de la solution d'acide chlorhydrique (3.1) et mettre
au bain d'eau à 100° C pendant 30 minutes. Refroidir et ajuster à
pH 4,5 par addition d'acétate de sodium (3.2). Ajouter ensuite 50 mg
de B amylase et 500 mg de takadiastase avec un peu d'eau. Agiter.
Mettre à l'étuve à 37° C pendant une nuit. Transvaser
quantitativement dans une fiole jaugée de 125 ml et ajuster avec de
l'eau. Filtrer le surnageant (solution à injecter dans le
chromatographe).
5.2 Préparation des étalons
Faire des dilutions au l/lOOème, au 1/200ème et au 1/500ème avec de
l'eau de la solution étalon-mère (3.10) et filtrer les solutions
obtenues sur membrane d'acétate de cellulose (4.6) (solutions
étalons à injecter dans le chromatographe et contenant

Xl
respectivement 1,00 ; 0,5â et 0,20 ~g de vitamine B2 par ml).
5.3 Conditions chromatographiques
Débit de la phase mobile :'1 ml/minute
Détection par fluorescence: longueur d'onde d'excitation 422 nm
longueur d'onde d'émission 540 nm
Volume injecté: 20 ~l
5.4 Remarque: toutes les opérations analytiques doivent étre réalisées
avec de la verrerie brune ou, à défaut, à l labri de la lumière
solaire directe.
6. Expression des résultats
6.1 Mode de calcul et formule
Soit x la quantité de vitamine B2 (exprimée en ~g) contenue dans
ml de la solution injectée dans le chromatographe (valeur obtenue
à l'aide de la courbe d'étalonnage).
La teneur en vitamine 82 de l'échantillon à analyser (exprimée en
mg/ 100 g) est donnée par la relation
12,5 . x
M
6.2 Répétabilité
La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées
simultanément ou succéssivement par le méme analyste ne doit pas excéder 0,03
mg % lorsque la teneur en vitamine 82 de l'échantillon" à analyser est voisine
de 0,60 mg %. Cette différence peut atteindre 0,15 mg % pour des aliments
riches en vitamine 82 (teneur de l'ordre de 4 mg X).

XII
DOSAGE DE L'ACIDE NICOTINIQUE DANS CES ALIMENTS PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE
LI QU IDE HAUTE PERFORMANCE
1. Définition et domaine d'application
La teneur en acide nicotinique dans les aliments est le résultat
obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après.
2. Principe
Extraction de l'acide nicotinique par hydrolyses acide et enzymatique
et dosage de ce composé par photométrie à 260 nm après isolement par
chromatographie en phase liquide haute performance en phase inverse.
3. Réactifs
Acétate de sodium 0,05 Met 2,5 M
Acide chlorhydrique environ 0, l M
B amylase
Bromure de cétyltriméthylammonium
Methanol (qualité pour chromatographie)
Takadiastase
Acide nicotinique
4. Apparei 11 age
Mixeur-broyeur
Bain d'eau
pH-mètre
Etuve à 37° C
Appareil de chromatographie en phase liquide haute performance avec
détection par absorption ultraviolette.
5. Conditions opératoires
Colonne contenant une phase inverse greffée de type octadécylsilane
de 10 ~ de granulométrie (longueur 30 cm et diamètre 4 mm).

XIII
Phase mobile: mélange ~O ~ 50 (v/v) de méthanol et d'acétate de
sodium 0,05 M (pH 4,5) contenant le bromure de céty1triméthy1ammonium
0,0005 M.
débit: 0,8 ml / mn.
détection par absorption ultraviolette à une longueur d'onde de
260 nm
Volume injecté : 20 ~1
Etalonnage externe
6. Mode opératoire
Préparation de l'échantillon pour essai
Homogénéiser l'échantillon après l'avoir broyé finement. Peser
exactement environ Mg d'échantillon dans un er1enmeyer de 250 ml (M
de l'ordre de 5 à 10 g). Ajouter 65 ml de la solution d'acide
chlorhydrique 0,1 Met mettre au bain d'eau à 100 0 C pendant 30
minutes. Refroidir et ajuster à pH 4,5 par addition d'acétat~ de
sodium 2,5 M. Ajouter ensuite 50 mg de B amylase et 500 mg de
takadiastase avec un peu d'eau. Agiter. Mettre à l'étuve à 37 0 C
pendant une nuit. Transvaser quantitativement dans une fiole jaugée
de 125 ml et ajuster avec de l'eau distillée. Filtrer le surnageant
(solution à injecter dans le chrommatographe).
Préparation des étalons
Préparer une solution étalon mère diacide nicotinique à 100 mg/1.
Faire des dilutions au 1/10e, au 1/20e et au 1/50e avec de l'eau et
filtrer les solutions obtenues sur membrane d'acétate de cellulose
0,2 ~(solutions étalons à injecter et contenant respectivement 10 ; 5
et 2 ~g d'acide nicotinique par ml).
7. Expression des résultats
Soit x la quantité d'acide nicotinique (exprimé en
g) contenu dans 1
ml de la solution injectée dans le chromatographe (valeur obtenue à
l'aide de la courbe d'étalonnage). La teneur en acide nicotinique de
l'échantillon (exprimée en mg %) donnée par la relation:
12,5 . x
M

XIV
DOSAGE DE LA NICOTINAMIDEDANS LES ALIMENTS PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE
LI QU 1DE HAUTE PERFORMANCE
1. Définition et domaine d'application
La teneur en nicotinamide dans les aliments est le résultat obtenu
par l'application de la méthode décrite ci-après.
2. Principe
Extraction de la nicotinamide par hydrolyses acide et enzymatique et
dosage de ce composé par photométrie à 260 nm après isolement par
chromatographie en phase liquide haute performance en phase inverse.
3. Réactifs
Acétate de sodium 0,05 Met 2,5 M
Acide chlrohydrique environ 0, l M
Acide heptanesulfonique
B amyl ase
Méthanol (pour chromatographe)
Nicotinamide
Takadi astase
4. Appareillage
Mixeur broyeur
Bain d'eau
pH-mètre
Etuve à 37° C
Appareil de chromatographie en phase liquide haute performance avec
détecteur par absorption ultraviolette.
5. Conditions
Colonne contenant une phase inverse greffée de type octadécylsilane
de 5 ~m de granulométrie (longueur 250 cm et diamètre intérieur 4 mm).

xv
Phase mobile: mélange 10 : 90 (v/v) de méthanol et d'acétate de
sodium 0,05 M (pH 4,5) contenant l'acide heptanesulfonique 0,0005 M.
débit : l ml / mn.
détection par absorption ultraviolette à une longueur d'onde de
260 nm.
Volume injecté: 20 ~l
Etalonnage externe
6. Mode opératoire
Préparation de l'échantillon pour essai
Homogénéiser l'échantillon après l'avoir broyé finement. Peser
exactement environ Mg (M de l 'ordre de 5 à 10 g) d'échantillon dans
un erlenmeyer de 250 ml. Ajouter 65 ml de la solution d'acide
chlorhydrique 0,1 Met mettre au bain d'eau à 100 0 C pendant 30
minutes. Refroidir et ajuster à pH 4,5 avec la solution d'acétate de
sodium 2,5 M. Ajouter ensuite 50 mg de B amylase et 500 mg de
takadiastase avec un peu d'eau. Agiter. Mettre à l'étuve à 37 0 C
pendant une nuit. Transvaser quantitativement dans une fiole jaugée
de 125 ml et ajuster avec de l'eau distillée. Filtrer le surnageant
sur papier plissé en éliminant les 10 premiers ml. Filtrer 5 ml sur
membrane d'acétate de cellulose 0,2 ~ (solution à injecter dans le
chromatographe).
Préparation des étalons
Préparer une solution étalon mère de nicotinamide à 100 mg/l. Faire
des dilutions au l/lOème, au 1/20ème et au 1/50ème avec de l'eau
distillée et filtrer les solutions obtenues sur membrane d'acétate de
cellulose 0,2 ~ (solutions é~alons à injecter dans la colonne
contenant respectivement 10, 5 et 2 ~g de nicotinamide par ml).

XVI
7. Expression des résulta~s
Soit x la quantité de nicotinamide (exprimée en ~g) contenue dans
l ml de la solution injectée dans le chromatographe (valeur obtenue à
l'aide de la courbe d'étalonnage).
La teneur en nicotinamide de l'échantillon (exprimée en mg %) est
donnée par la relation :
12,5 . x
M

XVII
DOSAGE DE LA· VITAMINE 86 (PYRIDOXOL, PYRIDOXAL, PYRIDOXAMINE) DANS LES
ALIMENTS PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE
1. Définition et domaine d'ap~lication
La teneur en vitamine 86 (pyridoxamine, pyridoxal et pyridoxol) dans
les aliments est le résultat obtenu par l'application de la méthode
décrite ci-après.
2. Principe
Extraction des trois formes de la vitamine 86 par hydrolyses acide et
enzymatique. Dosage de ces composés par fluorométrie après isolement
par chromatographie en phase liquide haute performance en phase
inverse.
3. Réactifs
Les réactifs doivent étre de qualité analytique. L1eau utilisée est
de lleau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.
Acétate de sodium 0,05 Met 2,5 M
Acétonitrile
Acide heptane sulfonique (Pic B7)
Acide chlorhydrique environ 0, l N
Acide trichloroacétique à 50 %
Chlorhydrate de pyridoxal
Chlorhydrate de pyridoxol
Dichlorhydrate de pyridoxamine
Dichlorométhane
Phosphate monopotassique 0,05 M
Phosphatase acide

XVIII
4. Appareillage
Mixeur-broyeur
Etuve à 37° C
Autoclave
pH-mètre
Chromatographe en phase liquide avec détecteur par fluorométrie.
5. Conditions opératoires
Colonne contenant une phase inverse greffée de type octadécylsilane
de faible granulométrie (5 pm). (longueur 250 cm, diamètre intérieur
4mm) •
Phase mobile: mélange 4 : 96 (v/v) d'acétonitrile et de phosphate
monopotassique 0,05 M à pH 2,5 contenant de l'acide heptane
sulfonique à 0,5 .10- 3 M.
Débit: 0,8 ml/mm
Détection par fluorescence avec
À excitati on
290 nm
À émission
395 nm
volume injecté: 20 ~l
Etalonnage externe
6. Mode opératoire
a) Préparation des échantions
Peser 5 à 10 g d'échantillon finement broyé. Ajouter 50 ml de la
solution d'acide chlorhydrique 0,1 N et mettre au bain d'eau à
100 0 C pendant 30 minute~. Refroidir et ajuster le pH à 4,5 avec
la solution d'acétate de sodium 2,5 M. Ajouter 20 mg de
phosphatase acide. Mettre à l'étuve à 37° C pendant deux heures.
Ajouter 2 ml d'acide trichloroacétique à 50 %. Agiter
vigoureusement et mettre au bain d'eau à 100° C pendant 5 minutes.
Laisser refroidir à température ambiante. Ajouter 3 ml de
dichlorométhane (pour éliminer les lipides). Retirer la phase

XIX
huileuse. Compléter à 100 ml avec de l'eau distillée. Mélanger
puis filtrer sur papier plissé en éliminant les 10 premiers ml.
Prélever 5 ml et filtrer sur membrane d'acétate de cellulose
0,2 ~ (solution d'échantillon à injecter dans le chromatographe).
b) Préparation
des étalons
Il est nécessaire de préparer des solutions étalons de
pyridoxamine, de pyridoxal et pyridoxol. La préparation est
identique pour chacun des trois composés: préparer d'abord une
solution mère à 100 mg/l pour chaque composé. Ensuite faire des
dilutions au l/lOOe, 1/200e et 1/500e pour obtenir des solutions
étalons respectivement à l ~g/ml, à 0,5~g/ml et à 0,2~/ml.
Filtrer sur membrane d'acétate de cellulose 0,2 ~ (solution étalon
à injecter pour chacun des trois composés).
7. Expression et résultats
Soit x la quantité d'un des constituants de la vitamine B6 (exprimée
en ~g) contenue dans l ml de la solution injectée dans le
chromatographe (valeur obtenue à l'aide de la courbe d'étalonnage).
Soit Mla pesée en grammes de l'échantillon.
La teneur pour un des composés de la vitamine B6 (valable pour chaque
composé) dans l'échantillon à analyser (exprimée en mg/100g) est
donnée par la relation:
10 . x
M
La teneur globale en vitamine B6 de l'échantillon à analyser est
égale à la somme des teneurs en pyridoxamine, en pyridoxal et en
pyridoxol.

xx .
DOSAGE DE L1ACIDE L-ASCORBIQUE DANS LES ALIMENTS PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE
LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE SUR ECHANGEURS D'ANIONS FAIBLES
Principe
L1acide L-ascorbique est extrait de l'échantillon par de l'acide
métaphosphorique à 0,4 %. L1acide L-ascorbique est isolé par chroma-
~ographie
en phase liquide et dosé par photométrie à 254 nm.
REACTIFS
Acide métaphosphorique à 20 % (solution mère conservée à 4° C)
Acide métaphosphorique à 0,4 % (à préparer au moment de llemploi)
Phosphate monopotassique KH
à 25 m M
2P04
Méthanol pour chromatographie
· Acide L-ascorbique
· Filtre Durieux N° 111
Cartouches SEP-PAK C 18
· Membranes d'acétate de cellulose (0,20 )
MembraneS de cellulose régénérée (0,45 )
APPAREILLAGE
· Verrerie brune
pH-mètre
· Chromatographie en phase liquide avec intégrateur
Détecteur UV
CONDITIONS CHROMATOGRAPHIQUES
Colonne Lichrosorb NH
(10 ~m) (25cm/4 mm)
2
· Phase mobile: méthanol - phosphate monopotassique 25 m M(pH = 4,6)
(50:50 v/v) filtrée sur membrane de cellulose régénérée
Débit : l ml/mn
Volume injecté: 20 ~l
Détection : photométrie à 254 nm

XXI
. Etalonnage externe
MODE OPERATOIRE
Préparation des échantillons •
Peser au l/lOème de mg près dans un bécher une certaine quantité de
produit en fonction de la teneur présumée en vitamine C de l'aliment.
Transvaser dans une fiole jaugée de 50 ml à l'aide de l'acide
métaphosphorique à 0,4 %. Ajuster à 50 ml avec cette solution.
Si on a affaire à un jus, pipeter directement l'échantillon dans la
fiole jaugée et ajuster avec la solution d'acide métaphosphorique à
0,4 %.
Filtrer la solution sur membrane d'acétate de cellulose (0,2 ~) puis
passer le filtrat sur la cartouche SEP-PAK C 18*. Eliminer les deux
premiers ml, recueillir ensuite 5 ml pour l'analyse.
Dosage de l'acide ascorbique
Injecter 20 ~l de filtrat sur la colonne Lichrosorb NH 2
Préparation des étalons
Peser la mg d'acide L-ascorbique dans un bécher. Dissoudre l'acide L-
ascorbique avec de l'acide méthaphosphorique à 0,4 %. Transvaser dans
une fiole jaugée de 100 ml. Ajuster avec l'acide méthaphosphorique à
0,4 %. On obtient une solution-mère à 100 g/ml.
*Cette opération n'est indispensable que si le dosage de l'acide L-
ascorbique est perturbé par la présence des pics parasites (aliments
trés colorés). Ce passage sur SEP-PAK entraîne une perte de la % de
l'acide déhydroascorbique.
Les cartouches SEP-PAK sont conditionnées par passage de 2 ml de
méthanol et de deux fois 2 ml d'eau bidistillée.

XXII
DOSAGE DES ACIDES L-ASCORBIQUE ET DE,HYDRO L-ASCORBIQUE DANS LES ALIMENTS PAR
CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE PAR PAIRES D'IONS
PRINCIPE
La vitamine C (acide ascorbique + acide déshydro L-ascorbique) est
extraite de l'échantillon par de l'acide métaphosphorique à 0,4 %.
L'acide L-ascorbique est isolé par chromatographie en phase liquide et
dosé par photométrie à 265 nm.
L'acide déhydro L-ascorbique, éventuellement présent dans l'extrait, est
réduit en acide L-ascorbique par la DL-homocystéine. L'acide L-
ascorbique total est isolé par chromatographie en phase liquide et dosé
par photométrie à 265 nm. La différence entre les deux dosages donne la
quantité d'acide
déhydro L-ascorbique dans l'échantillon.
REACTIFS
Acide métaphosphorique à 20 % (solution mère conservée à 4° C)
Acide métaphosphorique à 0,4 % (à préparer au moment de l'emploi)
Phosphate monopotassique KH
0,1 M
2P04
· Phosphate bipotassique K2HP04 à 45 %
Méthanol pour chromatographie
Bromure de cétyltriméthylammonium
Acide L-ascorbique
· Acide déhydro L-ascorbique
DL-homocystéine - solution à 1,6 g/l dans l'eau distillée (à préparer
au moment de llemploi).
· Cartouches SEP-PAK C 18
· Membrane d'acétate de cellulose (0,2 ~)

" ' < ,
XXIII
APPAREILLAGE
· Verrerie brune
· pH-mètre
· Chromatographe en phase liquide avec intégrateur
· Détecteur UV
CONDITIONS CHROMATOGRAPHIQUES
· Colonne ~ Bondapak C 18 (10 ~m) (30 cm/3,9 mm)
· Phase mobile: phosphate monopotassique 0, l M - méthanol (9:1 v/v)
(le bromure de céty1triméthy1ammonium est dissous dans
3
la phase aqueuse à la concentration de 5 x 10- M)
· Débit : lml/mn
· Volume injecté: 20
~l
Détection: photomètre à 265 nm
Etalonnage externe
MODE OPERATOIRE
Préparation des échantillons
1
Peser au l/lOème de mg près dans un bécher une certaine quantité de
produit en fonction de la teneur présumée en vitamine C de l'aliment.
Transvaser dans une fiole jaugée de 50 ml à l'aide de l'acide
métaphosphorique à 0,4 %. Ajuster à 50 ml avec cette solution.
Si on a affaire à un jus, pipeter directement l'échantillon dans la
fiole jaugée de 50 ml et ajuster avec la solution d'acide
métaphosphorique à 0,4 %.
Filtrer la solution sur membrane d'acétate de cellulose (0,2 ~) puis
passer le filtrat sur la cartouche SEP-PAK C 18*. Eliminer les deux
premiers ml, recueillir
ensuite 5 ml pour l'analyse.
* Cette opération n'est indispensable que si le dosage de l'acide L-
ascorbique est pertubé par la présence de pics parasites (aliments très
colorés).
Les cartouches SEP-PAK sont conditionnées par passage ~e 2 ml de méthanol
et de deux fois 2 ml d'eau bidistillée.
L

XXIV
Dosage de l lacide L-ascorbique
Injecter 20 ~l de filtrat sur la colonne Bondapak C 18
Dosage·dela.vitamine C (acide ascorbique + acide déhydro l-ascorbique)
Dans une fiole jaugée de 10 ml, mettre 4 ml du filtrat obtenu après
passage sur la membrane dlacétate de de cellulose 0,2 ~ et 4 ml de la
solution dlhomocystéine. Ajuster à pH 7 avec la solution KH2P0 à 45 %
4
et compléter à 10 ml avec de lleau bidistillée. Laisser agir 10 minutes.
Passer la solution sur cartouche Sep Pak C 18 et filtrer sur membrane
dlacétate de cellulose 0,2 ~.
Injecter 20 ~l de la solution sur la colonne ~ Bondapak C 18
Préparation des étalons
Peser 10 mg diacide L-ascorbique dans un bécher. Dissoudre l lacide L-
ascorbique avec de llacide métaphosphorique à 0,4 %. Transvaser dans une
fiole jaugée de 100 ml. Ajuster avec llacide métaphosphorique à 0,4 %.
On obtient une solution-mère à 100
g/ml.

xxv
DETERMINATION DE LA TENEUR EN ACIDE L-ASCORBIQUE ET DEHYDRO L-ASCORBIQUE DANS
LES ALIMENTS (METHODE FLUOROMETRIQUE)
1. Définition.et.domained'app'ication
La teneur en vitamine C (acides L-ascorbique et déhydro L-ascorbique)
dans les aliments est le résultat obtenu par l'application de la
méthode décrite ci-après.
2. Principe
Oxydation de l'acide L-ascorbique en acide déhydro L-ascorbique par
le charbon actif (Norite). Réaction de l'acide dehydro L-ascorbique
formé avec l 'orthophénylènediamine et formation d'un composé
fluorescent ayant un maximum d'excitation à 350 nm et un maximum
d'émission à 430 nm.
Elimination de la fluorescence parasite de l'échantillon par addition
diacide borique à un échantillon dit témoin (l'acide déhydro L-
ascorbique est complexé par l'acide borique et ne réagit plus avec
l 'orthophénylènediamine). Soustraire l'intensité de fluorescence de
l'échantillon témoin de celle de l'échantillon à analyser.
Calcul de la teneur en vitamine C en comparant l'intensité de
fluorescence corrigée de l'échantillon à celle de solutions d'acide
L-ascorbique oxydées et traitées de la même façon. Proportionnalité
entre l'intensité de fluorescence et la concentration en vitamine C
(zone de linéarité: 0 - 80 mg/l).
3. Réactifs
3.1 Solutions d'extraction
3.1.1. Solution (acide métaphosphorique - acide acétique)
Dans un bécher dissoudre en agitant et en chauffant
légèrement 30g d'acide métaphosphorique (HP0
dans 80 ml
3)n

XXVI
d'acide acétique crista11isab1e et 400 ml d'eau distillée.
Laisser refroidir puis transvaser quantitativement dans une
fiole jaugée de 1 litre et compléter avec de l'eau distillée
(cette solution peut se conserver une semaine au
réfrigérateur).
3.1.2. Solution (acide métaphosphorique - acide acétique - acide
sulfurique)
Opérer comme en 3.1.1. mais remplacer l'eau distillée par une
solution d'acide sulfurique 0,3 N.
3.2 Solution d'orthophény1ènediamine
Peser 20 mg d'orthophény1ènediamine, 2HC1. Diluer à 100 ml avec de
l'eau distillée (à préparer extemporanément).
3.3 Solution d'acétate de sodium
Dissoudre 500g d'acétate de sodium trihydraté dans de l'eau
distillée et compléter à 1 litre.
3.4 Solution complexante d'acide borique et d'acétate de sodium
Dissoudre 3g d'acide borique dans 100 ml de solution d'acétate de
sodium (3.3)(à préparer extemporanément).
3.5 Charbon actif
Peser 200g de charbon actif (Norite). Ajouter l litre d'acide
chlorhydrique dilué à 10 % (v/v). Porter à ébullition puis filtrer
sur verre fritté sous pression réduite. Remettre le charbon actif
dans un grand bécher, ajouter l litre d'eau distillée, agiter et
filtrer sur verre fritté. Répéter le lavage à l'eau distillé et
filtrer à nouveau. Sécher le charbon actif à l'étuve durant une nuit
à llO-120°C.

XXVII
3.6 Solution étalon-mère diacide L-ascorbique (1000 mg/l)
Peser au l/lOème de mg, 50 mg d'acide L-ascorbique préalablement
déshydraté dans un'dessicateur, à l'abri de la lumière. Transvaser
quantitativement dans une fiole jaugée de 50 ml à l'aide de la
solution d'extraction (3.1.1.) et ajuster à 50 ml (à effectuer
immédiatement avant l'utilisation).
3.7 Solution de bleu de thymol à 0,04 %
Dissoudre 0,1 g d'indicateur par trituration dans un mortier en
agate avec 10,75 ml de soude 0,02N et diluer avec 250 ml d'eau
distillée (zone de virage pH = 1,2 (rouge) - pH = 2,8 (jaune)).
4. Appareillage
Matériel courant de laboratoire et notamment
4.1 Mixeur Vortex
4.2 Agitateur pour tube à essai
4.3 Fluorimètre
5. Mode opératoire
5.1 Test préliminaire pour apprécier la quantité de substances basiques
dans l'échantillon à analyser
Pour les échantillons liquides, faire une dilution avec un volume
double de la solution 3.1.1. Pour des échantillons solides,
pulvériser une quantité d'échantillon correspondant à la prise
d'essai et ajouter 25 ml de la solution 3.1.1. Faire le test avec
l'indicateur coloré (3.7.) sur une plaque à godets. Si pH
1,2
présence appréciable de substances basiques dans l'échantillon et
nécessité d'utiliser comme solution d'extraction la solution 3.1.2.
et non la solution 3.1.1.

XXVIII
5.2 Préparation des échantillons
5.2.1. Cas des échantillons solides
Réduire l'échantillon (contenant de l à 8 mg de vitamine C)
en poudre, ajouter la solution d'extraction (3.1.1. ou 3.1.2.
suivant le résultat 'du test 5.1.) et triturer jusqu'à ce que
l'échantillon soit en suspension. Diluer avec la solution
3.1.1. jusqu'à un volume inférieur à 100 ml. Filtrer les
solutions contenant de grosses quantités de solides en
suspension. Compléter le filtrat à 100 ml avec la solution
3.1.1. Transférer la solution obtenue dans une fiole conique
de 250 ml. Ajouter 2 g de Norite, agiter vigoureusement.
Filtrer. Eliminer les cinq premiers millilitres, puis
recueillir le filtrat.
5.2.2. Cas des échantillons liquides
Prendre un échantillon contenant entre l et 8 mg de vitamine
C. Ajuster à pH 1,2 avec la solution d'extraction 3.1.2. si
l'échantillon contient des quantités appréciables de
substances alcalines. Si nécessaire, filtrer. Compléter à
100 ml avec la solution d'extraction 3.1.1. Transférer la
solution échantillon dans une fiole conique de 250 ml puis
opérer comme en 5.2.1.
5.3 Préparations des étalons
Prélever à l 'aide d'une pipette graduée 2, 4 et 6 ml de la solution
étalon-mère (3.6.), les introduire dans les fioles jaugées de
100 ml. Ajuster avec la solution d'extraction (3.1.1.). Transférer
les solutions étalons dans des fioles coniques de 250 ml puis opérer
comme en 5.2.1.
5.4 Détermination fluorométrique
5.4.1. Echantillon
Dans une fiole jaugée de 100 ml contenant 5 ml de la solution
d'acétate de sodium (3.3.), introduire 5 ml de filtrat
(5.2.1. ou 5.2.2.) et ajuster au trait de jauge avec de l'eau
distillée.

XXIX
5.4.2. Echantillon témoin<
Dans une fiole jaugée de 100 ml contenant 5 ml de la solution
comp1exante acide borique - acétate de sodium (3.4.),
introduire 5 ml de filtrat (5.2.1. ou 5.2.2.). Laisser en
contact pendant 15 minutes puis ajuster au trait de jauge
avec de l'eau distillée.
5.4.3. Etalons
Opérer convne en 5.4.1. en uti l i sant 5 ml de filtrat (5.3.).
5.4.4. Etalons témoins
Opérer convne en 5.4.2. en utilisant 5 ml de filtrat (5.3.).
5.4.5. Dosage proprement dit
Dans une série de tubes à essai, mettre 2 ml des diverses
solutions obtenues en 5.4.1.,5.4.2.,5.4.3. et 5.4.4. (faire
3 mesures par solution). Ajouter à chaque tube 5 ml de la
solution d'orthophény1ènediamine (3.2.) à 1labri de la
lumière. Bien mélanger à l'aide d'un agitateur pour tube à
essai. Laiiser la réaction se développer 35 minutes à
l'obscurité. Puis faire les mesures au f1uorimètre ( À
=
exc
350 nm, Àem = 430 nm).
5.4.6. Expression des résultats
Porter sur une feuille de papier millimétré les valeurs
moyennes (corrigées) d'intensité de fluorescence des
solutions étalons en fonction de leur concentration.
Porter sur l'axe des ordonnées la valeur moyenne (corrigée)
dlintensité de fluorescence de la solution échantillon. Lire
sur le graphe la concentration en vitamine C contenue dans
100 9 (ou 100 ml) d'échantillon initial. Tenir compte des
éventuelles dilutions nécessaires si l léchantillon à analyser
contient de fortes quantités de vitamine C.

ANNEXE 3

xxx
Nom et numéro correspondant
des laboratoires ayant participé aux analyses
interlaboratoires.
1. Laboratoire Interrégional de la Répression des Fraudes de Strasbourg.
2. Laboratoire Central de la Répression des Fraudes de Massy
3. Laboratoire Interrégional de la Répression des Fraudes de Rennes
4. Laboratoire Interrégional de la Répression des Fraudes de Bordeaux
5. Laboratoire de la Société des Produits du Maïs
6. Laboratoire du Service Central des Etudes et des Réalisations de
l'Intendance
7. Laboratoire Coopératif
8. Centre de Recherches et d'Etudes Alimentaires (CREALIS)
9. Laboratoires Wolff

-
1 -
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