Pharm. Méd. Trad. Afr. 1997, Vol. 9, pp.40-47.
LA STANDARDISATION DES PHYTOMÉDICAMENTS
PAR LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE À HAUTE
PERFORMANCE (HPLC)
K. DOTSÉ*, R. ASSAGBUI**, K. KOUMAGLO"',J.T. ARNASON*'"
et
M. GBEASSOR*
* Centre de Recherche et de Formation sur les Plantes
Médicinales (CERFOPLAM),
Université du Bénin, RP. 1515, Lomé, Togo.
"* Université d'Ottawa, Département de Biologie,
f
Ontario, Canada.
f
RESUME
1
L'utilisation des plantes médicinales dans les soins de santé primaires dans les
f
pays africains, est très répandue et répond à des exigences tant culturelles qu'économiques.
Pour permettre une meilleure intégration de la médecine traditionnelle dans le système
sanitaire de nos pays, il s'avère de plus en plus important de bien caractériser les
médicaments dérivés de plantes sur le plan chimique, pharmacologique et toxicologique.
Dans le souci d'assurer le contrôle de qualité des phytomédicaments éthiques, nous
f
avons mis au point une méthode par HPLC nous permettant de quantifier l'une des
1
molécules actives dans la préparation.
Mots clés:
Phytomédicament,
Standardisation, Azadirachta
indica,
Psidium
guajava, Zingiber officinale, HPLC
INTRODUCTIO~
La production de Phytomédicaments éthiques semble être une étape indispensable
dans les pays en développement et particulièrement ceux d'Afrique pour assurer une
meilleure couverture sanitaire de la population.
Le contrôle de qualité des produits dérivés de plantes est une exigence avant leur
mise sur le marché comme médicaments. Trop souvent on remarque· qu'une action
- 40-
pharmacologique spécifique est décrite pour un produit de plante mais qu'il n'y a pas de
caractérisation chimique.
La chromatographie est la méthode la plus utilisée pour le contrôle de qualité des
extraits de plante (1). Généralement la chromatographie sur couche mince (TLC), la
chromatographie liquide à haute performance (HPLC) sont utilisées comme des méthodes
qualitatives. Si les principes actifs sont connus, les mêmes techniques sont appliquées à
des fins quantitatives.
Dans notre centre nous avons développé des méthodes de standardisation avec le
HPLC. Les résultats obtenus pour trois extraits sont présentés dans cette communication.
MATERIEL ET METHODES
Trois extraits de plantes différentes ont été utilisés. Il s'agit de Azadirachta indica,
Psidium guajava et Zingiber officinale.
Les échantillons des plantes ont été récoltés au Togo, leur authentification a été
effectuée par le laboratoire de Botanique de l'Université du Bénin où des spécimens sont
déposés.
Les méthodes de préparation des extraits varient d'une plante à l'autre.
. Extrait de Azadirachta indica
Les feuilles de Azadirachta indica (236.29g) hachées sont extraites dans l'éthanol
95%. Après filtration sous vide sur papier Whatman N°l, le filtrat est concentré à 500 ml
par évaporation sous vide, puis filtré par microfiltre et dilué 3 fois pour l'analyse.
. Extrait de Psidium guajava
A 5g de feuille de goyavier moulue sont ajoutés 100mi d'éthanol 95%. Le
mélange est agité et laissé pour macération pendant 24H. Après filtration sous vide sur
papier Whatman N°l, l'extrait est évaporé presque à sec. Le concentré est récupéré en
rinçant le ballon avec de l'eau ultra-pure. On y ajoute du HCl concentré pour avoir un pH
entre IN et 2N. On chauffe avec reflux dans un bain d'eau bouillant pendant 30 minutes
et on laisse refroidir. La quercétine est extraite dans une ampoule à décanter de 250 ml
avec 2 fois 50 ml d'acétate d'éthyle. La phase organique est récupérée et filtrée sur papier
Whatman N°l sous vide. Après évaporation à sec, le résidu est dissous dans 5 ml de
méthanol, fùtré par mÏcrofùtre et analysé à l'HPLC.
- 41 -
· Extrait de Zingiber officinale
170 ml de méthanol sont ajoutés à 5g de gingembre broyé. Le mélange est agité
pendant 1 mn avec le Waring Blender, puis laissé macérer pendant 20 min. 11 est filtré
sous vide sur papier Whatman N°l et le filtrat est évaporé à sec. L'extrait repris dans
5 ml de méthanol est filtré sur membrane (0,2f.!m) puis analysé par HPLC.
RESULTATS
1
Extrait de Azadirachta indica
1
Le principe actif recherché dans cet extrait est la gédunine. L'étalonnage a été
,,
effectué avec un standard mis en solution dans de l'éthanol à 95% à raison de lmg/ml.
L'analyse chromatographique a été faite dans les conditions su ivantes :
- Phase mobile: mélange méthanol/eau dans les proportions
initia les
respectives de 40% et 60% avec un gradient d'eau de 60 - 35% de °à 5 min, 35-0% de
20 à 24 min et 0-60% de 27 à 28 min.
- débit: Iml/min
- longueurs d'onde: 215 et 350 mn
- volume injecté : 20f.!1
t
- durée de l'analyse: 45 min
Les résultats pour la courbe standard sont les suivants:
Quantité injectée
Hauteur du pic
(mg)
(cm)
f
i
1,000
3,98
0,500
1,96
0,250
1,31
0,125
0,79
0,0625
0,55
1
0.000
o
1
De ces résultats on tire l'équation de la droite qui est Y = 4.0694x (r2 = 0,973)
avec y = hauteur du pic et x la quantité injectée en mg.
f
f
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1
1
1
1
La figure 1 montre le profil du spectre après l'injection de 20!-tl de l'extrait de
Azadirachta indica. Le pic de la Gédunine sort à 26,58 min avec une hauteur de 1,18 cm.
La concentration est estimée à I,S4mg/g de matériel sec.
.
Extrait de Psidium guajava
Le principe actif recherché est la quercétine. Les conditions de l'analyse
chromatographique sont les suivantes:
- phase mobile: Méthanol / 5% acide acétique (aq) (7:83)
- gradient d'acide: 93-83% de 2 à 8 min, 83-25% cie 8 il
25 min, 25-20% de 25 à 27 min, 20-0% de 29 à 30 min,
0-93% de 32 à 33 min.
- débit: 1,5mllmin
- longueur d'onde: 2S0 et 350 nm
- volume injecté : 20/11
- durée d'analyse: 35 min.
L'équation de la courbe d'étalonnage à partir du standard est Y =0,067x, x étant
la quantité exprimée en !-tg.
La figure 2 montre le profile du spectre de l'extrait. La quercétine sorl ù lO.Y()
min. Sa concentration dans l'extrait est estimée à 71,65~Lg/g cie matériel sec.
Extrait de Zingiber officinale
Le principe actif recherché est
le gi ngerol.
Les conditions de l'analyse
chromatographique sont les suivantes:
- phase mobile: Acétonitrile/2% acide acétique (aq) (40:60)
- débit: 1,5 ml/min;
- longueur d'onde : 270 nm
- volume injecté: 20 !-tl
- durée d'analyse: 10 min.
DISCUSS10N
La chromatographie liquide à haute performmlce (HPLC) est la méthode la plus
utilisée pour l'analyse chimique des extraits bioactifs(l). La raison principale est que cette
- 43 -
technique permet une analyse directe d'extraits aqueux. Par ailleurs il existe un certain
nombre de détecteurs susceptibles de donner des signes spécifiques en fonction des
composés.
Nous avons montré que le HPLC permet de caractériser la gédunine, la quercétine
et le gingerole qui sont des composés bioactifs retrouvés respectivement dans les extraits
de Azadirachta indica (2) de Psidium guajava (5,7) et Zingiher oJjïcinale (3,4). En
disposant de standards commerciaux purs de ces composés, la technique permet même
d'estimer leur quantité présente dans les échantillons. Ce qui fait une méthode fiable pour
le contrôle de qualité des phytomédicamellts.
REFERENCES
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Medicinal Plan Industry. CRC Press, pp : 99 - 105, 1991
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3 -
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Figure 3: Chromatogramme d'un extrait de gingembre.
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