Pharm. Méd. Trad. Afr. 1997, Vol. 9, pp. 109-121.
ACTIVITÉ ANTIPALUDIQUE D'EXTRAITS DE FEUILLES
DE Cassia spectabilis et Entandrophragma
angolense
NDOUNGA, M.12
•
j FLINIAUX, MA.3 et CARME, B.2
1. - Centre d'Etudes sur les Ressources Végétales (CERVE),
RP. 1249 Brazzaville, Congo.
2. - Service de Parasitologie et Mycologie, CHU Hôpital Sud,
80 Amiens, France.
3. - Laboratoire de Biologie Cellulaire et Biochimie Végétale
Faculté de Pharmacie, 80 Amiens, France.
I. - INTRODUCTION
Le paludisme à Plasmodium falciparum reste pour le Congo la principale endémie.
Il est responsable d'une grande mortalité et morbidité. Son incidence est en constante
augmentation en raison de la pharmacorésistance mais aussi de la dégradation des
conditions socio-économiques qui empêchent la grande partie de la population d'acquérir
les médicaments efficaces mais onéreux. C'est ainsi que des traitements alternatifs il base
de plantes sont de plus en plus utilisés pour soigner les fièvres attribuées à tort ou il raison
à la malaria. L'étude de ces plantes s'impose par conséquent pour infirmer ou confirmer
leur usage en médecine traditionnelle et permettre aux populations de les utiliser
rationnellement.
Dans le cadre de l'étude des propriétés antimalariques des plantes de la flore
congolaise, nous avons ciblé deux espèces végétales. La première, Cassia !>1}ectabilis DC
(Caesalpiniaceae) est utilisée selon quelques informations dans le traitement des fièvres
attribuées au paludisme. Il faut signaler qu'un autre Cassia, Cassia occidentalis L. est plus
couramment utilisé en phytothérapie traditionnelle congolaise pour le même usage. Cette
espèce ainsi que Cassia abreviata ont fait l'objet d'une évaluation de l'activité
antipaludique in vitro. Cela a permis de mettre en évidence une faible activité pour C.
abreviata, tandis que pour C. occidentalis les tests se sont révélés négatifs [Weenen et al.
1990].
1
La seconde, Entandrophragma angolense C.CD. (Meliaceae) n'est pas utilisée dans
i
le traitement traditionnel du paludisme. Cependant, des espèces de la même famille
1
r
comme Azadirachta indica, Melia azadarach, Cedra odorata, Guerea multiflora, Khaya
t
- 109-
1
1
1
1
grandifoliola Khaya ivorensis et Khaya senegalensis sont employées dans certains pays
dans le traitement des symptômes de la malaria. Ces plantes renferment des substances
appelées liminoîdes fortement actives in vitro sur la maturation de Plasmodium falciparum
[Khalid et al. 1986; Bray et al. 1990]. Pour sa partAo indica réduit de façon significative
la parasitémie des souris porteuses de Plasmodium berghei [Abatan et al. 1986]. Il en est
de même de K grandifoliola, K ivorensis et K senegalensis [Makinde et al. 1988; Awe
et al. 1991]. Dans le genre Entandrophrama, E. bussei a révélé une activité in vitro faible
comparable à celle d'A. indica [Weenen et al. 1990].
Dans cette communication, nous présentons les résultats obtenus après l'évaluation
de l'activité antipaludique in vitro des extraits de C. spectabilis et E. angolense sur la
souche de Plasmodium falciparum W2 chloroquinorésistance. L'extrait le plus actif a par
ailleurs été administré à des souris parasités avec plasmodium berghei pour l'évaluation
de l'activité antipaludique in vivo et testé vis-à-vis de la lignée cellulaire MRC5 pour la
détermination de l'effet cytotoxique in vitro.
Mots clés:
Cassia spectabilis, Entandrophragma angolense, activité antipaludique,
test in vitro, test in vivo, cytotoxicité.
II. - MATERIEL ET METHODES
2.1. - Matériel végétal
Cassia spectabilis. Les feuilles de cet arbre ornemental très courant au Congo sont
utilisées sous forme de décocté dans le traitement des fièvres attribuées au paludisme. Le
décocté aqueux des feuilles est également administré per os pour traiter la blennoragie
[Ajanohoun 1988]. Le jus des écorces de tronc est donné en boisson contre les maux de
reins et de ventre [Bouquet 1969]. C'est une des espèces qui renferment des alcaloïdes
[Christofidis 1977a, 1977b, Mulchandani 1977]. Des quinones ont par ailleurs été
identifiés [Mulchandani et al 1977]. L'échantillon testé a été cueilli en Septembre 1994
dans l'enceinte de l'ORSTOM de Brazzaville.
Entandrophragma
angolense est un grand arbre de forêt primaire. Au Congo, il est
employé comme analgésique, anti-inflammatoire [Bouquet 1969]. Une étude récente a mis
en évidence une activité antiulcéreuse de l'extrait méthanolique de l'écorce de tronc, le
principe actif étant le méthylangolensate [Njar et al 1995]. Les feuilles testées ont été
récoltées dans la forêt primaire de Ntonkama à 30 km de Brazzaville en Août 1994.
- 110-
!1i
2.2. - Préparation des extraits
~t
Les feuilles séchées à l'abri du soleil sont broyées et la poudre traitée à chaud
l
pendant 2 H par le chloroforme. L'extrait sec obtenu après évaporation du solvant est
repris à froid par le méthanol. On recueille une fraction soluble et résidu insoluble MeOH.
Les rendements des différents extraits sont consignés dans le tableau 1.
1
Dans les extraits chloroformiques, nous avons recherché la présence des alcaloïdes
sur C.C.M. de silice, après révélation à l'UV et pulvérisation du réactif de Dragendorf.
1
Seul C. spectabilis a monté la présence d'alcaloïdes de façon très marquée.
f
2.3.• Evaluation de l'activité antimalarique in vitro
1
f
La souche de Plasmodium falciparum
W2 chloroquinorésitan~e ongmaire
d'Indochine est issue d'un clonage réalisé par D. Walliker de l'Université d'Edinbourgh
(GB). Le maintien en culture s'est fait suivant la technique de culture in vitro [Trager et
Jensen 1976]. Pour l'évaluation de l'activité in vitro, nous avons utilisé le microtest
isotopique qui nous sert depuis plusieurs années pour la surveillance de la chloroquino-
résistance au Congo [Mirowsky et al 1990].
Solubilisation des produits testés. Le DMSO est utilisé pour les extraits à raison
de 80 mg/ml; les solutions mères d'extraits sont diluées avec le milieu de culture RPMI
1640 additionné de 10% de sérum humain. Les solutions de base ont une concentration
de 400~g/ml. Le sulfate de chloroquine est dissout dans le chlorure de sodium 0.9% pour
une solution de 5 mg/ml équivalent chloroquine base; celle-ci est diluée pour avoir une
solution de base à 3 ~g/ml.
Réalisation des tests. Les solutions d'extraits et de chloroquine sont réparties dans
des plaques de culture à fond plat de 96 puits (Costar) à raison de 100 ~1/cupule et 2
cupules par produit. Après dilution (ordre 2), on ajoute dans chaque cupule 200 ~l d'une
suspension de globules rouges parasites renfermant 0.4 ~Cie/ml d'hypoxanthine tritiée
(ICN Pharmaceuticals). Les plaques contiennent à cette étape une série de 9 concentrations
pour la chloroquine (600; 300; 150; 75; 37.5; 18.75; 9.38; 4.7; 2.3) et des séries de 6
concentrations pour les extraits de plantes (160; 80; 40; 20; 10; 5). Les plaques sont
1
portées à 37°C dans une étuve à CO pendant 44 H.
2
1
Après l'incubation, on procède à la collecte des hématies sur des filtres spéciaux
avec un collecteur de cellules semi automatique (Stakron). Ces filtres imprégnés de
f
parasités sont placés dans des mini tubes contenant du liquide à scintillation (Optiscint)
afin de procéder au comptage de la radioactivité à l'aide d'un compteur Beta (LBK Rack
1
Beta).
t
- 111-
1
1
Exploitation des données. Deux essais au moins sont réalisés pour la détermination de
la C.I.50 (concentration inhibitrice 50) obtenue en exprimant les pourcentages d'inhibition
de la maturation des parasites en fonction du logarithme des concentrations. La courbe qui
représente cette fonction est d'allure sigmoîde. Sur la partie de la courbe comprise entre
20 et 80% assimilable à une droite, on calcule l'équation de la droite de régression. Nous
avons utilisé pour cela le Logiciel Microsoft Excel 4.0 pour Macintosh.
2.4.· Détermination des effets cytotoxiques
Réalisation du test. L'effet cytotoxique est déterminé par une méthode semi-
quantitative rapide (Quentin - Leclercq 1990). Nous avons utilisé pour cela les cellules
MRC5 (EURO BIO) de poumon d'embryon humain. La suspension commerciale de cellule,
après dilution à environ 5.104 cell./ml est répartie dans des plaques de culture à fond plat
de 96 puits à raison de 250 !-tg/cupule. Le milieu de culture est constitué par le milieu de
base MEN additionné de L-glutamine, d'antibiotiques, de bicarbonate de sodium et de
10% de sérum de veau foetal. Après 24 II d'incubation à l'étuve à 37°C dans une étuve
à CO2, le milieu de culture est remplacé par le même volume de la dilution du produit à
tester en utilisant quatre (4) cupules pour chaque dilution.
Après 72 H d'incubation supplémentaires, on fixe le~ cellules en remplaçant les
milieux de culture par 100 !-tl d'éthanol 96% préalablement maintenu à -20°e. La fixation
à proprement parler dure 30 mn, les plaques de culture étant maintenues à -20°e.
L'éthanol éliminé, on ajoute pour la coloration des cellules 50!-tl d'une solution de bleu de
toluidine à 2%. Les plaques sont laissées à la température ambiante. Elles sont enfin
lavées à l'eau courante et séchées retournées.
Interprétation des résultats. On estime visuellement l'intensité de la coloration à partir
de l'échelle de cotation ci-après :
: absence de coloration = absence de cellules vivantes, fixées et colorées,
+
: coloration très faible = présence de quelques cellules vivantes,
++
: assez forte coloration = présence d'assez nombreuses cellules vivantes,
+++
: forte coloration = présence de nombreuses cellules vivantes
++++
: très forte coloration = très nombreuses cellules colorées (témoins)
2.5.• Evaluation de l'activité antipaludique in vivo
Animaux. Nous avons appliqué le test suppressif de 4 jours [Peters 1973, Abatan
1986, Fandeur 1985]. Des souris non consanguines OF1 (IFFA-CREDO) pesant 20 à 25
g réparties en lots de 5 sont infestées avec du sang provenant de souris parasitées depuis
- 112-
4 à 5 jours avec Plasmodium berghei et présentant une parasitémie d'environ 15 à 20%.
A chaque animale on injecte 1O01l1 de sang dilué au 1/10ème dans le PBS: L'inoculum
contient environ 5.100 hématies parasitées.
Traitement des animaux. Les extraits sont administrés sous la forme d'émulsions
contenant 2% de Tween 80 dans la solution saline. La chloroquine (sulfate) est
directement solubilisée avec la solution saline. Le traitement des animaux commence
aussitôt après leur infestation par voie orale ou sous cutanée en injectant à chaque souris
quatre doses consécutives (1 dose/jour) de 10 à 10+3. Un lot témoin est prévu pour chaque
série d'essais auquel on administre 0.5 ml d'une solution à 2% de Tween 80.
Exploitation des données. Le contrôle de la parasitémie se fait à 10+4 sur frottis
mince réalisé avec une goutte de sang prélevée à la pointe de la queue et coloré au RAL.
Pour chaque animal, on rapporte le pourcentage de réduction de la parasitémie à 10+4 et
la durée de survie des souris traitées par rapport aux témoins. L'analyse statistique des
données brutes a été rendue possible grâce au Programme EPIDEMIO, Version 1988, B.
t
DUFLO, Paris. Il permet la comparaison des moyennes en utilisant le Test de Student qui
1
donne la probabilité P d'établir une différence significative entre la réponse des animaux
témoins et celle des souris traitées si P < 0.05.
1
III. - RESULTATS ET DISCUSSION
3.1. - Activité antimalarique in vitro
Les résultats des essais in vitro rapportés dans le tableau 2 montrent un profil
1
d'activité intéressant pour E. angolense. Sa fraction soluble MeOH (C.I.50 = 10 Ilg/ml)
i
est significativement plus active que l'extrait chloroformique (C.I.50 =28.9 Ilg/ml), P =
0.01. On constate également que le fractionnement permet une concentration des principes
actifs dans la fraction soluble MeOH. Le résidu insoluble MeOH (C.I.50 =53 Ilg/ml) a
une activité faible en comparaison de l'extrait chloroformique, P < 0.01.
1
1
;
Pour C. spectabilis, le fractionnement donne un résidu insoluble très peu actif
1
(C.I.50 = 15.8 Ilg/mi) plus actif. Cette fraction n'est pas significativement plus active que
l'extrait chloroformique (C.I.50 = 32.2 Ilg/ml), P = 0.1.
1
L'ensemble des résultats permet de conclure à une activité faible des deux plantes
si on établit une comparaison avec la chloroquine (C.I.50 = 0.212 Ilg/ml. E. angolense est
1
,
néanmoins un peu plus active que C. spectabilis.
.
11
- 113-
1
)
1
f
!1
1
3.2. Effet cytotoxique
On note une forte létalité à 200 Ilg/mllorsque les cellules sont mises en présence
de la fraction soluble MeOH de C. spectabilis. Avec 100 et sa Ilg/ml, l'action' du même
extrait est très limitée ou nulle. Pour E. angolense, aucune cellule ne survit à 200 et 100
Ilg/ml. La non létalité est observée à 12.5 Ilg/ml. La chloroquine a un effet cytotoxique
très modéré. La concentration non létale est de lS.6 Ilg/ml. Avec 2S Ilg/ml on observe la
mort de toutes les cellules.
La prise en compte des indices cytotoxiques permet de conclure à une cytotoxicité
prononcée mais assez comparable des fractions solubles MeOH de C. spectabilis (indice
= 6) et d'E. angolense (indice = S). Nous avons également la confirmation de l'action
modérée de la chloroquine (indice = 30) sur la multiplication et la survie des cellules
MRCS.
3.3. Activité antimalarique in vivo
Par voie orale, l'administration de 200 mg/kg d'une suspension de la fraction
soluble MeOH de l'extrait chloroformique de C. spectabilis ne provoque aucune réduction
de la parasitémie à 10+4 (P>O.OS) bien qu'on observe une légère prolongation de la survie
des animaux traités (P = 0.01). Dans les mêmes conditions, la fraction soluble MeOH d'E.
angolense induit une réduction de la parasitémie de 4S% (P = 0.04) à 10+4 et une
prolongation de la survie des souris traitées (P < 0.01). Le sulfate de chloroquine à la dose
de S mg/kg provoque une forte réduction de la parasitémie de 99.9% (P < 0.91) et une
prolongation de la survie (P < 0.01).
Par voie sous cutanée, les deux extraits de plante ne provoquent ni réduction de
la parasitémie ni prolongation de la survie (P > O.OS). La chloroquine à la dose de 2.5
mglkg induit une réduction de la parasitémie à 10+4 (P < 0.01) et une prolongation de la
survie des animaux traités (P = 0.03). Avec 5 mglkg, on obtient une guérison totale des
souris qui se traduit par l'absence d'hématozoaires dans le sang des souris traitées à Jo+4
et Jo+ 14.
III. - CONCLUSION
L'évaluation de l'activité antipaludique de deux (2) plantes de la flore congolaise
nous a donné des résultats intéressants. En effet, C. spectabilis sélectionnée sur la base de
données ethnopharmacognosiques c'est-à-dire
en prenant en compte son usage en
médecine traditionnelle, s'est révélée faiblement active in vitro comparée à la chloroquine,
- 114-
tandis qu'in vivo, on n'observe aucun effet significatif sur l'évolution de la parasitémie des
souris traitées.
Pour E. angolense choisie sur la base des données chimiotaxonomiques, l'activité
in vitro quoique faible est néanmoins plus forte à celle de C. spectabilis. Les essais in
vivo ont montré par ailleurs que l'extrait d'E. angolense réduit de façon significative la
parasitémie après traitement des animaux par voie orale. Le traitement sous-cutanée n'a
1
pas cependant donné de résultat significatif.
1
Les deux plantes ont une activité cytotoxique forte sur les cellulés MRCS en
comparaison de la chloroquine qui présente une action modérée.
1
!f
Les résultats de l'évaluation de l'activité antipaludique montrent qu'en adoptant la
démarche chimiotaxonomique, il est possible de sélectionner des plantes suffisamment
actives. L'interprétation de ces résultats demande néanmoins une certaine prudence en ce
1
qui concerne l'usage traditionnel de C. spectabilis tant l'activité peut varier en fonction de
la saison de collecte ou du cycle biologique. Ces résultats montrent qu'E. angolense est
potentiellement antipalustre et confirme l'intérêt des Meliaceae.
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- 117··
Tableau 1 : Rendement des extraits et fractions préparés
C. spectabilis
E. angolense
Extrait chloroformique
15%
12%
Fraction soluble MeOH
7.5%
7.5%
Résidu insoluble MeOH
4.2%
1.7%
Tableau 2 : Activité antipaludique in vitro d'extraits de
C. spectabilis et E. angolense
Nbre
C.I.50 en ,ug/m1
Statistique
d'essais
C. spectabilis
Extrait chloroformique
2
32.2(23.9-40.6)
p= O.l(DNS)"
Fraction soluble MeOH
2
15.8(15.4-16.2)
Résidu insoluble MeO
2
92(73-111)
E. angolense
Extrait chloroformique
2
28.9(28.6-29,2)
P = O,Ol(DS)"
Fraction soluble MeOH
2
10(9.7-10.3)
P =0.04(DS)"
Résidu insoluble MeO
2
53(52.4-53.6)
Chloroquine
4
0.212(0.176-0.247)
DNS : différence non significative ; DS : différence significative; a : Fraction soluble
MeOH versus extrait chloroformique ; b : résidu insoluble MeOH versus extrait
chloroformique.
- 118-
Tableau 3 : Effet cytotoxique in vitro d'extraits de
C. spectabilis et E. angolense
Concentrations en
C. spectabilisc
E. angolensec
Chloroquine
!lg/ml
200
+
-
nt
100
+++
-
nt
50
++++
++
nl
25
++++
+++
nt
12.5
++++
++++
+
6.25
++++
++++
++
3.12
nt
nt
+++
1.56
nt
nt
++++
0.78
nt
nt
++++
1
0
++++
++++
++++
l
Indice cytotoxique
100
50
6.25
------
= 6
- ... ----
=5
------
::: 30
1
15.8
10
0.212
nt : non testé; c : fraction soluble MeOH de l'extrait chloroformique
- : absence de coloration et de cellules vivantes, fixées et colorées ; + : coloration très
(
faible::: présence de quelques cellules vivantes; ++ : assez forte coloration::: présence
,.
d'assez nombreuses cellules vivantes; +++ : forte coloration::: présence de nombreuses
f'.•
cellules vivantes ; ++++ : très forte coloration ::: très nombreuses cellules colorées
(témoins).
- 119-
1
Tableau 5: Activité antipaludique in vivo des extraits de C. spectabilis et E. allgolense
(traitement sous-cutané)
Dose en
Parasitémie en % a 10+4
Durée moyenne de survie en
mg/kg
jours
S.
S.traitées
%
S.témoins
S.traitées
Statis-
témoins
& statis-
réduction
tique
tique
C.speclabi/is
80
23.3
17.4 (13.
25
5.6
6.2
P=O.3
(13-33)
5-21.5)
DNS
P=0.14
DNS
E.ango/ense
80
23.3
21 (15-
10
5,6
6
P=O,4
(13-33)
27)
DNS
P=0.06
DNS
Ch/oroquine
2.5
23.3
1.2
su/tale
(13-33)
(0.7-1.7)
lJl
56
6.8
P=O.03
P<O,OI
OS
OS
5
23.3
0
1
(13-33)
P<O.OI
100
5.6
guérisof1
P«WI
OS
1
totale à
OS
t
10+4
f
t
1
r
f
1
1
t
- 121-
r!!!r