ri
.="5'7
Sciences et Médecine
Propriétés coagulantes de ca/otropis procera et ses possibilités
d'utilisation en industrie agro-alimentaire
BABA-MOUSSA Farid*, BABA-MOUSSA Lamine"; AHISSOU Hyacinthe**, BOKOSSA Innocent',
CAPO-CHICHI Bénédicte", TOUKOUROU Fatiou", SANNI Ambaliou**
RESUME
Le Bénin dispose d'une flore constituée de plusieurs types de formations végétales parmi lesquelles bon nombre sont
exploitées pour leurs nombreuses vertus en médecine traditionnelle, en alimentation, en cosmétique etc. Calotropis
procera (Ait) Ait. Fest une plante arbustive de la famille desAsclépiadaceae caractérisée par la production d'un latex blanc.
Ses différentes parties (feuilles, tiges, fruits, latex) sont utilisées pour cailler le lait de vache dans un processus traditionnel
de fabrication de fromage appelé « warangachi » bien connu au Bénin. Le but de cette étude est d'analyser les propriétés
coagulantes de Calotropis procera et de voir l'effet de certains paramètres physico-chimiques sur la coagulation. Des
solutions coagulantes de cette plante ont été préparées à partir de feuilles, de tiges, de fruits et du latex puis testéessur le
lait de vache en vue de déterminer la partie la plus efficace pour la coagulation. Lesrésultats obtenus ont montré que le
latex avait une activité plus importante. L'activité protéolytique de cette présure végétale est influencée par les facteurs du
milieu, principalement la température et le pH. La température optimale sesitue entre 65 -70°C pour un pH compris entre
7 et 8.Enfin, des essais d'isolement de la protéine enzymatique par desméthodes de séparations chromatographiques ont
montré que 3 fractions étaient coagulantes.
Mots clés: Calotropis procera, latex, lait, coagulation, protéine.
ABSTRACT
Benin has several plant flora among which a lot ofare exploited in traditional medicine, in food, in cosmetic etc. Calotropis
procera Ait.F is a shrubby plant of the family of the Asclepiadaceae characterized by the production of white latex.
Different parts (leaves, stems, fruits, latex) are used to curdle milk in a tradition al process of cheese making in Benin. The
present study is about the coagulant properties of Calotropis procera and the effect ofphysical and chemical parameters
on the coagulation. Coagulant solutions were prepared with leaves, stems, fruits, latex and tested on milk in order to
determine the most efficient part for the coagulation. The results have shown that the latex had a more important activity.
The proteoiytic activity of this plant rennet is influenced by the factors like the temperature and the pH. The optimal
temperature is located between 65-70°C for a pH between 7 and 8.The enzymatic protein isolation by chromatographies
methods has given three coagulant fractions.
Keywords : Calotropis procera, latex, milk, coagulation, enzyme.
INTRODUCTION .
1974). C'est dans ce contexte que se place la présente
La valorisation des ressources naturelles dans les
étude qui
porte sur les propriétés coagulantes
pays en voie de développement pourrait constituer
de
Calotropis
procera
(Ait) Ait. F. Cette plante,
une solution au progrès socio-économique (Dewan
communément appelé Arbre à soie ou Pommier de
S. et al., 2000). Le Bénin, possède une diversité de
Sodome ou plante à lait ou encore Roustonnier (Berhaut,
formations végétales dont certaines ont révélé des
1971), est un arbuste caractérisé par de grandes
vertues qui suscitent l'intérêt et méritent une étude
feuilles ovales de couleur gris vert, opposées, sessiles,
approfondie en vue d'une exploitation plus judicieuse
couvertes d'un velours dense formé de petites fibres
voire bénéfique pour les populations (Egounlety M. et
blanches. Ses fleurs sont blanches et violines pourpres
al., 1974).
* Laboratoire de Microbiologie et des Technologies. Alimentaires;
Ainsi, depuis plusieurs années, des travaux de
Faculté des Sciences et Techniques, Université d'Abomey-Calavi, BP
36 Abomey-Calavi, Bénin.
recherches sont entrepris dans ce sens et plusieurs
** Laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire, Faculté des
espèces susceptibles d'être exploitéesdans les domai-
Sciences et Techniques, Université d'AbomeY-Ca/~vi, 04 BP 0320
nes pharmaceutiques, cosmétiques, agroalimentaires
Cotonou, Bénin.
etc, sont prospectées et étudiées (Egounlety M, et al.,
***Auteur de correspondance Email: fbmouss@yahob.fr,
Tel: (229) 90-03-65-25
-
Rev. CAMES - Série A, Vol. OS, 2007
Sciences et MédecinE!
de 15mm de diamètre avec une corolle large de 2 à 3
scalpel, on incise la tige de C. procera et 1 ml de latex est
cm formée de 5 pétales verdâtres portant une tâche
recueilli. A partir de celui-ci, on prépare des solutions à
violacée au sommet. Le-fruit est un follicule verdâtre,
lü-l, lü-2, 10-3 ,10-4 et lü-5 respectivement diluées dans
ovoïde, lâchement et mollement fibreux à l'intérieur.
de l'eau distillée.
Les graines sont aplaties et surmontées d'une aigrette
blanche. Toutes les parties de la plante sont riches en
1.2. 1.2 Testde coagulation
sève laiteuse (von Maydell, 1990). Elle est répandue
Cinquante (50) ml de lait entier de vache sont
dans les zones sèches sur sols sableux d'Afrique,
prélevés dans un Erlenmeyer puis chauffé. Lorsque la
d'Asie Mineure, du Pakistan et d'Inde (Kees, 1996). Elle
température du lait atteint 35°C,2 ml de solution de C.
est utilisée en pharmacopée traditionnelle comme
procera sont ajoutés et le chauffage est poursuivis.
vermifuge (Neuwinger, 2000), antidiarrhéique (Kumar
Pour cette l'étude, le temps de coagulation est le
et al.,2001),analgésique (Dewan et al.,2000), émétique
temps qui s'écoule entre l'addition du coagulant et
(Adjanohoun et al; 1989).Elle dispose également d'une
l'apparition des premiers flocons. Encasde coagulation,
propriété très peu connue, celle de faire cailler le lait
le coagulum est récupéré et gardé à l'étuve à 3rC
(Kees, 1996).En effet, les bergers Peuhls du Nord Bénin
pendant 4 heures pour faire évaporer l'eau: Le
et de l'Etat d'Dyo au Nigeria (Aworh et Nakai, 1986)
coagulum est ensuite pesé. Dans le cas échéant le
l'utilisent comme coagulant végétal dans le processus
résultat est négatif.
de la fabrication traditionnelle du fromage local. Dans la
plupart des pays en développement particulièrement
7.2.2. Influence des facteurs physico-chimiques
en Afrique de l'Ouest où la consommation en protéine
sur la coagulation
animale est très faible (moins de 10 q/jour/habitant), le
La variation
du
pH
est
suivie
en
ajoutant
fromage local est une importante source de protéines
progressivement une solution d'acide chlorhydrique
(35,6%) et de matière grasse (49,4%) (Egounlety et al.,
ou .d'hydroxyde de sodium. La lecture du pH se fait à
1981). Sa faible teneur en lactose en fait un aliment
l'aide d'un ph-mètre METTLER P200®. Des échantillons
recommandé aux personnes souffrant de l'intolérance
de lait de pH compris entre 6,6 et 4 sont obtenus par
au lactose (Egounlety et al., 1981).
ajout d'acide chlorhydrique et des échantillons de lait
de pH compris entre 6,6 et 10 par ajout d'une solution
Cefromage traditionnel est utilisé en remplacement
d'hydroxyde de sodium. A partir de ces échantillons
de la viande ou du poisson
dans divers mets.
de lait de 50 ml à pH modifié, les tests de coagulation
L'importance de sa consommation actuelle incite à
sont réalisés suivant la méthode décrite ci-dessus. Les
entreprendre des études pour améliorer le mode de
valeurs de pH supérieures à 5 sont prises en compte car
préparation afin de réduire les risques de contami-
lorsqu'on atteint le pHi des caséines (4,6), on observe
nation microbiologique et toxicologique.
une coagulation chimique sans ajout du coagulant.
Pour tracer le graphe, des valeurs ont été attribuées
1. MA"rERIEL ET METHODES
aux signes (-, +, ++, +++) comme suit:
1.1. Matériel
- correspond à la valeur 0;
Le matériel végétal utilisé est constitué de feuilles,
+ correspond à la valeur 1;
tiges, fruits et latex de C. procera collectés à Cotonou
++ correspond à la valeur 2;
à la place du Champ de Foire. Un échantillon a été
+++ correspond à la valeur 3.
déposé à l'herbier national pour identification et pour
A des températures comprises entre 20 et 80°C, les
servir de référence. Les essais de mise en évidence de
tests de coagulation sont réalisés pour montrer l'effet
la coagulation ont été réalisés avec du lait entier de
de la température sur le temps de coagulation.
vache prélevé le jour même sur un campement peuhl
à Cotonou, près du marché de Zongo.
1.2.3.
Essai
d'isolement
de
la
protéine
enzymatique
1.2. Méthodes
Du gel (Sephadex G100 Superfine, limites: 4000-
1.2.1. Etude de l'activité coagulante des diffé·
150000 Da) est gonflé dans de l'eau distillée toute la
rentes parties de la plante
nuit. Il est ensuite coulé dans une colonne (40 x 3,2
1.2.1.1. Préparation des échantillons
cm) puis équilibré avec le tampon d'élution composé
Dix (10) grammes de feuilles, tiges, ou fruits frais
de Tris HCI1 OmM pH 7.4 NaCI 0.15 M azide de sodium
de C. procera sont soigneusement lavés puis broyés
0.02 %. L'azide de sodium est utilisé comme agent
séparément dans un mortier en porcelaine avec 10 ml
bactériostatique contre l'apparition de bactéries et
d'eau distillée. Le mélange est filtré sur papier filtre. Le
de moisissures qui peuvent altérer les propriétés
filtrat obtenu est recueilli dans un becher. A l'aide d'un
chromatographiques du Sephadex ainsi que le débit
8
Rev. CAMES- Série A, Vol. OS,2007
Sciences et Médecine
Tableaul' Activité du filtrat des feuilles, tiges et fruits
densités optiques des fractions recueillies ont été
mesurées à 280 nm. Les valeurs obtenues ont permis
Organes
Masse du
Temps de
Température
Appréciation
de tracer le profil d'élution de l'échantillon déposé,
coagulum
coagulation
du coagulum
et de regrouper les fractions en 7 lots. Les 7 lots de
fractions sont ramenés à la même concentration (100
Feuilles
14,53g
15mn
69°e
+++
mg/ml) après dilution. La lecture de la concentration
se fait au spectrophotomètre (JENWAY GENOVA®).
Tiges
15,73g
13mn
6re
+++
Ces fractions sont utilisées comme coagulant dans
les tests de coagulation. Ainsi, sur des échantillons de
Fruits
10,86g
21mn
700e
++
-
lait de même volume (5 ml), les fractions coagulantes
de volume allant de 0 à 100 fJl ont été ajoutés.
de la colonne (Hosttetman K et al., 1997).
L'appréciation du coagulum a été réalisée grâce à un
Cinq (5) ml de latex frais sont mélangés avec 3ml
panel d'observateurs qui attribuent des signes +++,
du tampon d'élution composé de Tris HCI 10 Mm pH
++, + et - au coagulum:
Tableau1/' Activité du latex
+ : floculation,
++ : Prise en masse,
Paramètres
Dilution
Dilution
Dilution
Dilution
Dilution
10-1
10-1
10-3
10-4
10-5
+++: Bonne coagulation
(prise en
masseet fermeté),
- : Pas de coagulation.
Température à t'ajout
35°(
35°(
35°(
35°(
35°(
du coagulant
Lesfractions ayant révélé une activité
Temps de
7mn
10 mn
14mn
19 mn
-
coagulante, subissent une électropho-
coagulation
rèse sur gel
de
polyacrylamide en
Température au
62°(
65°(
66°(
66°(
-
conditions
dénaturantes
selon
la
début de la
méthode de Laemmli (Laemmli, 1970)
coagulation
pour visualiser les bandes protéiques et
Appréciation du
+++
+++
déterminer la masse des protéines.
++
+
-
coagulum
21g
18,5g
12,3g
8,1g
-
Il. RESULTATS ETDISCUSSION
Masse du coagulum
2.7. Etude de l'activité coagulante
du filtrat des différentes parties de C.
7,4 NaCl 0,15M azide de sodium 0,02%. Le mélange
procera
est centrifugé pendant 30mn à 4000 tr/mn. Après
Des tests de coagulation ont été effectués en
centrifugation, 7,5 ml du surnageant sont déposés sur
utilisant comme coagulant le filtrat de feuilles, de tiges
le gel. Le tampon d'élution est ensuite coulé sur le gel
ou de fruits broyés, et également du latex dilué avec
à l'aide d'une ampoule à décanter. Le débit d'entrée du
de l'eau distillée. Les résultats sont consignés dans le
tampon sur le gel est le même que le débit de sortie
tableau 1et II.En nous basant sur la massede coagulum
obtenue et sur le temps
au bout duquel la
Act io ndupH
coagulation a lieu, les tableaux 1 et Il montrent
que les différentes parties (feuilles, tiges, fruits, et
3.~ .
le latex) de Cptocera ont une activité coagulante
sur la caséine du lait. Lesfeuilles et tiges donnent
à peu près le même résultat. Les fruits sont moins
efficaces, par contre le latex présente une activité
".
plus marquée et les dilutions
au 1Oé et 100é
donnent les meilleurs résultats.
2.2. Etude de l'influence des facteurs
12
14
physico-chimiques sur la coagulation
16
2.2.7 . Influence du pH du lait
pH
Les tests de coagulation effectués sur les
échantillons de lait à pH modifié ont permis'
Figure 7 : Effetdu pH du lait surla qualité du coagulum
d'avoir les résultats consignés dans la figure 1.
de la colonne. Pour cette séparation, le débit est de
L'enzyme a une activité maximale sur la caséine
2 ml d'éluant toutes les 10 mn, soit 12 ml/heure. Les
du lait à un pH situé entre 7 et 8 (figure 2).
Rev. CAMES - Série A, Vol. OS, 2007
9
Sciences et Médecine
tiges, fruits, latex) de Calotropis
Action de la température
procera
nous
ont
permis
d'observer
une activité plus
importante au niveau du latex.
Ceci pourrait s'expliquer par le
fait que j'enzyme responsable
de la coagulation est concentré
~ .
dans le latex. D'après les résul-
tats que nous avons obtenus,
10 .'
les tiges sont plus efficaces que
les feuilles. Les fruits ont donné
5
de faibles concentrations. La
quantité de latex varie selon les
0'
o
100
différentes parties de la plante.
" faut ajouter que cela dépend
tem pérature en ·C
aussi de l'âge de la plante, de
sa station ècoloqique et de son
Figure 2 : Effet de la température du lait sur le temps de coagulation
approvisionnement en eau. Ces
différentes raisons font qu'il n'est
2.2.2./nfluence de la température du lait
pas possible de donner avec précision la quantité de
L'étude de l'influence de la température du lait sur
matière végétale qu'il faut utiliser pour la fabrication
l'activité coagulante de C. procera a montré que plus
du fromage. La mise au point de cette présure végétale
la température augmente, plus le temps de début
permettra de surmonter ces difficultés et de maîtriser
de coagulation diminue (figure 3). La température
plus facilement
cette
technique
de fabrication
optimale de coagulation pour cette présure végétale
traditionnelle.
E
chromatogramme
Comme pour toutes les enzymes, l'activité
& 3,5
protéolytique' de cette
présure végétale
~
3
-ca
2,5
est influencée par des facteurs de milieu
g '2
et principalement la température et le pH.
1,5 .
L'étude de l'influence des' facteurs physico-
1
chimiques sur l'activité de l'enzyme a montré
. 0,5,
que l'augmentation de la température réduit le
o - - - '
, -0,5 0
50
100
150
200
temps de coagulation. On pourrait l'expliquer
Numero de fraction
par le fait que l'énergie fournie sous forme
thermique au système en réaction entraîne
une augmentation de complexe activé ce
Figure 3 : Profil d'élution du latex après Chromatographie de filtration sur gel
qui rend la réaction plus rapide. Le temps de
coagulation le plus court (l mn) est obtenu
présente dans le latex de C. procera se situe entre
pour des températures comprises entre 65°C-70°(,
65°C et 70°e. Au-delà de cette fourchette, il n'y a plus
Au-delà de 75°C il n'y a plus coagulation. L'enzyme isolé
coagulation; cela peut être dû à la dénaturation de
de Calotropis procera a donc un maximum d'activité
l'enzyme.
entre 65-70°(, Signalons qu'à ces températures la
présure de veau est dénaturée (Bourdier, 1974).
2.3. Recherche de l'activité coagulante Tableau .
11/' Etude de J'activité coagulante des 7 lots de fractions
des fractions
Parmi les sept (7) lots de fractions testées,
N° des fractions
Fl
F2
F3
F4
F5
F6
F7
1à40
41 à60
61 à 80
81 à 100
101à130
131 à 151
151 à 190
trois (3) ont une, actlvitécoaqulante sur la
,.
caséine du lait (tableaux III,etIV): L'enzyme
responsable de la coagulation serait présent c Activité coagulante
négatif
positif
négatif
Positif
négatif
positif
négatif
dans ces 3 fractions. ,
L'influence du pH du lait surla coaqulation par
III. DISCUSSION
l'enzyme a' été\\hùdiée"par observation'et appréciation
Les expériences réalisées en vue de déterminer
de la fermeté du coagulum obtenu par coagulation
l'activité coagulante des différentes parties (feuilles,
des échantillons de lait à pH modifié. Le pH optimum
10
Rev. CAMES - S'érie A, Vol~ OS, 2007
Sciences et Médecine
d'action de cette enzyme sur la caséine du lait est
cation complète et de la cristallisation de l'enzyme.
environ 7.
Pour une utilisation large en industrie agroalimentaire,
l'hydrolyse de la caséine k par cette présure végétale
Au Nigeria, la présure végétale obtenue par
n'est pas une condition suffisante. Plusieurs proprié- .
précipitation des feuilles de Calotropis procera au
tés physico-chimiques et technologiques (propriétés
sulfate d'ammonium a montré une importante activité
rhéologiques du coagulum, la synérèse du coagulum,
coagulante à pH 6.4 à 65 "C (Aworh et Muller, 1987).
le rendement en fromage etc.) compatibles avec
Toutefois Ogudiwin et Oke (1983) ont observé que
l'environnement fromager et la qualité alimentaire des
la température du début de caillage varie entre 70 et
produits finis doivent être étudiés. Des travaux visant
92 "C et dans la majorité des cas entre 80 et 92 oc.
à mettre en évidence d'autres propriétés de l'enzyme
.
··d l'
.. , d
,~.
1
(700
doivent
être
réalisés.
En
effet
cet
Tableau IV: Comparaison e activite es trois tractions coagu antes
mgr
' t ' d
li
,.
,
, ,
enzyme pourrai avoir
es app icanons
ml) par appreciation de la qualité du coagulum
d
1
d '
l'
t '
ans
es
omarnes
a imen aires,
biotechnologiques,
pharmaceutiques,
0
10 !JI
20 !JI
30 !JI
40 !JI 50 !JI
60 !JI
70 !JI
80 !JI
90 !JI
100 !JI
etc. Les travaux
de Kareem et al.,
(2002) ont montré que cet enzyme
Fraction 2
-
-
-
-
-
-
+
+
++
++
++
interviendrait
dans
la
purification
d'autres
enzymes
et· constituerait
Fraction 4
-
-
-
-
+
+
+
+
++
++
++
une méthode de purification efficace
et
moins coûteuse par rapport à
l'ultrafiltration
et
l'utilisation
des
Fraction 6
-
-
+
+.
+
++
+
++
++
+++
+++
polyélectrolytes.
La purification de
la présure végétale contenue
Dans les années à venir, le clonage du gène codant
dans Calotropis procera par chromatographie de gel
pour la synthèse de cette protéine sera d'une grande
filtration sursephadexG 100superfine a permis d'avoir 3
utilité car elle permettra de la produire en grande
fractions coagulantes. Les résultats du SOS PAGE réalisé
quantité grâce aux méthodes actuelles de génie
sur les trois fractions coagulantes ont montré que la
génétique. Ce serait une solution face aux difficultés
protéine recherchée a une masse d'environ 30Kda. Les
liées à la collecte de la matière végétale et au coût
travaux de Aworh et al (1994) ont révélé la présence
de la purification qui ne permet pas de mettre sur le
dans le latex de Calotropis procera de deux protéases
marché des préparations coagulantes commerciales à
hydrolysant la caséine, de masses respectives 25000
des prix raisonnables.
et 30000 Da et de pH optimum 7 et 8. Une protéase
d'environ 28.8 Kda a été purifié à partir du latex de
Enfin, s'il est reconnu scientifiquement que la sève
Calotropis procera (Kumar et al, 2003).
de Calotropis procera est toxique, la quantité de sève
utilisée dans la fabrication du fromage est tellement
Contrairement à la plupart des enzymes d'origines
faible qu'une intoxication alimentaire est à écarter.
végétales qui ont une forte activité protéolytique,
Toutefois, il ne serait pas inutile de préciser par des
l'enzyme issu de Calotropis procera a une activité
études approfondies tous les paramètres de toxicité
protéolytique faible (Kees M., 1996). Différents travaux
de la sève de Calotropis procera.
ont montré qu'il n'y a presque pas de différence
du point de vue qualité nutritive entre le fromage
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emprésuré avec l'extrait de Calotropis procera et le
fromage fabriqué avec la présure de veau ou avec du
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