Pharm. Méd. Trad. Afr. 2004, VoLl3, pp.21-28
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EFFETS IN VITRO DE L'EXTRAIT AU METHANOL DES FEUILLES DE
Bidens pi/osa SUR LA CHLOROQUINO-RESISTANCE
DE Plasmodium
falciparum.
Bilanda D. c", Dimo T'., Mbacham F. W2., Evéhé MS2., Muluh J2., Njifutié N'.
\\ : luboratuire de physiologie animalede l'universitéde Yaoundé 1
2 . Laboratoire desanté publique du centrede biotcchnologje de Nkol-bisson
Introduction
Le paludisme est une pathologie à évolution rapide causé par un hématozoaire du genre
plasmodium et transmis à l'homme par un moustique du genre anophèles. Cette maladie constitue la
principale cause de mortalité dans plusieurs pays d'Afrique sub-saharienne où elle est endémique.
Plasmodium falciparum est l'agent causal de la forme la plus grave du paludisme humain. Les
personnes les plus vulnérables sont les femmes enceintes et les enfants de moins de Sans. Au
Cameroun, le programme national de lutte contre le paludisme fait état de 35% de décès dans les
hôpitaux (Ministère de la Santé Publique, 1999). Le programme de lutte contre le paludisme est axées
sur la prévention et
le traitement curatif. Pour ce qui du traitement curatif, il renferme la
chimiothérapie et la phytothérapie.
La chloroquine est le premier antipaludéen de synthèse calqué sur le modèle de la quinine
qui a fait naître beaucoup d'espoir dans la lutte contre le paludisme. En effet, elle était bon marché et
efficace contre toutes les espèces plasrnodiales (Mbacham, 1998). Malheureusement depuis 1965 ont
été détectés les premiers cas de résistance à la chloroquine en Amérique latine et en Asie du sud-est
(Brasseur et al., 1988). Cette résistance est aujourd'hui observée dans plusieurs pays et se répand
d'une manière inquiétante. L'un des moyens pour faire face à ces résistances est l'utilisation judicieuse
des médicaments en association. Parmi les molécules utilisées en association avec la chloroquine, les
bloqueurs des canaux calciques ont été efficaces pour ce qui est d'atténuer et même d'annuler la
résistance à la chloroquine. Parmi ceux déjà étudiés on peut mentionner le cas du fantofarone.
du
cyproheptadine, du désiprarnine, de la ketotifènc et du véraparnil, Malheureusement beaucoup de ces
bloqueurs des canaux calciques sont toxiques à des concentrations actives, si bien que la majorité des
études sont menées sur des cultures de Plasmodium in vitro ( Adovelande et al., 1998, Alan et al.,
1999).
Bidens pi/osa fait partie des plantes médicinales aux vertus multiples dont plusieurs sont dues
à son activité sur l'influx calcique transmembranaire. Bidens pi/osa aux faibles concentrations inhibe
la contraction du muscle lisse aortique induite par le calcium en milieu contenant de la noradrénaline
et du véraparnil. Ces observations suggèrent que Bidens pilosa contient des substances capables d'agir
sur l'entrée de calcium récepteur-dépendant. Aux fortes concentrations, Bidens pilosa inhibe l'entrée
du
calcium
voltage-dépendant,
ce
qui
le
rapproche du
vérapamil (Dimo, 200]).
L'activité
antipaludéenne de Bidens pilosa a été démontrée (Brandao et al., 1997). Etant donné que les
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Bloqueurs de canaux calciques potentialisent l'activité de la chloroquine sur des souches de P.
falciparum chloroquino-résistant (Adovelande cf al., 1998), l'objectif principal de cette étude est
d'évaluer les effets ill vitro de l'extrait au méthanol des feuilles de Bidens pi/osa sur la résistance de
Plasrnodiumfalciparum à la chloroquine. Pour atteindre cet objectif, nous allons évaluer:
La concentration maximale de Bidens pi/osa tolérée par les globules rouges
l'activité antipaludéenne des antagonistes calciques, Bidens pi/osa et vérapamil ;
l'effet des associations de chloroquine avec
le vérapamil
ou différentes
concentrations de l'extrait au méthanol des feuilles de Bidens pi/osa sur la
croissance de Plasmodtumfalciparum ;
la nature génétique des souches de Plasmodium cultivées.
MATERIEL ET METHODE
Extrait au méthanol des fcuilles de Bidens ri/osa
La poudree IS g) des feuilles de Bidens pi/osa obtenue après séchage et pulvérisation a été macérée
dans du méthanol (1 1) pendant 48 heures. L'extrait ainsi obtenu a été débarrassé de la chlorophylle par
épuisement au chlorure de méthylène, ce qui a permit d'obtenir une fraction au chlorure de méthylène
et un résidu au méthanol. Seul le résidu méthanolique a été utilisé dans cette étude.
Tests de sensibilité in vitro
Ces tests ont été réal isés sur des cultures de sang parasité, prélevé chez des patients en consultation à
l'hôpital d'Etoug-Ebé à Yaoundé. Les parasites ont été maintenu dans milieu de culture conforme à
celui décrit par trager et Jensen, avec quelques modifications. Le milieu de culture RPMI 1640 a été
supplérnenté de 1% de sérum humain AB+, de l' HEPES et du bicarbonate de sodium. La
chloroquine(CQ) et le Vérapamil(VR) ont été dissous dans le milieu de culture dépourvu de sérum et
de bicarbonate de manière à obtenir des solutions stocks de SOO ng/ml.
ACTIVITE ANTIPALUDEENNE DE CQ, VR ET B. pi/osa: des plaques de culture de 96 (12X8)
puits ont été préparées d'après la méthode décrite par Basee et collaborateurs (2002). Les dilution ont
été effectuées à partir de SOO ng/ml pour CQ et VR, et de 100 ug/ml pour B. pilosa. Les ont été
réalisées au 1/3. Les cultures ont été contrôlées jusqu'à ce que 60% des parasites contenus dans les
puits témoins révolus en schizonte. L'identification et le comptage des parasites s'est fait sur des
frottis sanguins au microscope optique.
INTERACTION ENTRE LA CQ ET LES ANTAGONISTES CALCIQUES: les plaques ont été
préparées comme précédemment, mais uniquement avec de la CQ(40 ul), le volume a été complété à
SOfL! par les antagoniste calciques par colonne (1Oüug/ml, Sûug/rnl, 1ug/rnl. SOOng/ml pour B. pilosa
et SOOng/ml pour VR).
CARACTERISTION GENETIQUE DES ECHANTILONS CULTIVES: L'extractionde l'ADN des
papier filtre s'est faite par la méthode au chelex -100. Les gènes Pfcrt. dhps et glurp ont ensuite été
amplifiés par deux PCR successives (outer et nested PCR). Les produits de la nested PCR des gènes
Pfcrt et dhps ont été précipités à l'éthanol absolu et digérés par les enzymes Apol et Aval!
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respectivement. Les produits de la nested PCR de glurp et de la digestion de Pfcrt et dhps ont éte
analysés par migration sur un gel d'agarose à 3%. Le gel a ensuite été visualisé sur UV et filmé.
RESULTATS
Activité antipaludéenne de B. pi/osa et VR : les pourcentage de croissance ont été calculée par rapport
aux puits contrôle et des courbes dose/effet ont été tracées(fig.l)
a:ub:516
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100
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3
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5
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Figure 9 : activité antipaludéenne de B. pi/osa et du VR
Nous constatons une diminution dose-dépendante de la croissance des parasites. traduisant l'activité
antipaludéenne de ces deux produits. Cependant, cette diminution ne nous a pas permis de déterminer
les IC50.
Effets de Bidens pi/osa et de VR sur l'activité de la CQ: Les pourcentages de croissance ont
également été déterminés comme précédemment et les courbes dose/effet tracées (fig.2). Nous avons
alors constaté deux phénomènes. traduisant l'effets de ces associations d'une part sur les souches de P.
falciparum chloroquino-sensibles(CQS), et d'autrepart sur les souches chloroquino-résistames(CQR).
Ces courbes nous
ont
permis de determiner les IC,o que
nous
avons regroupées dans
un
tableau.(tableau 1).
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a:utes2
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6
-1
2
1
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h-~I
r
°
1
10 <Xlv'
1
1
<Xlv'
1~caP11
~
. ~ COBP1I
CXlP21
1 ~
cx:BP3
!
cx:BP3
1
1 - - - (X]J>;;
L--------,
1
1
Figure 2 :effet de B. pi/osa et de VR sur l'activité de JaCQ
Tableau 6: Concentration inhibitrice 50 (lC 5o)de la chloroquine seule et des différentes combinaisons
avec la chloroquine
ICso
i
1 N" de
f=:illon
CQ
CQV
CQBP1*
CQBP2*
CQBP3
125,89
31,62
32,36
33,88
34,67
33,11
30,9
31.47
31.62
32.36
1
!
1
49,og--l
§~ 169.82 19,9 20,6 21,3
155,48
19
19,9
20,6
49,05
181.97
28,83
25,01
63,09
125,89
177,82
26,3
22,4
63,09
89,12
7
89,12
13,63
13,66
20,47
29,05
8
31,62
18,58
19,49
23,44
31,26
9
17,37
13,8
13,18
14,45
15,13
10
17,37
5,49
5,46
6,91
7,OB
11
18,7
0,46
0,43
2,75
12,57
24
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12
17,37
0,87
0,50
5,62
6 9 1 -
,
13
31,62
17,78
16,59
15,84
14
50,11
25,11
19,95
17,78
Légende: CO: chloroquine; CQV: chloroquine + Vérapamil (SOOng/mL) ; COBP1*: chloroquine +
Bidens pi/osa (SO IJg/mL pour les 8 premiers et 100IJg/mL pour les 4 derniers) ; COSP2* : chloroquine +
Bidens pi/osa (1IJg/mL) ou chloroquine + verapamil (SOOng/mL)+Bidens pi/osa (100mg/mL) pour les deux
derniers échantillons; COSP3 : chloroquine + Bidens pi/osa (SOOng/mL)
Caractères génétiques des échantillons cultivés: La digestion de dhps par l'enzyme Avallnous a
révélé que les échantillons 4, 5, 7, 10 et 12 étaient résistants au Fansidar® alors que les échantillons 6,
8, et 9 étaient sensibles. la digestion de Pfcrt par l'enzyme Apol a révélé que tous les échantillons
étaient porteurs du gène de la résistance à la CO, L'amplification du gène glurp a révélé que chaque
échantillon était infecté par une seule souche de Pifalciparum. Nous avons également mis en évidence
la présence de 3 allèles de glurp :535bp, 577bp et 622pb.
La comparaison entre le tests de sensibilité in vitro et la biologie moléculaire pour évaluer la COR a
montré une conformité des deux tests pour les échantillons 4, 5, 6, et 7, alors que les échantillons 8,9,
10. J 1 et 12 sont non conformes.
DISCUSSION
Les tests de sensibilité in vitro sont souvent utilisés pour tester l'efficacité d'un nouveau
produit. Bidens pi/osa est une plante connue pour ses multiples vertus thérapeutiques. L'évaluation de
l'activité antipaludéenne de cette plante a montré une diminution dose-dépendante de la croissance de
1'. fulciparum, La concentration maximale utilisée (100 ug/ml.) a provoqué une diminution de la
croissance du parasite inférieure à 50%. La ICso de la chloroquine n'a pas été déterminée. Ces résultats
sont en accord avec les travaux de Brandao et al (1997) avec les extraits de la plante entière et ceux de
Oliveira el al (2004) avec les extraits des racines. La faible activité antipaludéenne observée dans cette
étude pourrait résulter des doses et de la partie du végétal utilisée. Le choix de l'extrait au méthanol
des feuilles pour cette étude a été motivé par la fait les études antérieures (Dirno , 2001) ont montré
une activité de cet extrait sur les canaux calciques. Il est connu que la combinaison des antagonistes
calciques aux antipaludéens comme la chloroquine est capable de potentialiser l'action de ce dernier
(Adovelande et al., 1998). Ces substances n'ont cependant aucun effet sur les souches sensibles.
L'évaluation de l'influence de l'association CO - B. pilosa sur la résistance de P. falciparum à la
chloroquine a montré que cette combinaison diminue la ICso cie la CO, La diminution de la lCso de la
CO aussi bien par le vérapamil que par B. pilosa sur les parasites sensibles à la CO serait
incompréhensible si l'on considère que les anticalciques n'ont aucun effet sur ce type de parasites
(Helrnuth et al.. 1993). Une faible activité antipaludéenne des anticalciques a été mise en évidence par
Adovelande el al (1998). Les résultats de cette ont confirmé l'activité antipaludéenne de B. pi/mu et
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du vérapamil, substances à activité anticalcique (Dimo, 2001). Ainsi, la faible activité anti paludéenne
de B. pi/osa et du vérapamil pourrait s'additionner il celle de la CQ pour inhiber la croissance du
parasite. Il y aurait par conséquent une sommation des effets des produits en association.
L'analyse et la caractérisation génétique des populations de P. [alciparutn par la réaction de
polymérisation en chaine (PCR) a été utilisée pour établir les caractères génétiques des échantillons cultivés. Les
résultats obtenus ont montré que les échantillons étudiés n'étaient pas infectés par la même souche de l'.
falciparum. En effet il a été mis en évidence trois allèles différents du gène glurp (535 pb, 577 pb et 622 pb). La
présence d'une seule bande pour chaque échantillon suggère que chaque était infecté par une seule espèce de l'.
[atcipurum. La digestion du gène dhps par l'enzyme Ava /1 a confirmé la résistance du clone 7GB au Fansidar".
Notre étude a mis en évidence la présence dans nos échantillons des souches résistantes au Fansidar'" et des
souches sensibles. Il ressort de nos résultats qu'il n'existerait pas de rapport entre les allèles du gène g/llrp et le
résistance de P. [alciparum au Fansidar®. La digestion du gène Pfcn par 1'enzyme Apo 1 a permis de mettre en
évidence la résistance du clone 7G8 à la CQ. Un tel clone résistant à plus d'un médicament est qualifié de "
multi-drugs" résistant, comme le sont les échantillons 4,5.7, 10 et 12. La majorité des parasites cultivés sont
chloroquinc-résistants (CQr). En effet, l'enzyme de restriction Apo / clive le gène Pfcrt lorsqu'il n'y a pas de
mutation au niveau de son site de restriction. Celle absence de digestion suggère qu'il y a eu substitution de la
lysine par la thréonine en position 76. Le gène Pfcrt est connu pOLIr être le meilleur marqueur de la chloroquino-
résistance (CQR) (Djimbe el a/., 2001). La mutation de ce gène au niveau du codon 76 confère au parasite la
résistance à la CQ.
Sur les souches de l'. fatciparum CQr, il y a une réduction remarquable de la IC50 de la CQ par Bidens
pi/osa. En admettant que B. pi/osa est un antagoniste calcique type "vérapamil like" ( Dimo, 200 J), il semble
qu'il soit capable de reverser la CQR. Il est connu que le vérapamil restaure complètement la sensibilité à la CQ
des souches de l'. falciparum CQr (Adovelande et al., 1998) et cette action serait proportionnelle au degré de la
CQR (Bitondi el al., 1988). L'identification d'un mouvement des ions calcique, uniquement chez les souches de
P. falcipurum CQr a permis à Krogstad et De (1998) de suggérer que les antagonistes calciques agiraient sur ce
mouvement de Ca"< pour reverser la CQR L'extrait de B. pi/osa semble augmenter la sensibilité des souches
CQr; en diminuant considérablement la IC50 de la CQ. Un phénomène similaire est observé avec l'échantillon B
qui est pourtant CQr. Cette différence pourrait s'expliquer si on considère que le gène Pfcrt n'est pas l'unique
marqueur de la CQR. Une bonne analyse de la CQR devrait inclure en plus des tests in vitro
et de la
caractérisation génétique, un test in vivo. Généralement, la CQR par ce dernier test ce traduit par un échec
thérapeutique. Il se pourrait alors que cet échantillon bien qu'ayant Je gène Pfcr; muté, ne soit pas totalement
CQr.
CONCLUSION
L'extrait au méthanol de Bidens pi/osa inhibe légèrement la croissance de P. falciparum en culture.
Cette inhibition se fait aussi bien quand Bidens pi/osa est utilisé seul ou en combinaison avec la CQ.
Utilisé seul, Bidens pi/osa présente une faible activité antipaludéenne. En association avec la CQ. il a
été observé sur les souches de P. falciparum CQr une potentialisation de l'action de la CQ par Bidens
pi/osa. Sur les isolats CQs, nos résultats ont montré une simple sommation de l'activité de Bidens
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pi/osa avec celle de la CQ. Ce porte à croire de Bpi/osa u'influence pas l'activité de la CQ chez ces
dernières. Les résultats de cette étude laisse entrevoir un certain nombre de similitudes d'action entre
Bidens pi/osa et le vérapamil. Une étude sur un échantillon plus large permettrait de mieux caractériser
les effets et les mécanismes d'action de cette association..
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llavonoids.
Avalable
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Antirnalarial;
Bidens pi/osa; Polyacetylene;
Flavonoids
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