Pharm. MM. Trad. Afr. 1998, Vol.lO, pp.68-79.
KASE: VALORISATION D'UNE PLANTE MEDICINALE
ANTI-INFLAMMATOIRE
.,'
)
Par
M. LOMP01 ; S. OUEDRAOG01 ; S. SOURABm1 ; I.P. GUISSOUl-2
1 Institut de Recherche en Sciences de la Santé (lRSS)
Département Médecine-Phannacopée TraditionnellelPharmacie
03 BP 7192 • Ouagadougou 03
2 Faculté des Sciences de la Santé - Université de Ouagadougou.
,
03 BP 7021 - Ouagadougou 03.
RESUME
Khaya senegalen.ris A. Juss (MELIACEAE) est utilisé au Burkina Faso en
tradithérapeutique dans les cas d'inflammations diverses. Une investigation de
l'activité anti-inflammatoire selon le modèle de l'oedème à l'huile de croton de
l'oreille de souris a permis de mettre en évidence un support phannacodynamique
explicatif de cette utilisation traditionnelle des écorces de tronc de la plante.
L'étude de la toxicité générale aiguë des extraits aqueux lyophilisés a permis d'évaluer
la DL50 avec son intervalle de confiance les classant parmi les produits moyennement
toxiques. La toxicité générale aiguë est correlée d'une hypothermie qui laisse penser
à une action centrale comme c'est le cas pour les neuroleptiques.
Dans le but de contribuer à l'utilisation thérapeutique rationnelle des écorces de tronc,
des formulations galéniques sous forme de crèmes et de gels ont été proposées offrant
une perspective d'usage de la plante sous une forme galénique moderne.
MOTS CLES:
Khaya senegalensis - Ecorces de tronc - Anti-inflammatoire -
Crèmes - Gels - toxicité - DL50.
1.
INTRODUCTION
Khaya senegalen.ris A. Juss. (MELIACEAE) ou caïlcédrat est un grand arbre
de 25 à 30 m de haut typique des savanes arborées (BERHAUT, 1967). Très
largement employé au Burkina Faso en médecine et phannacopée traditionnelles, il est
utilisé dans de nombreuses pathologies parmi lesquelles les affections· à composante
inflammatoire en dennatologie, rhumatologie, traumatologie, odonto-stomatologie et
en O.R.L.
- 68-
La drogue, constituée essentiellement par les écorces de tronc, est la plupart du temps
utilisée en macération, en décoction, en infusion ou broyée et incorporée dans du
beurre de karité en pommade.
Dans le but de contribuer à la valorisation des données de la médecine et
pharmacopée traditionnelles, nos travaux antérieurs (LOMPO, 1993) ont mis en
évidence une activité anti-inflammatoire par voie générale (intrapéritonéale) de l'extrait
aqueux de la poudre d'écorce. De même ces travaux (LOMPO, 1995) ont évalué la
toxicité générale aiguê de l'extrait en définissant la DL50 qui est égale à 1250 mg!kg
chez la souris. Cette toxicité est correlée d'un effet hypothennisant marqué aux doses
comprises entre 1000 et 1500 mg/kg où une faible variation de dose provoque un
important abaissement de température. Cet extrait doit être par conséquent considéré
de maniement difficile.
L'objectif du présent travail est de contribuer par une approche' plu~ rationnelle à
l'utilisation thérapeutique des écorces de tronc de Khaya senegalensis en proposant des
formes galéniques topiques (crèmes et gels) présentant moins de risques d'utilis~ti9.n.
1
. / ,
. ;
Il.
MATERIEL ET METHODE DE L'ETUDE
1.
Màtériel
1.1. Le végétal
Les écorces de tronc de Khaya senegalensis A. Juss. sont récoltées dans la
région de Saponé (province du BAZEGA à environ 30 km au Sud de Ouagadougou)
au Burkina Faso. Elles sont séchées à l'ombre dansuile salle aérée et sous ventilation
artificielle à l'abri de la 'poussière, puis réduites en poudre et conservées dans des
récipients appropriés à l'abri de l'humidité à l'Institut de Recherche en Sciences de la
Santé (lRSS).
r.2. Matériel de l'étude de l'activité anti-inflammatoire
par voie topique
les extraits
· extrait aqueux lyophilisé
· extrait à la pétroleine
· extrait chloroformique après épuisement à la pétroleine
· extrait méthanolique après épuisement à la pétroleine et au chlorofonne
· extrait aqueux après épuisement à la pétroleine au chlorofonne et au
méthanol.
les animaux
Ce sont des souris mâles NMRI(IFFA CREDO)'de poids compris entre 28 et 32 g
stabulées dans le laboratoire de pharmacologie dans les conditions de température
- 69-
comprise entre 21 et 24 oC et de taux d'humidité de 70 ± 5 %. La salle est soumise
à un éclairage artificiel de 12 heures et d'obscurité de 12 h.
2. MÉTHODE DE L'ÉTUDE
2.1. Etude de l'activité anti-inflammatoire
A)
PREPARATION DES DIFFERENTS EXTRAITS
Extrait aqueux lyophilisé
100 g de poudre d'écorce sont mis à macérer dans 500 ml d'eau distillée au
réfrigérateur pendant 24 h. Après agitation magnétique, l'extrait est filtré sur du coton
hydrophile et lyophilisé pour donner une poudre de 5.9 g.
soit un rendement
d'extraction de 5. 9g.
Extrait à la pétroléine
520 de poudre d'écorces sont macérés dans un litre d'éther de pétrole sous
agitation pendant 96 h en chambre froide. Le macéré est ensuite introduit dans un
percolateur sur lequel 1 litre d'éther de pétrole est versé goutte à goutte. Le percolat
recueilli et évaporé au rotavapor à 40°C sous pression réduite. Un résidu de 1.67g est
recueilli. Le rendement est de 0.32%.
Extrait chloroformique
Sur le marc résultant de l'extraction à l'éther de pétrole, 2,5 litres de
chlorofonne sont versés goutte à goutte et le percolat est recueilli dans un ballon rodé
d'évaporation.
Cette solution chloroformique est également évaporée comme précédemment
au rotavapor.
Le résidu obtenu pèse 6.3 g soit un rendement de 1.21 %.
Extrait méthanolique
Sur le marc issu de l'extraction chloroformique, 3.8 litres de méthanol sont
versés au goutte à goutte. Le percolat est recueilli et traité de la même manière que
précédemment ; le résidu méthanolique obtenu pèse 97.8g, soit un rendement
d'extraction de 18.81 %.
1-
- 70-
Extrait aqueux
2.7501 d'eau distillée sont enfm coulés au goutte à goutte sur le marc resté
dans le percolateur. Le percolat est évaporé sous pression réduite à 50°C pour donner
un résidu sec de 25.5g ; le rendement obtenu est de 4.90%.
B)
METHODE DE L'ETUDE DE L'ACTIVItE ANTI-INFLAMMATOIRE
Etude de l'activité anti-inflammatoire topique des différents extraits versus
l'indométacine selon le modèle de l'oedème à l'huile de croton de l'oreille de souris.
1)
Préparation des solutions utilisées
Solution de kétamine chlorhydrate à 15 mg/ml :
75 mg de ketamine chlorhydrate sont dissous dans 5 ml d'eau pour préparation
injectable
Solution d'huile de croton à 15 mg/ml ;
selon le cas, 75 mg d'huile de croton sont dissous dans 5 ml de
dichlorométh.ane ou d'éthanol
Solution d;indométacine à 50 mg/ml ;
50 mg d'indométacine sont dissous dans 1 ml de la solution d'huile de croton ci-
dessus.
les solutions d'extrait à la pétroleine et chloroformique se préparent de la
même façon que l' indométacine.
les solutions d'extraits au méthanol et à l'eau se préparent de la même manière
mais en utilisant respectivement comme solvants la solution éthanolique de croton et
de l'eau.
2)
Protocole expérimental
Deux lots d'au moins six souris pesées et marquées sont nécessaaires pour
chaque test. Le 1er lot (lot contrôle) ne recevant que la solution d'huile de croton et
l'autre lot recevant la substance à étudier dissoute dans la solution d'huile de croton
(des essaais préliminaires ont montré l'inexistence d'interférence entre ces substances
(NIKIEMA, 1997).
L'inflammation cutanée est induite chez le lot contrôle en appliquant 5 Jtl de la
solution d 'huile de croton sur la surface interne du pavillon de l'oreille droite de la
souris préalablement anesthésiée par la solution de kétamine chlorhydrate (150 mg/kg)
par voie intrapéritonéale. L'oreille gauche n'est pas traitée et sert de témoin.
- 71 -
Le lot n02 reçoit sur la face interne du pavillon de l'oreille droite (après être
anesthésié comme précédemment) 5 ILl de la soluton de substance à étudier (250 JJ.g
par oreille).
N.B. : pour les solutions aqueuses, les extraits sont dissous dans de l'eau. Leur dépôt
se fera immédiatement après celui de la solution d'huile de croton. Le contrôle recevra
un dépôt (même volume) d'eau pour préparation injectable immédiatement après celui
de la solution d'huile de croton.
Les deux lots sont observés pendant 6 h (maximum de l'inflammation) (TUBARO ;
1985). Les animaux sont sacrifiés par rupture de la moelle épinière au niveau cervical
par étirement. Les oreilles droites et gauches sont alors sectioIinées au ràS de leur
implantation. A l'aide d'un perce-bouton (diamètre 7 mm), un morceau du pavillon
de l'oreille est prélevé au niveau de la marge en pointe et pesé immédiatement.
Les différences de poids entre les morceaux de l'oreille droite et gauche sont notées.
Les tests sont réalisés de 10 à 16 h pour éviter les éventuelles variations des réponses
dues aux fluctuations circadiennes des corticostéroïdes des animaux.
3) Expression des résultats
Soit D.M. la différence moyenne de poids entre les morceaux des oreilles
droites traitées à l'huile de croton et ceux des oreilles gauches non traitées du lot
contrôlé. Soit D.M;T. la différence moyenne de poids entre les morceaux des oreilles
droites traitées à la substance anti-inflammatoire et ceux des oreilles gauches traitées.
Soit D.i. la différence de poids entre les morceaux de l'oreille droite et de l'oreille
gàuche d'une souris donnée.
Le pourcentage d'inhibition de l'inflammation est:
(D.M. - D.M.T.) x loo/D.M.
t
Le pourcentage d'inhibition calculé pour chaque animal est:
!
(D.M. - D.i.) x loo/D.M.
1
2.2. Méthode de l'étude de la toxicité générale aiguë de l'extrait aqueux lyophilisé
Six lots de 6 souris femelles préalablement mis à jeun pendant 12 h sont
constitués de la façon la plus homogène possible et reçoivent en mtrapéritonéale
respectivement des doses de 50 ; 100 ; 200 ; 300 ; 400 et 600 mg/kg de solution
d'extrait aqueux lyophilisé. Des observations sont faites au bout de '24;'48 et 72 h
comparativement à un lot témoin qui ne reçoit que de l'eau distillée. Les souris mortes
sont dénombrées et les valeurs enregistrées et traitées à l'informatique selon le
programme TALLARIDA SOFfWARE (1987) pour en déterminer la DL50 et son
intervalle de confiance.
- 72 -
La valeur de la DLSO permet de classer l'extrait aqueux lyophilisé sur l'échelle
de toxicité de HODGE et STERNER suivante chez le rat ou la souris :
- produits extrêmement toxiques
DLSO < 1 mg/kg
- produits très toxiques
DLSO de 1 à SO mg/kg
- produits moyennement toxiques
DLSO de SO à SOO mg/g
- produits faiblement toxiques
DLSO de 500 à 5000 mg/kg
- produits pratiquement non toxiques
DL50 de 5 à 15 glkg
- produits relativement sans danger
DL50 > 15 g/kg
2.3. Méthodes de l'étude ealéDigue
A)
FORMULATION
a)
Les crèmes
Formule utilisée
· extrait de plante
1 g
· cire blanche
1 g
· alcool cetylique (lanette 16)
9g
· propylène glycol
10 g
· emulgade 1000 NI
lOg
· eau conservante q.s.p.
100 g
Mode opératoire: Après avoir pesé les différents constituants,
1.
Faire fondre dans un mortier au bain marie à une température voisine de 70°C
le mélange émulgade 1oooNI, alcool cétylique (lanette 16) et cire blanche
2.
Dissoudre le propyléneglycol dans 3/4 de la quantité d'eau nécessaire dans
laquelle on a préalablement dissout à chaud l'agent conservateur (acide
sorbique). Porter la température à 75°C.
3.
Dissoudre l'extrait aqueux lyophilisé dans le 1/4 restant d'eau
- Retirer le mortier du bain-marie et ajouter par petites portions 2 dans 1 en
agitant vivement
- y additionner 3 en fin d'opération en agitant lorsque la température du
mélange est tombée au voisinage de 40°C
.
- Mélanger en agitant de moins en moins vigoureusement jusqu'à
refroidissement
4.
Conditionner dans des pots de 125 ml.
- 73 -
b)
Gel au carbopol de l'extrait aqueux lyophilisé
Formule utilisée
· extrait de plante
LOg
· carbopol940
1.5 g
· propylèneglycol
15.0 g
· EDTA
50.0 mg
· triethanolamine
5.0 g
· eau conservante q.s.p.
100.0 g
Mode opératoire: Après avoir pesé les différents constituants,
1.
dissoudre l'acide sorbique et l'EDTA dans 3/4 de l'eau nécessaire additionnée
de triéthanolamine ;
2.
dissoudre l'extrait 'aqueux lyophilisé dans le 114 restant d'eau;
3.
dans un mortier, triturer avec soin le carbopol et propylèneglycol
(homogénéiser) ;
4.
verser 1 dans 3 en remuant lentement pour homogénéiser;
5.
laisser reposer le gel et conditionner dans des pots de
125 ml.
N.B. : Les crèmes et les gels des autres extraits sont préparés selon le même principe.
B.
EVALUATION DEL 'ACTIVITE ANTI-INFLAMMATOIRE DES FORMES
REALISEES
Le protocole utilisé est le même que décrit antérieurement selon le modèle de
l'oedème à l'huile de croton de l'oreille de souris. Le lot témoin reçoit l'excipient
après dépôt de l'agent inflammatoire tandis que le lot traité reçoit la crème ou le gel
après avoir déposé l'agent inflammatoire.
C.
CONTROLE DES FORMES REALISEES
Les tests suivants ont été réalisés :
homogénéité de la forme
étaleme~,s~ Ja peau·
toxicité cutanée '
stabilité d'activité
stabilité d'aspect au COurs du temps
- 74 -
III.
RESULTATS ET DISCUSSIONS
1. Activité anti-inflammatoire des différents extraits versus indométacine
Tableau 1 : Inhibition de l'oedème par les différents extraits d'écorce
de tronc de Khaya senegalensis A. Juss.
Extraits
Dose adminis-
Nombre
.Pourcentage
trée (lLg/oreille)
d'animaux
d'inhibition
de l'oedème (%)
Extrait aqueux après épuisements
250
6
11.0 ± 7.8
successifs
Extrait aqueux lyophilisé
250
6
44.3 ± 5.1
Extrait à la pétroléine
250
6
62.8 ± 8.1
Indométacine
250
6
82.7 ± 6.0
Extrait chloroformique après
épuisement à la pétroléine
250
6
79.9 ± 6.2
Extrait méthanolique après
épuisement à la pétroléine et au
250
6
25.6 ± 7.7
chloroforme
L'analyse du tableau 1 montre l'existence d'un effet anti-inflammatoire pour tous les
extraits réalisés mais à des degrés divers. On peut classer ces extraits suivant un ordre
croissant de l'effet anti-inflammatoire de la façon suivante:
extrait aqueux après épuisement successif à la pétroléine,
au chloroforme et au méthanol. (inhibition d'oedème: 11 %)
extrait méthanolique après épuisement à la pétroleine et au
chloroforme (inhibition d'oedème: 25.6%) ;
extrait aqueux total lyophilisé (inhibition d'oedème: 44.3 %) ;
extrait à la pétroleine (inhibition d'oedème: 62.8%) ;
extrait chloroformique (inhibition d'oedème: 79%) ;
indométacine (inhibition d'oedème: 82.7 %).
Les extraits organiques (moins polaires) semblent présenter un effet anti-
inflammatoire supérieur à celui des extraits méthanolique et aqueux plus polaires. Ceci
s'expliquerait par leur caractère lipophile plus marqué que les derniers.'
- 75 -
t
En effet, la barrière épidennique est essentiellement constituée par la couche
f
cornée qui est surtout une barrière limitante de caractère lipophile (WEPIERRE,
1977). Les composés lipophiles pourraient s'y dissoudre et diffuser dans la matrice
lipidique située entre les marnents de kératine et au sein des lipides intercellulaires.
1
,
Les petites molécules hydrophiles beaucoup moins diffusibles migreraient lentement
au sein des régions riches en eau.
1
La différence d'activité entre ces deux types d'extraits (moins polaires et
1
polaires) peut également s'expliquer par la différence de composition chimique qui
ferait que dans les extraits moins polaires on retrouve des substances à activité anti-
inflammatoire plus marquée que celle des extraits plus polaires.
2. Toxicité générale aiguë de l'extrait aqueux lyophilisé
Le traitement informatique des données sur la mortalité cumulative :
- au cours de 24 heures
DL50 = 318 mglkg avec un intervalle de confiance
(I.C.) = [228.9 - 442.6 mg/kg] à p < 0.05
DL5 = 145111g!kg ; DL95 = 700 mg/kg
Les rappôrts DL5/DL95 = 0.21 ; DL5/DL50 = 0.46 ; DL50/DL95 = 0.45 prouvent
la validité du test; cependant le rapport DL95/DL5 est inférieur à 10 d'où les
précautions à prendre quant à l'utilisation par voie générale.
- au cours de 48 heures
DL50 = 221.3 mg!kg avec I.C. = [165.6 - 295.9 mg/kg] à p < 0.05
- au cours de 72 heures
DL50 = 203.6 mg/kg avec I.C. = [124.6 - 332 mg!kg] à p < 0.05
Ces différentes valeurs de la DL50 classent l'extrait aqueux lyophilisé en
administration intrapéritonéale comme étant moyennement toxique. Cette toxicité est
correlée d'un certain nombre de signes: Hypothennie ; tendance à l'immobilisation
; perte d'instinct d'exploration; tendance à l'endormissement et au regroupement,
perte du tonus, refus de s'alimenter.
L'hypothermie relevée au cours de cette étude serait alors un témoin voire un signe
de la toxicité de l'extrait à l'instar de ce qui est observé avec certains psychotropes
comme les neuroleptiques (COHEN, 1996 ; GINESTET et al. 1988). Une action
centrale pourrait être alors envisagée.
L
- 76 -
m.3. Etude galénique
A)
Fonnulation
Les fonnes topiques ont été choisies parce que présentant une action locale, ce qui
éviterait l'hypothennie observée par voie générale.
a)
Les crèmes
Les crèmes de l'extrait aqueux lyophilisé, de l'extrait à la pétroleine et au chlorofonne
. se réalisent aisément sans artifice particulier.
b)
Les gels : il en est de même pour les gels
B)
Evaluation de l'activité des fonnes réalisées
Les mesures ont été faites seulement six heures après une administration unique
Tableau fi : Inhibition de l'oedème des fonnes réalisées
Dose
Nombre
Pourcentage
Formes réalisées
administrée
d'animaux
d'inhibition
mg/oreille
de l'oedème (%)
Crème de l'extrait aqueux lyophilisé
25
6
19.3 + 6.4
Crème de l'extrait à la petroleine
25
6
21.4 + 12.1
Crème de l'extrait chloroforroique
25
6
22.8 + 6.9
Gel de l'extrait aqueux lyophilisé
25
6
30.4 + 8.3
Gel de l'extrait à la pétroleine
25
6
20.4 + 12.8
Gel de l'extrait chloroforroique
25
6
24.8 + 11.6
Gel de l'indométaeine
25
6
24.7 + 9.1
D'une manière générale, les gels obtenus semblent présenter une meilleure
biodisponibilité que les crèmes.
Les rapports effet (gel) sur effet (extrait correspondant) sont les suivants:
- 68.5% pour l'extrait aqueux lyophilisé
- 32.5 % pour l'extrait à l'éther de pétrole
- 31 % pour l'extrait chloroforroique
- 29.9% pour l'indométacine
- 77-
Les rapports effet (crème) sur effet (extrait correspondant) sont les suivants:
- 43.5% pour l'extrait aqueux lyophilisé
- 34.1 % pour l'extrait à la pétroleine
- 28.5 % pour l'extrait chloroformique
Il en résulte que le gel et la crème de l'extrait aqueux lyophilisé présentent les
meilleurs rapports effet (forme réalisée) sur effet (extrait non formulé). lis semblent les plus
intéressants à exploiter.
C)
Contrôle des formes réalisées
Le contrôle, réalisé sur ces formes selon différents protocoles décrits par
PRADEAU (1992) semble indiquer une bonne qualité de ces crèmes et gels. En effet, ils
sont dénués de toute irritabilité de la peau; l'indice d'irritation cutanée primaire étant <
0.5. Les pH des formes sont compris entre 5 - 6 donc voisin de celui de la pe,au. Leur
stabilité organoleptique et d'activité au cours du temps est notable (plus d'une année de
conservation).
'
CONCLUSION ET "PERSPECTIVES
Khaya senegalensis qui jouit d'une réputation non négligeable en médecine et
pharmacopée traditionnelles fait présentement l'objet de nombreuses investigations dans le
but de
valoriser les
données de l'utilisation traditionnelle
contre les
maladies
inflammatoires.
Du
point
de
vue
pharmacologique,
la
recherche
du
support
pharmacologique explicatif de l'utilisation des écorces de tronc comme anti-inflammatoire
a été démontrée par la mise en évidence de l'activité inhibitrice de l'oedème à l'huile de
croton chez la souris des extraits aqueux, à l'éther de pétrole, au chloroforme et au
méthanol. Cependant la prépondérance de cet effet inhibiteur de l'oedème semble plus
marquée pour les extraits organiques moins polaires (chloroformique 79.9% d'inhibition,
et à la petroleine 62.8% d'inhibition qu'aux extraits plus polaires comme extrait aqueux
lyophilisé (44.4. % d'inhibition). L'indométacine quant à elle présente 82.7% d'inhibition.
La DL5ü de l'extrait aqueux lyophilisé qui est de 318 mg/kg après 24 h
d'observation; 221.3 mg/kg après 48 h et 203.6 mglkg après 72 h d'observation le classe
parmi les produits moyennement toxiques.
L'hypothermie semble un signe de la
manifestation de la toxicité générale aiguë.
Les propositions de formulation faites semblent offrir des perspectives de
l'utilisation plus rationnelle des écorces de tronc sous forme de gels ou de crèmes.
En effet, la crème à 1% ou le gel à 1% de l'extrait aqueux lyophilisé semblent en
particulier présenter un meilleur rapport effet (forme réalisée) sur effet (extrait non
formulé). Par ailleurs, l'extrait aqueux lyophilisé présente un bon rendement d'extraction.
Les travaux futurs viseront au fractionnement des différents extraits en vue de
meUre en évidence la substance active afin de pouvoir mieux la contrôler au cours du temps
et envisager sa formulation galénique.
- 78 -
BIBUOGRAPHIE
1 -
BERHAUT J. (1967) : Flore du Sénégal- 2ème Ed. Clairafrique Dakar, P. 60.
2 -
COHEN Y.(1986): Abrégé Pharmacologie (2ème Ed. MASSON - Paris 89.
3 -
GINESTET D., KAPSAMBEUS V. et BRION N. (1988) : Neuroleptiques in
Pharmacologie clinique : Bases de la thérapeutique. Expansion scientifique
Française, Paris, 2ème Ed. 1209-1232
4 -
WMPO M. (1993) : Etude pharmaco-toxicologique chez la souris et le rat de
Khaya senegalensis (Desr.) A. Juss. (MEUACEAE) utilisé en tradithérapeutique
au Burkina Faso. Mém. de DEA Sc. Biol. Appl. (Physiol. Animale) Univ.
Ouagadougou 66-71
5 •
WMPO M. (1995) : Effet hypothermisant et toxicité générale aiguë chez les
souris des écorces de tronc de KASE. CAMES Pharm. Méd. Trad. Mr. Lomé
Presses de l'UB 73-80
6·
NIKIEMAJ.B. (1997): Contribution à l'étude phytochimiqueet pharmacologique
de Leptenia hastata (pres.) Decne. Thèse Doctorat ès Sciences Pharmaceutiques.
Institut de Pharmacie. Univ. Libre de Bruxelles.
7 -
PRADEAU D. (1992) : L'analyse pratique du médicament. Ed. Médicales
Internationales. Tee et Doc. Lavoisier Paris - 970-976.
8·
TALLARIDA R.J. and MURRAY R.B. (1987) : Pharmacologie Calculation
System based on "Manual of Pharmacologie Calculations with Computer
Programm". Secoud Edition. Spring-Verlag. New York Inc. Seriai N° 423213 -
12.28.1994.
9 -
TUBARO A., DR! P., DELBEUO G., ZILU C., DELLA WGGIA R.
(1985) : The Croton Oil Ear Test revisited. Agents and Actions, Vol. 17, 3-4
10 -
WEPIERRE J. (1977) : Abrégé de Pharmacodynamie générale. Ed. MASSON -
Paris, 18-22.
- 79-