Sciences et Médecine
Etude de la résistance in vitro à ralstonia solanaœarum
chez six hybrides somatiques de pomme de terre
(solanum tuberosum 1.) et leurs parents
. .
R. SIDIKOU DJERMAKOYE SEYNP
Faculté des Sciences Université A.M.de Niamey, BP 12022, Niamey, Niger (Auteur et edresse poste le pour les correspondences), E-mail: sramatou@ird.ne ou
rsidikouseyni@yahoo.com, Tel :00 (227)26 58 44 ou 00(227)7327 38 Fax:00 (227)73 30 72
D.SIHACHAKR2 'Morphogenèse Végétale Expérimentale, Belt.360, Université Paris Sud- 91405OrsayCedex, France.
A.C. LEROUX3 'Unité Mixte deRecherches INRAIENSAR BI03P, Domainede laMotte,BP35327-F, 35650LeRheu Cedex, France.
A.SERVAES2, A. ÀMBROISP 'Morphogenèse Végétale Expérimentale, Belt.360, Université Paris Sud- 91405OrsayCedex, France.
B.JOUAN3 'Unité MixtedeRecherches INRA/ENSAR BI03P,Domaine dela Motte,BP35327-F, 35650LeRheu Cedex, France.
D.ELLISSECHE4 'INRAStationd'améliorationde la pommedeterreet des plantesclbulbes, Keraiber,29260 Ploudaniel.
G.DUCREUX2 'Morphogenèse Végétale Expérimentale, Bell. 360, Université Paris Sud- 91405OrsayCedex, France.
,
RÉSUMÉ
Le flétrissement bactérien dû à la bactérie Ralstoniasolanacearum est l'une des plus graves maladies de la pomme de terre
intervenantdans de nombreux pays. Laprincipalevoiepour limiter l'incidence decettemaladie est la création de variétés tolérantes.
L'hybridation somatique entre une variété diploïde sensible (BFI5.2X) et des espèces sauvages (Solanum stenotomum, Solanum
phureja) apparentées résistantes à la bactérie ont étémenées dans l'optique d'un transfertde la résistance. Sixdes hybrides obtenus
ont étéévalués comparativement avecles troisparentssauvages et le témoin sensible BFI5.4X. Lasouche de Ralstonta solanaiearuin
utilisée, d'origine sahélienne, dela région deSikasso au Mali,appartient au biovar 3 et à la division 1. Les degrés de résistance ou de
sensibilité des hybrides BS33, BS37,8S44 (issus de la fusion BFI5.2X + Solanum sténotornurn) et BP3;- BP4, BP 15 (issus de la fusion
BFI5.2X +Solanum phureja)ont étéévalués surla base detests derésistance. Ainsi, d'après les Indices geMaladie(IMr: r CiNi/r Ni
de WINSTEAD et KELMAN, 1952), les hyprides avec S. stenotomum BS33, BS37, BS44 seraientrésistants (avec des IMr respectifs de0.16
- 0.16 - 0.17à 3 semaines deculture), tandisqueles hybrides avec S.phureja BP3, BP4, BP15 seraient tolérants(avec des IMrrespéétifs
de0.26 - 0.26 - O. 19). Ces résultats sont confirmés au niveau des parents où it a ététrouvé que vis à visde cettesouche sahélienne de
R. solanacearum, leparent sauvage S. stenotomum (SST) estplusrésistant (IMr0.14) queleparent sauvage S.phureja (P5) qui lui n'est
quetolérant(IMr0.38). Le témoinBF15.4X étant bienentendu toujours sensible (IMr0.69) à R. solanacearum.
Motsclés:S. tuberosum, R. solanaœarum, S. stenotomum, S. phuteia, flétrissement bactérien, hybridation somatique, ptotoptastes.
Abréviations:MS - Milieu debase Murashigé 'êt Skoog; ufc- unitéformant la colonie
.
. -
ABSTRACT
. .
..
Bacterial witt due to Ralstoniasolanacearum ts one of the severest diseases of potatoes in many countries. The main way td Iimit
the incidence of tho:disease is to creaie soine tolerant varieties. Somatichybridisation bétweenà sensitive diploid variety(BF15.2X)
and related wild species (Solanumstenotomum, Solanum phureja) resistant to thebacterta, has beendone in order totransîer the
resistance choractet. Sixof the obtained hybridshavebeen evaluatedcomporauvety to the 3 wild parents and the sensitive control
BF15.2X The strain of R. solanacearum useâ.oriçinated from Sahelian regionof Sikasso in Mali,belongs to biovô'3 and division 1. The
résistance and sensitivitylevel of the hybridsBS33, BS37 BS44 (from the cross of BFI5.2X +S. stenotomum.)and BP3, BP4, BP15 (from
thecross of BFI5.~X +S. phureja)havebeen assessed on a resistance testbasis.
Thereforaccording to theindexofdisease (IMr: LCi Ni/LNi ofWINSTEADand KELMAN, 1952),hybrids with S,stenotomum.BS33,BS37,
BS44 were resistant (with IMr respectivelyof0.16-0.16-0.17,3 weeks ofter planting) white hybridswith S. phureja BP3, BP4, BP15 were
tolerant(IMrrespectively of 0.26-0.26-0.19). These resuïts were confirmedwith theparents, where it hasbeen found thatcompared to
theSahelian strain of R. solanacearum, the wild parentS. stenotomum (SST) ismoreresistant(IMr0.14) thon thewild parentS. phureja
(PS), which isonly tolerant (IMr0.38). The control BFI5.2X isstill sensitive rothe R. solanacearum (IMr0.69)..
Keys word: S. tuberosum, R. solanacearum, S. stenotomum.S. phuteia, bacteriai wilt, somatichybrids,protoplasts
.
Abbreviations:BFI5.lX - Diploid cv Belle de Fontenay, Ci ~ Coefficient, CiNi- Numberof deseased teaves, IMr -Index of desease. Ni
- Numberotleaves .
.
)
INTRODUèTION
EnAfriq ue subsaharlen ne,lescondltlonsdimatlques
te. flétrissement.. bactérien
(encore
appelé
. et la rusticité des techniques culturales inadaptées font
.pourriture 'brune).. dû à Rqfsronia solanacearum est
que les phytopathogèhes comme R. solanacearum, très
la plus importante phytobactériose des Solanacées
favorisés par la chaleur (25°Cen moyenne) et l'humidité,
(RADTKE et RIECKMANN, 1993; KELMAN, 1998).Maladie
trouvent des conditions favorables pour mieux se
endémique assez répandue dans le monde, son degré
développer (PRIOR et al; 19~4). Contrairement aux
de gravité lui vaut d'être classée comme parasite. de
maladies .des cultures pérennes tropicales (MARIAU,
quarantaine (Arrêté du 11 Février 1999, YABUUCHlet
1999) et des grandes cultures vivrières céréalières
ai., 1999).
.
tropicales, les maladies des cultures maraîchères
Rev. CAMES ~ Série A, Vot 03,2005
75
Sciences et Médecine
tropicales sont peu étudiées,et lès méthodes classiques
modifier les réponses des plantes. De plus, la culture in
de lutte restant peu efficaces (NSIKA MIKOKO et al.,
vitro autorise l'utilisation en toute sécurité de souches
2000). Au niveau de la culture de pomme de terre et
bactériennes d'origines géographiques variées' dont
des espèces voisines (tomate, aubergine), l'accentest .
l'utilisation, .même en conditions. contrôlées, ferait
mis sur la lutte génétique par la caractérisation des
peser le risque d'urie introduction de variants ayant
pathogènes et la sélection de matériel végétal résistant
des capacités pathologiques différentes. L'étude du
(HAYWARD, 1991; HARTMAN et ELPHINSTONE, 1994;
comportement in vitro de génotypes face à la bactérie
CHARRIER et al; 1997 ; COLLONIER et al., 2001).
.
pourrait contribuer à la lutte génétique contre ce fléau,
donc au développement de la culture de pomme de
Diverses sources de résistance ont été trouvées
terre en zone sahélienne (SIDIKOU, 1997; SIDIKOU etaI.,
chez les espèces sauvages apparentées à Solanum
2000) et d'autres Solanacées par la même occasion.
tuberosum L. Certaines de ces espèces sont reconnues
pour leurs résistances particulières à plusieurs agents
1. MATtRIELS ETMtTHODES
pathogènes. dont celui du flétrissement bactérien,
1.1. Matériel végétal
la bactérie R. solanacearum (BOWMAN et SEQUEIRA,
Différents
génotypes
d'hybrides
somatiques
1982kL'hybridation somatique offre la possibilité
tétraploïdes (2n=4x) obtenus par électrofusion à
d'introduction de ces résistances en s'affranchissant
. partir de protoplastes ont été utilisés pour ces tests de
des barrières sexuelles. La pomme de terre a déjà été
résistance in vitro:
l'objet de nombreuseshybridations somatiques aussi
§ Deux groupes d'hybrides tétraploïdes, à raison de 3
bien intraspécifiques (AUSTIN et al, 1985; CHAPUT
génotypes par groupe de fusion:
<et ai; 1990) qu'lnterspéclfiques (EHL~NFELDT et
o BS33, BS3 7,BS44 (issusde la fusion BF 1S.2X + Solanum
HELGESON, 1987 ; FISH et cii., i 988 ; SERRAF et al., 1991 ;
stenotornum)
SIHACHAKR, VEDEL et DUCREUX, 1991; MATTHEIJ et
o BP3; BP4, BP1 S (issus de la fusion BF1 S.2X + Solanum
PUITE, 1992; 5ERRAF et. al., 1994; SIHACHAKR et al.,
phureja).
1994 ;)ADARletal.;19.92, 1997;HOFFMANNet al; 1999 ;
§ Les trois parents diploïdes (2n=2x) de ces hybrides:
..'GERUNGANetal:; 2000) et l'introduction de caractères.
• L'espèce sauvage Solanum stenotomum (SST)
de résistance chez S. tuberosum, à partir d'espèces
• l'espèce sauvage Solanum phureja (PS)
.
sauvages apparentées, à pu être effectuée.
• Le diploïde sensible BF1 S.2X
§
Le témoin
tétraploïde
(2n=4x)
apparenté' et
Cependant,
dans
le
domaine
spécifique
de
sensible: BF 15.4X
,
.l'introduction de résistance au flétrissement bactérien,
'assezpeudetravauxontété réalisésactuetlement.C'est
Les boutures utilisées ont été cultivées in vitro
ainsi qu'on peutmentionner, en plus de l'obtention
, à raison d'une bouture par tube à essai, sur 10 ml
d'hybrides somàtiques résistants à R. soianaceotum
de milieu solide de type MS (MURASHIGE et SKOQG,
entre S. tùbetosum et S. commetsonil (LAFERRIERE et al.,
1962) avec 2% de saccharose, sans substance de
. "999); cellesd'hybrides somatiques entre S. tuberosum
croissance; pendant 4 semaines dans les conditions.
et S.stenotomum;entre S. tuberosumet S.phureja(FOCK
environnementales (photopériode de 14h,. intensité
et al., 2000).
lumineuse de SS urnol.mt.s', 20°C, 60% d'humidité
relative).
, Parmi les hybrides ainsi créés, six ont fait l'objet de
notre étude, avecles trois parents sauvagesetle témoin
1.2. Matériel bactérien
sensible BF15.4X. Cette étude a consisté à effectuer
Lasouche de R.solanacearum utilisée est une souche
des tests de résistance à une souche sahélienne de R.
africaine du Mali (région de SIKASSO), isolée et purifiée
solanacearum en conditions in vitro, afin d'évaluer le
.à l'INRAde Rennesà partir de pourritures de tubercules
degré de résistance ou de sensibilité des hybrides. En .
de pomme de terre présentant des symptômes de la
effet, là sélection de génotypes résistants ou tolérants
maladie. Les tests de caractérisation, effectués à l'UMR
nécessite une mise au point de tests rapides, simples
de l'INRA de Rennes (LE ROUX, 1996; BOUDAZIN et al;
et précis (MARIAU, 1999). Compte tenu de la grande
1999; SIDIKOUetal., in press), ont permis de rattacher
variabilité de R. solanacearum et de sagrande virulence,
cette souche au biovar 3 et à la division 1.
il est indispensable que cestravaux soient cond uits dans
un environnement contrôlé (YABUUCHI etel; 1999).Les
1.3. Inoculation des vitroplants
tests de résistancein vitro,en'plus de leur rapidité,de leur
La méthode d'inocùlation utilisée est inspirée de
précision et de leur sûreté, permettent de s'affranchir
différents travaux (ELPHINSTONE, 1994; LE ROUX,
des contraintes environnementales susceptibles de
1996; FOCK et ai; 2000; COLLONNIER et at; 2001). Les
76
Rev. CAMES~. Série A, Vole :03,2005
ScienêèsefMedecine'
bactéries, réactivées à partir d'une souche congelée
Il. R~SULTATS ET DISCUSSION
à -80°C dans un milieu liquide « levure-peptone»
A la fin de l'expérimentation, crest àdire 35 jours (5
glycérolé à 30%, sont cultivées sur milieu de Kelman-
semaines) après l'inoculation, la plupart des vitroplants
modifié (KELMAN, 1954) à 26°C, pendant 72h. Des
est plus ou moins flétrie, ou avec des feuilles et des
colonies bactériennes typiques et bien muqueuses,
tiges plus ou moins décolorées ou jaunies ouencore
sont prélevées. Une suspension
bactérienne est
brunies. Trois semaines après l'inoculation, on peut
préparée avec de l'eau distillée stérile à partir d'une
définir 3 classes de comportement selon la valeur de
culture de 24 h. La concentration est ajustée à 108 ufc
l'Indice de Maladie (IMr) obtenue:
par ml par mesure spectrophotométrique de.la DO
Tabl.au - Evolution d•• lndl,•• d. maladl•• (lMr) chez les hybrides
à 650 nm (DO 650 = 0,125) (PRIOR et al; 1990). Cette
I~~~:~O.
1.17
II~
1.121
I.m
1.11~
suspension est par la suite diluée de façon à avoir une
.
IR~11
n'O<
n
0
,
concentration finale de 107 ufc/ml pour l'inoculation
.
IR"]1
,
0
0.01
016
02R
des vitroplants. L'âge des plants (4 semaines environ)
IR"-IA
0
001
OIR
016
' .
et la concentration de l'inoculum (106 à 107 ufc/ml), qui
1HP]
OOR
0.26
0.46
0.56 1Tnl....n.
ne doit en aucun cas être inférieure à 105 ufc/ml, sont
1RP~
0
001
017
04-
0~2 IT.....n.
des facteurs Iimitants (GONZALEZ et 01.,1973).
IRPI~
001
0
ou
' .
Pour chacun des génotypes et variétés' testés,
1P4RFNT<;
IRF1UX
0
016
. 047
06
l'inoculation s'est faite selon le protocole suivant:
InF~
I~.T
OJ~
O.
n 1Ré',;",n'
12 vitroplants, dont les racines sont coupées au tiers
Ip~
0
007
o 1R
n~~
IT ••
inférieur, sont mis à tremper pendant 20 min dans
la suspension bactérienne à 107 cfu puis sont mis en
1TEMOIN
IHFI5.4X
nru
'0 "
0.69.
0.9
,nQ
n,;hle
Légende Classesde comportement 3 semames ()21) après inoculation .
culture dans 5 ml de milieu de croissance liquide de
,
Résistant :IMr < 0,2
Tolérant :0,2 < IMr < O,S Sensible :IMD 0,5
type MS(MURASHIGE et SKOOG, 1962),dans les mêmes
conditions environnementales que celles utiliséespour
• Les génotypes ayant un IMr inférieur à 0.2 'seraient
la micropropagation du matériel végétal. De la même
résistants,
manière, pour chaque génotype et variété.ô vitroplants
• Les génotypes ayant un IMr compris entre,0.2 et 0.5
sont trempés pendant 20 min dans de l'eau stérile
seraient tolérants,
'avant d'être mis en culture dans 5 ml demilieu liquide
• Les génotypes ayant un IMr supérieur à 0.5 seraient
de type MS.Ces plantes constituent les témoins.
sensibles.
Une fois par semaine des notations (nombres
, D'après les indices de maladie calculés selon la
de feuilles malades / nombre total de feuilles) sont
formule de WII\\lSTEAD et KELMÀN(1952), les hybrides
effectuées pour chacun des vitro plants, pendant 5
BS33, BS37,BS44avec 5.stenotomum seraient résistants
semaines. Les plantes sont classées selon une échelle
(avec des IMr respectifs de 0.16,0.16,0.17 à 3 semaines
de notation comprenant 5 classes (ClAMPI et al, 1980;
de culture), tandis que les hybrides BP3, BP4, BP15avec.
HEet al., 1983 ; SWANEPOEL, 1990) :
5. phureja seraient tolérants (avec des IMr respectifs
de 0.26, 0.26/ 0.19). Ces résultats sont confirmés au
Classes
%demaladie
Ci
Ni
niveau des parents où i(a été trouvé que vis à vis de
cette souche sahélienne de R. solanacearum, le parent
0
0%
0
NO
1
< 5% (1 feuille flétrie)
om5
N1
Graphique:Indices de Maladie QMr) chez les Hybridessomatiques
2
5 à25%
0.150
N2
étleu rsParents
3
25 à 50%
0.375 ' N3
0.9 ~---,------------'----~
O , B V - - - - - - - - - - - - : - - - - - - -
4
50à 75%
' 0.625
N4
0,7
5
75 à 100%
0.875
N5
0 , 6 1 / - - - - - - - - - -
0.6 i r - - - - - - - - j l l l - - - . - - -
Un coefficient Ci est attribué à chaque classe et
0,4lr------..r
l'indice de maladie est calculé pour chaque génotype
0,3
après chaque, notation selon la formule suivante
0,2
CJ28
0.1
(WINSTEAD et KELMAN, 1952) :
'J~o
o
8S33
'8S44
BP4
SST
Indice de Maladie =IMr=L Ci Ni1L Ni
Hybrides
Parents'
Témoin
Rev. CAMES- Série A, Vol. 03,2005
77
Sciences et Médecine .
sauvage S. stenotomumJSST) est plus résistant (IMr
1996). D'oÙ la nécessité encore une fois réaffirmée,
0.14) que le parent sauvage S. phureja (P5) qui lui n'est
de mettre en place des schémas de production de
que tolérant (IMr 0.38). Le témoin BF15.4X étant bien
semences adaptés aux conditions locales, incluant
entendu toujours sensible (IMr 0.69) à R. solanacearum.
l'évaluation des variétés à l'égard des principaux
Soulignons cependant que le degré de résistance des
pathogènes (JOUAN et al.,1999).
hybrides BS reste néanmoins légèrement inférieur à
celui du parent sauvage S. stenotomum tandis que le
D'autre part, l'évolution de la maladie au cours des
degré de tolérance des hybrides BPs'est nettement
5 semaines d'expérimentation (la plupart des plants
amélioré par rapport à celui du parent sauvage S.
étant soit complètement flétrie pour les sensibles,
phureja (Tableau et Graphique des IMr).
soit à moitié jaunie pour les résistants),dérncntreque
tous les' génotypes, qu'ils soient sensibles, tolérants
L'objectif de cette étude était de tester in vitro le
ou résistants, hébergent la bactérie. Ainsi, comme
, comportement de nouveaux génotypes que sont des
l'ont souligné plusieurs auteurs (PRIOR er 'al; 1996;
. hybrides somatiques de pomme de terre et de celui de
TRIGALET et àt., 1998), la résistance au flétrissement
leursparents en présenced'une souchesahélienne de R.
bactérien résulte non pas d'une résistance mécanique
solanacearum; et de vérifier si le transfert de résistance
à la pénétration de la bactérie dànsla plante, mais
a bien été réaliséet dans quelles proportions.
d'une moindre propagation de celle-ci dans les tissus
vasculaires. Dans le même ordre d'idées, plusieurs
Les résultats que nous avons obtenus
nous
espèces et génotypes résistants peuvent héberger
permettent d'affirmer que le transfert de résistance
l'agent pathogène sans manifester les symptômes
a bien réussi lors des hybridations somatiques,
(espèces voisines,espèces adventices), ce qui doit être
puisque nous avons observé chez ces hybrides des
pris en ligne de compte dans les programmes de lutte'
phénomènes de résistance absents chez le témoin
contre le flétrissement bactérien, programmes de lutte
tétraploïde sensible et le parent diploïde sensible.
intégrée où la résistance variétale est une composante
Face à cette souche sahélienne, les parents sauvages
majeure.
et les hybrides issus de S. stenotomurn sont plus
résistants que ceux issus de S. phureja. Néanmoins,
CONCLUSION
le transfert de caractères de résistance à partir de S.
L'utilisation destech niquesd'hybridation somatique
phureja reste avantageux dans la mesure où cette
parfusion deprotoplastesen biotechnologies végétales
espèce sauvage est reconnue pour être résistante à
est une approche intéressante pour l'amélioration de
d'autres pathogènes comme le Phytophtora infestans
la pomme de terre (JADARI et al; 1997).Lefait de partir
responsabledu mildiou (HOFFMANN L., 1999),bien que
de protoplastes permet de s'affranchir des barrières
ce champignon pathogène ne puisse se développer
sexuelles, de pouvoir combiner des génomes parfois
sous les climats chauds et secs des zones tropicales
incompatibles et de raccourcir la durée d'obtention
sahéliennes; Ces hybrides somatiques, obtenus et
d'hybrides par rapport aux méthodes conventionnelles
testés in vitro en présence d'une souche sahélienne
(MILLAM et al., 1995). Le seul obstacle (toutefois non
de R. solanacearum, en attendant d'être évalués in
insurmontable) dans l'hybridation somatique chez
vivo dans les conditions africaines et sahéliennes, en
Solanum tuberosum et d'autres Solanacées résidant
plus d'autres localités, constituent un potentiel très
dans la difficile différenciation de bourgeons foliaires à
intéressant dans une perspective du développement
partir des cals issusde fusion (SIHACHAKR et al., 2000),
de la culture de pomme de terre au Sahel.
.
nous avons essayé d'explorer la voie de régénération'
par embryogenèse
somatique. Malheureusement,
Des études menées par FOCK et al., (2000) sur le
cette voie, bien que réalisable chez d'autres espèces
même matériel végétal que nous avons testé, mais
(SIDIKOU etal; 1992), n'est restée qu'éventuellement
par rapport à d'autres souches de R.so/anacearum, ont
prometteuse (O'HAIR et aL, 1987). Les sources de
abouti à des résultats voisins quant à S. stenotomum,
résistance étant multiples et la pomme de terre se
avec néanmoins quelques différences. Ce qui permet
prêtant bien à l'hybridation somatique, la régénération
d'affirmer que le phénomène de résistance, tout
par rernbryoqenèse somatique serait d'une grande
comme d'autresphênomènes .bioloçiques, est un
contribution .dans les programmes d'amélioration
ensemble complexe dépendant de plusieurs facteurs,
variétale chez cette espèce d'intérêt économique
aussi bien endogènes (génotype 'du matériel végétal) .
mondial qu'est S. tuberosum, particulièrement en ce
qu'exogènes (type .et origine de l'agent pathogène,
qui concerne l'apport des biotechnologies végétales à
conditions
environnementales)
(PRIOR,
1990 ;
la sécurité alimentaire en zones sahéliennes.
SIHACHAKR et al., 1994; DUCREUX, 1995 ; PRIOR et al.,
78
Rèv.'CAMES ~ Série A~ Vol. 03,2005
Sciences et Médecine .
Remerciements
13. GERUNGAN R.F.I. , JADARI R., COLLONIER C., FOCK
Ces études ont été possiblesgrdce à la collaboration
1., LIAN V., AMBROISE A., SERVAES A.,' LAVERGNE
de /'INRA de Rennes pour la souche baaérienne et du
D., DUCREUX G., SIHACHAKR D., 2000. Hybridation
laboratoire MVE de l'Université Paris XI d'Orsay pour
somatique pour le transfert de caractères de résistance au
verticillium à partir de Solanum tarijense dans la pomme
le matériel végétal et la mise à disposition des moyens
de terre (Solanum tuberosum). vue' Journées Scientifiques.
nécessaires à la conduite des travaux en conditions in
AUPELF-UREF p 107.
vitro.
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