Pharm. Méd. Trad. Afr. 1997, Vol. 9, pp.24-33.
ETUDE DE L'EFFET HÉPATOPROTECTEUR D'UNE
PLANTE DE LA PHARMACOPÉE SÉNÉGALAISE :
TINOSPORA BAKIS (MENISPERMACEAE) À PARTIR
D'UN MODÈLE IN VITRO
DlALLÛ A.,
NDIAYE/NIANG M.,
NDIAYE A.K.,
DlENG c.,
FAYE B.
Laboratoire de Pharmacologie/Physiologie
Faculté de Médecine et Pharmacie - UCAD - DAKAR
RESUME
L'objectif de ce travail est d'étudier les propriétés hépatoprotectrices de l'extrait
aqueux lyophilisé des racines de Tinospora bakis à partir d'un modèle in vitro.
La méthodologie consiste à isoler des hépatocytes de rat et à les incuber après
intoxication par le CCl en présence et en absence de différentes concentrations de l'extrait
4
aqueux de Tinospora bakis.
La protection des hépatocytes est évaluée par la baisse du pourcentage de
relargage des enzymes intracellulaires (LDH et ASAT).
Les relations doses-effets ont été étudiées pour des concentrations d'extrait variant
de 1 mg/ml à 4 mg/ml, cie même que l'influence du temps sur la cytoprotection.
Les résultats obtenus sont les suivants:
Le nombre de cellules isolées par rat est de 185,4 millions ± 71,5 avec une
variabilité> 90%. Les pourcentages de relargage des ASAT et LDH par les hépatocytes
sont significativement diminués en présence de bakis.
Les effets cytoprotecteurs de l'extrait ne sont pas close-dépendants, en revanche,
plus le temps d'incubation est long, plus la protection est importante.
Par ce travail, nous démontrons pour la première fois la protection directe des
cellules de foie par l'extrait aqueux des racines de Tin()~jJora bakis confirmant ses
propriétés hépatoprotectrices.
- 24 -

Dans notre travail, nous étudierons les propriétés hépatoprotectrices de l'extrait
aqueux lyophilisé de T. bakis sur des hépatocytes isolés de rat après intoxication par Je
CCI4•
II. - MATERIEL ET METHODES
1. Préparation de l'extrait aqueux IYQQhilisé~T. bill<i~
Les racines de Tinospora bakis ont été achetées au marché Tilène (Dakar-
Medina). Elles sont coupées en petites rondelles, séchées à l'étuve puis broyées. 2 kg de
racines fraîches ont donné 415 g de poudre sèche.
On réalise une décoction à raison de 125 g de poudre pour 1 litre d'eau distillée.
Le décocté est filtré à chaud sur gaze puis centrifugé à faible vitesse (70 g). Le
surnageant est recueilli et lyophilisé.
Des rats Wistar d'un poids moyen de 200 g ont été utilisés. Ils sont mis à jeun 18
heures avant l'isolement des hépatocytes, par contre ils ont libre accès à ['eau.
3. Isolement et purification des hépatocytes
A) - Isolement: nous avons utilisé la méthode de Seglen modifiée par le Cam (7).
1
B) - Purification des hépatocytes : nous avons utilisé la méthode de Dolet et al (4) qui
f
s'effectue sur gradient de Percoll.
1
4. Intoxication des hépatocytes par le CCI,
Les hépatocytes isolés sont mis en suspension dans le Leitbovitz à raison de
5 millions de cellules pour 1 ml de milieu. Les suspensions cellulaires sont incubées à
1
l'étuve à 37°C en présence de CC1 (2 mM) préalablement solubilisé dans du DMSO.
4
t
- 26 -
l '
1
i
1
1
~

Après 15 et 30 minutes d'incubation, les suspensions cellulaires sont centrifugées
à 1000 tours/minute (70 g) ; sumageants et culots sont alors récupérés pour ~éterminer le
pourcentage de relargage de la LDH et des ASAT qui sont des enzymes cytosoliques dont
la présence dans le milieu de culture des cellules est le signe d'une nécrose cellulaire dont
le dosage permet d'en évaluer l'importance. Les réactions s'effectuent avec un kit
(BJOTROL).
La mesure de la LDH ou des ASAT extracellulaires est effectuée sur un aliquot
du milieu de culture cellulaire, celle de la LDH ou des ASAT totales sur suspension
cellulaire après perméabilisation des membranes par une solution de Triton 0,2% dans un
tampon PBS pH 7,2. Le pourcentage de relargage est calculé en effectuant le rapport.
Quantité enzyme extracelluJaire/Quantité totale enzymes
5. Etude de la cytQQrotection l:!~ato~-Y!~lÎre par J'extrait aqueux
de Tinospora bakis
Pour l'étude de la cytoprotection deux méthodes ont été utilisées .
. Méthode préventive : elle consiste à incuber à 37°C les hépatocytes isolés (5 mil-
lions/ml) avec l'extrait de Tinospora bakis pendant 15 ou 30 minutes puis à faire agir Je
toxique de référence le CCl pendant 15 minutes .
4
. Méthode curative: elle consiste à ajouter à la suspension cellulaire l'extrait du bakis et
le CCl simultanément, et à incuber le mélange à 3rC pendant 15 à 30 minutes.
4
Le CCl a été utilisé à la concentration de 2 mM ; l'extrait de T. bakis préalablement
4
solubilisé dans du DMSO à des concentrations allant de 1 mg/ml à 4 mg/ml. Le pourcen-
tage de relargage de la LDH et des ASAT est déterminé.
III. - RESULTATS
Les résu Hats de l'isolement, de la viabilité sont résumés dans le tableau 1. Ils
représentent la moyenne ± un écart type des résultats obtenus à partir de 35 expériences.
Les résultats de J'effet de T. bakis sur les hépatocytes isolés en fonction du temps et de
la concentration sont présentés dans les tableaux II - III - IV. Les résultats sont donnés
sous forme de moyenne ± un écart type. Les moyennes inter et intragrouges ont été
comparées par analyse de variance (Test de Fischer). Les valeurs de P < 0,05 ont été
considérées comme significatives.
- 27-

~ot~clé~. : Tinospora bakis ; Hépatoprotection ; Hépatocytes isolés; Rat.
SUMMARY
The aim of this work is to study hepatoprotective properties of lyophilized aqueous extract
of Tinospora bakis roots.
We used hepatocytes isolated from rats and intoxication celles were treated with different
concentrations of Tinospora bakis extract. (1 mg to 4 mg/ml)
Protection of cells is evaluated by the decrease of intrncellular enzymes release (LDH and
ASAT). The impact of time on the cytoprotection was also studied.
From each rat we isolated 185,4 millions 1. 71,S hepatocytes. The percent of ASAT and
LDH release was significatively decrease when we compared treated and not treated
hepatocytes suggesting cells protection.
This cytoprotection is dos independant but is more effective for long time treatment.
These results show the direct protection of isolated hepatocytes by Tinm;pora hakis
extract.
Key words : Tinospora bakis ; hepatoprotection ; lsolated hepatocytes ; Rat.
1. - INTRODUCTION
Tinospora bakis est une plante de la pharmacopée sénégalaise très utilisée en
médecine traditionnelle dans le traitement des maladies du foie et des voies biliaires.
Elle serait hépatoprotectrice. Cependant nous disposons de peu de travaux
scientifiques ayant validé cette propriété.
La seule étude qui nous parait significative est celle de KAMSOULOUM et al (6)
dont les résultats sur modèle in vivo suggèrent une protection du foie par un extrait
aqueux de Tinospora bakis.
- 25 -

Tableau 1 : Résultats de l'isolement et de la viabilité des hépatocytes isolés.
Nombre de cellules isolées
(Millions/ra t)
185,4 ± 71,5
Viabilité cellulaire (%)
90,7
5,0
±
Tableau II : Effets de l'extrait de T. bakis sur le pourcentage de relargage de la LDH et
des ASAT
Résultats de la méthode préventive après 15 minutes d'incubation.
Nature suspension
LDH
ASAT
% relargage
% relargage
Cellules seules
t
= 5,0 ± 2,6
3,5 ± 0,7
o
t15 = 8,9 ± 4,5
Cellules + CCl
2 mM
34,04 ± 8,0
32,51
4
Cellules + CCl
2mM
4
+ bakis 1mg/ml
28,6 ± 1,5
21,7 ± 5,3
+ bakis 2mg/ml
27,6 ± 3,3
22,0 ± 5,7
+ bakis 3mg/ml
25,4 ± 3,5
21,2 ± 4,2
+ bakis 4mg/ml
23,8 ± 5,6
20,8 ± 4,0
- 28-

Tableau III : Effets de l'extrait de T. bakis sur le pourcentage de la LDH e't des ASAT.
Résultats de la méthode préventive après 30' d'incubation
Nature suspension
LDH
ASAT
% relargage
% relargage
Cellules seules
to = 1,0 ± 0,2
lo
=8,2 + 1,3
lis
=3,8 ± 0,7
t
= 12,5+ 4,1
45
Cellules + CC1
2mM
31,7 ± ]0,5
4
45,6 ± 5,0
Cellules + CC1
2mM
4
+ bakis 1mg/ml
24,6 ± 8,8
35,7 ± 2,5
+ bakis 2mglml
24,9 ± 5,2
29,3 ± 3,9
+ bakis 3mglml
18,9 ± 4,9
21,7 ± 2,5
+ bakis 4mglml
-
17,3 ± 1,9
..
Tabl~_ill!.JV : Effets de l'extrait de T. bakis sur le pourcentage de relargage de la LDH e
des ASAT
Résultats de la méthode curative après 15' d'incubation
Nature suspension
LDH
ASAT
% relargage
% relargage
Cellules seules
14,2 ± 6,2
3,9 + 0,7
Cellules + CC1
2mM
23,2 ± 0,2
55,3 ± 3,8
4
Cellules + CC1
2mM
4
+ bakis Img/ml
15,9 ± 8,8
19,3 ± 1,8
+ bakis 2mglml
16,1 ± 5,2
19,4 ± 4,5
+ bakis 3mglml
15,0 ± 4,9
18,6 ± 3,9
+ bakis 4mglml
14,9 ± 3,6
12,6 ± 2,3
- 29-

Tableau V
Effets de l'extrait de T. bakis et de la Catéchine sur le pourcentage de
relargage de la LDH et des ASAT
Résultats de la méthode curative après 30' d'incubation
Nature suspension
LDH
ASAT
% relargage
% relargage
Cellules seules
ta
= 8,0 ± 2,0
2,8
t)lJ = 17,7 ± 4,5
6,J
Cellules + CCl
2 mM
52,9 ± 2,9
59,J
4
Cellules + CCl
2 mM
4
+ bakis 1mglml
22,5 ± 10,1
12,6
+ bakis 2mglml
21,6 ± 10,3
7,0
+ bakis Jmg/ml
18,0 ± 7,2
6,5
+ bakis 4mglml
16,8 ± 4,5
6,1
DISCUSSION ET CONCLUSION
Pour étudier l'effet hépatoprotecteur de l'extrait aqueux lyophilisé de T. bakis nous
avons eu recours à un modèle in vitro utilisant des hépatocytes isolés.
L'isolement des hépatocytes a été réalisé selon la méthode de Séglen modifiée (12)
qui nous a permis d'obtenir un grand nombre d'hépatocytes fonctionnels dont la viabilité
est supérieure à 90%.
Pour l'intoxication des hépatocytes isolés nous avons utilisé du CCl
à [a
4
concentration de 2 mM. Cette dose nous semble optimale. En effet en deça de cette dose,
les effets toxiques sont peu marqués et au delà, la toxicité du DMSO utilisé pour
solubiliser le CCl dans le milieu de culture peut apparaître. Comme l'ont montré Adzet
4
et al (1) le pourcentage maximal de DMSO dans le milieu de culture ne doit pas excéder
1,3 % (v/v). Comme l'ont recommandé Parafita et al (10), la proportion de DMSO que
nous avons utilisée est de 0,5% (v/v).
i .
i
- 30-

Les cellules ont été incubées avec le CCl pendant des temps brefs
(15 et 30
4
minutes) car comme l'ont démontré Parafita et al (10), les hépatocytes perdent rapidement
leur activité cytochrome P450' nécessaire à l'activation du CCl (9-10).
4
Pour cette même raison, nous n'avons pas utilisé des hépatocytes en'culture pour
rechercher la cytoprotection par l'extrait de Tinospora bakis.
Les concentrations d'extrait de Tinospora bakis que nous avons testées varient de
1 mg/ml à 4 mg/ml. Au-delà la solubilité de l'extrait dans le milieu de culture est très
limitée.
A ces concentrations l'effet cytoprotecteur de l'extrait de Tinospora IJakis est net.
En effet, pour toutes ces doses le pourcentage de relargage des cellules incubées avec
l'extrait de Tinospora bakis est significativement diminué comparé il celui des cellules
témoins ayant subi l'action du CCI .
4
L'étude des relations doses-effets montre que les effets hépatoprotecteurs cie
l'extr~it aqueux de Tinospora bakis ne sont pas dose-dépendants.
De tels résultats ont déjà été constatés avec d'autres plantes telles Eupatorium
cannabinum (8), ils sont par contre contraires à ceux obtenus avec l'extrait aqueux de
Cochlospermum tinctorium dont les effets sont dose-dépendants (2,3) ; ou encore obtenus
avec les jeunes pousses de Rosmarinus officinalis qui ont un effet maximal à l mg/ml el
dont l'effet décroît lorsque la dose augmente (4). Ainsi, même pour de faibles doses,
l'extrait aqueux de Tinospora bakis est cytoprotecteur.
On sait que le CCl a une toxicité directe. Cette toxicité est essentiellement clue
4
à l'apparition de radicaux libres ou de formes toxiques de l'oxygène qui induisent une
péroxydation lipidique aboutissant à la destruction des membranes cellulaires (11).
Les hypothèses que nous pouvons donc avancer à propos du mécanisme d'action
cellulaire du Tino:-,pora bakis est une protection membranaire par diminution de la
péroxydation lipidique.
- 31 -

· BIBLIOGRAPHIE
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